JPH0363357B2 - - Google Patents
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- JPH0363357B2 JPH0363357B2 JP57124553A JP12455382A JPH0363357B2 JP H0363357 B2 JPH0363357 B2 JP H0363357B2 JP 57124553 A JP57124553 A JP 57124553A JP 12455382 A JP12455382 A JP 12455382A JP H0363357 B2 JPH0363357 B2 JP H0363357B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はプラスミドpSVH1、およびストレプ
トマイセテスのDNAの他の微生物、特にストレ
プトマイセテス（Streptomycetes）〔ストレプト
マイセス（Streptomyces）〕の別の種に伝達しう
る雑種（ハイブリド）ベクターの調製へのその使
用に関する。
トマイセテスのDNAの他の微生物、特にストレ
プトマイセテス（Streptomycetes）〔ストレプト
マイセス（Streptomyces）〕の別の種に伝達しう
る雑種（ハイブリド）ベクターの調製へのその使
用に関する。
ドイツ特許出願公開第3005226号明細書の記載
から、ストレプトマイセス・エスピノズス
（Streptomyces espinosus）の培養物からプラス
ミドpUC6が取得されうることは知られている。
さらにPCT特許出願第79／01169号明細書によれ
ば、数種のストレプトマイセスにDNAを導入す
るためのベクターとして適当であると考えられる
プラスミドがストレプトマイセス・リビダンス
（St.lividans）から取得されうることも知られて
いる。
から、ストレプトマイセス・エスピノズス
（Streptomyces espinosus）の培養物からプラス
ミドpUC6が取得されうることは知られている。
さらにPCT特許出願第79／01169号明細書によれ
ば、数種のストレプトマイセスにDNAを導入す
るためのベクターとして適当であると考えられる
プラスミドがストレプトマイセス・リビダンス
（St.lividans）から取得されうることも知られて
いる。
これらの事実から、抗生物質形成性ストレプト
マイセス種への遺伝子技術方法の適用には特別な
意味があることが認識できる。しかしながら、大
抵の従来既知のプラスミドは実際上の使用にはあ
まり重要視されなかつた。何故ならばこれらは比
較的大量には容易に調製されなかつたからであ
る。他方、１細胞当り多数のコピーにて存在する
プラスミド（マルチコピープラスミド）がクロー
ン化された遺伝子の増幅のためのベクターとして
適度に使用される場合には、そのプラスミドを入
手しうることは遺伝子技術操作にとつて非常に重
要である。
マイセス種への遺伝子技術方法の適用には特別な
意味があることが認識できる。しかしながら、大
抵の従来既知のプラスミドは実際上の使用にはあ
まり重要視されなかつた。何故ならばこれらは比
較的大量には容易に調製されなかつたからであ
る。他方、１細胞当り多数のコピーにて存在する
プラスミド（マルチコピープラスミド）がクロー
ン化された遺伝子の増幅のためのベクターとして
適度に使用される場合には、そのプラスミドを入
手しうることは遺伝子技術操作にとつて非常に重
要である。
抗生物質の調製に使用されるストレプトマイセ
ス株を抗生物質の形成量を増大させる目的で遺伝
的に改良することは重要な課題である。しかしな
がら、相互に関連しない種でしばしば観察される
ように、宿主細胞として用いられているストレプ
トマイセス種から再び即座に脱離されないプラス
ミドが入手できる場合にのみ遺伝子技術方法を用
いて効果的に解決される。
ス株を抗生物質の形成量を増大させる目的で遺伝
的に改良することは重要な課題である。しかしな
がら、相互に関連しない種でしばしば観察される
ように、宿主細胞として用いられているストレプ
トマイセス種から再び即座に脱離されないプラス
ミドが入手できる場合にのみ遺伝子技術方法を用
いて効果的に解決される。
従つて、ストレプトマイセス株を遺伝的に改良
するためのベクターとして適当な容易に単離でき
且つ細胞中で安定に存在するマルチコピープラス
ミドを見出すという課題があつた。この課題は他
のストレプトマイセス種に適合性のあるプラスミ
ドを探し出せれば最も容易に解決できることは明
白である。
するためのベクターとして適当な容易に単離でき
且つ細胞中で安定に存在するマルチコピープラス
ミドを見出すという課題があつた。この課題は他
のストレプトマイセス種に適合性のあるプラスミ
ドを探し出せれば最も容易に解決できることは明
白である。
今やストレプトマイセス・ベネズエラ（St.
venezuelae）DSM40755の培養物から取得される
分子量8.4メガダルトン、外形長さ4.1μｍを有し
そして12.6キロ塩基対合（＝kb）からなるプラス
ミドpSVH1によりこの課題が解決されることが
示された。
venezuelae）DSM40755の培養物から取得される
分子量8.4メガダルトン、外形長さ4.1μｍを有し
そして12.6キロ塩基対合（＝kb）からなるプラス
ミドpSVH1によりこの課題が解決されることが
示された。
これに使用されるストレプトマイセス・ベネズ
エラの菌株はL.Ettlinger氏等の「Arch.
Mikrobiol.」第31巻第326〜358頁（1958年）、特
に第352頁以降に詳細に記載されている。更に詳
細はR.Huetter氏著「Systematik der
Streptomyceten」（Karger出版1967年発行）第
60頁に見出される。
エラの菌株はL.Ettlinger氏等の「Arch.
