CH653040A5

CH653040A5 - Radiomarkierte monoklonale antikoerper.

Info

Publication number: CH653040A5
Application number: CH6239/82A
Authority: CH
Inventors: Thomas Henry Adams; Gary Samuel David; Samuel Elliot Halpern
Original assignee: Hybritech Inc; Univ California
Priority date: 1981-10-27
Filing date: 1982-10-26
Publication date: 1985-12-13
Also published as: FR2515046B1; AT392004B; DK164682B; IT1153857B; NL8204108A; NO169947C; ATA391682A; NO823530L; JPH0564130B2; FI823633A0; ES8505482A1; DK164682C; FI82379C; GB2109407B; IT8223932A0; ES8404857A1; FR2515046A1; CA1202892A; FI82379B; GB2109407A

Description

ls Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf monoklonale Antikörper zu einem tumorassoziierten Antigen, die mit Radionukliden markiert sind und sich für den Nachweis von Tumoren eignen.

Eine zuverlässige Methode für den lagespezifischen Nach-20 weis von Tumoren wird seit langem gesucht. Es wurden bereits Methoden für den Nachweis von mit menschlichem Carcinom assoziiertem, im Blutstrom zirkulierendem carci-noembryonischem Antigen (CEA) beschrieben, z.B. in den US-PS 3.663.684 und 3.697.638. Diese Methoden eignen sich 2s offensichtlich nicht zur Bestimmung der Lage des Tumors. In letzter Zeit wurde vorgeschlagen, mit radioaktiven Isotopen, von Iod markierte Antikörper für den Nachweis einer mit einem tumorassoziierten Antigenen Substanz einzusetzen. In der US-PS 3.927.193 ist beispielsweise ein Verfahren unter 30 Verwendung von mit 125I und 131I markierten Antikörpern CEA beschrieben. Radiomarkierte Antikörper zu CEA-Antigen werden im Nachstehenden kurz «CEA-Antikörper» genannt. In nach dieser Patentschrift ausgeführten Versuchen unter Verwendung von männlichen syrischen Hamstern, in 35 welche menschliches Siegelringzellen-Carcinom eingeführt worden war, zeigte die Prüfung der Organe der Versuchstiere nach Injektion von markiertem CEA-Antikörper von Ziegen, im Tumor lokalisiertes Radioisotop. Demzufolge wurde vorgeschlagen, die Lage eines Tumors in einem Menschen in 40 vivo zu bestimmen durch parenterale Verabreichung einer Lösung des Antikörpers und anschliessende Abtastung des Patienten mit einem Photoscanner.

Die aktuelle Verwendung von radioiodierten Antikörpern hat jedoch die durch die früheren Arbeiten angeregten Erwar-45 tungen nicht befriedigt. Beispielsweise haben Goldenberg et al in «N. Eng. J. Med.», 298, S. 1384-1388 (1978) über gewisse Erfolge bei der Abtastung von Menschen mit radioiodierten CEA-Antikörpern berichtet. Auf Grund der verbliebenen Hintergrund-Radioaktivität war der berichtete 50 beschränkte Erfolg jedoch abhängig vom Einsatz von Subtraktionsmethoden. Mach et al berichteten in «N. Eng. J. Med.», 303, S. 5-10 (1980) sogar über weniger Erfolg und bestimmten, dass nur 0,1% der verabreichten Dosis im Tumor lokalisiert waren. In ausgewählten Fällen war jedoch die 55 bildhafte Darstellung des Tumors immer noch möglich.

Es ist wohlbekannt, dass die Affinitätsreinigung von hete-rologen Antiseren zur Erzielung der in Verfahren zur Darstellung von Tumoren nach dem Stand der Technik verwendeten Antikörper üblicherweise zum Verlust von Antikörpern 60 hoher Affinität führt und die erhaltenen Antikörper ein Gemisch von spezifischen Antikörpern für verschiedene Determinanten auf dem Antigen sind, wobei das Gemisch in grossem Ausmass Antikörper geringer Affinität und Antikörper, die keine spezifische Reaktionen ergeben, enthält. 65 Andererseits können monoklonale Antikörper ausgewählt werden, die hohe Affinität zu ausgewählten Stellen des Antigens und geringe, nicht spezifische Bindung aufweisen. Überraschenderweise wurde jedoch gefunden, dass nach

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bekannten Verfahren mit Radioisotopen von Iod markierte monoklonale Antikörper zu Tumor-Antigenen ungeachtet der Tatsache, dass in vitro Immunoreaktivität nachgewiesen werden kann, immer noch schlechte Lokalisierung der Lage des Tumors ergeben. Dies kann sehr wahrscheinlich auf den Verlust von radioaktivem Iod aus dem markierten Antikörper zurückgeführt werden. Demzufolge besteht immer noch Nachfrage nach einer zuverlässigen Methode zur Feststellung der genauen Lage eines Tumors in vivo.

Diese Aufgabe wird durch den erfindungsgemässen, im Patentanspruch 1 definierten Antikörper gelöst.

Der erfindungsgemässe Antikörper oder ein Fragment davon zu einem tumorassoziierten Antigen ist entweder direkt mit einem metallischen Radionuklid markiert oder mit einem chelatgebundenen Radionuklid, beispielsweise DTPA gebundenem luIn, durch Konjugation eines Chelatbildners an den Antikörper und anschliessende Bildung eines Komplexes zwischen dem Chelatbildner und dem Radionuklid. Der erhaltene, markierte Antikörper oder das Fragment davon, lokalisiert sich nach Injektion in einen tumorbehafteten Patienten rapid mit hoher Spezifizität im Tumor selbst. In einigen Fällen kann auch Lokalisierung in entfernten Metastasen auftreten und dadurch die Ausbreitung des Tumors anzeigen. Die Lage des Tumors kann dann durch röntgenfotografische Abtastungsmethoden nachgewiesen werden. Es können hierbei auch Gemische von erfindungsgemässen, markierten Antikörpern zum Einsatz gelangen.

Der erfindungsgemässe Antikörper ermöglicht ein verbessertes Verfahren zur bildhaften Darstellung der Lage von Tumoren in befallenen Patienten.

