JPH1151935A - 複数種類のターゲット分子の同時検出方法 - Google Patents
複数種類のターゲット分子の同時検出方法Info
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- JPH1151935A JPH1151935A JP22575497A JP22575497A JPH1151935A JP H1151935 A JPH1151935 A JP H1151935A JP 22575497 A JP22575497 A JP 22575497A JP 22575497 A JP22575497 A JP 22575497A JP H1151935 A JPH1151935 A JP H1151935A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 検出感度が高く，検出操作が容易な，複数種
類のターゲット分子の同時検出方法を提供する。 【解決手段】 複数種類のターゲット分子１１，１２に
対して特異的に結合し得る特異的結合性分子にその種類
ごとに異なる種類のハプテンを標識してなるハプテン標
識分子２１，２２を準備する工程と，ハプテンと特異的
にカップリングする抗ハプテン抗体とその種類ごとに異
なる種類の酵素とからなる酵素標識抗ハプテン抗体３
１，３２を準備する工程と，酵素と特異的に反応して異
なった色に蛍光し得る蛍光物質４１，４２を準備する工
程と，ターゲット分子にハプテン標識分子を結合させ，
ハプテン標識分子に酵素標識抗ハプテン抗体をカップリ
ングさせ，酵素に蛍光基質を反応させ，異なった蛍光色
で複数種類のターゲット分子を同時に検出する工程とか
らなる。
類のターゲット分子の同時検出方法を提供する。 【解決手段】 複数種類のターゲット分子１１，１２に
対して特異的に結合し得る特異的結合性分子にその種類
ごとに異なる種類のハプテンを標識してなるハプテン標
識分子２１，２２を準備する工程と，ハプテンと特異的
にカップリングする抗ハプテン抗体とその種類ごとに異
なる種類の酵素とからなる酵素標識抗ハプテン抗体３
１，３２を準備する工程と，酵素と特異的に反応して異
なった色に蛍光し得る蛍光物質４１，４２を準備する工
程と，ターゲット分子にハプテン標識分子を結合させ，
ハプテン標識分子に酵素標識抗ハプテン抗体をカップリ
ングさせ，酵素に蛍光基質を反応させ，異なった蛍光色
で複数種類のターゲット分子を同時に検出する工程とか
らなる。
Description
【０００１】
【技術分野】本発明は，蛍光基質を用いた，複数種類の
ターゲット分子の同時検出方法に関する。
ターゲット分子の同時検出方法に関する。
【０００２】
【従来技術】アルカリホスファターゼ（以下，ＡＬＰと
もいう。）の発色基質を複数種類用いて，異なる塩基配
列を有する核酸を検出するマルチカラーディテクション
キットがＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍより
市販されている。このキットを用いた検出方法について
説明する。まず，図１３に示すごとく，ターゲットＤＮ
Ａ９１１〜９１３を混合し，これらをゲル９２において
電気泳動させ（図１３（Ａ）），次いでこれらをナイロ
ン製のメンブレン９３に転写する（図１３（Ｂ））。
もいう。）の発色基質を複数種類用いて，異なる塩基配
列を有する核酸を検出するマルチカラーディテクション
キットがＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍより
市販されている。このキットを用いた検出方法について
説明する。まず，図１３に示すごとく，ターゲットＤＮ
Ａ９１１〜９１３を混合し，これらをゲル９２において
電気泳動させ（図１３（Ａ）），次いでこれらをナイロ
ン製のメンブレン９３に転写する（図１３（Ｂ））。
【０００３】次いで，ディゴキシゲニン（以下，ＤＩＧ
ともいう。）を標識したプローブＤＮＡ９２１と，ビオ
チン（以下，ＢＩＯともいう。）を標識したプローブＤ
ＮＡ９２２と，フルオレセイン（以下，ＦＬＵＯＳとも
いう。）を標識したプローブＤＮＡ９２３とを準備す
る。次いで，これらのプローブＤＮＡ９２１〜９２３を
混合して，メンブレン９３上のターゲットＤＮＡ９１１
〜９１３とハイブリダイゼーションさせる（図１３
（Ｃ））。
ともいう。）を標識したプローブＤＮＡ９２１と，ビオ
チン（以下，ＢＩＯともいう。）を標識したプローブＤ
ＮＡ９２２と，フルオレセイン（以下，ＦＬＵＯＳとも
いう。）を標識したプローブＤＮＡ９２３とを準備す
る。次いで，これらのプローブＤＮＡ９２１〜９２３を
混合して，メンブレン９３上のターゲットＤＮＡ９１１
〜９１３とハイブリダイゼーションさせる（図１３
（Ｃ））。
【０００４】次いで，図１４（Ｄ１）に示すごとく，Ｄ
ＩＧを標識したプローブＤＮＡ９２１に対して，ＡＬＰ
標識抗ＤＩＧ抗体９３１をカップリングさせる。次い
で，ＡＬＰに対して，ナフトールＡＳ−ＧＲのリン酸体
とＦａｓｔ Ｂｌｕｅ Ｂ（ジアゾニウム塩）とを組み
合わせた蛍光基質９４１を反応させる。次いで，図１４
（Ｄ２）に示すごとく，メンブレンを加熱し，ターゲッ
トＤＮＡ９１１に結合しているＡＬＰを失活させる。
ＩＧを標識したプローブＤＮＡ９２１に対して，ＡＬＰ
標識抗ＤＩＧ抗体９３１をカップリングさせる。次い
で，ＡＬＰに対して，ナフトールＡＳ−ＧＲのリン酸体
とＦａｓｔ Ｂｌｕｅ Ｂ（ジアゾニウム塩）とを組み
合わせた蛍光基質９４１を反応させる。次いで，図１４
（Ｄ２）に示すごとく，メンブレンを加熱し，ターゲッ
トＤＮＡ９１１に結合しているＡＬＰを失活させる。
【０００５】次いで，図１４（Ｅ１）に示すごとく，Ｂ
ＩＯを標識したプローブＤＮＡ９２２に対して，ＡＬＰ
標識抗ＢＩＯ抗体９３２をカップリングさせる。次い
で，ＡＬＰに対して，ナフトールＡＳのリン酸体とＦａ
ｓｔ Ｒｅｄ ＴＲ（ジアゾニウム塩）とを組み合わせ
た蛍光基質９４２を反応させる。次いで，図１４（Ｅ
