JPH0141311B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規なプラスミドに関するものであ
る。 近年、ベクターとして使用可能と思われるプラ
スミドの種々のものが知られるようになつたが、
更に多くの有用なプラスミドの開発が期待されて
いる。 本発明者は、分子量が約3.5メガダルトン
（Md）と使用に適した大きさで、コピー数が多
く、制限酵素による切断点があり、かつクロラム
フエニコールおよびテトラサイクリン耐性を有す
る新しいプラスミドが、枯草菌（Bacillus
subtilis）に安定に存在することを確かめ本発明
を完成した。 すなわち、コリネバクテリウム・キセロシス
（Corynebacterium xerosis）からプラスミド
pTP10を分離し、これで枯草菌を形質転換後再
びプラスミド（pTP11）を分離し、このものと
ブドウ球菌由来のプラスミドpNS1（Gene 21，
105〜112（1983））を制限酵素Hindで切断した
後ライゲイシヨンすることにより分子量が約
4.3MdであるプラスミドpTP1102が得られるが、
さらにこのものを制限酵素Xbaで切断し、次い
でライゲイシヨンすることにより分子量が約
3.5MdであるプラスミドpTP1103を得ることがで
きた。 これらの工程における処理手段は公知の一般的
方法を使用することができ、例えば次のような方
法が用いられる。 コリネバクテリウムの培養と溶菌はShillerら
の方法（Antimicrob.Agents Chemo ther.18，
814〜821（1980））に準じて行ない、アルカリ変性
法によるDNAの抽出はHansenおよびOlsenの方
法（J.Bacteriol.135，227〜238（1978））に従つて
行なえばよい。 枯草菌の形質転換はChangおよびCohenのプロ
トプラスト法（Molec.gen.Genet.168，111〜115
（1979））に準じて行なえばよい。 プラスミドの分離にはアガロースゲル電気泳動
法や密度勾配遠心法のような一般的な方法を用い
ることができ、また、プラスミドDNAの制限酵
素による切断と、DNA鎖の連結酵素（リガーゼ）
による結合（ライゲイシヨン）も常法によつて行
なうことができる。 次に、本発明のプラスミドの製造法を実験例に
より詳述するが、使用したコリネバクテリウム・
キセロシスM82B株は、本発明者が分離した菌株
であり、分子量が30.4±2.7Mdのプラスミドを保
有しており、このプラスミド上にエリスロマイシ
ン、カナマイシン、クロラムフエニコール、テト
ラサイクリン耐性遺伝子を持つている。また、染
色体上にもストレプトマイシン耐性遺伝子を有し
ている。 例 １： コリネバクテリウム・キセロシスM82B株から
のプラスミドDNAの分離 トリプトソイブイヨン培地（トリプトン17ｇ、
ソイペプトン３ｇ、ブドウ糖2.5ｇ、リン酸一水
素カリウム2.5ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、蒸留水
１、PH7.3）によるM82B株の一夜培養液を新
鮮同培地に1/100量接種し、37℃で約３時間振盪
培養した後、ペニシリンＧを最終濃度5μｇ／ml
となるように加え、さらに２時間振盪培養した。 この培養液を冷却遠心し、得られたペレツトを
TEバツフア（10mMトリスアミノメタン、
0.5mMEDTA，PH8.0）で２回洗浄後、TEバツフ
アに溶かした0.5Mシユークロースに懸濁した。
この懸濁液にリゾチーム（シグマ）を最終濃度
10μｇ／mlとなるように加え37℃で２時間インキ