Im Nachstehenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beispielsweise erläutert. In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 eine Gruppe von graphischen Darstellungen der Verteilung von H1In und 12SI im Gewebe im Vergleich zur Verteilung von 67Ga als Funktion der Zeit nach der Injektion von mit UIIn und 125I bzw. 67Ga-Citrat markiertem CEA-Anti-körper in mit menschlichem Dickdarmkrebs infizierte nackte Mäuse;

Fig. 2 eine Gruppe von graphischen Darstellungen der von nackten Mäusen in Abhängigkeit von der Zeitdauer nach der Injektion von mit mIn und ,25I bzw. Ä7Ga-Citrat markiertem CEA-Antikörper ausgeschiedenen Mengen von luIn und 125I bzw. 67Ga;

Fig. 3 eine Gruppe von graphischen Darstellungen der Verteilung von luIn und 125I im Gewebe von nackten Mäusen, 48 h nach der Injektion von mit !11In und 125I markiertem CEA-Antikörper im Vergleich zu mit mIn-Citrat und 125I markiertem menschlichem Albumin;

Fig. 4 eine Gruppe von graphischen Darstellungen des Tumor/Gewebe-Verhältnisses von U1ln und I25I im Vergleich zu 67Ga nach Injektion von mit mIn und 125I bzw. 67Ga-Citrat markiertem CEA-Antikörper in nackte Mäuse als Funktion der Zeit.

Wie bereits erwähnt sind die beschriebenen, monoklonen Antikörper zu tumorassoziierten Antigenen oder Fragmente davon direkt mit metallischen Radionukliden oder mit chelatgebundenen Radionukliden markiert. Die beschriebenen Antikörper sind Produkte der heute wohlbekannten Hybridationstechnologie. Es kann in dieser Beziehung auf die in «Nature», 256, S. 495-497 (1975) beschriebene Originalarbeit von Milstein und Kohler verwiesen werden. Im Prinzip umfasst das Verfahren Injektion eines Immunogens, im vorliegenden Fall eines tumorassoziierten Antigens, wie CEA, in eine Maus oder ein anderes zweckentsprechendes Tier. Danach wird das immunisierte Tier getötet und aus

• dessen Milz entnommene Zellen werden mit Myelomzellen verschmolzen, wobei als «Hybridome» bezeichnete Hybridzellen erhalten werden, die in vitro reproduziert werden können. Die Antikörper produzierende Zellenbevölkerung s wird selektiv gezüchtet und zur Isolierung von individuellen Klonen, von denen jeder eine einzige, auf einem besonderen Bereich «déterminant» auf der Oberfläche des Antigenmole-küls spezifische Sorte von Antikörper ausscheidet, gesiebt. Deshalb werden solche Antikörper hier als «monoklone» io Antikörper bezeichnet.

Die individuellen Klonen können zur Bestimmung derjenigen, welche Antikörper der höchsten Affinität für das Antigen und niedrige nicht-spezifische Bindung aufweisen, weiterhin gesiebt werden. Der zur Radiomarkierung ausge-ls wählte, normalerweise aus Ascites isolierte Antikörper, wird entweder mit dem metallischen Radionuklid zur Reaktion gebracht oder mit einem zweckentsprechenden Chelatbildner, der anschliessend zur Bindung des Radionuklids dient, konjugiert. Der Chelatbildner kann unter Einsatz einer 20 grossen Anzahl verschiedener Methoden an den Antikörper gebunden werden. Im allgemeinen kann, da der Antikörper ein Polypeptid ist, ein Chelatbildner mit einer als reaktionsfähig mit Proteinsubstraten bekannten, reaktiven Gruppe verwendet werden. Geeignete derartige reaktive Gruppen 25 sind beispielsweise solche der Formeln:

Ch-NCS

30

Ch

35

Ch

Î /^N

Ch-C-N \

Ch-S02Cl

O

II

Ch-C-O-N

40

H

Ch-N-S02-CH=CH2

55 Ch-N

Ch-N2+ (aus Ch-NH2)

60

O

Ch-NH-C-CmBr

Ch-C-0-C-CH2CH(CH3)2

O O

65 wobei CH für den Rest des Chelatbildners steht.

Geeignete Chelatbildner umfassen eine grosse Anzahl verschiedener Polydentat-Chelatbildner, deren Liganden mit metallischen Radionukliden komplexieren. Derartige Ver-

5

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bindungen sind beispielsweise die Polyaminocarbonsäuren der Formel h02c éch2)y

\ /

h02c—éch2)v n-ch (ch0}

| 2. z r

(1)

(CH2h7-C02H

n—ch (ch-)

| 2 z r

(ch2)v co2h

(<"H2) y C02

h worin x null oder eine ganze Zahl, vorzugsweise null oder 1, y 1 oder 2, vorzugsweise 1, z eine ganze Zahl von 1-7, vorzugsweise 1 oder 7 und R Wasserstoff oder eine Gruppe, durch welche der Chelatbildner mit dem Antikörper konjugiert wird, oder eine Gruppe, welche die Bindungskonstante des Chelatbildners für das Radionuklid beeinflusst, bedeuten, von nützlichen derartigen Gruppen R ist insbesondere die Gruppe der Formel

■Q«

zu erwähnen, worin A die Gruppe darstellt, durch welche die Konjugation erfolgt. Beispielsweise kann A die Gruppe -N2+ sein, die durch Diazotierung der Gruppe -nh2 erhalten wird, welche wiederum erhalten wird durch Reduktion einer Nitro-gruppe (-no2) und diese wiederum durch Nitration des Phe-nylkerns erhältlich ist. A kann auch für eine Gruppe der Formel

O

II

-NH-C-CH2L

stehen, die erhalten wird durch Acetylierung der Gruppe

-nh2 auf bekannte Art, in welcher L für eine Komponente steht, die während der Konjugation verdrängt wird, beispielsweise für ein Halogen, wie Chlor, Brom oder Jod, wovon Brom bevorzugt ist.

20 In anderen Fällen kann R für -CH3 oder eine Gruppe der Formel -CH2C6H4OCH2CO2H stehen.

Bei Einsatz der Polyaminocarbonsäuren kann die Konjugation über die Carbonsäuregruppe selbst erzielt werden durch Bildung von beispielsweise einem Säureanhydrid-25 Zwischenprodukt, wie von Krejcarek und Tucker in

«Biochemical and Biophysical Research Communications», 77, S. 581 (1977) beschrieben.

Von den Polyaminocarbonsäuren werden gegenwärtig die Polyaminoessigsäuren bevorzugt. Verwendbare spezifische 30 Polyaminocarbonsäuren sind beispielsweise Ethylendiami-notetraessigsäure (EDTA) und Derivate davon, wie Diethy-lentriaminopentaessigsäure (DTPA), p-Bromacetamido-phenyl-(ethylendinitrilotetraessig)-säure und l-(p-Amino-phenyl)-ethylendiaminotetraessigsäure, wobei letztere zur 35 Ermöglichung der Konjugation in ein Diazoniumsalz umgesetzt wird. Von diesen Chelatbildnern wird DTPA gegenwärtig bevorzugt.