Mikrobiol.」第31巻第326〜358頁（1958年）、特
に第352頁以降に詳細に記載されている。更に詳
細はR.Huetter氏著「Systematik der
Streptomyceten」（Karger出版1967年発行）第
60頁に見出される。
ストレプトマイセス・ベネズエラDSM47055は
まず第一にプラスミドの優れた供給体とみなされ
る。何故ならば、これにはその8.4メガダルトン
なる低い分子量のゆえに遺伝子技術操作の実施に
特に良好に適するプラスミドが各細胞中に20個よ
りはるかに多数存在するからである。
まず第一にプラスミドの優れた供給体とみなされ
る。何故ならば、これにはその8.4メガダルトン
なる低い分子量のゆえに遺伝子技術操作の実施に
特に良好に適するプラスミドが各細胞中に20個よ
りはるかに多数存在するからである。
ストレプトマイセス・ベネズエラDSM40755は
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
Gesellschaft f¨ur Biotechnologische Forschung
MBH（DSM）に国際寄託受託番号DSM 40755と
して寄託されている。
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
Gesellschaft f¨ur Biotechnologische Forschung
MBH（DSM）に国際寄託受託番号DSM 40755と
して寄託されている。
ストレプトマイセス・ベネズエラDSM40755か
らのプラスミドの単離はそれ自体既知の方法によ
り遂行される。はじめに菌株をグリシンを含有す
る適当な培地中で培養する。菌糸体を収穫し、洗
滌しそして均質化した後、細胞壁をリゾチームを
用いてとり除く。細胞をプロテイナーゼＫおよび
ドデシル硫酸ナトリウムで処理した後に細胞が溶
解し、従つて細胞残分および染色体DNAが遠心
分離により分離されうる。次にプラスミドをポリ
エチレングリコールで沈殿させそしてH.C.
BirnboimおよびJ.Doly両氏の「J.Nucl.Acids
Res.」第７巻第1513〜1523頁（1975年）記載の方
法による迅速調査のために後処理する。かくして
濃縮されたプラスミドpSVH1は直ちに分析調査
に使用できそして制限エンドヌクレアーゼでの処
理に付されうる。純粋な調製は２回連続するセシ
ウムクロライド密度勾配遠心分離より達成されう
る。
らのプラスミドの単離はそれ自体既知の方法によ
り遂行される。はじめに菌株をグリシンを含有す
る適当な培地中で培養する。菌糸体を収穫し、洗
滌しそして均質化した後、細胞壁をリゾチームを
用いてとり除く。細胞をプロテイナーゼＫおよび
ドデシル硫酸ナトリウムで処理した後に細胞が溶
解し、従つて細胞残分および染色体DNAが遠心
分離により分離されうる。次にプラスミドをポリ
エチレングリコールで沈殿させそしてH.C.
BirnboimおよびJ.Doly両氏の「J.Nucl.Acids
Res.」第７巻第1513〜1523頁（1975年）記載の方
法による迅速調査のために後処理する。かくして
濃縮されたプラスミドpSVH1は直ちに分析調査
に使用できそして制限エンドヌクレアーゼでの処
理に付されうる。純粋な調製は２回連続するセシ
ウムクロライド密度勾配遠心分離より達成されう
る。
かくして得られたプラスミドpSVH1はアガロ
ースゲル上で制限酵素を用いてエンドヌクレアー
ゼ解裂させることにより特性化されうる。この方
法によりそれぞれのpSVH1フラグメントの数お
よび寸法が識別されうる。このプラスミド
pSVH1にとつて特徴的なことは、それが制限エ
ンドヌクレアーゼEco R1、Hind、Xba1およ
びHpa1に対して何ら切断部位を有せず、制限エ
ンドヌクレアーゼPstおよびBclによつて１
個所のみ切断され、Xhoによつて長さ7.6およ
び4.9kbを有する２個のフラグメントに切断され、
Claによつて長さ11.8および0.8kbを有する２個
のフラグメントに切断され、Bglによつて長さ
7.5、2.8および2.4kbを有する３個のフラグメント
に切断され、そしてBamHによつて長さ7.7、
1.8および1.2kbを有する４個のフラグメントに切
断されることである。さらに、これら酵素のいく
つかの切断部位の相関関係は環形状のプラスミド
分子上に示された（添付図面参照）。加えて、
PvuおよびKpnを用いるエンドヌクレアーゼ
解裂により４個のフラグメント、Nru、Pvu
およびSmaを用いて５個のフラグメント、Sat
およびSacを用いて７個のフラグメント、
Sstを用いて８個のフラグメント、そしてSal
を用いて10個よりはるかに多数のフラグメントが
生ずる。
ースゲル上で制限酵素を用いてエンドヌクレアー
ゼ解裂させることにより特性化されうる。この方
法によりそれぞれのpSVH1フラグメントの数お
よび寸法が識別されうる。このプラスミド
pSVH1にとつて特徴的なことは、それが制限エ
ンドヌクレアーゼEco R1、Hind、Xba1およ
びHpa1に対して何ら切断部位を有せず、制限エ
ンドヌクレアーゼPstおよびBclによつて１
個所のみ切断され、Xhoによつて長さ7.6およ
び4.9kbを有する２個のフラグメントに切断され、
Claによつて長さ11.8および0.8kbを有する２個
のフラグメントに切断され、Bglによつて長さ
7.5、2.8および2.4kbを有する３個のフラグメント
に切断され、そしてBamHによつて長さ7.7、
1.8および1.2kbを有する４個のフラグメントに切
断されることである。さらに、これら酵素のいく
つかの切断部位の相関関係は環形状のプラスミド
分子上に示された（添付図面参照）。加えて、
PvuおよびKpnを用いるエンドヌクレアーゼ
解裂により４個のフラグメント、Nru、Pvu
およびSmaを用いて５個のフラグメント、Sat
およびSacを用いて７個のフラグメント、
Sstを用いて８個のフラグメント、そしてSal
を用いて10個よりはるかに多数のフラグメントが
生ずる。
多数のプラスミドについての外形測定で寸法
4.1μｍおよびそれから導かれる分子量8.23メガダ
ルトンが得られた。この値はゲル電気泳動により
分離した後の制限フラグメント重量を加算して計
算された分子量（＝8.4メガダルトン）とよく一
致する。同じかまたは類似のプラスミドはこれま
で何ら他のストレプトマイセス・ベネズエラ純型
において見出されなかつた〔V.S.MalikおよびF.
