JPS5876100A - ラツカ−ゼの使用法 - Google Patents
ラツカ−ゼの使用法Info
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- JPS5876100A JPS5876100A JP17295981A JP17295981A JPS5876100A JP S5876100 A JPS5876100 A JP S5876100A JP 17295981 A JP17295981 A JP 17295981A JP 17295981 A JP17295981 A JP 17295981A JP S5876100 A JPS5876100 A JP S5876100A
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- Japan
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- bilirubin
- laccase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は体液中Ｏ主を水素供与体であるビリルビン、ア
スコルビン酸、尿酸、へ毫グロビンを分解する活性を有
するラッカーゼＯ使用法に関する。
スコルビン酸、尿酸、へ毫グロビンを分解する活性を有
するラッカーゼＯ使用法に関する。
さらに詳しく言えば、血清あるいは尿等Ｏ体液中の成分
を一定する系にお−て２目的酸分Ｏ測定をよ〕正確に行
なうために、＠的外Ｏ成分をラッカーゼを用いて分解す
る方法及びラッカーゼＯビリルビンを分解する性質を用
％／％良ビリルビン０ＩＩＩ定法に関するもＯである。
を一定する系にお−て２目的酸分Ｏ測定をよ〕正確に行
なうために、＠的外Ｏ成分をラッカーゼを用いて分解す
る方法及びラッカーゼＯビリルビンを分解する性質を用
％／％良ビリルビン０ＩＩＩ定法に関するもＯである。
近都、血清あるいは尿等Ｏ体液中の成分を測定する方法
として、目的成分に特異的に反応する酸化酵素（オキシ
ダーゼ）を作用させ、そＯ反応生成物としての過酸化水
素に西洋ワサビ由来Ｏ／（−オキシダーゼを作用させ、
水素供与体である色原体を酸化的発色化合物へ変換させ
る系を用いた測定法が広く普及し１日常検査に取り入れ
られている。例ＪＬｔｆコレステロール、クルコース、
ｉｓ。
として、目的成分に特異的に反応する酸化酵素（オキシ
ダーゼ）を作用させ、そＯ反応生成物としての過酸化水
素に西洋ワサビ由来Ｏ／（−オキシダーゼを作用させ、
水素供与体である色原体を酸化的発色化合物へ変換させ
る系を用いた測定法が広く普及し１日常検査に取り入れ
られている。例ＪＬｔｆコレステロール、クルコース、
ｉｓ。
リン脂質、中性脂肪、遊離脂肪酸尋の測定が主に上述の
方法によシ行なわれている。
方法によシ行なわれている。
こＯ方法は酵素反応を用いるため、特異性が良く、迅速
でかつ簡易な方法であシ１日常り検査としてＦｉ優れた
方法である。しかし検体試料と表る体液中に存在する目
的以外Ｏ成分である還元性物質、すなわちビリルビン、
アスコルビン酸、尿酸、ヘモグロビン等が水素供与体と
して作用するため。
でかつ簡易な方法であシ１日常り検査としてＦｉ優れた
方法である。しかし検体試料と表る体液中に存在する目
的以外Ｏ成分である還元性物質、すなわちビリルビン、
アスコルビン酸、尿酸、ヘモグロビン等が水素供与体と
して作用するため。
過酸化水素Ｏ検出系であるパーオキシダーゼ−水素供与
体色原体Ｏ発色反応が影４１１を受けて目的とする成分
Ｏ正確な測定値が得られない欠点を有する。特にビリル
ビン及びアスコルビン酸がその主える原因となっている
。
体色原体Ｏ発色反応が影４１１を受けて目的とする成分
Ｏ正確な測定値が得られない欠点を有する。特にビリル
ビン及びアスコルビン酸がその主える原因となっている
。
そＯえめζＯような悪影響を回避するえめＯ検討がなさ
れてき良。そＯひとりは体筐中Ｏ還元性物質と同様に１
水素供与体として作用する色原体を改良する方法である
が１期待できる程の成果はまだ認められていない。もう
ひとつは体液中Ｏ還元性物質を分解除去する方法である
。例えばビリルビンＤ場合、ａ２−過冒つ素酸で酸化す
