JPS59179081A - プラスミドｐＴＰ１１０２ - Google Patents
プラスミドｐＴＰ１１０２Info
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- JPS59179081A JPS59179081A JP58053051A JP5305183A JPS59179081A JP S59179081 A JPS59179081 A JP S59179081A JP 58053051 A JP58053051 A JP 58053051A JP 5305183 A JP5305183 A JP 5305183A JP S59179081 A JPS59179081 A JP S59179081A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規なプラスミドに関するものである。
近年、ベクターとして使用可能と思われるプラスミドの
種々のものが知られるようになったが、更に多くの有用
なプラスミドの開発が期待されている。
種々のものが知られるようになったが、更に多くの有用
なプラスミドの開発が期待されている。
本発明者は、コリネバクテリウム由来のプラスミドとブ
ドウ球菌由来のプラスミドに由来するプラスミドが枯草
菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ）に安定に
存在し、制限酵素による切断点があり、かつ薬剤耐性を
有していることを利用して本発明を完成した。
ドウ球菌由来のプラスミドに由来するプラスミドが枯草
菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ）に安定に
存在し、制限酵素による切断点があり、かつ薬剤耐性を
有していることを利用して本発明を完成した。
すなわち、コリネバクテリウム・キセロシス（Ｃｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｒｏＳｉｓ ）からプラ
スミドｐＴＰＩＱを分離し、これで枯草菌を形質転換後
再びプラスミド（ｐＴＰｌｌ）を分離し、このものとブ
ドウ球菌出来のプラスミドｐＮｓ１（Ｇｅｎｅ ２１，
１０５〜１１２（１９８３））を制限酵素Ｈｉｎｄ Ｉ
で切断した後ライゲイジョンすることにより分子紙が約
４・、、３Ｍｄであるプラスミド１）ＴＰＩＩ（１２が
得られる。
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｒｏＳｉｓ ）からプラ
スミドｐＴＰＩＱを分離し、これで枯草菌を形質転換後
再びプラスミド（ｐＴＰｌｌ）を分離し、このものとブ
ドウ球菌出来のプラスミドｐＮｓ１（Ｇｅｎｅ ２１，
１０５〜１１２（１９８３））を制限酵素Ｈｉｎｄ Ｉ
で切断した後ライゲイジョンすることにより分子紙が約
４・、、３Ｍｄであるプラスミド１）ＴＰＩＩ（１２が
得られる。
これらの工程における処理手段は公知の一般的方法を使
用することができ２例えば次のような方法が用いられる
。
用することができ２例えば次のような方法が用いられる
。
コリネバクテリウムの培養と溶菌は５ｈｉｌｌｅｒらの
方法（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、 Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅ
ｍｏｔｈｅｒ、 １８．’８１４〜８２Ｎ１９８０））
に準じて行ない、アルカリ変性法によるＤＮＡの抽出は
Ｈａｎｓｅｎおよび０１ｓｅｎの方法（Ｊ、 Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、 １３５．２２７〜２３８（１９７８））
に従って行なえばよい。
方法（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、 Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅ
ｍｏｔｈｅｒ、 １８．’８１４〜８２Ｎ１９８０））
に準じて行ない、アルカリ変性法によるＤＮＡの抽出は
Ｈａｎｓｅｎおよび０１ｓｅｎの方法（Ｊ、 Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、 １３５．２２７〜２３８（１９７８））
に従って行なえばよい。
枯草菌の形質転換はＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎのプロ
トプラスト法（Ｍｏｌｅｃｏｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、
１６８ 、１１１〜１１５（１９７９））に準じて行な
えばよい。
トプラスト法（Ｍｏｌｅｃｏｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、
１６８ 、１１１〜１１５（１９７９））に準じて行な
えばよい。
プラスミドの分離にはアガロースゲル電気泳動法や密度
勾配遠心法のような一般的な方法を用いることができ、
また、プラスミドＤＮＡの制限酵累による切断と、ＤＮ
Ａ鎖の連結酵累（リガーゼ）による結合（ライゲイジョ
ン）も常法によって行なうことができる。
勾配遠心法のような一般的な方法を用いることができ、
また、プラスミドＤＮＡの制限酵累による切断と、ＤＮ
Ａ鎖の連結酵累（リガーゼ）による結合（ライゲイジョ
ン）も常法によって行なうことができる。
次に９本発明のプラスミドの製造法を実験例により詳述
するが、使用したコリネバクテリウム・キセロシスＭ８
２Ｂ株は２本発明者が分離した菌株であり９分子量が８
０．４±２．７Ｍｄのプラスミドを保有しており、この
プラスミド上にエリスロマイシン、カナマイシン、クロ
ラムフェニコール、テトラサイクリン耐性遺伝子を持っ
ている。また、染色体上にもストレプトマイ・′−シン
耐性遺伝子を有している。
するが、使用したコリネバクテリウム・キセロシスＭ８
２Ｂ株は２本発明者が分離した菌株であり９分子量が８
０．４±２．７Ｍｄのプラスミドを保有しており、この
プラスミド上にエリスロマイシン、カナマイシン、クロ
ラムフェニコール、テトラサイクリン耐性遺伝子を持っ
ている。また、染色体上にもストレプトマイ・′−シン
耐性遺伝子を有している。
例１：コリネバクテリウム・キセロシスＭ８２Ｂ株から
のプラスミドＤＮＡの分離 トリプトソイブイヨン培地（トリプトン１７り、ソイペ
プトン３ｇ、ブドウ糖２．５ｐ、 リン酸−水素カリ
ウム２．５９．塩化ナトリウム５９゜蒸留水１ ｌ、
ｐＨ７，３）によるＭ２Ｂ５株の一夜培養液を新鮮同培
地に１／１００量接種し。
のプラスミドＤＮＡの分離 トリプトソイブイヨン培地（トリプトン１７り、ソイペ
プトン３ｇ、ブドウ糖２．５ｐ、 リン酸−水素カリ
ウム２．５９．塩化ナトリウム５９゜蒸留水１ ｌ、
ｐＨ７，３）によるＭ２Ｂ５株の一夜培養液を新鮮同培
地に１／１００量接種し。
３７°Ｃで約３時間振盪培養した後、ペニシリンＧを最
終濃度５１１１；ｌ／−となるように加え、さらに２時
間振盪培養した。
終濃度５１１１；ｌ／−となるように加え、さらに２時
間振盪培養した。
この培養液を冷却遠心し、得られたベレットをＴＥバッ
ファ（１０ｍＭ）リスアミノメタン。
ファ（１０ｍＭ）リスアミノメタン。
Ｑ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）で２回洗浄後。
ＴＥバッファに溶かした０、５Ｍシュークロースに懸濁
した。この懸濁液にリゾチーム（シグマ）を最終濃度１
０１ｔ９／−となるように加え８７℃で２時間インキュ
ベートした。
した。この懸濁液にリゾチーム（シグマ）を最終濃度１
０１ｔ９／−となるように加え８７℃で２時間インキュ
ベートした。
この溶液に１０％ｓｎｓ （ドデシル硫酸ナトリウム）
溶液を最終濃度１％になるように加え。
溶液を最終濃度１％になるように加え。
５５°Ｃで３０分間静置した。次に新たに調整した３Ｎ
水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ１，２，１〜１２．
８とし軽く混和後、２Ｍトリス溶液（ｐＨ７，０）を水
酸化ナトリウム溶液の２倍量加えた。
水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ１，２，１〜１２．
８とし軽く混和後、２Ｍトリス溶液（ｐＨ７，０）を水
酸化ナトリウム溶液の２倍量加えた。
さらに５Ｍ塩化ナトリウム溶液を最終濃度ＩＭとなるよ
うに加えた後４°Ｃで一夜放置した０その後１０．００
Ｏｒｐｍ、８０分の冷却遠心により上清を分取し、Ｔ
ＩＥバッファで飽和した等量の再蒸留ツーノールを加え
よく混和した。
うに加えた後４°Ｃで一夜放置した０その後１０．００
Ｏｒｐｍ、８０分の冷却遠心により上清を分取し、Ｔ
ＩＥバッファで飽和した等量の再蒸留ツーノールを加え
よく混和した。
１０．００ Ｏｒｐｍ、２０分の冷却遠心により水Ｊ・