Reuser両氏「Plamid」第２巻第627〜31頁
（1979年）参照〕。
4.1μｍおよびそれから導かれる分子量8.23メガダ
ルトンが得られた。この値はゲル電気泳動により
分離した後の制限フラグメント重量を加算して計
算された分子量（＝8.4メガダルトン）とよく一
致する。同じかまたは類似のプラスミドはこれま
で何ら他のストレプトマイセス・ベネズエラ純型
において見出されなかつた〔V.S.MalikおよびF.
Reuser両氏「Plamid」第２巻第627〜31頁
（1979年）参照〕。
プラスミドpSVH1はベクターの調製にいくつ
かの理由で非常に適している。まず第一に１細胞
当り20よりはるかに多いプラスミドなる極度に高
いコピー数およびその安定性は遺伝子技術上の操
作にpSVH1を使用するための非常に重要な要件
である。従来、ストレプトマイセス・ベネズエラ
DSM40755でプラスミドのない菌株は広範囲の研
究にもかかわらず観察されなかつた。プラスミド
の単離に際してはストレプトマイセテスの原初培
養液１当りでは計算して200μｇ以上の収量が
常に収穫される。
かの理由で非常に適している。まず第一に１細胞
当り20よりはるかに多いプラスミドなる極度に高
いコピー数およびその安定性は遺伝子技術上の操
作にpSVH1を使用するための非常に重要な要件
である。従来、ストレプトマイセス・ベネズエラ
DSM40755でプラスミドのない菌株は広範囲の研
究にもかかわらず観察されなかつた。プラスミド
の単離に際してはストレプトマイセテスの原初培
養液１当りでは計算して200μｇ以上の収量が
常に収穫される。
プラスミドpSVH1はなかんずく他のストレプ
トマイセテスに導入されうる雑種ベクターの形成
に適する。これは従来知られているすべてのプラ
スミドが比較的小数の宿主細胞においてしか確立
され得ないことが見出されているからである。従
つて例えばグラム陽性細菌とグラム陰性細菌との
間には外来DNAの増殖に対する障壁が存在する
ことが知られる〔P.CourvalinおよびM.Fiandt両
氏「Gene」第８巻第247〜269頁（1980年）参
照〕。クローニングが成功する最大の機会は雑種
ベクターが密接に関連した宿主細胞中に導入され
る場合に常に存在する。これまで発表されたスト
レプトマイセテスのプラスミドおよびフアージに
関するすべてのデータは、これらが非常に限定さ
れた数の他のストレプトマイセテス中にのみ安定
に導入されうることを示しさえする。ストレプト
マイセテス中におけるストレプトマイセテス
DNAのクローニングは、例えば抗生物質の合成
に関与する１個または小数のみでなく非常に多数
の遺伝子がクローニングされるべき場合に常に必
要である。
トマイセテスに導入されうる雑種ベクターの形成
に適する。これは従来知られているすべてのプラ
スミドが比較的小数の宿主細胞においてしか確立
され得ないことが見出されているからである。従
つて例えばグラム陽性細菌とグラム陰性細菌との
間には外来DNAの増殖に対する障壁が存在する
ことが知られる〔P.CourvalinおよびM.Fiandt両
氏「Gene」第８巻第247〜269頁（1980年）参
照〕。クローニングが成功する最大の機会は雑種
ベクターが密接に関連した宿主細胞中に導入され
る場合に常に存在する。これまで発表されたスト
レプトマイセテスのプラスミドおよびフアージに
関するすべてのデータは、これらが非常に限定さ
れた数の他のストレプトマイセテス中にのみ安定
に導入されうることを示しさえする。ストレプト
マイセテス中におけるストレプトマイセテス
DNAのクローニングは、例えば抗生物質の合成
に関与する１個または小数のみでなく非常に多数
の遺伝子がクローニングされるべき場合に常に必
要である。
全代謝径路についての遺伝子のクローニングは
その遺伝子がストレプトマイセテスのゲノム全体
にわたつて分配されているため、たとえそれが実
際上解決できない問題とはならないにしても少く
とも膨大な作業である。ストレプトマイセテスの
クローニングシステムにおいてはここでは例えば
代謝溢路が存在する場合、実質上より高い収量を
達成するには事情によつては１個の遺伝子の増幅
で充分でありうる。密接に関連した代謝径路を組
み合わせること、例えば抗生物質を変性させる酵
素を挿入することにより、考えられうるような雑
種抗生物質の創成においても、同じ理由からスト
レプトマイセテス宿主ベクターシステムのみが成
功の見込みがある。プラスミドpSVH1はこれら
の理由から抗生物質収量の増大を可能にするため
の雑種ベクターの調製に顕著に適している。
その遺伝子がストレプトマイセテスのゲノム全体
にわたつて分配されているため、たとえそれが実
際上解決できない問題とはならないにしても少く
とも膨大な作業である。ストレプトマイセテスの
クローニングシステムにおいてはここでは例えば
代謝溢路が存在する場合、実質上より高い収量を
達成するには事情によつては１個の遺伝子の増幅
で充分でありうる。密接に関連した代謝径路を組
み合わせること、例えば抗生物質を変性させる酵
素を挿入することにより、考えられうるような雑
種抗生物質の創成においても、同じ理由からスト
レプトマイセテス宿主ベクターシステムのみが成
功の見込みがある。プラスミドpSVH1はこれら
の理由から抗生物質収量の増大を可能にするため
の雑種ベクターの調製に顕著に適している。
雑種ベクターを調製するには大腸菌プラスミド
においてすでに用いられそしてストレプトマイセ
テスでもM.Bibb氏等の「Nature」等284巻第526
〜531頁（1980年）、およびC.J.Thompson氏等の