る方法〔ジャパニーズジャーナルオブメディカルテクノ
ロジー（Ｊａｐａｎ＊ｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍ
＠１ｉｏａｘ〒＠ＯＭＯＩＯｇ７ ） ＆ｓ ０巻、３
号、、ＳＯＳページ、（１９１５１）参照〕があり、ア
スコルビン酸Ｏ場合には１強アルカリＯ条件で処理する
方法、Ｃｕ＋４−イオンや１・“イオンで前処理する方
法（％／ｊ：ｔｌｉ５６−！４？２０号参照）及びすで
に一部で実用化すれているアスコルビン酸オキシダーゼ
という酵素による反応処理法〔クリニカル ケミストリ
ー （Ｏｌｉｎｆｏａｌｏｈａｍｉｓｔｒｙ ）、２４
巻、２５０ベージ゛（１９７８）参照〕が検討されてい
る。
れてき良。そＯひとりは体筐中Ｏ還元性物質と同様に１
水素供与体として作用する色原体を改良する方法である
が１期待できる程の成果はまだ認められていない。もう
ひとつは体液中Ｏ還元性物質を分解除去する方法である
。例えばビリルビンＤ場合、ａ２−過冒つ素酸で酸化す
る方法〔ジャパニーズジャーナルオブメディカルテクノ
ロジー（Ｊａｐａｎ＊ｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍ
＠１ｉｏａｘ〒＠ＯＭＯＩＯｇ７ ） ＆ｓ ０巻、３
号、、ＳＯＳページ、（１９１５１）参照〕があり、ア
スコルビン酸Ｏ場合には１強アルカリＯ条件で処理する
方法、Ｃｕ＋４−イオンや１・“イオンで前処理する方
法（％／ｊ：ｔｌｉ５６−！４？２０号参照）及びすで
に一部で実用化すれているアスコルビン酸オキシダーゼ
という酵素による反応処理法〔クリニカル ケミストリ
ー （Ｏｌｉｎｆｏａｌｏｈａｍｉｓｔｒｙ ）、２４
巻、２５０ベージ゛（１９７８）参照〕が検討されてい
る。
しかしこれらＯ方法Ｏ目的とするもＯｒｉ、ビリルビン
あるいはアスコルビン酸ＯいづれかＯ分解Ｅｌｌられて
お）、還元性干渉物質としてＯビリルビン、アスコルビ
ン酸、尿酸、ヘモグロビン埠を単一〇処理で同時に分解
して、測定系におけるそれらＤ影響を回避する方法は知
られていない。
あるいはアスコルビン酸ＯいづれかＯ分解Ｅｌｌられて
お）、還元性干渉物質としてＯビリルビン、アスコルビ
ン酸、尿酸、ヘモグロビン埠を単一〇処理で同時に分解
して、測定系におけるそれらＤ影響を回避する方法は知
られていない。
一方１体液中に共存しているビリルビンＯ測定は、それ
自体高度な臨床的意義を有しておル１例えば肝胆道閉塞
機序（黄ｉｌｌ ＞ （り鑑別に利用されている。そＯ
測定方法として日常検査で用いられている方法は化学的
方法であシ、ジアゾスルファニル酸の工うなジアゾ、ニ
ウム塩駈用いる。いわゆるジアゾ法が主流である。一般
に緩和な条件で簡易にかつ特異的に測定できる酵業法に
ついてはビリルビンＯ場合あまり報告されていない。一
部には前述したよう表水素供与体としてのビリルビンＤ
パーオキシダーゼー水素供与体色原体発色系における干
渉作用を間接的に利用した方法があるが。
自体高度な臨床的意義を有しておル１例えば肝胆道閉塞
機序（黄ｉｌｌ ＞ （り鑑別に利用されている。そＯ
測定方法として日常検査で用いられている方法は化学的
方法であシ、ジアゾスルファニル酸の工うなジアゾ、ニ
ウム塩駈用いる。いわゆるジアゾ法が主流である。一般
に緩和な条件で簡易にかつ特異的に測定できる酵業法に
ついてはビリルビンＯ場合あまり報告されていない。一
部には前述したよう表水素供与体としてのビリルビンＤ
パーオキシダーゼー水素供与体色原体発色系における干
渉作用を間接的に利用した方法があるが。
ヒれは本来Ｏ意味でＯ酵素法とにいい難い。また％ｌ１
１昭５４−ＩＦ１１？Ｓ号に記載されているようにビリ
ルビンに特異的な耐性酵素組成物上用いる測定法もある
が、と０１５法ではビリルビンとＯ反応生成物として過
酸化水素Ｏ生成が認められる場合と賢められない場合が
ある。と記載されており、従って化学量論的に酵素反応
を論じた場合。
１昭５４−ＩＦ１１？Ｓ号に記載されているようにビリ
ルビンに特異的な耐性酵素組成物上用いる測定法もある
が、と０１５法ではビリルビンとＯ反応生成物として過
酸化水素Ｏ生成が認められる場合と賢められない場合が
