JPS5917999A - ビリルビンの定量法及びその定量用試薬組成物 - Google Patents
ビリルビンの定量法及びその定量用試薬組成物Info
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- JPS5917999A JPS5917999A JP12763282A JP12763282A JPS5917999A JP S5917999 A JPS5917999 A JP S5917999A JP 12763282 A JP12763282 A JP 12763282A JP 12763282 A JP12763282 A JP 12763282A JP S5917999 A JPS5917999 A JP S5917999A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は被検液、特に血液、尿など生体液中の′ビリル
ビンを酵素的に定量する方法及びその定量用試薬組成物
に関する。更に詳？シ＜はミロセシウム属菌の産するビ
リルビンオキシダーゼによる直接型ビリルビンを定量す
る方法、ならびに該菌株などの産するビリルビンメキシ
ダー妃、ラッカーゼ、チロシナーゼ又はアスコルビン酸
オキシダーゼによる総ビリルビンを定量する方法及びそ
れらの定量用試薬組成物に関する。
ビンを酵素的に定量する方法及びその定量用試薬組成物
に関する。更に詳？シ＜はミロセシウム属菌の産するビ
リルビンオキシダーゼによる直接型ビリルビンを定量す
る方法、ならびに該菌株などの産するビリルビンメキシ
ダー妃、ラッカーゼ、チロシナーゼ又はアスコルビン酸
オキシダーゼによる総ビリルビンを定量する方法及びそ
れらの定量用試薬組成物に関する。
ビリルビンは胆汁中に最も多く存在する色素で。
正常人では血清中に約１ ｒＩｖｄｔ以下含まれる。血
清中では主にグルクロン酸と結合した直接型ビリルビン
（抱合型ビリルビン）又はアルブミンと結合した間接型
ビリルビン（非抱合型、遊離型ビリルビン）として存在
し、非抱合非結合型のビリルビンは生理的ｐＨ（ｐＨ７
，４）では水に不溶性であるので＃１とんど存在しない
。尿中では直接型ビリルビンが主である。
清中では主にグルクロン酸と結合した直接型ビリルビン
（抱合型ビリルビン）又はアルブミンと結合した間接型
ビリルビン（非抱合型、遊離型ビリルビン）として存在
し、非抱合非結合型のビリルビンは生理的ｐＨ（ｐＨ７
，４）では水に不溶性であるので＃１とんど存在しない
。尿中では直接型ビリルビンが主である。
直接型ビリルビン、間接型ビリルビンを分別定量する意
義は、血清、尿など生体液中のビリルビンの増加が何に
起因するかを知る上で重要である。
義は、血清、尿など生体液中のビリルビンの増加が何に
起因するかを知る上で重要である。
すなわち、直接型ビリルビンの増加は肝細胞倖害１肝内
胆汁うつ滞、肝外性胆汁うつ滞などが予想され１間接、
型ビリルビンの増加はビリルビンの生成増加、肝処理機
能異常などによることが考えられている。
胆汁うつ滞、肝外性胆汁うつ滞などが予想され１間接、
型ビリルビンの増加はビリルビンの生成増加、肝処理機
能異常などによることが考えられている。
従来、ビリルビンの分別定量法としては、ビリルビンと
ジアゾ試薬が反応して生ずるアゾビリルビンの紅色を比
色定量する方法（金井泉：臨床検査法提要、第２８版、
金属出版、ベージＸ［１−２４゜昭和５３年）などの化
学的方法が主として用いられている。この方法はジアゾ
試薬がビリルビン以外の血清成分と反応するため正確性
に欠けることがある。
ジアゾ試薬が反応して生ずるアゾビリルビンの紅色を比
色定量する方法（金井泉：臨床検査法提要、第２８版、
金属出版、ベージＸ［１−２４゜昭和５３年）などの化
学的方法が主として用いられている。この方法はジアゾ
試薬がビリルビン以外の血清成分と反応するため正確性
に欠けることがある。
又、ビリルビンに反応する酵素の例としては。
ユーロピアンジャーナル・オブ・バイオケミストリー（
Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ ） 、第１Ｏ巻、４６
８〜４７３ページ（１９６９年）に、ギニアビッグのヘ
モグロビン、チトクロームＣ１同じく脳、肝臓、心臓な
どの組織中のオキシダーゼ、及びホースラデイシュのパ
ーオキシダーゼ、牛乳のキサンチンオキシダーゼにビリ
ルビン酸化能のあることが記載されている。これら酵素
は、キサンチンオキシダー／ ゼを除いて過酸化水素の存在によシ活性化される。
Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ ） 、第１Ｏ巻、４６
８〜４７３ページ（１９６９年）に、ギニアビッグのヘ
モグロビン、チトクロームＣ１同じく脳、肝臓、心臓な
どの組織中のオキシダーゼ、及びホースラデイシュのパ
ーオキシダーゼ、牛乳のキサンチンオキシダーゼにビリ
ルビン酸化能のあることが記載されている。これら酵素
は、キサンチンオキシダー／ ゼを除いて過酸化水素の存在によシ活性化される。
反応生成物に過酸化水素が含まれるか否かは記載かない
。又、特開昭５４−１５１１９３号公報にはアガリカス
ビスポラス菌の生産するビリルビンに活性を有する酵素
組成物について記載されている。
。又、特開昭５４−１５１１９３号公報にはアガリカス
ビスポラス菌の生産するビリルビンに活性を有する酵素
組成物について記載されている。
−該酵素組成物はビリルビンに反応し１反応生成物は５
１０ ｎｍの最大吸収を有し、４５０ｎｍの励起波長に
よＶ） ５２５ ｎｍの螢光を発する物質及び過酸化水
素である。しかしながら、直接型１間接型いずれのビリ
ルビンに作用するのかについては全く記載がない。
１０ ｎｍの最大吸収を有し、４５０ｎｍの励起波長に
よＶ） ５２５ ｎｍの螢光を発する物質及び過酸化水
素である。しかしながら、直接型１間接型いずれのビリ
ルビンに作用するのかについては全く記載がない。
本発明者等はこれらの現状に鑑み、鋭意研究を続けた結
果、酵素性測定によるビリルビンの分別定量法を見出し
た。すなわち１本発明の方法は。
果、酵素性測定によるビリルビンの分別定量法を見出し
た。すなわち１本発明の方法は。
被検液にミロセシウム属菌の産生ずるビリルビンオキシ
ダーゼを作用させることを特徴とする直接型ビリルビン
の定量法及び本ビリルビンオキシダーゼと反応促進物質
を作用させるか、又はラッカーゼ、チロシナーゼ、アス
コルビン酸オキシダーゼ又はコプリナス属菌の産生ずる
ビリルビ、ンオキシダーゼを作用させることを特徴とす
