JPS60151561A - ビリルビンの定量方法 - Google Patents
ビリルビンの定量方法Info
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- JPS60151561A JPS60151561A JP764584A JP764584A JPS60151561A JP S60151561 A JPS60151561 A JP S60151561A JP 764584 A JP764584 A JP 764584A JP 764584 A JP764584 A JP 764584A JP S60151561 A JPS60151561 A JP S60151561A
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- JP
- Japan
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- bilirubin
- specimen
- reaction
- reagent
- absorbancy
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- Pending
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はビリルビンの定量方法、更に詳しくは定量試薬
としてビリルビンオキシダーゼを使用したビリルビンの
定量方法に関する。
としてビリルビンオキシダーゼを使用したビリルビンの
定量方法に関する。
ビリルビンは、胆汁色素の主成分をなすもので、その血
清中の存在量から肝機能障害の程度尋を知ることができ
るので、これを定量することは臨床的に極めて重要であ
る。
清中の存在量から肝機能障害の程度尋を知ることができ
るので、これを定量することは臨床的に極めて重要であ
る。
従来よシ、ビリルビンの定量方法としては、ジアゾ法、
比色法及び分光光度法等が知られている。然し、ジアゾ
法は、■呈色が弱く、正常値付近の濃度では測定に大量
の検体を必袂とする、■検体に混濁が生じやすく、定量
値にバラツキが太きい、■反応が十分平衡に達したとみ
なせるまでに長時開裂するため、反応のエンド・？イン
ドが不明確となり、定量値が不正確になυ易い尋の欠点
を有する。
比色法及び分光光度法等が知られている。然し、ジアゾ
法は、■呈色が弱く、正常値付近の濃度では測定に大量
の検体を必袂とする、■検体に混濁が生じやすく、定量
値にバラツキが太きい、■反応が十分平衡に達したとみ
なせるまでに長時開裂するため、反応のエンド・？イン
ドが不明確となり、定量値が不正確になυ易い尋の欠点
を有する。
一方、比色法及び分光光度法は微量の検体を迅速に測定
できるという利点を有する反部、■検体の混濁や検体中
のビリルビン以外の黄色色素、例えばカロチン婢によっ
て誤差を生じやすい、■ジアゾ法に比べて感度が低く、
正常値付近の定量は困難である、■光によりビリルビン
が酸化され誤差を生じやすい等の欠点を有し、いまだ十
分満足のゆくものではなかった。
できるという利点を有する反部、■検体の混濁や検体中
のビリルビン以外の黄色色素、例えばカロチン婢によっ
て誤差を生じやすい、■ジアゾ法に比べて感度が低く、
正常値付近の定量は困難である、■光によりビリルビン
が酸化され誤差を生じやすい等の欠点を有し、いまだ十
分満足のゆくものではなかった。
本発明者は、斯かる実情において、上記欠点のないビリ
ルビンの定量方法を開発すべく、ビリルビンに特異的に
作用し、これを酸化してビリベルシンに変える酵素とし
て知られるビリルビンオキシダーゼを使用してビリルビ
ンを定量せ、んと試みた。これまでビリルビンオキシダ
ーゼの至適ｐＨは６〜７にあるとされていることから、
本発明者は、当該ｐ■において、ビリルビンにビリルビ
ンオキシダーゼを作用せしめたところ、反応時間が長い
と共にエンド・緻インドがガかなか定まらず、ビリルビ
ンを有利に測定することは困難であった。
ルビンの定量方法を開発すべく、ビリルビンに特異的に