Andere geignete Chelatbildner sind beispielsweise Poly-amino-alkylenphosphorsäuren, insbesondere solche der 40 Formel

O

II

ho-p (ch0)

î 2 y oh ho-p 6cho

I 2 y oh

0

î

(£h9)---p-0h

2 y 1

oh

'n-ch—(ch9 I ^

r

•CH-fCH2^-^N r

(2)

0 ii

,(CH2h^-P~OH oh

O

H

(cH2vroH

oh worin x, y, z und R die vorstehend angegebene Bedeutung ss Hexamethylendiaminotetra-methylenphosphorsäure, haben. Vorzugsweise bedeuten x null oder 1 und y und z je 1. Diethylentriaminopenta-methylenphosphorsäure. Spezifische Poly-amino-methylenphosphorsäuren, worin y 1 Weitere geeignete Chelatbildner sind beispielsweise die bedeutet, sind Ethylendiaminotetra-methylenphosphorsäure, Polyamine der Formel

H2N-^CH2^rCH2

\

n—ch fch

H2N—(CH2^"CH2

r

(3)

2 z

^CH2—^CH2^z"NH2\ /CH2—*CH2^ z NIi2

chj-(CH2^-NH2

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6

worin x, z und R die vorstehend angegebene Bedeutung haben.

oh

1

Eine andere Klasse von geeigneten Chelatbildnern sind solche der Formel ho ch

!~

0

II

ho-p-ch,

1

oh n—ch—chn—n

I 2

R

0

II

.p-oh

CH^l oh

(4)

worin R die vorstehend angegebene Bedeutung mit der Ausnahme hat, dass wenn R keine Gruppe ist, welche Konjugation ermöglicht, mindestens eine der Phenolgruppen eine solche der Formel

ist, in welcher A die vorstehend angegebene Bedeutung hat.

Eine andere, besonders nützliche Klasse von Chelatbildnern sind die Porphyrine. Für die Erfindung nützlich sind synthetische und natürlich vorkommende Porphyrine, einschliesslich von Porphyrinen der Formel

Gruppe der Formel

20

O

II

-NH-C-CH2L,

25 worin L die vorstehend angegebene Bedeutung hat, oder mit anderen Gruppen substituiert, um die Konjugation mit dem Antikörper zu ermöglichen. Normalerweise liegt die Substitution einer Phenylgruppe in p-Stellung und einer Pyridyl-Gruppe in 2- oder 4-Stellung.

30 Andere für die Erfindung geeignete Chelatbildner sind beispielsweise die Kronenether und deren Kryptand-Analoge der Formeln:

R \.

R,

r

/

worin R die vorstehend angegebene Bedeutung hat und Ri für Wasserstoff oder einen als Teil eines natürlich vorkommenden Porphyrinmoleküls vorhandenen Substituenten oder für eine während der Synthese eingeführte Gruppe steht, beispielsweise um Konjugation zu ermöglichen oder die Bindungskonstante des Porphyrins zu beeinflussen., Bevorzugte Porphyrine sind Tetraphenylporphyrin, worin R Phenyl und Ri Wasserstoff bedeuten, oder Tetrapyridylporphyrin, worin R 4-Pyridyl und Ri Wasserstoff bedeuten. Eine oder mehrere der Phenyl- oder Pyridyl-Gruppen ist mit -nh2 oder einer und

(7)

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worin R die vorstehend angegebene Bedeutung hat. Alter- einverleibt werden, wie in der nachstehenden Formel darge-nativ kann die zur Ermöglichung der Konjugation einge- stellt:

setzte Gruppe dem Kronenether oder Kryptandgefüge direkt

0

v_y wobei A die vorstehend angegebene Bedeutung hat. Derivate von Desferrioxamin B können auch als Chelatbildner verwendet werden. Diese entsprechen der Formel

0 OH II '

0

0 OH

R-CH2-C-N eCH2^-NH-C—fCH2^2"c-N

OH 0 0 1 H II K2N (CH2fj-N-C (CH2f^-C-NH— (CH2*y

(8)

worin R die vorstehend angebene Bedeutung hat. Derivate von Enterobactin sind auch nützliche Chelatbildner. Bevorzugt werden solche der Formel

OH OH

worin A die vorstehend angegebene Bedeutung hat. Carbocyclische Analoge von Enterobactin sind ebenfalls geeignete Chelatbildner. Besonders zu erwähnen sind solche der Formel

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8

worin A die vorstehend angegebene Bedeutung hat. Andere als Chelatbildner nützliche carbocyclische Systeme umfassen beispielsweise Verbindungen der Formel

0—CH,

OH OH

î M

(11)

und entsprechende Anilide, wobei A die vorstehend angegebene Bedeutung hat.

Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass der Ring in den Formeln von Enterobactin und den carbocyclischen Analogen davon weiterhin substituiert sein kann mit Substi-tuenten, welche die Fähigkeit der Bindung von metallischen

Radionukliden nicht materiell beeinträchtigen, und dass derartige Substituente eingeführt werden können, um Anknüp-65 fungsstellen für die Konjugation an den Antikörper zu schaffen.

Eine weitere verwendete Gruppe von Chelatbildner sind die Siloxane der Formel

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oh oh chr worin R die vorstehend angegebene Bedeutung mit der Ausnahme hat, das wenn R keine die Konjugation ermöglichende Gruppe ist, mindestens eine der Catechingruppen eine solche der Formel in welcher A die vorstehend angegebene Bedeutung hat, ist.

Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass die vorstehende Liste von Chelatbildnern nicht abschliessend ist, sondern eher als erläuternder Hinweis für verwendbare Chelatbildner betrachtet werden muss.

Direkte Markierung von Antikörpern mit metallischen Radionukliden kann nach bekannten Methoden zur Einführung eines metallischen Ions in einen Antikörper oder durch Bindung an eine Anknüpfungsstelle des Antikörpers selbst ausgeführt werden. In gewissen Fällen kann das metallische Radionuklid eingeführt werden, indem der Antikörper, üblicherweise in Lösung, der Einwirkung des Radionuklids in zweckentsprechenden Oxidationszustand ausgesetzt wird. Eine gegenwärtig bevorzugte Technik umfasst beispielsweise die direkte Metallisierung eines Antikörpers mit I03Ru+3 durch Kontaktierung des Antikörpers mit einem zweckentsprechenden Rutheniumsalz, beispielsweise Ruthenium-trichlorid, in einer gepufferten Lösung. Hierfür geeignete Puffer sind beispielsweise Caliumacetat, Natriumbicarbonat und Trihydroxyethylamin (Tris).

Andere geeignete Methoden umfassen direkte Metallie-rung des Antikörpers mit Chrom. Chrom-Radionuklide können eingeführt werden durch Vermischen eines Chromat-salzes des Radionuklids, beispielsweise Natrium- oder Kalium-Chromat, mit dem Antikörper in Lösung.

