JPS59166087A - プラスミド - Google Patents
プラスミドInfo
- Publication number
- JPS59166087A JPS59166087A JP58038454A JP3845483A JPS59166087A JP S59166087 A JPS59166087 A JP S59166087A JP 58038454 A JP58038454 A JP 58038454A JP 3845483 A JP3845483 A JP 3845483A JP S59166087 A JPS59166087 A JP S59166087A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- dna
- solution
- restriction enzyme
- strain
- Prior art date
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- Granted
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規なプラスミドに関するものである。
近年、ベクターとして使用可能と思われるプラスミド（
プラスミドＤＮＡ ）の種々のものが知られるようにな
ったが、広い用途に充分に対応するため更に多くの有用
かつ安全なプラスミドの開発が期待されている。
プラスミドＤＮＡ ）の種々のものが知られるようにな
ったが、広い用途に充分に対応するため更に多くの有用
かつ安全なプラスミドの開発が期待されている。
本発明者は、病原性に問題のないコリネバクテリウムφ
キセロシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｒ
ｏｓｉｓ ）に由来するプラスミドが枯草菌（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ５ｕｂ−ｔ：１−１ｊ−ｓ ） に安定に
存在し、制限酵素による切断点があり、かつ薬剤耐性を
有していることを利用して本発明を完成した。
キセロシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｒ
ｏｓｉｓ ）に由来するプラスミドが枯草菌（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ５ｕｂ−ｔ：１−１ｊ−ｓ ） に安定に
存在し、制限酵素による切断点があり、かつ薬剤耐性を
有していることを利用して本発明を完成した。
すなわち、コリネバクテリウム・キセロシスからプラス
ミド（ｐＴｐｔｏ）を分離し、これで枯草菌を形質転換
後再びプラスミド（ｐＴＰｌｌ）を分離し、これを制限
酵素ＸｂａＩで切断後ライゲーションすることにより分
子量が約１．７メガダルトン（Ｍｃｌ）であるプラスミ
ド（ｐＴＰ１２）が得られ、また、プラスミドｐＴＰ１
１とプラスミドｐＮ８１を制限酵素）（ｉｎｄ ■で切
断した後ライゲイジョンすることにより分子量が約４１
．３ＭｄであるプラスミドｐＴＰ１１θ１およびｐＴＰ
１１０２が得られる。
ミド（ｐＴｐｔｏ）を分離し、これで枯草菌を形質転換
後再びプラスミド（ｐＴＰｌｌ）を分離し、これを制限
酵素ＸｂａＩで切断後ライゲーションすることにより分
子量が約１．７メガダルトン（Ｍｃｌ）であるプラスミ
ド（ｐＴＰ１２）が得られ、また、プラスミドｐＴＰ１
１とプラスミドｐＮ８１を制限酵素）（ｉｎｄ ■で切
断した後ライゲイジョンすることにより分子量が約４１
．３ＭｄであるプラスミドｐＴＰ１１θ１およびｐＴＰ
１１０２が得られる。
これらの工程における処理手段は公知の一般的方法を使
用することができ９例えば次のような方法が用いられる
。
用することができ９例えば次のような方法が用いられる
。
コリネバクテリウムの培養と溶菌は５ｈｉｌｌｅｒらの
方法（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、 Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈａ
ｍｏｔｈｅｒ、 １８８１４〜８２１（１９８０）ｌに
準じて行ない、アルカリ変性法によるＤＮＡの抽出はＨ
ａｎｓｅｎ 及（Ｊ０１ｓａｎの方法（Ｊ、 Ｂ２Ｌｃ
ｔｅｒｉｏ１．１８５−２２７〜２３８（：ｚＨ８））
に従って行なえばよい。
方法（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、 Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈａ
ｍｏｔｈｅｒ、 １８８１４〜８２１（１９８０）ｌに
準じて行ない、アルカリ変性法によるＤＮＡの抽出はＨ
ａｎｓｅｎ 及（Ｊ０１ｓａｎの方法（Ｊ、 Ｂ２Ｌｃ
ｔｅｒｉｏ１．１８５−２２７〜２３８（：ｚＨ８））
に従って行なえばよい。
枯草菌の形質転換はｃｈａｎｇ及びｃｏｈｅｎのプロト
プラスト法（Ｍ、ｏｌｅｃ、 ｇｅｎ、 Ｇｅｎｏｔ、
’ １（３８−１１１〜１ｔ５（１９７９））に準じ
て行なえばよい。
プラスト法（Ｍ、ｏｌｅｃ、 ｇｅｎ、 Ｇｅｎｏｔ、
’ １（３８−１１１〜１ｔ５（１９７９））に準じ
て行なえばよい。
プラスミドの分離にはアガロースゲルＱ気泳動法や活度
勾配遠心法のような一般的な方法を用いることがでもま
