JPS58135820A - Tumor contrasting method using radiated monoclonal antibody - Google Patents

Tumor contrasting method using radiated monoclonal antibody

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JPS58135820A
JPS58135820A JP57188921A JP18892182A JPS58135820A JP S58135820 A JPS58135820 A JP S58135820A JP 57188921 A JP57188921 A JP 57188921A JP 18892182 A JP18892182 A JP 18892182A JP S58135820 A JPS58135820 A JP S58135820A
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tumor
antibody
radionuclide
antibodies
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。(57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は腫瘍の検出法に関するものである。また本発明
は放射性核種でラベルしたモノクロン抗体に関するもの
である。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for detecting tumors. The present invention also relates to monoclonal antibodies labeled with radionuclides.

腫瘍？位置を特異的に検出するための信頼できる方法が
長年に亘り探求されてきた。たとえば、血液中を循環す
る、ひとの癌に関係がある癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を検
出する方法が発表されている。米国特許第３．４　Ａ　
３．６　ｇ　’Ｉ号及び第３．６９’ｌｌ、３ｇ号径照
。これらの方法を使用しても腫瘍の位置は決定できない
ことは明らかである。最近、ヨウ素の放射性同位元素で
ラベルした抗体を用いて、腫瘍関連抗原性物質を検出す
る方法が提案されている。すなわち、米国特許第３．９
２２／　９３号には、１２５１と１３１夏でラベルした
ＣＥＡに対する抗体を用いる方法が開示されている。こ
の特許によれば、ひと印環細胞癌を導入した雄シリアハ
ムスターを用いて行った実験において、ラベルしたやぎ
の抗ＣＥ＾を注入し、次いでハムスターの器官を検査し
たところ、ラジオアイソトーゾが腫瘍に局在しているこ
とがわかった。したがって、抗体の非経口溶液を生体内
投与し、次いで患者をホトスキャンすることにより、ひ
との腫瘍部位を決定することができることが掃案された
。tumor? Reliable methods for specifically detecting location have been sought for many years. For example, methods have been published to detect carcinoembryonic antigen (CEA), which circulates in the blood and is associated with human cancer. U.S. Patent No. 3.4 A
3.6 g 'I and 3.69'll, 3g diameter guide. It is clear that the location of the tumor cannot be determined using these methods. Recently, a method has been proposed for detecting tumor-associated antigenic substances using antibodies labeled with radioisotope of iodine. That is, U.S. Patent No. 3.9
No. 22/93 discloses a method using antibodies against CEA labeled with 1251 and 131 summer. According to this patent, in experiments conducted using male Syrian hamsters transfected with human signet ring cell carcinoma, injecting labeled goat anti-CE^ and then examining the hamster's organs revealed that radioisotozoans were detected in tumors. It was found that it was localized in It has therefore been shown that a person's tumor site can be determined by administering a parenteral solution of the antibody in vivo and then photoscanning the patient.

放射性ヨウ素化した抗体を実際に使用したが、初期の研
究がもたらしたような期待に沿うものではなかった。た
とえば、ゴールデンバーグらは７９７ｇ年に、放射性ヨ
ウ素化抗ＣＥＡを用いてひとをスキャンし、ある程度の
成功をおさめたと報告している［、　Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、
Ｍｅｄ、、　２９　ｇ　ｐ　／　３　ｇ　’１−／３ｇ
ｇ（／９７Ａ））。しかし、残留バックグラウンド放射
能のために、この成功は、差引法を使用することにより
制限されたものであった。The actual use of radioiodinated antibodies did not live up to the promise that earlier studies had generated. For example, Goldenberg et al. 797g reported scanning humans with radioiodinated anti-CEA with some success [, N., Eng, J.
Med,, 29 g p/3 g '1-/3 g
g(/97A)). However, due to residual background radioactivity, this success was limited using the subtractive method.

マツハらは、成功とはいえないが、投与量のわずか０．
７％が腫瘍に局在していることを測定したと報告してい
る［Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、ｅ　　３０３　ｅ　！；
　−／θ（７９ｇｏ）〕。しかし、いくつかの場合に、
腫瘍の造影は可能であった。Matsuha et al. were not successful, but with only a small dose of 0.
reported that 7% were measured to be localized to the tumor [N, Eng, J, Med, e 303 e! ;
−/θ(79go)]. But in some cases,
Imaging of the tumor was possible.

従来の腫瘍造影法に使用されている抗体を得るための異
質組織抗血清の親和性純化（ａｆｆｉｎｉｔｙｐｕｒ目
１ｃａｔｉｏｎ）は、高親和性抗体の損失をもたらすこ
とおよび、得られる抗体は、異なる抗原決定基に対し特
異的な抗体の混合物であり、大部分が伺親和性の抗体と
、非特異的な反応をする抗体とから構成されていること
はよ（知られている。一方、モノクロン抗体は、抗原の
所定の部位に高親和性を示し、恢い非特異性結合を示す
ように選ぶことができる。しかし、驚りべきことに本発
明者らは、周知の方法により放射性ヨウ素でラベルした
腫瘍抗原に対するモノクロン抗体がなお、免疫反応性を
生体外で明らかに示すことができるという事実にもかか
わらず、ｌ１ｉＦ瘍部位にあまり局在していないという
ことを発見した。これはおそらく、ラベルした抗体によ
り放射性ヨウ素が失われたことによるものであろう。し
たがって、生体内で、腫瘍の部位を正確に検出する信頼
性の高い方法に対する必要性が依然として存在している
。Affinity purification of foreign tissue antisera to obtain antibodies, which is used in conventional tumor imaging methods, results in the loss of high-affinity antibodies and that the resulting antibodies contain different antigenic determinants. It is well known that monoclonal antibodies are a mixture of antibodies that are specific to a target, and are mostly composed of antibodies that have specific affinity and antibodies that react nonspecifically.On the other hand, monoclonal antibodies can be selected to exhibit high affinity for a given site on the antigen and to exhibit nonspecific binding.However, surprisingly, the inventors were able to label the antigen with radioactive iodine by a well-known method. Despite the fact that monoclonal antibodies directed against tumor antigens can still clearly demonstrate immunoreactivity in vitro, we found that L1iF was poorly localized to tumor sites; this was probably due to the labeling. This may be due to the loss of radioactive iodine by the antibodies.Therefore, there remains a need for reliable methods to accurately detect tumor sites in vivo.

本発明によれば、腫瘍抗原に対するモノクロン抗体ある
いはモノクロン抗体フラグメントは、直接に金属放射性
核種によりラベルされるか、あるいは、キレート結合し
た放射性核種たとえば、ＤＴＰＡ結合したＮ１．ｎを用
いて、キレート化剤を抗体に結合し、次いでキレート化
剤と放射性核種との間でコンデレックスを形成すること
によりラベルされる。このようにラベルした抗体または
そのフラグメントを、腫瘍をもつ宿主に注入すると、速
かにかつ高度の特異性をもって腫瘍そのものに集中する
。成る場合には、離れた転移部の局在化が起こり、さら
に、腫瘍の広がりを示すことがある。腫瘍部位はホトス
キャンにより検出可能である。ラベルしたモノクロン抗
体の混合物も使用することができる。According to the invention, monoclonal antibodies or monoclonal antibody fragments directed against tumor antigens can be labeled directly with a metal radionuclide or can be labeled with a chelated radionuclide, such as DTPA-conjugated N1. n is used to couple the chelating agent to the antibody, which is then labeled by forming a conderex between the chelating agent and the radionuclide. When such labeled antibodies or fragments thereof are injected into a tumor-bearing host, they rapidly and with a high degree of specificity concentrate on the tumor itself. If this occurs, localization of distant metastases may occur and further indicate tumor spread. Tumor sites can be detected by photoscanning. Mixtures of labeled monoclonal antibodies can also be used.

したがって本発明の目的は、金属放射性核種でラベルし
た腫瘍関連抗原に対するモノクロン抗体　　−を得るこ
とである。It is therefore an object of the present invention to obtain monoclonal antibodies against tumor-associated antigens labeled with metal radionuclides.

本発明の仲の目的は、感染宿主の腫瘍を造影する改良さ
れた方法を提供することである。It is an object of the present invention to provide an improved method for imaging tumors in infected hosts.

これらの目的ならびに関連する目的が達成きれることは
、添付図面ならびに以下の詳細な説明から明らかになろ
う。The achievement of these and related objectives will be apparent from the accompanying drawings and detailed description below.

上記のとおり本発明によれば、腫瘍関連抗原に対するモ
ノクロン抗体またはそのフラグメントは、金属放射性核
種で直接に、あるいはキレート結合した放射性核種によ
りラベルされる。本発明に有用なモノクロン抗体は、周
知のハイプリドーマ法の生成物である。たとえば、ミル
スタインとコーラ−の論文を参照されたい［Ｎａｔｕｒ
ｅ、　　２　！；乙。According to the invention, as described above, monoclonal antibodies or fragments thereof directed against tumor-associated antigens are labeled with metal radionuclides either directly or with chelated radionuclides. Monoclonal antibodies useful in the invention are products of the well-known hybridoma method. See, for example, the paper by Milstein and Cora [Natur
e, 2! ; Otsu.