る総ビリルビンの定量法に関する。間接型ビリルビン量
は総ビリルビン量から直接型及び非結合型ビリルビン量
を減することによシ求められる。
ダーゼを作用させることを特徴とする直接型ビリルビン
の定量法及び本ビリルビンオキシダーゼと反応促進物質
を作用させるか、又はラッカーゼ、チロシナーゼ、アス
コルビン酸オキシダーゼ又はコプリナス属菌の産生ずる
ビリルビ、ンオキシダーゼを作用させることを特徴とす
る総ビリルビンの定量法に関する。間接型ビリルビン量
は総ビリルビン量から直接型及び非結合型ビリルビン量
を減することによシ求められる。
以下本発明の定量法及び定量用組成物につき詳細に説明
すると、ビリルビンの生体液中での存在は、前記のよう
に、グルクロン酸と結合した直接型ビリルビン及びアル
ブミンと結合した間接型ビリルビンに大別され、これ以
外にも、直接型ビリルビンとして、硫酸抱台型、塩型、
非抱合非結合型などが存在する。これらを総じて本明細
書中では総ビリルビンと称する。
すると、ビリルビンの生体液中での存在は、前記のよう
に、グルクロン酸と結合した直接型ビリルビン及びアル
ブミンと結合した間接型ビリルビンに大別され、これ以
外にも、直接型ビリルビンとして、硫酸抱台型、塩型、
非抱合非結合型などが存在する。これらを総じて本明細
書中では総ビリルビンと称する。
［液室ビリルビンの定量は、ミロセシウム属菌の産生ず
るビリルビンオキシダーゼの作用によって生ずるビリル
ビンの減少又は反応生成物であるビリベルノンの増加を
測定することによシ可能である。本酵素は間接型ビリル
ビンには作用しない。
るビリルビンオキシダーゼの作用によって生ずるビリル
ビンの減少又は反応生成物であるビリベルノンの増加を
測定することによシ可能である。本酵素は間接型ビリル
ビンには作用しない。
本酵素の例としては特願昭５７−２５６１３号に示され
るミロセシウム・ベル力リアＭＴ−１（Ｍｙｒｏｔｈｅ
ｃｉｕｍｖｅｒｒｕｃａｒｉａ ＭＴ−１） 、 ＦＥ
ＲＭ−Ｐ Ａ ５９１８の生産するビリルビンオキシダ
ーゼＮ５−１があげらレルＱ本ヒリルビンメキシダーゼ
Ｎ５−１は下記の性質をもつ。
るミロセシウム・ベル力リアＭＴ−１（Ｍｙｒｏｔｈｅ
ｃｉｕｍｖｅｒｒｕｃａｒｉａ ＭＴ−１） 、 ＦＥ
ＲＭ−Ｐ Ａ ５９１８の生産するビリルビンオキシダ
ーゼＮ５−１があげらレルＱ本ヒリルビンメキシダーゼ
Ｎ５−１は下記の性質をもつ。
（リ 作用：ビリルビンを分子状酸素の存在下に酸下し
１緑色物質、淡緑色物質を経て淡紫色物質を生成するも
過酸化水素を生成しない。
１緑色物質、淡緑色物質を経て淡紫色物質を生成するも
過酸化水素を生成しない。
（２）基質特異性：直接型ビリルビンに反応する。
間接型ビリルビンには反応しない。ビリベルノン。
ヘミン、ヘマトポルフィリン、クロロフィリンにハ若干
反応する。ヘモグロビン、クロロフィル。
反応する。ヘモグロビン、クロロフィル。
ビタミンＢ＋２ＫＩｔＬ反応しない。
（３） 温度およびｐＨ安定性： ｐＨ８，０（０，
１Ｍリン酸緩衝液）、５０℃、１５分処理で９０チ以上
残存し、７０℃、１５分では失活する。３７℃、６０分
処理にあくいてｐＨ５〜ｐＨ１０，５の間で９５％以上
残存する。
１Ｍリン酸緩衝液）、５０℃、１５分処理で９０チ以上
残存し、７０℃、１５分では失活する。３７℃、６０分
処理にあくいてｐＨ５〜ｐＨ１０，５の間で９５％以上
残存する。
（４）至適温度＝４０℃付近。
（５） 至適ｐＨ二 ｐＨ８，０付近。
（６）分子量：約５２，０００（グル濾過法）（７）等
電点：ＰＩ＝４．１ （８） 金属イメンの影響二Ｆ２：により著しく阻害
される。
電点：ＰＩ＝４．１ （８） 金属イメンの影響二Ｆ２：により著しく阻害
される。
（９）阻害剤等の影響ニジアン化カリウム、アジ化ナト
リウム、チオ尿素によって阻害される。
リウム、チオ尿素によって阻害される。
α０ 可視部吸収： ３７５ ｎｍおよび４６０ ｎｍ
付近に吸収極大がない。
付近に吸収極大がない。
直接型ビリルビンの定量法について、ビリルビンオキシ
ダーゼＮ５−１を用いた場合を例として説明する。すな
わち１本酵素０．１〜１．０単位を含む０、１ Ｍ ）
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，４）３＋＋＋Ｊと検液１００
μｔを３７℃で反応させ、ビリルビンの減少を４４０
ｎｍの吸収の減少から、あるいは反応で生じたビリベル
ジン、の増加を３３０ ｎｍ又は３８０ ｎｍの吸収の
増大、から測定する。検液として標準のビリルビン溶液
（試薬ビリルビンをアルカリ水溶液に溶解後ｐＨ８，４
に調整したもの）を使用した場合の反応前、後の吸収パ
ターンの変化を第１図に示す。ビリルビンの最大吸収波
長は４４０ ｎｍ付近にあり９反応の結果生ずるビリベ
ルジンは３３０ｎｍ及び３８０ ｎｍ付近に最大吸収波
長が存在する。同図かられかるように、３３０ｎｍ又は
３８０ ｎｍの吸収の変化による測定は１分子吸光係数
がビリルビンのもっ４４０ ｎｍの吸収の半分以下であ
シ、感度が低いため、正確な測定には好ましくない。
ダーゼＮ５−１を用いた場合を例として説明する。すな
わち１本酵素０．１〜１．０単位を含む０、１ Ｍ ）
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，４）３＋＋＋Ｊと検液１００
μｔを３７℃で反応させ、ビリルビンの減少を４４０
ｎｍの吸収の減少から、あるいは反応で生じたビリベル
ジン、の増加を３３０ ｎｍ又は３８０ ｎｍの吸収の
増大、から測定する。検液として標準のビリルビン溶液
（試薬ビリルビンをアルカリ水溶液に溶解後ｐＨ８，４
に調整したもの）を使用した場合の反応前、後の吸収パ
ターンの変化を第１図に示す。ビリルビンの最大吸収波
長は４４０ ｎｍ付近にあり９反応の結果生ずるビリベ
ルジンは３３０ｎｍ及び３８０ ｎｍ付近に最大吸収波
長が存在する。同図かられかるように、３３０ｎｍ又は
３８０ ｎｍの吸収の変化による測定は１分子吸光係数
がビリルビンのもっ４４０ ｎｍの吸収の半分以下であ
シ、感度が低いため、正確な測定には好ましくない。
次に総ビリルビンの定量法について詳細に説明する。前
記のミロセシウム属菌の生産するビリルビンオキシダー
ゼＮ５−１はアルブミンと結合した間接型ビリルビンに
は作用しない。総ビリルビンを定量するには直接型１間
接型などのすべてのビリルビンを測定する必要がある。
記のミロセシウム属菌の生産するビリルビンオキシダー
ゼＮ５−１はアルブミンと結合した間接型ビリルビンに
は作用しない。総ビリルビンを定量するには直接型１間