作用し、これを酸化してビリベルシンに変える酵素とし
て知られるビリルビンオキシダーゼを使用してビリルビ
ンを定量せ、んと試みた。これまでビリルビンオキシダ
ーゼの至適ｐＨは６〜７にあるとされていることから、
本発明者は、当該ｐ■において、ビリルビンにビリルビ
ンオキシダーゼを作用せしめたところ、反応時間が長い
と共にエンド・緻インドがガかなか定まらず、ビリルビ
ンを有利に測定することは困難であった。
そこで、本発明者は、斯かる欠点を克服せんと更に鋭意
研究を行った結果、驚くべきことに、当該反応をｐＨ３
以上で行うと、ビリルビンの見かけのモル吸光係数が一
定となシ、反応時間も短縮されて反応のエンド・？イン
ドが明確となシ、微量の検体で、簡単かつ迅速に、しか
も正確かつ再現性よくビリルビンを測定することができ
ることを見出し、本発明を完成した。
研究を行った結果、驚くべきことに、当該反応をｐＨ３
以上で行うと、ビリルビンの見かけのモル吸光係数が一
定となシ、反応時間も短縮されて反応のエンド・？イン
ドが明確となシ、微量の検体で、簡単かつ迅速に、しか
も正確かつ再現性よくビリルビンを測定することができ
ることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は水性検体に、ビリルビンオキシダー
ゼ及び陰イオン界面活性剤を含有するｐＨ１３以上のア
ルカリ性緩衝液からなる試薬（以下、本発明試薬と略称
する）を作用せしめ、その吸光度を測定することを特徴
とするビリルビンの定量方法を提供するものである。
ゼ及び陰イオン界面活性剤を含有するｐＨ１３以上のア
ルカリ性緩衝液からなる試薬（以下、本発明試薬と略称
する）を作用せしめ、その吸光度を測定することを特徴
とするビリルビンの定量方法を提供するものである。
本発明の測定原理は次の如くである。水性液体中のビリ
ルビンの極大吸収は、ビリルビン自体が４４０ ｎｍ付
近でアシ、アルブミンと結合したビリルビンが４６０
ｎｍ付近であるので、通１４４ｏ〜４７０ｎｍの範囲に
ある。一方、ビリベルシンはこの波長領域には吸収をほ
とんどもたない。従って、ビリルビンを含有する検体と
、これにビリルビンオキシダーゼを加えたものの４４０
〜４７０ ｎｍにおける吸光度差からビリルビンを定量
することができる。
ルビンの極大吸収は、ビリルビン自体が４４０ ｎｍ付
近でアシ、アルブミンと結合したビリルビンが４６０
ｎｍ付近であるので、通１４４ｏ〜４７０ｎｍの範囲に
ある。一方、ビリベルシンはこの波長領域には吸収をほ
とんどもたない。従って、ビリルビンを含有する検体と
、これにビリルビンオキシダーゼを加えたものの４４０
〜４７０ ｎｍにおける吸光度差からビリルビンを定量
することができる。
検体は、血清、血しょう、尿等の水性のものでおればよ
（、％ｖｃｌＬＵ定されない。検体は、ビリルビン含量
にもよるが、通例は少量でよく、ヒト血清中の平常値付
近（０，１〜１，０η／ ｄｔ ）であっても２０〜１
００７ｔｔ程度あれば梢度よく測定することができる。
（、％ｖｃｌＬＵ定されない。検体は、ビリルビン含量
にもよるが、通例は少量でよく、ヒト血清中の平常値付
近（０，１〜１，０η／ ｄｔ ）であっても２０〜１
００７ｔｔ程度あれば梢度よく測定することができる。
ビリルビンオキシダーゼは、検体中のビリルビン濃度に
もよるが、最終濃度として００５〜１．ＯＵ／１１ｄ使
用するのが好ましい。
もよるが、最終濃度として００５〜１．ＯＵ／１１ｄ使
用するのが好ましい。
本発明に使用する陰イオン界面活性剤としては、例えば
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、コール酸ナトリウ
ム等を挙げることができる。
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、コール酸ナトリウ
ム等を挙げることができる。
陰イオン界面活性剤は、最終濃度が０．０１〜５．０重
量％（以下、％で示す）となるように使用するのが好ま
しい。
量％（以下、％で示す）となるように使用するのが好ま
しい。