「Nature」第286巻第525〜527頁（1980年）によ
り使用されているのと同じ遺伝子技術方法が用い
られる。
においてすでに用いられそしてストレプトマイセ
テスでもM.Bibb氏等の「Nature」等284巻第526
〜531頁（1980年）、およびC.J.Thompson氏等の
「Nature」第286巻第525〜527頁（1980年）によ
り使用されているのと同じ遺伝子技術方法が用い
られる。
これら既知方法によりプラスミドpSVH1中に
上記制限エンドヌクレアーゼを用いて得られた切
断個所のいくつかに、抗生物質抵抗性を有する遺
伝子が挿入されうるのみならず、抗生物質産生の
増大をひき起す遺伝子も挿入されうる。かくして
得られた雑種プラスミドはこれまでのすべての実
験において、ストレプトマイセス細胞中で出発プ
ラスミドと同様に生存でき且つ増殖しうる。
上記制限エンドヌクレアーゼを用いて得られた切
断個所のいくつかに、抗生物質抵抗性を有する遺
伝子が挿入されうるのみならず、抗生物質産生の
増大をひき起す遺伝子も挿入されうる。かくして
得られた雑種プラスミドはこれまでのすべての実
験において、ストレプトマイセス細胞中で出発プ
ラスミドと同様に生存でき且つ増殖しうる。
本発明を以下の例によりさらに説明する。％は
別に断わりなければ重量によるものとする。
別に断わりなければ重量によるものとする。
例
１ ストレプトマイセス・ベネズエラDSM40755
の培養およびプロトラスト形成 培養は適当な容器例えば300mlのエレンマイ
ヤーフラスコ中で、50mlの培地例えばルリア
（Luria）肉汁または2YT〔J.H.Millr氏
Experiments in Molecular Genetics」（Cold
Spring Harbor Laboratory 1972年発行参照〕
中でかまたは有効な窒素源および炭素源を有す
るその他の培地中で遂行される。すべての培地
は付加的に0.5重量％のグリシンを含有する。
胞子懸濁液または胞子を充たした白金耳を用い
て接種する。培養は振盪器中32℃において振幅
４cm、220rpmで早期定常相となるまで２〜３
日間遂行する。続いて6000ｇおよび４℃で10分
間遠心分離することにより細胞を収穫する。続
くプラスミドを用いる転換のためのプロトプラ
スト形成のためにはこの工程および以後の工程
は減菌条件下にとり行われた。菌糸体ペレツト
を１回水洗しそして次に例えば庶糖25％エチレ
ンジアミンテトラ酢酸（EDTA）50ｍＭ濃度
およびトリス（ヒドロキシメチルアミノ）メタ
ン（Tris）50ｍＭ濃度の適当な高張緩衝液５
ml中にPH８でとる。次にガラスホモジナイザー
中で２〜４ストロークすることにより菌糸体を
破壊する。これによりリゾチームがその作用部
位に接近するのが容易になる。リゾチーム１ml
（PH８で50ｍＭ Tris中に10mg／ml含有）を添
加した後、実際上完全なプロトプラストの形成
を達成するには室温で60分間の消化で充分であ
る。
の培養およびプロトラスト形成 培養は適当な容器例えば300mlのエレンマイ
ヤーフラスコ中で、50mlの培地例えばルリア
（Luria）肉汁または2YT〔J.H.Millr氏
Experiments in Molecular Genetics」（Cold
Spring Harbor Laboratory 1972年発行参照〕
中でかまたは有効な窒素源および炭素源を有す
るその他の培地中で遂行される。すべての培地
は付加的に0.5重量％のグリシンを含有する。
胞子懸濁液または胞子を充たした白金耳を用い
て接種する。培養は振盪器中32℃において振幅
４cm、220rpmで早期定常相となるまで２〜３
日間遂行する。続いて6000ｇおよび４℃で10分
間遠心分離することにより細胞を収穫する。続
くプラスミドを用いる転換のためのプロトプラ
スト形成のためにはこの工程および以後の工程
は減菌条件下にとり行われた。菌糸体ペレツト
を１回水洗しそして次に例えば庶糖25％エチレ
ンジアミンテトラ酢酸（EDTA）50ｍＭ濃度
およびトリス（ヒドロキシメチルアミノ）メタ
ン（Tris）50ｍＭ濃度の適当な高張緩衝液５
ml中にPH８でとる。次にガラスホモジナイザー
中で２〜４ストロークすることにより菌糸体を
破壊する。これによりリゾチームがその作用部
位に接近するのが容易になる。リゾチーム１ml
（PH８で50ｍＭ Tris中に10mg／ml含有）を添
加した後、実際上完全なプロトプラストの形成
を達成するには室温で60分間の消化で充分であ
る。
２ 細胞の溶解
プラスミドDNAを調製するためにプロトプ
ラストをさらに30分間室温でプロテイナーゼＫ
（PH８で50ｍＭ Tris中に１mg／ml含有）１ml
と処理する。続いて細胞懸濁液にドデシル硫酸
ナトリウムを最終濃度0.1％となるまで加えそ
して次にさらに30分間室温で培養する。続いて
EDTA ２ｍＭ濃度、塩化ナトリウム2M濃度、
Tris50ｍＭ濃度の溶液７mlをPH８で加えそし
て高度に粘稠な混合物を少くとも１時間氷上で
培養する。次に細胞残留物および染色体DNA
の主要量を20000ｇおよび４℃で１時間遠心分
離することにより分離し、そして分析的プラス
ミド単離が意図されるかまたは調製的プラスミ
ド単離が意図されるかの如何に従つて異なる条
件下に処理される。
ラストをさらに30分間室温でプロテイナーゼＫ
（PH８で50ｍＭ Tris中に１mg／ml含有）１ml
と処理する。続いて細胞懸濁液にドデシル硫酸
ナトリウムを最終濃度0.1％となるまで加えそ
して次にさらに30分間室温で培養する。続いて
EDTA ２ｍＭ濃度、塩化ナトリウム2M濃度、
