JPS59179080A - プラスミドｐＴＰ１１０１ - Google Patents
プラスミドｐＴＰ１１０１Info
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- JPS59179080A JPS59179080A JP58053050A JP5305083A JPS59179080A JP S59179080 A JPS59179080 A JP S59179080A JP 58053050 A JP58053050 A JP 58053050A JP 5305083 A JP5305083 A JP 5305083A JP S59179080 A JPS59179080 A JP S59179080A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規なプラスミドに関するものである。
近年、ベクターとして使用可能と思われるプラスミドの
種々のものが知られるようになったが、更に多くの有用
なプラスミドの開発が期待されている。
種々のものが知られるようになったが、更に多くの有用
なプラスミドの開発が期待されている。
本発明者は、コリネバクテリウム由来のプラスミドとブ
ドウ球菌由来のプラスミドに出来するプラスミドが枯草
菌（Ｂ２Ｌｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ）に安定
に存在し、制限酵素による切断点があり、かつ薬剤耐性
を有していることを利用して本発明を完成した。
ドウ球菌由来のプラスミドに出来するプラスミドが枯草
菌（Ｂ２Ｌｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ）に安定
に存在し、制限酵素による切断点があり、かつ薬剤耐性
を有していることを利用して本発明を完成した。
すなわち、コリネバクテリウム・キセロシス（Ｃｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｒｏｓｉｓ ）からプラ
スミドｐ’ｒｐ：ｔｏを分離し、これで枯草菌を形質転
換後再びプラスミド（ｐＴＰＩＩ）を分離し、このもの
とブドウ球菌由来のプラスミドｐＮｓ１（Ｇｅｎｅ ２
１，１０５〜１１２（１９８３））を制限酵素Ｈｉｎｄ
ｍで切断した後ライゲイジョンすることにより分子楚
が約４．３ＭｄであるプラスミドｐＴＰ１１０１が得ら
れる。
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｒｏｓｉｓ ）からプラ
スミドｐ’ｒｐ：ｔｏを分離し、これで枯草菌を形質転
換後再びプラスミド（ｐＴＰＩＩ）を分離し、このもの
とブドウ球菌由来のプラスミドｐＮｓ１（Ｇｅｎｅ ２
１，１０５〜１１２（１９８３））を制限酵素Ｈｉｎｄ
ｍで切断した後ライゲイジョンすることにより分子楚
が約４．３ＭｄであるプラスミドｐＴＰ１１０１が得ら
れる。
これらの工程における処理手段は公知の一般的方法を使
用することができ１例えば次のような方法が用いられる
。
用することができ１例えば次のような方法が用いられる
。
コリネバクテリウムの培養と溶菌は５ｈｉｌ１６ｒらの
方法（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、 Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅ
ｍｏｔｈｅｒ、 １８ 、８１４〜８２１（１９８０）
）に準じて行ない、アルカリ変性法によるＤＮＡの抽出
はＨａｎＳＩ９ｎおよび０１ｓｅｎの方法（Ｊ、 Ｂ？
Ｌｃｔｅｒｉｏ１．１３５．２２７〜２８８（１９７８
））に従って行なえばよい。
方法（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、 Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅ
ｍｏｔｈｅｒ、 １８ 、８１４〜８２１（１９８０）
）に準じて行ない、アルカリ変性法によるＤＮＡの抽出
はＨａｎＳＩ９ｎおよび０１ｓｅｎの方法（Ｊ、 Ｂ？
Ｌｃｔｅｒｉｏ１．１３５．２２７〜２８８（１９７８
））に従って行なえばよい。
枯草菌の形質転換はＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎのプロ
トプラスト法（Ｍｏ１ｅｃ、 ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、
１６８．１１１〜１１５（１９７９））に準じて行な
えばよい。
トプラスト法（Ｍｏ１ｅｃ、 ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、