本発明に使用するアルカリ性緩衝液はｐＨが８以上であ
り、好ましくはｐＨ８〜１０のもので、例えばジエチル
バルビッール酸ナトリウム・塩酸緩衝液、トリスビトロ
キシアミンメタン・塩酸緩衝液等が挙げられる。
り、好ましくはｐＨ８〜１０のもので、例えばジエチル
バルビッール酸ナトリウム・塩酸緩衝液、トリスビトロ
キシアミンメタン・塩酸緩衝液等が挙げられる。
本発明試薬には、上記必須成分の＃ｌかに、乳糖アラニ
ン、グリシン、牛アルブミン、シクロデキストリン等の
安定化剤、像化ソーダ等を適宜添加配合することができ
る。また、検体の混濁を防ぐため、使用した陰イオン界
面活性剤と構造が類似でクラフト点のより高い界面活性
剤、例えばｆ３Ｄｆ３に対してはドデシルベンゼンスル
ホン酸ナトリウム（５ＤＢＳ ）等を併用するのが好ま
しい。
ン、グリシン、牛アルブミン、シクロデキストリン等の
安定化剤、像化ソーダ等を適宜添加配合することができ
る。また、検体の混濁を防ぐため、使用した陰イオン界
面活性剤と構造が類似でクラフト点のより高い界面活性
剤、例えばｆ３Ｄｆ３に対してはドデシルベンゼンスル
ホン酸ナトリウム（５ＤＢＳ ）等を併用するのが好ま
しい。
本発明試薬は、その使用にあたシ、１試薬として用いて
も、ｉた、２試薬に分けて使用時混合して使用すること
もできる。本発明に使用される陰イオン界面活性剤、例
えばｓｎｓは蛋白質変成作用があるため、ＯＤ８とビリ
ルビンオキシダーゼを共存させた場合、本発明試薬の保
存可能ガ期間は冷暗所で３日程度であるカ、ＳＤＢトビ
リルビンオキシダーゼを別の試薬に配合した場合、冷暗
所で１箇月は安定に保存できる。従って、２試薬に分け
て使用するのがより好ましい。測定は２５〜４０℃で行
なうのが好ましい。
も、ｉた、２試薬に分けて使用時混合して使用すること
もできる。本発明に使用される陰イオン界面活性剤、例
えばｓｎｓは蛋白質変成作用があるため、ＯＤ８とビリ
ルビンオキシダーゼを共存させた場合、本発明試薬の保
存可能ガ期間は冷暗所で３日程度であるカ、ＳＤＢトビ
リルビンオキシダーゼを別の試薬に配合した場合、冷暗
所で１箇月は安定に保存できる。従って、２試薬に分け
て使用するのがより好ましい。測定は２５〜４０℃で行
なうのが好ましい。
本発明試薬を用いてビリルビンを測定するには、検体を
２分し、一方の検体に本発明試薬を加え、３７℃で反応
させ、反応がエンド・？インドに達したら、この液の４
５０ ｎｍにおける吸光度（ＯＤＳ ）を測定する。通
例、エンド・、＋Ｐインドに達するのに要する時間（ｔ
・）は５〜２０分程度である。また、一方の検体にはビ
リルビンオキシダーゼを含有しない以外は上記と同じ組
成の試薬を加え、３７℃に保ち、ｔｏ分経過後のＡ５０
ｎｍにおける吸光度（ＯＤＢ）を測定する。吸光度差
＝ＯＤ −ＯＤ を計算し、ビリルビン標準液を用Ｂ いて、上記と同温度で得た検量線から、検体中のビリル
ビン濃度をめることができる。
２分し、一方の検体に本発明試薬を加え、３７℃で反応
させ、反応がエンド・？インドに達したら、この液の４
５０ ｎｍにおける吸光度（ＯＤＳ ）を測定する。通
例、エンド・、＋Ｐインドに達するのに要する時間（ｔ
・）は５〜２０分程度である。また、一方の検体にはビ
リルビンオキシダーゼを含有しない以外は上記と同じ組
成の試薬を加え、３７℃に保ち、ｔｏ分経過後のＡ５０
ｎｍにおける吸光度（ＯＤＢ）を測定する。吸光度差
＝ＯＤ −ＯＤ を計算し、ビリルビン標準液を用Ｂ いて、上記と同温度で得た検量線から、検体中のビリル
ビン濃度をめることができる。
ビリルビン標準液としては、日商ビリルビン標準液、ビ
リルビンコントロール血清（ディト社製）等が挙げられ
る。
リルビンコントロール血清（ディト社製）等が挙げられ
る。
次に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明する。
実施例１
下記の第１試薬、第２試薬を用い標準液および為ビリル
ビン血清を５段階希釈した液を各々検体として測定し、
試薬の直線性を調べた。
ビン血清を５段階希釈した液を各々検体として測定し、
試薬の直線性を調べた。
（試薬組成）