た。プラスミドＤ Ｎ Ａの制限酵素による切断と、Ｄ
Ｎ４鎧の連結酵素（リガーゼ）による結合（ライゲイジ
ョン）も常法Ｇ目よって行なうことができる。
勾配遠心法のような一般的な方法を用いることがでもま
た。プラスミドＤ Ｎ Ａの制限酵素による切断と、Ｄ
Ｎ４鎧の連結酵素（リガーゼ）による結合（ライゲイジ
ョン）も常法Ｇ目よって行なうことができる。
次に１本発明のプラスミドの製Ｍ法を実験例により詳述
するが、使用したコリネバクテリウム・キセ四シスＭ８
２Ｂ株は９本発明者が分離した菌株であり２分子量が３
０．４±２．７ＭｃｌのＲプラスミドを保有しており、
このＲプラスミド上にエリスロマイシン、カナマイシン
、クロラムフェニコール、デトラサイクリン耐性遺伝子
を持っている。また、染色体上にもストレプトマイシン
耐性遺伝子を有している。
するが、使用したコリネバクテリウム・キセ四シスＭ８
２Ｂ株は９本発明者が分離した菌株であり２分子量が３
０．４±２．７ＭｃｌのＲプラスミドを保有しており、
このＲプラスミド上にエリスロマイシン、カナマイシン
、クロラムフェニコール、デトラサイクリン耐性遺伝子
を持っている。また、染色体上にもストレプトマイシン
耐性遺伝子を有している。
例１ ： Ｍ８２Ｂ株からのプラスミドＤＮＡの分離
すなわち、トリプトソイブイヨン培地（トリプトン１７
り、ソイペプトン３り、ブドウ糖２．５り、リン酸−水
素カリウム２．５ｇ−、塩化ナトリウム５９．蒸留水１
１． ｐＨ７，３）にょる１４８２８株の一夜培養液
を新鮮同培地に１／１００量接種し、３７°Ｃで約８時
間振盪培養した後。
り、ソイペプトン３り、ブドウ糖２．５り、リン酸−水
素カリウム２．５ｇ−、塩化ナトリウム５９．蒸留水１
１． ｐＨ７，３）にょる１４８２８株の一夜培養液
を新鮮同培地に１／１００量接種し、３７°Ｃで約８時
間振盪培養した後。
ペニシリンＧを最終濃度５１１９／記となるように加え
、さらに２時間振盪培養した。この培養液を冷却遠心に
より集め、ペレットをＴＥバッフｙ（１０ｍＭ）リスア
ミノメタン、０．５ｍ’ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）で２
回洗浄後、 Ｔ Ｅ ／Ｎ ｙファＩｒ（１ｍかした０
、５Ｍシュークロースに懸濁シた。この懸濁液にリゾチ
ーム（ジグマンを最終濃度１０１１１；ｌ／−となるよ
うに加え３７°Ｃで２時間インキュベートした。この溶
液に１０％５ＤＳ（ドデシル硫酸す） ＩＪウム）溶液
を最終濃度１％になるように加え、５５°Ｃで３ｏ分間
静置した。次に新たに調整した３Ｎ水酸化ナトリウム溶
液を加えてｐＨ１２，１〜１２．３とし軽く混和後、２
Ｍトリス溶液（ｐＨ７，０）を水酸化ナトリウム溶液の
２倍量加えた。さらに５と塩化ナトリウム溶液を最終濃
度１’Ｍとなるように加えた後４°ｃ−６−夜放置した
。その後１０，０００ｒｐｍ、ＩＱ分の冷却遠心により
上清を分取し。
、さらに２時間振盪培養した。この培養液を冷却遠心に
より集め、ペレットをＴＥバッフｙ（１０ｍＭ）リスア
ミノメタン、０．５ｍ’ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）で２
回洗浄後、 Ｔ Ｅ ／Ｎ ｙファＩｒ（１ｍかした０
、５Ｍシュークロースに懸濁シた。この懸濁液にリゾチ
ーム（ジグマンを最終濃度１０１１１；ｌ／−となるよ
うに加え３７°Ｃで２時間インキュベートした。この溶
液に１０％５ＤＳ（ドデシル硫酸す） ＩＪウム）溶液
を最終濃度１％になるように加え、５５°Ｃで３ｏ分間
静置した。次に新たに調整した３Ｎ水酸化ナトリウム溶
液を加えてｐＨ１２，１〜１２．３とし軽く混和後、２
Ｍトリス溶液（ｐＨ７，０）を水酸化ナトリウム溶液の
２倍量加えた。さらに５と塩化ナトリウム溶液を最終濃
度１’Ｍとなるように加えた後４°ｃ−６−夜放置した
。その後１０，０００ｒｐｍ、ＩＱ分の冷却遠心により
上清を分取し。
ＴＥバッファで飽和した等量の再蒸留フェノールを加え
よく混和した。１０．００Ｏｒｐｍ２０分の冷却遠心に
より、水層を分院させた後、水・層を分取し、−２０°
Ｃのエタノールを８倍量加えて、−２０℃で一夜放置し
た。１０，０００ｒｐｍ８０分間の冷却遠心によりペレ
ットを集め、ＴＥパンファーに溶解し、ＤＮＡ溶液とし
た。
よく混和した。１０．００Ｏｒｐｍ２０分の冷却遠心に
より、水層を分院させた後、水・層を分取し、−２０°
Ｃのエタノールを８倍量加えて、−２０℃で一夜放置し
た。１０，０００ｒｐｍ８０分間の冷却遠心によりペレ
ットを集め、ＴＥパンファーに溶解し、ＤＮＡ溶液とし
た。
例２ ： Ｍ８２Ｂ株より抽出されたプラスミドｐ’ｒ
ｐｉｏ ＤＮＡによる枯草菌の形質転換 すなわち、枯草菌１６８ Ｌ ）ｔｔ Ａ Ｈ７６１２
２２（１ｅｕ−、ｍｅｔ−、ａｄｅ 、 ｈｉｒ−）株
のバクト−ベンアッセイブロス（デイフィフ：バクトー
ビーフイクストラクト１．５り、バタトーイーストイク
ストラクト１．５９．バタトペブトン５ｇ、バクトーデ
ャストロース１９．塩化ナトリウム３．５り、リン酸二
カリウム８．６８ｇ、 リン酸−カリウムｌｌ３２り
、蒸留水１ ｌ、 ｐＨ７，０±０．１）による−夜培
養液を新しい同培地に１／ １００量接種し８７°Ｃで
θＤ０．４（６ＱＱｙｂｍ）まで振盪培養した。菌体を
遠心により集菌し、ＳＭＭＰバッファー（０，５Ｍシュ
ークロース、０．０２Ｍマレイン酸二ナトリウム、１）
ｌ塩化マグネジようにリゾチームを加えた。８７°Ｃ約