ダ９．！１−１１９７ｃ／９７３）〕。基本的にはこの
方法は、マウスあるいはその他の適当な動物に、免疫原
、この場合にはＣＥＡのような腫瘍関連抗原を注入する
ものである。次（・で免疫したマウスを解剖し、その牌
腋から取った細胞を骨髄腫細胞と融合してハイプリドー
マ（これは生体外で再生産できる）と呼ばれるハイブリ
ッド細胞を得る。Da9. ! 1-1197c/973)]. Basically, the method involves injecting a mouse or other suitable animal with an immunogen, in this case a tumor-associated antigen such as CEA. Next, the immunized mice are dissected and the cells taken from their axilla are fused with myeloma cells to obtain hybrid cells called hybridomas (which can be reproduced in vitro).

抗体産生細胞集団を選択的に培養し、スクリーンにかけ
て個々のクロンを単離する。個々のクロンはそれぞれが
、抗原分子表面上の特定領域（“決定基″）に対して特
異的な単一の抗体種を分泌する。Antibody-producing cell populations are selectively cultured and screened to isolate individual clones. Each individual clone secretes a single antibody species specific for a particular region (“determinant”) on the surface of the antigen molecule.

個々のクロンな更にスクリーンにかけて、抗体に対する
最高の親和性をもぢ、低（・非特異的結合を示す抗体を
産生するようなりロンを決定する。Individual clones are further screened to determine those that have the highest affinity for the antibody and produce antibodies that exhibit low (non-specific binding).

放射性ラベル用に（一般に腹水から単離される）選択さ
れた抗体を金属放射性核種と反応させるか、あるいは適
当なキレート化剤と結合させ、次にこのキレート化剤に
放射性核種を結合させる。キレート化剤は、各種の方法
を用いて抗体に結合させることができる。一般に、抗体
はポリベゾチドであるため、残基導入用として知られて
いる反応基をもつキレート化剤を使用することができる
。適切な反応基としては次のようなものがある。The antibody selected for radiolabeling (generally isolated from ascites fluid) is reacted with a metal radionuclide or conjugated with a suitable chelating agent, and the radionuclide is then conjugated to the chelating agent. Chelating agents can be attached to antibodies using a variety of methods. Generally, since antibodies are polybezotides, chelating agents with reactive groups known for introducing residues can be used. Suitable reactive groups include:

式中、Ｃｈ　　はキレート化剤の残基である。In the formula, Ch is a residue of a chelating agent.

−切なキレート化剤としては、各種の多照配位子（ｐｏ
％ｙｄ＠ｎｔｓｔ・）キレート化剤があ勤、このキレー
ト化剤の配位子が金属放射性核種とコンプレックスを形
成する。このようなキレート化剤としては次式のＩす′
ア之ノカルがンーを挙げることかで式中、ｘｎ□ｔたけ
整数（Ｘ＝Ｏｆ九はＸ　ｍ　／が好ましい）、ｙ＝／ｌ
たはコ（ｙｘ／が好ましい）、Ｚ　Ｗ、　／〜りの整数
（！諺／または７が好ましい）、ＲＦｉ水素、または前
記キレート化剤と抗体とを結合している基、または放射
縞核穐のキレート化剤の結合定数に影−を与える基であ
る。有用なＲ基として基である）があげられる、九とえ
は、＾は−ＮＨ２のりアゾ化により得られるーＮｔでも
よ（、−ＮＨ２は−Ｎ０２０還元により得られ、→０２
　　はフェニル核のニトロ化により得られる。＾Ｉｄ　
−ＮＨ２を公知の方法よい。- As suitable chelating agents, various polyphotogenic ligands (po
%yd@ntst・) When the chelating agent is active, the ligand of this chelating agent forms a complex with the metal radionuclide. Examples of such chelating agents include Is' of the following formula.
In the formula, xn□t is an integer (X=Of9 is preferably X m /), y=/l
or co (yx/ is preferred), Z W, an integer from / to / or (preferably 7), RFi hydrogen, or a group linking the chelating agent and the antibody, or a radial stripe nucleus. It is a group that affects the binding constant of the chelating agent of Aki. Examples of useful R groups include -Nt (, -NH2 is obtained by -N020 reduction, and -NH2 is obtained by azotization, →02
is obtained by nitration of the phenyl nucleus. ^Id
-NH2 by a known method.

Ｌは結合の際に置換脱離する基であり、たとえば、α、
Ｓｒ、ｌのようなハロゲンである（　Ｓｒ　　が好まし
い）。L is a group that is substituted and eliminated during bonding, for example, α,
A halogen such as Sr, l (Sr is preferred).

また、Ｒは−ＣＨ３または−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４０ＣＨ２Ｃ
Ｏ２ＨＴもよい。Also, R is -CH3 or -CH2C6H40CH2C
O2HT is also good.

ポリアミノカルボン酸の場合には、結合はたとえば、酷
熱水物中間体の形成によりカルビン酸基自身を通して完
成される。にｒｅｊｃａｒｅｋおよびＴｕｃｋｅｒ、Ｂ
ｉｏｃｈｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ
　ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｒｎｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、
　　７７　、５ｇノ（／９り７）参照。In the case of polyaminocarboxylic acids, the linkage is completed, for example, through the carbic acid group itself by formation of a hyperthermic intermediate. Rejcarek and Tucker, B.
iochmical and biophysical
Research Communications,
77, see 5gno (/9ri 7).

ポリアミノカルボン酸としては、ポリアミノ酢酸が好ま
しい、使用可能な具体的なポリアミノカルボン酸として
は、エチレンソアミノ四節ａ（ＥＤＴＡ）およびその誘
導体、たとえばノエチレントリアミノ五酢酸（ＤＴＰＡ
）、ｐ−ブロモアセトアミドフェニル（エチレンノニト
リロ［Ｆ）酸および／−（ｐ−アミノフェニル）−エチ
レンノアミノ四酢酸があり、最後の化合物はノアゾニウ
ム塩に変換されて結合する。これらのキレート化剤のう
ち、ＤＴＰＡが好ましい。As the polyaminocarboxylic acid, polyaminoacetic acid is preferred. Specific polyaminocarboxylic acids that can be used include ethylenesoamino-tetra-a (EDTA) and its derivatives, such as noethylenetriaminopentaacetic acid (DTPA).
), p-bromoacetamidophenyl (ethylenenonitrilo[F) acid and /-(p-aminophenyl)-ethylenenoaminotetraacetic acid, the last compound being converted into a noazonium salt and conjugated. Among these chelating agents, DTPA is preferred.

その他の適切なキレート化剤としては次式で表わされる
よう、な４リアミノ（アルキレンリン）ｌｉｔがある。Other suitable chelating agents include 4-lyamino(alkylene phosphorus) lit, as shown below.

雪 ０Ｈ（２）　　　　　　　　。snow 0H (2).

１ Ｈ 式中ｓ　Ｘ＆　１％２およびＲＦｉ前記のとお勤である
。1 H In the formula, s X & 1% 2 and RFi are as described above.

好ましくは、翼はＯまたは／、ｙ項／％ｚ！／である１
本発明に使用するＩリアミノＣメチレンリン）ｄ（ｙｚ
−／　）の具体例としては、エチレンシアミノテトラ（
メチレンリン）酸、ヘキサメチレンジアセンテトラ（メ
チレンリン）蟻、ジエチレントリアミンペンタ（メチレ
ンリン）酸があけられる。Preferably, the wing is O or/, y-term/%z! / is 1
I lyamino C methylene phosphorus) d(yz
-/ ) is a specific example of ethylene cyamino tetra (
Methylene phosphorus) acid, hexamethylene diacetetra(methylene phosphorus) acid, and diethylenetriaminepenta(methylene phosphorus) acid are found.

さらにキレート化剤として、次式のポリアミンがある。Furthermore, as a chelating agent, there is a polyamine of the following formula.

式中、翼、２およびＲは前記のとおりである。In the formula, wing, 2 and R are as described above.

他のキレート化剤としては、次式のものがある。Other chelating agents include those of the following formula:

０Ｈ（４）　　　　　　’″ 式中Ｒは前記のとおりである。ただしＲが結合を可能に
する基でない場合には、フェノール基のＩルフイリンも
特に有用なキレート化剤である。0H(4)''' where R is as defined above, provided that when R is not a group that allows for bonding, the phenolic group Iluphyrin is also a particularly useful chelating agent.

本発明に有用なポルフィリンは、合成または天然に存在
する一ルフイリンンであり次式で表わされる。Porphyrins useful in the present invention are synthetic or naturally occurring porphyrins represented by the following formula.

式中、Ｒは前記のとおりであり、Ｒ１は水嵩、または天
然に存在するＩシフ４９２分子の一部として存在するｆ
換基、１１九は合成により導入された基、たとえば結合
を可能にし、あるいはＩルフイリンの結合定数に影響を
与えるような基である。where R is as defined above and R1 is a water bulk or f present as part of a naturally occurring I Schiff 492 molecule.
The substituent 119 is a synthetically introduced group, such as a group that enables binding or influences the binding constant of Irufilin.

好ましいＩルフイリンは、テトラフェニルポルフィリン
（Ｒ−フェニル、Ｒ１−Ｈ）またはテトラピリジルイル
フィリン（Ｒ−ダービリノル、Ｒ１−Ｈ）りである）ま
たは抗体との結合を可能とするようなその他の基である
。置換基は一般に、フェニル基に対してはパラ位、ピリ
ジル基に対しては２−位またはｑ−位である。Preferred Iruphyrins are tetraphenylporphyrin (R-phenyl, R1-H) or tetrapyridylphyrin (R-darbilinol, R1-H) or other groups such as allow binding to antibodies. be. Substituents are generally in the para position for phenyl groups and in the 2- or q-position for pyridyl groups.