接型などのすべてのビリルビンを測定する必要がある。
本発明者らはビリルビンオキシダーゼＮ５−１による総
ビリルビンの定量法について研究した結果、意外にも界
面活性剤。
ビリルビンの定量法について研究した結果、意外にも界
面活性剤。
芳香族カルボン酸、サルファ剤又はプロテアーゼか反応
系に共存させることにより１間接型ビリルビンに作用し
て総ビリルビンの定量が可能となることを見出した。こ
れら添加剤がどのような作用をもっているか明らかでな
いが、いずれにしてもビリルビンオキシダーゼＮ５−１
と間接型ビリルビンの反応を促進させる働きがある。従
ってここではこれら添加剤を反応促進物質という。これ
ら反応促進物質の具体的な例としては、界面活性剤とし
てショ糖脂肪酸エステル、胆汁酸塩、ドデシル硫酸塩、
ｐ −）ルエンスルホン酸、セチルヒリシニウムクロ
ライド、ノニルフェノールエトキシレート系、ポリメキ
シエチレンーポリ方キシプロピレン縮合物系など、芳香
族カルボン酸としてはサリチル酸−、スルホサリチル酸
など、サルファ剤としてはスルファニルアミド、アセト
スルファミンナトリウムなど、プロテアーゼとしてはプ
ロナーゼＰ（科研化学製）などがあげられる０ これら反応促進物質の効果を第１表に示す。すなわち、
下記組成の反応液を３７℃で反応させ。
系に共存させることにより１間接型ビリルビンに作用し
て総ビリルビンの定量が可能となることを見出した。こ
れら添加剤がどのような作用をもっているか明らかでな
いが、いずれにしてもビリルビンオキシダーゼＮ５−１
と間接型ビリルビンの反応を促進させる働きがある。従
ってここではこれら添加剤を反応促進物質という。これ
ら反応促進物質の具体的な例としては、界面活性剤とし
てショ糖脂肪酸エステル、胆汁酸塩、ドデシル硫酸塩、
ｐ −）ルエンスルホン酸、セチルヒリシニウムクロ
ライド、ノニルフェノールエトキシレート系、ポリメキ
シエチレンーポリ方キシプロピレン縮合物系など、芳香
族カルボン酸としてはサリチル酸−、スルホサリチル酸
など、サルファ剤としてはスルファニルアミド、アセト
スルファミンナトリウムなど、プロテアーゼとしてはプ
ロナーゼＰ（科研化学製）などがあげられる０ これら反応促進物質の効果を第１表に示す。すなわち、
下記組成の反応液を３７℃で反応させ。
反応開始後３分間の４４０ ’ｎｍの吸収の減少を測定
し、これを１分間当りに補正した値を同表に示した。な
お基質として用いた間接型ビリルビ／はディト社製のビ
リルビンコントロールである００、 ］、 Ｍ ）リス
塩酸緩衝液（ｐＨ８，４） ３ｍｌビリルビンコ
、ントロー ル（２０ｍ９／ｄ７り２０ ｔｔｔビリル
ビンメキシダーゼＮ５−１ （１５ｕΔｉ） ２
０μを反応促進物質（１０チ水溶液） ５０ｔｔｔ（
タタしプロナーゼＰは０．１９ｂ水溶液）第 １
表 第１表かられかるように９反応促進物質として特に好ま
しいのはコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム
、サリチル酸である。これら反応促進物質の反応液中で
の好適な濃度は、ドデシル硫酸ナトリウム及びコール酸
ナトリウムを例として説明すると、第２表に示す通りで
ある。なお方法は前記第１表の方法に準じて行った。
し、これを１分間当りに補正した値を同表に示した。な
お基質として用いた間接型ビリルビ／はディト社製のビ
リルビンコントロールである００、 ］、 Ｍ ）リス
塩酸緩衝液（ｐＨ８，４） ３ｍｌビリルビンコ
、ントロー ル（２０ｍ９／ｄ７り２０ ｔｔｔビリル
ビンメキシダーゼＮ５−１ （１５ｕΔｉ） ２
０μを反応促進物質（１０チ水溶液） ５０ｔｔｔ（
タタしプロナーゼＰは０．１９ｂ水溶液）第 １
表 第１表かられかるように９反応促進物質として特に好ま
しいのはコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム
、サリチル酸である。これら反応促進物質の反応液中で
の好適な濃度は、ドデシル硫酸ナトリウム及びコール酸
ナトリウムを例として説明すると、第２表に示す通りで
ある。なお方法は前記第１表の方法に準じて行った。
第 ２ 表
第２表から、ドデシル硫酸ナトリウムの場合は反応液中
で０．０５〜０．１％の濃度が、又コール酸ナトリウム
の場合は０．５〜０．７チの濃度が好適であることがわ
かる。
で０．０５〜０．１％の濃度が、又コール酸ナトリウム
の場合は０．５〜０．７チの濃度が好適であることがわ
かる。
本発明の方法において総ビリルビンを定量する方法とし
ては、前記ミロセシウム属菌の産生ずるビリルビンオキ
シダーゼに反応促進物質を併用する方法に加え、コゾリ
ナス属菌の生産するビリルビンオキシダーゼあるいはラ
ッカーゼ、チロシナーゼ又はアスコルビン酸オキシダー
ゼを利用した方法が提供できる。ラッカーゼ、チロシナ
ーゼ。
ては、前記ミロセシウム属菌の産生ずるビリルビンオキ
シダーゼに反応促進物質を併用する方法に加え、コゾリ
ナス属菌の生産するビリルビンオキシダーゼあるいはラ
ッカーゼ、チロシナーゼ又はアスコルビン酸オキシダー
ゼを利用した方法が提供できる。ラッカーゼ、チロシナ
ーゼ。
アスコルビン酸オキシダーゼはすべて公知の酵素である
が、それらがビリルビンに作用することは知られていな
い。これらの酵素を用いた総ビリルビンの定量法は前記
ビリルビンオキシダーゼの場合に従って行えばよ′い。
が、それらがビリルビンに作用することは知られていな
い。これらの酵素を用いた総ビリルビンの定量法は前記
ビリルビンオキシダーゼの場合に従って行えばよ′い。
この場合１反応促進物質はなくてもよいが、より反応を
すみやかに行うために添加するのが望ましい。
すみやかに行うために添加するのが望ましい。
本発明の方法に使用するビリルビン定量用試薬組成物に
ついて説明する。試薬組成物に含まれる酵素量はビリル
ビンオキシダーゼ活性と゛してビリルビンメキシダーゼ
、チロシナーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼの場合は
０．０１〜１．０単位であシュラッカーゼの場合は０．
２〜２０ミリ単位であるが、測定時間に応じて適宜調節
すればよい。反応促進物質は例えばドデシル硫酸ナトリ
ウムの場合は反応液中で０．０２％〜０．２ ％ 、好
ましくは０．０５〜０．１％、コール酸ナトリウムの場
合は同じ＜０．１〜１．０％、好ましくは０．５〜０．
７％である。その他緩衝液、醇素の安定剤などは必要に
応じて加えればよい。
ついて説明する。試薬組成物に含まれる酵素量はビリル
ビンオキシダーゼ活性と゛してビリルビンメキシダーゼ
、チロシナーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼの場合は
０．０１〜１．０単位であシュラッカーゼの場合は０．
２〜２０ミリ単位であるが、測定時間に応じて適宜調節
すればよい。反応促進物質は例えばドデシル硫酸ナトリ
ウムの場合は反応液中で０．０２％〜０．２ ％ 、好
ましくは０．０５〜０．１％、コール酸ナトリウムの場
合は同じ＜０．１〜１．０％、好ましくは０．５〜０．
７％である。その他緩衝液、醇素の安定剤などは必要に
応じて加えればよい。
以下９本発明で使用する酵素のｌ方性測定法、試験例、
並に実施例を説明する。
並に実施例を説明する。
ビリルビンオキシダーゼ活性測定法
エチレンレアミン四酢酸１ ｍＭを含む０．２Ｍ−トリ
ス塩酸緩衝液２５０ｍ１に試薬ビリルビン（和光紬薬製
）５〜を溶解し、この２ ｍｌと酵素液０．２ ｍｌ！
を３７℃で反応させ４４０ ｎｍの吸光度の減少を測定
する。１分間に１マイクロモルのビリルビンを酸化する
酵素量を１単位とする。
ス塩酸緩衝液２５０ｍ１に試薬ビリルビン（和光紬薬製
）５〜を溶解し、この２ ｍｌと酵素液０．２ ｍｌ！
を３７℃で反応させ４４０ ｎｍの吸光度の減少を測定
する。１分間に１マイクロモルのビリルビンを酸化する
酵素量を１単位とする。
試験例 ｌ ビリルビンオキシダーゼＮ５−１の調製ミ
ロセシウム・ベル力リア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍｖｅ
ｒｒｕｃａｒｉａ） ＭＴ−１、ＦＥＲＭ−Ｐ Ｌ ５
９１８株をグルコース・ジャガイモ培地に培養し、ビリ
ルビンオキシダーゼＭＳ−１−を含む培養液を得た。該
培養液を順次硫安塩析、透析、活性炭処理、 ＱＡＥ−
セファデックスＡ−５０カラムクロマトグラフィー、限
外濾過及びセファデックスＧ−Ｚｏｏカラムクロマトグ
ラフ１−を行い精製ビリルビンオキシダーゼＭＳ−１を
得た。本標品はポリアクリルアミドゲルディスク電気泳
動的に単一であった。
ロセシウム・ベル力リア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍｖｅ
ｒｒｕｃａｒｉａ） ＭＴ−１、ＦＥＲＭ−Ｐ Ｌ ５
９１８株をグルコース・ジャガイモ培地に培養し、ビリ
ルビンオキシダーゼＭＳ−１−を含む培養液を得た。該
培養液を順次硫安塩析、透析、活性炭処理、 ＱＡＥ−
セファデックスＡ−５０カラムクロマトグラフィー、限
外濾過及びセファデックスＧ−Ｚｏｏカラムクロマトグ
ラフ１−を行い精製ビリルビンオキシダーゼＭＳ−１を
得た。本標品はポリアクリルアミドゲルディスク電気泳
動的に単一であった。
試験例 ２ コグリナス属菌の産するビリルビンオキシ
ダーゼの調製 コプリナス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅ
ｒｅｕｓ ） ＩＦ０８３７１株をポテト・グルコース
培地に培養し。
ダーゼの調製 コプリナス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅ
ｒｅｕｓ ） ＩＦ０８３７１株をポテト・グルコース
培地に培養し。
ビリルビンオキシダーゼ活性を含む培養液を得た。
−スカラムクロマトグラフィー、 ＤＥＡＥ−セファロ
ースカラムクロマトグラフィー、限外濾過、セファデッ
クスＧ−１００カラムクロマトグラフイーを行いｆｆ１
ｌ’リルビンオキシダーゼヲ得り。
ースカラムクロマトグラフィー、限外濾過、セファデッ
クスＧ−１００カラムクロマトグラフイーを行いｆｆ１
ｌ’リルビンオキシダーゼヲ得り。
試験例 ３ ポリポラス属菌″の産するラッカーゼの調
製 ポリポラス・ペルシカラ−（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｖｅ
ｒｓｉｃｏｌｏｒ ）ＩＦｏ ９７９１株をグルコース
、Ｌ−アスパラギン。
製 ポリポラス・ペルシカラ−（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｖｅ
ｒｓｉｃｏｌｏｒ ）ＩＦｏ ９７９１株をグルコース
、Ｌ−アスパラギン。
ＤＬ−フェニルアラニン、アデニン、チアミンおよび無
機塩を含有する培地に培養しラッカーゼ活性、を含む培
養液を得た。該培養液を順次、硫安塩析。
機塩を含有する培地に培養しラッカーゼ活性、を含む培
養液を得た。該培養液を順次、硫安塩析。
透析、限外濾過、 ＤＥＡＥ−七フｒデックスＡ−５０
カラムクロマトグラフィー、限外濾過、及びセファデッ
クスＧ −１００カラムクロマトグラフイーを行い精製
標品を得た。本標品はディスク電気泳動的に単一であっ
た。
カラムクロマトグラフィー、限外濾過、及びセファデッ
クスＧ −１００カラムクロマトグラフイーを行い精製
標品を得た。本標品はディスク電気泳動的に単一であっ
た。
試験例 ４ マツシュルーム起源のチロシナーゼの調製
シグマ社製チロシナーゼ（ブレイドｍ）を用い。
これをさらにＤＥＡＥ−セファデックスＡ −５０カラ
ムクロマトグラフイー、ハイドロキシアノｚｐイトカラ
ムクロマトグラフィー、 ＤＥＡＥ−セファデックスＡ
−５０カラムクロマトグラフィーを行い精製標品を得た
。本標品はディスク電気泳動的に約９０１の純度であっ
た。
ムクロマトグラフイー、ハイドロキシアノｚｐイトカラ
ムクロマトグラフィー、 ＤＥＡＥ−セファデックスＡ
−５０カラムクロマトグラフィーを行い精製標品を得た
。本標品はディスク電気泳動的に約９０１の純度であっ
た。
試験例 ５ ウルシラッカーゼの調製
ウルシの汁液を塩析、透析、限外濾過後セファデックス
Ｇ −２００カラムクロマトグラフイーを行い部分精製
標品を得た。
Ｇ −２００カラムクロマトグラフイーを行い部分精製
標品を得た。
試験例 ６ 各種酵素の基質特異性
本発明の方法に用いられる各種酵素の基質特異性を測定
した。酵素は試験例１〜４で調製したビリルビンオキシ
ダーゼＮＳ−１（Ａと略称、以下同様）、コプリナス属
菌の生産するビリルビンオキシダーゼ（Ｂ） 、ポリポ
ラス属菌の生産するラッカーゼ（Ｃ） 、マツシュルー
ム起源のチロシナーゼ（Ｅ）ならびにウルシ起源のラッ
カーゼ（Ｄ）及びきゅうり起源のアスコルビン酸オキシ
ダーゼ（東洋紡績゛製、グレイドＩＩＩ ） ＣＦ）を
用いた。第３表に示した７ｍＭ＃度の各種基質と上記酵
素の一定量とを３７℃で反応させ酵素活性を測定した。
した。酵素は試験例１〜４で調製したビリルビンオキシ
ダーゼＮＳ−１（Ａと略称、以下同様）、コプリナス属