１６８．１１１〜１１５（１９７９））に準じて行な
えばよい。
プラスミドの分離にはアガロースゲル電気泳動法や密度
勾配遠心法のような一般的な方法を用いることができ、
また、プラスミドＤ Ｎ Ａの制限酵素による切断と、
ＤＮＡ鎖の連結酵素（リガーゼ）による結合（ライゲイ
ジョン）も常法によって行なうことができる。
勾配遠心法のような一般的な方法を用いることができ、
また、プラスミドＤ Ｎ Ａの制限酵素による切断と、
ＤＮＡ鎖の連結酵素（リガーゼ）による結合（ライゲイ
ジョン）も常法によって行なうことができる。
次に２本発明のプラスミドの製造法を実験例により詳述
するが、使用したコリネバクテリウム・キ七ロシスＭ８
２Ｂ株は２本発明者が分離した菌株であり２分子量が３
０．４±２．７Ｍｄのプラスミドを保有しており、この
プラスミド上にエリスロマイシン、カナマイシン、クロ
ラムフェニコール、テトラサイタリン耐性遺伝子を持っ
ている。また、染色体上にもストレプトマイシン耐性遺
伝子を有している。
するが、使用したコリネバクテリウム・キ七ロシスＭ８
２Ｂ株は２本発明者が分離した菌株であり２分子量が３
０．４±２．７Ｍｄのプラスミドを保有しており、この
プラスミド上にエリスロマイシン、カナマイシン、クロ
ラムフェニコール、テトラサイタリン耐性遺伝子を持っ
ている。また、染色体上にもストレプトマイシン耐性遺
伝子を有している。
例１：コリネバクテリウム・ギセロシスＭ８２Ｂ株から
のプラスミドＤＮＡの分離 トリプトソイブイヨン培地（トリプトン１７り、ソイペ
プトン３り、ブドウ糖２．５ｇ−、リン酸−水素カリウ
ム２．５９．塩化ナトリウム５９゜蒸留水１ ｌ、 ｐ
Ｈ７，３）によるＭ８２Ｂ株の一夜培養液を新鮮同培地
に１７１００量接種し。
のプラスミドＤＮＡの分離 トリプトソイブイヨン培地（トリプトン１７り、ソイペ
プトン３り、ブドウ糖２．５ｇ−、リン酸−水素カリウ
ム２．５９．塩化ナトリウム５９゜蒸留水１ ｌ、 ｐ
Ｈ７，３）によるＭ８２Ｂ株の一夜培養液を新鮮同培地
に１７１００量接種し。
３７°Ｃで約３時間振盪培養した後、ペニシリンＧを最
終濃度５／’９／−となるように加え、さらに２時間振
盪培養した。
終濃度５／’９／−となるように加え、さらに２時間振
盪培養した。
この培養液を冷却遠心し、得られたペレットをＴＥバ、
ファ（１０ｍＭ）リスアミ／メタン。
ファ（１０ｍＭ）リスアミ／メタン。
０．５ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ、 ｐＨ８，０）で２回
洗浄後。
洗浄後。
ＴＥバッフ ７ ニｆＢ カした０、５Ｍシュークロー
スに懸濁した。この懸濁液にリゾチーム（シグマ）を最
終濃度１０１０１ｌ９７となるように加え８７°Ｃで２
時間インキュベートした。
スに懸濁した。この懸濁液にリゾチーム（シグマ）を最
終濃度１０１０１ｌ９７となるように加え８７°Ｃで２
時間インキュベートした。
この溶液に１０％ＳＤＳ （ドデシル硫酸ナトリウムン
溶液を最終濃度１％になるように加え。
溶液を最終濃度１％になるように加え。
５５°Ｃで３０分間静置した。次に新たに調整した３Ｎ
水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ１２，１〜１２．８
とし軽く混和後、２Ｍトリス溶液（ｐＨ７，０）を水酸
化ナトリウム溶液の２倍量加えた。
水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ１２，１〜１２．８
とし軽く混和後、２Ｍトリス溶液（ｐＨ７，０）を水酸
化ナトリウム溶液の２倍量加えた。
さらに５Ｍ塩化ナトリウム溶液を最終濃度ＩＭとなるよ
うに加えた後４°Ｃで一夜放置した。その後１０，００
０ ｒｐｍ、８０分の冷却遠心により上清を分取し、Ｔ
Ｅバッフ了で飽和したｌの再蒸留フェノールを加えよく
混和した。
うに加えた後４°Ｃで一夜放置した。その後１０，００
０ ｒｐｍ、８０分の冷却遠心により上清を分取し、Ｔ
Ｅバッフ了で飽和したｌの再蒸留フェノールを加えよく
混和した。
１０．００ Ｏｒｐｍ、２０分の冷却遠心により水層を
分取し、−２０°Ｃのエタノールを８倍量加えて、−２
０°Ｃで一夜放置した。 １０，００ Ｏｒｐｍ３０分
間の冷却遠心によりペレットを集め、ＴＥバッファーに
溶解し、ＤＮＡ溶液とした。
分取し、−２０°Ｃのエタノールを８倍量加えて、−２
０°Ｃで一夜放置した。 １０，００ Ｏｒｐｍ３０分
間の冷却遠心によりペレットを集め、ＴＥバッファーに
溶解し、ＤＮＡ溶液とした。
例２：Ｍ８２Ｂ株より抽出されたプラスミドｐＴＰ１０
ＤＮＡによる枯草菌の形質転換 枯草菌１６８ＬＭＡＨ７６１２２２（ｌｅｕ−。