本発明に使用されるその他のキレート化剤は、クラウン
エーテルとそのクリグタンド類縁体であり、次式で表わ
される。Other chelating agents used in the present invention are crown ethers and their kligtand analogs, represented by the formula:

式中、ＲｄｆＮ記のとおりである。また、結合を可能と
するのに使用される基は、次式で表わされるように１ク
ラウンエーテルｉ九はクリプタンド博造中に直接に才ま
れてぃてもよい。In the formula, RdfN is as follows. The group used to enable the bonding may also be created directly during the cryptand experiment, as represented by the following formula:

式中、＾は繭ｍｌのとお９である・ デスフヱリオ中サミンＢの誘導体もキレート化剤として
使用できる。これらは次式で表わされる。where ^ is 9 through ml of cocoon. Derivatives of samin B in desulfuria can also be used as chelating agents. These are expressed by the following formula.

（８） 式中％Ｒは前記のとおりである。(8) In the formula, %R is as described above.

エンテロバクチン誘導体もキレート化剤として有用であ
る０次式のものが好ましい。Enterobactin derivatives are also preferably of the zero-order formula, which are useful as chelating agents.

Ｈ Ｏ 式中、＾は前ｄ己のとおりである。H O In the formula, ^ is as described above.

エンテロバクチンのカルがン＃ｉ傾縁体も好適である。Also suitable are enterobactin calgan#i tilted analogs.

それらの中には次式の化合物がある。Among them are compounds of the following formula:

ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ−−ＣＨ２ 聞 （１１ 式中、＾は前記のとおりである。CH2-CH2-CH--CH2 Listen (11 In the formula, ^ is as described above.

中レージ化剤として有用なその他のカルーン酸化合物と
しては次式の化合物およびこれに対応するアニリドがあ
けられる。Other carunic acid compounds useful as medializing agents include compounds of the following formula and the corresponding anilides.

ａυ 式中、＾は前記のとおりである・ 金属放射性核種を結合する能力を実質的に損うことがな
いような置換基によって、エンテリノ噌りチン中カルが
サイクリック頑縁体を示す壌がさらに置換されていても
よいこと、またこのような置＊ｉが抗体への結合部位を
提供するという目的で導入されていてもよいこと１、画
業＃に明らかなところである。aυ In the formula, ^ is as described above. Substituents that do not substantially impair the ability to bind metal radionuclides can be used to ensure that the enterinosilicate group exhibits a cyclic rigidity. It is clear from Gakko #1 that further substitutions may be made and that such position *i may be introduced for the purpose of providing a binding site for antibodies.

さらＫもう１つの有用なキレーシ化剤は次式の（１１） （＾は前記Ｏとか礎でｈ為）〒ある。Another useful chelating agent is the following formula (11): (^ is h for O or the foundation mentioned above) There is.

金属放射性核１’ｌｌＣよる抗体の直接標識（ラベル）
化は、抗体自体のサイト（部位）に金属イオンを付着さ
せて抗体に金属イオンを導入するという公知の方法を利
用して実施することができる。いくつかの場合において
は、該金属放射性核種は、通常溶液中にある抗体を適当
な酸化状態にある放射性核種に曝露することにより抗体
に暇人れることができる。例えば、現在のところ好まし
いとされている方法においては、抗体を１０３８．＋３
で直接金属化することを含み、該金属化は抗体と適当な
ルテニウム塩、例えば三塩化ルテニウムとを緩衝溶液中
で接触させることからなる。使用することのできる緩衝
剤と−しては酢酸カリウム、重炭酸ナトリウムおよびト
リヒドロキシエチルアミン（Ｔｒｉｓ）　　がある。Direct labeling of antibodies with metal radioactive nuclei 1'llC
The conversion can be carried out using a known method of introducing metal ions into the antibody by attaching the metal ions to the site of the antibody itself. In some cases, the metal radionuclide can be added to the antibody by exposing the antibody, normally in solution, to the radionuclide in the appropriate oxidation state. For example, in the currently preferred method, antibodies 1038. +3
The metallization consists of contacting the antibody with a suitable ruthenium salt, such as ruthenium trichloride, in a buffered solution. Buffers that can be used include potassium acetate, sodium bicarbonate and trihydroxyethylamine (Tris).

適切なもう一つの方法としては、抗体のクロムによる直
接金属化がある。クロム放射性核種は溶液中で放射性核
種のクロム酸塩、例えばクロム酸ナトリウムもしくはカ
リウムと抗体とを混合することにより導入することがで
きる。Another suitable method is direct metallization of antibodies with chromium. The chromium radionuclide can be introduced by mixing the antibody with a chromate salt of the radionuclide, such as sodium or potassium chromate, in solution.

他の情況の下では、抗体をまず放射性核種を受入れるよ
うに４ヒ学的に変性させ、次いで該核種と反応させるこ
とができる。例えば、抗体内のジスルフィド基を還元し
て、−５−Ｍまたは−５−Ｍ−５基（ただし、Ｍは放射
性核種である）を形成することが回前である。例身ば、
ジスルフィド基をジチオスライドールによって還元して
、まずチオール基を形成することができ、該チオール基
は適当な金庫イオン、例えば酸化物もしくは塩型の水銀
、鋼、亜鉛、鉛またはカドミウムのイオンと反応を生じ
得るものである。Under other circumstances, the antibody can first be chemically modified to accept the radionuclide and then reacted with the radionuclide. For example, it is common to reduce a disulfide group within an antibody to form a -5-M or -5-M-5 group, where M is a radionuclide. For example,
A disulfide group can be reduced by dithiothreidole to first form a thiol group, which is then reacted with a suitable safe ion, such as ions of mercury, steel, zinc, lead or cadmium in oxide or salt form. This can cause

本発明において使用することのできる放射性核種は多座
配位型キレート化剤と錯体を形成するもの、もしくは適
当な条件下で抗体と直接結合するものである。放射性核
種は、安全に投秦できかつ安全に人体内に導入し得る半
減期並びに他の放射特性を有するものとして選ばれる。Radionuclides that can be used in the present invention are those that form a complex with a multidentate chelating agent, or those that bind directly to antibodies under appropriate conditions. The radionuclide is selected to have a half-life and other radiation properties that allow it to be safely delivered and safely introduced into the human body.

多数の放射性核種が人体内で使用するために研究されて
きており、これらは本発明において有用であろう。これ
らは以下のように分類することができる。A number of radionuclides have been investigated for use within the human body and would be useful in the present invention. These can be classified as follows.

ポルフィリン（式Ｓ）、クラウンエーテル（式乙）およ
びクリプタンド（式７）キレート化剤が＋−酸化状態を
とる放射性核種の結合に対して最モ有用テアル。例エバ
、１９５ｍｐｔ、ｓ　’Ｎｆ、５７ＣＯ，＋０５Ａ、１
６７Ｃｕ　　および５２Ｍｎ　　はその＋２酸化状態に
おいて安定な錯体を形成する。Porphyrins (Formula S), crown ethers (Formula B), and cryptand (Formula 7) chelators are the most useful for the binding of radionuclides in the +-oxidation state. Example Eva, 195mpt, s'Nf, 57CO, +05A, 1
67Cu and 52Mn form a stable complex in their +2 oxidation state.

式／〜Ｓおよび９〜／２のキレート化剤は＋３酸化状態
をとる放射性核種と安定な錯体を形成する。＋３酸化状
態において安定な錯体を形成する放射性核種の中には以
下のようなものがある。即ち、５２Ｆｅ、　　Ｎ１．ｎ
１＋４５ｍ、、　、　９９ｍｙｃ、　６８Ｇａ１６７Ｇ
ａ、　　＋　６９ｖｂ　、　　５７ｃ０．１６７Ｔｍ１
１６６丁□、１４６Ｇｄ１１５７Ｄｙ１９５ｍＮｂ、　
　＋０３ＲＬｌ、　　９７Ｒｕ１９９Ｒｈ、　　ＩＱｉ
ｍＲｈ。Chelating agents of formulas /˜S and 9˜/2 form stable complexes with radionuclides in the +3 oxidation state. Among the radionuclides that form stable complexes in the +3 oxidation state are: That is, 52Fe, N1. n
1+45m, , 99myc, 68Ga167G
a, +69vb, 57c0.167Tm1
166 tons□, 146Gd1157Dy195mNb,
+03RLl, 97Ru199Rh, IQi
mRh.

および２０　＋　７１である。カテコール基を有するキ
レート化剤（式９〜／、２）は生体内において高い移動
性を有する放射性核種と共に使用するのに特に適してお
り、特に５２．ｅ　　などの鉄の放射性核種が適して（
・る。　　　　　　　″ｉ 抗体に直接結合させ得る放射性核種は２０，３Ｈ，１１
９７Ｈ，、＋０５Ａ、　、　２０３Ｐｂ、　９７Ｒｕ、
　１０３Ｒｕ、９９Ｒｈ１１０１ｍＲｈオヨヒ４８Ｃ「
ヲ含む。and 20 + 71. Chelating agents having catechol groups (formulas 9-/, 2) are particularly suitable for use with radionuclides that have high mobility in vivo, especially 52. Iron radionuclides such as e are suitable (
・Ru. ``i Radionuclides that can be directly bound to antibodies are 20,3H,11
97H,, +05A, , 203Pb, 97Ru,
103Ru, 99Rh1101mRh Oyohi 48C
Including wo.

