JPH11513047A - ヒアルロン酸の微細粒子中に封入された薬物の徐放性組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒアルロン酸またはその無機塩の微細粒子および前記微細粒子中に封入されたタンパク質またはペプチド薬物を含む徐放性薬物組成物であって、前記微細粒子の平均粒径が０．１ないし４０μｍ範囲である組成物。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒアルロン酸の微細粒子中に封入された薬物の徐放性組成物発明の分野 本発明は、ヒアルロン酸またはその塩の固体微細粒子中に封入されたタンパク 質またはペプチド薬物の徐放性組成物およびそれを含む注射剤形に関する。発明の背景 タンパク質またはペプチド薬物は経口投与すると吸収が遅いため、通常注射に よって投与される。一回の注射投与による薬物の体内における活性維持期間が短 いため、長期間の治療が必要な場合にはこれらの薬物を繰返して継続的に注射投 与しなければならない。たとえば、脳下垂体欠乏性矮小症の小児を治療するため には、組換えヒト成長ホルモンを６ヶ月以上毎日注射しなければならない。した がって、このような連日投与の不便を解消できる徐放性剤形の開発が要求されて いる。 ヒト成長ホルモンのようなタンパク質またはペプチド薬物の徐放性剤形は、体 内で徐々に加水分解する生分解性高分子マトリックス物質の微細粒子中に薬物を 封入することによって製造される。このような観点から、徐放性薬剤用に適合な 生分解性高分子の開発研究が活発に行われ、その結果、ポリラクチド、ポリグリ コリド、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ−オルト−エステルおよびポ リアンヒドリド（polyanhydride）のような生分解性ポリエステルが上記の用途 に効果的であることが明らかになった（M．Chasin & R．Langer，et al.，Biode gradable Polymers as Drug Delivery System，Marcel Dekker，（１９９０）； J．Heller，Adv．Drug Del．Rev.，１０，１６３（１９９３））。 また、ゼラチン、コラーゲン、キトサン、カルボキシメチルセルロース、アル ギネートおよびヒアルロン酸のような天然高分子物質を用いる徐放性薬剤の開発 研究も進まれている。一般に、これらの天然高分子は、水の存在の下でゲルを形 成し、このような高粘度で非常に低い薬物拡散速度を有するゲル型のマトリック スが徐放性薬物組成物の製造に用いられる。 たとえば、米国特許出願第５，４１６，０１７号は、０．０１ないし３％のヒ アルロン酸を含むゲルを用いたエリスロポエチン（erythropoietin）の徐放性注 射剤を開示しており、日本特開平１−２８７０４１号は、１％のヒアルロン酸で 製造されたゲルを用いたインスリンの徐放性注射剤を記述しており、また日本特 開平２−００２１３号は、５％のヒアルロン酸を含むゲルを用いたカルシトニン 、エルカノニンまたはヒト成長ホルモンの徐放性剤形を記述している。同様に、 メイヤーらは０．５ないし４％のヒアルロン酸を含むゲルを用いた顆粒球コロニ ー刺激因子の徐放性剤形を報告した（James Meyer，et al.，J．Controlled Rel .,３５，６７（１９９５））。 しかし、数％濃度のヒアルロン酸を含むゲルは１０⁷センチポイズ程度の高い 粘度を有するため、このような剤形を注射投与する場合大きい口径の注射針を用 いなければならない。さらに、人体に投与されたゲルは体液によって希釈される ことによって薬物の保留性を容易に失うので、薬物の放出が１日以上持続しない 。たとえば、日本特開平１−２８７０４１号は、１％のヒアルロン酸を含むイン スリンの徐放性注射剤をウサギに注射した場合、グルコースの血中濃度を低下さ せる治療効果が２４時間以上持続しないことを記述している。また、顆粒球コロ ニー刺激因子を含有する２％のヒアルロン酸剤形（James Meyer，et al.