Unter anderen Umständen kann der Antikörper zuerst für die Aufnahme des Radionuklids chemisch modifiziert und dann mit dem Radionuklid zur Reaktion gebracht werden. Beispielsweise können die Sulfidgruppen im Antikörper reduziert und anschliessend eine -S-M oder -S-M-S Gruppe, worin M das Radionuklid darstellt, gebildet werden. Disul-fidgruppen können beispielsweise unter Verwendung von Dithiothreitol reduziert werden, um zuerst eine Thiolgruppe zu bilden, die dann mit zweckentsprechenden Metallionen, beispielsweise Quecksilber, Silber, Zink, Blei oder Cadmium in Form von Oxiden oder Salzen, zur Reaktion gebracht werden kann.

Für die Erfindung verwendbare Radionuklide sind solche, die mit Polydentat-Chelatbildnern stabile Komplexe bilden oder sich unter zweckentsprechenden Bedingungen direkt mit dem Antikörper verbinden. Radionuklide werden zweckmässig so ausgewählt, dass sie eine Halbwertszeit und andere Strahlungseigenschaften aufweisen, die sichere Beseitigung und sichere Einführung in Menschen ermöglichen. Es wurde eine grosse Anzahl von Radionukliden untersucht, um für die ls Verwendung in Menschen geeignete auszuwählen. Die Ausgewählten können folgendermassen eingeteilt werden:

Die Porphyrine der vorstehenden Formel 5, Kronenether der vorstehenden Formel 6 und Kryptande der vorstehenden Formel 7 als Chelatbildner sind bestens geeignet für die Bin-20 dung von Radionukliden mit einem +2 Oxidationszustand. Beispielsweise bilden 195mPt, 57Ni, S7Co, I05Ag, 67Cu und 52Mn in deren +2 Oxidationszustand stabile Komplexe. Die Chelatbildner der vorstehenden Formeln 1-5 und 9-12 bilden stabile Komplexe mit Radionukliden +3 Oxidations-25 zustand. Geeignete derartige Radionuklide, die im +3 Oxidationszustand stabile Komplexe bilden, sind beispielsweise 52Fe, mIn, 113mIn, 99mTc, 68Ga, 67Ga, I69Yb, 57Co, [67Tm, '«Tm, I46Gd, 157Dy, 95mNb, 103Ru, 97Ru, "Rh, 101mRhund 201T1. Die Chelatbildner der vorstehenden Formeln 9-12 mit Catechin-30 gruppen sind besonders geeignet für die Verwendung mit Radionukliden, die in vivo höchst mobil sind, insbesondere Radionuklide von Eisen, wie 52Fe.

Radionuklide, die direkt an Antikörper gebunden werden können, sind beispielsweise 203Hg, 197Hg,105Ag, 203Pb, 97Ru, 35 103Ru, "Rh, 101mRh und 48Cr. Am besten geeignete Radionuklide sind Gammastrahler mit einer Halbwertszeit im Bereich von 5 h bis 5 d, deren Gammastrahlung eine Energie von 100-400 keV aufweist.

Aus heute noch nicht klar verständlichen Gründen wider-40 stehen bestimmte individuelle, monoklone Antikörper zu Tumor-Antigenen direkter Metallisierung. Es ist somit für die Einarbeitung des Radioisotops auf diesem Weg notwendig, spezifische Antikörper sorgfältig auszuwählen. Demzufolge wird es gegenwärtig bevorzugt, ein Radionuklid unter 45 Anwendung der flexibleren Methode an einen Antikörper zu binden und somit zuerst einen Chelatbildner an den Antikörper zu konjugieren und danach mit dem Radionuklid einen Komplex zu bilden. In dieser Hinsicht wird insbesondere die Verwendung von mIn mit einer Halbwertszeit von so 2,8 d als Radionuklid in Zusammenwirkung mit DTPA als Chelatbildner bevorzugt.

Die erfindungsgemässen Antikörper eignen sich zur Verwendung zu tumorassoziierten Antigenen im allgemeinen. Ausser CEA können beispielsweise auch melanomassoziierte 55 Antigene, a-feto-Protein, Ferritin, menschliches Choriogo-nadotopin, Zinkglycinat-Markierungsmittel und prostatische Säurephosphatase (PAP) als Immunogene zur Anregung der beschriebenen Antikörper verwendet werden. Beim aktuellen Einsatz kann der radiomarkierte Antikörper dem Patienten 60 in Form einer zweckentsprechenden Lösung parenteral ininjiziert werden. Nach genügender Zeitdauer kann der Patient dann mit einem Photoscanner abgetastet werden, um durch die lokalisierte Strahlung die Lage eines Tumors und/oder von Metastasen davon bildhaft nachzuweisen. 65 Die nachstehenden Versuche wurden mit einer Ausführungsform des erfindungsgemässen monoklonalen, mit ,2äI bzw.11'In radiomarkierten Antikörpers zu CEA ausgeführt, um die Vorteile der Verwendung von mittels Chelat gebun

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denen Radionukliden markierten, monoklonalen Antikörpern für die bildhafte Darstellung von Tumoren gegenüber bekannten Verfahren unter Verwendung von mit Iod markierten Antikörpern darzustellen.

1. Herstellung von radiomarkiertem CEA-Antikörper

Von Hybritech, Inc., La Jolla, Ca., USA erhältlicher,

monoklonaler CEA-Antikörper wurde nach der von Bolton und Hunter in «Biochem. J.», 133, S. 529-539 (1973) beschriebenen Methode mit 12SI markiert. Das erhaltene Produkt wurde durch eine mit «Sephadex» G-25 gefüllte Säule geleitet und das durchgelaufene Material enthielt weniger als 0,5% freies Iodid. Die Bindung des erhaltenen, radiomarkierten monoklonalen Antikörpers mit «Sepharose» gebundenem Pferde-Mausantigen war grösser als 80% und mit an «Sepharose» gebundenem CEA grösser als 75%.

Der gleiche monoklonale CEA-Antikörper wurde unter Verwendung von konjugiertem DTPA als Chelatbildner nach der von Krejcarek und Tucker in «Biochemical and Biophy-sical Research Communications», 77, S. 581 (1977) beschriebenen Methode mit11'In radiomarkiert. Das Reaktionsprodukt wurde durch Hindurchleiten durch eine mit «Sephades» G-75 gefüllte Säule gereinigt. Die Antigenbindung des erhaltenen Produktes war derjenigen des mit I25I radiomarkierten Antikörpers erzielten vergleichbar. Die Markierungsbehandlung beeinflusste die Affinitätskonstante Ka des Antikörpers im Vergleich zu nicht-chelatisiertem Antikörper, bestimmt durch Titration mit CEA, nicht nachteilig.