ある。と記載されており、従って化学量論的に酵素反応
を論じた場合。
当該酵素が単一なもＯかどうか疑わしく、酵素法にお叶
る必須条件である均一な品質Ｏ酵素Ｏ供給という面から
問題があると考えられる。
る必須条件である均一な品質Ｏ酵素Ｏ供給という面から
問題があると考えられる。
そとで本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、ラッカー（
を用いて体液中Ｏ還元性物質を分解し。
を用いて体液中Ｏ還元性物質を分解し。
還元性物質Ｏ発色反応系へＯＢ影畳を回避する方法及び
ラッカー−Ｖを用いて体液中０ビリルビンを測定する方
法１見い出し１本発明を完成した。以下に本発明の詳細
な説明する。
ラッカー−Ｖを用いて体液中０ビリルビンを測定する方
法１見い出し１本発明を完成した。以下に本発明の詳細
な説明する。
ラッカーゼは一般に、は次式Ｏ反応を触媒する酵素（１
・１０・３・２）である。
・１０・３・２）である。
本発明に使用されるラッカー４１は、以下に示されるよ
うな性質を有するラッカーゼであれば例でもよいが、好
ましくはコリオラス（０ｏｒｌｏｌｕｓ）属由来Ｏラッ
カーゼである。本発明の説明Ｏため本酵素Ｏ代表的な性
質を述べる。
うな性質を有するラッカーゼであれば例でもよいが、好
ましくはコリオラス（０ｏｒｌｏｌｕｓ）属由来Ｏラッ
カーゼである。本発明の説明Ｏため本酵素Ｏ代表的な性
質を述べる。
（１）吸収極大４６０ｎｍｉ有するビリルビンを酸化し
、吸収極大４８０ ｎｍを有し、ビリルビンよ）４１小
さい吸光係数を有するビリベルジンに変化させ、さらに
吸収をもたない未知物質へ酸化する。
、吸収極大４８０ ｎｍを有し、ビリルビンよ）４１小
さい吸光係数を有するビリベルジンに変化させ、さらに
吸収をもたない未知物質へ酸化する。
ヒＯ時反応液中Ｏ溶存酸素を消費するが過酸化水素は生
成しない。すなわちビリルビンのもつ色調及び還元力を
消失させる。
成しない。すなわちビリルビンのもつ色調及び還元力を
消失させる。
Ｃ２） ビリルビン以外にアスコルビン酸、尿酸、へ
篭グロビン等も同時に基質となる。こＯ事実はアスコル
ビン酸のもつ還元力からの測定法、尿＃Ｏアルカリ性条
件下における２ ９ Ｓ ｎｍでＯ紫外部数１ｆｌＯ測
定、ヘモグロビン溶液の吸収スペクトル法によるメトヘ
モグロビンＯ生成尋から確認されている。さらにこれら
が基簀となった場合でも過酸化水素Ｏ生成はみられない
。
篭グロビン等も同時に基質となる。こＯ事実はアスコル
ビン酸のもつ還元力からの測定法、尿＃Ｏアルカリ性条
件下における２ ９ Ｓ ｎｍでＯ紫外部数１ｆｌＯ測
定、ヘモグロビン溶液の吸収スペクトル法によるメトヘ
モグロビンＯ生成尋から確認されている。さらにこれら
が基簀となった場合でも過酸化水素Ｏ生成はみられない
。
（３） グルコース、コレステロール、プリン、グリ
セロール、グリセロール−三−リン酸及びアシル−Ｃｏ
ム 等に対しては作用を示さない。
セロール、グリセロール−三−リン酸及びアシル−Ｃｏ
ム 等に対しては作用を示さない。
（４） 酵素タン白は分子量ｓ ａ ｏ ｏ ｏ、糖
含量＆４慢、銅含量αｓ９Ｇ及び等電点４１°をもっ４
０てあシ、一般にブループロティンと呼ばれる酵素群に
入ると考えられる。
含量＆４慢、銅含量αｓ９Ｇ及び等電点４１°をもっ４
０てあシ、一般にブループロティンと呼ばれる酵素群に
入ると考えられる。
（５） ｆｌｌｌ＆反応り至適ｐ１１１１１５〜Ｌ
ｓ ０１８１１’性であり１反応阻害剤として線アジ化
ナトリウム、硫酸第一鉄、フェロシアン化カリウム１フ
ツ化カリウム等がそＯ代表的なもＯである。特にアジ化
ナトリウムは終濃度１ｍＭではは完全に反応を阻害する
。
ｓ ０１８１１’性であり１反応阻害剤として線アジ化
ナトリウム、硫酸第一鉄、フェロシアン化カリウム１フ
ツ化カリウム等がそＯ代表的なもＯである。特にアジ化
ナトリウムは終濃度１ｍＭではは完全に反応を阻害する
。
（６） 過酸化水素Ｏ検出に用ｉられるパーオキシダ
ーゼ−水素供与体色原体発色法にお叶る色原体。
ーゼ−水素供与体色原体発色法にお叶る色原体。
例えば４−７ミノアンチピリン（以下４ムムと略記する
。）−フェノールカップリング系、４ムム−−／エチル