，J．Co ntrolled Rel.，３５，６７（１９９５））またはインターフェロン−αおよび 血漿タンパク質を含有する１．５％のヒアルロン酸剤形（米国特許第５，４１６ ，０１７号）を実験動物に投与した場合、血中薬物濃度が２４時間以内に初期濃 度の１／１０以下に急激に落ちることを報告した。すなわち、ヒアルロン酸ゲル の徐放性薬剤は薬物の放出が２４時間以上持続しないという短所を有する。 天然ヒアルロン酸またはその無機塩は水にのみ溶解する。一方、ヒアルロン酸 −ベンジルエステルＨＹＡＦＦ^TMは水に溶けないが、ジメチルスルホキシドのよ うな有機溶媒に溶ける。前記疎水性ヒアルロン酸誘導体およびこれに薬物の固体 微細粒子を封入した薬物組成物は通常のエマルジョン溶媒抽出法で製造される（ N．S．Nightlinger，et al.，proceed．Intern．Symp．Control．Rel．Bioact． Mater.，２２nd，Paper No.３２０５（１９９５）；L．Ilum，et al.，J．Contr olled Rel.，２９，１３３（１９９４））。この方法を簡単に説明する と、タンパク質薬物粒子をヒアルロン酸−ベンジルエステルのジメチルスルホキ シド溶液に分散し、得られた分散液をミネラル油に加えてエマルジョンを形成さ せる。このエマルジョンに酢酸エチルのような有機溶媒を加えてジメチルスルホ キシドを抽出して薬物およびヒアルロン酸−ベンジルエステルで構成された微細 粒子を得る。 しかし、前記方法は、タンパク質薬物が有機溶媒または疎水性ヒアルロン酸ベ ンジルエステルと接触することによって変性するという問題を有する。実際に、 完全にエステル化されたヒアルロン酸誘導体を用いて製造した顆粒球コロニー刺 激因子の微細粒子剤形は、初めの数日間顆粒球コロニー刺激因子含有量の２５％ が放出されるのみで、その後１７日間は全然放出されないと報告された（N．S． Nightlinger，et al.，proceed．Intern．Symp．Control．Rel．Bioact．Mater. ，２２nd，Paper No.３２０５（１９９５））。この場合、タンパク質薬物の大 部分が損失されたが、ヒアルロン酸−ベンジルエステルおよび／または有機溶媒 との相互作用によって変性された可能性が高い。発明の要約 したがって、本発明の目的は、タンパク質またはペプチド薬物の改善された徐 放性剤形を提供することである。 本発明の他の目的は、ヒアルロン酸またはこれらの無機塩の微細粒子および前 記微細粒子中に封入されたタンパク質またはペプチド薬物を含む徐放性薬物組成 物を提供することであり、ここで、前記微細粒子の平均粒径は０．１ないし４０ μｍ範囲である。図面の簡単な説明 本発明の前記および他の目的および特色は、下記の図面を伴う本発明の説明に よって明らかになる。 図１は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の体外溶出量の経時変化を示し、 図２Ａおよび２Ｂは、本発明のｈＧＨを含む徐放性組成物の薬物安定性を逆相 高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて観察した結果であり （a：本発明の剤形から溶出されたｈＧＨ；およびｂ：ｈＧＨ水溶液の対照群）、 図３Ａおよび３Ｂは、本発明のｈＧＨを含む徐放性組成物の薬物安定性をサイ ズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて観察した結果であり（Ａ：本発明 の剤形から溶出されたｈＧＨ；およびＢ：ｈＧＨ水溶液の対照群）、 図４は、ヒド成長ホルモンを含む本発明の徐放性剤形および通常の剤形で処理 した矮小ラットの平均体重増加の経時変化を比べたものであり、 図５は、ヒト成長ホルモンを含む本発明の徐放性剤形および通常の剤形で処理 した矮小ラットの平均体重増加の経時変化を比べたものであり、 図６は、血中ヒト成長ホルモン濃度の経時変化を示したものであり；および 図７は、ヒト成長ホルモンを含む本発明の徐放性剤形および通常の剤形で処理 した矮小ラットの平均体重増加の経時変化を比べたものである。