２）に示すごとく，メンブレンを加熱し，ターゲットＤ
ＮＡ９１２に結合しているＡＬＰを失活させる。
ＩＯを標識したプローブＤＮＡ９２２に対して，ＡＬＰ
標識抗ＢＩＯ抗体９３２をカップリングさせる。次い
で，ＡＬＰに対して，ナフトールＡＳのリン酸体とＦａ
ｓｔ Ｒｅｄ ＴＲ（ジアゾニウム塩）とを組み合わせ
た蛍光基質９４２を反応させる。次いで，図１４（Ｅ
２）に示すごとく，メンブレンを加熱し，ターゲットＤ
ＮＡ９１２に結合しているＡＬＰを失活させる。
【０００６】次いで，図１４（Ｆ１）に示すごとく，Ｆ
ＬＵＯＳを標識したプローブＤＮＡ９２３に対して，Ａ
ＬＰ標識抗ＦＬＵＯＳ抗体９３３をカップリングさせ
る。次いで，ＡＬＰに対して，ナフトールＡＳのリン酸
体とＦａｓｔ Ｂｌｕｅ Ｂ（ジアゾニウム塩）とを組
み合わせた蛍光基質９４３を反応させる。次いで，図１
４（Ｆ２）に示すごとく，メンブレンを加熱し，ターゲ
ットＤＮＡ９１３に結合しているＡＬＰを失活させる。
ＬＵＯＳを標識したプローブＤＮＡ９２３に対して，Ａ
ＬＰ標識抗ＦＬＵＯＳ抗体９３３をカップリングさせ
る。次いで，ＡＬＰに対して，ナフトールＡＳのリン酸
体とＦａｓｔ Ｂｌｕｅ Ｂ（ジアゾニウム塩）とを組
み合わせた蛍光基質９４３を反応させる。次いで，図１
４（Ｆ２）に示すごとく，メンブレンを加熱し，ターゲ
ットＤＮＡ９１３に結合しているＡＬＰを失活させる。
【０００７】次に，図１４（Ｇ）に示すごとく，ナイロ
ンメンブレン９３に励起光を照射して，蛍光物質９４１
〜９４３からの反応生成物を励起させる。これにより，
ターゲットＤＮＡ９１１は緑色で検出され，ターゲット
ＤＮＡ９１２は赤色で検出され，ターゲットＤＮＡ９１
３は青色で検出される。
ンメンブレン９３に励起光を照射して，蛍光物質９４１
〜９４３からの反応生成物を励起させる。これにより，
ターゲットＤＮＡ９１１は緑色で検出され，ターゲット
ＤＮＡ９１２は赤色で検出され，ターゲットＤＮＡ９１
３は青色で検出される。
【０００８】
【解決しようとする課題】上記従来の多色プローブ法を
用いたＤＮＡの検出方法は，検出シグナルが色であるた
め，感度が低い。また，いずれのターゲットＤＮＡ９１
１〜９１３ともアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の反
応により検出しているため，各ターゲットＤＮＡに結合
した酵素の反応が終了する度に，ＡＬＰを失活する工程
を行わなければならない。そのため，検出操作が複雑で
ある。
用いたＤＮＡの検出方法は，検出シグナルが色であるた
め，感度が低い。また，いずれのターゲットＤＮＡ９１
１〜９１３ともアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の反
応により検出しているため，各ターゲットＤＮＡに結合
した酵素の反応が終了する度に，ＡＬＰを失活する工程
を行わなければならない。そのため，検出操作が複雑で
ある。
【０００９】また，ＡＬＰの失活が不十分である場合に
は，次のターゲットＤＮＡに結合させたＡＬＰの酵素反
応においても前回にターゲットＤＮＡに結合させたＡＬ
Ｐも反応してしまい，種類の異なるターゲットＤＮＡの
発色の区別がつかなくなり，多色プローブ法を使えなく
なる場合がある。
は，次のターゲットＤＮＡに結合させたＡＬＰの酵素反
応においても前回にターゲットＤＮＡに結合させたＡＬ
Ｐも反応してしまい，種類の異なるターゲットＤＮＡの
発色の区別がつかなくなり，多色プローブ法を使えなく
なる場合がある。
【００１０】本発明はかかる従来の問題点に鑑み，検出
感度が高く，検出操作が容易な，複数種類のターゲット
分子の同時検出方法を提供しようとするものである。
感度が高く，検出操作が容易な，複数種類のターゲット
分子の同時検出方法を提供しようとするものである。
【００１１】
【課題の解決手段】請求項１の発明は，検出すべき複数
種類のターゲット分子に対して特異的に結合する性質を
有する特異的結合性分子に，該特異的結合性分子の種類
ごとに異なる種類のハプテンを標識してなるハプテン標
識分子を準備する工程と，上記ハプテンと特異的にカッ
プリングする抗ハプテン抗体と，該抗ハプテン抗体の種
類ごとに異なる種類の酵素とからなる酵素標識抗ハプテ
ン抗体を準備する工程と，上記酵素と特異的に反応して
それぞれ異なった色に蛍光し得る蛍光物質を準備する工
程と，検出すべき複数種類のターゲット分子に上記ハプ
テン標識分子を結合させる工程と，上記ハプテン標識分
子に上記酵素標識抗ハプテン抗体をカップリングさせる
工程と，上記酵素に蛍光基質を反応させる工程と，異な
った蛍光色で上記複数種類のターゲット分子を同時に検
出する工程とからなることを特徴とする複数種類のター
ゲット分子の同時検出方法である。
種類のターゲット分子に対して特異的に結合する性質を
有する特異的結合性分子に，該特異的結合性分子の種類
ごとに異なる種類のハプテンを標識してなるハプテン標
識分子を準備する工程と，上記ハプテンと特異的にカッ
プリングする抗ハプテン抗体と，該抗ハプテン抗体の種
類ごとに異なる種類の酵素とからなる酵素標識抗ハプテ
ン抗体を準備する工程と，上記酵素と特異的に反応して
それぞれ異なった色に蛍光し得る蛍光物質を準備する工
程と，検出すべき複数種類のターゲット分子に上記ハプ
テン標識分子を結合させる工程と，上記ハプテン標識分
子に上記酵素標識抗ハプテン抗体をカップリングさせる
工程と，上記酵素に蛍光基質を反応させる工程と，異な
った蛍光色で上記複数種類のターゲット分子を同時に検
出する工程とからなることを特徴とする複数種類のター
ゲット分子の同時検出方法である。
【００１２】本発明において最も特徴とすることは，検
出すべきターゲット分子の種類に対応して，特異的結合
性分子にハプテンを標識してなるハプテン標識分子，酵
素標識抗ハプテン抗体，及び蛍光色の異なる蛍光基質を
用いたことである。
出すべきターゲット分子の種類に対応して，特異的結合