！ｚ １試薬：’０．Ｑ５Ｍゾエテルバルビッール酸ナ
トリウム・塩酸緩衝液（ｐＨ８，１）、０１％８ＤＳ、
０．１％５ＤＢＳ含有。
トリウム・塩酸緩衝液（ｐＨ８，１）、０１％８ＤＳ、
０．１％５ＤＢＳ含有。
第２試薬：０．００５Ｍ炭酸緩衝液（Ｎ ａ２ｃＯ３十
Ｎ１１ＨＣＯ３） （ｐＨ９，５）ビリルビンオキシダ
ーゼ〔凍結乾燥品（日水製薬株式会社製））０．８Ｕ／
、ｇ、乳糖、アラニン含有。
Ｎ１１ＨＣＯ３） （ｐＨ９，５）ビリルビンオキシダ
ーゼ〔凍結乾燥品（日水製薬株式会社製））０．８Ｕ／
、ｇ、乳糖、アラニン含有。
（８ＩＩＩ定方法および結果）
検体２Ｑｐｔに、ｉｉ試Ｑ５００μｔを加え、３７℃で
５分間反比・させる。５分後に吸光度を測定する（ Ｏ
Ｄ’ ）。次に、当該反応液に第２試薬１００ ｐｔを
加え、３７℃で５分間反応はせ、吸光度を測定する（
ｏＤ’ ）。吸光度差−ＯＤ’ −ＯＤ’をめ、標準液
（ビリルビン既Ｂ 知娘度）での吸光度差と比較してビリルビン濃度をめた
。なお測定には日立７０５（日立製作新製）を使用し、
測定波長は主波長４・５０ｎｍ、副波長５４６ ｎｍの
２波長で行なった。
５分間反比・させる。５分後に吸光度を測定する（ Ｏ
Ｄ’ ）。次に、当該反応液に第２試薬１００ ｐｔを
加え、３７℃で５分間反応はせ、吸光度を測定する（
ｏＤ’ ）。吸光度差−ＯＤ’ −ＯＤ’をめ、標準液
（ビリルビン既Ｂ 知娘度）での吸光度差と比較してビリルビン濃度をめた
。なお測定には日立７０５（日立製作新製）を使用し、
測定波長は主波長４・５０ｎｍ、副波長５４６ ｎｍの
２波長で行なった。
その結果、第１図に示す如く、約３０■／ｄｔまでの直
線性が明らかとなった。また柚々の誕度（０，２〜３０
ｑ／ｄ２）の検体を繰り返し４１１１足して再現性を調
べたところ、いずれの場合も再現性は良好であった。
線性が明らかとなった。また柚々の誕度（０，２〜３０
ｑ／ｄ２）の検体を繰り返し４１１１足して再現性を調
べたところ、いずれの場合も再現性は良好であった。
実施例２
検体として生血清を用い、反応曲線を調べた。第２図に
示すように反応は５分程度でエンド・４ｅインドに達し
反応は完了した。なおこの検体のビリルビン濃度は１８
．８■／ｄｔだった。
示すように反応は５分程度でエンド・４ｅインドに達し
反応は完了した。なおこの検体のビリルビン濃度は１８
．８■／ｄｔだった。
実施例３
検体としてビリルビンコントロール血清 ４゜（ディト
社製）及び下記ｐＨの異なる試薬を用いて、反応時間を
比較した。得られた反応曲線を第３図に示す。
社製）及び下記ｐＨの異なる試薬を用いて、反応時間を
比較した。得られた反応曲線を第３図に示す。
（試薬組成）
試薬人（ｐＨ８）：
０．０４２Ｍ４２Ｍジエチルバルビッール ＩＪウム・
塩酸緩衝液、０．０８３％８Ｄ８，０．０８％５ＤＢ８
含有。
塩酸緩衝液、０．０８３％８Ｄ８，０．０８％５ＤＢ８
含有。
試薬Ｂ （ｐＨ７） ：
０．０４２Ｍイミダゾール・塩酸緩衝液、０、０８３％
ＳＤＳ、０．０８３％８ＤＢ８含有。
ＳＤＳ、０．０８３％８ＤＢ８含有。
第３図から明らかな如く、ｐＨ８でｉｉ′ｐＨ７の場合
に比べ反応時間が格段に短かく、反応のエンド・ＡＰイ
ンドも明確であった。
に比べ反応時間が格段に短かく、反応のエンド・ＡＰイ
ンドも明確であった。
第１図は、希釈倍率とビリルビン濃度の定量値の相関を
示す図面、第２図は検体に生血・清を用いた場合の反応
曲線を示す図面、第３図はｐＨ７（−−−）又はｐＨ８
（−−−）の試薬を用いた場合の反応曲線を示す図面で
ある。 以上 第１図 （ｍｖａｔ ） 希釈倍率 第２図 反応時間（分）
示す図面、第２図は検体に生血・清を用いた場合の反応
曲線を示す図面、第３図はｐＨ７（−−−）又はｐＨ８
（−−−）の試薬を用いた場合の反応曲線を示す図面で
ある。 以上 第１図 （ｍｖａｔ ） 希釈倍率 第２図 反応時間（分）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 水性検体に、ビリルビンオキシダーゼ及び陰イオ
ン界面活性剤を含有するｐａ ８以上のアルカリ性緩衝