発明の詳細な説明 本発明の徐放性組成物は、ヒアルロン酸またはその塩の固体微細粒子および前 記粒子中に封入されたタンパク質またはペプチド薬物を含む。本発明の組成物は 、既存のヒアルロン酸ゲルを用いた剤形より薬物の放出持続期間が長く、また取 扱いやすい。すなわち、本発明の微細粒子組成物を用いて製造した注射剤形は低 い粘度を有するため投与しやすく、生体内で薬物を長期間に亘って一定な速度で 放出する。 また、本発明の組成物は組成物から薬物が１００％放出されるまで薬物が変性 しないという長所を有する。 ０．１ないし４０μｍ、好ましくは１ないし１０μｍの平均粒径を有する本発 明の微細粒子組成物は、タンパク質またはペプチド薬物およびヒアルロン酸また はその塩を含む水溶液を噴霧乾燥または凍結乾燥することによって製造し得る。 必要に応じて溶液に安定剤を加え得る。 本発明の固体微細粒子組成物の製造に使用され得る薬物としては、ヒト成長ホ ルモン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成 長ホルモン放出ペプチド、顆粒球−コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ− コロニー刺激因子、マクロファージ−コロニー刺激因子、エリスロポエチン、骨 格形態発生タンパク質、インターフェロン、インスリン、アトリオペプチン−II I、モノクロナール抗体、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、マクロファージ活性化因子 、インターロイキン、腫瘍変性因子、インスリン−類似成長因子、表皮成長因子 、組 織プラスミノゲンアクチベーターおよびウロキナーゼなどがある。 本発明の固体微細粒子組成物の製造に使用され得るヒアルロン酸の代表的な無 機塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、アンモニウム、マグ ネシウム、亜鉛、銅およびコバルト塩が含まれる。 本発明に使用され得る安定剤としては、炭水化物、タンパク質、アミノ酸、脂 質、脂肪酸、ポリエチレングリコール、無機塩および界面活性剤がある。 本発明の微細粒子徐放性組成物は組成物の総量を基準として１ないし９０重量 ％のタンパク質またはペプチド薬物を含み、また、選択的に組成物の総量を基準 として１ないし９０重量％の安定剤を含み得る。 本発明の徐放性注射剤は、注射剤用媒体に注射剤の総量を基準として０．０１ ないし１０重量％の本発明の微細粒子徐放性組成物を分散することによって製造 できる。必要に応じてこれに分散剤または防腐剤をさらに加え得る。本発明の注 射剤に使用され得る一般的な注射剤用媒体としては、緩衝水溶液、エタノール、 プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、ミネラル油、スクア レン、たら肝油、モノ−、ジ−、およびトリ−グリセリド、またはこれらの混合 物がある。 植物油の例としては、トウモロコシ油、オリーブ油、大豆油、紅花油、綿実油 、落花生油、胡麻油およびこれらの混合物がある。 また、本発明の微細粒子徐放性組成物を含むエアロゾル剤を製造し得る。この ように製造した本発明のエアロゾル剤は、微細粒子組成物が鼻粘膜や気管支粘膜 を通じて薬物を調節放出するように適用され得る。 以下、本発明を下記実施例および試験例は本発明を例示するのみであり、本発 明の範囲を制限しない。実施例１：微細粒子の製造 ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）２ｍｇ／ｍｌを含有する５ｍＭリン酸塩緩衝溶液 （ＰＢＳ）にツイーン８０を０．０１重量％の濃度で加えた。これに、分子量１ ，０００，０００のヒアルロン酸ナトリウムを２ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた。得 られた溶液を３ｍｌ／分の流速で噴霧乾燥機（Buchi １９０）に供給して微細粒 子を製造した。この際、噴霧乾燥機に流入される乾燥空気の温度は８５℃であっ た。 得られた微細粒子の平均粒径は３．０μｍであった。実施例２：微細粒子の製造 ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）１ｍｇ／ｍｌを含有する５ｍＭ ＰＢＳにツイー ン８０を０．０１重量％の濃度で加えた。これに、分子量２，０００，０００の ヒアルロン酸ナトリウムを１ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた。得られた溶液を２ｍｌ ／分の流速で噴霧乾燥機（Buchi １９０）に供給して粒子を製造した。この際、 噴霧乾燥機に流入される乾燥空気の温度は８５℃であった。得られた微細粒子の 平均粒径は２．０μｍであった。実施例３：微細粒子の製造 ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）０．１ｍｇ／ｍｌを含有する５ｍＭ ＰＢＳにツ イーン８０を０．０１重量％の濃度で加えた。これに、分子量２，０００，００ ０のヒアルロン酸ナトリウム０．９ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた。得られた溶液を ３ｍｌ／分の流速で噴霧乾燥機（Buchi １９０）に供給して微細粒子を製造した 。この際、噴霧乾燥機に流入される乾燥空気の温度は８５℃であった。得られた 微細粒子の平均粒径は２．０μｍであった。試験例１：インビトロ放出試験 前記実施例１、２および３で製造した微細粒子を緩衝溶液（１５０ｍＭ塩化ナ トリウム、１０ｍＭリン酸塩、０．０５％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．４）にｈ ＧＨの濃度が１．０ｍｇ／ｍｌになるまで各々懸濁した。得られた分散液をオー ブンに入れ、ｈＧＨの放出試験を撹拌機を用いて３７℃で行った。一定時間後、 分散液を８００ｘｇで１０分間遠心分離して全体分散液の１／１０に相当する上 澄液を分離した。同一量の緩衝液を分散液に加えた後さらに３７℃で放出試験を 続けた。上澄液におけるｈＧＨの濃度をローリー法および高性能液体クロマトグ ラフィー（ＨＰＬＣ）で測定してヒト成長ホルモンの経時放出量を決定した。そ の結果を図１に示す。 図１は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のインビトロ経時溶出量の変化を示す。 図１から分かるように、ヒト成長ホルモンの放出速度はヒアルロン酸の分子量が 大きいほど、そしてｈＧＨの含量が少ないほど遅かった。実際に、実施例３で製 造した微細粒子は最も遅い放出速度を示した。この結果から薬物の放出期間はヒ アルロン酸の分子量、タンパク質含量などの条件によって調節が可能であること が分かる。また、本発明で製造した微細粒子はインビトロ放出の際、初期の急激 な放出がなく、７０％程度が放出されるまで一定な速度を示すことが分かる。試験例２：微細粒子中のヒト成長ホルモンの安定性 本発明の微細粒子中のヒト成長ホルモンが微細粒子の製造に用いた水溶液状の ヒト成長ホルモンと同一であるか否かを判断するために、インビトロ放出試験に おいて微細粒子から放出されたヒト成長ホルモンを逆相高性能液体クロマトグラ フィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて分析した。 酸化、脱アミド化によるｈＧＨの変性は逆相ＨＰＣＬによって確認でき、その 結果を図２Ａおよび２Ｂに示す。 図２Ａおよび２Ｂは、ｈＧＨを含む本発明の徐放性組成物の薬物安定性を逆相 高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて観察した結果を示し 、図２Ａは、本発明の剤形から溶出されたｈＧＨのＲＰ−ＨＰＬＣプロフィルで あり、図２Ｂは水溶液ｈＧＨコントロールのプロフィールである。 