JP5621846B2 - 蛍光測定方法 - Google Patents
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Description
工程(b):酵素固定基板上に、水溶性カチオン化多糖類である水溶性高分子および蛍光分子前駆分子を導入する工程;
工程(c):前記酵素固定基板上で酵素反応を生じさせて、前記蛍光分子前駆分子を蛍光分子に変換する工程;
工程(d):前記蛍光分子を前記水溶性高分子と結合させて、前記酵素固定基板上に蛍光分子−水溶性高分子複合体を形成させる工程;および、
工程(e):前記蛍光分子−水溶性高分子複合体から発光された蛍光を検出する工程
を含むことを特徴とする。
また、本発明に係る蛍光測定方法において、上記工程(b)における水溶性高分子および蛍光分子前駆分子の導入が、流路を通じて行われることが好ましい。
工程(a):検体、酵素、リガンド分子および基板を用いて前記酵素固定基板を製造する工程、および
工程(f):工程(e)で検出された蛍光量から、前記検体中に含まれる前記生体分子を定量する工程
がさらに含まれる。
本発明に係る蛍光測定方法は、
工程(b):酵素固定基板11上に、水溶性高分子43および蛍光分子前駆分子41を導入する工程;
工程(c):前記酵素固定基板11上で酵素反応を生じさせて、前記蛍光分子前駆分子41を蛍光分子42に変換する工程;
工程(d):前記蛍光分子42を前記水溶性高分子43と結合させて、前記酵素固定基板11上に蛍光分子−水溶性高分子複合体31を形成させる工程;および、
工程(e):前記蛍光分子−水溶性高分子複合体31から発光された蛍光を検出する工程
を含むことを特徴とする。
本発明の蛍光測定方法において、工程(b)は、酵素固定基板11上に、水溶性高分子43および蛍光分子前駆分子41を導入する工程である。
本発明に係る蛍光測定方法で用いられる酵素固定基板11は、酵素23を表面上に固定した基板である。この酵素固定基板11は、基板21と酵素23とを含んでおり、この酵素23が基板21と結合した構造を有する。
本発明に係る蛍光測定方法で用いられる酵素固定基板11において、基板21は、酵素23を固定する土台としての役割を有するとともに、後述する工程(e)において蛍光検出を行う測定場を提供する役割を有する。したがって、本明細書において基板21は、「酵素固定基板」との区別をより明確にするために「基礎基板」と呼ばれる場合もある。
本発明に係る蛍光測定方法で用いられる酵素固定基板11において、酵素23は、後述する蛍光分子前駆分子41を蛍光分子42に変換する役割を果たす。本発明において用いられる酵素23は、蛍光分子前駆分子41を蛍光分子42に変化させる性質を有するが、それ以外の構成要素、例えば、水溶性高分子43を変質または分解する性質を有さない限り、どのような種類の酵素であってもよい。そのような酵素23の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)などの酸化還元酵素、アルカリホスファターゼなどのホスファターゼ類、および、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明に係る蛍光測定方法で用いられる酵素固定基板11において、酵素23は、基板21と直接結合していてもよい。しかし、酵素23が基板21上に確実に固定されるよう、通常の場合、酵素23は、図1に示されるように他の分子または分子複合体等からなる結合部22を介して間接的に結合している。この結合部22は、基板21と酵素23とを結びつける役割を有していることから、必然的に、基板21と結合するための接合部と、酵素23と結合するための接合部とを含むことになる。
このような接合部における結合の例として、ビオチンとアビジンとの結合を利用したものが挙げられる。
ただ単に、酵素23を基板21に結合すれば足りる場合には、基板21と結合するための接合部と酵素23と結合するための接合部とが一体のものであってもよいし、あるいは、一般的なバイオアッセイ法用のスペーサーまたはリンカーとして一般的に用いられる従来公知の分子を介して、基板21と結合するための接合部と酵素23と結合するための接合部とが結合していてもよい。