Die in vitro Stabilitäten der radiomarkierten CEA-Antikörper wurden bestimmt durch Inkubation eines Teils des Materials in einer Lösung für parenterale Verabreichung in steriler normaler Kochsalzlösung U.S.P. bei 37°C während 72 h und chromatographische Bestimmung des freien Radionuklids. Die Antikörperlösungen wurden punktweise auf Streifen von Baker-Aluminiumoxid 1B aufgetragen und in einer 50%igen wässrigen Lösung von Aceton entwickelt. Das proteingebundene Radionuklid verbleibt an der Auftragsstelle, während freies Radionuklid migriert. Nach der Inkubationsperiode zeigte das radioiodierte Material eine vorhandene Aktivität als freies Iodid von weniger als 3%, die bei Lagerung bei 4°C um 50% vermindert wurde. Unter gleichen Bedingungen zeigte der mit U1ln radiomarkierte CEA-Antikörper vergleichbare Stabilität.

2. Verteilungsstudien in nackten Mäusen

Mit dem radiomarkierten monoklonalen Maus-CEA-Anti-körper wurden in nackten Mäusen, die mit 0,5-1,0 g menschlichen Kolontumoren infiziert waren, Gewebe-Verteilungsstudien durchgeführt. Das Lebendgewicht der Versuchsmäuse lag im Bereich von 17-28 g und betrug durchschnittlich etwa 23 g. Die Tumore wurden durch subcutane Injektion eines CEA-bildenden, menschliche Kolon-Adeno-carcinomzellen enthaltenden Breis erzeugt. Die Verteilungsstudien wurden 3 Wochen danach in zwei verschiedenen Versuchsreihen ausgeführt. In der ersten Versuchsreihe wurden 19 Versuchstiere in vier Gruppen von 4-6 Tieren aufgeteilt. Jeder Maus wurde intravenös (IV) je 0,1 ml einer sterilen, U.S.P. normalen Kochsalzlösung, enthaltend 1,85.104Bq125I CEA-Antikörper (etwa 0,3 p,g Antikörper) und, als Kontrolle, trägerfreies 67Ga-Citrat, ein bekanntes, nicht spezifisches Mittel zur bildhaften Lokalisierung von menschlichem Kolontumor, injiziert. Die Injektionen wurden ohne Anästhesie unter Verwendung einer 100 pl Hamilton-Spritze zur Sicherstellung der Genauigkeit verabreicht. Versuchstiere, bei denen die Dosis zum Teil in den Schwanz infiltriert war, wurden aus der Versuchsreihe ausgeschlossen. Nach der Injektion wurden die Mäuse in sterile, metabolische Käfige mit erhöhtem Drahtnetzboden zur Sammlung von Urin und

Fäkalien eingesetzt. Unterhalb des Drahtnetzbodens wurde sterile 4x4 Gaze solcherart angeordnet, dass sie von den Tieren nicht angenagt werden konnte. Die Mäuse wurden in einem sauberen Raum mit Überschussangebot von sterilem s Futter und Wasser bei 4,5°C gehalten und in Gruppen 4,24, 48 bzw. 72 h nach der Injektion des Tracers getötet.

Die Mäuse wurden mit Äther anästhetisiert, und durch direkte Cardialpunktur wurden Blutproben entnommen. Dann wurden die Mäuse durch Genickbrechen getötet. In io anschliessender Sezierung wurden der Tumor, die Leber, Nieren, Muskeln, Lunge, Milz, das Herz und der Femur entnommen, zweimal in Wasser und einmal in 10%igen For-malin gespült, abgetrocknet und feucht auf einer analytischen Waage gewogen. Der intakte Magen und die Einge-ls weide wurden ebenfalls entfernt und ausgezählt. Für die Berechnung der Gesamtaufnahme der Organe wurde angenommen, dass Blut, Muskeln und Knochen 7%, 40% bzw. 10% des gesamten Körpergewichts ausmachten. Die übrigen Organe wurden als Gesamtheit gewogen. Die Auszählung der 20 Radioaktivität wurde mit einem automatischen Gammaquel-lenzähler ausgezählt, dessen Fenster über den 27-35 keV Pho-topeak von 125I und den 93 keV Photopeak von 67Ga eingestellt waren. Der Zähler wurde auf Rejektion bei 10 min oder 1 mio Zählungen programmiert, um für diejenigen Proben 25 mit der niedrigsten Aktivität statistische Signifikants zu erzielen. Korrekturen für Hintergrund und Rückstrahlungen isotoper Aktivität zwischen den Fenstereinstellungen wurden unter Verwendung von vorbereiteten Quellen und Lösung von Simultangleichungen vorgenommen. Die Aktivität in 30 den Proben wurde dann mit Standardproben des injizierten Materials verglichen und die Resultate in Prozenten der injizierten Dosis/g und in Prozenten der injizierten Dosis/ Organ ausgedrückt. Das Tumor/Gewebe-Verhältnis wurde aus den Daten der prozentualen Dosis/g errechnet. Die Akti-35 vität in Eingeweide, Urin und Kot wurden prozentual, bezogen auf die injizierte Gesamtdosis errechnet.

In der zweiten Studie wurden 37 nackte Mäuse mit Tumoren aus dem gleichen menschlichen Kolonkrebs in fünf Gruppen von 7-8 Tieren aufgeteilt. Eine Gruppe diente als 40 Kontrolle und wurde gleichzeitig intravenös mit 3,7 • 104Bq 125I menschlichem Serumalbumin (0,01 mg Albumin) und 11,1- 104Bq trägerfreiem mIn Citrat (0,01 mg Citrat) injiziert und 48 h nach der Injektion getötet. Die übrigen vier Gruppen der Prüftiere wurden gleichzeitig mit je 11,1 • 104Bq 45 niIn CEA-Antikörper (1,5 [ig Antikörper) und 18,5- 104Bq trägerfreiem 67Ga-Citrat intravenös injiziert. Diese Gruppen wurden nach 4,24,48 bzw. 72 h getötet. Sezierung, Herstellung der Proben für den Radioassay, Auszählung und Rechnungen wurden ausgeführt, wie vorstehend beschrieben. Für so luIn wurde der Spektrometer zur Zählung des 247 keV Photo-peaks unter Verwendung eines 40 keV Fensters (210-250 keV) eingestellt, während 67Ga mit einem 30 keV Fenster, das den 93 keV Photopeak überlappt, gezählt wurde. Diese Einstellungen ergaben weniger als 10% Rückstrahlungsmessungen 55 von Radioaktivität.

Wie in Fig. 1 dargestellt, nahm die Konzentration von11'In CEA-Antikörper, der im Tumor lokalisiert wurde, über die ganze Zeitdauer des Versuchs ständig zu. Innert 72 h waren 23% der injizierten Dosis akkumuliert und diese Resultate 6o lassen vermuten, dass diese Konzentration sogar höher geworden wäre, wenn noch spätere Proben genommen worden wären. Im Gegensatz dazu nahm die Konzentration im Blut während der Versuchsdauer ab. Die Leber zeigte rapide Aufnahme innert 4 h gefolgt von einer Periode 65 geringer Veränderung und dann einen Anstieg bis zu 72 h. Die anderen Gewebe zeigten während der Gesamtdauer des Versuchs kleine Variation.

