JPS58135820A - 放射化モノクロン抗体及びそれを有効成分とする造影剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は腫瘍の検出法に関するものである。また本発明
は放射性核種でラベルしたモノクロン抗体に関するもの
である。

腫瘍？位置を特異的に検出するための信頼できる方法が
長年に亘り探求されてきた。たとえば、血液中を循環す
る、ひとの癌に関係がある癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を検
出する方法が発表されている。米国特許第３．４　Ａ　
３．６　ｇ　’Ｉ号及び第３．６９’ｌｌ、３ｇ号径照
。これらの方法を使用しても腫瘍の位置は決定できない
ことは明らかである。最近、ヨウ素の放射性同位元素で
ラベルした抗体を用いて、腫瘍関連抗原性物質を検出す
る方法が提案されている。すなわち、米国特許第３．９
２２／　９３号には、１２５１と１３１夏でラベルした
ＣＥＡに対する抗体を用いる方法が開示されている。こ
の特許によれば、ひと印環細胞癌を導入した雄シリアハ
ムスターを用いて行った実験において、ラベルしたやぎ
の抗ＣＥ＾を注入し、次いでハムスターの器官を検査し
たところ、ラジオアイソトーゾが腫瘍に局在しているこ
とがわかった。したがって、抗体の非経口溶液を生体内
投与し、次いで患者をホトスキャンすることにより、ひ
との腫瘍部位を決定することができることが掃案された
。

放射性ヨウ素化した抗体を実際に使用したが、初期の研
究がもたらしたような期待に沿うものではなかった。た
とえば、ゴールデンバーグらは７９７ｇ年に、放射性ヨ
ウ素化抗ＣＥＡを用いてひとをスキャンし、ある程度の
成功をおさめたと報告している［、　Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、
Ｍｅｄ、、　２９　ｇ　ｐ　／　３　ｇ　’１−／３ｇ
ｇ（／９７Ａ））。しかし、残留バックグラウンド放射
能のために、この成功は、差引法を使用することにより
制限されたものであった。

マツハらは、成功とはいえないが、投与量のわずか０．
７％が腫瘍に局在していることを測定したと報告してい
る［Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、ｅ　　３０３　ｅ　！；
　−／θ（７９ｇｏ）〕。しかし、いくつかの場合に、
腫瘍の造影は可能であった。

従来の腫瘍造影法に使用されている抗体を得るための異
質組織抗血清の親和性純化（ａｆｆｉｎｉｔｙｐｕｒ目
１ｃａｔｉｏｎ）は、高親和性抗体の損失をもたらすこ
とおよび、得られる抗体は、異なる抗原決定基に対し特
異的な抗体の混合物であり、大部分が伺親和性の抗体と
、非特異的な反応をする抗体とから構成されていること
はよ（知られている。一方、モノクロン抗体は、抗原の
所定の部位に高親和性を示し、恢い非特異性結合を示す
ように選ぶことができる。しかし、驚りべきことに本発
明者らは、周知の方法により放射性ヨウ素でラベルした
腫瘍抗原に対するモノクロン抗体がなお、免疫反応性を
生体外で明らかに示すことができるという事実にもかか
わらず、ｌ１ｉＦ瘍部位にあまり局在していないという
ことを発見した。これはおそらく、ラベルした抗体によ
り放射性ヨウ素が失われたことによるものであろう。し
たがって、生体内で、腫瘍の部位を正確に検出する信頼
性の高い方法に対する必要性が依然として存在している
。

本発明によれば、腫瘍抗原に対するモノクロン抗体ある
いはモノクロン抗体フラグメントは、直接に金属放射性
核種によりラベルされるか、あるいは、キレート結合し
た放射性核種たとえば、ＤＴＰＡ結合したＮ１．ｎを用
いて、キレート化剤を抗体に結合し、次いでキレート化
剤と放射性核種との間でコンデレックスを形成すること
によりラベルされる。このようにラベルした抗体または
そのフラグメントを、腫瘍をもつ宿主に注入すると、速
かにかつ高度の特異性をもって腫瘍そのものに集中する
。成る場合には、離れた転移部の局在化が起こり、さら
に、腫瘍の広がりを示すことがある。腫瘍部位はホトス
キャンにより検出可能である。ラベルしたモノクロン抗
体の混合物も使用することができる。

したがって本発明の目的は、金属放射性核種でラベルし
た腫瘍関連抗原に対するモノクロン抗体　　−を得るこ
とである。

本発明の仲の目的は、感染宿主の腫瘍を造影する改良さ
れた方法を提供することである。

これらの目的ならびに関連する目的が達成きれることは
、添付図面ならびに以下の詳細な説明から明らかになろ
う。

上記のとおり本発明によれば、腫瘍関連抗原に対するモ
ノクロン抗体またはそのフラグメントは、金属放射性核
種で直接に、あるいはキレート結合した放射性核種によ
りラベルされる。本発明に有用なモノクロン抗体は、周
知のハイプリドーマ法の生成物である。たとえば、ミル
スタインとコーラ−の論文を参照されたい［Ｎａｔｕｒ
ｅ、　　２　！；乙。

ダ９．！１−１１９７ｃ／９７３）〕。基本的にはこの
方法は、マウスあるいはその他の適当な動物に、免疫原
、この場合にはＣＥＡのような腫瘍関連抗原を注入する
ものである。次（・で免疫したマウスを解剖し、その牌
腋から取った細胞を骨髄腫細胞と融合してハイプリドー
マ（これは生体外で再生産できる）と呼ばれるハイブリ
ッド細胞を得る。