１時間の培養の後８．ＯＯＯｒｐｍｌＥｉ分の遠心によ
り集菌し、Ｓｌｉ（ＭＰバッファーで一度洗浄後、菌体
を６艷のＳＭＭＰバッファーに懸濁し、プロトプラスト
溶液とした。
ｐｉｏ ＤＮＡによる枯草菌の形質転換 すなわち、枯草菌１６８ Ｌ ）ｔｔ Ａ Ｈ７６１２
２２（１ｅｕ−、ｍｅｔ−、ａｄｅ 、 ｈｉｒ−）株
のバクト−ベンアッセイブロス（デイフィフ：バクトー
ビーフイクストラクト１．５り、バタトーイーストイク
ストラクト１．５９．バタトペブトン５ｇ、バクトーデ
ャストロース１９．塩化ナトリウム３．５り、リン酸二
カリウム８．６８ｇ、 リン酸−カリウムｌｌ３２り
、蒸留水１ ｌ、 ｐＨ７，０±０．１）による−夜培
養液を新しい同培地に１／ １００量接種し８７°Ｃで
θＤ０．４（６ＱＱｙｂｍ）まで振盪培養した。菌体を
遠心により集菌し、ＳＭＭＰバッファー（０，５Ｍシュ
ークロース、０．０２Ｍマレイン酸二ナトリウム、１）
ｌ塩化マグネジようにリゾチームを加えた。８７°Ｃ約
１時間の培養の後８．ＯＯＯｒｐｍｌＥｉ分の遠心によ
り集菌し、Ｓｌｉ（ＭＰバッファーで一度洗浄後、菌体
を６艷のＳＭＭＰバッファーに懸濁し、プロトプラスト
溶液とした。
例１で得たＤＮＡ溶液５０μｌ（約ＤＮＡ０．５Ｋ）に
同量の２ＸＳＭＭバッファー（１Ｍシュークロース、０
．０４Ｍマレイン酸二ナトリウム。
同量の２ＸＳＭＭバッファー（１Ｍシュークロース、０
．０４Ｍマレイン酸二ナトリウム。
２Ｍ塩化マグネシウム）を加えた後、上述のプロトプラ
スト溶液１ｆｎｔを加えた。ざらに４０％ポリエチレン
グリコール６０００溶液３−を加えて、Ｏ℃２分間静置
後５−のＳＭＭＰバッファーを加え８，０００ｒｐｍｌ
Ｏ分間の遠心により集菌した。集めたプロトプラストベ
レットを１ｍのＳ Ｍ Ｍ Ｐバクファーに懸濁し３０
°Ｃ１，５時間培養後、その０．１−をクロラムフェニ
コール２５厚／−含有のＤＭ−３再生培地（リン酸二カ
リウム８．ｉ５９． リン酸−カリウム１．５ｊ７゜
カズアミノ酸５り、塩化マグネシウム４．０６９゜コハ
ク酸すトリウム１３５９．イーストイクストラクト５）
、グルコース５り、寒天８り、牛血清アルブミン０．０
５り、蒸留水１１！、ｐＨ７，３）に塗抹し、３７°Ｃ
で２〜３日間培養することにより形質転換株を得た。
スト溶液１ｆｎｔを加えた。ざらに４０％ポリエチレン
グリコール６０００溶液３−を加えて、Ｏ℃２分間静置
後５−のＳＭＭＰバッファーを加え８，０００ｒｐｍｌ
Ｏ分間の遠心により集菌した。集めたプロトプラストベ
レットを１ｍのＳ Ｍ Ｍ Ｐバクファーに懸濁し３０
°Ｃ１，５時間培養後、その０．１−をクロラムフェニ
コール２５厚／−含有のＤＭ−３再生培地（リン酸二カ
リウム８．ｉ５９． リン酸−カリウム１．５ｊ７゜
カズアミノ酸５り、塩化マグネシウム４．０６９゜コハ
ク酸すトリウム１３５９．イーストイクストラクト５）
、グルコース５り、寒天８り、牛血清アルブミン０．０
５り、蒸留水１１！、ｐＨ７，３）に塗抹し、３７°Ｃ
で２〜３日間培養することにより形質転換株を得た。
例３：形質転換株からのプラスミドＤＮＡの分離
得られたクロラムフェニコール耐性の形質転換株ヲプレ
インハ〜トインフユージョン（ＢＨＩ）培地ＩＯ−に接
種し、−夜装置培養した。
インハ〜トインフユージョン（ＢＨＩ）培地ＩＯ−に接
種し、−夜装置培養した。
この培養液をＣＹ培地（リン酸二カリウム０．７％、リ
ン酸−カリウム０．８％、硫酸アンモニウム０゜１％、
クエン酸ナトリウム０．０５％、ディフコカザミノ酸０
．２％、ディフコ酵母抽出物０．１％、硫酸マグネシウ
ム０．０２５％、ブドウ糖０．５％、 ｐＨ，７，０
） １０ｍｌに吸光度０．１（６０１ｍｌになるように
加えた。３７８Ｃで振盪培養し、吸光度０．３（６θＱ
ｒｂｍ ）の時にデオキシアデノシンを最終濃度２５
０μｇ／−になるように加えた。３分後トリチウムチミ
ジンを最終濃度１０〆１／ゼになるように加えた。
ン酸−カリウム０．８％、硫酸アンモニウム０゜１％、
クエン酸ナトリウム０．０５％、ディフコカザミノ酸０
．２％、ディフコ酵母抽出物０．１％、硫酸マグネシウ
ム０．０２５％、ブドウ糖０．５％、 ｐＨ，７，０
） １０ｍｌに吸光度０．１（６０１ｍｌになるように
加えた。３７８Ｃで振盪培養し、吸光度０．３（６θＱ
ｒｂｍ ）の時にデオキシアデノシンを最終濃度２５
０μｇ／−になるように加えた。３分後トリチウムチミ
ジンを最終濃度１０〆１／ゼになるように加えた。
吸光度０．８ （６００ｎｍ力で氷にて発育を停止し、
１０，０００Ｘりで１５分間４℃に於てブロスから菌体
を分難し、上澄を菌体ベレットから傾斜テ除いた。ベレ
ットをＴＢＳ緩衝液（０，０５Ｍ塩化ナトリウム、Ｏ，
Ｏ’０５Ｍ ＫＤＴＡ含有トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８，０’ ） ）によって再懸濁した。次に、０．５Ｍ
ＥＤＴＡ液０．２ｆｎｔ、１０ｍ９ ／ ｉ ｉ度
のリゾチーム液０．１−を加え、混合物を１０分間３７
°Ｃで培養した。ブリジー５８を最終濃度０．５％とな
るように加え、８７°Ｃ１１０分間培養した。次にＮ−
ラウロイルサルコシンナトリウムを最終濃度２．５％に
なるように加え、５０°Ｃ１３０分間培養し溶菌を行っ
た。
１０，０００Ｘりで１５分間４℃に於てブロスから菌体
を分難し、上澄を菌体ベレットから傾斜テ除いた。ベレ
ットをＴＢＳ緩衝液（０，０５Ｍ塩化ナトリウム、Ｏ，