ＤＮＡによる枯草菌の形質転換 枯草菌１６８ＬＭＡＨ７６１２２２（ｌｅｕ−。
ｍｅｔ−、ａｃｈｅ−、ｈｉｒ−）株のバクトーベンア
ッセイブロス（デイフ：７＝バクトービー７抽出惜１，
５９、バクトー酵母抽出物１．５９＋バタトペブトン５
り、バタトーデキストロース１９．塩化ナトリウム３．
５９． リン酸二カリウム３，６８９゜リン酸−カリ
ウム１．３２Ｌ蒸留水ｌｌ、ｐ）１７．０±０．１）に
よる−夜培養液を新しい同培地に１／ｌｏｏ量接種し８
７°Ｃで吸光度（ＯＤ）０．４．（６０いｔ）まで振盪
培養した。菌体を遠心により集菌し、ＳＭＭＰバッフ了
−（０，５Ｍシュークロース、０．０２Ｍマレイン酸二
ナトリウＡ、１Ｍ塩化マグネシウムを２倍濃度のバクト
ーベン了ッセイブロスに溶解）に懸濁した後。
ッセイブロス（デイフ：７＝バクトービー７抽出惜１，
５９、バクトー酵母抽出物１．５９＋バタトペブトン５
り、バタトーデキストロース１９．塩化ナトリウム３．
５９． リン酸二カリウム３，６８９゜リン酸−カリ
ウム１．３２Ｌ蒸留水ｌｌ、ｐ）１７．０±０．１）に
よる−夜培養液を新しい同培地に１／ｌｏｏ量接種し８
７°Ｃで吸光度（ＯＤ）０．４．（６０いｔ）まで振盪
培養した。菌体を遠心により集菌し、ＳＭＭＰバッフ了
−（０，５Ｍシュークロース、０．０２Ｍマレイン酸二
ナトリウＡ、１Ｍ塩化マグネシウムを２倍濃度のバクト
ーベン了ッセイブロスに溶解）に懸濁した後。
最終濃度２ｍ９／−となるようにリゾチームを加えた。
３７°Ｃ約１時間の培養の後３，００ Ｏｒｐｍ１５分
の遠心により集菌し、ＳＭＭＰ／＜ツフア−で一度洗浄
後、菌体を６−のＳＭＭＰバッフ丁−に懸濁し、プロト
プラスト溶液とした。
の遠心により集菌し、ＳＭＭＰ／＜ツフア−で一度洗浄
後、菌体を６−のＳＭＭＰバッフ丁−に懸濁し、プロト
プラスト溶液とした。
例１で得たＤＮＡ溶液５０μｔ（約１）ＮＡｏ、５μｇ
）に同量の二倍濃度のＳＭＭバ、、 ７ 了−（１Ｍシ
ュークロース、０．０４Ｍマレイン酸二ナトリウム、２
Ｍ塩化マグネシウム）を加えた後、上述のプロトプラス
ト溶液ｌｆｎ！−を加えた。
）に同量の二倍濃度のＳＭＭバ、、 ７ 了−（１Ｍシ
ュークロース、０．０４Ｍマレイン酸二ナトリウム、２
Ｍ塩化マグネシウム）を加えた後、上述のプロトプラス
ト溶液ｌｆｎ！−を加えた。
さらに４０％ポリエチレングリコール６０００溶液３＋
ｎｔを加えて、θ℃２分間静置後５−のＳＭＭＰバッフ
ァーを加え８．ｏＯＱｒｐｍｌＯ分間の遠心により集菌
した。集めたプロトプラストペレットを１−のＳＭＭＰ
バッファーに懸濁し８０″Ｃで１．５時間培養後、その
０．１記をクロラムフェニコール２５μ２／−含有のＤ
Ｍ−３再生培地（リン酸二カリウム８．５９． リン
酸−カリウム１．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、塩化マグネシ
ウム４．０６り、フハク酸ナトリウム１，３５１゜酵母
抽出物５９ｔグルコ一ス５ｇ、寒天８り。
ｎｔを加えて、θ℃２分間静置後５−のＳＭＭＰバッフ
ァーを加え８．ｏＯＱｒｐｍｌＯ分間の遠心により集菌
した。集めたプロトプラストペレットを１−のＳＭＭＰ
バッファーに懸濁し８０″Ｃで１．５時間培養後、その
０．１記をクロラムフェニコール２５μ２／−含有のＤ
Ｍ−３再生培地（リン酸二カリウム８．５９． リン
酸−カリウム１．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、塩化マグネシ
ウム４．０６り、フハク酸ナトリウム１，３５１゜酵母
抽出物５９ｔグルコ一ス５ｇ、寒天８り。
牛血清アルブミン０．０５９．蒸留水１１．ｐＨ７，８
）に塗抹し、８７°Ｃで２〜３日間培養することにより
形質転換株を得た。
）に塗抹し、８７°Ｃで２〜３日間培養することにより
形質転換株を得た。
例３：形質転換株からのプラスミドＤＮＡの分離
得られたクロラムフェニコール耐性の形質転換株をディ
７コラボラトリース社製プレインハートインフュージョ
ン培地（ＢＨＩ培地）１０づに接種し、−夜装置培養し
た。この培養液をａｙ培地（リン酸二カリウム０．７％
、リンｍ−カリウム０．３％、硫酸アンモニウム０．１
％、クエン酸ナトリウム０．０５％、カザミノ酸０．２
％。
７コラボラトリース社製プレインハートインフュージョ
ン培地（ＢＨＩ培地）１０づに接種し、−夜装置培養し
た。この培養液をａｙ培地（リン酸二カリウム０．７％
、リンｍ−カリウム０．３％、硫酸アンモニウム０．１
％、クエン酸ナトリウム０．０５％、カザミノ酸０．２
％。
酵母抽出物０．１％、硫酸マグネシウム０．０２５％、
ブドウ糖０゜５％、 ］）Ｈ７，０）１０ｆｎｔに吸光
度０．１ （６０ｏｒＬｍ）になるように加えた。
ブドウ糖０゜５％、 ］）Ｈ７，０）１０ｆｎｔに吸光