Tris50ｍＭ濃度の溶液７mlをPH８で加えそし
て高度に粘稠な混合物を少くとも１時間氷上で
培養する。次に細胞残留物および染色体DNA
の主要量を20000ｇおよび４℃で１時間遠心分
離することにより分離し、そして分析的プラス
ミド単離が意図されるかまたは調製的プラスミ
ド単離が意図されるかの如何に従つて異なる条
件下に処理される。
３(a) 分析的プラスミド単離
遠心分離の上澄み液を注意深く注ぎそして
ポリエチレングリコール6000を最終濃度10％
となるまで添加することによりプラスミド
DNAを沈澱させる。氷上で１時間培養後、
沈澱を20000ｇおよび４℃で20分間遠心分離
することにより集め、このペレツトを0.2N
NaOH500μl中にとりそして30分間０℃で培
養する。続いてアルカリ性の懸濁液をPH4.8
の3M酢酸ナトリウム溶液375μの添加によ
り中和する。それによりアルカリ処理によつ
て部分的に１本のストランドに変性された染
色体DNSが部分的に相同の領域において再
び二重ストランドDNAに変換され、そして
染色体DNAフラグメントの交叉結合により
分子量の巨大な生成物が生じ、これは15000
ｇおよび４℃で５分間遠心分離することによ
り容易に除去されうる「Nucleic Acids
Research」第７巻第1513〜23頁（1979年）
参照〕。次に上澄み液に2.5倍量のエタノール
を加えそして−18℃で４時間培養後沈殿した
プラスミドDNAを遠心分離（15000ｇ、４
℃、20分間）により集めそして78％エタノー
ルで１回洗う。次に凝縮されたプラスミド
DNAを0.1ｍＭ EDTAおよび20ｍＭ Tris
中にPH８でとりそして制限酵素を用いるプラ
スミドの迅速分析に使用する。
ポリエチレングリコール6000を最終濃度10％
となるまで添加することによりプラスミド
DNAを沈澱させる。氷上で１時間培養後、
沈澱を20000ｇおよび４℃で20分間遠心分離
することにより集め、このペレツトを0.2N
NaOH500μl中にとりそして30分間０℃で培
養する。続いてアルカリ性の懸濁液をPH4.8
の3M酢酸ナトリウム溶液375μの添加によ
り中和する。それによりアルカリ処理によつ
て部分的に１本のストランドに変性された染
色体DNSが部分的に相同の領域において再
び二重ストランドDNAに変換され、そして
染色体DNAフラグメントの交叉結合により
分子量の巨大な生成物が生じ、これは15000
ｇおよび４℃で５分間遠心分離することによ
り容易に除去されうる「Nucleic Acids
Research」第７巻第1513〜23頁（1979年）
参照〕。次に上澄み液に2.5倍量のエタノール
を加えそして−18℃で４時間培養後沈殿した
プラスミドDNAを遠心分離（15000ｇ、４
℃、20分間）により集めそして78％エタノー
ルで１回洗う。次に凝縮されたプラスミド
DNAを0.1ｍＭ EDTAおよび20ｍＭ Tris
中にPH８でとりそして制限酵素を用いるプラ
スミドの迅速分析に使用する。
(b) 調製的プラスミド単離
分析的プラスミド単離において既に記載の
ポリエチレングリコール沈澱後、20000ｇお
よび４℃で20分間遠心分離することにより集
めたプラスミドDNAを10ｍＭ EDTAおよ
び50ｍＭ Trisの溶液６ml中にPH８でとる。
生じた懸濁液量をピペツトで測定しそして懸
濁液１ml当り塩化セシウム１ｇを添加する。
続いてエチジウムブロマイド（10mg／ml）
200μを加えそしてこの懸濁液を超遠心器
中で80000ｇおよび15℃で60時間遠心分離す
る。密度の比較的濃い帯域を紫外光線により
可視的となし、注射針で側面から穿刺してと
り出しそして新たに10ｍＭ EDTA、50ｍ
Ｍ Trisからなる付加的にさらに塩化セシ
ウム５ｇを含有する溶液５mlをPH８で加え
る。超遠心器中における再遠心分離は続く帯
域の単離と同じ条件下に遂行される。集めら
れたDNAを次にエチジウムブロマイドを除
去するために塩化セシウムを飽和したｎ−ブ
タノールを用いて数回抽出しそして水相を10
ｍＭ EDTA50ｍＭ TrisでPH８で少くと
も６時間透析する。続いて透析物に２倍半量
のエタノールを加えそして−18℃で４時間後
には析出したプラスミドDNAは15000ｇおよ
び４℃で20分間遠心分離することによりペレ
ツト化される。次に沈殿を78％エタノールで
１回洗いそして0.1ｍＭ EDTA、20ｍＭ
Tris中PH８および４℃で保存する。
ポリエチレングリコール沈澱後、20000ｇお
よび４℃で20分間遠心分離することにより集
めたプラスミドDNAを10ｍＭ EDTAおよ
び50ｍＭ Trisの溶液６ml中にPH８でとる。
生じた懸濁液量をピペツトで測定しそして懸
濁液１ml当り塩化セシウム１ｇを添加する。
続いてエチジウムブロマイド（10mg／ml）
200μを加えそしてこの懸濁液を超遠心器
中で80000ｇおよび15℃で60時間遠心分離す
る。密度の比較的濃い帯域を紫外光線により
可視的となし、注射針で側面から穿刺してと
り出しそして新たに10ｍＭ EDTA、50ｍ
Ｍ Trisからなる付加的にさらに塩化セシ
ウム５ｇを含有する溶液５mlをPH８で加え
る。超遠心器中における再遠心分離は続く帯
域の単離と同じ条件下に遂行される。集めら
れたDNAを次にエチジウムブロマイドを除
去するために塩化セシウムを飽和したｎ−ブ
タノールを用いて数回抽出しそして水相を10
ｍＭ EDTA50ｍＭ TrisでPH８で少くと
も６時間透析する。続いて透析物に２倍半量
のエタノールを加えそして−18℃で４時間後
には析出したプラスミドDNAは15000ｇおよ