Ｏ’０５Ｍ ＫＤＴＡ含有トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８，０’ ） ）によって再懸濁した。次に、０．５Ｍ
ＥＤＴＡ液０．２ｆｎｔ、１０ｍ９ ／ ｉ ｉ度
のリゾチーム液０．１−を加え、混合物を１０分間３７
°Ｃで培養した。ブリジー５８を最終濃度０．５％とな
るように加え、８７°Ｃ１１０分間培養した。次にＮ−
ラウロイルサルコシンナトリウムを最終濃度２．５％に
なるように加え、５０°Ｃ１３０分間培養し溶菌を行っ
た。
溶菌液をピペットにて粘性をとり、軟化させたのち、塩
化セシウム、臭化エチジウムと混合し密度１．５５３の
溶液とした。この溶液を１２６．０００Ｘ９で平衡まで
（約４０時間）遠心した。
化セシウム、臭化エチジウムと混合し密度１．５５３の
溶液とした。この溶液を１２６．０００Ｘ９で平衡まで
（約４０時間）遠心した。
遠心管下部末端より、溶液を分画分取し、各分画ごとに
１０μノをワットマンろ紙ＧＦ／Ａに吸着さぜ、このろ
紙に吸着されたトリチウムの放射活性を液体シンチレー
ションカウンター（パラカード８３００ ）にて測定し
、ｃｐｍにて表わす。染色体ＤＮＡに由来する高活性を
示す分画の大きなピークとプラスミドＤＮＡに由来する
小さなピークの２つを与える。この小さなピークを示し
た分画をとり、？？、−オクタツールで２回処理するこ
とにより、臭化エチジウムを抽出除去した。次に水層を
５ＳＯ（０，１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエ
シクエン酸ナトリウム）Ｈ７，０）の１０倍希釈液に対
して透析してプラスミドを分離した。分離したプラスミ
ドＤ Ｎ Ａの分子量を電子顕微鏡により測定したと玄 こる４、 ７ Ｍ（１であった。本プラスミドｐＴＰ１
１とする。また本プラスミドを所有する菌株をＬＭＡＨ
（ｐ’ｒＰ１１ ）株と名付けた。本プラスミドのコピ
ー数は約２０であった。
１０μノをワットマンろ紙ＧＦ／Ａに吸着さぜ、このろ
紙に吸着されたトリチウムの放射活性を液体シンチレー
ションカウンター（パラカード８３００ ）にて測定し
、ｃｐｍにて表わす。染色体ＤＮＡに由来する高活性を
示す分画の大きなピークとプラスミドＤＮＡに由来する
小さなピークの２つを与える。この小さなピークを示し
た分画をとり、？？、−オクタツールで２回処理するこ
とにより、臭化エチジウムを抽出除去した。次に水層を
５ＳＯ（０，１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエ
シクエン酸ナトリウム）Ｈ７，０）の１０倍希釈液に対
して透析してプラスミドを分離した。分離したプラスミ
ドＤ Ｎ Ａの分子量を電子顕微鏡により測定したと玄 こる４、 ７ Ｍ（１であった。本プラスミドｐＴＰ１
１とする。また本プラスミドを所有する菌株をＬＭＡＨ
（ｐ’ｒＰ１１ ）株と名付けた。本プラスミドのコピ
ー数は約２０であった。
例４ニブラスミドｐＴＰ１１の枯草菌ＲＭ１２５株への
再形質転換 ＬＭＡＨ（ｐＴＰｌｌ）株よりプラスミドＤＮＡを下記
の方法により調整した。
再形質転換 ＬＭＡＨ（ｐＴＰｌｌ）株よりプラスミドＤＮＡを下記
の方法により調整した。
枯草ｉＬＭＡＨ（ｐＴｌ、１ ）株をディフィコ・ラボ
ラトリーズ製プレインハートインフュージョン（ＢＨＩ
）培地１００−に接種する。この培地の組成は次に示す
。
ラトリーズ製プレインハートインフュージョン（ＢＨＩ
）培地１００−に接種する。この培地の組成は次に示す
。
カーフプレイン インフュージョン ２０．０％ビー
フハート インフュージョン ２５．０％プロテオー
ス ペプトン １．０％バクトーデキスト
ロース ０．２％塩化ナトリウム
０．５％リン酸ニナトリウム
０．２５％蒸留水
１００ Ｑｍ／！ｐＨが７．４±０．２であるこ
とを確認する。
フハート インフュージョン ２５．０％プロテオー
ス ペプトン １．０％バクトーデキスト
ロース ０．２％塩化ナトリウム
０．５％リン酸ニナトリウム
０．２５％蒸留水
１００ Ｑｍ／！ｐＨが７．４±０．２であるこ
とを確認する。
培地を５００−坂ロフラスコ中で予め滅菌する。
接種後フラスコを３７°Ｃ９約１８〜２４峙間振盪培養
する。
する。
この細胞懸濁液を１％の率で同培地の２０本のフラスコ
に接種するのに使用する。３７°Ｃで１８〜２４；時間
振盪培養後、１０，０ＯＯＸりで約１５分間４°Ｃに於
てブロスがら分離し、上澄を菌体ペレットから傾斜で除
く。上澄を捨てペレットをＴＥＳ緩衝液によって２回洗
浄後。
に接種するのに使用する。３７°Ｃで１８〜２４；時間
振盪培養後、１０，０ＯＯＸりで約１５分間４°Ｃに於
てブロスがら分離し、上澄を菌体ペレットから傾斜で除
く。上澄を捨てペレットをＴＥＳ緩衝液によって２回洗
浄後。
１００ｄの２５％蔗糖含有ＴＥＳ緩価液に再懸濁する。
次に０．５Ｍ−ＥＤＴＡ溶液４０づ。
１０ｍ９／−濃度のリゾチーム溶液２０ｎ！７！を加え
混合物を３０分間３７°Ｃで培養する。次に５０ｒｒｕ
ｉ／−濃度のプリジー５Ｂ ２０Ｊを加え、混合物を
８７°Ｃ２１０分間培養する１、さらに２５０■／４［
（７）Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム２０−を加
え、５０°Ｃで１０〜８０分間培養する（細胞破壊）。
混合物を３０分間３７°Ｃで培養する。次に５０ｒｒｕ
ｉ／−濃度のプリジー５Ｂ ２０Ｊを加え、混合物を