Die Konzentration von 67Ga im Tumor verblieb während

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653 040

der Gesamtdauer des Versuchs ziemlich konstant und betrug etwa 'A derjenigen von11'In CEA-Antikörper nach 72 h. Die Konzentration von 67Ga im Blut sank stetig ab, während diejenige in der Leber ähnlich verlief wie diejenige des11'In markierten Antikörpers. Die Konzentration von 67Ga in den Muskeln sank bis zu 48 h ab und war dann ausgeglichen, während die Konzentration in Knochen (Femus) während der gesamten Versuchsdauer unverändert blieb.

Die Konzentration von Iodid im Tumor erreichte den Höchststand nach 4 h und war anfänglich etwas höher als diejenige des '"In, nahm dann während der restlichen Versuchsdauer unregelmässig ab und betrug nach 72 h nur '/io derjenigen von "1 In. Zu diesem Zeitpunkt erschien im Tumor doppelt soviel 67Ga als 125I. In allen Geweben nahm die Zählrate von 125I von ihrem Maximum bei 4 h rapid ab und erreichte in einigen Fällen nach 48 h das Niveau des Hintergrunds.

Die Ausscheidungsdaten in Fig. 2 zeigen stetigen Anstieg von "'In im Urin zwischen 24und 72 h und erreichen ein Maximum von 14% der injizierten Dosis. Die Konzentration von '"In in Kot verblieben zwischen 24 und 48 h ziemlich konstant und stiegen dann bei 72 h auf 17% an, während die Konzentration in den Eingeweiden während der gesamten Versuchsdauer relativ konstant blieb und 5% der injizierten Dosis nie überstieg.

Das Ausscheidungsmuster von 67Ga war demjenigen von " ' In ziemlich ähnlich, zeigte jedoch mehr Tracer in Gedärmen und Kot als bei "'In und weniger im Urin.

Im Urin wurden während den ersten 24 h nahezu 60% der 12SI-Radioaktivität und nach 48 h 75% eliminiert. Weitere 5% davon wurden im Kot verloren. Nach 72 h waren somit etwa 80% des ursprünglich injizierten i25I vom Tier ausgeschieden. Chromatographie des 125I im Urin zeigte, dass das meiste davon iodidfrei war und ein weiterer Teil davon, der wahrscheinlich freies 125I war, mit etwas anderem als einem Protein komplexiert war.

In Fig. 3 sind die Daten für "'In markierten CEA-Antikörper nach 48 h im Vergleich zu ' "In-Citrat und 125I markiertem, menschlichem Serumalbumin, nachstehend als «I25IHSA» bezeichnet, dargestellt. Das "'In-Citrat wurde als Kontrolle für irgendwelches Indium, das vom Antikörper dissoziiert haben könnte, eingesetzt, während das l25IHSA als nicht-spezifische Proteinkontrolle verwendet wurde. Der "'In CEA-Antikörper zeigte ein vom "'In-Citrat sehr unterschiedliches Verteilungsmuster und konzentrierte sich im Tumor mit um den Faktor 10 verstärkter Wirksamkeit. Die Aufnahme der beiden Tracer durch die anderen Gewebe war auch unterschiedlich. Die Konzentration von '25IHSA im Tumor betrug 20% derjenigen von "1 In CEA-Antikörper, war jedoch immer noch 50% höher als diejenige von 125I CEA-Antikörper. Die Verteilung von 125IHSA im tumorfreien Gewebe ist auch unterschiedlich von derjenigen des '"In CEA-Antikörpers. Es ist besonders bedeutend, dass 125IHSA, das lange als stabiles iodiertes Protein eingestuft wurde, nach 48 h nahezu 60% Ausscheidung (43% im Urin) aufwies, in bemerkenswerter Übereinstimmung mit der vorstehenden Erkenntnis, dass im Urin auch 125I CEA-Antikörper gefunden wurden. Die Urinfraktion stellt wahrscheinlich freies Iodid dar.

Das Tumor/Gewebe-Verhältnis gemäss Fig. 4 zeigt Überlegenheit von '"In CEA-Antikörper gegenüber 67Ga in bezug auf alle Gewebe mit Ausnahme von Blut, bei welchem letzteres etwa gleich ist. Die Verhältnisse des 125I CEA-Antikörpers, die denjenigen von "'In und 67Ga in einigen Geweben gleich zu sein scheinen, sind irreführend, da sie eher aus niedrigen ,2SI Werten in normalen Geweben als aus der Lokalisierung im Tumor stammen.

Aus den vorstehenden Versuchen ergibt sich eindeutig,

dass ,25I CEA-Antikörper als Mittel zur bildhaften Darstellung eines Tumors ungeeignet ist. Die rapide und ausgedehnte Dehalogenierung vermindert die Konzentration des Tumortracers und erhöht den Hintergrund im Blut, sodass die Verwendung ohne aufwendige Subtraktionstechnik ausgeschlossen ist. Tatsächlich enthält der Tumor nach 72 h doppelt soviel des nichtspezifischen 67Ga, ausgedrückt in Gramm, als 125I. Ausserdem sind die Tumor/Blut-Verhält-nisse bei 67Ga besser als diejenigen des iodierten Antikörpers. Unter Beachtung, dass 67Ga als ungeeignet für die bildhafte Darstellung von Adenocarcinom des Kolons erachtet wird, sind die von Mach et al in «N. Eng. J. Med.», 303 S. 5-10 (1980) rapportierten Schwierigkeiten leicht zu erklären. Die bei Verwendung von '25I erhaltenen Daten zeigen eindeutig, dass ohne Subtraktionstechnik, bei Verwendung von 13'I sehr grosse Dosierungen des damit radiomarkierten Materials verabreicht werden müssten, um die für eine wirksame bildhafte Darstellung nötigen Konzentrationen im Tumor zu erzielen. Dies würde dazu führen, dass der Patient auf Grund der Halbwertszeit von 8 d und einer 608 keV-Beta-Komponente von 13'I eine hohe Stahlungsdosis erhalten würde. Im Gegensatz dazu ermöglichen bei "'In CEA-Antikörper der hohe Prozentsatz der von der injizierten Dosis vom Tumor aufgenommenen Konzentration und die vorteilhafteren physikalischen Eigenschaften dieses Antikörpers Injektion einer geringeren Menge dieses Tracers bei gleichzeitiger Verbesserung der Bilddarstellung und Herabsetzung der Strahlungsdosis für den Patienten auf ein Minimum.