凝集によるｈＧＨの変性はＳＥＣで確認でき、その結果を図３Ａおよび３Ｂに 示した。 図３Ａおよび３Ｂは、ｈＧＨを含む本発明の徐放性組成物の薬物安定性をサイ ズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて観察した結果を示し、図３Ａは、 本発明の剤形から溶出されたｈＧＨのＳＥＣプロフィールであり、図３Ｂは水溶 液ｈＧＨコントロールのプロフィールである。 図２Ａ、２Ｂ、３Ａおよび３Ｂから分かるように、本発明の組成物から溶出さ れたヒト成長ホルモンはヒト成長ホルモン水溶液のコントロールと同一であり、 ｈＧＨ単量体の含量は９５％以上であった。この結果からｈＧＨは微細粒子組成 物の製造課程および３７℃での溶出課程中において変性しなかったことが分かる 。試験例３：インビボ溶出試験 低い成長ホルモン分泌の遺伝性を有する矮小ラット（dwarf rat）を実験動物 として用いて本発明の微細粒子の徐放特性を観察した。 実施例１で製造した徐放性微細粒子をプロピレングリコールとエタノールの７ ：３の比の混合溶液にヒト成長ホルモンの濃度が５ｍｇ／ｍｌになるまで分散 した。得られた分散液をヒト成長ホルモンの濃度が０．５ｍｇ／ｍｌになるまで 緩衝水溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、リン酸塩１０ｍＭ、ｐＨ７．４）で希釈し た。 １０３ｇの平均体重を有する生後７週齢の矮小ラット１８匹を各６匹ずつ３群 に分離した。第１群の矮小ラットには各々前記で製造した微細粒子分散液０．１ ｍｌ（ヒト成長ホルモン５０μｇ）を毎日２週間皮下注射で投与した（実験群） 。第２群の矮小ラットには水溶液状注射剤形として市販されている公知のユウト ロピン^Rを同一な条件で投与した（比較群）。第３群の矮小ラットにはｈＧＨを 投与しなかった（非処理対照群）。ラットの体重変化を測定するため体重を毎日 測定した。 図４は、実験群、比較群および対照群のラットの平均体重増加の経時変化を比 べたものである。 図４から分かるように、実験群のラットは比較群および対照群のラットに比べ て２週間の実験期間中遥かに大きな継続的な体重増加を示した。この結果から本 発明の微細粒子組成物はその徐放特性のため既存の水溶液状剤形より効力が優れ ていることが分かる。試験例４：インビボ溶出試験 実施例２で製造した徐放性微細粒子を綿実油にヒト成長ホルモンの濃度が１． ５ｍｇ／ｍｌになるまで分散した。 １０５ｇの平均体重を有する生後７週齢の矮小ラット２４匹を各６匹ずつ４群 に分離した。第１群の矮小ラットには各々前記で製造した微細粒子分散液０．１ ｍｌ（ヒト成長ホルモン１５０μｇ）を２週間に亘って３日ごとに皮下注射で投 与した（実験群）。第２群の矮小ラットにはユウトロピン^Rを同一な条件で投与 した（比較群）。第３群の矮小ラットには５０μｇのｈＧＨに相当するユウトロ ピン^Rを２週間の間毎日投与した（比較群２）。第４群の矮小ラットにはｈＧＨ を投与しなかった（非処理対照群）。ラットの体重変化を測定するため体重を毎 日測定した。 図５は、実験群、比較群および対照群のラットの平均体重増加の経時変化を比 べたものである。 図５から分かるように、実験群のラットは比較群および対照群のラットより大 きな体重の増加を示した。比較群１のラットは注射後１日目には相当な体重増加 を示したが、２日および３日目には対照群より体重の増加率が小さかった。実験 群と比較群２は継続的な体重増加を示した。この結果から本発明の微細粒子組成 物は少なくとも３日間持続される徐放性特性を保っていることが分かる。試験例５：インビボ溶出試験 実施例２で製造した徐放性微細粒子を綿実油にヒト成長ホルモンの濃度が１． ５ｍｇ／ｍｌになるまで分散した。２．５ｋｇの平均体重を有する８匹のウサギ を各４匹ずつ２個の群に分けた。一つの群のウサギには各々ヒト成長ホルモン３ ，７００μｇを含む微細粒子分散液を注射投与した（実験群）。他の群のウサギ にはｈＧＨを投与しなかった（対照群）。 