抗体産生細胞集団を選択的に培養し、スクリーンにかけ
て個々のクロンを単離する。個々のクロンはそれぞれが
、抗原分子表面上の特定領域（“決定基″）に対して特
異的な単一の抗体種を分泌する。

個々のクロンな更にスクリーンにかけて、抗体に対する
最高の親和性をもぢ、低（・非特異的結合を示す抗体を
産生するようなりロンを決定する。

放射性ラベル用に（一般に腹水から単離される）選択さ
れた抗体を金属放射性核種と反応させるか、あるいは適
当なキレート化剤と結合させ、次にこのキレート化剤に
放射性核種を結合させる。キレート化剤は、各種の方法
を用いて抗体に結合させることができる。一般に、抗体
はポリベゾチドであるため、残基導入用として知られて
いる反応基をもつキレート化剤を使用することができる
。適切な反応基としては次のようなものがある。

式中、Ｃｈ　　はキレート化剤の残基である。

−切なキレート化剤としては、各種の多照配位子（ｐｏ
％ｙｄ＠ｎｔｓｔ・）キレート化剤があ勤、このキレー
ト化剤の配位子が金属放射性核種とコンプレックスを形
成する。このようなキレート化剤としては次式のＩす′
ア之ノカルがンーを挙げることかで式中、ｘｎ□ｔたけ
整数（Ｘ＝Ｏｆ九はＸ　ｍ　／が好ましい）、ｙ＝／ｌ
たはコ（ｙｘ／が好ましい）、Ｚ　Ｗ、　／〜りの整数
（！諺／または７が好ましい）、ＲＦｉ水素、または前
記キレート化剤と抗体とを結合している基、または放射
縞核穐のキレート化剤の結合定数に影−を与える基であ
る。有用なＲ基として基である）があげられる、九とえ
は、＾は−ＮＨ２のりアゾ化により得られるーＮｔでも
よ（、−ＮＨ２は−Ｎ０２０還元により得られ、→０２
　　はフェニル核のニトロ化により得られる。＾Ｉｄ　
−ＮＨ２を公知の方法よい。

Ｌは結合の際に置換脱離する基であり、たとえば、α、
Ｓｒ、ｌのようなハロゲンである（　Ｓｒ　　が好まし
い）。

また、Ｒは−ＣＨ３または−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４０ＣＨ２Ｃ
Ｏ２ＨＴもよい。

ポリアミノカルボン酸の場合には、結合はたとえば、酷
熱水物中間体の形成によりカルビン酸基自身を通して完
成される。にｒｅｊｃａｒｅｋおよびＴｕｃｋｅｒ、Ｂ
ｉｏｃｈｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ
　ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｒｎｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、
　　７７　、５ｇノ（／９り７）参照。

ポリアミノカルボン酸としては、ポリアミノ酢酸が好ま
しい、使用可能な具体的なポリアミノカルボン酸として
は、エチレンソアミノ四節ａ（ＥＤＴＡ）およびその誘
導体、たとえばノエチレントリアミノ五酢酸（ＤＴＰＡ
）、ｐ−ブロモアセトアミドフェニル（エチレンノニト
リロ［Ｆ）酸および／−（ｐ−アミノフェニル）−エチ
レンノアミノ四酢酸があり、最後の化合物はノアゾニウ
ム塩に変換されて結合する。これらのキレート化剤のう
ち、ＤＴＰＡが好ましい。

その他の適切なキレート化剤としては次式で表わされる
よう、な４リアミノ（アルキレンリン）ｌｉｔがある。

雪 ０Ｈ（２）　　　　　　　　。

１ Ｈ 式中ｓ　Ｘ＆　１％２およびＲＦｉ前記のとお勤である
。

好ましくは、翼はＯまたは／、ｙ項／％ｚ！／である１
本発明に使用するＩリアミノＣメチレンリン）ｄ（ｙｚ
−／　）の具体例としては、エチレンシアミノテトラ（
メチレンリン）酸、ヘキサメチレンジアセンテトラ（メ
チレンリン）蟻、ジエチレントリアミンペンタ（メチレ
ンリン）酸があけられる。

さらにキレート化剤として、次式のポリアミンがある。

式中、翼、２およびＲは前記のとおりである。

他のキレート化剤としては、次式のものがある。

０Ｈ（４）　　　　　　’″ 式中Ｒは前記のとおりである。ただしＲが結合を可能に
する基でない場合には、フェノール基のＩルフイリンも
特に有用なキレート化剤である。

本発明に有用なポルフィリンは、合成または天然に存在
する一ルフイリンンであり次式で表わされる。

式中、Ｒは前記のとおりであり、Ｒ１は水嵩、または天
然に存在するＩシフ４９２分子の一部として存在するｆ
換基、１１九は合成により導入された基、たとえば結合
を可能にし、あるいはＩルフイリンの結合定数に影響を
与えるような基である。

好ましいＩルフイリンは、テトラフェニルポルフィリン
（Ｒ−フェニル、Ｒ１−Ｈ）またはテトラピリジルイル
フィリン（Ｒ−ダービリノル、Ｒ１−Ｈ）りである）ま
たは抗体との結合を可能とするようなその他の基である
。置換基は一般に、フェニル基に対してはパラ位、ピリ
ジル基に対しては２−位またはｑ−位である。