最も適した放射性核種は、約Ｓ時間〜Ｓ日の範囲の半減
期を有し、／θ０−＋０θにｅＶの１囲のエネルギーの
γ−線を放出するものである。The most suitable radionuclides are those that have half-lives ranging from about S hours to S days and emit gamma-rays at energies in the range of eV at /θ0-+0θ.

現時点においては明らかに理解され得な℃・理由のため
に、肺瘍抗扉に対する個々の単クロン（モノクロン）抗
体のいくらかは直接的全膨化に抵抗する。かくして、こ
のルートにより放射性核種を取入れるためには、特定の
抗体を注童深く選択する必要がある。従って、今のとこ
ろまず抗体にキレート化剤を結合させ、次いで放射性核
種との錯体を形成するという、より柔軟性ある方法を利
用して、抗体に放射性核種を結合することが好ましい。For reasons that cannot be clearly understood at this time, some individual monoclonal antibodies to lung tumor anti-doors resist direct expansion. Thus, incorporation of radionuclides by this route requires careful selection of specific antibodies. Therefore, it is currently preferred to attach a radionuclide to an antibody using the more flexible method of first attaching a chelating agent to the antibody and then forming a complex with the radionuclide.

この点に関し、放射性核種として　　Ｉｎ　（Ｔ％二２
．３日）を使用して、キレート化剤としてのＤＴＰＡと
結合することが好ましい。In this regard, In (T%22
．． 3 days) is preferably used to combine with DTPA as chelating agent.

本発明の方法は１、一般に腫瘍関連抗原に対する単クロ
ン抗体を使用して腫瘍を検出するために使用することが
できる。ＣＥＡに加えて、黒色腫関連抗原、α−フェト
−プロティン、フェリチン、ヒトコリオゴナドトロピン
、グリシン酸亜鉛標識物、プロスタチック酸ホスファタ
ーゼ（ＰＡＰ）は、例えば前述のように所定の単クロン
抗体の生産を刺激するための免疫原として使用すること
ができる。実際の使用の際には、適当な非軽口的溶液中
の標識抗体が磨者内に注入される。十分な時間の軽過後
、息者は光により走査（ホトスキャン）されて、腫瘍お
よび／またはその転移体の１種の存在を示す局所的放射
能を有するあらゆるサイトを検出する。The methods of the invention can be used to detect tumors, generally using monoclonal antibodies directed against tumor-associated antigens. In addition to CEA, melanoma-associated antigens, alpha-feto-protein, ferritin, human choriogonadotropin, zinc glycinate conjugate, and prosstatic acid phosphatase (PAP) can be used to enhance the production of certain monoclonal antibodies, e.g., as previously described. Can be used as an immunogen for stimulation. In actual use, the labeled antibody in a suitable non-toxic solution is injected into the polisher. After sufficient time of relief, the breath is scanned with light (photoscanning) to detect any sites with local radioactivity indicating the presence of the tumor and/or one of its metastases.

１２５：およびＮ＋、ｎ　で標識されたＣＥＡに対する
単クロン抗体を用いて行った以下の実験は、ヨウ素標識
した抗体による方法と比較して、本発明による腫瘍像造
影にとって、キレート結合した放射性核種で標識した単
クロン抗体の使用の有利さを証明している。The following experiments performed using a monoclonal antibody against CEA labeled with 125: and N+,n demonstrate that chelated radionuclides are useful for tumor imaging according to the present invention compared to methods using iodine-labeled antibodies. The advantage of using labeled monoclonal antibodies has been demonstrated.

／　放射性標識した抗−ＣＥＡの調製 Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ、　Ｉｎｃ、、（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ
、　Ｃａ、）から入手できる単り四ン抗−ＣＥＡを、Ｂ
ｏｌｔｏｎ　＆　Ｈｕｎｔｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ
、、　／　３３　ｅ　Ｓ　２９−３９　（／９７３）］
の方法を用いて、　　１　で標識した。生成物を５ｅｐ
ｈａｄｅｘ　　Ｇ　−，２３カラムに通したところ、最
終物質はの５％より少ない遊離ヨウ素を含んでいた。/ Preparation of Radiolabeled Anti-CEA Hybritech, Inc., (La Jolla
A single anti-CEA available from B.
Olton & Hunter (Biochem, J
,, / 33 e S 29-39 (/973)]
1 using the method described above. 5ep of product
When passed through a hadex G-,23 column, the final material contained less than 5% free iodine.

放射性標識した単クロン抗体の結合はセファロースに結
合した馬抗−マウス抗体についてｇｏ％より犬であり、
セファロースに結合したＣＥＡについては７３％より大
であった。Binding of radiolabeled monoclonal antibodies was % higher than that for horse anti-mouse antibodies conjugated to Sepharose;
It was greater than 73% for CEA bound to Sepharose.

Ｋｒｅｉｃａｒｅｋ　＆　Ｔｕｃｋｅｒ　［Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ　ａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ　Ｃ０ｒＴ’ｒｎＬＩｎｉＣａｔｆＯｎＳ＋
　　７７　ｅ３ｇ／（／９７？）］の方法に従って、キ
レート化剤として複合ＤＴＰＡを用いて、同じ単りロン
抗−ＣＥＡを＋＋１．ｎで標識した。反応生成物を５ｅ
ｔ）ｈａｄｅｘ　　Ｇ　−７！；カヲムに通すことによ
り精製した。抗原結合は１２５１　　で標識した抗体の
示す値に匹敵した。標識工程は、ＣＥＡで滴宇すること
により決定された未標識抗体と比較して、抗体に対する
アフィニティ一定数にａ　には影◆を与えなかった。Kreicarek & Tucker [Bioch
chemical and biophysical Re5
search C0rT'rnLIniCatfOnS+
77 e3g/(/97?)] using complex DTPA as the chelating agent, the same monomer anti-CEA was injected with +1. Labeled with n. The reaction product is 5e
t) hadex G-7! ; It was purified by passing it through Kawom. Antigen binding was comparable to that of 1251-labeled antibodies. The labeling step did not affect the affinity constant for the antibody compared to the unlabeled antibody as determined by incubation with CEA.

標識した抗−ＣＥＡ抗体の生体外安定性は以下のように
して決められた。即ち、該物質の一部を無菌化標準塩水
（ｕ、ｓ、ｐ、）を含む非経口溶液中にて、３７℃で７
２時間恒温保持し、遊離放射性核種をクロマトグラフィ
ーで測定した。抗体溶液をＢａｋｅｒアルミナ１Ｂスト
リップ上に点滴し、５０％水性アセトン中で展開させた
。タンパクの結合した放射性核種は原点に残り、一方遊
離放射性核種は移動する。淵ｅ期間終了稜、放射性ヨウ
素標識された物質は遊離ヨウ素の存在による放射能３％
未満を示した。９℃での保存はこれを５０％だ１１ け滅じた。同様な条件下では、Ｉｎ抗−ＣＥＡは同様に
匹敵する安定性を示した。The in vitro stability of the labeled anti-CEA antibody was determined as follows. That is, a portion of the substance was placed in a parenteral solution containing sterile standard saline (u, s, p,) at 37°C for 7 days.
The temperature was kept constant for 2 hours, and free radionuclides were measured by chromatography. Antibody solutions were dripped onto Baker alumina 1B strips and developed in 50% aqueous acetone. Protein-bound radionuclides remain at the origin, while free radionuclides migrate. At the end of the Fuchi e period, the radioactive iodine-labeled material has a radioactivity of 3% due to the presence of free iodine.
showed less than Storage at 9°C destroyed this by 50%. Under similar conditions, In anti-CEA showed comparable stability as well.