本発明において「生体分子」は、本発明に係る蛍光測定方法をバイオアッセイ法に応用する場合に、測定の対象となる分子または分子断片を意味し、アナライトとも呼ばれる分子である。このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸(一本鎖であっても二本鎖であってもよいDNA、RNA、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、PNA(ペプチド核酸)等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子)、タンパク質(ポリペプチド、オリゴペプチド等)、アミノ酸(修飾アミノ酸も含む。)、糖質(オリゴ糖、多糖類、糖鎖等)、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、AFP(αフェトプロテイン)等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
本発明において「リガンド分子」は、上記「生体分子」を特異的に認識し(または、認識され)結合し得る分子または分子断片をいう。このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸(一本鎖であっても二本鎖であってもよいDNA、RNA、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、PNA(ペプチド核酸)等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子)、タンパク質(ポリペプチド、オリゴペプチド等)、アミノ酸(修飾アミノ酸も含む。)、糖質(オリゴ糖、多糖類、糖鎖等)、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明に係る蛍光測定方法で用いられる酵素固定基板11において、酵素23は基板21と直接的に、あるいは結合部22を介して間接的に結合している。基板21への酵素23の結合態様は、本発明の目的が達せられる限り特に限定されるものではない。しかし、本発明に係る蛍光測定方法においては、結合の安定性の点から、基板21と酵素23とが共有結合または分子間のアフィニティに基づく結合を介して結合していることが好ましい。ここで、基板21と酵素23との間に複数の結合が介在していてもよく、またこの複数の結合が、異なる種類の結合から成るものであってもよい。
本発明に係る蛍光測定方法において、蛍光分子前駆分子41は、酵素23による酵素反応により蛍光分子42を生成させる基質として用いられる。この蛍光分子前駆分子41は、従来公知の蛍光原基質変換法における蛍光原基質に相当する分子である。
本発明に係る蛍光測定方法の最大の特徴は、酵素固定基板11上での酵素反応および、酵素反応により生成した蛍光分子42からの発光検出を水溶性高分子43存在下で行うことにある。ここで、水溶性高分子43は、酵素23による酵素反応により生成した蛍光分子42を捕捉し、溶液中への拡散を防ぐ目的で用いられる。蛍光測定における蛍光検出の対象となる領域は、測定系中のごく狭い部分であることから、蛍光分子42を蛍光検出の対象となる領域付近に局在させることによって、蛍光発光の検出効率を高めることができ、その結果検出感度の向上が可能となる。
本発明に係る蛍光測定方法において、酵素固定基板11上に蛍光分子前駆分子41および水溶性高分子43を導入する方法は特に限定されるものではない。しかし、本発明に係る蛍光測定方法の典型的な態様において、水溶性高分子43を使用しない対応する従来公知の蛍光測定方法と同様、閉じた流路系中に酵素固定基板11が配置され、且つ流路を通じて各種薬剤や溶液等が供給される測定系で行われる。そのような測定系で使用する際の操作性の点から、蛍光分子前駆分子41および水溶性高分子43は、通常、溶液の形で酵素固定基板11上に導入されるものであり、その典型的な導入態様では、送液の形で流路を通じて酵素固定基板11上に導入される。
「流路」とは、微量な薬液の送達を効率的に行うことができ、反応促進を行うために送液速度を変化させたり、循環させたりすることができる直方体または管状のものである。
また、この流路として、基板21または酵素固定基板11を設置する個所近傍は直方体構造を有することが好ましく、薬液を送達する個所近傍は管状を有することが好ましい。流路を構成する材質、流路の寸法については、水溶性高分子43を使用しない対応する従来公知の方法で用いられる流路と同様のものとすることができる。