７品すン系、４ムムー菖−エチル−１−ヒドロキシエチ
ル−論−トルイシンｌａ及ＵＳ−メテルニ２−ベンゾチ
アゾリノン−艦ド２ジンージメチルアニリン系等を過酸
化水嵩０存在しない条件で酸化縮合発色させる。
。）−フェノールカップリング系、４ムム−−／エチル
７品すン系、４ムムー菖−エチル−１−ヒドロキシエチ
ル−論−トルイシンｌａ及ＵＳ−メテルニ２−ベンゾチ
アゾリノン−艦ド２ジンージメチルアニリン系等を過酸
化水嵩０存在しない条件で酸化縮合発色させる。
本発明に従えば、上記ラッカーゼの性質から明らかなよ
うに、各種の生体成分に作用する酸化酵素−パーオキシ
ダーゼ−水素供与体色原体発色法を用りで、グルコース
、コレステロール、コリン、グリセロール、グリセロー
ル−三−リン酸ｔりｔｉアシル−０ｏＡ郷の各種生体成
分を測定する方法においては、あらかじめ検体をラッカ
アゼで処理しておくことにより、検体９区共存するビリ
ルビン、アスコルビン酸、尿酸及びヘモグロビンＩＩＩ
ＩＯ還元性干渉物質【分解処理する仁とが可能となり、
これらＯ発色系へＯ悪影響を回避し、目的成分Ｏ測定ｔ
よシ正確に行なうことができる。さらにラッカーゼで前
処理した後、（５）に示したような反応阻害剤を加える
こと罠より、ラッカーゼＯ＠原体に対する作用を食い止
め、＠的成分だけを正確に色原体に反映させることがで
きる。
うに、各種の生体成分に作用する酸化酵素−パーオキシ
ダーゼ−水素供与体色原体発色法を用りで、グルコース
、コレステロール、コリン、グリセロール、グリセロー
ル−三−リン酸ｔりｔｉアシル−０ｏＡ郷の各種生体成
分を測定する方法においては、あらかじめ検体をラッカ
アゼで処理しておくことにより、検体９区共存するビリ
ルビン、アスコルビン酸、尿酸及びヘモグロビンＩＩＩ
ＩＯ還元性干渉物質【分解処理する仁とが可能となり、
これらＯ発色系へＯ悪影響を回避し、目的成分Ｏ測定ｔ
よシ正確に行なうことができる。さらにラッカーゼで前
処理した後、（５）に示したような反応阻害剤を加える
こと罠より、ラッカーゼＯ＠原体に対する作用を食い止
め、＠的成分だけを正確に色原体に反映させることがで
きる。
処理方法としては、（１）血清または尿等Ｏ検体試料１
０〜１００ ｐｊにラッカーゼ１１〜１単位を含む１１
１Ｈ４ｏ〜７．００緩衝液２好ましくは）Ｈ＆５〜１０
０酢酸緩衝液１１〜１−加え、３７℃前後Ｏ温度で１〜
２０分間、好ましぐは５〜１０分間反応させた後、（１
）ラッカー４Ｉｌｌｌ害剤を１〜５０ｍｍｏｊ／ Ｊ好
ましくは５ ｍｍｏｊ／ Ｊ Ｏ濃度で含む水溶液を加
え、これ以後は通常Ｏ各種生体成分Ｏ測定方法を行うこ
とができる。また上記Ｏ処理方法においては、ラッカー
ゼ阻害剤を各種体液成分測定用Ｏ試薬に添加しておいて
、ラッカーゼで処理した検体に試薬と共に加えてもさし
つかえない。
０〜１００ ｐｊにラッカーゼ１１〜１単位を含む１１
１Ｈ４ｏ〜７．００緩衝液２好ましくは）Ｈ＆５〜１０
０酢酸緩衝液１１〜１−加え、３７℃前後Ｏ温度で１〜
２０分間、好ましぐは５〜１０分間反応させた後、（１
）ラッカー４Ｉｌｌｌ害剤を１〜５０ｍｍｏｊ／ Ｊ好
ましくは５ ｍｍｏｊ／ Ｊ Ｏ濃度で含む水溶液を加
え、これ以後は通常Ｏ各種生体成分Ｏ測定方法を行うこ
とができる。また上記Ｏ処理方法においては、ラッカー
ゼ阻害剤を各種体液成分測定用Ｏ試薬に添加しておいて
、ラッカーゼで処理した検体に試薬と共に加えてもさし
つかえない。
さらに本発明に従えば、前記したラッカーゼＯ性質（１
）を利用して体液中Ｏビリルビンを定置することができ
る。
）を利用して体液中Ｏビリルビンを定置することができ
る。
ビリルビンＯ定量方法は前記したラッカーゼによる処理
方法Ｏ（：）に従って反応させ、その時Ｏビリルビン０
４６０ｍｍでの吸光度減少率よ〕被検物中のビリルビン
Ｏ含量を測定するか、あるいはＳ−メチル−２−ベンゾ
チアゾリノン−とドラジン（以下ＭＢＴＨと略記する。
方法Ｏ（：）に従って反応させ、その時Ｏビリルビン０
４６０ｍｍでの吸光度減少率よ〕被検物中のビリルビン
Ｏ含量を測定するか、あるいはＳ−メチル−２−ベンゾ
チアゾリノン−とドラジン（以下ＭＢＴＨと略記する。
）とビリルビン分解物とＯ反応により生ずる青色色素を