液からなる試薬を作用せしめ、その吸光度を測定するこ
とを特徴とするビリルビンの定量方法。 ２、 陰イオン界面活性剤がアルキル硫酸塩又は／及び
アルキル了りルスルホネートである特許請求の範囲第１
項記載のビリルビンの定量方法。 ３、 陰イオン界面活性剤がドデシル硫酸す） ＩＪウ
ムである特許請求の範囲第１項記載のビリルビンの定量
方法。 ４、陰イオン界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム及び
ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムである特許請求
の範囲第１項記載のビリルビンの定量方法。 ５、 アルカリ性緩衝液がゾエテルパルビツール酸ナト
リウム・塩酸緩衝液である特許請求の範囲第１項記載の
ビリルビンの定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP764584A JPS60151561A (ja) | 1984-01-19 | 1984-01-19 | ビリルビンの定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP764584A JPS60151561A (ja) | 1984-01-19 | 1984-01-19 | ビリルビンの定量方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60151561A true JPS60151561A (ja) | 1985-08-09 |
Family
ID=11671559
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP764584A Pending JPS60151561A (ja) | 1984-01-19 | 1984-01-19 | ビリルビンの定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60151561A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020116547A1 (ja) * | 2018-12-05 | 2020-06-11 | 大関株式会社 | ビリルビンオキシダーゼの活性向上方法、およびビリルビンオキシダーゼ製品 |
| WO2020116546A1 (ja) * | 2018-12-05 | 2020-06-11 | 大関株式会社 | ビリルビンオキシダーゼの保存方法、ビリルビンオキシダーゼ製品、および染毛剤 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5917999A (ja) * | 1982-07-23 | 1984-01-30 | Amano Pharmaceut Co Ltd | ビリルビンの定量法及びその定量用試薬組成物 |
-
1984
- 1984-01-19 JP JP764584A patent/JPS60151561A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5917999A (ja) * | 1982-07-23 | 1984-01-30 | Amano Pharmaceut Co Ltd | ビリルビンの定量法及びその定量用試薬組成物 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020116547A1 (ja) * | 2018-12-05 | 2020-06-11 | 大関株式会社 | ビリルビンオキシダーゼの活性向上方法、およびビリルビンオキシダーゼ製品 |
| WO2020116546A1 (ja) * | 2018-12-05 | 2020-06-11 | 大関株式会社 | ビリルビンオキシダーゼの保存方法、ビリルビンオキシダーゼ製品、および染毛剤 |
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