性分子にハプテンを標識してなるハプテン標識分子，酵
素標識抗ハプテン抗体，及び蛍光色の異なる蛍光基質を
用いたことである。
【００１３】即ち，ターゲット分子のそれぞれに特異的
にハプテン標識分子を結合させ，これに抗原抗体反応を
利用して，異なった酵素を標識した酵素標識抗ハプテン
抗体をカップリングさせ，更に各酵素に対して発色の異
なる蛍光基質を反応させる。そのため，各ターゲット分
子を，その種類ごとに，異なる蛍光色で検出することが
できる。
にハプテン標識分子を結合させ，これに抗原抗体反応を
利用して，異なった酵素を標識した酵素標識抗ハプテン
抗体をカップリングさせ，更に各酵素に対して発色の異
なる蛍光基質を反応させる。そのため，各ターゲット分
子を，その種類ごとに，異なる蛍光色で検出することが
できる。
【００１４】また，本発明の各工程を１通り行うことに
より，複数種類のターゲット分子を同時に検出すること
ができる。従来のように，各ターゲット分子毎に別々に
酵素反応を行う必要はない。そのため，従来に比べて操
作が非常に簡便である。また，ターゲット分子の種類の
大小にかかわらず，短時間で検出することができる。
より，複数種類のターゲット分子を同時に検出すること
ができる。従来のように，各ターゲット分子毎に別々に
酵素反応を行う必要はない。そのため，従来に比べて操
作が非常に簡便である。また，ターゲット分子の種類の
大小にかかわらず，短時間で検出することができる。
【００１５】また，異なった種類の酵素を同時に反応さ
せているため，従来のように各酵素反応終了後に酵素を
失活させる操作は不要であり，検出操作が簡便である。
また，酵素失活不良による検出の誤差もなく，検出感度
が極めて高い。
せているため，従来のように各酵素反応終了後に酵素を
失活させる操作は不要であり，検出操作が簡便である。
また，酵素失活不良による検出の誤差もなく，検出感度
が極めて高い。
【００１６】例えば，請求項３の発明のように，上記タ
ーゲット分子は，核酸，抗体，抗原，又は蛋白質であ
る。
ーゲット分子は，核酸，抗体，抗原，又は蛋白質であ
る。
【００１７】特異的結合性分子は，ターゲット分子に対
して特異的に結合する性質を有するものであれば，特に
限定しない。例えば，請求項４の発明のように，上記特
異的結合性分子は，核酸プローブ，又は抗体がある。
して特異的に結合する性質を有するものであれば，特に
限定しない。例えば，請求項４の発明のように，上記特
異的結合性分子は，核酸プローブ，又は抗体がある。
【００１８】請求項５の発明のように，上記ハプテン
は，ジベレリン，ビオチン，又はフルオレセインである
ことが好ましい。これにより，ハプテンと抗ハプテン抗
体との結合性が向上する。ジベレリンとしては，検出感
度の観点から，特に，ジベレリンＡ４を用いることが好
ましい。また，抗ハプテン抗体としては，かかるハプテ
ンに対応する抗ハプテン抗体を用いる。
は，ジベレリン，ビオチン，又はフルオレセインである
ことが好ましい。これにより，ハプテンと抗ハプテン抗
体との結合性が向上する。ジベレリンとしては，検出感
度の観点から，特に，ジベレリンＡ４を用いることが好
ましい。また，抗ハプテン抗体としては，かかるハプテ
ンに対応する抗ハプテン抗体を用いる。
【００１９】酵素は，抗ハプテン抗体ごとに異なった種
類のものを選択する。請求項６の発明のように，上記酵
素は，アルカリ性ホスファターゼ，酸性ホスファター
ゼ，ペルオキシダーゼ，エステラーゼ，及びβ−ガラク
トシダーゼ等の加水分解酵素のグループから複数種類が
選択されることが好ましい。これらは蛍光基質との反応
が高いため，検出感度が高くなるからである。
類のものを選択する。請求項６の発明のように，上記酵
素は，アルカリ性ホスファターゼ，酸性ホスファター
ゼ，ペルオキシダーゼ，エステラーゼ，及びβ−ガラク
トシダーゼ等の加水分解酵素のグループから複数種類が
選択されることが好ましい。これらは蛍光基質との反応
が高いため，検出感度が高くなるからである。
【００２０】請求項７の発明のように，上記酵素標識抗
ハプテン抗体は，アルカリ性ホスファターゼ標識抗ジベ
レリン抗体，酸性ホスファターゼ標識抗ジベレリン抗
体，ペルオキシダーゼ標識抗ジベレリン抗体，エステラ
ーゼ標識抗ジベレリン抗体，β−ガラクトシダーゼ標識
抗ジベレリン抗体，アルカリ性ホスファターゼ標識抗ビ
オチン抗体，酸性ホスファターゼ標識抗ビオチン抗体，
ペルオキシダーゼ標識抗ビオチン抗体，エステラーゼ標
識抗ビオチン抗体，β−ガラクトシダーゼ標識抗ビオチ
ン抗体，アルカリ性ホスファターゼ標識抗フルオレセイ
ン抗体，酸性ホスファターゼ標識抗フルオレセイン抗
体，ペルオキシダーゼ標識抗フルオレセイン抗体，エス
テラーゼ標識抗フルオレセイン抗体，及びβ−ガラクト
シダーゼ標識抗フルオレセイン抗体のグループから，複
数種類が選択されることが好ましい。これらは，ハプテ
ンとの結合性が高く，かつ蛍光基質との反応性が高いた
め，更に検出感度が高くなる。なお，ハプテンがジベレ
リンＡ４の場合には，抗ジベレリン抗体を用いる。
ハプテン抗体は，アルカリ性ホスファターゼ標識抗ジベ
レリン抗体，酸性ホスファターゼ標識抗ジベレリン抗
体，ペルオキシダーゼ標識抗ジベレリン抗体，エステラ
ーゼ標識抗ジベレリン抗体，β−ガラクトシダーゼ標識
抗ジベレリン抗体，アルカリ性ホスファターゼ標識抗ビ
オチン抗体，酸性ホスファターゼ標識抗ビオチン抗体，
ペルオキシダーゼ標識抗ビオチン抗体，エステラーゼ標
識抗ビオチン抗体，β−ガラクトシダーゼ標識抗ビオチ
ン抗体，アルカリ性ホスファターゼ標識抗フルオレセイ
ン抗体，酸性ホスファターゼ標識抗フルオレセイン抗
体，ペルオキシダーゼ標識抗フルオレセイン抗体，エス
テラーゼ標識抗フルオレセイン抗体，及びβ−ガラクト
シダーゼ標識抗フルオレセイン抗体のグループから，複
数種類が選択されることが好ましい。これらは，ハプテ
ンとの結合性が高く，かつ蛍光基質との反応性が高いた
め，更に検出感度が高くなる。なお，ハプテンがジベレ