菌の生産するビリルビンオキシダーゼ（Ｂ） 、ポリポ
ラス属菌の生産するラッカーゼ（Ｃ） 、マツシュルー
ム起源のチロシナーゼ（Ｅ）ならびにウルシ起源のラッ
カーゼ（Ｄ）及びきゅうり起源のアスコルビン酸オキシ
ダーゼ（東洋紡績゛製、グレイドＩＩＩ ） ＣＦ）を
用いた。第３表に示した７ｍＭ＃度の各種基質と上記酵
素の一定量とを３７℃で反応させ酵素活性を測定した。
結果を第１表に示す。
同表には各基質に対する最高の活性を示す酵素を１００
とした相対活性で表示した。
とした相対活性で表示した。
第 ３ 表
第３表に示すように、ビリルビンに対する作用はビリル
ビンオキシダーゼが最も強力であったが。
ビンオキシダーゼが最も強力であったが。
他の酵素にも弱いながら反応性が認められた。
実施例 １
ビリルビンオキシダーゼＮ５−１による各ａビｌＪルピ
ンへの作用をみた。非抱合非結合型ビリルビンは和光紬
薬製の試薬ビリルビンを１間接型ビリルビンはディト社
製のビリルビンコン）ＣＩ−ルを用いた。抱合型ビリル
ビンは本発明者らが以下の方法で調製したものを使用し
た。すなわち、イヌの胆汁１０ｍ１を２倍量のクロロホ
ルムで抽出し、水ｉを濃縮後セファデックスＧ−２５デ
ル瀘過によシ精製標品を得た。本標品についてビリルビ
ンＢテスト「和光」（和光紬薬製）を用いてノアゾ反応
を行ったところ９間接型ビリルビンは認められなかった
。ビリルビンオキシダーゼＮ５−１０．３ 単位。
ンへの作用をみた。非抱合非結合型ビリルビンは和光紬
薬製の試薬ビリルビンを１間接型ビリルビンはディト社
製のビリルビンコン）ＣＩ−ルを用いた。抱合型ビリル
ビンは本発明者らが以下の方法で調製したものを使用し
た。すなわち、イヌの胆汁１０ｍ１を２倍量のクロロホ
ルムで抽出し、水ｉを濃縮後セファデックスＧ−２５デ
ル瀘過によシ精製標品を得た。本標品についてビリルビ
ンＢテスト「和光」（和光紬薬製）を用いてノアゾ反応
を行ったところ９間接型ビリルビンは認められなかった
。ビリルビンオキシダーゼＮ５−１０．３ 単位。
０．１Ｍ−）！Ｊス塩酸緩衝ｇ、３ ｍｌから成る定量
用試薬組成物と各種濃度のビリルビン１００μｔを。
用試薬組成物と各種濃度のビリルビン１００μｔを。
３７℃、３０分反応させた後、４４０ｎｍの吸収の減少
を測定した。
を測定した。
結果を第２図に示す。同図中で（−Ｄ−）は間接型ビリ
ルビンを、（十）は非抱合非結合票ビリルビ／を、（★
）は抱合型ビリルビンをそれぞれ表わす。同図かられか
るように、ビリルビンオキシダーゼＮ５−１は間接型の
ビリルビンにはほとんど作用しなかった０又、抱合型、
非抱合非結合型ビリルビンには反応し、しかもよい＠線
性が得られた。
ルビンを、（十）は非抱合非結合票ビリルビ／を、（★
）は抱合型ビリルビンをそれぞれ表わす。同図かられか
るように、ビリルビンオキシダーゼＮ５−１は間接型の
ビリルビンにはほとんど作用しなかった０又、抱合型、
非抱合非結合型ビリルビンには反応し、しかもよい＠線
性が得られた。
実施例 ２
ビリルビンオキシダーゼＭＳ−１と反応促進物質を用い
１間接型ビリルビン定量の検量線を求めた。
１間接型ビリルビン定量の検量線を求めた。
反応促進物質としてはドデシル硫酸ナトリウムを使用し
た。すなわち、ビリルビンオキシダーゼＮ５−１０．３
単位、ドデシル硫酸ナトリウム３ｍ９゜０．１Ｍ−トリ
ス塩酸緩衝液３ ｍｌから成る定量用試薬組成物に各種
濃度のビリルビンコントロール１００μｔを反応させ４
４０ ｎｍの吸収の減少を測定した。結果を第３図に示
す。ビリルビン濃度と吸光度の間にはよい直線性が得ら
れた。
た。すなわち、ビリルビンオキシダーゼＮ５−１０．３
単位、ドデシル硫酸ナトリウム３ｍ９゜０．１Ｍ−トリ
ス塩酸緩衝液３ ｍｌから成る定量用試薬組成物に各種
濃度のビリルビンコントロール１００μｔを反応させ４
４０ ｎｍの吸収の減少を測定した。結果を第３図に示
す。ビリルビン濃度と吸光度の間にはよい直線性が得ら
れた。
実施例 ３
実施例２のビリルビンオキシダーゼＮ５−１に代えてコ
プリナス属菌のビリルビンオキシダーゼ（０，０１単位
）、ポリポラス属菌のラッカーゼ（０，４ミ！ｊ単位）
、ウルシ起源のラッカーゼ（４ミリ単位）を用い実施例
２と同様に操作した。その結果検量線は実施例２と同一
であった。
プリナス属菌のビリルビンオキシダーゼ（０，０１単位
）、ポリポラス属菌のラッカーゼ（０，４ミ！ｊ単位）
、ウルシ起源のラッカーゼ（４ミリ単位）を用い実施例
２と同様に操作した。その結果検量線は実施例２と同一
であった。
実施例 ４
ヒリルビン定重用試薬ｍ成物中のビリルビンオキシダー
ゼＭＳ−１の必要量を求めた。すなわち。
ゼＭＳ−１の必要量を求めた。すなわち。
０．０７５単位、０．１５単位、０．２単位又は０．３
単位のビリルビンオキシダーゼＭＳ−１および２０％コ
−ル酸ナトリウム１００μｔと０．１Ｍ−）リス塩酸緩
衝液（ｐＨ８，４）３ ｍｌから成る組成物をビリルビ
ンコントロール水溶液（２０ｍ９７ｄｌ！ ） １００
μｔと３７℃で反応させ、４４０ｎｍの減少を経時的に
測定した。結果を第４□□□に示す。３０分で反応を完
了させるためには約０．１５単位以上あればよいことが
わかった。
単位のビリルビンオキシダーゼＭＳ−１および２０％コ
−ル酸ナトリウム１００μｔと０．１Ｍ−）リス塩酸緩
衝液（ｐＨ８，４）３ ｍｌから成る組成物をビリルビ
ンコントロール水溶液（２０ｍ９７ｄｌ！ ） １００
μｔと３７℃で反応させ、４４０ｎｍの減少を経時的に
測定した。結果を第４□□□に示す。３０分で反応を完
了させるためには約０．１５単位以上あればよいことが
わかった。
実施例 ５
血清１７検体中の総ビリルビン及び直接型ビリルビンを
定量した０定量用試薬組成物としては次のもの使用した
。
定量した０定量用試薬組成物としては次のもの使用した
。
（１）＠液室ビリルビン定量用試薬組成物下記を含むト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，４） ３ ｍｌビリルビンメ
キシダーゼＭＳ−１０，３単位（２）総ビリルビン定量
用試薬組成物 下記を含むトリス塩−酸緩衝ｆＬ（ｐＨ８，４） ３
ｍｌビリルビンオキシダーゼＮ５−１ ０．３４ＩＱコ
ール酸ナトリウム ０．６％（３） ブラン
ク用 上記（２）から酵素を除いたもの上記キットに各
種検体１００μｔを添加し、３７℃、３０分反応後、４
４０ｎｍの吸収の減少を測定し、検量線よりビリルビン
の含量を求めた。なお対照として、 ；ｉＵ光純紬薬ビ
リルビン−Ｂテスト和光を使用したジアゾ法による定量
を実施した。本実施例とジアゾ法による測定結果の関係