ａを分取し、−２０°Ｃのエタノールを３倍量加えて、
−２０°Ｃで一夜放置した。 １０＋０００ｒｐｍ８０
分間の冷却遠心によりペレットを集め、ＴＥバッファー
に溶解し、ＤＮＡ溶液とした。
ａを分取し、−２０°Ｃのエタノールを３倍量加えて、
−２０°Ｃで一夜放置した。 １０＋０００ｒｐｍ８０
分間の冷却遠心によりペレットを集め、ＴＥバッファー
に溶解し、ＤＮＡ溶液とした。
例２：Ｍ８２Ｂ株より抽出されたプラスミドｐＴＰ１０
ＤＮＡによる枯草菌の形質転換 枯草菌１６８ Ｌ ｕ Ａ Ｈ７６１２２２（１ｅｕ−
。
ＤＮＡによる枯草菌の形質転換 枯草菌１６８ Ｌ ｕ Ａ Ｈ７６１２２２（１ｅｕ−
。
ｍｅｔ−、ＩＬ（１８−、ｈｉｒ−）株のバクトーペン
アッセイブロス（ディ７コ；バクトービー７抽出物１．
５シ、バクトー酵母抽出物１．５９．バタトペブトン５
り、バタトーデキストロース１り、塩化ナトリウム８．
５ｇ、 リン酸二カリウム８．．６８９ 。
アッセイブロス（ディ７コ；バクトービー７抽出物１．
５シ、バクトー酵母抽出物１．５９．バタトペブトン５
り、バタトーデキストロース１り、塩化ナトリウム８．
５ｇ、 リン酸二カリウム８．．６８９ 。
リン酸−カリウムＬ８２９．蒸留水１７．ｐＨ７，０±
０．１）による−夜培養液を新しい同培地に１／ｌｏｏ
量接種し８７℃で吸光度（ＯＤ） 。
０．１）による−夜培養液を新しい同培地に１／ｌｏｏ
量接種し８７℃で吸光度（ＯＤ） 。
０．４ （６００ｎｍ）まで振盪培養した。菌体を遠心
により集菌し、ＳＭＭＰバッファー（０，５Ｍシューク
ロース、０．０２Ｍマレイン酸二ナトリウム、１Ｍ塩化
マグネシウムを２倍濃度のバクトーベンアッセイブロス
に溶解）に懸濁した後。
により集菌し、ＳＭＭＰバッファー（０，５Ｍシューク
ロース、０．０２Ｍマレイン酸二ナトリウム、１Ｍ塩化
マグネシウムを２倍濃度のバクトーベンアッセイブロス
に溶解）に懸濁した後。
最終濃度２１ｎ９／−となるようにリゾチームを加えた
。３７°Ｃ約１時間の培養の後８，００ Ｏｒｐｍ１５
分の遠心により集菌し、ＳＭＭＰバッファーで一度洗浄
後、菌体を６４のＳＭＭＰバッファーに懸濁し、プロト
プラスト溶液とした。
。３７°Ｃ約１時間の培養の後８，００ Ｏｒｐｍ１５
分の遠心により集菌し、ＳＭＭＰバッファーで一度洗浄
後、菌体を６４のＳＭＭＰバッファーに懸濁し、プロト
プラスト溶液とした。
例１で得たＤＮＡ溶液５０μｌ（約ＤＮＡ０．５μり）
に同量の二倍濃度のＳＭＭバ、ファー（ｌ ｋ（シュー
クロース、０．０４Ｍマレイン酸二ナトリウム、２Ｍ塩
化マグネシウム）を加えた後、上述のプロトプラスト溶
液ｌ記を加えた。
に同量の二倍濃度のＳＭＭバ、ファー（ｌ ｋ（シュー
クロース、０．０４Ｍマレイン酸二ナトリウム、２Ｍ塩
化マグネシウム）を加えた後、上述のプロトプラスト溶
液ｌ記を加えた。
さらに４０％ポリエチレングリコール６０００溶液３−
を加えて、０°Ｃ２分間静置後５−のＳＭＭＰバッファ
ーを加え８，０００ｒｐｍ １０分間の遠心により集
菌した。集めたプロトブラストペレットを１記のＳ Ｍ
Ｍ ｐバッファーに懸濁し８０°Ｃで１．５時間培養
後、その０．１−をクロラムフェニコール２５μ９．／
ｄ金含有ＤＭ−３再生培地（リン酸二カリウム３．５り
、リン酸−カリウム１．５９．カザミノ酸５ｇ、塩りマ
グネシウム４．０６９． コハク酸ナトリウム１３１
゜酵母抽出物５り、グルコース５９．寒天８９゜牛血清
アルブミン０．０５り、蒸留水１１．ｐＨ７，８）に塗
抹し、８７°Ｃで２・〜８日間培養することにより形質
転換株を得た。
を加えて、０°Ｃ２分間静置後５−のＳＭＭＰバッファ
ーを加え８，０００ｒｐｍ １０分間の遠心により集
菌した。集めたプロトブラストペレットを１記のＳ Ｍ
Ｍ ｐバッファーに懸濁し８０°Ｃで１．５時間培養
後、その０．１−をクロラムフェニコール２５μ９．／
ｄ金含有ＤＭ−３再生培地（リン酸二カリウム３．５り
、リン酸−カリウム１．５９．カザミノ酸５ｇ、塩りマ
グネシウム４．０６９． コハク酸ナトリウム１３１
゜酵母抽出物５り、グルコース５９．寒天８９゜牛血清
アルブミン０．０５り、蒸留水１１．ｐＨ７，８）に塗
抹し、８７°Ｃで２・〜８日間培養することにより形質
転換株を得た。
例８：形質転換株からのプラスミドＤＮＡの分離
得られたクロラムフェニコール耐性の形質転換株をディ
フコラボラドリース社製プレインハートインフュージョ
ン培地（ＢＨＩ培地）１０ｄに接種し、−夜装置培養し
た。この培養液をＣＹ培地（リン酸二カリウム０．７％
、リン酸−カリウム０．３％、硫酸アンモニウム０．１