測定することにより行なわれる。例えば血清等Ｏ検体試
料１０〜１００μｌに、ラッカーゼＬ１０５〜１５単位
及びＭＢＴＨ１〜１０．ｐｍｏＪｅｓ を含む緩衝液。
測定することにより行なわれる。例えば血清等Ｏ検体試
料１０〜１００μｌに、ラッカーゼＬ１０５〜１５単位
及びＭＢＴＨ１〜１０．ｐｍｏＪｅｓ を含む緩衝液。
好ましくはｐＨ翫５〜＆ＯＩＤ酢酸緩衝ａを１５〜＆Ｏ
ｄ添加し、５７℃前後の温度で１〜２０分間。
ｄ添加し、５７℃前後の温度で１〜２０分間。
好ましくは５〜１５分間反応させ、塩酸酸性にした後ま
たは塩酸酸性下で塩化第二鉄の溶液を加えた後吸光極大
６ ｊ Ｏｎｕ Ｏ吸光度を測定することにより行なわ
れる。
たは塩酸酸性下で塩化第二鉄の溶液を加えた後吸光極大
６ ｊ Ｏｎｕ Ｏ吸光度を測定することにより行なわ
れる。
以下に実施例を示し本発明をさらに詳細に説明するが、
これらは本発明を限定するもＯではない。
これらは本発明を限定するもＯではない。
実施例１
中性脂肪測定時におけるビリルビン及びアスコルビン酸
Ｏ影響Ｏ回避例 １）試薬 中前処理剤：ラッカーゼ５００単位／ｊを含む５０ ｍ
ａ ｍｏｊ／ Ｊ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）。
Ｏ影響Ｏ回避例 １）試薬 中前処理剤：ラッカーゼ５００単位／ｊを含む５０ ｍ
ａ ｍｏｊ／ Ｊ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）。
Ｏｉ）中性脂肪測定用試薬二市販Ｏリビドスー５５０キ
ット（登ａ商標、小野薬品製）。試薬組成はリポプロテ
ィンリパーゼ、グリセロールキナーゼ。
ット（登ａ商標、小野薬品製）。試薬組成はリポプロテ
ィンリパーゼ、グリセロールキナーゼ。
ダリセロリン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ。
アデノシントリフオス７エート、４アミノアンチピリン
、 ＩＬＩＩ−ジエチル−ｍ−）ルイジ゛ン及びグツド
緩ｍ１ｌｌＣｐｉ 直５）である。
、 ＩＬＩＩ−ジエチル−ｍ−）ルイジ゛ン及びグツド
緩ｍ１ｌｌＣｐｉ 直５）である。
［相］ラッカーゼ阻害剤：アジ化ナトリウム１００ｍｗ
ｈｏｊ／ｊを含む水溶液。
ｈｏｊ／ｊを含む水溶液。
２）操作法
血清試料２０ ｐｉを試験管に加え、試薬（１）α５−
を添加し３７℃で１０分間保温後、試薬Ｏ１）とωＯ混
合液〔混合比、（ｉｉ）：（ｈｌ−２０：１）を５−添
加し、常法に従い３７℃で１５分間反応させ。
を添加し３７℃で１０分間保温後、試薬Ｏ１）とωＯ混
合液〔混合比、（ｉｉ）：（ｈｌ−２０：１）を５−添
加し、常法に従い３７℃で１５分間反応させ。
ｓ ｓ ｏ ｎｍで吸光度【測定した。又同ｗｏ血清試
料を用い、従来法によっても測定した。
料を用い、従来法によっても測定した。
次に血清試料にビリルビン（第−化学薬品製）及びアス
クルピン酸（鳥人薬品製）をそれぞれ２０ｗＩＩ／４４
及び５ｍｆ／ａｊＯ割合で添加したも０１及び両者とも
添加したもＯを作成し、これを被検体として本発明方法
と従来法で測定を行い、本発明方法Ｏ効果を検討した。
クルピン酸（鳥人薬品製）をそれぞれ２０ｗＩＩ／４４
及び５ｍｆ／ａｊＯ割合で添加したも０１及び両者とも
添加したもＯを作成し、これを被検体として本発明方法
と従来法で測定を行い、本発明方法Ｏ効果を検討した。
そＯ結果を以下０表に示す。
表１ 本発明方法と従来法における検体試料中の還元性
物質の影響 Ｗａ＞ 従来法によるビリルビン及びアスコルビン酸を
無添加Ｏ場合の試料中の中性脂肪Ｏ実欄値（ｓｗ／ａｊ
）ｔｌｏｏ−とし、それ以外Ｏ場合はこれに対する相対
値で表わした。
物質の影響 Ｗａ＞ 従来法によるビリルビン及びアスコルビン酸を
無添加Ｏ場合の試料中の中性脂肪Ｏ実欄値（ｓｗ／ａｊ
）ｔｌｏｏ−とし、それ以外Ｏ場合はこれに対する相対
値で表わした。
実施例２
ラッカーゼによるビリルビン及び尿酸Ｏ処理例１）ビリ
ルビン（第−化学薬品製）０２０噌／１ｊ溶液３００
ｐｉ及び１０．Ｏｍｍｏｊ／ｊＯ酢酸緩衝液（ｐＨ４５
）、Ｓ−からなる混合溶液にラッカーゼ１１単位を添加
して４４０ ｎｍ Ｋおける吸光度減少度合ｆｌｚ５７