本発明に係る蛍光測定方法をバイオアッセイ法としての用途に応用する場合、工程(b)に先立ち、検体、酵素23、リガンド分子、および、基板21(すなわち、「基礎基板」)を用いて酵素固定基板11を製造することになる。この酵素固定基板11を製造する工程は、本発明の蛍光測定方法における一連の工程(b)〜(e)とは独立した工程として行うことも可能ではある。しかし、本発明に係る蛍光測定方法を、閉じた流路系中に酵素固定基板11が配置され、且つ流路を通じて各種薬剤や溶液等が供給される測定系で用いる場合、酵素固定基板11を製造する工程と、引き続く工程(b)〜(e)とを同じ流路系のもとで一貫して行うことが操作上好都合である。したがって、この酵素固定基板11を製造する工程は、工程(a)として本発明の蛍光測定方法における一連の工程に組み込まれていることが好ましい。
工程(a−1):基板21の表面に、必要に応じてSAM層等の表面処理層を形成させる工程、
工程(a−2):基板21の表面に直接的に、あるいは前記工程(a−1)で形成された表面処理層を介して間接的にリガンド分子を結合させる工程、
工程(a−3):前記工程(a−2)で得られた基板の表面に検体を接触させて、検体中の生体分子をリガンド分子と結合させる工程、
工程(a−4):前記工程(a−3)で基板と結合した生体分子に酵素23を結合させる工程
を通じて製造される。
工程(a−2)により、基礎基板である基板21の表面にリガンド分子を結合させて、リガンド分子が固定された基板(以下、「リガンド固定基板」と呼ぶ場合がある。)を得、
工程(a−3)により、前記「リガンド固定基板」の表面に検体を接触させて、検体中の生体分子をリガンド分子と結合させて、生体分子が固定された基板(以下、「生体分子固定基板」と呼ぶ場合がある。)を得、
工程(a−4)により、前記「生体分子固定基板」に酵素を結合させる
ことにより得ることができ、その際、工程(a−2)〜(a−4)に先立ち、
工程(a−1)により、基板21の表面に予めSAM層等の表面処理層を形成させておく
こともできる。
本発明において、「検体」とは、本発明に係る蛍光測定方法をバイオアッセイ法としての用途に応用する場合に測定対象となる種々の試料をいう。
本発明の蛍光測定方法において、工程(c)は、酵素固定基板11上で酵素反応を生じさせて、蛍光分子前駆分子41を蛍光分子42に変換する工程である。
本発明に係る蛍光測定方法において、蛍光分子42は、工程(b)において導入された蛍光分子前駆分子41が、酵素23による酵素反応により変化して生成する蛍光発光性の分子である。本発明においては、この蛍光分子42の生成量は、蛍光の発光量の形で評価される。なお、蛍光分子前駆分子41として用いられる代表的な酵素反応用基質から生成する蛍光分子42の励起波長および発光波長については、前述の蛍光分子前駆分子の項で述べた通りである。
本発明の蛍光測定方法において、工程(d)は、工程(c)で生成した蛍光分子42を水溶性高分子43と結合させて、酵素固定基板11上に蛍光分子−水溶性高分子複合体31を形成させる工程である。
工程(c)における酵素反応により生成した蛍光分子42は、水溶性高分子43が存在しない測定系においては、酵素固定基板11上に存在する溶液中で自由に移動し、酵素固定基板11から離れた部位にまで拡散する。ここで、蛍光測定における蛍光検出の対象となる領域は酵素固定基板11周辺というごく狭い部分に限られていることから、酵素固定基板11から離れた部位にまで拡散した蛍光分子42からの発光した蛍光は検出されず、このことが従来公知の蛍光原基質変換法に基づく蛍光測定方法において検出感度が充分に向上しない原因となっている。
本発明の蛍光測定方法において、工程(e)は、工程(d)で生成した蛍光分子−水溶性高分子複合体31から発光された蛍光を検出する工程である。工程(e)における蛍光の検出は、工程(d)で生成した蛍光分子−水溶性高分子複合体31に対して、励起光を照射し、その励起光に対応する蛍光発光の強度を計測することによって行われる。
本発明に係る蛍光測定方法をバイオアッセイ法としての用途に応用する場合、工程(e)の後、検出された蛍光量をもとにして、検体中に含まれる「生体分子」を定量することになる。より具体的には、既知濃度の生体分子での測定を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて被測定検体中の生体分子量を測定シグナルから算出する工程である。