ユベートした。 この溶液に10％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）
溶液を最終濃度１％になるように加え、55℃で30
分間静置した。次に新たに調整した3N水酸化ナ
トリウム溶液を加えてPH12.1〜12.3とし軽く混和
後、2Mトリス溶液（PH7.0）を水酸化ナトリウム
溶液の２倍量加えた。さらに5M塩化ナトリウム
溶液を最終濃度1Mとなるように加えた後４℃で
一夜放置した。その後10000rpm、30分の冷却遠
心により上清を分取し、TEバツフアで飽和した
等量の再蒸留フエノールを加えよく混和した。 10000rpm、20分の冷却遠心により水層を分取
し、−20℃のエタノールを３倍量加えて、−20℃で
一夜放置した。10000rpm30分間の冷却遠心によ
りペレツトを集め、TEバツフアに溶解し、DNA
溶液とした。 例 ２： M82B株より抽出されたプラスミドpTP10
DNAによる枯草菌の形質転換 枯草菌168LMAH761222（leu^-，met^-，ade^-，
hir^-）株のバクト−ペンアツセイブロス（デイフ
コ：バクト−ビーフ抽出物1.5ｇ、バクト−酵母
抽出物1.5ｇ、バクトペプトン５ｇ、バクト−デ
キストロース１ｇ、塩化ナトリウム3.5ｇ、リン
酸ニカリウム3.68ｇ、リン酸一カリウム1.32ｇ、
蒸留水１、PH7.0±0.1）による一夜培養液を新
しい同培地に1/100量接種し37℃で吸光度（OD）
0.4（600nm）まで振盪培養した。菌体を遠心によ
り集菌し、SMMPバツフアー（0.5Mシユークロ
ース、0.02Mマレイン酸二ナトリウム、1M塩化
マグネシウムを２倍濃度のバクト−ペンアツセイ
プロスに溶解）に懸濁した後、最終濃度２mg／ml
となるようにリゾチームを加えた。37℃約１時間
の培養の後3000rpm15分の遠心により集菌し、
SMMPバツフアーで一度洗浄後、菌体を６mlの
SMMPバツフアーに懸濁し、プロトプラスト溶
液とした。 例１で得たDNA溶液50μ（約DNA0.5μｇ）
に同量の二倍濃度のSMMバツフアー（1Mシユ
ークロース、0.04Mマレイン酸二ナトリウム、
2M塩化マグネシウム）を加えた後、上述のプロ
トプラスト溶液１mlを加えた。さらに40％ポリエ
チレングリコール6000溶液３mlを加えて、０℃２
分間静置後５mlのSMMPバツフアーを加え
3000rpm10分間の遠心により集菌した。集めたプ
ロトプラストペレツトを１mlのSMMPバツフア
ーに懸濁し30℃で1.5時間培養後、その0.1mlをク
ロラムフエニコール25μｇ／ml含有のDM−３再
生培地（リン酸二カリウム3.5ｇ、リン酸一カリ
ウム1.5ｇ、カザミノ酸５ｇ、塩化マグネシウム
4.06ｇ、コハク酸ナトリウム135ｇ、酵母抽出物
５ｇ、グルコース５ｇ、寒天８ｇ、牛血清アルブ
ミン0.05ｇ、蒸留水１、PH7.3）に塗抹し、37
℃で２〜３日間培養することにより10⁹〜10¹⁰株
に１株の頻度で形質転換株を得た。 例 ３： 形質転換株からのプラスミドDNAの分離 得られたクロラムフエニコール耐性の形質転換
株をデイフコラボラトリース社製ブレインハート
インフユージヨン培地（BHI培地）10mlに接種
し、一夜静置培養した。この培養液をCY培地
（リン酸二カリウム0.7％、リン酸一カリウム0.3
％、硫酸アンモニウム0.1％、クエン酸ナトリウ
ム0.05％、カザミノ酸0.2％、酵母抽出物0.1％、
硫酸マグネシウム0.025％、ブドウ糖0.5％、PH
7.0）10mlに吸光度0.1（600nm）になるように加え
た。37℃で振盪培養し、吸光度0.3（600nm）の時
にデオキシアデノシンを最終濃度250μｇ／mlに