を第５図及び第６図に示す。第５図は総ビＩＪ ）レヒ
゛ンを、第６図は直接型ビリルビンの定量結果をそれぞ
れ示が認められた０ 実施例 ６ 試験例３で調製したラッカーゼを用いて血清中の総ビリ
ルビンを定量した。試薬組成物としては次のものを使用
した０ （１）総ビリルビン泥倉用試薬組成物 下記を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７，０） ３ ｍｌラ
ッ カ − ゼ ０．
０１報コール酸ナトリウム ０．６ ％（２）
ブランク用試薬組成物 上記（１）からラッカーゼを除いたもの上記試薬組成物
に血清サンプル１００μｔを添加し３７℃、３０分反応
後、４４０ｎｍの吸収の減少を測定し、検量線よりビリ
ルビンの含量を求めた。
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，４） ３ ｍｌビリルビンメ
キシダーゼＭＳ−１０，３単位（２）総ビリルビン定量
用試薬組成物 下記を含むトリス塩−酸緩衝ｆＬ（ｐＨ８，４） ３
ｍｌビリルビンオキシダーゼＮ５−１ ０．３４ＩＱコ
ール酸ナトリウム ０．６％（３） ブラン
ク用 上記（２）から酵素を除いたもの上記キットに各
種検体１００μｔを添加し、３７℃、３０分反応後、４
４０ｎｍの吸収の減少を測定し、検量線よりビリルビン
の含量を求めた。なお対照として、 ；ｉＵ光純紬薬ビ
リルビン−Ｂテスト和光を使用したジアゾ法による定量
を実施した。本実施例とジアゾ法による測定結果の関係
を第５図及び第６図に示す。第５図は総ビＩＪ ）レヒ
゛ンを、第６図は直接型ビリルビンの定量結果をそれぞ
れ示が認められた０ 実施例 ６ 試験例３で調製したラッカーゼを用いて血清中の総ビリ
ルビンを定量した。試薬組成物としては次のものを使用
した０ （１）総ビリルビン泥倉用試薬組成物 下記を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７，０） ３ ｍｌラ
ッ カ − ゼ ０．
０１報コール酸ナトリウム ０．６ ％（２）
ブランク用試薬組成物 上記（１）からラッカーゼを除いたもの上記試薬組成物
に血清サンプル１００μｔを添加し３７℃、３０分反応
後、４４０ｎｍの吸収の減少を測定し、検量線よりビリ
ルビンの含量を求めた。
ナシ。対照としてビリルビンＢ−テスト「和光」を用い
たジアゾ法による定量を実施した。その結果本発明の方
法による値は１０．６ ｍ９７ｄｅであるのに対しジア
ゾ法によるそれは１１．６ ｍ？Ａｌｔであった。
たジアゾ法による定量を実施した。その結果本発明の方
法による値は１０．６ ｍ９７ｄｅであるのに対しジア
ゾ法によるそれは１１．６ ｍ？Ａｌｔであった。
実施例 ７
実施例５の総ビリルビン定量用試薬組成物のうチ、ビリ
ルビンオキシダーゼＮ５−１０．３単位の代りに試験例
３で得られたラッカービ０．０１単位を用い血清中の総
ビリルビン及び直接型ビリルビンを定食した。その結果
総ビリルビンは８．８１吟儒、直接型ビリルビンは６．
２ ｒＩｖｄｌＶであり、同検体についてジアゾ法によ
る定量結果はそれぞれ９．２ ｒＩｖｄｅ 。
ルビンオキシダーゼＮ５−１０．３単位の代りに試験例
３で得られたラッカービ０．０１単位を用い血清中の総
ビリルビン及び直接型ビリルビンを定食した。その結果
総ビリルビンは８．８１吟儒、直接型ビリルビンは６．
２ ｒＩｖｄｌＶであり、同検体についてジアゾ法によ
る定量結果はそれぞれ９．２ ｒＩｖｄｅ 。
５、５ ｍ９７ｄｉであツタ。
第１図は本発明に使用する酵素をビリルビンに作用させ
たときの吸収・ぐターンの変化を表わす図である。 第２図は本発明の方法による各種ビリルビンの検量線を
表わす図であり、第３図は間接型ビリルビンの検量線を
表わす図である。 第４図は本発明の試薬組成物中のビリルビンオキシダー
ゼＮ５−１の量と反応速度を表わす図である。 第５図は本発明の方法とジアゾ法による血清中総ビリル
ビンの定量結果の関係を表わす図であり。 第６図は同じく直接型ビリルビンの定量結果の関係を表
わす図である。 特許 出願人 天野製薬株式会社 代 理 人 久 高 将 信（外−名
） 遣長 （１兜） 第２図 ビリルビン１度 （′ｒｎｔ／、＆） 第３図 ５７０− 第４図 反爪・時間 （介） 第５０ 第６５！Ｉ ビリルビンオキシダーゼ漁Ｃ’ｎｒ／ｄｌ）手続補正音 昭和５８年ｌＯ月２７日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 １、事件の表示 特 願 昭５７−１２７，６３２号 ２発明の名称 ビリルビンの定量法及びその定量用試薬組成物３、補正
をする者 事件との関係 特許出願人 天野製薬株式会社 ４、代理人 東京Ｓ港区虎ノ門１−１−１２．虎ノ門ピル５０５号（
６２１７）久 高 将 信（外−名）５、補正の
対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 特願昭５７−１２７，６３２号９手続補正書（１）
明細書中の次の字句を夫々補正します。 ト （２） 明細書の次の個所に夫々字句を挿入します。 【 習 （３）明細書第１７頁第１８行の、「を得た。」のあと
に次の文を挿入します、。 ［本酵素の性質は前述ミロセシウム属菌産生のビリルビ
ンオキシダーゼＮ５−１’に似ているが、至適温度は３
０Ｃ付近９等電点はａ８であった。 」（４） 明細
書牙８頁第１行の、「及び非結合型」の字句を抹消しま
す。 −以 上 −
たときの吸収・ぐターンの変化を表わす図である。 第２図は本発明の方法による各種ビリルビンの検量線を
表わす図であり、第３図は間接型ビリルビンの検量線を
表わす図である。 第４図は本発明の試薬組成物中のビリルビンオキシダー
ゼＮ５−１の量と反応速度を表わす図である。 第５図は本発明の方法とジアゾ法による血清中総ビリル
ビンの定量結果の関係を表わす図であり。 第６図は同じく直接型ビリルビンの定量結果の関係を表
わす図である。 特許 出願人 天野製薬株式会社 代 理 人 久 高 将 信（外−名
） 遣長 （１兜） 第２図 ビリルビン１度 （′ｒｎｔ／、＆） 第３図 ５７０− 第４図 反爪・時間 （介） 第５０ 第６５！Ｉ ビリルビンオキシダーゼ漁Ｃ’ｎｒ／ｄｌ）手続補正音 昭和５８年ｌＯ月２７日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 １、事件の表示 特 願 昭５７−１２７，６３２号 ２発明の名称 ビリルビンの定量法及びその定量用試薬組成物３、補正