本発明に使用されるその他のキレート化剤は、クラウン
エーテルとそのクリグタンド類縁体であり、次式で表わ
される。

式中、ＲｄｆＮ記のとおりである。また、結合を可能と
するのに使用される基は、次式で表わされるように１ク
ラウンエーテルｉ九はクリプタンド博造中に直接に才ま
れてぃてもよい。

式中、＾は繭ｍｌのとお９である・ デスフヱリオ中サミンＢの誘導体もキレート化剤として
使用できる。これらは次式で表わされる。

（８） 式中％Ｒは前記のとおりである。

エンテロバクチン誘導体もキレート化剤として有用であ
る０次式のものが好ましい。

Ｈ Ｏ 式中、＾は前ｄ己のとおりである。

エンテロバクチンのカルがン＃ｉ傾縁体も好適である。

それらの中には次式の化合物がある。

ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ−−ＣＨ２ 聞 （１１ 式中、＾は前記のとおりである。

中レージ化剤として有用なその他のカルーン酸化合物と
しては次式の化合物およびこれに対応するアニリドがあ
けられる。

ａυ 式中、＾は前記のとおりである・ 金属放射性核種を結合する能力を実質的に損うことがな
いような置換基によって、エンテリノ噌りチン中カルが
サイクリック頑縁体を示す壌がさらに置換されていても
よいこと、またこのような置＊ｉが抗体への結合部位を
提供するという目的で導入されていてもよいこと１、画
業＃に明らかなところである。

さらＫもう１つの有用なキレーシ化剤は次式の（１１） （＾は前記Ｏとか礎でｈ為）〒ある。

金属放射性核１’ｌｌＣよる抗体の直接標識（ラベル）
化は、抗体自体のサイト（部位）に金属イオンを付着さ
せて抗体に金属イオンを導入するという公知の方法を利
用して実施することができる。いくつかの場合において
は、該金属放射性核種は、通常溶液中にある抗体を適当
な酸化状態にある放射性核種に曝露することにより抗体
に暇人れることができる。例えば、現在のところ好まし
いとされている方法においては、抗体を１０３８．＋３
で直接金属化することを含み、該金属化は抗体と適当な
ルテニウム塩、例えば三塩化ルテニウムとを緩衝溶液中
で接触させることからなる。使用することのできる緩衝
剤と−しては酢酸カリウム、重炭酸ナトリウムおよびト
リヒドロキシエチルアミン（Ｔｒｉｓ）　　がある。

適切なもう一つの方法としては、抗体のクロムによる直
接金属化がある。クロム放射性核種は溶液中で放射性核
種のクロム酸塩、例えばクロム酸ナトリウムもしくはカ
リウムと抗体とを混合することにより導入することがで
きる。

他の情況の下では、抗体をまず放射性核種を受入れるよ
うに４ヒ学的に変性させ、次いで該核種と反応させるこ
とができる。例えば、抗体内のジスルフィド基を還元し
て、−５−Ｍまたは−５−Ｍ−５基（ただし、Ｍは放射
性核種である）を形成することが回前である。例身ば、
ジスルフィド基をジチオスライドールによって還元して
、まずチオール基を形成することができ、該チオール基
は適当な金庫イオン、例えば酸化物もしくは塩型の水銀
、鋼、亜鉛、鉛またはカドミウムのイオンと反応を生じ
得るものである。

本発明において使用することのできる放射性核種は多座
配位型キレート化剤と錯体を形成するもの、もしくは適
当な条件下で抗体と直接結合するものである。放射性核
種は、安全に投秦できかつ安全に人体内に導入し得る半
減期並びに他の放射特性を有するものとして選ばれる。

多数の放射性核種が人体内で使用するために研究されて
きており、これらは本発明において有用であろう。これ
らは以下のように分類することができる。

ポルフィリン（式Ｓ）、クラウンエーテル（式乙）およ
びクリプタンド（式７）キレート化剤が＋−酸化状態を
とる放射性核種の結合に対して最モ有用テアル。例エバ
、１９５ｍｐｔ、ｓ　’Ｎｆ、５７ＣＯ，＋０５Ａ、１
６７Ｃｕ　　および５２Ｍｎ　　はその＋２酸化状態に
おいて安定な錯体を形成する。

式／〜Ｓおよび９〜／２のキレート化剤は＋３酸化状態
をとる放射性核種と安定な錯体を形成する。＋３酸化状
態において安定な錯体を形成する放射性核種の中には以
下のようなものがある。即ち、５２Ｆｅ、　　Ｎ１．ｎ
１＋４５ｍ、、　、　９９ｍｙｃ、　６８Ｇａ１６７Ｇ
ａ、　　＋　６９ｖｂ　、　　５７ｃ０．１６７Ｔｍ１
１６６丁□、１４６Ｇｄ１１５７Ｄｙ１９５ｍＮｂ、　
　＋０３ＲＬｌ、　　９７Ｒｕ１９９Ｒｈ、　　ＩＱｉ
ｍＲｈ。

および２０　＋　７１である。カテコール基を有するキ
レート化剤（式９〜／、２）は生体内において高い移動
性を有する放射性核種と共に使用するのに特に適してお
り、特に５２．ｅ　　などの鉄の放射性核種が適して（
・る。　　　　　　　″ｉ 抗体に直接結合させ得る放射性核種は２０，３Ｈ，１１
９７Ｈ，、＋０５Ａ、　、　２０３Ｐｂ、　９７Ｒｕ、
　１０３Ｒｕ、９９Ｒｈ１１０１ｍＲｈオヨヒ４８Ｃ「
ヲ含む。