び４℃で20分間遠心分離することによりペレ
ツト化される。次に沈殿を78％エタノールで
１回洗いそして0.1ｍＭ EDTA、20ｍＭ
Tris中PH８および４℃で保存する。
４ プラスミドDNAの特性化
電子顕微鏡による調査は標準的方法により遂
行された〔A.K.Kleinschmidt氏「Monolayer
Techniques in Electron Microscopy of
Nucleic Actd Molecules」S.P.Colowick氏等
編「Methods of Enzymology」第25巻第361
〜377頁（1968年）参照〕。それにより外形長さ
は4.1μｍと測定された。プラスミドの外形長さ
から分子量8.4メガダルトンが測定できた。プ
ラスミドpSVH1の特性化は種々の制限酵素を
用いて実施された。次に消化されたDNAを0.7
％水平アガロースゲル（２ｍＭ EDTA、40
ｍＭ酢酸ナトリウム、80ｍＭ Tris、PH8.3）
上で電圧勾配5V／cmで４時間電気泳動するこ
とにより分離した。さらに、同時に電気泳動に
かけられた既知寸法の標識フラグメントに基い
て電場での移動距離を比較することにより未知
フラグメントの分子量が測定されうる。６個の
制限酵素の切断点は環状のpSVH1分子上で正
確に相互に測定された（添付図面参照）。
行された〔A.K.Kleinschmidt氏「Monolayer
Techniques in Electron Microscopy of
Nucleic Actd Molecules」S.P.Colowick氏等
編「Methods of Enzymology」第25巻第361
〜377頁（1968年）参照〕。それにより外形長さ
は4.1μｍと測定された。プラスミドの外形長さ
から分子量8.4メガダルトンが測定できた。プ
ラスミドpSVH1の特性化は種々の制限酵素を
用いて実施された。次に消化されたDNAを0.7
％水平アガロースゲル（２ｍＭ EDTA、40
ｍＭ酢酸ナトリウム、80ｍＭ Tris、PH8.3）
上で電圧勾配5V／cmで４時間電気泳動するこ
とにより分離した。さらに、同時に電気泳動に
かけられた既知寸法の標識フラグメントに基い
て電場での移動距離を比較することにより未知
フラグメントの分子量が測定されうる。６個の
制限酵素の切断点は環状のpSVH1分子上で正
確に相互に測定された（添付図面参照）。
プラスミド上の唯１個のPst切断個所をこ
こで任意に０点として設定した。他の制限エン
ドヌクレアーゼとの処理により生ずるようなフ
ラグメント上の酵素例えばBamHの切断点
の位置は２回連続する消化により測定された。
酵素BamHを用いる制限後に１部分は直接
ゲル上に適用され、他の部分はPH８の100ｍＭ
Tris緩衝液を飽和したフエノールで２回抽
出し、そしてフエノールを除去するために水相
をエーテルで３回抽出した。続いてDNAを２
倍半量のエタノールで沈殿させそして消化緩衝
液中に懸濁して第２の酵素の作用にさらされ
る。二重に消化されたDNAは第２の酵素のみ
で処理されたプラスミド試料と共にここでゲル
上に適用される。この方法で第２の酵素が制限
個所を有するフラグメントが測定されうる。
こで任意に０点として設定した。他の制限エン
ドヌクレアーゼとの処理により生ずるようなフ
ラグメント上の酵素例えばBamHの切断点
の位置は２回連続する消化により測定された。
酵素BamHを用いる制限後に１部分は直接
ゲル上に適用され、他の部分はPH８の100ｍＭ
Tris緩衝液を飽和したフエノールで２回抽
出し、そしてフエノールを除去するために水相
をエーテルで３回抽出した。続いてDNAを２
倍半量のエタノールで沈殿させそして消化緩衝
液中に懸濁して第２の酵素の作用にさらされ
る。二重に消化されたDNAは第２の酵素のみ
で処理されたプラスミド試料と共にここでゲル
上に適用される。この方法で第２の酵素が制限
個所を有するフラグメントが測定されうる。
１細胞当り実質上20個以上のコピーを有する
pSVH1のコピー数は以下の方法で測定された。
細胞中において染色体およびプラスミドDNA
中に同程度にとりこまれる炭素−14標識付けら
れたチミジン分子が振盪培養においてストレプ
トマイセス・ベネズエラDSM40755の細胞中に
利用された。細胞の溶解、およびエチジウムブ
ロマイドの存在下での塩化セシウム密度勾配を
用いて染色体DNAを予め分離することなく粗
溶解質を分離した後、次に勾配を約50フラクシ
ヨンに分割しそして個々のフラクシヨンの放射
能を測定する。密度の高いプラスミド帯域と薄
い染色体帯域との活性度の比率からプラスミド
の分子量の知識および染色体の推定分子量の知
識により１細胞当りのプラスミドのコピー数が
計算されうる〔R.Radloff氏等「Proc.Nat.
Acad.Sci.U.S.」第57巻第1514〜1520頁（1967
年）参照〕。
pSVH1のコピー数は以下の方法で測定された。
細胞中において染色体およびプラスミドDNA
中に同程度にとりこまれる炭素−14標識付けら
れたチミジン分子が振盪培養においてストレプ
トマイセス・ベネズエラDSM40755の細胞中に
利用された。細胞の溶解、およびエチジウムブ
ロマイドの存在下での塩化セシウム密度勾配を
用いて染色体DNAを予め分離することなく粗
溶解質を分離した後、次に勾配を約50フラクシ
ヨンに分割しそして個々のフラクシヨンの放射
能を測定する。密度の高いプラスミド帯域と薄
い染色体帯域との活性度の比率からプラスミド
の分子量の知識および染色体の推定分子量の知
識により１細胞当りのプラスミドのコピー数が
計算されうる〔R.Radloff氏等「Proc.Nat.