％、クエン酸ナトリウム０．０５％、カザミノ酸０．２
％。
フコラボラドリース社製プレインハートインフュージョ
ン培地（ＢＨＩ培地）１０ｄに接種し、−夜装置培養し
た。この培養液をＣＹ培地（リン酸二カリウム０．７％
、リン酸−カリウム０．３％、硫酸アンモニウム０．１
％、クエン酸ナトリウム０．０５％、カザミノ酸０．２
％。
酵母抽出物０．１％、硫酸マグネシウム０．０２５％、
ブドウ糖０．５％、ｐＨ７，０）１０−に吸光度０．１
（６０（ＩｒＬｍ）になるように加えた。
ブドウ糖０．５％、ｐＨ７，０）１０−に吸光度０．１
（６０（ＩｒＬｍ）になるように加えた。
８７℃で振盪培養し、吸光度０．８（６００ｒＬｍ）の
時にデオキシアデノシンを最終濃度２５０〃〜になるよ
うに加えた。８分後トリチウム標識チミジンを最終濃度
１０μＣｉｉ／−になるように加えた。
時にデオキシアデノシンを最終濃度２５０〃〜になるよ
うに加えた。８分後トリチウム標識チミジンを最終濃度
１０μＣｉｉ／−になるように加えた。
吸光度０．８（６０（１ｍ）の時点で氷にて発育を停止
させ、Ｎｏ、０ＯＯＸｇで１５分間４°Ｃに於て遠心し
てプロスから菌体を分離し、菌体ペレットをＴＥＳ緩衝
液（０，０５Ｍ塩化ナトリウム、０．００５Ｍ ＥＤ
ＴＡ含有トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０））に再懸濁
した。
させ、Ｎｏ、０ＯＯＸｇで１５分間４°Ｃに於て遠心し
てプロスから菌体を分離し、菌体ペレットをＴＥＳ緩衝
液（０，０５Ｍ塩化ナトリウム、０．００５Ｍ ＥＤ
ＴＡ含有トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０））に再懸濁
した。
次に、０．５Ｍ ＥＤＴＡ液０．２ｉ、 １ ｏｒｎ９
／ｉ濃度のリゾチーム液０．１−を加え、混合物を１０
分間３７℃で培養した。これにプリジー５８（花王アト
ラス■）を最終濃度０．５％となるように加え、８７℃
で１ｏ分間培養した。次にＮ−ラウロイルサルコシンナ
トリウムを最終濃度２．５％になるように加え、５０°
Ｃで３０分間培養し溶菌を行った。
／ｉ濃度のリゾチーム液０．１−を加え、混合物を１０
分間３７℃で培養した。これにプリジー５８（花王アト
ラス■）を最終濃度０．５％となるように加え、８７℃
で１ｏ分間培養した。次にＮ−ラウロイルサルコシンナ
トリウムを最終濃度２．５％になるように加え、５０°
Ｃで３０分間培養し溶菌を行った。
溶菌液をピペットにて粘性をとり、軟化させたのち、塩
化セシウムおよび臭化エチジウムと混合し、密度１．５
５８の溶液とした。この溶液を１２６，０ＯＯＸりで平
衡まで（約４０時間）遠心した。
化セシウムおよび臭化エチジウムと混合し、密度１．５
５８の溶液とした。この溶液を１２６，０ＯＯＸりで平
衡まで（約４０時間）遠心した。
遠心管下部末端より、溶液を分画分取し、各分画ごとに
１０μｌをワットマンろ紙ＣＦ ／ Ａに吸着させ、こ
のろ紙に吸着されたトリチウムの放射活性を液体シンチ
レーションカウンター（パラカードａａｏｏ ）にて測
定しｃｐｍにて表わすと、染色体ＤＮＡに由来する高活
性を示す分画の大きなピークとプラスミドＤＮＡに由来
する小さなピークの２つが得られた。この小さなピーク
を示した分画をとり、ｎ−オクタツールで２回処理する
ことにより、臭化エチジウムを抽出除去した。次に水層
をＳＳＧ緩衝液（０，１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１
！ＭＪクエン酸ナトリウムＴ Ｉ）Ｈ’ｉ、ｏ ）の１
０倍希釈液に対して透析してプラスミドを分離した。分
離したプラスミドＤＮＡの分子量を電子顕微鏡により測
定したところ４．７Ｍｄであった。本プラスミドをｐＴ
Ｐｌｌとする。また本プラスミドを所有する菌株を枯草
菌ＬＭＡＨ（ｐＴＰｌｌ）株と名付けた。本プラスミド
のコピー数は約２０であった。
１０μｌをワットマンろ紙ＣＦ ／ Ａに吸着させ、こ
のろ紙に吸着されたトリチウムの放射活性を液体シンチ
レーションカウンター（パラカードａａｏｏ ）にて測
定しｃｐｍにて表わすと、染色体ＤＮＡに由来する高活
性を示す分画の大きなピークとプラスミドＤＮＡに由来
する小さなピークの２つが得られた。この小さなピーク
を示した分画をとり、ｎ−オクタツールで２回処理する
ことにより、臭化エチジウムを抽出除去した。次に水層
をＳＳＧ緩衝液（０，１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１