度０．１ （６０ｏｒＬｍ）になるように加えた。
３７°Ｃで振盪培養し、吸光度０．８（６００ａｍ）の
時にデオキシアデノシンを最終濃度２５０／’＆Ａｎｌ
になるように加えた。８分後トリチウム標識チミジンを
最終濃度１０μＣ’ｉ／−になるように加えた。
時にデオキシアデノシンを最終濃度２５０／’＆Ａｎｌ
になるように加えた。８分後トリチウム標識チミジンを
最終濃度１０μＣ’ｉ／−になるように加えた。
吸光度０．８（６００＋ｚｍ）の時点で氷にて発育を停
止させ、１０，０００Ｘ９で１５分間４°Ｃに於て遠心
してブロスから菌体を分離し、菌体ペレットをＴＥＳ緩
衝液（０，０５Ｍ塩化ナトリウム、０，００５Ｍ Ｅ
ＤＴＡ含有トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０））に再懸
濁した。
止させ、１０，０００Ｘ９で１５分間４°Ｃに於て遠心
してブロスから菌体を分離し、菌体ペレットをＴＥＳ緩
衝液（０，０５Ｍ塩化ナトリウム、０，００５Ｍ Ｅ
ＤＴＡ含有トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０））に再懸
濁した。
次に、０．５Ｍ ＥＤＴＡ液０．２ｔｎｌ、 １ ｏ
ｍ９／ｌｎｌ濃度のリゾチーム液０．１４を加え、混合
物を１０分間３７°Ｃで培養した。これにブリジー５８
（花王アトラス■）を最終濃度０．５％となるように加
え、８７°Ｃで１０分間培養した。次にＮ−ラウロイル
サルコシンナトリウムを最終濃度２．５％になるように
加え、５０°Ｃで８０分間培養し溶菌を行った。
ｍ９／ｌｎｌ濃度のリゾチーム液０．１４を加え、混合
物を１０分間３７°Ｃで培養した。これにブリジー５８
（花王アトラス■）を最終濃度０．５％となるように加
え、８７°Ｃで１０分間培養した。次にＮ−ラウロイル
サルコシンナトリウムを最終濃度２．５％になるように
加え、５０°Ｃで８０分間培養し溶菌を行った。
溶菌液をピペットにて粘性をとり、軟化させたのち、塩
化セシウムおよび臭化エチジウムと混合し、密度１．５
５３の溶液とした。この溶液を１２６，０ＯＯＸりで平
衡まで（約４０時間）遠心した。
化セシウムおよび臭化エチジウムと混合し、密度１．５
５３の溶液とした。この溶液を１２６，０ＯＯＸりで平
衡まで（約４０時間）遠心した。
遠心管下部末端より、溶液を分画分取し、各分画ごとに
ｌＯμｌをワットマンろ紙ＧＦ／Ａに吸着させ、このろ
紙に吸着されたトリチウムの放射活性を液体シンチレー
ションカウンター（パラカード５ｓｏｏ）にて測定しｃ
ｐｍにて表わすと、染色体ＤＮＡに由来する高活性を示
す分画の大きなピークとプラスミドＤＮＡに由来する小
さなピークの２つが得られた。この小さなピークを示し
た分画をとり、ルーオクタツールで２回処理することに
より、臭化エチジウムを抽出除去した。次に水層をＳＳ
Ｃ緩衝液（０，１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍク
エン酸す） ＩＪウム、 １）Ｈ７，０）の１０倍希釈
液に対して透析してプラスミドを分離した。分離したプ
ラスミドＤＮＡの分子量を電子顕微鏡により測定したと
ころ４．７Ｍ（１であった。本プラスミドをｐＴＰｌｌ
とする。また本プラスミドを所有する菌株を枯草菌ＬＭ
ＡＨ（ｐＴＰｌ １ ）株と名付けた。本プラスミドの
コピー数は約ｚＯであった０ 例４＝プラスミドｐＴＰ１１による枯草菌ＲＭ１２５株
の形質転換 枯草菌ＬＭＡＨ（ｐＴＰｌｌ ）株よりプラスミドＤ
Ｎ Ａを下記の方法により調整した。
ｌＯμｌをワットマンろ紙ＧＦ／Ａに吸着させ、このろ
紙に吸着されたトリチウムの放射活性を液体シンチレー
ションカウンター（パラカード５ｓｏｏ）にて測定しｃ
ｐｍにて表わすと、染色体ＤＮＡに由来する高活性を示
す分画の大きなピークとプラスミドＤＮＡに由来する小
さなピークの２つが得られた。この小さなピークを示し
た分画をとり、ルーオクタツールで２回処理することに
より、臭化エチジウムを抽出除去した。次に水層をＳＳ
Ｃ緩衝液（０，１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍク
エン酸す） ＩＪウム、 １）Ｈ７，０）の１０倍希釈
液に対して透析してプラスミドを分離した。分離したプ
ラスミドＤＮＡの分子量を電子顕微鏡により測定したと
ころ４．７Ｍ（１であった。本プラスミドをｐＴＰｌｌ
とする。また本プラスミドを所有する菌株を枯草菌ＬＭ
ＡＨ（ｐＴＰｌ １ ）株と名付けた。本プラスミドの
コピー数は約ｚＯであった０ 例４＝プラスミドｐＴＰ１１による枯草菌ＲＭ１２５株
の形質転換 枯草菌ＬＭＡＨ（ｐＴＰｌｌ ）株よりプラスミドＤ
Ｎ Ａを下記の方法により調整した。
枯草菌ＬＭＡＨ（ｐＴＰｌｌ）株をＢＨＩ培地１００ｇ