８７°Ｃ２１０分間培養する１、さらに２５０■／４［
（７）Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム２０−を加
え、５０°Ｃで１０〜８０分間培養する（細胞破壊）。
溶解物を２６，０００×２，３０分間冷却遠心後、上澄
に５Ｍ濃度の塩化す） ＩＪウム溶液５０−を加え一夜
放置後。
に５Ｍ濃度の塩化す） ＩＪウム溶液５０−を加え一夜
放置後。
ポリエチレングリコール６０００を最終濃度１０％とな
るように加え、さらに−夜４°Ｃにて放置した。この混
合物をＮｏ、０ＯＯＸり、１５分間遠心し、ベレットを
Ｔ４Ｓ緩衝液に溶解した。この溶液を塩化セシウム、臭
化エチジウムと混合し、密度１．５５８の溶液を与える
。この溶液を１２６，０ＯＯＸりで平衡まで（約４０時
間）遠心する。・紫外線照射下で（３６５ルｍ）線状染
色体及びプラスミドＤＮＡは強い螢光を発するバンドと
して遠心機チューブの中に見られる。このプラスミドＤ
ＮＡを密度勾配から取り出し、ルーオクタツールで２回
抽出することにより臭化エチジウムを除き２次に水層を
１０倍希釈ＳＳａ緩衝液（Ｑ、１５Ｍ塩化ナトリウム。
るように加え、さらに−夜４°Ｃにて放置した。この混
合物をＮｏ、０ＯＯＸり、１５分間遠心し、ベレットを
Ｔ４Ｓ緩衝液に溶解した。この溶液を塩化セシウム、臭
化エチジウムと混合し、密度１．５５８の溶液を与える
。この溶液を１２６，０ＯＯＸりで平衡まで（約４０時
間）遠心する。・紫外線照射下で（３６５ルｍ）線状染
色体及びプラスミドＤＮＡは強い螢光を発するバンドと
して遠心機チューブの中に見られる。このプラスミドＤ
ＮＡを密度勾配から取り出し、ルーオクタツールで２回
抽出することにより臭化エチジウムを除き２次に水層を
１０倍希釈ＳＳａ緩衝液（Ｑ、１５Ｍ塩化ナトリウム。
０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、 ｐＨ７，０）に
対して透析してｐＴＰｌｌを得た。得られたｐＴＰｌｌ
、ＤＮＡを前述のプロトプラスト法により枯草菌の制限
欠損−修飾欠損株であるＲ Ｍ２Ｂ５株へ形質転換した
。得られたクロラムフェニコール耐性コロニーのひとつ
を使い、チミジンラベル法によりプラスミドの検出を行
ったところｐＴＰｌｌと全く同じ分子量のプラスミドを
検出することが出来た。本実験よりプラスミドｐＴＰ１
１上にはクロラムフェニコール耐性遺伝子が存在してい
ることが’５’Ａ 認された。
対して透析してｐＴＰｌｌを得た。得られたｐＴＰｌｌ
、ＤＮＡを前述のプロトプラスト法により枯草菌の制限
欠損−修飾欠損株であるＲ Ｍ２Ｂ５株へ形質転換した
。得られたクロラムフェニコール耐性コロニーのひとつ
を使い、チミジンラベル法によりプラスミドの検出を行
ったところｐＴＰｌｌと全く同じ分子量のプラスミドを
検出することが出来た。本実験よりプラスミドｐＴＰ１
１上にはクロラムフェニコール耐性遺伝子が存在してい
ることが’５’Ａ 認された。
例５ニブラスミドｐＴＰ１１の制限酵素解裂地図の作成
制限酵素によるプラスミドＤＮＡの消化は次の条件によ
り行った。また、２種の制限酵素を組み合わせて反応さ
せる場合は、−万の酵素反応をフェノールで停止させ、
さらにフェノールをエーテル抽出した後に２倍量のエタ
ノールを加え、析出したＤＮＡを遠心によって集めＴＥ
バッフ了−に溶解した後２次の酵素反応を行った。
り行った。また、２種の制限酵素を組み合わせて反応さ
せる場合は、−万の酵素反応をフェノールで停止させ、
さらにフェノールをエーテル抽出した後に２倍量のエタ
ノールを加え、析出したＤＮＡを遠心によって集めＴＥ
バッフ了−に溶解した後２次の酵素反応を行った。
ＥｃｏＲＩ １． ＯｍＭ ）リスー塩ｐｅａ液（ｐ
Ｈ７，２）。
Ｈ７，２）。
５ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭメル
カプトエタノール＋ ５ｏ”Ｍ塩化ナトリウム、８７
°Ｃ Ｈｐａｌ［２０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）
。
°Ｃ Ｈｐａｌ［２０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）
。
７ ｍ Ｍ塩化マグネシウム、ｌｆｆ１Ｍジチオスレイ
トール（ＤＴＴ）、３７°Ｃ Ｘｂａ Ｉ ６ ｍ Ｍ ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，４）。
トール（ＤＴＴ）、３７°Ｃ Ｘｂａ Ｉ ６ ｍ Ｍ ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，４）。
１００ｍＭ塩化ナトリウム、６ｆｆ１Ｍ塩化マグネシウ
ム、３７°Ｃ ＢｃｌＩ １２ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７−４
）＋１２ｍＭ塩化マグネシウム、 １１ｆｆＬＭ’ｈ
化＋ ） Ｑ ウＡ 、 ０８５ｍＭ ＤＴＴ。
ム、３７°Ｃ ＢｃｌＩ １２ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７−４
）＋１２ｍＭ塩化マグネシウム、 １１ｆｆＬＭ’ｈ
化＋ ） Ｑ ウＡ 、 ０８５ｍＭ ＤＴＴ。
５０°Ｃ
Ｈｉｒ＋ｃｔｌ ２０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，４）。