最も適した放射性核種は、約Ｓ時間〜Ｓ日の範囲の半減
期を有し、／θ０−＋０θにｅＶの１囲のエネルギーの
γ−線を放出するものである。

現時点においては明らかに理解され得な℃・理由のため
に、肺瘍抗扉に対する個々の単クロン（モノクロン）抗
体のいくらかは直接的全膨化に抵抗する。かくして、こ
のルートにより放射性核種を取入れるためには、特定の
抗体を注童深く選択する必要がある。従って、今のとこ
ろまず抗体にキレート化剤を結合させ、次いで放射性核
種との錯体を形成するという、より柔軟性ある方法を利
用して、抗体に放射性核種を結合することが好ましい。

この点に関し、放射性核種として　　Ｉｎ　（Ｔ％二２
．３日）を使用して、キレート化剤としてのＤＴＰＡと
結合することが好ましい。

本発明の方法は１、一般に腫瘍関連抗原に対する単クロ
ン抗体を使用して腫瘍を検出するために使用することが
できる。ＣＥＡに加えて、黒色腫関連抗原、α−フェト
−プロティン、フェリチン、ヒトコリオゴナドトロピン
、グリシン酸亜鉛標識物、プロスタチック酸ホスファタ
ーゼ（ＰＡＰ）は、例えば前述のように所定の単クロン
抗体の生産を刺激するための免疫原として使用すること
ができる。実際の使用の際には、適当な非軽口的溶液中
の標識抗体が磨者内に注入される。十分な時間の軽過後
、息者は光により走査（ホトスキャン）されて、腫瘍お
よび／またはその転移体の１種の存在を示す局所的放射
能を有するあらゆるサイトを検出する。

１２５：およびＮ＋、ｎ　で標識されたＣＥＡに対する
単クロン抗体を用いて行った以下の実験は、ヨウ素標識
した抗体による方法と比較して、本発明による腫瘍像造
影にとって、キレート結合した放射性核種で標識した単
クロン抗体の使用の有利さを証明している。

／　放射性標識した抗−ＣＥＡの調製 Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ、　Ｉｎｃ、、（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ
、　Ｃａ、）から入手できる単り四ン抗−ＣＥＡを、Ｂ
ｏｌｔｏｎ　＆　Ｈｕｎｔｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ
、、　／　３３　ｅ　Ｓ　２９−３９　（／９７３）］
の方法を用いて、　　１　で標識した。生成物を５ｅｐ
ｈａｄｅｘ　　Ｇ　−，２３カラムに通したところ、最
終物質はの５％より少ない遊離ヨウ素を含んでいた。

放射性標識した単クロン抗体の結合はセファロースに結
合した馬抗−マウス抗体についてｇｏ％より犬であり、
セファロースに結合したＣＥＡについては７３％より大
であった。

Ｋｒｅｉｃａｒｅｋ　＆　Ｔｕｃｋｅｒ　［Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ　ａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ　Ｃ０ｒＴ’ｒｎＬＩｎｉＣａｔｆＯｎＳ＋
　　７７　ｅ３ｇ／（／９７？）］の方法に従って、キ
レート化剤として複合ＤＴＰＡを用いて、同じ単りロン
抗−ＣＥＡを＋＋１．ｎで標識した。反応生成物を５ｅ
ｔ）ｈａｄｅｘ　　Ｇ　−７！；カヲムに通すことによ
り精製した。抗原結合は１２５１　　で標識した抗体の
示す値に匹敵した。標識工程は、ＣＥＡで滴宇すること
により決定された未標識抗体と比較して、抗体に対する
アフィニティ一定数にａ　には影◆を与えなかった。

標識した抗−ＣＥＡ抗体の生体外安定性は以下のように
して決められた。即ち、該物質の一部を無菌化標準塩水
（ｕ、ｓ、ｐ、）を含む非経口溶液中にて、３７℃で７
２時間恒温保持し、遊離放射性核種をクロマトグラフィ
ーで測定した。抗体溶液をＢａｋｅｒアルミナ１Ｂスト
リップ上に点滴し、５０％水性アセトン中で展開させた
。タンパクの結合した放射性核種は原点に残り、一方遊
離放射性核種は移動する。淵ｅ期間終了稜、放射性ヨウ
素標識された物質は遊離ヨウ素の存在による放射能３％
未満を示した。９℃での保存はこれを５０％だ１１ け滅じた。同様な条件下では、Ｉｎ抗−ＣＥＡは同様に
匹敵する安定性を示した。

コ　ヌードマウス中における分布の研究放射性標識され
た単りロンマウス抗−ＣＥＡの組織分布の研究を、ヒト
結腸腫瘍０．３−１．Ｏｆを有するヌードマウスについ
て行った。このマウスの体重は７７〜２ｇｆ（平均約２
３２）の範囲であった。腫瘍はＣＥＡ−生産ヒト結腸腺
癌細胞を含有するミ／スミートの皮下□注入により発生
させた。分布の研究は３週間俵まで行った。λつの実験
を行った。第７に、７９匹の動物を４−Ａ匹か（約０．
３μを抗体）の０．３マイクロキユーリーおよび対象と
して担体を含まない６７Ｇａ　　シトレート、公知の非
−特異的ヒト結腸腫瘍造影剤を含有する無菌化標準塩水
（ｕ、ｓ、ｐ、）溶液θ。／−を静脈内注入した。正確
さを確保するために１０θμｌＨａｍＮｔｏｎ　　シリ
ンジを使用して麻酔せずに注入を行った。投与物が部分
的に尾に侵入した動物はこの研究から排除した。注入に
続き、マウスを＃′菌代謝ケージに入れた。該ケージは
尿および糞便を集めるために高い金網の床を有している
。この床の下には無菌化ダ×ｑガーゼを、動物によりか
み切られないように詰めた。随意に無菌化食物および水
を与えて約＋、４ｔ℃（ｌＬｔθ’Ｆ　）の清潔な家で
飼育したマウスはトレーサーの注入後の’ｌ、２’ｌ、
ｌＩｇおよび７２時間において各グループ毎に殺された
。