コ　ヌードマウス中における分布の研究放射性標識され
た単りロンマウス抗−ＣＥＡの組織分布の研究を、ヒト
結腸腫瘍０．３−１．Ｏｆを有するヌードマウスについ
て行った。このマウスの体重は７７〜２ｇｆ（平均約２
３２）の範囲であった。腫瘍はＣＥＡ−生産ヒト結腸腺
癌細胞を含有するミ／スミートの皮下□注入により発生
させた。分布の研究は３週間俵まで行った。λつの実験
を行った。第７に、７９匹の動物を４−Ａ匹か（約０．
３μを抗体）の０．３マイクロキユーリーおよび対象と
して担体を含まない６７Ｇａ　　シトレート、公知の非
−特異的ヒト結腸腫瘍造影剤を含有する無菌化標準塩水
（ｕ、ｓ、ｐ、）溶液θ。／−を静脈内注入した。正確
さを確保するために１０θμｌＨａｍＮｔｏｎ　　シリ
ンジを使用して麻酔せずに注入を行った。投与物が部分
的に尾に侵入した動物はこの研究から排除した。注入に
続き、マウスを＃′菌代謝ケージに入れた。該ケージは
尿および糞便を集めるために高い金網の床を有している
。この床の下には無菌化ダ×ｑガーゼを、動物によりか
み切られないように詰めた。随意に無菌化食物および水
を与えて約＋、４ｔ℃（ｌＬｔθ’Ｆ　）の清潔な家で
飼育したマウスはトレーサーの注入後の’ｌ、２’ｌ、
ｌＩｇおよび７２時間において各グループ毎に殺された
。Tissue distribution studies of radiolabeled single mouse anti-CEA in human colon tumors 0.3-1. The experiment was carried out on nude mice with Of. The weight of this mouse is 77-2 gf (about 2 gf on average).
32). Tumors were generated by subcutaneous injection of Mi/Smeat containing CEA-producing human colon adenocarcinoma cells. Distribution studies were conducted up to 3 weeks after bales. λ experiments were conducted. Seventh, 79 animals were divided into 4-A (approximately 0.
A sterile standard saline (u, s, p,) solution θ containing 0.3 microcuries of 3μ antibody) and carrier-free 67Ga citrate, a known non-specific human colon tumor contrast agent, θ. /- was injected intravenously. Injections were performed without anesthesia using a 10θ μl HamNton syringe to ensure accuracy. Animals in which the dose partially penetrated the tail were excluded from this study. Following injection, mice were placed in #' bacterial metabolic cages. The cage has a raised wire mesh floor to collect urine and feces. Sterilized Daxq gauze was stuffed under this floor to prevent it from being chewed by animals. Mice housed in a clean house at approximately +, 4t°C (lLtθ'F) with sterile food and water ad libitum showed 1', 2'l, 2'l,
lIg and killed in each group at 72 hours.

マウスはエーテルで麻酔され、匍液試料が直接心臓穿刺
することにより得られた。次いでマウスは頚部脱臼によ
り殺された。一連の解剖中に、腫瘍、肝瞼、腎臓、筋肉
、心臓、肺、大腿骨、牌臓を取出し、水中で２度、７０
％ホルマリンで７度洗浄し、ふき取り乾燥し、分析天秤
で湿潤重量を測定した。無傷前および腸管をも取出し、
秤量した。血液、筋肉および骨は、全器官の取込み量の
計算に対して、夫々全体重の７％、ｌＩＯ％および７０
％であると見積もられた。他の器官は全体と２５ して秤量した。放射症は、　　Ｉ　の、２７〜３５にｅ
Ｖフォトビークおよび　Ｇａ　　の９３にｅＶフォトぎ
−りに亘り作動する窓を有する自動ガンマ線井戸型カウ
ンタで行った。このカウンタは最低放射能レベルの試料
に対する統計的意義を得るために７０分もしくは１０Ｏ
万力ウント以上を除くようにプログラムされている。窓
セツティング間における同位体放射能の逆寄与並びに・
臂ツクグラウンドに対する補正は調製源を使用し、連立
方程式を解くことにより行った。次いで、試料中の放射
能は注入物質の標準と比較され、給米を％注入量／２お
よび％注入量／器官によって表した。腫瘍対組織比を％
投与量／を表示−のデータから計算した。Mice were anesthetized with ether and fluid samples were obtained by direct cardiac puncture. Mice were then killed by cervical dislocation. During a series of dissections, the tumor, liver eyelids, kidneys, muscles, heart, lungs, femur, and spleen were removed and submerged twice in water for 70 minutes.
% formalin seven times, wiped dry, and the wet weight was measured using an analytical balance. The intact anterior and intestinal tracts were also removed;
Weighed. Blood, muscle, and bone account for 7%, lIO%, and 70% of total body weight, respectively, for whole organ uptake calculations.
It was estimated that %. Other organs were weighed as a whole. Radiation sickness is e in I, 27-35.
It was performed in an automatic gamma well counter with a V photobeak and a window operating over the 93 eV photobeak of Ga. This counter should be run for 70 minutes or 100 minutes to obtain statistical significance for samples with the lowest radioactivity levels.
It is programmed to eliminate vise unds and above. Inverse contribution of isotope radioactivity between window settings and
Correction for the arm ground was performed using prepared sources and by solving simultaneous equations. The radioactivity in the samples was then compared to a standard of injected material and the yield was expressed as % injected volume/2 and % injected volume/organ. Tumor-to-tissue ratio as %
Dose/was calculated from the data shown.

臓器、尿および便中の放射能ｍ全注入量の百分率として
計算した。Radioactivity m in organs, urine and faeces was calculated as a percentage of the total injected dose.

第２の研究では、同じヒト結腸癌から生長した腫瘍を有
する３７匹のヌードマウスを各７〜ｇ匹からなるＳつの
群に分けた。７つの群を対照とし、／マイクロキューリ
ーの　　１　ヒト血清アルブミン（θ、θ／■ＨＳＡ）
　　および３マイクロキユーリーの担体を含まない＋＋
＋、ｎシトレー）　＜０．０．　／　ｓｑシトレート）
を同時にｔ　、ｖ、　　で注入し、注入後ｔＩｇ時間に
おいて殺した。残りの９群には、３マイクロキユーリー
の１１１．ｎ標識抗−ＣＥ　Ａ　（／ｊ　ｐ？抗体）お
よびＳマイクロキューリーの担体を含まない６７Ｇａ　
　シトレートを同時に注入した。これらグ群を夫々注入
後’Ｉ、２１Ｉ、４℃ｇおよび７２時間において殺した
。組織解剖、放射線検定用試料調製、計数法および計算
は上記のように実施した。In a second study, 37 nude mice bearing tumors grown from the same human colon cancer were divided into S groups of 7-g each. Seven groups were used as controls and microcuries of 1 human serum albumin (θ, θ/■HSA)
and 3 microcuries carrier-free++
+, n citley) <0.0. /sq citrate)
were simultaneously injected at t,v, and killed at tIg time post-injection. The remaining 9 groups received 3 microcuries of 111. n-labeled anti-CE A (/j p? antibody) and S microcurie carrier-free 67Ga
Citrate was injected at the same time. These groups were sacrificed at 'I, 21I, 4°C g and 72 hours after injection, respectively. Tissue dissection, sample preparation for radiological assays, counting methods and calculations were performed as described above.

Ｎｊ、ｎの場合、分光器は’Ｉ　ＯＫｅＶ窓（２１０〜
２ＳＯにｅＶ　）を使用してＪＩＩ７にｅＶフォトビー
クを割数するようにセットされ、一方　Ｇａ　は９３に
ｅＶフォトビークを重合せる３０にｅＶ窓を用いて計数
した。このようなセツティングは結果として７０％より
小さな放射能の逆寄与を与えた。For Nj,n, the spectrometer has an 'I OKeV window (210 ~
2SO (eV) was set to divide the eV photobeak to JII7, while Ga was counted using a 30 eV window that superimposed the 93 eV photobeak. Such a setting resulted in a negative contribution of radioactivity of less than 70%.

第１図に示したように、腫瘍中に局在するＮ１．ｎ抗−
ＣＥＡ濃度は実験期間を辿じて定常的に増加した。注入
量の２３％が７２時間までに蓄積され、この結果は、こ
の濃度がψに遅い試料採取を行った場合よりも一層高い
ものであることを示唆する。As shown in Figure 1, N1. n anti-
CEA concentration increased steadily over the course of the experiment. 23% of the injected dose was accumulated by 72 hours, a result that suggests that this concentration is even higher than with late sampling at ψ.

逆に、血液量の濃度は実験期間全体を通して減少した。Conversely, blood volume concentration decreased throughout the experimental period.

肝臓は９時間における急速な取込みを示し、次いで殆ど
変化しない期間を経て７２時間まで増加した。他の組織
は実験した期間に亘り殆ど変化しなかった。The liver showed rapid uptake at 9 hours, followed by a period of little change before increasing up to 72 hours. Other tissues changed little over the period of the experiment.

腫瘍中の６７ａａ　濃度は実験中ずつと殆ど一定に維持
され、７２時間後における　　１ｎ抗−ＣＥＡの濃度の
約％であった。血液中の６７Ｇａ　　濃度は定常的に減
少し、一方肝臓中の濃度は　　Ｉｎ標識抗体と幾分類似
するノｆターンを示した。筋肉中の６７（！ｈａ　　＊
度は４ｔｇ時間まで−少し、次いで一定となり、一方骨
中濃度は全期間中一定に保たれた。The 67aa concentration in the tumor remained nearly constant throughout the experiment and was approximately % of the concentration of 1n anti-CEA after 72 hours. The 67Ga concentration in the blood decreased steadily, while the concentration in the liver showed a no-f turn, somewhat similar to the In-labeled antibody. 67 (! ha *
The degree was slightly - then constant until 4 tg hours, while the bone concentration remained constant during the whole period.

腫瘍中のヨウ素の量は９時間でピークに達し、の弗りの
期間中を通して不知側に減少し、７２時間においてはわ
ずかにＮｌ、ｎの／／１０であった。The amount of iodine in the tumor peaked at 9 hours, decreased steadily throughout the period of swelling, and was only 1/10 of Nl,n at 72 hours.

その時点で腫瘍中の′６７Ｇａ　の量は　　１　の−倍
であった。すべての組織中の１２５１　　の計数率は９
時間の時点における最大値から急速に減少し、いくつか
の場合には、ｌＩｇ時間までにバックグラウンドレベル
に達する。At that time, the amount of '67Ga in the tumor was 1-fold. The counting rate of 1251 in all tissues is 9
It decreases rapidly from its maximum value at time and in some cases reaches background levels by time IIg.