７，４）。
７ ｍ Ｍ塩化マグネシウム、６０ｍＭ塩化ナトリウム
、８７°Ｃ 消化混合物はシャープ等によってつくられた１％アガロ
ースゲル中で分析した（ Ｊ、 ５ｈａｒｐ ｅｔａｌ
、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、 ≦１２． ３０５
５〜８０６３ （１９７８） ン。
、８７°Ｃ 消化混合物はシャープ等によってつくられた１％アガロ
ースゲル中で分析した（ Ｊ、 ５ｈａｒｐ ｅｔａｌ
、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、 ≦１２． ３０５
５〜８０６３ （１９７８） ン。
ＥｑｏＲＩ消化λＤ消化全ＤＮＡ対照として使用した（
Ｔｈｏｍａｓら、 Ｊ、 Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、、
９１ ３１５〜８２８（１，９７５））。
Ｔｈｏｍａｓら、 Ｊ、 Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、、
９１ ３１５〜８２８（１，９７５））。
ｐＴＰｌｌの制限酵素開裂点の数および開裂断片の分子
量を表に示し、開裂地図は図１に示した。
量を表に示し、開裂地図は図１に示した。
例６：ブラスミドｐＴＰ１］からのＤＮＡ断片欠損プラ
スミドの分離 プラスミドｐＴＰ１１ ＤＮＡを前述の条件でｘｂａ
ＩまたはＨｉｎｄ ］［で切断後Ｔ４ＤＮＡリガーゼに
よりライゲイジョン反応を行った。反応条件は６６ｔｌ
Ｍ−）リス塩酸緩衝液（ｐＨ６，５’Ｌ６゜６ｍＭ塩化
マグネシウム、１０７１１Ｍジチオスレイトールｔ Ｏ
−４１” Ｍ’ ＡＴｐ存在下で１５°Ｃ２０ＦＲｊｎ
ｊ１行った。反発後前述のプロトプラスト法により枯草
菌ＲＭ１２５株へ形質転換を行った。ｗラレｔ、ニーク
ロラムフェニコール耐性コロニーについて調べたところ
、 Ｘｂａｌ −Ｔ４１Ｊガーゼの組み合せから得られ
たコロニーからは１．７Ｍｔ１のプラスミドｐＴＰ１２
が得られた。また。
スミドの分離 プラスミドｐＴＰ１１ ＤＮＡを前述の条件でｘｂａ
ＩまたはＨｉｎｄ ］［で切断後Ｔ４ＤＮＡリガーゼに
よりライゲイジョン反応を行った。反応条件は６６ｔｌ
Ｍ−）リス塩酸緩衝液（ｐＨ６，５’Ｌ６゜６ｍＭ塩化
マグネシウム、１０７１１Ｍジチオスレイトールｔ Ｏ
−４１” Ｍ’ ＡＴｐ存在下で１５°Ｃ２０ＦＲｊｎ
ｊ１行った。反発後前述のプロトプラスト法により枯草
菌ＲＭ１２５株へ形質転換を行った。ｗラレｔ、ニーク
ロラムフェニコール耐性コロニーについて調べたところ
、 Ｘｂａｌ −Ｔ４１Ｊガーゼの組み合せから得られ
たコロニーからは１．７Ｍｔ１のプラスミドｐＴＰ１２
が得られた。また。
Ｈｉｎｄｌｌｌ −Ｔ ４リガーゼの組み合せからは２
．８ＭｃｌのｐＴＰｌ：３が得られた。
．８ＭｃｌのｐＴＰｌ：３が得られた。
例７：ブラスミドｐＴＰ１２．ｐ’ｒｐｉａの制限酵素
解裂地図の作成並びに分子量、コピー数の測定 プラスミドｐＴＰ１２および１８に関し３Ｈ−チミヂン
ラベル法によりコピー数を測定するとともにＤＮＡをと
り正“確に分子量の測定を電子顕微鏡により行った。ま
た、制限酵素解裂地図は前述と全く同じ方法で行った。
解裂地図の作成並びに分子量、コピー数の測定 プラスミドｐＴＰ１２および１８に関し３Ｈ−チミヂン
ラベル法によりコピー数を測定するとともにＤＮＡをと
り正“確に分子量の測定を電子顕微鏡により行った。ま
た、制限酵素解裂地図は前述と全く同じ方法で行った。
その結果、プラスミドｐＴＰ１２は分子量が１．７Ｍｄ
と小さく、Ｈｐａｌに対し２つの解裂点をもっていたが
。
と小さく、Ｈｐａｌに対し２つの解裂点をもっていたが
。
Ｘｂａｌに関する解裂点はなくなっていた。本プラスミ
ドはコピー数が約２００と多く７本プラスミドを所有し
ている枯草菌を液体培養すると培地中からクロラムフェ
ニコール アセチルトランスフェラーゼの活性が認めら
れた。ｐＴＰｌ８はｐＴＰｌｌのＨｉｎｄＬＩ［の大き
な断片（２，８Ｍｃｌ ）が環状化したものであること
がわかった。本プラスミドのコピー数は約７０であった
。
ドはコピー数が約２００と多く７本プラスミドを所有し
ている枯草菌を液体培養すると培地中からクロラムフェ
ニコール アセチルトランスフェラーゼの活性が認めら
れた。ｐＴＰｌ８はｐＴＰｌｌのＨｉｎｄＬＩ［の大き
な断片（２，８Ｍｃｌ ）が環状化したものであること
がわかった。本プラスミドのコピー数は約７０であった
。
ｐＴＰｌ２とｐＴＰｌ３の制限酵素解裂黒地図を図２及
び図３に示す。
び図３に示す。
例８ニブラスミドｐＴＰ５からＤＮＡ欠損プラスミドｐ
Ｎ３１の分離 ｐＮｓｌの分離に関してはＧｅｎｅ ２１ ： １０５
〜１．１２（１９８３）に報告されている。すなわち枯
草菌プラスミドｐ Ｔ Ｐ ５ Ｄ Ｎ ’Ａ （Ｍ、
Ｋｏｎ。
Ｎ３１の分離 ｐＮｓｌの分離に関してはＧｅｎｅ ２１ ： １０５
〜１．１２（１９８３）に報告されている。すなわち枯
草菌プラスミドｐ Ｔ Ｐ ５ Ｄ Ｎ ’Ａ （Ｍ、
Ｋｏｎ。
ｅｔ ２ＬＩ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ
５ ： ５５〜５ ！Ｊ （１９７８）］を枯草菌１６
８ＬＭＡ、Ｈ７６１２２２（ｐＴＰ５）より例４に記載
された方法により抽出した。このｐＴＰ５ＤＮＡ２／ｌ