なるように加えた。３分後トリチウム標識チミジ
ンを最終濃度10μCi／mlになるように加えた。 吸光度0.8（600nm）の時点で氷にて発育を停止
させ、10000×ｇで15分間４℃に於て遠心してブ
ロスから菌体を分離し、菌体ペレツトをTES緩
衝液（0.05M塩化ナトリウム、0.005M EDTA含
有トリス−塩酸緩衝液（PH8.0））に再懸濁した。 次に、0.5M EDTA液0.2ml、10mg／ml濃度の
リゾチーム液0.1mlを加え、混合物を10分間37℃
で培養した。これにブリジ−58（花王アトラス(株)）
を最終濃度0.5％となるように加え、37℃で10分
間培養した。次にＮ−ラウロイルサルコシンナト
リウムを最終濃度2.5％になるように加え、50℃
で30分間培養し溶菌を行つた。 溶菌液をピペツトにて粘性をとり、軟化させた
のち、塩化セシウムおよび臭化エチジウムと混合
し、密度1.553の溶液とした。この溶液を126000
×ｇで平衡まで（約40時間）遠心した。 遠心管下部末端より、溶液を分画分取し、各分
画ごとに10μをワツトマンろ紙GF／Ａに吸着さ
せ、このろ紙に吸着されたトリチウムの放射活性
を液体シンチレーシヨンカウンター（パツカード
3300）にて測定しcpmにて表わすと、染色体
DNAに由来する高活性を示す分画の大きなピー
クとプラスミドDNAに由来する小さなピークの
２つが得られた。この小さなピークを示した分画
をとり、ｎ−オクタノールで２回処理することに
より、臭化エチジウムを抽出除去した。次に水層
をSSC緩衝液（0.15M塩化ナトリウム、0.015Mク
エン酸ナトリウム、PH7.0）の10倍希釈液に対し
て透析してプラスミドを分離した。分離したプラ
スミドDNAの分子量を電子顕微鏡により測定し
たところ4.7Mdであつた。本プラスミドをpTP11
とする。また本プラスミドを所有する菌株を枯草
菌LMAH（pTP11）株と名付けた。本プラスミド
のコピー数は約20であつた。 例 ４： プラスミドpTP11による枯草菌RM125株の形
質転換 枯草菌LMAH（pTP11）株よりプラスミド
DNAを下記の方法により調製した。 枯草菌LMAH（pTP11）株をBHI培地100mlに
接種し、37℃で約18〜24時間振盪培養する。 この細胞懸濁液を１％の率で同培地の20本のフ
ラスコに接種するのに使用する。37℃で18〜24時
間振盪培養後、10000×ｇで約15分間４℃に於て
遠心し上澄を傾斜で除く。得た菌体ペレツトを
TES緩衝液によつて２回洗浄後、100mlの25％蔗
糖含有TES緩衝液に再懸濁する。 次に0.5M−EDTA溶液40ml、10mg／ml濃度の
リゾチーム溶液20mlを加え混合物を30分間37℃で
培養する。次に50mg／ml濃度のブリジ−58 20ml
を加え、混合物を37℃で10分間培養する。さらに
250mg／ml濃度のＮ−ラウロイルサルコシンナト
リウム20mlを加え、50℃で10〜30分間培養する
（細胞破壊）。 溶解物を26000×ｇ、30分間冷却遠心後、上澄
に5M塩化ナトリウム溶液50mlを加え一夜放置後、
ポリエチレングリコール6000を最終濃度10％とな
るように加え、さらに一夜４℃にて放置した。こ
の混合物を10000×ｇ、15分間遠心し、得られた
ペレツトをTES緩衝液に溶解した。 この溶液を塩化セシウムおよび臭化エチジウム
と混合して密度1.553の溶液を製する。この溶液
を126000×ｇで平衡まで（約40時間）遠心する。
紫外線照射下で（365nm）線状染色体およびプラ
スミドDNAは強い螢光を発するバンドとして遠
心機チユーーブの中に見られる。 このプラスミドDNAを密度勾配から取り出し、
ｎ−オクタノールで２回抽出することにより臭化