ｎｔに接種し、３７°Ｃで約１８〜２４時間振盪培養す
る。
ｎｔに接種し、３７°Ｃで約１８〜２４時間振盪培養す
る。
この細胞懸濁液を１％の率で同培地の２０本のフラスコ
に接種するのに使用する。８７℃で１８〜２４時間振盪
培養後、 １．０．０００ Ｘりで約１５分間４℃に於
て遠心し上澄を傾斜で除く。
に接種するのに使用する。８７℃で１８〜２４時間振盪
培養後、 １．０．０００ Ｘりで約１５分間４℃に於
て遠心し上澄を傾斜で除く。
得た菌体ベレットをＴＥＳ緩衝液によって２回洗浄後、
１００−の２５％蔗糖含有ＴＥＳ緩衝液に再懸濁する。
１００−の２５％蔗糖含有ＴＥＳ緩衝液に再懸濁する。
次に０．５Ｍ−ＥＤＴＡ溶液４０ｉ、１０Ｔｎ９／ｉ濃
度のリゾチーム溶液２０１１１ｔを加え混合物を８０分
間８７°Ｃで培養する。次に５０ｍ９／−濃度のブリジ
ー５８２０−を加え、混合物を８７℃で１０分間培養す
る。さらに２５０ ｍ９７ｍ１濃度のＮ−ラウロイルサ
ルコシンナトリウム２０−を加え、５０°Ｃで１０〜８
０分間培養する（細胞破壊）。
度のリゾチーム溶液２０１１１ｔを加え混合物を８０分
間８７°Ｃで培養する。次に５０ｍ９／−濃度のブリジ
ー５８２０−を加え、混合物を８７℃で１０分間培養す
る。さらに２５０ ｍ９７ｍ１濃度のＮ−ラウロイルサ
ルコシンナトリウム２０−を加え、５０°Ｃで１０〜８
０分間培養する（細胞破壊）。
溶解物を２６，０ＯＯＸり、３０分間冷却遠心後、上澄
に５Ｍ塩化ナトリウム溶液５０−を加え一夜放置後、ポ
リエチレングリコール６０００を最終濃度１０％となる
ように加え、さらに−夜４°Ｃにて放置した。この混合
物を１０，０００Ｘり、１５分間遠心し、得られたベレ
ットをＴＥＳ緩衝液に溶解した。
に５Ｍ塩化ナトリウム溶液５０−を加え一夜放置後、ポ
リエチレングリコール６０００を最終濃度１０％となる
ように加え、さらに−夜４°Ｃにて放置した。この混合
物を１０，０００Ｘり、１５分間遠心し、得られたベレ
ットをＴＥＳ緩衝液に溶解した。
この溶液を塩化セシウムおよび臭化エチジウムと混合し
て′＠度１．５５３の溶液を製する。この溶液を１２６
．ＱＱＯＸ９で平衡まで（約４０時間）遠心する。紫外
線照射下で（３６５ルｍ）線状染色体およびプラスミド
ＤＮＡは強し）螢光を発するバンドとして遠心機チュー
ブの中（こ見られる。
て′＠度１．５５３の溶液を製する。この溶液を１２６
．ＱＱＯＸ９で平衡まで（約４０時間）遠心する。紫外
線照射下で（３６５ルｍ）線状染色体およびプラスミド
ＤＮＡは強し）螢光を発するバンドとして遠心機チュー
ブの中（こ見られる。
このプラスミドＤＮＡを密度勾配から取り出し、ｎ−オ
クタツールで２回抽出することにより臭化エチジウムを
除き１次に水層を１０倍希釈ｓ ｓ ａｍｍ液液対して
透析してｐＴＰｌｌを得た０ 得られたｐＴＰｌｌＤＮＡを前述のプロトプラスト法に
より枯草菌の制限欠損−修飾欠損株であるＲ Ｍ １２
５株へ形質転換した。
クタツールで２回抽出することにより臭化エチジウムを
除き１次に水層を１０倍希釈ｓ ｓ ａｍｍ液液対して
透析してｐＴＰｌｌを得た０ 得られたｐＴＰｌｌＤＮＡを前述のプロトプラスト法に
より枯草菌の制限欠損−修飾欠損株であるＲ Ｍ １２
５株へ形質転換した。
得うｔ’ｔ、 タクロラムフェニコール耐性コロニーの
ひとつを使い、トリチウム標識チミジンラベル法により
プラスミドの検出を行ったところｐＴＰｌｌと全く同じ
分子量のプラスミドを検出することが出来た。本実験よ
りプラスミドｐＴＰ１１上にはクロラムフェニコール耐
性遺伝子が存在していることが確認された。
ひとつを使い、トリチウム標識チミジンラベル法により
プラスミドの検出を行ったところｐＴＰｌｌと全く同じ
分子量のプラスミドを検出することが出来た。本実験よ
りプラスミドｐＴＰ１１上にはクロラムフェニコール耐
性遺伝子が存在していることが確認された。
例５ニブラスミドｐＴＰ１１の制限酵素開裂点地図の作
成 制限酵素によるプラスミドＤＮＡの消化は次の条件によ
り行った。また、２種の制限酵素を組み合わせて反応さ
せる場合は、一方の酵素反応をフェノールで停止させ、
さらにフェノールをエーテル抽出した後に２倍量のエタ
ノールを加え、析出したＤＮＡを遠心によって集めＴＥ
バッファーに溶解した後２次の酵素反応を行った。
成 制限酵素によるプラスミドＤＮＡの消化は次の条件によ
り行った。また、２種の制限酵素を組み合わせて反応さ
せる場合は、一方の酵素反応をフェノールで停止させ、
さらにフェノールをエーテル抽出した後に２倍量のエタ
ノールを加え、析出したＤＮＡを遠心によって集めＴＥ
バッファーに溶解した後２次の酵素反応を行った。
Ｅｃｏ、ＲＩ １０ ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，２）。