排出データ（第２図）は２ｑ〜７２時間の間で尿中の　
　１０の定常的増加を示し、注入量の７９％に当る最大
値に達する。便中０１０Ｉｎ濃度は２４ｔおよびりざ時
間においてｔまは一定に保たれ、次いで７２時間におけ
る。７７％まで増加した。一方、腸管内の量は全実験期
間中比較的一定に保たれ、投与量の５％を越えることは
なかった。The excretion data (Fig. 2) shows the amount of
It shows a steady increase of 10 and reaches a maximum value which corresponds to 79% of the injected volume. The fecal 010In concentration remained constant at 24 hours and then at 72 hours. It increased to 77%. On the other hand, the amount in the intestinal tract remained relatively constant during the entire experimental period, never exceeding 5% of the administered dose.

６７Ｇａ　排出ノリーンはＮｌ、ｎのノ４ターンに幾分
似ているが、しかしく７２時間においては）腸管並びに
便中では　　Ｉｎについて観察された値よりもトレーサ
ーの量は大であり、尿中では逆に似かった。67Ga excretion is somewhat similar to that of Nl,n, but at 72 hours) the amount of tracer is greater in the intestinal tract and in the stool than that observed for In, and in the urine. It was similar in reverse.

１２５１　　の放射能のほぼ１０％が初めの２ｑ時間内
に尿中に排出され、ｑｇ待時間でに７５％排出された。Approximately 10% of the 1251 radioactivity was excreted in the urine within the first 2 q hours, with 75% being excreted by the q g waiting period.

仙の１２５１　　の５％は便中に含まれていた。5% of Sen's 1251 was contained in the stool.

かくして、７２時間後に初めに注入した１２５１　　の
約ｇθ％が動物から排出された。尿中０１２５１　　の
クロマトグラフィーはその殆どがタンノ母り以外の何物
かと錯化された遊離１２５１　　であろうと思われる第
２の種を含む遊離ヨウ素であることを示した。Thus, approximately gθ% of the originally injected 1251 was excreted from the animal after 72 hours. Chromatography of urinary 01251 showed that most of it was free iodine, including a second species, likely free 1251 complexed with something other than tanno-hydrogen.

第３図はり３時間における　　１ｎ標識抗−ＣＥＡのデ
ータを、ＩＮ、ｎシトレートおよび１２５１　Ｈ９Ａと
比較して示すものである。ＩＮ、ｎシトレートは抗体か
ら分解されるかもしれない何等かのインジウムに対する
対照として使用され、他方１２５ＩＨ５＾は非特異的タ
ンノ？りの対照として使用された。Figure 3 shows data for 1n labeled anti-CEA at 3 hours compared to IN, n citrate and 1251 H9A. IN,n citrate is used as a control for any indium that may be degraded from the antibody, while 125IH5^ is a non-specific tanno? was used as a control.

１１　ｊ　Ｉｎ抗−ＣＥＡはＩＮ、ｎシトレートとは著
しく異った分布パターンを示し、１０倍という高い効率
で腫瘍中に濃縮された。仲の組織によるこれら２種のト
レーサーの増込みも全く異っていた。腫瘍に対する１２
５ｔ　Ｈ８＾の集中は　　１ｎ抗−ＣＥＡのコ０％であ
るが、依然として１２５１抗−ＣＥＡよりも３０％以上
大きい。腫瘍のない組織中における１２５ｔ　ＨＳ＾　
の分布も１１１．ｎ抗−ＣＥ＾生成物の分布とは著しく
異っている。　　ｌ　Ｈ５＾　（長い間、安宇なヨウ素
化タン・ぐりであると考λられていた）はｌＩｇ時間ま
でに殆ど６０％（４ｔ３％は尿中）が２５ 排出されることを示し、　　１　抗−ＣＥＡも尿中に見
出されるという上記発見と殆ど一致した。尿中の両分は
たぶん遊離ヨウ素であろう。11 j In anti-CEA showed a markedly different distribution pattern than IN, n citrate and was concentrated in tumors with a 10-fold higher efficiency. The recruitment of these two types of tracers by neighboring tissues was also completely different. 12 against tumors
Although the concentration of 5t H8^ is 0% that of 1n anti-CEA, it is still more than 30% greater than that of 1251 anti-CEA. 125t HS in non-tumor tissue
The distribution of is also 111. The distribution of the n anti-CE product is markedly different. It has been shown that almost 60% of lH5^ (long considered to be a cheap iodinated acid) is excreted by lIg time (4t3% in the urine), -Almost consistent with the above finding that CEA is also found in urine. Both parts of the urine are probably free iodine.

腫瘍／組織比（第り図）は血液以外のすべての組織につ
いて、Ｎｊ、ｎ抗−ＣＥＡが”Ｇａ　　より優れている
ことを示し、血液については６７Ｇａ　　と殆ど同じで
ある。い（つかの組織においては見損は上１１　ｌ　Ｉ
ｎおよび６７Ｇａ　　ｒ、りも好ましいように考えられ
るか、　　ｌ　抗−ＣＥＡＯ比は誤解され易い。The tumor/tissue ratio (Fig. In this case, the mistake is above 11 l I
Although n and 67Ga r are also considered favorable, the l anti-CEAO ratio is easily misunderstood.

というのは　１２５．　　抗−ＣＥＡに関する高い比は
腫瘍中における高い局在化によるのではなく、むしろ正
常組織中における１２５１　　濃度が低いこ之に起因す
るからである。That is 125. The high ratio for anti-CEA is not due to its high localization in tumors, but rather to the low concentration of 1251 in normal tissues.

前述の実験から　１２５．　　抗−Ｃ［＾は明らかに腫
瘍部分特定化剤としては不適当である。急速かつ高度の
脱ハロゲン化は腫瘍トレーサー濃度を減少させ、血液バ
ックグラウンドを高くシ、熟練した差引き技法を用いる
ことなしに造影に際して使用することを制限する。事実
、７コ時間において、腫瘍はダラム当たりの基準で非特
異的　Ｇａ　　の量を１２５１　　の２倍含んでいる。From the above experiment 125. Anti-C[^ is clearly unsuitable as a tumor localization agent. Rapid and high dehalogenation reduces tumor tracer concentration and produces a high blood background, limiting its use in imaging without skilled subtraction techniques. In fact, at 7 hours the tumor contains twice the amount of non-specific Ga on a per duram basis.

更に、腫瘍／血液比はヨウ素化抗体よりも６７Ｇａ　　
の方が良好である。Furthermore, the tumor/blood ratio is lower than that of iodinated antibodies.
is better.

結腸の腺癌造影のためＫ　　Ｇａ　の使用が不十分であ
ると考えられる場合には、Ｍａｃｈ等［Ｎ、εｎｇ、Ｊ
。If the use of K Ga is considered insufficient for colon adenocarcinoma imaging, Mach et al. [N, εng, J
.

Ｍａｄ、＋　３θ３．！；−７０（／９ｇｏ）〕の経験
した難点が容易に説明される。　　置　を使用したこれ
らのデータは明らかに以下のことを証明している。即ち
　１５１．　　を使用した場合において差引き技法がな
い場合には、極めて大量の　　１　標識物質を投与して
、効果的な造影のために必要な腫瘍上での集中化を達成
しなければならない。このことは、結果として患者に３
日という物理的半減期ｉ１″′ と１３１１　　のＡ　Ｏｇ　ＫａＶというβ−成分に基
く極めて高い放射線量を与えることになる。Mad, +3θ3. ! ;-70(/9go)] is easily explained. These data clearly prove that: That is, 151. When subtractive techniques are used, extremely large amounts of 1 labeled material must be administered to achieve the concentration on the tumor necessary for effective imaging. This results in the patient having 3
This results in an extremely high radiation dose based on the β-component of A Og KaV of 1311 days and a physical half-life i1''' of 1311 days.

逆に、腸瘍に取込まれる　　１ｎ抗−ＣＥＡの注い物性
がより少量の放射性薬剤の注入を可能とし、一方造影性
が改良されかつ患者に対する放射線量が最小化される。Conversely, the pourability of 1n anti-CEA into the intestinal tumor allows for the injection of smaller amounts of radiopharmaceutical, while improving contrast quality and minimizing radiation dose to the patient.

＋Ｎ、ｎ抗−ＣＥＡにより形成される腫瘍対パックグラ
ウンド比はまったく造影の目的に必要とされる範囲内に
ある。これは大量の放射性核種が腫瘍中に局在化される
からである。The tumor-to-ground ratio produced by +N,n anti-CEA is well within the range required for imaging purposes. This is because large amounts of radionuclides are localized within the tumor.

更に、このデータは腫瘍が一担他の組織中にを込まれる
かもしくは付着した放射性標識物を取込むことを示唆す
る。Furthermore, this data suggests that tumors may take up radiolabels that are embedded or attached to other tissues.

１１ 各マウスは、Ｉｎｎ標識−ＣＥＡの注入徒の４１、２グ
、グざおよび７．２時間の時点で、ρｈｏｇａｍＨＰ　
Ａｎｇｅｒ　　ガンマカメラ、を用いて光走査に付され
た。ｌＩｇ時間までに、腫瘍は差引き技法に軸る必要性
なしに、十分に造影された。７２時間において、腫瘍の
造影力はより一層憂められた。11 Each mouse was injected with Inn-labeled-CEA at 41, 2, 7 and 7.2 hours.
Optical scanning was performed using an Anger gamma camera. By time IIg, the tumor was well imaged without the need to resort to subtraction techniques. At 72 hours, the contrast intensity of the tumor was even more alarming.