エチジウムを除き、次に水層を10倍希釈SSC緩衝
液に対して透析してpTP11を得た。 得られたpTP11DNAを前述のプロトプラスト
法により枯草菌の制限欠損−修飾欠損株である
RM125株へ形質転換した。 得られたクロラムフエニコール耐性コロニーの
ひとつを使い、トリチウム標識チミジンラベル法
によりプラスミドの検出を行つたところpTP11
と全く同じ分子量のプラスミドを検出することが
出来た。本実験よりプラスミドpTP11上にはク
ロラムフエニコール耐性遺伝子が存在しているこ
とが確認された。 例 ５： プラスミドpTP11の制限酵素開裂点地図の作
成 制限酵素によるプラスミドDNAの消化は次の
条件により行つた。また、２種の制限酵素を組み
合わせて反応させる場合は、一方の酵素反応をフ
エノールで停止させ、さらにフエノールをエーテ
ル抽出した後に２倍量のエタノールを加え、析出
したDNAを遠心によつて集めTEバツフアーに溶
解した後、次の酵素反応を行つた。 EcoR 10mMトリス−塩酸緩衝液（PH7.2）、
5mM塩化マグネシウム、2mMメルカプ
トエタノール、50mM塩化ナトリウム、
37℃ Hpa 20mMトリス−塩酸緩衝液（PH7.4）、
7mM塩化マグネシウム、1mMジチオス
レイトール（DTT）、37℃ Xba 6mMトリス−塩酸緩衝液（PH7.4）、
100mM塩化ナトリウム、6mM塩化マグ
ネシウム、37℃ Bcl 12mMトリス−塩酸緩衝液（PH7.4）、
12mM塩化マグネシウム、12mM塩化ナ
トリウム、0.5mMDTT、50℃ Hind 20mMトリス−塩酸緩衝液（PH7.4）、
7mM塩化マグネシウム、60mM塩化ナ
トリウム、37℃ 消化混合物はシヤープ等によつてつくられた１
％アガロースゲル中で分析した（J.Sharp et al，
Biochemistry，12 3055〜3063（1973））。EcoR
消化λDNAを分子量対照として使用した
（Thomasら、J.Mol.Biol.，91 315〜328
（1975））。 pTP11の制限酵素開裂点の数および開裂断片
の分子量を表に示す。

【表】 例 ６：プラスミドpTP1102の製造 枯草菌RM125（pNS1）株（Gene 21，105〜
112（1983））よりプラスミドpNS1DNAを前述の
方法（例４）と同様にして抽出し、プラスミド
pTP11DNAと混合後制限酵素Hindで切断し
た。 すなわち、pTP11DNA1μｇとpNS11μｇを
20mMトリス塩酸緩衝液（PH7.4）、7mM塩化マ
グネシウム、60mM塩化ナトリウム、Hind10
単位含有溶液中で37℃、１時間の反応により切断
する。反応をフエノールを加えることにより停止
させ、エーテル抽出によりフエノールを除去後２
倍量のエタノールを加え、DNAを沈殿させた。 沈殿したDNAペレツトを66mMトリス塩酸緩
衝液（PH7.6）、6.6mM塩化マグネシウム、10mM
ジチオスレイトール、4mMアデノシン三リン酸
溶液100μに溶解後、T4DNAリガーゼ0.01単位
を加え16℃、16時間の反応によつてDNAを連結
させた。フエノールにより反応を停止させ、エー
テル抽出によりフエノールを除去後、２倍量のエ
タノールを加えDNAを沈殿させた。沈殿した
DNAを滅菌蒸留水50μに溶解し、形質転換用
DNA試料として用いた。 形質転換は例２に記載したプロトプラスト法に
より行つた。受容菌には枯草菌RM125株を用い
た。 得られたクロラムフエニコール、テトラサイク
リン両耐性を持つコロニーについてプラスミド
DNAの検索を行つた。すなわち、得られたコロ
ニーを溶菌用緩衝液（リゾチーム2μｇ／ml、