マウスはエーテルで麻酔され、匍液試料が直接心臓穿刺
することにより得られた。次いでマウスは頚部脱臼によ
り殺された。一連の解剖中に、腫瘍、肝瞼、腎臓、筋肉
、心臓、肺、大腿骨、牌臓を取出し、水中で２度、７０
％ホルマリンで７度洗浄し、ふき取り乾燥し、分析天秤
で湿潤重量を測定した。無傷前および腸管をも取出し、
秤量した。血液、筋肉および骨は、全器官の取込み量の
計算に対して、夫々全体重の７％、ｌＩＯ％および７０
％であると見積もられた。他の器官は全体と２５ して秤量した。放射症は、　　Ｉ　の、２７〜３５にｅ
Ｖフォトビークおよび　Ｇａ　　の９３にｅＶフォトぎ
−りに亘り作動する窓を有する自動ガンマ線井戸型カウ
ンタで行った。このカウンタは最低放射能レベルの試料
に対する統計的意義を得るために７０分もしくは１０Ｏ
万力ウント以上を除くようにプログラムされている。窓
セツティング間における同位体放射能の逆寄与並びに・
臂ツクグラウンドに対する補正は調製源を使用し、連立
方程式を解くことにより行った。次いで、試料中の放射
能は注入物質の標準と比較され、給米を％注入量／２お
よび％注入量／器官によって表した。腫瘍対組織比を％
投与量／を表示−のデータから計算した。

臓器、尿および便中の放射能ｍ全注入量の百分率として
計算した。

第２の研究では、同じヒト結腸癌から生長した腫瘍を有
する３７匹のヌードマウスを各７〜ｇ匹からなるＳつの
群に分けた。７つの群を対照とし、／マイクロキューリ
ーの　　１　ヒト血清アルブミン（θ、θ／■ＨＳＡ）
　　および３マイクロキユーリーの担体を含まない＋＋
＋、ｎシトレー）　＜０．０．　／　ｓｑシトレート）
を同時にｔ　、ｖ、　　で注入し、注入後ｔＩｇ時間に
おいて殺した。残りの９群には、３マイクロキユーリー
の１１１．ｎ標識抗−ＣＥ　Ａ　（／ｊ　ｐ？抗体）お
よびＳマイクロキューリーの担体を含まない６７Ｇａ　
　シトレートを同時に注入した。これらグ群を夫々注入
後’Ｉ、２１Ｉ、４℃ｇおよび７２時間において殺した
。組織解剖、放射線検定用試料調製、計数法および計算
は上記のように実施した。

Ｎｊ、ｎの場合、分光器は’Ｉ　ＯＫｅＶ窓（２１０〜
２ＳＯにｅＶ　）を使用してＪＩＩ７にｅＶフォトビー
クを割数するようにセットされ、一方　Ｇａ　は９３に
ｅＶフォトビークを重合せる３０にｅＶ窓を用いて計数
した。このようなセツティングは結果として７０％より
小さな放射能の逆寄与を与えた。

第１図に示したように、腫瘍中に局在するＮ１．ｎ抗−
ＣＥＡ濃度は実験期間を辿じて定常的に増加した。注入
量の２３％が７２時間までに蓄積され、この結果は、こ
の濃度がψに遅い試料採取を行った場合よりも一層高い
ものであることを示唆する。

逆に、血液量の濃度は実験期間全体を通して減少した。

肝臓は９時間における急速な取込みを示し、次いで殆ど
変化しない期間を経て７２時間まで増加した。他の組織
は実験した期間に亘り殆ど変化しなかった。

腫瘍中の６７ａａ　濃度は実験中ずつと殆ど一定に維持
され、７２時間後における　　１ｎ抗−ＣＥＡの濃度の
約％であった。血液中の６７Ｇａ　　濃度は定常的に減
少し、一方肝臓中の濃度は　　Ｉｎ標識抗体と幾分類似
するノｆターンを示した。筋肉中の６７（！ｈａ　　＊
度は４ｔｇ時間まで−少し、次いで一定となり、一方骨
中濃度は全期間中一定に保たれた。

腫瘍中のヨウ素の量は９時間でピークに達し、の弗りの
期間中を通して不知側に減少し、７２時間においてはわ
ずかにＮｌ、ｎの／／１０であった。

その時点で腫瘍中の′６７Ｇａ　の量は　　１　の−倍
であった。すべての組織中の１２５１　　の計数率は９
時間の時点における最大値から急速に減少し、いくつか
の場合には、ｌＩｇ時間までにバックグラウンドレベル
に達する。

排出データ（第２図）は２ｑ〜７２時間の間で尿中の　
　１０の定常的増加を示し、注入量の７９％に当る最大
値に達する。便中０１０Ｉｎ濃度は２４ｔおよびりざ時
間においてｔまは一定に保たれ、次いで７２時間におけ
る。７７％まで増加した。一方、腸管内の量は全実験期
間中比較的一定に保たれ、投与量の５％を越えることは
なかった。