工程(f)においては、上記工程(b)の前に測定した“ブランク蛍光シグナル”、上記工程(e)で得られた“測定蛍光シグナル”、および何も修飾していない基板21を流路に固定し、超純水を流しながら蛍光発光を測定して得られたシグナルを“初期ノイズ”としたとき、下記式(4a)で表されるアッセイS/N比を算出することができる:
アッセイS/N比=|Ia/Io|/In (4a)
(上記式(1a)において、Iaはアッセイ蛍光シグナル、Ioはブランク蛍光シグナル、Inは初期ノイズである)。
アッセイS/N比=|Ia|/|Ian| (4b)
(上記式(4b)において、Ianはアッセイノイズシグナル、Iaは上記式(4a)の場合と同様にアッセイ蛍光シグナルである)。
抗AFPモノクローナル抗体(一次抗体)を表面に固定化したSPFSセンサー基板を常法により作成し、抗体を固定化した側の表面に、抗原であるAFP(0.1ng/mL)を反応させた後、アルカリフォスファターゼ標識抗AFPモノクローナル抗体(二次抗体)を結合させた。これにより、酵素固定基板として機能する、表面に抗原抗体のサンドイッチ複合体が形成されたSPFSセンサーが得られた。
比較例として、基質溶液としてカチオン化高分子を添加していない基質溶液を用いたことを除いては実施例1と同様に、蛍光分子の蛍光強度を測定した。
21・・・基板
22・・・結合部
23・・・酵素
31・・・蛍光分子−水溶性高分子複合体
41・・・蛍光分子前駆分子
42・・・蛍光分子
43・・・水溶性高分子
Claims (13)
- 下記工程(b)〜(e)を含むことを特徴とする蛍光測定方法:
工程(b):酵素固定基板上に、水溶性カチオン化多糖類である水溶性高分子および蛍光分子前駆分子を導入する工程;
工程(c):前記酵素固定基板上で酵素反応を生じさせて、前記蛍光分子前駆分子を蛍光分子に変換する工程;
工程(d):前記蛍光分子を前記水溶性高分子と結合させて、前記酵素固定基板上に蛍光分子−水溶性高分子複合体を形成させる工程;および、
工程(e):前記蛍光分子−水溶性高分子複合体から発光された蛍光を検出する工程。 - 前記水溶性高分子に含まれるカチオン性基が、第4級アンモニウム基である請求項1に記載の蛍光測定方法。
- 前記蛍光分子−水溶性高分子複合体が、前記蛍光分子と前記水溶性高分子との静電相互作用により形成される請求項1または2に記載の蛍光測定方法。
- 前記水溶性カチオン化多糖類におけるカチオン置換度が0.01〜1である請求項1〜3のいずれか1項に記載の蛍光測定方法。
- 前記水溶性高分子の重量平均分子量が1万〜200万である請求項1〜4のいずれか1項に記載の蛍光測定方法。
- 上記工程(b)における水溶性高分子および蛍光分子前駆分子の導入が、流路を通じて行われる請求項1〜5のいずれか1項に記載の蛍光測定方法。
- 前記工程(c)〜(e)が静置状態で行われる請求項1〜6のいずれか1項に記載の蛍光測定方法。
- 前記酵素固定基板において、酵素が生体分子とリガンド分子との結合を介して基板上に固定されている請求項1〜7のいずれか1項に記載の蛍光測定方法。
- 前記酵素固定基板において、
前記基板に前記リガンド分子が結合し、
前記リガンド分子に前記生体分子が結合し、
前記生体分子に前記酵素が直接的または間接的に結合している
請求項8に記載の蛍光測定方法。 - 工程(a):検体、酵素、リガンド分子および基板を用いて前記酵素固定基板を製造する工程、および
工程(f):前記工程(e)で検出された蛍光量から、前記検体中に含まれる前記生体分子を定量する工程
をさらに含むことを特徴とする請求項8または9に記載の蛍光測定方法。 - 前記工程(e)において、近接場光により励起された蛍光を検出する請求項1〜10のいずれか1項に記載の蛍光測定方法。
- 前記近接場光がプラズモンにより増強された光である請求項11に記載の蛍光測定方法。
- 前記工程(e)において、共焦点レーザー顕微鏡または共焦点レーザースキャナーを用いて蛍光の検出を行う請求項1〜10のいずれか1項に記載の蛍光測定方法。
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