Ｈ７，２）。
５”Ｍｍ化マグネシウム、２ｍＭメルカプトエタノール
、５０ｍＭ塩化ナトリウム、３７℃ ＨｐａＩ［２０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，’
Ｌ７ｍｌＪ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトー
ル（ＤＴＴ）、８７°Ｃ Ｘｂ＆Ｉ ６ｔ＋１Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，
４） 。
、５０ｍＭ塩化ナトリウム、３７℃ ＨｐａＩ［２０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，’
Ｌ７ｍｌＪ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトー
ル（ＤＴＴ）、８７°Ｃ Ｘｂ＆Ｉ ６ｔ＋１Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，
４） 。
１００ｍＭ塩化ナトリウム、６ｍＭ塩化マグネシウム、
８７℃ ＢｃｌＩ １２ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４
）。
８７℃ ＢｃｌＩ １２ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４
）。
１１＋１Ｍ塩化マグネシウム、１２ｍＭ塩化ナトリウム
、０゜５ｍＭＤＴＴ、５０℃Ｈｉｎｄｌｔｌ ２０
ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（ｐ）１７．４ ） ＋７ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、（！ＯｍＭ塩化ナトリウム、３７
°Ｃ 消化混合物はシャープ等によってつくられた１％アガロ
ースゲル中で分析した（ Ｊ、８ｈｆＬｒｐ ｅｔａｌ
、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 １２８０５５〜８０
６８ （１９７８） ）。
、０゜５ｍＭＤＴＴ、５０℃Ｈｉｎｄｌｔｌ ２０
ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（ｐ）１７．４ ） ＋７ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、（！ＯｍＭ塩化ナトリウム、３７
°Ｃ 消化混合物はシャープ等によってつくられた１％アガロ
ースゲル中で分析した（ Ｊ、８ｈｆＬｒｐ ｅｔａｌ
、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 １２８０５５〜８０
６８ （１９７８） ）。
ｇｃｏＲｌ消化λＤＮＡを分子量対照として使用した（
Ｔｈｏｍａｓら、 Ｊ、 Ｍｏｌ、 Ｂｉｏｌ、、
９１ ８１５〜３２８（１９７５））。
Ｔｈｏｍａｓら、 Ｊ、 Ｍｏｌ、 Ｂｉｏｌ、、
９１ ８１５〜３２８（１９７５））。
ｐＴＰｌｌの制限酵素開裂点の数および開裂断片の分子
量を表に示し、開裂意地図は図１に示した。
量を表に示し、開裂意地図は図１に示した。
例６：ブラスミドｐＴＰＩＩＯＩの製造枯草菌ＲＭ１２
５ （ｐＮｓｌ ）株（Ｇｅｎｅ ２１゜１０５〜１１
２（１９８８））よりプラスミドｐＮＳ Ｉ ＤＮＡ
（制限酵素開裂点地図を図２に示す）を前述の方法（例
４）と同様にして抽出し、プラスミドｐＴＰ１１ ＤＮ
Ａと混合後制限酵素Ｈｉｎｄ ｍ で切断した。すなわ
ち、ｐＴＰｌｌＯＮＡ １％とｐＮｓｌ １１ｔ９を２
０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４７、７，ｍＭ塩化
マグネシウム。
５ （ｐＮｓｌ ）株（Ｇｅｎｅ ２１゜１０５〜１１
２（１９８８））よりプラスミドｐＮＳ Ｉ ＤＮＡ
（制限酵素開裂点地図を図２に示す）を前述の方法（例
４）と同様にして抽出し、プラスミドｐＴＰ１１ ＤＮ
Ａと混合後制限酵素Ｈｉｎｄ ｍ で切断した。すなわ
ち、ｐＴＰｌｌＯＮＡ １％とｐＮｓｌ １１ｔ９を２
０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４７、７，ｍＭ塩化
マグネシウム。
６０ｍＭ塩化ナトリウム、 Ｈｉｎｄｌｌｌ １０単
位含有溶液中で８７°Ｃ，１時間の反応により切断する
。反応をフェ７−ルを加えることにより停止させ、エー
テル抽出によりフェノールを除去後２倍量のエタノール
を加え、ＤＮＡを沈殿させた。
位含有溶液中で８７°Ｃ，１時間の反応により切断する
。反応をフェ７−ルを加えることにより停止させ、エー