Die mit '"In CEA-Antikörper erhaltenen Tumor/Hintergrund-Verhältnisse liegen gut in einem Bereich, der für bildhafte Darstellungszwecke benötigt wird, da sich das Radionuklid in hoher Konzentration im Tumor lokalisiert. Ausserdem weisen diese Daten daraufhin, dass der Tumor Radiomarkierung aufnimmt, die einmal in andere Gewebe eingebracht oder an diesen zum Haften gebracht wurden. Individuelle Mäuse wurden unter Verwendung einer Phogam HP Anger, Gammakamera 4,24,48 bzw. 72 h nach Injektion des mit "'In radiomarkierten CEA-Antikörpers photographisch abgetastet. Nach 48 h konnte der Tumor gut lokalisiert werden, ohne die Notwendigkeit, auf eine Subtraktionstechnik zurückzugreifen. Nach 72 h war die Lokalisierung des Tumors sogar noch deutlicher.

Die in vivo Stabilität und somit Eignung zur Verwendung für bildhafte Darstellung von Tumoren eines direkten markierten monoklonalen Antikörpers wird durch die nachstehenden Versuche unter Verwendung eines mit I03Ru markierten, monoklonalen Melanom-Antikörpers im Vergleich zum gleichen, jedoch mit '25I markierten Antikörper dargestellt.

1. Herstellung eines mit '03Ru radiomarkierten Melanom-Antikörpers

220 (xl einer von New England Nuclear, Inc. erhältlichen wässrigen Lösung von 103RuCh wurden zu 100 jil einer gesättigten wässrigen Lösung von Kaliumacetat gegeben und der pH-Wert mit 70 (xl 10 M Natronlauge auf 5,3 gestellt. Die erhaltene Lösung von Radionuklid wurde zu 500 (il einer Lösung, enthaltend 0,5 g/1 Mäuse-Melanom-Antikörper, gegeben und das Gemisch wurde während 1 h bei Zimmertemperatur inkubiert. Dann wurde der pH-Wert durch Zusatz von 20 |il 10 M Natronlauge auf 7,2 gestellt und die Zubereitung über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen. Das ungebundene Metall wurde von dem an den Antikörper gebundenen Metall abgetrennt, indem das Reaktionsgemisch auf eine Säule von «Sephadex» G-50 gegeben und mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2 eluiert wurde. Protein enthaltende Fraktionen wurden gesammelt und für in vivo Versuche an Mäusen vereinigt.

s

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

653040

12

2. Verteilungsstudien in Normalmäusen Versuche der Verteilung im Gewebe von normalen BALB-C Mäusen wurden unter Verwendung des wie vorstehend beschrieben hergestellten, mit 103Ru radiomarkierten Melanom-Antikörpers und mit wie vorstehend für die Radiomarkierung von CEA-Antikörper beschrieben mit 125I radiomarkiertem Melanom-Antikörper ausgeführt.

Zwei Gruppen der Versuchsmäuse erhielten intravenöse

Injektion der beiden erhaltenen, radiomarkierten Antikörperpräparate. Die Mäuse wurden 4,24,48,72 bzw. 96 h nach der Injektion getötet, seziert und die Radioaktivität in den verschiedenen Organen bestimmt, wie vorstehend für die s Versuchsreihen mit monoklonem CEA-Antikörper beschrieben. Die Verteilung von !25I und 103Ru im Gewebe ist in der nachstehenden Tabelle aufgeführt.

Verteilung von 125I und I03Ru im Gewebe von normalen BALB-C Mäusen nach unterschiedlicher Einwirkungsdauer nach Injektion von radiomarkiertem Melanom-Antikörper

4h 24h 48h 72h 96h

% Dosis / Organ % Dosis / Organ % Dosis / Organ % Dosis / Organ % Dosis / Organ

1-125 Ru-103 1-125 Ru-103 1-125 Ru-103 1-125 Ru-103 1-125 Ru-103

Blut*

X

46,4

28,3

11,7

12,5

13,0

6,97

11,8

5,54

13,2

3,30

± s.d.

4,17

3,32

10,8

1,74

6,66

,550

6,88

,678

,929

,244

Leber

X

12,6

48,1

5,22

42,9

5,27

47,2

4,54

41,2

3,86

39,3

+ s.d.

1,87

6,63

,864

4,84

,904

6,42

1,03

4,14

,395

4,34

Milz

X

1,27

3,38

,520

2,64

,340

1,95

,284

1,94

,252

1,98

± s.d.

,181

,467

,053

,498

,049

,248

,025

,311

,022

,263

Nieren

X

1,94

7,11

,784

5,15

,641

4,21

,542

3,68

,460

3,21

± s.d.

,135

,284

,091

,352

,073

,284

,063

,203

,034

,188

Herz

X

,792

,629

,403

,327

,340

,301

,263

,236

,220

,207

± s.d.

,161

,119

,075

,049

,036

,017

,060

,051

,037

,015

Muskeln*

X

15,2

7,61

12,5

8,64

11,6

8,17

9,56

6,98

8,05

6,66

± s.d.

2,56

1,02

2,34

1,55

2,48

1,88

1,00

,906

,641

,482

Femur

X

,360

,346

,189

,253

,163

,241

,150

,252

,106

,200

± s.d.

,040

,027

,046

,045

,035

,041

,019

,030

,014

,015

Lunge

X

2,58

2,01

1,13

,817

,878

,612

1,17

,585

,855

,475

± s.d.

,736

,464

,271

,133

,131

,079

,281

,082

,159

,075

Eingeweide

X

23,8

7,72

5,61

6,11

6,04

5,51

5,22

4,70

3,94

4,01

± s.d.

4,24

,646

3,16

,817

,704

,460

,501

,523

,129

,296

Tiergewicht, g

X

17,96 ± 3,88

16,3 ±

1,68

14,8 ±

1,79

14,95 ±

: 1,80

15,95 ±

: 1,21

Gewichtsbereich

>,g

12,1 -

22,2

14,6-

19,8

11,6 —

17,1

13,1 -

18,2

14,0-

17,5

n 10 10 9 10 8

Die Daten entsprechen dem Durchschnitt (X) von n Versuchstieren ± Standardabweichung (s.d.)

*Es wurde angenommen, dass das Gewicht des Blutes 7% und dasjenige der Muskeln 40%, bezogen auf das Lebendgewicht der Versuchstiere, betrug.