投与後、６日間毎日ウサギの血液サンプルを採取した。 血液サンプル中のｈＧＨの量をＲＩＡ（Radio immuno assay）法で定量した。 図６は、血中のヒト成長ホルモン濃度の経時変化を示す。 図６から分かるように、血中ヒト成長ホルモンの量は投与後４日間０ないし１ １ｎｇ／ｍｌの範囲で維持され、５日以降にはしだいに減少した。この結果から 本発明の微細粒子組成物は４日間一定な放出速度を有し、その以降は放出速度が しだいに減少する特性があることが分かる。この結果は、ｈＧＨのインビトロ放 出速度がｈＧＨの７０％が放出されるまで放出速度が一定であるという試験例１ の結果と一致した。これとは対照的に、対照群の血中ヒト成長ホルモンの濃度は ＲＩＡ法の感知濃度以下（１ｎｇ／ｍｌ）の無視できる範囲にあった。実施例４：微細粒子の製造およびインビトロ溶出試験 （段階１）微細粒子の製造 ウシ成長ホルモン（ｂＳＴ）２ｍｇ／ｍｌを含有する５ｍＭ ＰＢＳにツイー ン８０を０．０１重量％の濃度で加えた。これに、分子量１，０００，０００の ヒアルロン酸ナトリウムを２ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた。得られた溶液を３ｍｌ ／分の流速で噴霧乾燥機（Buchi １９０）に供給して微細粒子を製造した。この 際、噴霧乾燥機に流入される乾燥空気の温度は８５℃であった。得られた微細粒 子の平均粒径は３．０μｍであった。 （段階２）インビトロ溶出試験 段階１で製造した微細粒子を用いて試験例１の方法に従ってインビトロ溶出試 験を行い、溶出されたｂＳＴの安定性を試験例２の方法に従って調べた。 放出されたｂＳＴをサイズ排除クロマトグラフィー法で定量および定性分析を 行った。その結果、ｂＳＴは７２時間の間８５％以上が溶出され、ｂＳＴの変性 は起こらなかった。実施例５：微細粒子の製造およびインビトロ溶出試験 （段階１）微細粒子の製造 ブタ成長ホルモン（ｐＳＴ）２ｍｇ／ｍｌを含有する５ｍＭ ＰＢＳにツイー ン８０を０．０１重量％の濃度で加えた。これに、分子量１，０００，０００の ヒアルロン酸ナトリウムを２ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた。得られた溶液を３ｍｌ ／分の流速で噴霧乾燥機（Buchi １９０）に供給して微細粒子を製造した。この 際、噴霧乾燥機に流入される乾燥空気の温度は８５℃であった。得られた微細粒 子の平均粒径は３．０μｍであった。 （段階２）インビトロ溶出試験 段階１で製造した微細粒子を用いて試験例１の方法に従ってインビトロ溶出試 験を行い、溶出されたｐＳＴの安定性を試験例２の方法に従って調べた。 放出されたｐＳＴをサイズ排除クロマトグラフィー法で定量および定性分析を 行った。その結果、ｐＳＴは７２時間の間９０％以上が溶出され、ｐＳＴの変性 は起こらなかった。実施例６：微細粒子の製造およびインビトロ溶出試験 （段階１）微細粒子の製造 顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（granulocyte macrophage−colony stimulating factor，ＧＭ−ＣＳＦ）０．４ｍｇ／ｍｌを含有する５ｍＭ ＰＢ Ｓにツイーン８０を０．０１重量％の濃度で加えた。これに、分子量１，０００ ，０００のヒアルロン酸ナトリウムを１．６ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた。得られ た溶液を３ｍｌ／分の流速で噴霧乾燥機（Buchi １９０）に供給して微細粒子を 製造した。この際、噴霧乾燥機に流入される乾燥空気の温度は８５℃であった。 得られた微細粒子の平均粒径は３．０μｍであった。 （段階２）インビトロ溶出試験 段階１で製造した微細粒子を用いて試験例１の方法に従ってインビトロ溶出試 験を行い、溶出されたＧＭ−ＣＳＦの安定性を試験例２の方法に従って調べた。 放出されたＧＭ−ＣＳＦをサイズ排除クロマトグラフィー法で定量および定性 分析を行った。