RNase0.1mg／ml、25％シユークロースとなるよ
うにTEバツフアーに溶解）40μに懸濁し37℃、
２時間反応させた。この溶液に５％SDS溶液10μ
を加え、完全に溶菌後、フエノール50μを加
え10000rpm10分間の遠心後、水層を分取した。 この水層についてアガロースゲル電気泳動法に
より、プラスミドDNAの確認を行い、分子量が
最も小さいプラスミドDNAを持つているいくつ
かの形質転換株を選択した。 各形質転換株より前述の方法でプラスミド
DNAを調製し、EcoR，HindおよびKpn
に関する制限酵素開裂点地図を作成した。Kpn
の反応条件は6mMトリス−塩酸緩衝液（PH7.5）、
6mM塩化ナトリウム、6mM塩化マグネシウム、
6mM2−メルカプトエタノール、37℃である。 この結果、pNS1由来のHind−Ａ断片
（1.5Md）とpTP11由来の2.8Mdの断片とが結合
したプラスミドpTP1102を持つ形質転換株が存
在することが確認された。この株を枯草菌
RM125（pTP1102）株と名付けた。 例 ７：プラスミドpTP1102DNAの調製 枯草菌RM125（pTP1102）株をデイフコ・ラボ
ラトリーズ製ブレインハートインフユージヨン
（BHI）培地100mlに接種する。PHが7.4±0.2であ
ることを確認する。培地を500ml坂口フラスコ中
で予め滅菌する。接種後フラスコを37℃、約18〜
24時間振盪培養する。 この細胞懸濁液を１％の率で同培地の20本のフ
ラスコに接種するのに使用する。37℃で18〜24時
間振盪培養後、10000×ｇで約15分間４℃に於て
ブロスから分離し、上澄を菌体ペレツトから傾斜
で除く。上澄を捨てペレツトをTES緩衝液によ
つて２回洗浄後、100mlの25％蔗糖含有TES緩衝
液に再懸濁する。次に0.5M−EDTA溶液40ml、
10mg／ml濃度のリゾチーム溶液20mlを加え混合物
を30分間37℃で培養する。次に50mg／ml濃度のブ
リジ−58 20mlを加え、混合物を37℃、10分間培
養する。さらに250mg／ml濃度のＮ−ラウロイル
サルコシンナトリウム20mlを加え、50℃で10〜30
分間培養する（細胞破壊）。 溶解物を26000×ｇ、30分間冷却遠心後、上澄
に5M濃度の塩化ナトリウム溶液50mlを加え一夜
放置後、ポリエチレングリコール6000を最終濃度
10％となるように加え、さらに一夜４℃にて放置
した。この混合物を10000×ｇ、15分間遠心し、
ペレツトをTES緩衝液に溶解した。 この溶液を塩化セシウム、臭化エチジウムと混
合し、密度1.553の溶液とする。この溶液を
126000×ｇで平衡まで（約40時間）遠心する。紫
外線照射下で（365nm）線状染色体およびプラス
ミドDNAは強い螢光を発するバンドとして遠心
機チユーブの中に見られる。このプラスミド
DNAを密度勾配から取り出し、ｎ−オクタノー
ルで２回抽出することにより臭化エチジウムを除
き、次に水層を10倍希釈SSC緩衝液（0.15M塩化
ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウム、PH
7.0）に対して透析してpTP1102DNAを得た。 例 ８： プラスミドpTP1102からのDNA断片欠損プラ
スミドDNAの調製 プラスミドpTP1102DNA2μｇを、6mM−トリ
ス塩酸緩衝液（PH7.4）、100mM塩化ナトリウム、
6mM塩化マグネシウム、Xba10単位含有溶液
中で37℃、１時間の反応により切断する。反応を
フエノールを加えることにより停止させ、エーテ
ル抽出によりフエノールを除去後、２倍量のエタ
ノールを加え、DNAを沈殿させた。 沈殿したDNAペレツトを66mMトリス塩酸緩