！ＭＪクエン酸ナトリウムＴ Ｉ）Ｈ’ｉ、ｏ ）の１
０倍希釈液に対して透析してプラスミドを分離した。分
離したプラスミドＤＮＡの分子量を電子顕微鏡により測
定したところ４．７Ｍｄであった。本プラスミドをｐＴ
Ｐｌｌとする。また本プラスミドを所有する菌株を枯草
菌ＬＭＡＨ（ｐＴＰｌｌ）株と名付けた。本プラスミド
のコピー数は約２０であった。
例４＝プラスミドｐＴｐＨによる枯草菌ＲＭ１２５株の
形質転換 枯草菌ＬＭＡＨ（ｐＴＰｌｌ ）株よりプラスミドＤＮ
Ａを下記の方法により調整した。
形質転換 枯草菌ＬＭＡＨ（ｐＴＰｌｌ ）株よりプラスミドＤＮ
Ａを下記の方法により調整した。
枯草菌ＬＭＡＨ（ｐＴＰｌｌ ）株をＢＨＩ培地１００
ｍ１に接種し、８７℃で約１８〜２４時間振盪培養する
。
ｍ１に接種し、８７℃で約１８〜２４時間振盪培養する
。
この細胞懸濁液を１％の率で同培地の２０本のフラスコ
に接種するのに使用する。８７°Ｃで１８〜２４時間振
盪培養後、１０，０００Ｘ９で約１５分間４℃に於て遠
心し上澄を傾斜で除く。
に接種するのに使用する。８７°Ｃで１８〜２４時間振
盪培養後、１０，０００Ｘ９で約１５分間４℃に於て遠
心し上澄を傾斜で除く。
得た菌体ペレットをＴＥＳ緩衝液によって２回洗浄後、
１００−の２５％蔗糖含有ＴＥＳ緩衝液に再懸濁する。
１００−の２５％蔗糖含有ＴＥＳ緩衝液に再懸濁する。
次に０．５Ｍ−ＥＤＴＡ溶液４０ ｍ７．１０ｍ９／ｒ
ｎｌ濃度のリゾチーム溶液２９ｔｄを加え混合物を３０
分間３７℃で培養する。次に５０■／−濃度のプリジー
５８２０４を加え、混合物を８７°Ｃで１０分間培養す
る。さらに２５０７＋１９／ｍｌ濃度のＮ−ラウロイル
サルコシンナトリウム２０ＷＬ／を加え、５０°Ｃで１
０〜８０分間培養する（細胞破壊）。
ｎｌ濃度のリゾチーム溶液２９ｔｄを加え混合物を３０
分間３７℃で培養する。次に５０■／−濃度のプリジー
５８２０４を加え、混合物を８７°Ｃで１０分間培養す
る。さらに２５０７＋１９／ｍｌ濃度のＮ−ラウロイル
サルコシンナトリウム２０ＷＬ／を加え、５０°Ｃで１
０〜８０分間培養する（細胞破壊）。
溶解物を２６，０ＯＯＸり、３０分間冷却遠心後、上澄
に５Ｍ塩化す） ＩＪウム溶液５０−を加え一夜放置後
、ポリエチレングリコール６０００を最終濃度１０％と
なるように加え、さらに−夜４°Ｃにて放置した。この
混合物を１０，０００Ｘｉ、１５分間遠心し、得られた
ペレットをＴＥＳ緩衝液に溶解した。
に５Ｍ塩化す） ＩＪウム溶液５０−を加え一夜放置後
、ポリエチレングリコール６０００を最終濃度１０％と
なるように加え、さらに−夜４°Ｃにて放置した。この
混合物を１０，０００Ｘｉ、１５分間遠心し、得られた
ペレットをＴＥＳ緩衝液に溶解した。
この溶液を塩化セシウムおよび臭化エチジウムと混合し
て密度１．５５３の溶液を製する。この溶液を１２６，
０ＯＯＸりで平衡まで（約４０時間）遠心する。紫外線
照射下で（８６５ｎｍ）線状染色体およびプラスミドＤ
ＮＡは強い螢光を発するバンドとして遠心機チー−ブの
中に見られる。
て密度１．５５３の溶液を製する。この溶液を１２６，
０ＯＯＸりで平衡まで（約４０時間）遠心する。紫外線
照射下で（８６５ｎｍ）線状染色体およびプラスミドＤ
ＮＡは強い螢光を発するバンドとして遠心機チー−ブの
中に見られる。
このプラスミドＤＮＡを密度勾配から取り出し、ｎ−オ
クタツールで２回抽出することにより臭化エチジウムを
除き７次に水層を１０倍希釈５ｓｃａ衝液に対して透析
してｐＴＰｌｌを得た。
クタツールで２回抽出することにより臭化エチジウムを
除き７次に水層を１０倍希釈５ｓｃａ衝液に対して透析
してｐＴＰｌｌを得た。
得られたｐＴＰｌｌ ＤＮＡを前述のプロトプラスト法
により枯草菌の制限欠損−修飾欠損株であるＲＭ１２５
株へ形質転換した。
により枯草菌の制限欠損−修飾欠損株であるＲＭ１２５
株へ形質転換した。
ｉ らｈｔ、＝クロラムフェニコール耐性コロニーのひ
とつを使い、トリチウム標識チミジンラベル法によりプ
ラスミドの検出を行ったところｐＴＰｌｌと全く同じ分
子量のプラスミドを検出することが出来た。本実験より
プラスミドｐＴＰ１１上にはクロラムフェニコール耐性
遺伝子が存在していることが確認された。
とつを使い、トリチウム標識チミジンラベル法によりプ
ラスミドの検出を行ったところｐＴＰｌｌと全く同じ分
子量のプラスミドを検出することが出来た。本実験より
プラスミドｐＴＰ１１上にはクロラムフェニコール耐性
遺伝子が存在していることが確認された。