６７Ｇａ　排出ノリーンはＮｌ、ｎのノ４ターンに幾分
似ているが、しかしく７２時間においては）腸管並びに
便中では　　Ｉｎについて観察された値よりもトレーサ
ーの量は大であり、尿中では逆に似かった。

１２５１　　の放射能のほぼ１０％が初めの２ｑ時間内
に尿中に排出され、ｑｇ待時間でに７５％排出された。

仙の１２５１　　の５％は便中に含まれていた。

かくして、７２時間後に初めに注入した１２５１　　の
約ｇθ％が動物から排出された。尿中０１２５１　　の
クロマトグラフィーはその殆どがタンノ母り以外の何物
かと錯化された遊離１２５１　　であろうと思われる第
２の種を含む遊離ヨウ素であることを示した。

第３図はり３時間における　　１ｎ標識抗−ＣＥＡのデ
ータを、ＩＮ、ｎシトレートおよび１２５１　Ｈ９Ａと
比較して示すものである。ＩＮ、ｎシトレートは抗体か
ら分解されるかもしれない何等かのインジウムに対する
対照として使用され、他方１２５ＩＨ５＾は非特異的タ
ンノ？りの対照として使用された。

１１　ｊ　Ｉｎ抗−ＣＥＡはＩＮ、ｎシトレートとは著
しく異った分布パターンを示し、１０倍という高い効率
で腫瘍中に濃縮された。仲の組織によるこれら２種のト
レーサーの増込みも全く異っていた。腫瘍に対する１２
５ｔ　Ｈ８＾の集中は　　１ｎ抗−ＣＥＡのコ０％であ
るが、依然として１２５１抗−ＣＥＡよりも３０％以上
大きい。腫瘍のない組織中における１２５ｔ　ＨＳ＾　
の分布も１１１．ｎ抗−ＣＥ＾生成物の分布とは著しく
異っている。　　ｌ　Ｈ５＾　（長い間、安宇なヨウ素
化タン・ぐりであると考λられていた）はｌＩｇ時間ま
でに殆ど６０％（４ｔ３％は尿中）が２５ 排出されることを示し、　　１　抗−ＣＥＡも尿中に見
出されるという上記発見と殆ど一致した。尿中の両分は
たぶん遊離ヨウ素であろう。

腫瘍／組織比（第り図）は血液以外のすべての組織につ
いて、Ｎｊ、ｎ抗−ＣＥＡが”Ｇａ　　より優れている
ことを示し、血液については６７Ｇａ　　と殆ど同じで
ある。い（つかの組織においては見損は上１１　ｌ　Ｉ
ｎおよび６７Ｇａ　　ｒ、りも好ましいように考えられ
るか、　　ｌ　抗−ＣＥＡＯ比は誤解され易い。

というのは　１２５．　　抗−ＣＥＡに関する高い比は
腫瘍中における高い局在化によるのではなく、むしろ正
常組織中における１２５１　　濃度が低いこ之に起因す
るからである。

前述の実験から　１２５．　　抗−Ｃ［＾は明らかに腫
瘍部分特定化剤としては不適当である。急速かつ高度の
脱ハロゲン化は腫瘍トレーサー濃度を減少させ、血液バ
ックグラウンドを高くシ、熟練した差引き技法を用いる
ことなしに造影に際して使用することを制限する。事実
、７コ時間において、腫瘍はダラム当たりの基準で非特
異的　Ｇａ　　の量を１２５１　　の２倍含んでいる。

更に、腫瘍／血液比はヨウ素化抗体よりも６７Ｇａ　　
の方が良好である。

結腸の腺癌造影のためＫ　　Ｇａ　の使用が不十分であ
ると考えられる場合には、Ｍａｃｈ等［Ｎ、εｎｇ、Ｊ
。

Ｍａｄ、＋　３θ３．！；−７０（／９ｇｏ）〕の経験
した難点が容易に説明される。　　置　を使用したこれ
らのデータは明らかに以下のことを証明している。即ち
　１５１．　　を使用した場合において差引き技法がな
い場合には、極めて大量の　　１　標識物質を投与して
、効果的な造影のために必要な腫瘍上での集中化を達成
しなければならない。このことは、結果として患者に３
日という物理的半減期ｉ１″′ と１３１１　　のＡ　Ｏｇ　ＫａＶというβ−成分に基
く極めて高い放射線量を与えることになる。

逆に、腸瘍に取込まれる　　１ｎ抗−ＣＥＡの注い物性
がより少量の放射性薬剤の注入を可能とし、一方造影性
が改良されかつ患者に対する放射線量が最小化される。

＋Ｎ、ｎ抗−ＣＥＡにより形成される腫瘍対パックグラ
ウンド比はまったく造影の目的に必要とされる範囲内に
ある。これは大量の放射性核種が腫瘍中に局在化される
からである。

更に、このデータは腫瘍が一担他の組織中にを込まれる
かもしくは付着した放射性標識物を取込むことを示唆す
る。

１１ 各マウスは、Ｉｎｎ標識−ＣＥＡの注入徒の４１、２グ
、グざおよび７．２時間の時点で、ρｈｏｇａｍＨＰ　
Ａｎｇｅｒ　　ガンマカメラ、を用いて光走査に付され
た。ｌＩｇ時間までに、腫瘍は差引き技法に軸る必要性
なしに、十分に造影された。７２時間において、腫瘍の
造影力はより一層憂められた。