℃に保温して経時的に観察した。
ルビン（第−化学薬品製）０２０噌／１ｊ溶液３００
ｐｉ及び１０．Ｏｍｍｏｊ／ｊＯ酢酸緩衝液（ｐＨ４５
）、Ｓ−からなる混合溶液にラッカーゼ１１単位を添加
して４４０ ｎｍ Ｋおける吸光度減少度合ｆｌｚ５７
℃に保温して経時的に観察した。
その結果を第１図に示す。第１図よシ、ラッカーゼによ
るビリ゛ルピンＯ酸化は明らかである。又。
るビリ゛ルピンＯ酸化は明らかである。又。
この反応系にラッカー（と共ＫＭＢＴｉｌを存在させて
おくと第２図Ｏごと（５２０ｎｍａに最大吸収をもつ化
合物を生成し九。さらに塩酸酸性Ｏ条件下において塩化
第二鉄Ｏ溶液を加えることによって分子吸光係数が高（
６１０ｎｍ Ｋ最大吸収をもつ化合物が生成した。
おくと第２図Ｏごと（５２０ｎｍａに最大吸収をもつ化
合物を生成し九。さらに塩酸酸性Ｏ条件下において塩化
第二鉄Ｏ溶液を加えることによって分子吸光係数が高（
６１０ｎｍ Ｋ最大吸収をもつ化合物が生成した。
２）４本Ｏ試験管Ｏそれぞれに尿酸０１ Ｇ １１ｆ／
ｄＪ溶液１００ＪＩｊｉ入れ、そＯうち５本Ｏ試験管に
５０ ｗａ ｍｏｊ／ｊ Ｄリン駿緩衝液（ｐＨＬＤ）
２５０μｊを加え、さらにそ０うち１０２零にラッカ一
層α２単祉を添加し、そＯうち０１本を３′７℃で１０
分間反応させた。そＯ後４本Ｏ試験管にそれぞれ１００
ｍ ｍｏｊ／ｊ Ｏ）リス−塩酸緩衝ｉ［（ｐＨｔｏ
）ｓＷｌｌを加え、アルカリ性条件下における尿酸０２
９５ｎｍＯ吸収変化をみた。そＯ結果を第Ｓ図に示す・ 実施例３ 中性脂肪測定時におけるビリルビンＯ影響０囲避例 血清検体４０例についてそのそれぞれにビリルビン（第
−化学薬品製）を２０■７ｄｔ、ｏ割合で添加した４の
及び無添加の４Ｏを検体として用い中性脂肪の測定を行
った。試薬および操作法は実施例ＩＫ準じて行い、従来
法と本発明方法とＯ比較相関性を検討した。結果を第４
図に示す。相関Ｏ回帰直線は従来法ではｙ−ＩＢ１２ｘ
−７，０（ｎＩＩＩＩ４０．ｒｍＩｗα９９６）である
のに対し本発明方法でｒｉｙ−（Ｌ９８５−＆２（ｎ−
４０，ｒｓｍａ？？７）となり、従来法ではビリルビン
Ｏ影響Ｉ□ で低い値で測定されていたもＯが本発明方法によル改善
された事がわかる。
ｄＪ溶液１００ＪＩｊｉ入れ、そＯうち５本Ｏ試験管に
５０ ｗａ ｍｏｊ／ｊ Ｄリン駿緩衝液（ｐＨＬＤ）
２５０μｊを加え、さらにそ０うち１０２零にラッカ一
層α２単祉を添加し、そＯうち０１本を３′７℃で１０
分間反応させた。そＯ後４本Ｏ試験管にそれぞれ１００
ｍ ｍｏｊ／ｊ Ｏ）リス−塩酸緩衝ｉ［（ｐＨｔｏ
）ｓＷｌｌを加え、アルカリ性条件下における尿酸０２
９５ｎｍＯ吸収変化をみた。そＯ結果を第Ｓ図に示す・ 実施例３ 中性脂肪測定時におけるビリルビンＯ影響０囲避例 血清検体４０例についてそのそれぞれにビリルビン（第
−化学薬品製）を２０■７ｄｔ、ｏ割合で添加した４の
及び無添加の４Ｏを検体として用い中性脂肪の測定を行
った。試薬および操作法は実施例ＩＫ準じて行い、従来
法と本発明方法とＯ比較相関性を検討した。結果を第４
図に示す。相関Ｏ回帰直線は従来法ではｙ−ＩＢ１２ｘ
−７，０（ｎＩＩＩＩ４０．ｒｍＩｗα９９６）である
のに対し本発明方法でｒｉｙ−（Ｌ９８５−＆２（ｎ−
４０，ｒｓｍａ？？７）となり、従来法ではビリルビン
Ｏ影響Ｉ□ で低い値で測定されていたもＯが本発明方法によル改善
された事がわかる。
実施例４
ビリルビンＯ定量
１）ビリルビン０４６０ｎｗ＊における吸収減少法によ
る定量。
る定量。
ビリルビン（第−化学薬品製）を用−て、ＯｗＩｇ／４
ｊ、 ５１１Ｆ／ａｊ、 １０ｗＩＩ／ａｊ、 １５
１ＱＦ／１４゜２０１１ｆ／（１ｊＯ希釈系列を作成し
そＯそれぞれ０２０ ｐｉを試験管に採堆し、 １０
．Ｏｍ ｍｏｊ／ ｊ Ｏリン酸緩衝液（ｐｌｉ＆５）
２ｍを添加した。ζＯＯ液０４４０！ＩＩＩＫおける吸
光度を測定し、引き続きラッカーゼＯα０２単位を添加
し、添加直稜からＯ吸光度を１分おきＫｍ定した。結果
をＩＲ５図に示す。
ｊ、 ５１１Ｆ／ａｊ、 １０ｗＩＩ／ａｊ、 １５
１ＱＦ／１４゜２０１１ｆ／（１ｊＯ希釈系列を作成し
そＯそれぞれ０２０ ｐｉを試験管に採堆し、 １０
．Ｏｍ ｍｏｊ／ ｊ Ｏリン酸緩衝液（ｐｌｉ＆５）