例５ニブラスミドｐＴＰ１１の制限酵素開裂意地図の作
成 制限酵素によるプラスミドＤＮＡの消化は次の条件によ
り行った。また、２種の制限酵素を組み合わせて反応さ
せる場合は、一方の酵素反応をフェノールで停止させ、
さらにフェノールをエーテル抽出した後に２倍量のエタ
ノールを加え、析出したＤＮＡを遠心によって集めＴＥ
バッファーに溶解した後２次の酵素反応を行った。
成 制限酵素によるプラスミドＤＮＡの消化は次の条件によ
り行った。また、２種の制限酵素を組み合わせて反応さ
せる場合は、一方の酵素反応をフェノールで停止させ、
さらにフェノールをエーテル抽出した後に２倍量のエタ
ノールを加え、析出したＤＮＡを遠心によって集めＴＥ
バッファーに溶解した後２次の酵素反応を行った。
ＥｃｏＲＩ １０ ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，２）。
７，２）。
５ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭメルカプトエタノール
、５０ｍＭ塩化ナトリウム、８７℃ ＨｐａｌＩ ２０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，
４）。
、５０ｍＭ塩化ナトリウム、８７℃ ＨｐａｌＩ ２０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，
４）。
７ｍＭ塩化マグネシウム１１ｍＭジチオスレイトール（
ＤＴＴ）、８７°Ｃ Ｘｂａｌ ６？ｌ１Ｍ）リスー塩酸綴衝液（ｐＨ７，
４） 。
ＤＴＴ）、８７°Ｃ Ｘｂａｌ ６？ｌ１Ｍ）リスー塩酸綴衝液（ｐＨ７，
４） 。
１００ ｍＭ塩化ナトリウム、６ｍＭ塩化マグネシウム
、３７℃ ＢｃｌＩ １２ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４
Ｌ１２ｍＭ塩化マグネシウム＋１２”Ｍ＠化ナナトリウ
ム ０．５ ｍＭ Ｄ Ｔ Ｔ、 ５０’ＣＨｉｎｄｌ
ｌ ２０ ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（ｐ）（７−４
Ｌ７ｍＭ塩化マグネシウム、６０ｍＭ塩化ナトリウム、
８７°Ｃ 消化混合物はシャープ等によってつくられた１％アガロ
ースゲル中で分析した（ Ｊ、 ５ｈａｒｐ ｅｔ２Ｌ
ｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 １２８０５５〜３
０６８ （１９７８） ）。
、３７℃ ＢｃｌＩ １２ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４
Ｌ１２ｍＭ塩化マグネシウム＋１２”Ｍ＠化ナナトリウ
ム ０．５ ｍＭ Ｄ Ｔ Ｔ、 ５０’ＣＨｉｎｄｌ
ｌ ２０ ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（ｐ）（７−４
Ｌ７ｍＭ塩化マグネシウム、６０ｍＭ塩化ナトリウム、
８７°Ｃ 消化混合物はシャープ等によってつくられた１％アガロ
ースゲル中で分析した（ Ｊ、 ５ｈａｒｐ ｅｔ２Ｌ
ｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 １２８０５５〜３
０６８ （１９７８） ）。
ＥｃｏＲｌ消化λＤＮＡを分子量対照として使用した（
Ｔｈｏｍａｓら、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、
９１ ３１５〜８２８（１９７５））。
Ｔｈｏｍａｓら、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、
９１ ３１５〜８２８（１９７５））。
ｐＴＰｌｌの制限酵素開裂点の数および開裂断片の分子
量を表に示し、開裂黒地図は図１に示した。
量を表に示し、開裂黒地図は図１に示した。
例６：プラスミドｐＴＰ１１０２の製造枯草菌ＲＩＪ１
２５ （ｐＮｓｌ ）株（Ｇｅｎｅ ２１゜１０５〜１
１２（１９８３））よりプラスミドｐＮＳ Ｉ ＤＮＡ
（制限酵素開裂意地図を図２に示す）を前述の方法（例
４）と同様にして抽出し、プラスミドｐＴＰ１１ ＤＮ
Ａと混合後制限酵素）（ｉｎｄ Ｎで切断した。すなわ
ち、、ｐＴＰｌｌＤＮＡ １％と１）ＮＳＩ ｌｐｇを
２０ｍλ（トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）、 ７
ｍＭ塩化マグネシウム。