リンＡ４の場合には，抗ジベレリン抗体を用いる。
【００２１】蛍光基質は，互いに異なる色に蛍光するも
のを複数種類選択する。請求項８の発明のように，上記
アルカリ性ホスファターゼ又は酸性ホスファターゼの蛍
光基質は，「図１」，「図２」，「図３」に示すいずれ
かの骨格を有し，「図１」，「図２」において，Ｒ１，
Ｒ２はアルキル基，芳香族基，アルコキシル基及びハロ
ゲン基のグループから選ばれる１種又は２種以上であ
り，「図３」において，Ｒ３は芳香族基又は縮合芳香族
基を有する有機物であり，ｎ１は１〜１０であることが
好ましい。これにより，蛍光強度が高くなり，検出感度
が向上する。図１〜図３に示す骨格を有する蛍光基質
は，アルカリ性ホスファターゼ又は酸性ホスファターゼ
と反応し励起されることにより，図１のものは青色に，
図２のものは緑色に，図３のものは黄緑色に蛍光する。
のを複数種類選択する。請求項８の発明のように，上記
アルカリ性ホスファターゼ又は酸性ホスファターゼの蛍
光基質は，「図１」，「図２」，「図３」に示すいずれ
かの骨格を有し，「図１」，「図２」において，Ｒ１，
Ｒ２はアルキル基，芳香族基，アルコキシル基及びハロ
ゲン基のグループから選ばれる１種又は２種以上であ
り，「図３」において，Ｒ３は芳香族基又は縮合芳香族
基を有する有機物であり，ｎ１は１〜１０であることが
好ましい。これにより，蛍光強度が高くなり，検出感度
が向上する。図１〜図３に示す骨格を有する蛍光基質
は，アルカリ性ホスファターゼ又は酸性ホスファターゼ
と反応し励起されることにより，図１のものは青色に，
図２のものは緑色に，図３のものは黄緑色に蛍光する。
【００２２】請求項９の発明のように，上記ペルオキシ
ダーゼの蛍光基質は，「図４」に示す骨格を有し，「図
４」において，Ｒ４は水素，アルキル基，芳香族基，ア
ルコキシル基及びハロゲン基のグループから選ばれる１
種又は２種以上であることが好ましい。これにより，蛍
光強度が高くなり，検出感度が向上する。図４に示す骨
格を有する蛍光基質は，ペルオキシダーゼと反応し励起
されることにより，オレンジ色に蛍光する。
ダーゼの蛍光基質は，「図４」に示す骨格を有し，「図
４」において，Ｒ４は水素，アルキル基，芳香族基，ア
ルコキシル基及びハロゲン基のグループから選ばれる１
種又は２種以上であることが好ましい。これにより，蛍
光強度が高くなり，検出感度が向上する。図４に示す骨
格を有する蛍光基質は，ペルオキシダーゼと反応し励起
されることにより，オレンジ色に蛍光する。
【００２３】請求項１０の発明のように，上記エステラ
ーゼの蛍光基質は，「図５」，「図６」，「図７」に示
すいずれかの骨格を有し，「図５」において，Ｒ５は芳
香族基又は縮合芳香族基を有する有機物であり，ｎ２は
１〜１０であり，「図６」，「図７」において，Ｒ６，
Ｒ７は，アルキル基，芳香族基，アルコキシル基及びハ
ロゲン基のグループから選ばれる１種又は２種以上であ
ることが好ましい。これにより，蛍光強度が高くなり，
検出感度が向上する。図５〜図７に示す骨格を有する蛍
光基質は，エステラーゼと反応することにより，いずれ
も黄緑色に蛍光する。
ーゼの蛍光基質は，「図５」，「図６」，「図７」に示
すいずれかの骨格を有し，「図５」において，Ｒ５は芳
香族基又は縮合芳香族基を有する有機物であり，ｎ２は
１〜１０であり，「図６」，「図７」において，Ｒ６，
Ｒ７は，アルキル基，芳香族基，アルコキシル基及びハ
ロゲン基のグループから選ばれる１種又は２種以上であ
ることが好ましい。これにより，蛍光強度が高くなり，
検出感度が向上する。図５〜図７に示す骨格を有する蛍
光基質は，エステラーゼと反応することにより，いずれ
も黄緑色に蛍光する。
【００２４】次に，請求項２の発明は，検出すべき複数
種類のターゲット分子に対して特異的に結合する性質を
有する特異的結合性分子に，該特異的結合性分子の種類
ごとに異なる種類のハプテンを標識してなるハプテン標
識分子を準備する工程と，上記ハプテンと特異的にカッ
プリングする抗ハプテン抗体と，該抗ハプテン抗体の種
類ごとに異なる種類の酵素とからなる酵素標識抗ハプテ
ン抗体を準備する工程と，検出すべきターゲット分子の
有無を判断すべき被検体に上記ハプテン標識分子を添加
する工程と，上記被検体に上記酵素標識抗ハプテン抗体
を添加する工程と，上記被検体に上記蛍光基質を添加す
る工程と，上記被検体から発する蛍光の有無，及び蛍光
色を検査することにより，上記被検体に複数種類のター
ゲット分子が存在するか否かを検査する工程とからなる
ことを特徴とすることを特徴とする複数種類のターゲッ
ト分子の同時検出方法である。
種類のターゲット分子に対して特異的に結合する性質を
有する特異的結合性分子に，該特異的結合性分子の種類
ごとに異なる種類のハプテンを標識してなるハプテン標
識分子を準備する工程と，上記ハプテンと特異的にカッ
プリングする抗ハプテン抗体と，該抗ハプテン抗体の種
類ごとに異なる種類の酵素とからなる酵素標識抗ハプテ
ン抗体を準備する工程と，検出すべきターゲット分子の
有無を判断すべき被検体に上記ハプテン標識分子を添加
する工程と，上記被検体に上記酵素標識抗ハプテン抗体
を添加する工程と，上記被検体に上記蛍光基質を添加す
る工程と，上記被検体から発する蛍光の有無，及び蛍光
色を検査することにより，上記被検体に複数種類のター
ゲット分子が存在するか否かを検査する工程とからなる
ことを特徴とすることを特徴とする複数種類のターゲッ
ト分子の同時検出方法である。
【００２５】本発明は，上記請求項１の発明を利用し
て，被検体の中に複数種類のターゲット分子が存在する
か否かを同時に検出するものである。被検体の中に，検
出すべきターゲット分子が存在しない場合には，被検体
は何ら蛍光を示さないが，１種でもターゲット分子が存
在するには，被検体中のターゲット分子が，その種類ご
とに異なった色に蛍光する。蛍光基質による蛍光が検出
された場合，どの蛍光色がどのターゲット分子に対応す
るかは，ターゲット分子に抗原抗体反応により結合させ