Aus der Tabelle geht hervor, dass der mit 125I radiomarkierte Melanom-Antikörper rapid dehalogeniert wurde, wie dies bei dem mit 125I radiomarkierten CEA-Antikörper erfolgte, während der mit 103Ru radiomarkierte Melanom-Antikörper stabil war. Diese Beobachtungen werden durch die Tatsache bestätigt, dass die Konzentration von 125I im Blut 4 h nach der Injektion sehr hoch ist und in der Zeitdauer von 24-96 h auf ein niedriges, jedoch konstantes Niveau abfällt. Im Gegensatz dazu verschwindet die Konzentration von 103Ru relativ schnell aus dem Blut und konzentriert sich in der Leber, wie dies bei einem nichttumorbefallenen Patienten zu erwarten wäre. Die Konzentrationen in Milz und Nieren der mit dem mit !03Ru radiomarkierten Melanom-Antikörper injizierten Mäuse sind in Übereinstimmung mit in vivo Stabilität.

Es ist wohlbekannt, dass CEA und einige andere tumorassoziierte Antigene vom Tumor ausgeschieden oder abge-stossen werden. In solchen Fällen kann die auf Grund der Kombination von im Blut oder anderen Geweben zirkulierendem Antigen mit radiomarkiertem Antikörper auftretende Hintergrundstrahlung reduziert werden, indem vorgängig unmarkierter Antikörper zwecks Kombination mit

45 zirkulierendem Antigen verabreicht wird. Dies würde auch dazu neigen, die hohe Aufnahme von radiomarkiertem Antikörper durch die Leber zu vermindern. Nach einer zweckentsprechenden Zeitdauer wird radiomarkierter Antikörper zugegeben und das Prüftier photographisch abgetastet, um so die Lage der lokalisierten Strahlung zu bestimmen.

Während im Vorstehenden die Verwendung eines einzigen, mit einem Radionuklid markierten, monoklonalen Antikörpers erläutert wurde, ist es natürlich möglich, für unterschied-ss liehe antigene Determinanten zwei oder sogar mehr derartige markierte, monoklonale Antikörper einzusetzen, wobei diese so ausgewählt werden, dass sie die Bindung des Antigens durch einen anderen Antikörper nicht beeinträchtigen.

Durch Verwendung von mehreren, einander nicht beein-60 trächtigenden, radiomarkierten Antikörpern, kann die bildhafte Darstellung des Tumors verbessert werden, da das Antigen dadurch eine höhere Kapazität für radiomarkierten Antikörper erhält. Die Verwendung von mehreren Antikörpern ist besonders nützlich für die bildhafte Darstellung eines 65 Tumors, dessen assoziiertes Antigen in niedriger Konzentration vorhanden ist.

B

Claims

653040 2

PATENTANSPRÜCHE 2. Antikörpernach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

1. Monoklonaler Antikörper zu einem tumorassoziierten dass der Chelatbildner ausgewählt ist aus Polyaminocarbon-

Antigen, dadurch gekennzeichnet, dass ein metallisches säuren, Poly-amino-alkylenphosphorsäuren, Polyaminen,

Radionuklid direkt oder über einen mit dem Antikörper kon- Porphyrinen, Kronenethern, Cryptanden, Desferrioxamin B

jugierten Chelatbildner an den Antikörper gebunden ist. s und Derivaten davon der Formel

0 QH

Î1

R-CH2~C-N fCH2,5

0 Q OH

II I I

NH-C—fCH_}-r—C—N—

2 2

h

OH O

1 ■

O

2n (ch2}-g-n-c (o^^c-nh- (ch2}-£-

(8)

worin R für Wasserstoff oder eine Gruppe, durch welche der an das Radionuklid beeinflusst, steht, Enterobactinen, vor-Chelatbildner mit dem Antikörper konjugierbar ist, oder eine zugsweise solchen der Formel Gruppe, welche die Bindungskonstante des Chelatbildners 20

OH OH

OH OH

ö-

C—NH—CH

worin A die Gruppe darstellt, durch welche die Konjugation dass der Chelatbildner eine Polyaminocarbonsäure der erfolgt, und carbocyclischen Analogen davon. 5» Formel
3. Antikörper nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,

h02c—<ch2)y

\ /

n -

4ch~) c0oh

2 y 2

ch —«ch^ n—çh—(ch2,z ho2c—(ch2)v

(ch2)v co2h

(ch2) co2h worin x null oder eine ganze Zahl, y 1 oder 2, z eine ganze 4. Antikörper nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,

Zahl von 1-7 bedeuten, und R die im Anspruch 2 angegebene dass der Chelatbildner eine Poly-amino-alkylenphosphor-Bedeutung hat, ist. säure der Formel

653040

O

HO-|—fCH2)y OH

\

O

*(CH2^y-f"°H

OH

0

H
CH.^—P-OH

/ 2 Y \

/ OH

N-CH £CH,K

| 2 z

R

•CH fCH-)-—I—N

i T \

HO-P fCHj i 2 y

OH

/ x

O

(CH0} P-OH

2 y i

OH

worin x, y, z und R die im Anspruch 3 angegebene Bedeutung haben, ist.
5. Antikörper nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass in den Formeln R Wasserstoff, Methyl, oder eine Gruppe der Formel -CH2C6H4OCH2CO2H oder -CòH4-A bedeutet, in denen A für ein Diazoniumsalz steht, oder eine Gruppe der Formel

O

-NH-C-CH2L

bedeutet, in welcher L für eine Gruppe steht, die während der Konjugation verdrängt wird.
6. Antikörper nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass in den Formeln x null bedeutet, und R für eine Gruppe der Formel

O

II

-CsHt-NH-C-CHzBr steht.
7. Antikörper nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Chelatbildner eine Polyaminocarbonsäure ist, in deren Formel x die Zahl 1 bedeutet, und R für eine Gruppe der Formel

O

II

-C6H4-NH-C-CH2Br steht.
8. Antikörper nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Chelatbildner Ethylendiaminotetraessigsäure, p-Brom-acetamidodiphenyl-(ethylendinitrilotetraessig-säure), 1 -(p-Aminophenyl)-ethylendiaminotetraessigsäure oder Diethylentriaminopentaessigsäure ist.
9. Antikörper nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Radionuklid ein Gamma-strahler mit einer Halbwertszeit von 5 h bis 5 d ist, dessen Gammastrahlung eine Energie von 100-400 keV aufweist.
10. Antikörper nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Radionuklid 195mpt, 57nì, 57co, 105Ag, 67cu, 52Mn, 52fe, 11 lin, 113in, 99mTc, 67gq, 68Ga, 169Yb, lÓÓTm, 167Tm, 14ÖGd, 157Dy, 95mNb, 103ru, 97ru, 99ru, lOlmRh, und 201ti, 203Hg, 197h8, 105Ag, 203pb, 99rh oder 48cr ist.
11. Diagnostikum in Form einer Lösung für parenterale Verabreichung, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens einen Antikörper zu einem tumorassoziierten Antigen nach Anspruch 1 enthält.
12. Diagnostikum nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Gemisch von 2 oder mehr der Antikörper nach Anspruch 1 enthält.