テル抽出によりフェノールを除去後２倍量のエタノール
を加え、ＤＮＡを沈殿させた。
沈殿したＤＮＡベレットを６６ｍＭ）リス塩酸緩衝液（
ｐＨ７，６） 、 ｅ、ａ ｍＭ塩化マグネシウム、
１０ｍＭジチオスレイトール、４ｍＭアデノシン三リシ
リン酸溶液１００μノ解後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．０
１単位を加え１６°Ｃ１１６時間の反応によってＤＮＡ
を連結させた。フェノールにより反応を停止させ、エー
テル抽出にヨリフェノールを除去後、２倍量のエタノー
ルを加えＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを滅菌蒸
留水５０μノに溶解し、形質転換用ＤＮＡ試料として用
いた。
ｐＨ７，６） 、 ｅ、ａ ｍＭ塩化マグネシウム、
１０ｍＭジチオスレイトール、４ｍＭアデノシン三リシ
リン酸溶液１００μノ解後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．０
１単位を加え１６°Ｃ１１６時間の反応によってＤＮＡ
を連結させた。フェノールにより反応を停止させ、エー
テル抽出にヨリフェノールを除去後、２倍量のエタノー
ルを加えＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを滅菌蒸
留水５０μノに溶解し、形質転換用ＤＮＡ試料として用
いた。
形質転換は例２に記載したプロトプラスト法により行っ
た。受容菌には枯草菌ＲＭ１２５株を用いた。
た。受容菌には枯草菌ＲＭ１２５株を用いた。
得られたクロラムフェニコール、テトラサイクリン両耐
性を持つコロニーについてプラスミドＤＮＡの検索を行
った。すなわち、得られたコロニーを溶菌用緩衝液（リ
ゾチーム２μり／−２ＲＮａｓｅ ０． Ｉ Ｔｎ９／
ｍｌ 、 ２５％シュークローストするようにＴＥバ
ッファーに溶解）４０μｌに懸濁し８７°Ｃ，２時間反
応させた。この溶液に５％ＳＤＳ溶液ｌＯμｌを加え、
完全に溶菌後、フェノール５０μｌを加え１０，０００
ｒｐｍｌＯ分間の遠心後、水層を分取した。
性を持つコロニーについてプラスミドＤＮＡの検索を行
った。すなわち、得られたコロニーを溶菌用緩衝液（リ
ゾチーム２μり／−２ＲＮａｓｅ ０． Ｉ Ｔｎ９／
ｍｌ 、 ２５％シュークローストするようにＴＥバ
ッファーに溶解）４０μｌに懸濁し８７°Ｃ，２時間反
応させた。この溶液に５％ＳＤＳ溶液ｌＯμｌを加え、
完全に溶菌後、フェノール５０μｌを加え１０，０００
ｒｐｍｌＯ分間の遠心後、水層を分取した。
この水層についてアガロースゲル電気泳動法により、グ
ラスミドＤＮＡの確認を行い１分子量が最も小さいプラ
スミドＤＮＡを持っているいくつかの形質転換株を選択
した。
ラスミドＤＮＡの確認を行い１分子量が最も小さいプラ
スミドＤＮＡを持っているいくつかの形質転換株を選択
した。
各形質転換株より前述の方法でプラスミドＤＮＡを調製
し、 ＥｃｏＲＩ、 ＨｉｎｃｌｌおよびＫｐｎ １
に閃する制限酵素開裂点地図を作成した。Ｋｐｎ Ｉの
反応条件は５ｍＭ）！Ｊスス−酸緩衝液（ｐＨ７，５）
、６ｍＭ塩化ナトリウム、６ｍＭ塩化マグネシウム、６
ｍＭ２−メルカプトエタノール。
し、 ＥｃｏＲＩ、 ＨｉｎｃｌｌおよびＫｐｎ １
に閃する制限酵素開裂点地図を作成した。Ｋｐｎ Ｉの
反応条件は５ｍＭ）！Ｊスス−酸緩衝液（ｐＨ７，５）
、６ｍＭ塩化ナトリウム、６ｍＭ塩化マグネシウム、６
ｍＭ２−メルカプトエタノール。
３７°Ｃである。
この結果、ｐＮｓ１由来のＨｉｎｄ ｌｉ −Ａ断片ミ
ドｐＴＰ１１０１とｐＴＰ１１０２をそれぞれ持つ２種
の形質転換株が存在することが確認された。
ドｐＴＰ１１０１とｐＴＰ１１０２をそれぞれ持つ２種
の形質転換株が存在することが確認された。
ｐＴＰｌｌｏｌとｐＴＰ１１０２の制限酵素開裂点地図
を図３と図４および図５に示した。
を図３と図４および図５に示した。
また、コピー数はおのおの約１００コピーであった０
以上に述べたように９本発明のプラスミドは分子量が約
４．３Ｍｄと取扱いに適当でコピー数が多く、かつテト
ラサイクリン耐性、クロラムフェニコール耐性の二つの
マーカーを有しているので極めて有用なものである。
４．３Ｍｄと取扱いに適当でコピー数が多く、かつテト
ラサイクリン耐性、クロラムフェニコール耐性の二つの
マーカーを有しているので極めて有用なものである。
また２以上の例で用いた微生物は工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託されており９次の番号を有している。
技術研究所に寄託されており９次の番号を有している。
コリネバクテリウム・キセロシスＭ８２ＢｒＥＲＭ Ｐ