直接標識された、単クロン抗体の生体内安定性およびそ
の結果としての腫瘍造影における使用に対する安定性は
　＋０３Ｒ，で標識した単りロ／抗−黒２５ 色原を使用し、　　１　で標識した同一の抗体と比較し
た以下の実験によって証明される。The in vivo stability of directly labeled monoclonal antibodies and their consequent stability for use in tumor imaging was demonstrated using a monoclonal antibody labeled with +03R, using a monoclonal antibody labeled with +03R, and an identical antibody labeled with 1. This is evidenced by the following experiment compared with the antibody.

／１０３Ｒｕ標識抗−黒色腫の調製 １０′ｘ′ＲＲｕＣ１３（Ｎｅ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃ
ｌ’ｅａｒ　Ｉｎｃ、から入手）の水性溶液２−〇μｌ
　を、飽和酢酸カリウム溶液／θ０　μｉ　　に添加し
た。ｐＨを、／　ＯＭＮａＯＨ７０μＩ　で！；、３　
Ｋ　８１節した。この放射性核種の溶液を、マウス抗−
黒色腫抗体の０．３μＶμｌ溶液ＳＯＯμｌ　に添加し
、混合物を室温にて／時間恒温保持した。ｐ）ｌを／　
Ｑ　ＭＮａＯＨ２０μｌ　添加して７．−に調節し、処
方物を室温にて一夜保存した。未結合金属は、反応混合
物を５ｓｐｈａｄｓｓｘ　　Ｇ　−！；θカラムに通し
、ｐ’Ａ７．２の燐＊ｍ緩衝塩水で溶出することにより
、抗体結合金属から分瞭された。タン・母り含有画分を
集め、マウスにおける生体内試験のためにプールした。Preparation of /103Ru labeled anti-melanoma 10'x'RRuC13 (Ne EnglandNuc
2-0 μl of an aqueous solution of
was added to a saturated potassium acetate solution/θ0 μi. Adjust the pH with 70 μI of OMNaOH! ;,3
K 81 verses. This radionuclide solution was added to the mouse anti-
A 0.3 μV μl solution of melanoma antibody was added to SOO μl and the mixture was incubated at room temperature/hour. p)l/
Add 20 μl of Q MNaOH7. - and the formulation was stored at room temperature overnight. Unbound metal is added to the reaction mixture by 5sphadssx G-! was separated from the antibody-bound metal by passing through a θ column and eluting with phosphorus*m buffered saline of p'A 7.2. Tan and motherly containing fractions were collected and pooled for in vivo testing in mice.

コ　正常マウス中における分布の研究 組織中の分布の研究は、正常なりＡｌ１−Ｃマウスにつ
いて行い、前記方法に従って調製した１０’Ｒｕ１ｌｌ
ｉｌ抗−黒色腫および抗−ＣＥＡを標識するために上記
した同じ方法で調製した１２５１　　標識抗−黒色腫を
使用した。Study on distribution in normal mice The study on distribution in tissues was conducted on normal and Al1-C mice, and 10'Ru1ll prepared according to the above method was used.
1251 labeled anti-melanoma prepared in the same manner as described above was used to label il anti-melanoma and anti-CEA.

マウスをコ群に分け、夫々１２５Ｉ標識および１０３Ｒ
ｕ標識抗体で静脈内注入した。マウスなダ、λＩＩ、４
Ｉｇ、７２および９６時間後に殺し、解剖し、単りロン
抗−ＣＥ＾に関する研究について上述したように、器官
の放射卵を測定した。１′１およびｔｏｅＲ，の組織中
における分布を以下の表に示す。Mice were divided into groups and labeled with 125I and 103R, respectively.
Intravenously injected with u-labeled antibody. mouse na da, λII, 4
Animals were sacrificed after 72 and 96 hours, dissected, and organ radiation was measured as described above for the studies with Ig, anti-CE^. The distribution of 1′1 and toeR in tissues is shown in the table below.

表中のデータは、丁度１２５１標識抗−ＣＥＡに１２５ ついて起こったように、　　　Ｉ標識抗−黒色腫は急激
に脱ハロゲン化され、−Ｊ　　、Ｒｕ　　標識抗−黒色
腫は安定であったことを示している。これらの観測は以
下の事実により確かめられる。即ち、血液中の　　１濃
度は注入後９時間において極め比較的急速に血液中から
失われ、非腫瘍ら患宿主において予想されるように、肝
臓中に濃縮される。The data in the table demonstrate that the I-labeled anti-melanoma was rapidly dehalogenated and the -J,Ru-labeled anti-melanoma was stable, just as happened with the 1251-labeled anti-CEA. It shows. These observations are confirmed by the following facts. That is, 1 concentration in the blood is lost from the blood very relatively rapidly within 9 hours after injection and becomes concentrated in the liver, as would be expected in a non-tumor-affected host.

１０３Ｒｕ標識抗−黒色腫を注射したマウスに対する牌
臓および腎臓中の濃度も生体内安定性に一致する。Concentrations in the spleen and kidney for mice injected with 103Ru labeled anti-melanoma are also consistent with in vivo stability.

ＣＥＡ並びにいくつかの他の腫瘍関連抗原が腫瘍により
分泌もしくは放出されることは公知である。このような
場合においては、血液中もしくは他の組織中を循環する
抗原が標識抗体と結合することに起因するバックグラウ
ンド放射の発生は初めに未標識抗体を投与して循環抗原
と結合させることにより減することができる。これはま
た、標識抗体の肝臓による高い取込みを減する傾向を示
すであろう、適当な期間の経過後、標識抗体を添加し、
対象を゛光走査して局在化放射能のサイトを決定する。It is known that CEA as well as several other tumor-associated antigens are secreted or released by tumors. In such cases, the generation of background radiation due to antigen binding to labeled antibodies circulating in the blood or other tissues can be eliminated by first administering unlabeled antibodies and allowing them to bind to the circulating antigen. can be reduced. Adding the labeled antibody after a suitable period of time, which would also tend to reduce the high uptake of the labeled antibody by the liver,
The target is optically scanned to determine the site of localized radioactivity.

前記議論は放射性核種で標識した畦−〇争りロン抗体の
使用を強調したが、異った抗原決定因子に対して２また
はそれ以上の標識単クロン抗体を使用することも本発明
の範囲内にはいる。異った抗体は他の抗体の抗原に対す
る結合を妨害しないように選ばれる。多数の非妨害性標
識抗体を使用することにより、腫瘍造影力は強化される
。なぜならば、抗原は標識抗体に対する高い容置を有す
るであろうからである。複数の抗体の使用は、腫瘍関連
抗原が低濃度で存在するような腫瘍の造影に対して特に
有用である。Although the above discussion has emphasized the use of radionuclide-labeled monoclonal antibodies, it is also within the scope of this invention to use two or more labeled monoclonal antibodies directed against different antigenic determinants. Enter. Different antibodies are chosen so as not to interfere with the binding of other antibodies to the antigen. By using multiple non-interfering labeled antibodies, tumor imaging power is enhanced. This is because the antigen will have a high capacity for labeled antibodies. The use of multiple antibodies is particularly useful for imaging tumors where tumor-associated antigens are present at low concentrations.

本発明の前記記載は現在のところ好ましい態様に係り、
他の変形は当栗者にとって明らかであることを理解すべ
きである。従って、本発明の範囲は特許請求の範囲のみ
によって限定されるものである。The above description of the invention relates to presently preferred embodiments;
It should be understood that other variations will be apparent to those skilled in the art. Accordingly, the scope of the invention is limited only by the claims that follow.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