をする者 事件との関係 特許出願人 天野製薬株式会社 ４、代理人 東京Ｓ港区虎ノ門１−１−１２．虎ノ門ピル５０５号（
６２１７）久 高 将 信（外−名）５、補正の
対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 特願昭５７−１２７，６３２号９手続補正書（１）
明細書中の次の字句を夫々補正します。 ト （２） 明細書の次の個所に夫々字句を挿入します。 【 習 （３）明細書第１７頁第１８行の、「を得た。」のあと
に次の文を挿入します、。 ［本酵素の性質は前述ミロセシウム属菌産生のビリルビ
ンオキシダーゼＮ５−１’に似ているが、至適温度は３
０Ｃ付近９等電点はａ８であった。 」（４） 明細
書牙８頁第１行の、「及び非結合型」の字句を抹消しま
す。 −以 上 −
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ｍ検液にビリルビンメキシダーゼ、ラッカーゼ、
チロシナーゼ又はアスコルビン酸オキシダーゼより選ば
れる酵素を作用せしめ、それにょシ生ずるビリルビンの
変化を光学的に測定することを特徴とする総ビリルビン
又は直接型ビリルビンの定量法。 ２ ビリルビンオキシダーゼがミロセシウム属に属する
菌株の産生ずる酵素である特許請求の範囲第１項記載の
直接型ビリルビンの定量法。 ３ ビリルビンオキシダーゼがミロセシウム属ニ属する
菌株の産生ずる酵素であシ、これと反応促進物質とを被
検液に作用せしめる特許請求の範囲第１項記載の総ビリ
ルビンの定量法。 ４ ビリルビンオキシダーゼがコプリナス属に属する菌
株の産生ずる酵素である特許請求の範囲第１項記載の総
ビリルビンの定量法。 ５ ラッカーゼがポリポラス属に属する菌株の産生する
酵素又−はうるし起源の酵素である特許請求の範囲第１
項記載の総ビリルビンの定量法。 ６ チロシナーゼがマツシュルーム起源の酵素である特
許請求の範囲第１項記載の総ビリルビンの定量法。 ７ アスコルビン酸オキシダーゼがキュウリ起源の酵素
である特許請求の範囲第１項記載の総ビリルビンの定量
法。 ８ コプリナス属に属する菌株の産生ずるビリルビンオ
キシダーゼあるいはラッカーゼ、チロシナーゼ又はアス
コルビン酸オキシダーゼと反応促進物質とを被検液に作
用せしめる特許請求の範囲第１項又は第４項乃至第７項
のいずれかに記載の総ビリルビンの定量法。 ９ 反応促進物質が界面活性剤、芳香族カルボン酸、サ
ルファ剤又はプロテアーゼからなる群よシ選ばれる特許
請求の範囲第３項又は第８項記載の総ビリルビンの定量
法。 ｌＯ少くトモヒリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ。 チロシナーゼ又はアスコルビン酸メキシダーゼを含んで
成ることを特徴とする総ビリルビン又は直接型ビリルビ
ン定量用試薬組成物。 １１ ビリルビンオキシダーゼがミロセシウム属ニ属
する菌株の産生ずる酵素である特許請求の範囲第１θ項
記載の直接型ビリルビン定量用試薬組成物０ １２ ビリルビンメキシダーゼがミロセシウム属ニ属
する菌株の産生ずる酵素であり、これと反応促進物質と
を含んで成る特許請求の範囲第１０項記載の総ビリルビ
ン定量用試薬組成物０ １３ ビリルビンオキシダーゼがコグリナス属に属す
る菌株の産生ずる酵素である特許請求の範囲−第１０項
記載の総ビリルビン定量用試薬組成物◇１４ ラッカ
ーゼがポリポラス属に属する菌株の産生ずる酵素又はう
るし起源の酵素である特許請求の範囲第１θ項記載の総
ビリルビン定量用試薬組成物。 １５ チロシナーゼがマツシュルーム起源の酵素であ
る特許請求の範囲第１０項記載の総ビリルビン定量用試
薬組成物。 １６ アスコルビン酸オキシダーゼがキュウリ起源の
酵素である特許請求の範囲第１０項記載の総ビリルビン
定量用試薬組成物。 １７ コゾリナス属に属する菌株の産生ずるビリルビ
ンメキシダーゼあるいはラッカーゼ、チロシナーゼ又は
アスコルビン酸オキシダーゼと反応促進物質とを含んで
成る特許請求の範囲第１Ｏ項又は第１３項乃至第１６項
のいずれかに記載の総ビリルビン定量用試薬組成物。 １８ 反応促進物質が界面活性剤、芳香族カルゲン酸
、サルファ剤又はプロテアーゼからなる群より選ばれる
特許請求の範囲第１２項又は第１７項記載の総ビリルビ
ン定量用試薬組成物。
Priority Applications (15)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12763282A JPS5917999A (ja) | 1982-07-23 | 1982-07-23 | ビリルビンの定量法及びその定量用試薬組成物 |
| DE3249743A DE3249743C2 (ja) | 1982-02-18 | 1982-10-20 | |
| DE19823239236 DE3239236A1 (de) | 1982-02-18 | 1982-10-20 | Verfahren zur quantitativen bestimmung von physiologischen komponenten in biologischen fluessigkeiten oder gasen |
| FR8217632A FR2521589B1 (fr) | 1982-02-18 | 1982-10-21 | Procede pour la determination quantitative de composants physiologiques dans des fluides biologiques |
| US06/436,385 US4554249A (en) | 1982-02-18 | 1982-10-25 | Method for the quantitative determination of physiological components in biological fluids |
| CA000414104A CA1185883A (en) | 1982-02-18 | 1982-10-25 | Method for the quantitative determination of bilirubin in biological fluids |
| GB08230397A GB2115926B (en) | 1982-02-18 | 1982-10-25 | Method for the quantitative determination of physiological components in biological fluids |