を２０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ，７，−１，） 、
７ ｍ ｈｒ塩化マグネシウム。
５ ： ５５〜５ ！Ｊ （１９７８）］を枯草菌１６
８ＬＭＡ、Ｈ７６１２２２（ｐＴＰ５）より例４に記載
された方法により抽出した。このｐＴＰ５ＤＮＡ２／ｌ
を２０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ，７，−１，） 、
７ ｍ ｈｒ塩化マグネシウム。
６０ ｍ ｒ、Ｉ塩化ナト１ノウム、 Ｈｉｎｃｌｌｌ
ｌ １０単位含有溶液中で３７°Ｃ，１時間の反応に
より切断する。反応をフェノールを加えることにより停
止させ、エーテル抽出によりフェノールを除去後２倍世
のエタノールを加え、ＤＮＡを沈殿させた。
ｌ １０単位含有溶液中で３７°Ｃ，１時間の反応に
より切断する。反応をフェノールを加えることにより停
止させ、エーテル抽出によりフェノールを除去後２倍世
のエタノールを加え、ＤＮＡを沈殿させた。
沈殿したＤ Ｎ Ａペレットを６６１１１１Ａ Ｉ・リ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７゜６）、６，６ｍＭ塩化マグネシ
ウム、ＩＱｍｕジチオスレイトール＋ ４ ｒｎＭアデ
ノシン三リシリン酸溶液１０１ｔｌに溶Ｍ後、Ｔ４ＤＮ
’Ａリガーゼ０．０１単位を加え］６°Ｃ，１−６時間
の反応によってＤ Ｎ Ａを連結させた。フェノールに
より反応を停止させ、エーテル抽出により、フェノール
を除去後、２倍量のエタノールを加えＤＮＡを沈殿させ
た。沈殿したＤＮＡを滅菌蒸留水５０μｌ に溶解し、
形質転換用ＤＮＡ試料として用いた。
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７゜６）、６，６ｍＭ塩化マグネシ
ウム、ＩＱｍｕジチオスレイトール＋ ４ ｒｎＭアデ
ノシン三リシリン酸溶液１０１ｔｌに溶Ｍ後、Ｔ４ＤＮ
’Ａリガーゼ０．０１単位を加え］６°Ｃ，１−６時間
の反応によってＤ Ｎ Ａを連結させた。フェノールに
より反応を停止させ、エーテル抽出により、フェノール
を除去後、２倍量のエタノールを加えＤＮＡを沈殿させ
た。沈殿したＤＮＡを滅菌蒸留水５０μｌ に溶解し、
形質転換用ＤＮＡ試料として用いた。
形質転換は例２に記載したプロトプラスト法により行っ
た。受容菌には枯草菌ＧＳＹ９０８株を用いた。得られ
たＴｃ耐性コロニーを溶菌用緩衝液（リゾチーム２μり
／ｍｌ、 ＲＮａ、ｓｅ Ｏ，１ｍ９／ｌｎｌ＋２５％
シュークロースをＴＥバッファーに溶ＪＷ ）４０μノ
に懸濁し８７°Ｃ，２時間反応させた。この溶液に５％
ＳＤＳ溶液Ｎｏμｌを加え、完全に溶菌後、フェノール
５０ｐｌを加え１０，０００ｒｐｍ１０分間の遠心後、
水層を分取し１こ。
た。受容菌には枯草菌ＧＳＹ９０８株を用いた。得られ
たＴｃ耐性コロニーを溶菌用緩衝液（リゾチーム２μり
／ｍｌ、 ＲＮａ、ｓｅ Ｏ，１ｍ９／ｌｎｌ＋２５％
シュークロースをＴＥバッファーに溶ＪＷ ）４０μノ
に懸濁し８７°Ｃ，２時間反応させた。この溶液に５％
ＳＤＳ溶液Ｎｏμｌを加え、完全に溶菌後、フェノール
５０ｐｌを加え１０，０００ｒｐｍ１０分間の遠心後、
水層を分取し１こ。
この水層についてアガロースゲル電気泳動法により２プ
ラスミドＤＮＡの確認を行い２分子量が最も小さいプラ
スミドＤＮＡを持っているいくつかの形質転換株につい
てさらに詳しく調べた。すなわち、各形質転換株より前
述の方法により、プラスミドＤＮＡを調整し、やはり前
述の方法によりＨ工ｎｄｌ 切断を行い、アガロース
ケル電気泳動を行った結果、プラスミドｐＴＰ５のＨｉ
ｎｄ ｍ −Ｃ断片（，０，８５Ｍｄ ）の欠損したプ
ラスミドｐＮ３１の存在が確認された。
ラスミドＤＮＡの確認を行い２分子量が最も小さいプラ
スミドＤＮＡを持っているいくつかの形質転換株につい
てさらに詳しく調べた。すなわち、各形質転換株より前
述の方法により、プラスミドＤＮＡを調整し、やはり前
述の方法によりＨ工ｎｄｌ 切断を行い、アガロース
ケル電気泳動を行った結果、プラスミドｐＴＰ５のＨｉ
ｎｄ ｍ −Ｃ断片（，０，８５Ｍｄ ）の欠損したプ
ラスミドｐＮ３１の存在が確認された。
このプラスミドｐＮｓＩＤＮＡを抽出し、枯草菌ＲＭ１
２５株にプロトプラスト法により形質転換し、プラスミ
ドルＮ３１上にＴｃ耐性遺伝子が存在していることを確
認した。以後の実験には枯草菌ＲＭＩ ２５ （ｐＮｓ
ｌ ）株を用いた。
２５株にプロトプラスト法により形質転換し、プラスミ
ドルＮ３１上にＴｃ耐性遺伝子が存在していることを確
認した。以後の実験には枯草菌ＲＭＩ ２５ （ｐＮｓ
ｌ ）株を用いた。
り
ｐＮｓｌの制限酵素開裂地図を図葛に示す。
例９ニブラスミドｐＴＰ１１０１とｐＴｐＨ０２の分離
と方向性の確認 枯草菌ＲＭ１２５ （ｐＮｓｌ ）株よりプラスミドＩ
）ＮＳＩＤＮＡを前述の方法により抽出し。
と方向性の確認 枯草菌ＲＭ１２５ （ｐＮｓｌ ）株よりプラスミドＩ
）ＮＳＩＤＮＡを前述の方法により抽出し。
プラスミドｐＴＰ１１ＤＮＡと混合後、前述の方法（倒
立）に従いＨｉｎｄ Ｍで切断後、Ｔ４１Ｊガーゼによ
り結合させ、プロトプラスト法によりＲＭ１２５株へ形
質転換した。
立）に従いＨｉｎｄ Ｍで切断後、Ｔ４１Ｊガーゼによ
り結合させ、プロトプラスト法によりＲＭ１２５株へ形
質転換した。