第１ｒ１４は、１１１１．と１２５畳でラベルした抗Ｃ
Ｅ＾ならびに　　Ｇ自シトレーＦを、ひと結腸癌を感染
させたヌードマウスに注入した後の時間と、組織中の１
１１１ｎおよヒ１２５１）分布ナラヒに６７Ｇ／）分布
を比較して示すグツ７である。 第一図は、１１１１ｎ　と　　１７ベルし九抗ＣＥ＾と
６モ１シトレートの注入後、経過時間でヌードマウスか
ら＃潰された１１１−と１２５■　　ならびに４７Ｇ−
の量を示すグラフである。 ＠３図は、１１１．ｎと１２５１　　ラベルした抗ＣＥ
＾と、１１１．ｎ１／）レートと１２５１　　ラベルし
たひとアルラミンとを、その注入後ｌＩｔ時間において
ヌードマウス中の１１１．　ｎと１２５１の組織分布を
比較して示すグラフである。 第４ＩＩｉＩＩは、　　Ｉｎと　　ロラペルした抗ＣＥ
＾と”Ｇ吟）レートをヌードマウスに注入後、　　Ｉｎ
と１２５１　　の膿瘍／組礒比ｔ”ａ拳と比較し、時間
の□ 関数として示すグ→７である。 図面の浄書（内容に変更なし） ％旙事最／≧− 俗ｉ１人監 ■”　＆−ＣＥＡ　　　　Ｂｍ　ＪＪ九−ＣＥＡ口４−
　　シトレート　　　　　■／Ｎ　ヒトアルブミン／タ
シＥ、／’ オルニア 一イ・アベニュー２２００番 ％許庁隘宮　　殿 １、事件の表革 昭和５７年特許願第１８８９２１号 ３、Ｎｉ正をする者 事件との関係　　　出願人 名　称　　ハイブリチック　インコーポレーケ・ノド外
１名 ４、代理人The 1st r14 is 1111. and anti-C labeled with 125 tatami
The time after injection of E^ and G autocitre F into nude mice infected with human colon cancer and the amount of 1 in the tissue.
111n and 1251) distribution Narahi and 67G/) distribution are compared and shown in Gutsu 7. Figure 1 shows crushed 111- and 125- and 47-
It is a graph showing the amount of @Figure 3 is 111. n and 1251 labeled anti-CE
^ and 111. n1/) rate and 1251 labeled human aluramine in nude mice at lIt time after its injection. It is a graph showing a comparison of the tissue distributions of n and 1251. No. 4 III
After injecting ＾ and ``G Gin'' rate into nude mice, In
Comparing the abscess/hyperforme ratio of 1251 with t”a fist, it is □ shown as a function of time → 7. Engraving of the drawing (no change in content) &-CEA Bm JJ9-CEA mouth 4-
Citrate ■/N Human Albumin/Tashi E, /' Ornia 1st Avenue 2200% Administrative Office Administrative Office 1, Representation of the Case 1988 Patent Application No. 188921 3, Relationship with the case of the person doing the Ni correction Applicant name: Hybritic Inc. 1 person and 4 other agents

Claims (9)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）　　金属放射性核種が、直接に、°あるいはモノ
クロン抗体に結合したキレート化剤を介して結合してい
る腫瘍関連抗原に対するモノクロン抗体。(1) A monoclonal antibody against a tumor-associated antigen in which a metal radionuclide is bound directly or via a chelating agent bound to the monoclonal antibody. （２）　　キレート化剤が、ポリアミノカルデン酸、ポ
リアミノ（アルキレンリン）酸、ポリアミン、Ｉルフイ
リン、クラウンエーテル、クリプタンド、デスフェリオ
キサミンＢおよびその誘導体、エンテロバクチンおよび
そのカルプサイクリック類縁体から選ばれる特許請求の
範囲第１項記載のモノクロン抗体。(2) The chelating agent is selected from polyaminocardic acids, polyamino(alkylene phosphoric) acids, polyamines, I-lufilin, crown ethers, cryptands, desferrioxamine B and its derivatives, enterobactin and its calpcyclic analogs. Selected monoclonal antibodies according to claim 1. （３）　　キレート化剤が、次の式で表わされるｙｊ？
　ＩＪアミノカルボン酸である特許請求の範囲第一項記
載のモノクロン抗体。 式中、ＸはＯまたは整数、ｙは／またはコ、２は／〜７
の整数、Ｒは水素、または前記キレート化剤と抗体とを
結合している基、または放射性核種のキレート化剤の結
合定数に影響を与える基である。(3) The chelating agent is expressed by the following formula: yj?
The monoclonal antibody according to claim 1, which is an IJ aminocarboxylic acid. In the formula, X is O or an integer, y is / or co, 2 is /~7
R is hydrogen, or a group linking the chelator to the antibody, or a group that affects the binding constant of the radionuclide chelator. （４）　　ポリアミン（アル−キレンリン）酸が、Ｆ記
載で表わされる特許請求の範囲第一項記載のモノクロン
抗体。 轟 ＯＨＱ １０ ＯＨ 式中、ＸはＯまたは整数、ｙは／またはコ、２は／〜７
の整数、Ｒは水素、または前記キレート化剤と抗体とを
結合している基、または放射性核種のキレート化剤の結
合定数に影響を与える基である１、、・・(4) The monoclonal antibody according to claim 1, wherein the polyamine (al-kylene phosphoric) acid is represented by F. Todoroki OHQ 10 OH In the formula, X is O or an integer, y is / or K, 2 is /~7
R is an integer of 1, . （５）Ｒが、水素、メチル、−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４０ＣＨ２
ＣＯ２Ｈ、および−”６”４−Ａ（Ａはジアゾニウム塩
またはその前１ 躯体、または　−ＮＨ−Ｃ−ＣＨ２Ｌ　　（Ｌは結合の
際にから選ばれる特許請求の範囲第３項または第９項記
載のモノクロン抗体。 １(5) R is hydrogen, methyl, -CH2C6H40CH2
CO2H, and -"6"4-A (A is a diazonium salt or its precursor), or -NH-C-CH2L (L is selected from the following when bonding) Claim 3 or 9 Monoclonal antibody. 1 （６）ｘがＯであり、・Ｒカーｃ６Ｈ４−ＮＨ−ｃ−ｃ
Ｈ２Ｂ「テある特許請求の範囲第Ｓ項記載のモノクロン
抗体。(6) x is O, ・R car c6H4-NH-c-c
H2B: A monoclonal antibody according to claim S. （７）　　＋レ−）化剤が、＆ｌＪアミノカルボン酸テ
あである特許請求の範囲第Ｓ項記載のモノクロン抗体。(7) The monoclonal antibody according to claim S, wherein the +)-forming agent is &lJ aminocarboxylic acid. （８）　　キレート化剤が、エチレンジアミン四節４、
ρ−プロモアセトアミドソフェニル（エチレン）二）　
＋）ｏ四節酸）、／　−（ｐ−アミノ７エ二ル）−エチ
レンノアミノ四節醜およびノエチレントリアミン五酢酸
がら成る群から選ばれる特許請求の範囲第２項記載のモ
ノクロン抗体。(8) The chelating agent is ethylenediamine 4,
ρ-promoacetamidosophenyl(ethylene)2)
2. The monoclonal antibody according to claim 2, which is selected from the group consisting of +) o-tetrabutyric acid), / -(p-amino7enyl)-ethylenenoaminotetrabutyrate, and noethylenetriaminepentaacetic acid. . （９）放射性核種が、半減期夕時間〜３日のｒ＠放射体
であり、そのｒｔｓ放射のエネルギが／θ０〜グθθＫ
ｅＶである特許請求の範囲第ハコ、３．９、ｊｓ　ｉ　
７ｔたは３項記載のモノクロン抗体。 よび４５ｃｒから選ばれる特許請求の範囲第７、コ、３
、グ、５．Ａ、７、ｇｉたは９項記載のモノクロン抗体
。 （１υ　腫瘍関連抗原が、癌胚抗原、α−７エトプロテ
イン７エリチン、ひと絨毛性ゴナドトロピン、亜鉛グリ
シネートマーカー、グロスタチツクアシドホス７アター
ゼおよびメラノーマ関連抗原から選ばれる特許請求の範
囲第１、λ、３、ダ、Ｓ％乙、ワ、９または７０項記載
のモノクロン抗体。 （１２、特許請求の範囲第１、コ、３、グ、Ｓ、乙、７
、ｇ１９、／θまたは７７項記載の腫瘍関連抗原に対す
るモノクロン抗体の非経口投与用溶液を含む組成物。 ０３　　前記モノ、クロン抗体の一種以Ｅの混合物を含
む特許請求の範囲第１コ項記載の組成物。 （Ｊ４）　　ａ）腫瘍関連抗原“に対するモノクロン抗
体であって、該抗体に直接に結合し、あるいは該抗体と
結合しているキレート化剤を介して結合している放射性
核種を有するモノクロン抗体を含む非経口組成物をひと
患者に投与し、 ｂ）　この患者をホトスキャンして、放射性核種からの
放射線によって示される患者の体内の抗体局在部分を決
定することを特徴とする腫瘍の造影方法。 （国　モノクロン抗体が特許請求の範囲第１、コ、３、
＆、Ｉ　Ａ、７、ｇ、９、ＩＯ１／／Ｊ２または７３項
記載の抗体である特許請求の範囲第１グ項記載の方法。(9) The radionuclide is an r@radiator with a half-life of evening time to 3 days, and the energy of its rts radiation is /θ0~gθθK
eV, Claim No. 3.9, js i
7t or the monoclonal antibody according to item 3. and 45 cr.
, gu, 5. A, 7, gi or the monoclonal antibody described in 9. (1υ The tumor-associated antigen is selected from carcinoembryonic antigen, α-7 ethoprotein 7-erythin, human chorionic gonadotropin, zinc glycinate marker, glostatacidophos-7atase, and melanoma-associated antigen. , 3, Da, S% Otsu, Wa, 9 or 70. Monoclonal antibody according to claim 1.
, g19, /θ or a solution for parenteral administration of a monoclonal antibody against the tumor-associated antigen according to item 77. 03. The composition according to claim 1, comprising a mixture of one or more of the mono- and clonal antibodies. (J4) a) A monoclonal antibody directed against a "tumor-associated antigen," which has a radionuclide bound directly to the antibody or via a chelating agent bound to the antibody. administering to a patient a parenteral composition comprising: b) photoscanning the patient to determine antibody localization within the patient's body as indicated by radiation from a radionuclide; Method. (Country) Monoclonal antibodies are claimed in claims 1, 3,
&, IA, 7, g, 9, IO1//J2 or the method according to claim 1, which is the antibody according to claim 73.
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