た酵素と反応する蛍光物質の種類により予想されるた
め，蛍光した色からターゲット分子の種類を知ることが
できる。
て，被検体の中に複数種類のターゲット分子が存在する
か否かを同時に検出するものである。被検体の中に，検
出すべきターゲット分子が存在しない場合には，被検体
は何ら蛍光を示さないが，１種でもターゲット分子が存
在するには，被検体中のターゲット分子が，その種類ご
とに異なった色に蛍光する。蛍光基質による蛍光が検出
された場合，どの蛍光色がどのターゲット分子に対応す
るかは，ターゲット分子に抗原抗体反応により結合させ
た酵素と反応する蛍光物質の種類により予想されるた
め，蛍光した色からターゲット分子の種類を知ることが
できる。
【００２６】請求項２の発明における各構成要素は，請
求項３〜請求項１０のものを用いることが好ましい。以
上の請求項１〜１０の発明は，発光学，臨床検査，免疫
学，遺伝子診断，特に癌遺伝子の転移の有無を検査する
ために用いることができる。
求項３〜請求項１０のものを用いることが好ましい。以
上の請求項１〜１０の発明は，発光学，臨床検査，免疫
学，遺伝子診断，特に癌遺伝子の転移の有無を検査する
ために用いることができる。
【００２７】
実施形態例１ 本発明の実施形態例にかかる複数種類のターゲット分子
の同時検出方法について，図８〜図１１を用いて説明す
る。本例の概要を説明すると，まず，図８（Ａ），
（Ｂ）に示すごとく，ターゲット分子１１，１２として
のＤＮＡ断片をアガロースゲル２の中で電気泳動させ，
次いでこれらをメンブレン３に転写する。
の同時検出方法について，図８〜図１１を用いて説明す
る。本例の概要を説明すると，まず，図８（Ａ），
（Ｂ）に示すごとく，ターゲット分子１１，１２として
のＤＮＡ断片をアガロースゲル２の中で電気泳動させ，
次いでこれらをメンブレン３に転写する。
【００２８】次いで，図８（Ｃ）に示すごとく，検出す
べき複数種類のターゲット分子１１，１２に対して特異
的に結合する性質を有するプローブＤＮＡにハプテン
（ＤＩＧ，Ｆｌｏｕｓ）を標識してなる複数種類のハプ
テン標識分子２１，２２を準備する。次いで，ハプテン
標識分子２１，２２とターゲット分子１１，１２とをそ
れぞれ結合させる。
べき複数種類のターゲット分子１１，１２に対して特異
的に結合する性質を有するプローブＤＮＡにハプテン
（ＤＩＧ，Ｆｌｏｕｓ）を標識してなる複数種類のハプ
テン標識分子２１，２２を準備する。次いで，ハプテン
標識分子２１，２２とターゲット分子１１，１２とをそ
れぞれ結合させる。
【００２９】次いで，図９（Ｄ）に示すごとく，ハプテ
ン標識分子２１，２２に，複数種類の異なった酵素を標
識した酵素標識抗ハプテン抗体３１，３２をカップリン
グさせる。次いで，各酵素に蛍光基質４１，４２を反応
させる。次いで，図９（Ｅ）に示すごとく，メンブレン
３に励起光を照射することにより，異なった蛍光色で上
記複数のターゲット分子１１，１２を同時に検出する。
ン標識分子２１，２２に，複数種類の異なった酵素を標
識した酵素標識抗ハプテン抗体３１，３２をカップリン
グさせる。次いで，各酵素に蛍光基質４１，４２を反応
させる。次いで，図９（Ｅ）に示すごとく，メンブレン
３に励起光を照射することにより，異なった蛍光色で上
記複数のターゲット分子１１，１２を同時に検出する。
【００３０】２種類のターゲット分子１１，１２として
は，制限酵素（ＥｃｏＲＩ）で切断したλＤＮＡ，Ｃｏ
ｌＥ１を用いる。ハプテン標識分子２１，２２として
は，ＤＩＧを標識した，λＤＮＡ／ＥｃｏＲＩと相補的
なＤＮＡプローブと，Ｆｌｏｕｓを標識した，λＤＮＡ
／ＥｃｏＲＩと相補的なＤＮＡプローブとを用いる。
は，制限酵素（ＥｃｏＲＩ）で切断したλＤＮＡ，Ｃｏ
ｌＥ１を用いる。ハプテン標識分子２１，２２として
は，ＤＩＧを標識した，λＤＮＡ／ＥｃｏＲＩと相補的
なＤＮＡプローブと，Ｆｌｏｕｓを標識した，λＤＮＡ
／ＥｃｏＲＩと相補的なＤＮＡプローブとを用いる。
【００３１】酵素標識抗ハプテン抗体３１，３２として
は，ＰＯＤ標識抗ＤＩＧ抗体と，ＡＬＰ標識抗Ｆｌｏｕ
ｓ抗体とを用いる。ＰＯＤに対する蛍光物質４１として
は４−ｂｅｎｚｏｙｌａｍｉｎｏ−２−ｍｅｔｈｏｘｙ
−５−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｅｎｅａｍｉｎｅ（図１
０）を用い，ＡＬＰに対する蛍光物質４２としてはＨＮ
ＰＰ（自社品）（図１１）を用いる。
は，ＰＯＤ標識抗ＤＩＧ抗体と，ＡＬＰ標識抗Ｆｌｏｕ
ｓ抗体とを用いる。ＰＯＤに対する蛍光物質４１として
は４−ｂｅｎｚｏｙｌａｍｉｎｏ−２−ｍｅｔｈｏｘｙ
−５−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｅｎｅａｍｉｎｅ（図１
０）を用い，ＡＬＰに対する蛍光物質４２としてはＨＮ
ＰＰ（自社品）（図１１）を用いる。
【００３２】以下，これを詳細に説明する。ＥｃｏＲ１
で消化したλＤＮＡ，ＣｏｌＥＩを泳動レーン当たりそ
れぞれ５ｎｇ，１ｎｇになるように混合し，１％アガロ
ースゲルを用いて電気泳動を行った。電源電圧は５０Ｖ
で，泳動用緩衝液としてはＴＡＥ（トリスアセテートＥ
ＤＴＡ）を用いた。電気泳動を行った後，アガロースゲ
ルを０．２５Ｎ塩酸に５分間浸漬し，更に０．５Ｎ塩化
ナトリウムに１０分間浸漬した。
で消化したλＤＮＡ，ＣｏｌＥＩを泳動レーン当たりそ
れぞれ５ｎｇ，１ｎｇになるように混合し，１％アガロ
ースゲルを用いて電気泳動を行った。電源電圧は５０Ｖ
で，泳動用緩衝液としてはＴＡＥ（トリスアセテートＥ
ＤＴＡ）を用いた。電気泳動を行った後，アガロースゲ
ルを０．２５Ｎ塩酸に５分間浸漬し，更に０．５Ｎ塩化
ナトリウムに１０分間浸漬した。
【００３３】次に，真空ブロッティングによりアガロー
スゲル中のＤＮＡをナイロン製のメンブレンに転写し
た。これを２倍濃度のＳＳＣ（１×ＳＳＣ；１５ｍＭＮ
ａＣｌ，１５ｍＭクエン酸ｐＨ７．５）で５分間洗浄す