直接標識された、単クロン抗体の生体内安定性およびそ
の結果としての腫瘍造影における使用に対する安定性は
　＋０３Ｒ，で標識した単りロ／抗−黒２５ 色原を使用し、　　１　で標識した同一の抗体と比較し
た以下の実験によって証明される。

／１０３Ｒｕ標識抗−黒色腫の調製 １０′ｘ′ＲＲｕＣ１３（Ｎｅ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃ
ｌ’ｅａｒ　Ｉｎｃ、から入手）の水性溶液２−〇μｌ
　を、飽和酢酸カリウム溶液／θ０　μｉ　　に添加し
た。ｐＨを、／　ＯＭＮａＯＨ７０μＩ　で！；、３　
Ｋ　８１節した。この放射性核種の溶液を、マウス抗−
黒色腫抗体の０．３μＶμｌ溶液ＳＯＯμｌ　に添加し
、混合物を室温にて／時間恒温保持した。ｐ）ｌを／　
Ｑ　ＭＮａＯＨ２０μｌ　添加して７．−に調節し、処
方物を室温にて一夜保存した。未結合金属は、反応混合
物を５ｓｐｈａｄｓｓｘ　　Ｇ　−！；θカラムに通し
、ｐ’Ａ７．２の燐＊ｍ緩衝塩水で溶出することにより
、抗体結合金属から分瞭された。タン・母り含有画分を
集め、マウスにおける生体内試験のためにプールした。

コ　正常マウス中における分布の研究 組織中の分布の研究は、正常なりＡｌ１−Ｃマウスにつ
いて行い、前記方法に従って調製した１０’Ｒｕ１ｌｌ
ｉｌ抗−黒色腫および抗−ＣＥＡを標識するために上記
した同じ方法で調製した１２５１　　標識抗−黒色腫を
使用した。

マウスをコ群に分け、夫々１２５Ｉ標識および１０３Ｒ
ｕ標識抗体で静脈内注入した。マウスなダ、λＩＩ、４
Ｉｇ、７２および９６時間後に殺し、解剖し、単りロン
抗−ＣＥ＾に関する研究について上述したように、器官
の放射卵を測定した。１′１およびｔｏｅＲ，の組織中
における分布を以下の表に示す。

表中のデータは、丁度１２５１標識抗−ＣＥＡに１２５ ついて起こったように、　　　Ｉ標識抗−黒色腫は急激
に脱ハロゲン化され、−Ｊ　　、Ｒｕ　　標識抗−黒色
腫は安定であったことを示している。これらの観測は以
下の事実により確かめられる。即ち、血液中の　　１濃
度は注入後９時間において極め比較的急速に血液中から
失われ、非腫瘍ら患宿主において予想されるように、肝
臓中に濃縮される。

１０３Ｒｕ標識抗−黒色腫を注射したマウスに対する牌
臓および腎臓中の濃度も生体内安定性に一致する。

ＣＥＡ並びにいくつかの他の腫瘍関連抗原が腫瘍により
分泌もしくは放出されることは公知である。このような
場合においては、血液中もしくは他の組織中を循環する
抗原が標識抗体と結合することに起因するバックグラウ
ンド放射の発生は初めに未標識抗体を投与して循環抗原
と結合させることにより減することができる。これはま
た、標識抗体の肝臓による高い取込みを減する傾向を示
すであろう、適当な期間の経過後、標識抗体を添加し、
対象を゛光走査して局在化放射能のサイトを決定する。

前記議論は放射性核種で標識した畦−〇争りロン抗体の
使用を強調したが、異った抗原決定因子に対して２また
はそれ以上の標識単クロン抗体を使用することも本発明
の範囲内にはいる。異った抗体は他の抗体の抗原に対す
る結合を妨害しないように選ばれる。多数の非妨害性標
識抗体を使用することにより、腫瘍造影力は強化される
。なぜならば、抗原は標識抗体に対する高い容置を有す
るであろうからである。複数の抗体の使用は、腫瘍関連
抗原が低濃度で存在するような腫瘍の造影に対して特に
有用である。

本発明の前記記載は現在のところ好ましい態様に係り、
他の変形は当栗者にとって明らかであることを理解すべ
きである。従って、本発明の範囲は特許請求の範囲のみ
によって限定されるものである。

【図面の簡単な説明】

第１ｒ１４は、１１１１．と１２５畳でラベルした抗Ｃ
Ｅ＾ならびに　　Ｇ自シトレーＦを、ひと結腸癌を感染
させたヌードマウスに注入した後の時間と、組織中の１
１１１ｎおよヒ１２５１）分布ナラヒに６７Ｇ／）分布
を比較して示すグツ７である。 第一図は、１１１１ｎ　と　　１７ベルし九抗ＣＥ＾と
６モ１シトレートの注入後、経過時間でヌードマウスか
ら＃潰された１１１−と１２５■　　ならびに４７Ｇ−
の量を示すグラフである。 ＠３図は、１１１．ｎと１２５１　　ラベルした抗ＣＥ
＾と、１１１．ｎ１／）レートと１２５１　　ラベルし
たひとアルラミンとを、その注入後ｌＩｔ時間において
ヌードマウス中の１１１．　ｎと１２５１の組織分布を
比較して示すグラフである。 第４ＩＩｉＩＩは、　　Ｉｎと　　ロラペルした抗ＣＥ
＾と”Ｇ吟）レートをヌードマウスに注入後、　　Ｉｎ
と１２５１　　の膿瘍／組礒比ｔ”ａ拳と比較し、時間
の□ 関数として示すグ→７である。 図面の浄書（内容に変更なし） ％旙事最／≧− 俗ｉ１人監 ■”　＆−ＣＥＡ　　　　Ｂｍ　ＪＪ九−ＣＥＡ口４−
　　シトレート　　　　　■／Ｎ　ヒトアルブミン／タ
シＥ、／’ オルニア 一イ・アベニュー２２００番 ％許庁隘宮　　殿 １、事件の表革 昭和５７年特許願第１８８９２１号 ３、Ｎｉ正をする者 事件との関係　　　出願人 名　称　　ハイブリチック　インコーポレーケ・ノド外
１名 ４、代理人