Acad.Sci.U.S.」第57巻第1514〜1520頁（1967
年）参照〕。
５ プラスミドpSVH1を用いるストレプトマイ
セテスの形質転換 Hopwood氏等によつて開発された形質転換
システムが用いられた「Nature」第274巻第
398〜400頁（1978年）参照〕。プロトプラスト
は前記１のようにしてストレプトマイセス・コ
エリコロール（Streptomyces coelicolor）を
用いて調製しそして遠心分離（6000ｇ、４℃、
５分間）しそしてプロトプラスト培地（スクロ
ーツ25％、K2SO4、1.5ｍＭ、Mgcl210ｍＭ、
KH2PO40.36ｍＭ、Cacl225ｍＭ、NaCl25ｍ
Ｍ、Tris25ｍＭ、PH7.2）中にとる。
セテスの形質転換 Hopwood氏等によつて開発された形質転換
システムが用いられた「Nature」第274巻第
398〜400頁（1978年）参照〕。プロトプラスト
は前記１のようにしてストレプトマイセス・コ
エリコロール（Streptomyces coelicolor）を
用いて調製しそして遠心分離（6000ｇ、４℃、
５分間）しそしてプロトプラスト培地（スクロ
ーツ25％、K2SO4、1.5ｍＭ、Mgcl210ｍＭ、
KH2PO40.36ｍＭ、Cacl225ｍＭ、NaCl25ｍ
Ｍ、Tris25ｍＭ、PH7.2）中にとる。
４℃で30分間培養後、プロトプラストを新た
にペレツトとなしそしてこのペレツトを注意深
くピペツトで吸い出しそしてピペツトから排出
することにより新鮮なプロトプラスト培地１ml
中に懸濁させる。続いてプラスミドpSVH1を
加えそしてこの懸濁液に30％ポリエチレングリ
コール1000を３mlの量で加え、混合しそしてさ
らに４分間０℃で培養する。次にプロトプラス
ト培地８mlを加えそして得られた懸濁液をもう
一度遠心分離する。ペレツトを変性された再生
培地（スクロース25％、グルコース30％、
K2SO41.5ｍＭ、MgCl210ｍＭ、カザミノ酸0.1
％、酵母抽出物0.5％、KH2PO40.36ｍＭ、
CaCl220ｍＭ、Ｌ−プロリン0.3ｍＭ、NaCl25
ｍＭ、Tris25ｍＭ、PH7.2）で被覆しそして振
盪している水浴中37℃で２時間培養する。生じ
た細胞懸濁液を個々のコロニーを単離するため
に適当な選択的培地を含有する寒天板上に塗布
しそして形質転換物は前記３(a)の迅速溶解法を
用いて分析しそしてしてその中に含有されるプ
ラスミドDNAを制限酵素を用いて特性化する。
にペレツトとなしそしてこのペレツトを注意深
くピペツトで吸い出しそしてピペツトから排出
することにより新鮮なプロトプラスト培地１ml
中に懸濁させる。続いてプラスミドpSVH1を
加えそしてこの懸濁液に30％ポリエチレングリ
コール1000を３mlの量で加え、混合しそしてさ
らに４分間０℃で培養する。次にプロトプラス
ト培地８mlを加えそして得られた懸濁液をもう
一度遠心分離する。ペレツトを変性された再生
培地（スクロース25％、グルコース30％、
K2SO41.5ｍＭ、MgCl210ｍＭ、カザミノ酸0.1
％、酵母抽出物0.5％、KH2PO40.36ｍＭ、
CaCl220ｍＭ、Ｌ−プロリン0.3ｍＭ、NaCl25
ｍＭ、Tris25ｍＭ、PH7.2）で被覆しそして振
盪している水浴中37℃で２時間培養する。生じ
た細胞懸濁液を個々のコロニーを単離するため
に適当な選択的培地を含有する寒天板上に塗布
しそして形質転換物は前記３(a)の迅速溶解法を
用いて分析しそしてしてその中に含有されるプ
ラスミドDNAを制限酵素を用いて特性化する。
６ 外来DNAのプラスミドpSVH1中におけるク
ローニング プラスミドpSVH1を制限酵素を用いて開環
させる。同時に、プラスミド中に組み込まれる
予定の染色体DNAを、同じ末端すなわち相互
に連結しうる末端を有する切断点が生ずるよう
に切断する。３分間70℃に加熱した後両方の調
製物を混合し、フエノールで抽出しそして前記
４のようにしてエタノールで沈殿させる。続い
てDNAをリガーゼ緩衝液中にとり、T4−
DNA−リガーゼを加えそして16℃で１時間そ
して次第に４℃まで冷却しつつ一夜培養する。
かくして連結されたプラスミドを次に前記５の
ようにして適当なストレプトマイセテス中に導
入する。
ローニング プラスミドpSVH1を制限酵素を用いて開環
させる。同時に、プラスミド中に組み込まれる
予定の染色体DNAを、同じ末端すなわち相互
に連結しうる末端を有する切断点が生ずるよう
に切断する。３分間70℃に加熱した後両方の調
製物を混合し、フエノールで抽出しそして前記
４のようにしてエタノールで沈殿させる。続い
てDNAをリガーゼ緩衝液中にとり、T4−
DNA−リガーゼを加えそして16℃で１時間そ
して次第に４℃まで冷却しつつ一夜培養する。
かくして連結されたプラスミドを次に前記５の
ようにして適当なストレプトマイセテス中に導
入する。
添付図面は本発明のプラスミドpSVH1の構造
および制限酵素切断点を示す模式図である。
および制限酵素切断点を示す模式図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ストレプトマイセス・ベネズエラ
（Streptomyces venezuelae）DSM 40755の培養
物から得られ、分子量8.4メガダルトン、外形長
さ4.1μｍおよび分子寸法12.6キロ塩基対合（kb）
を有し、制限エンドヌクレアーゼEcoRI、Hind
、HpaおよびXbaによつては全く切断され
ず、PstおよびBclによつて１個所だけ切断
され、Xhoによつて長さ7.6kbおよび4.9kbを有
する２個のフラグメントに切断され、Claによ
つて長さ11.8kbおよび0.8kbを有する２個のフラ
グメントに切断され、Bglによつて長さ7.5、
2.8および2.4kbを有する３個のフラグメントに切
断されそしてBam Ｈによつて長さ7.7、2.0、
1.8および1.2kbを有する４個のフラグメントに切
断されることを特徴とするプラスミドpSVH1。 ２ プラスミドpSVH1を解裂したものと、外来
DNAとを結合してベクターを形成し、該ベクタ
ーをストレプトマイセテス（Streptomycetes）
属に属する細菌中に導入することからなるストレ
プトマイセテス属に属する細菌を形質転換する方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19813128669 DE3128669A1 (de) | 1981-07-20 | 1981-07-20 | "plasmid p svh 1 und seine verwendung" |
| DE3128669.0 | 1981-07-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5824594A JPS5824594A (ja) | 1983-02-14 |
| JPH0363357B2 true JPH0363357B2 (ja) | 1991-09-30 |
Family
ID=6137332
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57124553A Granted JPS5824594A (ja) | 1981-07-20 | 1982-07-19 | 新規なプラスミド |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4673642A (ja) |
| EP (1) | EP0070522B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5824594A (ja) |
| AT (1) | ATE23190T1 (ja) |
| AU (1) | AU550419B2 (ja) |
| CA (1) | CA1187824A (ja) |
| DE (2) | DE3128669A1 (ja) |
| DK (1) | DK160999C (ja) |
| ES (1) | ES513947A0 (ja) |
| IL (1) | IL66344A (ja) |
| NO (1) | NO822490L (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL68349A0 (en) * | 1982-04-16 | 1983-07-31 | Lilly Co Eli | Chimeric cloning vectors for use in streptomyces and e.coli |