２ｍを添加した。ζＯＯ液０４４０！ＩＩＩＫおける吸
光度を測定し、引き続きラッカーゼＯα０２単位を添加
し、添加直稜からＯ吸光度を１分おきＫｍ定した。結果
をＩＲ５図に示す。
２）ＭＢＴＨとＯ色素生成法による定量。
１）と同Ｉｇ！にしてビリルビンＯ希釈系列を作成し、
そｏｓｏμＡｔ試験管に採取し、ＭＢＴＨ５ｍ ｍｏｊ
ｅｓ 、 ラッカーゼ５０単位／Ｉｔ）割合で含む１
００ ｗａ ｗＳｏｊ／ｊ Ｏ酢酸緩衝ｉ［（ｐＨ４５
）２□□ ） −を添加し、ｓ７°ＯＫで１５分間保温した。保温後、
ａｓＭｔＪ［＠０１−を添加し、そＯ吸光度を水を対照
に測定した。そＯ結果を第６図に示す。
そｏｓｏμＡｔ試験管に採取し、ＭＢＴＨ５ｍ ｍｏｊ
ｅｓ 、 ラッカーゼ５０単位／Ｉｔ）割合で含む１
００ ｗａ ｗＳｏｊ／ｊ Ｏ酢酸緩衝ｉ［（ｐＨ４５
）２□□ ） −を添加し、ｓ７°ＯＫで１５分間保温した。保温後、
ａｓＭｔＪ［＠０１−を添加し、そＯ吸光度を水を対照
に測定した。そＯ結果を第６図に示す。
実施例から明らかなように、本発明Ｏラッカーゼを用い
れば体液中に含まれる還元性干渉物質であるビリルビン
、アスコルビン酸、尿酸、ヘモグロビンを簡単な処理法
で分解除去する事が可能とな〕、各種成分分析に及ぼす
これらの影響【回避することが出来る。またその反応性
を利用してビリルビンの定置も簡易に出来ることが理解
される。
れば体液中に含まれる還元性干渉物質であるビリルビン
、アスコルビン酸、尿酸、ヘモグロビンを簡単な処理法
で分解除去する事が可能とな〕、各種成分分析に及ぼす
これらの影響【回避することが出来る。またその反応性
を利用してビリルビンの定置も簡易に出来ることが理解
される。
第１図は実施例１におけるラッカーゼＯ反応により消失
するビリルビンＯ吸収スペクトルＯ変化を示す。 第２図はＭＢＩＨ存在下ＯビリルビンとラッカーゼＯ反
応例におけるビリルビンの吸収スペクトルＯ変化を示し
、図中Ｏ矢印は塩酸酸性にしたことを示す。 ＃！３図はラッカーゼによる尿酸の吸収スペクトルＯ変
化を示す。 第４図は各種血清にビリルビンを添加した場合と添加し
ない場合についての血清中の中性脂肪Ｏ実測値を従来法
と本発明方法とで比較したも〇である。 婢５図は吸収減少法によるビリルビン０定量直線を示し
、横軸は４６０ｎｍｍＫおける１分当〕０吸光度減少率
を表わす。 第６図はＭＢＴＨとＯ色素生成法によるビリルビンＯ定
量直線を示す。 （はか３名） 仮長 （ｎｍ） ミ皮長（ｎｍ） 竿 ３ 図 仮 長 （ｎｍ） 第 ４− ｆｓ５図 第 ６ 図
するビリルビンＯ吸収スペクトルＯ変化を示す。 第２図はＭＢＩＨ存在下ＯビリルビンとラッカーゼＯ反
応例におけるビリルビンの吸収スペクトルＯ変化を示し
、図中Ｏ矢印は塩酸酸性にしたことを示す。 ＃！３図はラッカーゼによる尿酸の吸収スペクトルＯ変
化を示す。 第４図は各種血清にビリルビンを添加した場合と添加し
ない場合についての血清中の中性脂肪Ｏ実測値を従来法
と本発明方法とで比較したも〇である。 婢５図は吸収減少法によるビリルビン０定量直線を示し
、横軸は４６０ｎｍｍＫおける１分当〕０吸光度減少率
を表わす。 第６図はＭＢＴＨとＯ色素生成法によるビリルビンＯ定
量直線を示す。 （はか３名） 仮長 （ｎｍ） ミ皮長（ｎｍ） 竿 ３ 図 仮 長 （ｎｍ） 第 ４− ｆｓ５図 第 ６ 図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）ラッカーゼを用いて体液中の主な水素供与体である
ビリルビン、アスコルビン酸、尿素及び／又はヘモグロ
ビン１分解する方法。 ２）体液中Ｏ各種成分Ｏ分析に用いられる。目的成分の
酸化酵素−バーオキシダーゼ−水素供与体色原体反応系
の測定法にシいて、 ６！１Ｊ定試料に共存するビリル
ビン、アスコルビン酸、尿酸及びヘモグロビンを分解除
去する仁とを特徴とする特許請求Ｏ範囲第１項に記載Ｏ
方法。 ３）測定試料にラッカーゼを含むｐＨ４０〜ｚ００緩衝
液を加え、３７℃で１〜２０分間反応させ先後、ラッカ
ーイ阻害剤を加えることを特徴とする特許請求の範８第
２項記載の方法。 り体液中のビリルビンを定置することを特徴とする特許