| IT48544/83A IT1203658B (it) | 1982-07-23 | 1983-06-21 | Metodo per la determinazione quantitativa di componenti fisiologici in fluidi biologici |
| ES524270A ES8501444A1 (es) | 1982-07-23 | 1983-07-19 | Un metodo para la determinacion cuantitativa de bilirrubina conjugada en fluidos biologicos. |
| ES534138A ES534138A0 (es) | 1982-07-23 | 1984-07-09 | Un metodo para la determinacion cuantitativa de componentes fisiologicos en fluidos biologicos. |
| CA000464110A CA1218586A (en) | 1982-02-18 | 1984-09-26 | Method for the quantitative determination of physiological components in biological fluids |
| IT8422941A IT1213222B (it) | 1982-07-23 | 1984-10-01 | Metodo per la determinazione quantitativa di componenti fisiologici in fluidi biologici. |
| FR8419005A FR2556010B1 (fr) | 1982-02-18 | 1984-12-12 | Procede pour la determination quantitative de composants physiologiques dans des fluides biologiques |
| GB08431875A GB2152215B (en) | 1982-02-18 | 1984-12-18 | Method for the quantitative determination of physiological components in biological fluids |
| US06/749,425 US4839279A (en) | 1982-02-18 | 1985-06-27 | Method for the quantitative determination of physiological components in biological fluids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12763282A JPS5917999A (ja) | 1982-07-23 | 1982-07-23 | ビリルビンの定量法及びその定量用試薬組成物 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9993987A Division JPS62282598A (ja) | 1987-04-24 | 1987-04-24 | 総ビリルビンの定量法及び定量用試薬組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5917999A true JPS5917999A (ja) | 1984-01-30 |
| JPS6233880B2 JPS6233880B2 (ja) | 1987-07-23 |
Family
ID=14964889
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12763282A Granted JPS5917999A (ja) | 1982-02-18 | 1982-07-23 | ビリルビンの定量法及びその定量用試薬組成物 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5917999A (ja) |
| IT (1) | IT1213222B (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60151561A (ja) * | 1984-01-19 | 1985-08-09 | Nitsusui Seiyaku Kk | ビリルビンの定量方法 |
| JPS60154162A (ja) * | 1984-01-24 | 1985-08-13 | Nitsusui Seiyaku Kk | 遊離ビリルビンの定量方法 |
| JPS60178360A (ja) * | 1984-02-24 | 1985-09-12 | Fujimoto Daiagunosuteitsukusu:Kk | 総ビリルビンおよび直接ビリルビンの分別定量法 |
| EP0770688A1 (en) | 1995-10-27 | 1997-05-02 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method of quantitative determination of bilirubin and a reagent therefor |
| CN111455018A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-07-28 | 天津大学 | 含有枯草芽孢杆菌漆酶的直接胆红素检测试剂盒 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6450880U (ja) * | 1987-09-26 | 1989-03-29 |
Citations (2)
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1984
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Also Published As
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| IT8422941A0 (it) | 1984-10-01 |
| IT1213222B (it) | 1989-12-14 |
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