−６９７１ 枯草菌１６８ＬＭＡＨ７６１２２２ ＦＥＲＭ Ｐ−６９７２ 枯草菌ＲＭ１２５ ＦＥＲＭ Ｐ−６９７’３
枯草菌ＲＭ１２５ （ｐＮ３１ ） ＦＥＲＭ Ｐ−７００８
−６９７１ 枯草菌１６８ＬＭＡＨ７６１２２２ ＦＥＲＭ Ｐ−６９７２ 枯草菌ＲＭ１２５ ＦＥＲＭ Ｐ−６９７’３
枯草菌ＲＭ１２５ （ｐＮ３１ ） ＦＥＲＭ Ｐ−７００８
図１乃至図５は、プラスミドの制限酵素開裂点地図であ
る。 １ 図２ 回３１￥］４ Ｃ ＋−−−−−−一− ＣＰ十計ｅｐ
る。 １ 図２ 回３１￥］４ Ｃ ＋−−−−−−一− ＣＰ十計ｅｐ
Claims (1)
- テトラサイクリン耐性遺伝子およびクロラムフェニコー
ル耐性遺伝子を有し１分子量が約４．８メガダルトンで
あり、制限酵素開裂意地図が次の通りであるプラスミド
ｐＴｐＨ０１
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58053050A JPS59179080A (ja) | 1983-03-29 | 1983-03-29 | プラスミドｐＴＰ１１０１ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58053050A JPS59179080A (ja) | 1983-03-29 | 1983-03-29 | プラスミドｐＴＰ１１０１ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59179080A true JPS59179080A (ja) | 1984-10-11 |
| JPH0139754B2 JPH0139754B2 (ja) | 1989-08-23 |
Family
ID=12932030
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58053050A Granted JPS59179080A (ja) | 1983-03-29 | 1983-03-29 | プラスミドｐＴＰ１１０１ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59179080A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2569421A1 (fr) * | 1984-08-21 | 1986-02-28 | Asahi Chemical Ind | Plasmide et fragment d'adn comprenant un gene pour la resistance a la tetracycline, culture de microorganisme contenant le plasmide precite et microorganisme contenant ledit fragment d'adn |
| JPS61104791A (ja) * | 1984-10-30 | 1986-05-23 | Asahi Chem Ind Co Ltd | テトラサイクリン耐性遺伝子を含むｄｎａ断片および該ｄｎａ断片を含むベクタ−プラスミド |
-
1983
- 1983-03-29 JP JP58053050A patent/JPS59179080A/ja active Granted
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2569421A1 (fr) * | 1984-08-21 | 1986-02-28 | Asahi Chemical Ind | Plasmide et fragment d'adn comprenant un gene pour la resistance a la tetracycline, culture de microorganisme contenant le plasmide precite et microorganisme contenant ledit fragment d'adn |
| JPS61104791A (ja) * | 1984-10-30 | 1986-05-23 | Asahi Chem Ind Co Ltd | テトラサイクリン耐性遺伝子を含むｄｎａ断片および該ｄｎａ断片を含むベクタ−プラスミド |
| JPH0224518B2 (ja) * | 1984-10-30 | 1990-05-29 | Asahi Chemical Ind |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0139754B2 (ja) | 1989-08-23 |
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