る操作を２回繰り返した。次いで，ＵＶ照射によりＤＮ
Ａをメンブレンに固定した。
スゲル中のＤＮＡをナイロン製のメンブレンに転写し
た。これを２倍濃度のＳＳＣ（１×ＳＳＣ；１５ｍＭＮ
ａＣｌ，１５ｍＭクエン酸ｐＨ７．５）で５分間洗浄す
る操作を２回繰り返した。次いで，ＵＶ照射によりＤＮ
Ａをメンブレンに固定した。
【００３４】次に，ブロッキングのため，市販のハイブ
リダイゼーション溶液（ＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ．ベ
ーリンガーマンハイム社）を用いて，そのハイブリダイ
ズ用溶液に３７℃，３０分間浸漬した。次いで，ＤＩＧ
で標識した，λ／ＥｃｏＲＩと相補的なＤＮＡプローブ
（１００ｎｇ）と，Ｆｌｏｕｓで標識した，ＣｏｌＥＩ
／ＥｃｏＲＩと相補的なＤＮＡプローブ（５０ｎｇ）と
を，１ｍｌのＤＩＧ ＥａｓｙＨｙｂ（ベーリンガーマ
ンハイム社ハイブリダイゼーション溶液）中で混合し，
これをプローブ液としてメンブレンにのせ，３７℃で２
０時間ハイブリダイゼーションを行った。
リダイゼーション溶液（ＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ．ベ
ーリンガーマンハイム社）を用いて，そのハイブリダイ
ズ用溶液に３７℃，３０分間浸漬した。次いで，ＤＩＧ
で標識した，λ／ＥｃｏＲＩと相補的なＤＮＡプローブ
（１００ｎｇ）と，Ｆｌｏｕｓで標識した，ＣｏｌＥＩ
／ＥｃｏＲＩと相補的なＤＮＡプローブ（５０ｎｇ）と
を，１ｍｌのＤＩＧ ＥａｓｙＨｙｂ（ベーリンガーマ
ンハイム社ハイブリダイゼーション溶液）中で混合し，
これをプローブ液としてメンブレンにのせ，３７℃で２
０時間ハイブリダイゼーションを行った。
【００３５】２倍濃度のＳＳＣ，濃度０．１％ＳＤＳ
（ドデシル硫酸ナトリウム）で５分間２回洗った。更
に，濃度１／１０濃度ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳを用い
て，５５℃１５分間２回洗った。続いて，ブロッキング
バッファー（市販品）に２０分間浸漬した。
（ドデシル硫酸ナトリウム）で５分間２回洗った。更
に，濃度１／１０濃度ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳを用い
て，５５℃１５分間２回洗った。続いて，ブロッキング
バッファー（市販品）に２０分間浸漬した。
【００３６】ＰＯＤ標識抗ＤＩＧ抗体とＡＬＰ標識抗Ｆ
ｌｏｕｓ抗体との混合液（それぞれ濃度１／１０００，
濃度１／２０００）をメンブレン上にのせ，３０分間静
置した。続いて，ブロッキングバッファーで１０分間３
回洗浄した。
ｌｏｕｓ抗体との混合液（それぞれ濃度１／１０００，
濃度１／２０００）をメンブレン上にのせ，３０分間静
置した。続いて，ブロッキングバッファーで１０分間３
回洗浄した。
【００３７】次に，２ｍＭの４−ｂｅｎｚｏｙｌａｍｉ
ｎｏ−２−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚ
ｅｎｅａｍｉｎｅ，８０μＭのＨＮＰＰ，０．１ＭのＴ
ｒｉｓ（ｐＨ７．５），１０ｍＭの塩化マグネシウム，
０．００３％の過酸化水素とからなる蛍光基質溶液を，
メンブレンにのせ酵素反応を室温で３時間行った。反応
後，メンブレンにＵＶ励起光を照射し，蛍光シグナルの
観察を行った。
ｎｏ−２−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚ
ｅｎｅａｍｉｎｅ，８０μＭのＨＮＰＰ，０．１ＭのＴ
ｒｉｓ（ｐＨ７．５），１０ｍＭの塩化マグネシウム，
０．００３％の過酸化水素とからなる蛍光基質溶液を，
メンブレンにのせ酵素反応を室温で３時間行った。反応
後，メンブレンにＵＶ励起光を照射し，蛍光シグナルの
観察を行った。
【００３８】図９（Ｅ）に示すごとく，ターゲット分子
１１としてのλ／ＥｃｏＲＩがオレンジ色に蛍光し，タ
ーゲット分子１２としてのＣｏｌＥＩ／ＥｃｏＲＩが青
色に，２色の蛍光シグナルがメンブレン３上に検出され
た。
１１としてのλ／ＥｃｏＲＩがオレンジ色に蛍光し，タ
ーゲット分子１２としてのＣｏｌＥＩ／ＥｃｏＲＩが青
色に，２色の蛍光シグナルがメンブレン３上に検出され
た。
【００３９】実施形態例２ 本例においては，３種類のターゲット分子を同時に検出
した。３種類のターゲット分子としては，ＥｃｏＲＩで
切断したλＤＮＡ，ＣｏｌＥ１，ｐＢＲ３２２を用い
た。
した。３種類のターゲット分子としては，ＥｃｏＲＩで
切断したλＤＮＡ，ＣｏｌＥ１，ｐＢＲ３２２を用い
た。
【００４０】ハプテン標識分子としては，ＤＩＧを標識
した，λＤＮＡ／ＥｃｏＲＩと相補的なＤＮＡプローブ
と，Ｆｌｏｕｓを標識した，ＣｏｌＥ１／ＥｃｏＲＩと
相補的なＤＮＡプローブと，ＢＩＯを標識した，ｐＢＲ
３２２／ＥｃｏＲＩと相補的なＤＮＡプローブとを用い
た。
した，λＤＮＡ／ＥｃｏＲＩと相補的なＤＮＡプローブ
と，Ｆｌｏｕｓを標識した，ＣｏｌＥ１／ＥｃｏＲＩと
相補的なＤＮＡプローブと，ＢＩＯを標識した，ｐＢＲ
３２２／ＥｃｏＲＩと相補的なＤＮＡプローブとを用い
た。
【００４１】酵素標識抗ハプテン抗体としては，ＰＯＤ
標識抗ＤＩＧ抗体と，ＡＬＰ標識抗Ｆｌｏｕｓ抗体と，
エステラーゼ標識抗ＢＩＯ抗体とを用いた。ＰＯＤに対
する蛍光物質としては４−ｂｅｎｚｏｙｌａｍｉｎｏ−
２−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｅｎｅ
ａｍｉｎｅ（図１０）を用い，ＡＬＰに対する蛍光物質
としてはＨＮＰＰ（図１１）を用い，エステラーゼに対
する蛍光物質としてはＢＮＦアセテート（自社製品）
（図１２）を用いた。
標識抗ＤＩＧ抗体と，ＡＬＰ標識抗Ｆｌｏｕｓ抗体と，
エステラーゼ標識抗ＢＩＯ抗体とを用いた。ＰＯＤに対
する蛍光物質としては４−ｂｅｎｚｏｙｌａｍｉｎｏ−
２−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｅｎｅ
ａｍｉｎｅ（図１０）を用い，ＡＬＰに対する蛍光物質
としてはＨＮＰＰ（図１１）を用い，エステラーゼに対
する蛍光物質としてはＢＮＦアセテート（自社製品）
（図１２）を用いた。
【００４２】これらを用いて実施形態例１と同様の方法
で上記のターゲット分子の同時検出を行った。その結
果，λ／ＥｃｏＲＩがオレンジ色に蛍光し，ＣｏｌＥＩ
／ＥｃｏＲＩが青色に蛍光し，ｐＢＲ３２２／ＥｃｏＲ
Ｉが黄緑色の蛍光した。以上により，３種類のターゲッ
トＤＮＡを表示する３色の蛍光シグナルが検出された。
で上記のターゲット分子の同時検出を行った。その結
果，λ／ＥｃｏＲＩがオレンジ色に蛍光し，ＣｏｌＥＩ
／ＥｃｏＲＩが青色に蛍光し，ｐＢＲ３２２／ＥｃｏＲ
Ｉが黄緑色の蛍光した。以上により，３種類のターゲッ
トＤＮＡを表示する３色の蛍光シグナルが検出された。
【００４３】
【発明の効果】本発明によれば，検出感度が高く，検出
操作が容易な，複数種類のターゲット分子の同時検出方
法を提供することができる。
操作が容易な，複数種類のターゲット分子の同時検出方
法を提供することができる。
【図１】本発明における，アルカリ性ホスファターゼ又
は酸性ホスファターゼと反応し得る蛍光基質の化学構造
式を示す説明図。
は酸性ホスファターゼと反応し得る蛍光基質の化学構造
式を示す説明図。
【図２】本発明における，アルカリ性ホスファターゼ又
は酸性ホスファターゼと反応し得る蛍光基質の化学構造
式を示す説明図。
は酸性ホスファターゼと反応し得る蛍光基質の化学構造
式を示す説明図。
【図３】本発明における，アルカリ性ホスファターゼ又
は酸性ホスファターゼと反応し得る蛍光基質の化学構造
式を示す説明図。
は酸性ホスファターゼと反応し得る蛍光基質の化学構造
式を示す説明図。
【図４】本発明における，ペルオキシダーゼと反応し得
る蛍光基質の化学構造式を示す説明図。
る蛍光基質の化学構造式を示す説明図。
【図５】本発明における，エステラーゼと反応し得る蛍
光基質の化学構造式を示す説明図。
光基質の化学構造式を示す説明図。
【図６】本発明における，エステラーゼと反応し得る蛍
光基質の化学構造式を示す説明図。
光基質の化学構造式を示す説明図。
【図７】本発明における，エステラーゼと反応し得る蛍
光基質の化学構造式を示す説明図。
光基質の化学構造式を示す説明図。
【図８】実施形態例１における，２種類のターゲット分
子を同時に検出する方法を示す説明図。
子を同時に検出する方法を示す説明図。
【図９】図８に続く，２種類のターゲット分子を同時に
検出する方法を示す説明図。
検出する方法を示す説明図。
【図１０】実施形態例１，２における，４−ｂｅｎｚｏ
ｙｌａｍｉｎｏ−２−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙ
ｌｂｅｎｚｅｎｅａｍｉｎｅの化学構造式を示す説明
図。
ｙｌａｍｉｎｏ−２−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙ
ｌｂｅｎｚｅｎｅａｍｉｎｅの化学構造式を示す説明
図。
【図１１】実施形態例１，２における，ＨＮＰＰの化学
構造式を示す説明図。
構造式を示す説明図。
【図１２】実施形態例２における，ＢＮＦアセテートの
化学構造式を示す説明図。
化学構造式を示す説明図。
【図１３】従来例の多色プローブ法を示す説明図。
【図１４】図１３に続く，従来例の多色プローブ法を示
す説明図。
す説明図。
１１，１２．．．ターゲット分子， ２１，２２．．．ハプテン標識分子， ３１，３２．．．酵素標識抗ハプテン抗体， ４１，４２．．．蛍光基質，
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５０１ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５０１Ｄ 33/566 33/566 // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ (72)発明者 服部 篤 愛知県刈谷市八軒町５丁目50番地 株式会 社アイシン・コスモス研究所内 (72)発明者 パェディ イエラ レディ 愛知県刈谷市八軒町５丁目50番地 株式会 社アイシン・コスモス研究所内 (72)発明者 融 健 愛知県愛知郡東郷町御岳２−18−19
Claims (10)
- 【請求項１】 検出すべき複数種類のターゲット分子に
対して特異的に結合する性質を有する特異的結合性分子
に，該特異的結合性分子の種類ごとに異なる種類のハプ
テンを標識してなるハプテン標識分子を準備する工程
と，上記ハプテンと特異的にカップリングする抗ハプテ
ン抗体と，該抗ハプテン抗体の種類ごとに異なる種類の
酵素とからなる酵素標識抗ハプテン抗体を準備する工程
と，上記酵素と特異的に反応してそれぞれ異なった色に
蛍光し得る蛍光物質を準備する工程と，検出すべき複数
種類のターゲット分子に上記ハプテン標識分子を結合さ
せる工程と，上記ハプテン標識分子に上記酵素標識抗ハ
プテン抗体をカップリングさせる工程と，上記酵素に蛍
光基質を反応させる工程と，異なった蛍光色で上記複数
種類のターゲット分子を同時に検出する工程とからなる
ことを特徴とする複数種類のターゲット分子の同時検出
方法。 - 【請求項２】 検出すべき複数種類のターゲット分子に
対して特異的に結合する性質を有する特異的結合性分子
に，該特異的結合性分子の種類ごとに異なる種類のハプ
テンを標識してなるハプテン標識分子を準備する工程
と，上記ハプテンと特異的にカップリングする抗ハプテ
ン抗体と，該抗ハプテン抗体の種類ごとに異なる種類の
酵素とからなる酵素標識抗ハプテン抗体を準備する工程
と，検出すべきターゲット分子の有無を判断すべき被検
体に上記ハプテン標識分子を添加する工程と，上記被検
体に上記酵素標識抗ハプテン抗体を添加する工程と，上
記被検体に上記蛍光基質を添加する工程と，上記被検体
から発する蛍光の有無，及び蛍光色を検査することによ