得られたクロラムフェニコール、テトラサイクリン両耐
性を持つコロニーについてプラスミドＤ Ｎ Ａの検索
を行った。得られたコロニーを（例文）のごとく溶菌さ
せアガロースケル電気泳動を行い、プラスミドＤＮＡの
分子凰が最も小さいもの数株を選択した。これらの形質
転換株よりプラスミドＤＮＡを調整し、 ＥｃｏＲＩ。
性を持つコロニーについてプラスミドＤ Ｎ Ａの検索
を行った。得られたコロニーを（例文）のごとく溶菌さ
せアガロースケル電気泳動を行い、プラスミドＤＮＡの
分子凰が最も小さいもの数株を選択した。これらの形質
転換株よりプラスミドＤＮＡを調整し、 ＥｃｏＲＩ。
Ｈｉｎｄ ＩＩ［、Ｋｐｎ Ｉに関する制限酵素開裂地
図を作成した。制限酵素開裂地図の作成にはＥｃ％Ｉ。
図を作成した。制限酵素開裂地図の作成にはＥｃ％Ｉ。
Ｈｉｎｄ Ｈの他にＫｐｎＩ を使用した。Ｋｐｎｌ
の反応条件は６ ｍ Ｍ ）リスー塩酸緩街液（ｐＨ７
，５）。
の反応条件は６ ｍ Ｍ ）リスー塩酸緩街液（ｐＨ７
，５）。
６ ｍ Ｍ塩化ナトリウム、６ｍＭ塩化マグネシウム、
６ｍＭ２−メルカプトエタ７−ル、３７℃である。
６ｍＭ２−メルカプトエタ７−ル、３７℃である。
この結果、ｐＮｓ１由来のＨｉｎｄ ｌ［−Ａ断片（１
，５Ｍｄ）がｐＴＰ１１由来の２．８ＭｄＯ）断片と正
方向及び逆方向に結合した２種類のプラスミドｐＴＰ１
１０１とｐＴＰ１１０２をそれぞれ持つ２種の形質転換
株が存在することが確認された。
，５Ｍｄ）がｐＴＰ１１由来の２．８ＭｄＯ）断片と正
方向及び逆方向に結合した２種類のプラスミドｐＴＰ１
１０１とｐＴＰ１１０２をそれぞれ持つ２種の形質転換
株が存在することが確認された。
数はおのおの約１００コピーであった。
以上の例で用いた微生物は工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託されており９次の番号を有している。
究所に寄託されており９次の番号を有している。
コリネバクテリウム・キセロシスＭ８２ＢＦＥＢＭ
Ｐ−６９７１ 枯草菌１６８ＬＭＡＨ７６１２２２ ＦＥＲＭ Ｐ−６９７２ 枯草菌ＲＭ１２５ ＦＥＲＭ Ｐ−６９７３枯
草菌１６８ＬＭＡＨ７６１２２２（ｐＴＰ５）ＦＥＢＭ
Ｐ−６９７４
Ｐ−６９７１ 枯草菌１６８ＬＭＡＨ７６１２２２ ＦＥＲＭ Ｐ−６９７２ 枯草菌ＲＭ１２５ ＦＥＲＭ Ｐ−６９７３枯
草菌１６８ＬＭＡＨ７６１２２２（ｐＴＰ５）ＦＥＢＭ
Ｐ−６９７４
り
図１乃至図葵は、プラスミドの制限酵素開裂地図である
。 ８詠、ＪＮｉｉ １−１ｉ％ｄ［ 日６
。 ８詠、ＪＮｉｉ １−１ｉ％ｄ［ 日６
Claims (1)
- 分子量が約１．７メガダルトンであり、制限酵素開裂地
図が図２に示した通りであるプラスミドｐＴＰ１２
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58038454A JPS59166087A (ja) | 1983-03-09 | 1983-03-09 | プラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58038454A JPS59166087A (ja) | 1983-03-09 | 1983-03-09 | プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59166087A true JPS59166087A (ja) | 1984-09-19 |
| JPH0139753B2 JPH0139753B2 (ja) | 1989-08-23 |
Family
ID=12525716
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58038454A Granted JPS59166087A (ja) | 1983-03-09 | 1983-03-09 | プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59166087A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0375889A2 (de) * | 1988-12-09 | 1990-07-04 | Degussa Aktiengesellschaft | Verfahren zur ortsspezifischen Mutagenese von DNA und Entwicklung von Plasmidvektoren |
-
1983
- 1983-03-09 JP JP58038454A patent/JPS59166087A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0375889A2 (de) * | 1988-12-09 | 1990-07-04 | Degussa Aktiengesellschaft | Verfahren zur ortsspezifischen Mutagenese von DNA und Entwicklung von Plasmidvektoren |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0139753B2 (ja) | 1989-08-23 |
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