衝液（PH7.6）、6.6mM塩化マグネシウム、10mM
ジチオスレイトール、4mMアデノシン三リン酸
溶液100μに溶解後、T4DNAリガーゼ0.01単位
を加え16℃、16時間の反応によつてDNAを連結
させた。フエノールにより反応を停止させ、エー
テル抽出により、フエノールを除去後、２倍量の
エタノールを加えDNAを沈殿させた。沈殿した
DNAを滅菌蒸留水50μに溶解し、形質転換用
DNA試料として用いた。 例 ９：形質転換 枯草菌RM125株のバクト−ベンアツセイブロ
スによる一夜培養液を新しい同培地に1/100量接
種し37℃でOD0.4（600nm）まで振盪培養した。
菌体を遠心により集菌し、SMMPバツフアー
（0.5Mシユークロース、0.02Mマレイン酸二ナト
リウム、1M塩化マグネシウムを２倍濃度のバク
ト−ペンアツセイブロスに溶解）に懸濁した後、
最終濃度２mg／mlとなるようにリゾチームを加え
た。37℃約１時間の培養の後3000rpm15分の遠心
により集菌し、SMMPバツフアーで一度洗浄後、
菌体を６mlのSMMPバツフアーに懸濁し、プロ
トプラスト溶液とした。 例８で得たDNA溶液50μ（約DNA0.5μｇ）
に同量の２×SMMバツフアーを加えた後、上述
のプロトプラスト溶液１mlを加えた。さらに40％
ポリエチレングリコール6000溶液３mlを加えて、
０℃２分間静置後５mlのSMMPバツフアーを加
え3000rpm10分間の遠心により集菌した。集めた
プロトプラストペレツトを１mlのSMMPバツフ
アーに懸濁し30℃1.5時間培養後、その0.1mlをク
ロラムフエニコール25μｇ／ml含有のDM−３再
生培地に塗抹し、37℃で２〜３日間培養すること
により形質転換株を得た。 得られたクロラムフエニコール耐性コロニーを
溶菌用緩衝液（リゾチーム2μｇ／ml、RNase0.1
mg／ml、25％シユークロースをTEバツフアーに
溶解）40μに懸濁し37℃、２時間反応させた。
この溶液に５％SDS溶液10μを加え、完全に溶
菌後、フエノール50μを加え10000rpm10分間の
遠心後、水層を分取した。 この水層についてアガロースゲル電気泳動法に
より、プラスミドDNAの確認を行い、分子量が
最も小さいプラスミドDNAを持つているいくつ
かの形質転換株についてさらに詳しく調べた。 すなわち、各形質転換株より前述の方法によ
り、プラスミドDNAを調整し、やはり前述の方
法によりXba切断を行い、アガロースゲル電気
泳動を行つた結果、プラスミドpTP1102の0.8Md
のXba−断片が欠損したプラスミドpTP1103の
存在が確認された。pTP1103を有する株を枯草
菌RM125（pTP1103）と名付けた。 pTP1103は分子量3.5Mdであり、コピー数は約
100コピーであつた。 以上の例で用いた微生物は工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されており、次の番号を有し
ている。 コリネバクテリウム・キセロシスM82B FERM Ｐ−6971 枯草菌168LMAH761222 FERM Ｐ−6972 枯草菌RM125 FERM Ｐ−6973 枯草菌RM125（pNS1） FERM Ｐ−7008

【図面の簡単な説明】

図１は、プラスミドの制限酵素開裂点地図であ
り、図２はフローチヤートである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ テトラサイクリン耐性遺伝子およびクロラム
   フエニコール耐性遺伝子を有し、分子量が約3.5
   メガダルトンであり、制限酵素開裂点地図が次の
   通りであるプラスミドpTP1103