−求Ｏ範ＦＩ５第１項記載Ｏ方法。 ５）測定試料に、ラッカーゼを含むｐＨ４０−７，０Ｏ
緩衝液を加え、５７℃で１〜２０分反応させ、そＯ時Ｏ
ビリルビン０４４０ｎｍｆＣおける吸光度減少率を測定
することを特徴とする特許請求Ｏ範囲第４項記載Ｏ方法
。 ６）測定試料にラッカーゼ及び３−メチル−２−ベンゾ
チアゾリノン−ヒドラジンを含むｐＨ４０〜７．００緩
衝液を加え、ｓ７℃て１〜２０分反応させ１次いで゛塩
酸酸性にした後、４１０ ｎｍ ｆＣおける吸光度をＩ
ｌ宏することを特徴とする特許―求の範囲ＩＮ４Ｎ４項
記載決方
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17295981A JPS5876100A (ja) | 1981-10-30 | 1981-10-30 | ラツカ−ゼの使用法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17295981A JPS5876100A (ja) | 1981-10-30 | 1981-10-30 | ラツカ−ゼの使用法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5876100A true JPS5876100A (ja) | 1983-05-09 |
Family
ID=15951527
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17295981A Pending JPS5876100A (ja) | 1981-10-30 | 1981-10-30 | ラツカ−ゼの使用法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5876100A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5918000A (ja) * | 1982-07-23 | 1984-01-30 | Amano Pharmaceut Co Ltd | 生体成分の測定法及びそれに用いる試薬組成物 |
| JPS5917999A (ja) * | 1982-07-23 | 1984-01-30 | Amano Pharmaceut Co Ltd | ビリルビンの定量法及びその定量用試薬組成物 |
| JPS6315168A (ja) * | 1986-06-21 | 1988-01-22 | ベ−リンガ−・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 血液又は血液から誘導された試料中の血清フルクトサミン含量を特異的に測定する際に蛋白質基質効果を回避するための方法及び製剤 |
-
1981
- 1981-10-30 JP JP17295981A patent/JPS5876100A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5918000A (ja) * | 1982-07-23 | 1984-01-30 | Amano Pharmaceut Co Ltd | 生体成分の測定法及びそれに用いる試薬組成物 |
| JPS5917999A (ja) * | 1982-07-23 | 1984-01-30 | Amano Pharmaceut Co Ltd | ビリルビンの定量法及びその定量用試薬組成物 |
| JPS6233880B2 (ja) * | 1982-07-23 | 1987-07-23 | Amano Pharma Co Ltd | |
| JPH0329400B2 (ja) * | 1982-07-23 | 1991-04-24 | ||
| JPS6315168A (ja) * | 1986-06-21 | 1988-01-22 | ベ−リンガ−・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 血液又は血液から誘導された試料中の血清フルクトサミン含量を特異的に測定する際に蛋白質基質効果を回避するための方法及び製剤 |
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