| CA1203185A (en) * | 1982-06-03 | 1986-04-15 | Thomas G. Eckhardt | Cloned streptomycete gene |
| US4703009A (en) * | 1983-03-08 | 1987-10-27 | Merck & Co., Inc. | RDNA cloning vector pVE1, deletion and hybrid mutants and recombinant derivatives thereof products and processes |
| EP0118367B1 (en) * | 1983-03-08 | 1989-04-26 | Merck & Co. Inc. | Recombinant dna cloning vector pve1, deletion and hybrid mutants, and recombinant derivatives thereof, products and processes |
| DE3412093A1 (de) * | 1984-03-31 | 1985-10-10 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Hybridplasmide mit einem streptomyceten- und einem escherichia coli-replicon |
| AU594161B2 (en) * | 1986-06-24 | 1990-03-01 | Enterovax Limited | Non-antibiotic marker system |
| WO1988010119A1 (en) * | 1987-06-22 | 1988-12-29 | Genetics Institute, Inc. | Novel thrombolytic proteins |
| CA2378944A1 (en) * | 1999-07-23 | 2001-02-01 | Genentech, Inc. | Method for rnase- and organic solvent-free plasmid dna purification using tangential flow filtration |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0006692A1 (en) * | 1978-06-01 | 1980-01-09 | National Research Development Corporation | Streptomyces plasmids and microorganisms containing them, their use as vectors for nucleic acid and a process for the incorporation of nucleic acids into cellular systems |
| US4273875A (en) * | 1979-03-05 | 1981-06-16 | The Upjohn Company | Plasmid and process of isolating same |
| US4343906A (en) * | 1979-08-21 | 1982-08-10 | The Upjohn Company | Hybrid plasmid of pBR322 and Streptomyces plasmid and E. coli containing same |
| US4340674A (en) * | 1980-05-05 | 1982-07-20 | The Upjohn Company | Cointegrate plasmids and their construction from plasmids of Escherichia and Streptomyces |
| US4332900A (en) * | 1980-10-01 | 1982-06-01 | The Upjohn Company | Construction of co-integrate plasmids from plasmids of Streptomyces and Escherichia |
| US4401761A (en) * | 1981-01-26 | 1983-08-30 | The Upjohn Company | Process for stabilizing plasmids by deletion of DNA |
| EP0058002A3 (en) * | 1981-01-26 | 1983-06-29 | The Upjohn Company | Process for stabilising potential plasmid vectors and novel plasmids |
-
1981
- 1981-07-20 DE DE19813128669 patent/DE3128669A1/de not_active Withdrawn
-
1982
- 1982-07-14 ES ES513947A patent/ES513947A0/es active Granted
- 1982-07-15 AT AT82106361T patent/ATE23190T1/de active
- 1982-07-15 DE DE8282106361T patent/DE3273995D1/de not_active Expired
- 1982-07-15 EP EP82106361A patent/EP0070522B1/de not_active Expired
- 1982-07-16 CA CA000407435A patent/CA1187824A/en not_active Expired
- 1982-07-19 AU AU86173/82A patent/AU550419B2/en not_active Ceased
- 1982-07-19 NO NO822490A patent/NO822490L/no unknown
- 1982-07-19 DK DK324082A patent/DK160999C/da active
- 1982-07-19 IL IL66344A patent/IL66344A/xx unknown
- 1982-07-19 JP JP57124553A patent/JPS5824594A/ja active Granted
-
1984
- 1984-08-20 US US06/642,742 patent/US4673642A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1187824A (en) | 1985-05-28 |
| ES8306176A1 (es) | 1983-05-16 |
| ATE23190T1 (de) | 1986-11-15 |
| JPS5824594A (ja) | 1983-02-14 |
| DK160999C (da) | 1991-11-18 |
| DK160999B (da) | 1991-05-13 |
| IL66344A (en) | 1985-08-30 |
| EP0070522B1 (de) | 1986-10-29 |
| AU550419B2 (en) | 1986-03-20 |
| US4673642A (en) | 1987-06-16 |
| IL66344A0 (en) | 1982-11-30 |
| NO822490L (no) | 1983-01-21 |
| DE3128669A1 (de) | 1983-02-03 |
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| EP0070522A3 (en) | 1983-06-22 |
| DK324082A (da) | 1983-01-21 |
| DE3273995D1 (en) | 1986-12-04 |
| AU8617382A (en) | 1983-01-27 |
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