２５ （ｐＮｓｌ ）株（Ｇｅｎｅ ２１゜１０５〜１
１２（１９８３））よりプラスミドｐＮＳ Ｉ ＤＮＡ
（制限酵素開裂意地図を図２に示す）を前述の方法（例
４）と同様にして抽出し、プラスミドｐＴＰ１１ ＤＮ
Ａと混合後制限酵素）（ｉｎｄ Ｎで切断した。すなわ
ち、、ｐＴＰｌｌＤＮＡ １％と１）ＮＳＩ ｌｐｇを
２０ｍλ（トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）、 ７
ｍＭ塩化マグネシウム。
６ＱｍＭ塩化ナトリウム、 ［（ｉｎｄｌ １０単位
含有溶液中で８７°Ｃ，１時間の反応により切断する。
含有溶液中で８７°Ｃ，１時間の反応により切断する。
反応をツーノールを加えることにより停止させ、エーテ
ル抽出によりフェノールを除去後２倍量のエタノールを
加え、ＤＮＡを沈殿させた。
ル抽出によりフェノールを除去後２倍量のエタノールを
加え、ＤＮＡを沈殿させた。
沈殿したＤＮＡペレットを６６ｆｆ１Ｍ）リス塩酸緩衝
液（ｐＨ７，６） 、 ６’、６ ｍＭ塩化マグネシウ
ム、１ｏｍＭジチオスレイトール、４ｆｉＭ了デノシン
三リン酸溶液１００μｌに溶解後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
０．０１単位を加え１６°Ｃ，１６時間の反応によって
ＤＮＡを連結させた。フェノールにより反応を停止させ
、エーテル抽出によりフェノールを除去後、２倍量のエ
タノールを加えＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを
滅菌蒸留水５０μｌに溶解し、形質転換用Ｄ Ｉ＝Ｉ
Ａ試料として用いた。
液（ｐＨ７，６） 、 ６’、６ ｍＭ塩化マグネシウ
ム、１ｏｍＭジチオスレイトール、４ｆｉＭ了デノシン
三リン酸溶液１００μｌに溶解後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
０．０１単位を加え１６°Ｃ，１６時間の反応によって
ＤＮＡを連結させた。フェノールにより反応を停止させ
、エーテル抽出によりフェノールを除去後、２倍量のエ
タノールを加えＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを
滅菌蒸留水５０μｌに溶解し、形質転換用Ｄ Ｉ＝Ｉ
Ａ試料として用いた。
形質転換は例２に記載したプロトプラスト法により行っ
た。受容菌には枯草菌ＲＭ１２５株を用いた。
た。受容菌には枯草菌ＲＭ１２５株を用いた。
得られたクロラムフェニコール、テトラサイクリン両耐
性を持つコロニーについてプラスミドＤＮＡの検索を行
った。すなわち、得られたコロニーを溶菌用緩衝液（リ
ゾチーム２μシ／ ｍｌ。
性を持つコロニーについてプラスミドＤＮＡの検索を行
った。すなわち、得られたコロニーを溶菌用緩衝液（リ
ゾチーム２μシ／ ｍｌ。
ＲＮａｓｅ ０． Ｉ Ｍ９／ ｙｄ、 ２５％シュー
クロースとなるようにＴＥバッファーに溶解）４０μｌ
に懸濁し３７°Ｃ，２時間反応させた。この溶液に５％
ＳＤＳ溶液１０μｌを加え、完全に溶菌後、フェノール
５０μｌを加え１０．００Ｏｒｐｍ１０分間の遠心後、
水層を分取した。
クロースとなるようにＴＥバッファーに溶解）４０μｌ
に懸濁し３７°Ｃ，２時間反応させた。この溶液に５％
ＳＤＳ溶液１０μｌを加え、完全に溶菌後、フェノール
５０μｌを加え１０．００Ｏｒｐｍ１０分間の遠心後、
水層を分取した。
この水層についてアガロースゲル電気泳動法により、プ
ラスミドＩＪＮＡの確認を行い１分子量が最も小さいプ
ラスミドＤＮＡを持っているいくつかの形質転換株を選
択した。
ラスミドＩＪＮＡの確認を行い１分子量が最も小さいプ
ラスミドＤＮＡを持っているいくつかの形質転換株を選
択した。
各形質転換株より前述の方法でプラスミドＤＮＡを調製
し、 ＥｃｏＲｌ、 ＨｉｎｄｕおよびＫｐｎ １に
関する制限酵素開裂意地図を作成した。Ｋｐｎ １の反
応条件は６ｍＭ）’Ｊスス−酸緩衝液（ｐＨ７，５）、
６ｍＭ塩化ナトリウム、６ｍＭ塩化マグネシウム、（（
ｍＭ ２−メルカプトエタノール。
し、 ＥｃｏＲｌ、 ＨｉｎｄｕおよびＫｐｎ １に
関する制限酵素開裂意地図を作成した。Ｋｐｎ １の反
応条件は６ｍＭ）’Ｊスス−酸緩衝液（ｐＨ７，５）、
６ｍＭ塩化ナトリウム、６ｍＭ塩化マグネシウム、（（
ｍＭ ２−メルカプトエタノール。
８７°Ｃである。
この結果、ｐＮ３１由来のＨｉｎｄＥｌ −Ａ断片ミド
ｐＴｐＨ０１とｐＴＰ１１０２をそれぞれ持つ２種の形
質転換株が存在することが確認された。