り，上記被検体に複数種類のターゲット分子が存在する
か否かを検査する工程とからなることを特徴とすること
を特徴とする複数種類のターゲット分子の同時検出方
法。 - 【請求項３】 請求項１又は２において，上記ターゲッ
ト分子は，核酸，抗体，抗原，又は蛋白質であることを
特徴とする複数種類のターゲット分子の同時検出方法。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項において，
上記特異的結合性分子は，核酸プローブ，又は抗体であ
ることを特徴とする複数種類のターゲット分子の同時検
出方法。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項において，
上記ハプテンは，ジベレリン，ビオチン，又はフルオレ
セインであることを特徴とする複数種類のターゲット分
子の同時検出方法。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項において，
上記酵素は，アルカリ性ホスファターゼ，酸性ホスファ
ターゼ，ペルオキシダーゼ，エステラーゼ，及びβ−ガ
ラクトシダーゼ等の加水分解酵素のグループから複数種
類が選択されることを特徴とする複数種類のターゲット
分子の同時検出方法。 - 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか１項において，
上記酵素標識抗ハプテン抗体は，アルカリ性ホスファタ
ーゼ標識抗ジベレリン抗体，酸性ホスファターゼ標識抗
ジベレリン抗体，ペルオキシダーゼ標識抗ジベレリン抗
体，エステラーゼ標識抗ジベレリン抗体，β−ガラクト
シダーゼ標識抗ジベレリン抗体，アルカリ性ホスファタ
ーゼ標識抗ビオチン抗体，酸性ホスファターゼ標識抗ビ
オチン抗体，ペルオキシダーゼ標識抗ビオチン抗体，エ
ステラーゼ標識抗ビオチン抗体，β−ガラクトシダーゼ
標識抗ビオチン抗体，アルカリ性ホスファターゼ標識抗
フルオレセイン抗体，酸性ホスファターゼ標識抗フルオ
レセイン抗体，ペルオキシダーゼ標識抗フルオレセイン
抗体，エステラーゼ標識抗フルオレセイン抗体，及びβ
−ガラクトシダーゼ標識抗フルオレセイン抗体のグルー
プから，複数種類が選択されることを特徴とする複数種
類のターゲット分子の同時検出方法。 - 【請求項８】 請求項６又は７において，上記アルカリ
性ホスファターゼ又は酸性ホスファターゼの蛍光基質
は，「図１」，「図２」，「図３」に示すいずれかの骨
格を有し，「図１」，「図２」において，Ｒ１，Ｒ２は
アルキル基，芳香族基，アルコキシル基及びハロゲン基
のグループから選ばれる１種又は２種以上であり，「図
３」において，Ｒ３は芳香族基又は縮合芳香族基を有す
る有機物であり，ｎ１は１〜１０であるすることを特徴
とする複数種類のターゲット分子の同時検出方法。 - 【請求項９】 請求項６又は７において，上記ペルオキ
シダーゼの蛍光基質は，「図４」に示す骨格を有し，
「図４」において，Ｒ４は水素，アルキル基，芳香族
基，アルコキシル基及びハロゲン基のグループから選ば
れる１種又は２種以上であることを特徴とする複数種類
のターゲット分子の同時検出方法。 - 【請求項１０】 請求項６又は７において，上記エステ
ラーゼの蛍光基質は，「図５」，「図６」，「図７」に
示すいずれかの骨格を有し，「図５」において，Ｒ５は
芳香族基又は縮合芳香族基を有する有機物であり，ｎ２
は１〜１０であり，「図６」，「図７」において，Ｒ
６，Ｒ７は，アルキル基，芳香族基，アルコキシル基及
びハロゲン基のグループから選ばれる１種又は２種以上
であることを特徴とする複数種類のターゲット分子の同
時検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22575497A JPH1151935A (ja) | 1997-08-06 | 1997-08-06 | 複数種類のターゲット分子の同時検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22575497A JPH1151935A (ja) | 1997-08-06 | 1997-08-06 | 複数種類のターゲット分子の同時検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1151935A true JPH1151935A (ja) | 1999-02-26 |
Family
ID=16834309
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22575497A Pending JPH1151935A (ja) | 1997-08-06 | 1997-08-06 | 複数種類のターゲット分子の同時検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1151935A (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JP2002544488A (ja) * | 1999-05-07 | 2002-12-24 | クアンタム ドット コーポレイション | 半導体ナノクリスタルを用いて分析物を検出する方法 |
| US6581051B1 (en) | 1999-01-11 | 2003-06-17 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Agent presentation apparatus |
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1997
- 1997-08-06 JP JP22575497A patent/JPH1151935A/ja active Pending
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