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　金属放射性核種が、直接に、°あるいはモノ
   クロン抗体に結合したキレート化剤を介して結合してい
   る腫瘍関連抗原に対するモノクロン抗体。
2. （２）　　キレート化剤が、ポリアミノカルデン酸、ポ
   リアミノ（アルキレンリン）酸、ポリアミン、Ｉルフイ
   リン、クラウンエーテル、クリプタンド、デスフェリオ
   キサミンＢおよびその誘導体、エンテロバクチンおよび
   そのカルプサイクリック類縁体から選ばれる特許請求の
   範囲第１項記載のモノクロン抗体。
3. （３）　　キレート化剤が、次の式で表わされるｙｊ？
   　ＩＪアミノカルボン酸である特許請求の範囲第一項記
   載のモノクロン抗体。 式中、ＸはＯまたは整数、ｙは／またはコ、２は／〜７
   の整数、Ｒは水素、または前記キレート化剤と抗体とを
   結合している基、または放射性核種のキレート化剤の結
   合定数に影響を与える基である。
4. （４）　　ポリアミン（アル−キレンリン）酸が、Ｆ記
   載で表わされる特許請求の範囲第一項記載のモノクロン
   抗体。 轟 ＯＨＱ １０ ＯＨ 式中、ＸはＯまたは整数、ｙは／またはコ、２は／〜７
   の整数、Ｒは水素、または前記キレート化剤と抗体とを
   結合している基、または放射性核種のキレート化剤の結
   合定数に影響を与える基である１、、・・
5. （５）Ｒが、水素、メチル、−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４０ＣＨ２
   ＣＯ２Ｈ、および−”６”４−Ａ（Ａはジアゾニウム塩
   またはその前１ 躯体、または　−ＮＨ−Ｃ−ＣＨ２Ｌ　　（Ｌは結合の
   際にから選ばれる特許請求の範囲第３項または第９項記
   載のモノクロン抗体。 １
6. （６）ｘがＯであり、・Ｒカーｃ６Ｈ４−ＮＨ−ｃ−ｃ
   Ｈ２Ｂ「テある特許請求の範囲第Ｓ項記載のモノクロン
   抗体。
7. （７）　　＋レ−）化剤が、＆ｌＪアミノカルボン酸テ
   あである特許請求の範囲第Ｓ項記載のモノクロン抗体。
8. （８）　　キレート化剤が、エチレンジアミン四節４、
   ρ−プロモアセトアミドソフェニル（エチレン）二）　
   ＋）ｏ四節酸）、／　−（ｐ−アミノ７エ二ル）−エチ
   レンノアミノ四節醜およびノエチレントリアミン五酢酸
   がら成る群から選ばれる特許請求の範囲第２項記載のモ
   ノクロン抗体。
9. （９）放射性核種が、半減期夕時間〜３日のｒ＠放射体
   であり、そのｒｔｓ放射のエネルギが／θ０〜グθθＫ
   ｅＶである特許請求の範囲第ハコ、３．９、ｊｓ　ｉ　
   ７ｔたは３項記載のモノクロン抗体。 よび４５ｃｒから選ばれる特許請求の範囲第７、コ、３
   、グ、５．Ａ、７、ｇｉたは９項記載のモノクロン抗体
   。 （１υ　腫瘍関連抗原が、癌胚抗原、α−７エトプロテ
   イン７エリチン、ひと絨毛性ゴナドトロピン、亜鉛グリ
   シネートマーカー、グロスタチツクアシドホス７アター
   ゼおよびメラノーマ関連抗原から選ばれる特許請求の範
   囲第１、λ、３、ダ、Ｓ％乙、ワ、９または７０項記載
   のモノクロン抗体。 （１２、特許請求の範囲第１、コ、３、グ、Ｓ、乙、７
   、ｇ１９、／θまたは７７項記載の腫瘍関連抗原に対す
   るモノクロン抗体の非経口投与用溶液を含む組成物。 ０３　　前記モノ、クロン抗体の一種以Ｅの混合物を含
   む特許請求の範囲第１コ項記載の組成物。 （Ｊ４）　　ａ）腫瘍関連抗原“に対するモノクロン抗
   体であって、該抗体に直接に結合し、あるいは該抗体と
   結合しているキレート化剤を介して結合している放射性
   核種を有するモノクロン抗体を含む非経口組成物をひと
   患者に投与し、 ｂ）　この患者をホトスキャンして、放射性核種からの
   放射線によって示される患者の体内の抗体局在部分を決
   定することを特徴とする腫瘍の造影方法。 （国　モノクロン抗体が特許請求の範囲第１、コ、３、
   ＆、Ｉ　Ａ、７、ｇ、９、ＩＯ１／／Ｊ２または７３項
   記載の抗体である特許請求の範囲第１グ項記載の方法。