ｐＴｐＨ０１とｐＴＰ１１０２をそれぞれ持つ２種の形
質転換株が存在することが確認された。
ｐＴＰｌｌｏｌとｐＴＰ１１０２の制限酵素開裂意地図
を図３と図４および図５に示した。
を図３と図４および図５に示した。
また、コピー数はおのおの約１００コピーであった。
以上に述べたように９本発明のプラスミドは分子量が約
４．３Ｍｄと取扱いに適当でコピー数が多く、かつテト
ラサイクリン耐性、クロラムフェニコール耐性の二つの
マーカーを有しているので極めて有用なものである。
４．３Ｍｄと取扱いに適当でコピー数が多く、かつテト
ラサイクリン耐性、クロラムフェニコール耐性の二つの
マーカーを有しているので極めて有用なものである。
また５以上の例で用いた微生物は工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託されており１次の番号を有している。
技術研究所に寄託されており１次の番号を有している。
コリネバクテリウム・キセロシスＭ８２８ＦＥＲＭ
Ｐ−６９７１ 枯草菌１６８ＬＭＡＨ７６１２２２ ＦＥＲＭ Ｐ−６９７２ 枯草菌ＲＭ１２５ ＦＥＲＭ Ｐ−６９７３枯
草菌ＲＭ１２５ （ｐＮｓｌ ） Ｆ Ｅ Ｂ Ｍ Ｐ −７００８
Ｐ−６９７１ 枯草菌１６８ＬＭＡＨ７６１２２２ ＦＥＲＭ Ｐ−６９７２ 枯草菌ＲＭ１２５ ＦＥＲＭ Ｐ−６９７３枯
草菌ＲＭ１２５ （ｐＮｓｌ ） Ｆ Ｅ Ｂ Ｍ Ｐ −７００８
図１乃至図５は、プラスミドの制限酵素開裂意地図であ
る。 丁Ｃ ドーーーーーーーー ＵＰ ＋とＬ→
る。 丁Ｃ ドーーーーーーーー ＵＰ ＋とＬ→
Claims (1)
- テトラサイクリン耐性遺伝子およびクロラムツー二コー
ル耐性遺伝子を有し１分子量が約４・８メガダルトンで
あり、制限酵素開裂意地図が次の通りであるプラスミド
ｐＴＰ１１０２
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58053051A JPS59179081A (ja) | 1983-03-29 | 1983-03-29 | プラスミドｐＴＰ１１０２ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58053051A JPS59179081A (ja) | 1983-03-29 | 1983-03-29 | プラスミドｐＴＰ１１０２ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59179081A true JPS59179081A (ja) | 1984-10-11 |
| JPH0139755B2 JPH0139755B2 (ja) | 1989-08-23 |
Family
ID=12932058
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58053051A Granted JPS59179081A (ja) | 1983-03-29 | 1983-03-29 | プラスミドｐＴＰ１１０２ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59179081A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61104791A (ja) * | 1984-10-30 | 1986-05-23 | Asahi Chem Ind Co Ltd | テトラサイクリン耐性遺伝子を含むｄｎａ断片および該ｄｎａ断片を含むベクタ−プラスミド |
-
1983
- 1983-03-29 JP JP58053051A patent/JPS59179081A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61104791A (ja) * | 1984-10-30 | 1986-05-23 | Asahi Chem Ind Co Ltd | テトラサイクリン耐性遺伝子を含むｄｎａ断片および該ｄｎａ断片を含むベクタ−プラスミド |
| JPH0224518B2 (ja) * | 1984-10-30 | 1990-05-29 | Asahi Chemical Ind |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0139755B2 (ja) | 1989-08-23 |
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