その結果、ＧＭ−ＣＳＦは７２時間の間９２％以上が溶出され、 ＧＭ−ＣＳＦの変性は起こらなかった。実施例７：微細粒子の製造およびインビトロ溶出試験 （段階１）微細粒子の製造 エリトロポエチン（erythropoietin，ＥＰＯ）１０００ ＩＵ／ｍｌおよび血 漿アルブミン０．５ｍｇ／ｍｌを含有する５ｍＭ ＰＢＳにツイーン８０を０． ０１重量％の濃度で加えた。これに、分子量１，０００，０００のヒアルロン酸 ナトリウムを２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた。得られた溶液を３ｍｌ／分の流 速で噴霧乾燥機（Buchi １９０）に供給して微細粒子を製造した。この際、噴霧 乾燥機に流入される乾燥空気の温度は８５℃であった。得られた微細粒子の平均 粒径は３．５μｍであった。 （段階２）インビトロ溶出試験 段階１で製造した微細粒子を用いて試験例１の方法に従ってインビトロ溶出試 験を行い、溶出されたＥＰＯの安定性を試験例２の方法に従って調べた。 放出されたＥＰＯをサイズ排除クロマトグラフィー法で定量および定性分析を 行った。その結果、ＥＰＯは７２時間の間７０％以上が溶出され、ＥＰＯの変性 は起こらなかった。実施例８：微細粒子の製造およびインビトロ溶出試験 （段階１）微細粒子の製造 インターフェロン−アルファ（Interferon−α）２ ｘ １０⁵ＩＵ／ｍｌおよ び血漿アルブミン０．２ｍｇ／ｍｌを含有する５ｍＭ ＰＢＳにツイーン８０を ０．０１重量％の濃度で加えた。これに、分子量１，０００，０００のヒアルロ ン酸ナトリウムを２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた。得られた溶液を３ｍｌ／分 の流速で噴霧乾燥機（Buchi １９０）に供給して微細粒子を製造した。この際、 噴霧乾燥機に流入される乾燥空気の温度は１０５℃であった。得られた微細粒子 の平均粒径は３．５μｍであった。 （段階２）インビトロ溶出試験 段階１で製造した微細粒子を用いて試験例１の方法に従ってインビトロ溶出試 験を行い、溶出されたインターフェロン−αの安定性を試験例２の方法に従って 調べた。 放出されたインターフェロン−αをサイズ排除クロマトグラフィー法で定量お よび定性分析を行った。その結果、インターフェロン−αは７２時間の間９０％ 以上が溶出され、インターフェロン−αの変性は起こらなかった。実施例９：微細粒子の製造およびインビトロ溶出試験 （段階１）微細粒子の製造 インターフェロン−ガンマ（Interferon−γ）２ ｘ １０５ ＩＵ／ｍｌ、グ リシン０．２ｍｇ／ｍｌおよび血漿アルブミン０．２ｍｇ／ｍｌを含有する５ｍ Ｍ ＰＢＳにツイーン８０を０．０１重量％の濃度で加えた。これに、分子量１ ，０００，０００のヒアルロン酸ナトリウムを２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた 。得られた溶液を３ｍｌ／分の流速で噴霧乾燥機（Buchi １９０）に供給して微 細粒子を製造した。この際、噴霧乾燥機に流入される乾燥空気の温度は１０５℃ であった。得られた微細粒子の平均粒径は３．５μｍであった。 （段階２）インビトロ溶出試験 段階１で製造した微細粒子を用いて試験例１の方法に従ってインビトロ溶出試 験を行い、溶出されたインターフェロン−γの安定性を試験例２の方法に従って 調べた。 放出されたインターフェロン−γをサイズ排除クロマトグラフィー法で定量お よび定性分析を行った。その結果、インターフェロン−γは７２時間の間８５％ 以上が溶出され、インターフェロン−γの変性は起こらなかった。実施例１０：微細粒子の製造およびインビトロ溶出試験 （段階１）微細粒子の製造 インスリン２０ ＩＵ／ｍｌを含有する５ｍＭ ＰＢＳにツイーン８０を０．０ １重量％の濃度で加えた。これに、分子量１，０００，０００のヒアルロン酸ナ トリウムを２ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた。得られた溶液を３ｍｌ／分の流速で噴 霧乾燥機（Buchi １９０）に供給して微細粒子を製造した。この際、噴霧乾燥機 に流入される乾燥空気の温度は８５℃であった。得られた微細粒子の平均粒径は ３．０μｍであった。 （段階２）インビトロ溶出試験 段階１で製造した微細粒子を用いて試験例１の方法に従ってインビトロ溶出試 験を行い、溶出されたインスリンの安定性を試験例２の方法に従って調べた。 放出されたインスリンをサイズ排除クロマトグラフィー法で定量および定性分 析を行った。その結果、インスリンは７２時間の間９５％以上が溶出され、イン スリンの変性は起こらなかった。実施例１１：微細粒子の製造およびインビトロ溶出試験 （段階１）微細粒子の製造 インスリン−類似成長因子２ｍｇ／ｍｌを含有する５ｍＭ ＰＢＳにツイーン ８０を０．０１重量％の濃度で加えた。これに、分子量１，０００，０００のヒ アルロン酸ナトリウムを２ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた。得られた溶液を３ｍｌ／ 分の流速で噴霧乾燥機（Buchi １９０）に供給して微細粒子を製造した。この際 、噴霧乾燥機に流入される乾燥空気の温度は８５℃であった。得られた微細粒子 の平均粒径は３．０μｍであった。 （段階２）インビトロ溶出試験 段階１で製造した微細粒子を用いて試験例１の方法に従ってインビトロ溶出試 験を行い、溶出されたインスリン−類似成長因子の安定性を試験例２の方法に従 って調べた。 放出されたインスリン−類似成長因子をサイズ排除クロマトグラフィー法で定 量および定性分析を行った。その結果、インスリン−類似成長因子は７２時間の 間９０％以上が溶出され、インスリン−類似成長因子の変性は起こらなかった。比較例１：ゲル剤形の製造およびインビトロ溶出試験 （段階１）微細粒子の製造 ｈＧＨ ２．３ｍｇ／ｍｌを含有する５ｍＭ ＰＢＳに分子量２，０００，００ ０のヒアルロン酸ナトリウムを２０ｍｇ／ｍｌの濃度で加えてｈＧＨを含有する ２％ヒアルロン酸塩ゲル剤形を得た。 （段階２）インビトロ溶出試験 段階１で製造したゲル剤形を試験例１の方法に従って試験した。その結果、１ 時間以内にｈＧＨ１００％が放出された。この結果からゲル剤形は、水によって 容易に希釈されるため本発明の微細粒子より短い時間内に薬物を放出することが 分かる。比較例２：ゲル剤形の製造およびインビトロ溶出試験 （段階１）微細粒子の製造 ｈＧＨ １．５ｍｇ／ｍｌを含有する５ｍＭ ＰＢＳに分子量２，０００，００ ０のヒアルロン酸ナトリウムを２０ｍｇ／ｍｌの濃度で加えてｈＧＨを含有する 非流動性ゲル剤形を得た。 得られたゲル剤形１ｍｌを綿実油２ｍｌに分散し、均質化してエマルジョンを 形成した。 （段階２）インビトロ溶出試験 ９５ｇの平均体重を有する生後７週齢の矮小ラット２４匹を各６匹ずつ４群に 分離した。一つの群には段階１で製造したエマルジョン０．３ｍｌ（１５０μｇ のｈＧＨ）を皮下注射によって投与した（第１群）。 エマルジョン剤形の効果を他の剤形と比べるために、他の二つの群のラットに は、各々実施例２で製造した徐放性微細粒子をヒト成長ホルモンの濃度が１５０ μｇになるまで綿実油に分散した分散剤を投与し（第２群）；ヒト成長ホルモン １５０μｇに相当するユウトロピン^Rを投与した（第３群）。残りの群のラット にはヒト成長ホルモン剤形を投与しなかった(対照群)。投与後ラットの体重増加 の変化を６日間観察した。 図７は、ヒト成長ホルモンを含む本発明の徐放性剤形および通常の剤形で処理 した矮小ラットの平均体重増加の経時変化を比べたものである。結果としては、 ヒアルロン酸ゲル剤形で処理した矮小ラットの体重増加の経時変化はユウトロピ ン^Rと類似であった。ヒアルロン酸ゲル剤形で処理した矮小ラットの体重は投与 ２日または３日後減少し、以降は無投与対照群ラットの体重と類似であった。し かし、本発明の剤形で処理した群のラットは他の群に比べて６日間１５０％の体 重増加を示した。比較例３：ナトリウム−カルボキシルメチルセルロースを用いた微細粒子剤形の 製造およびインビトロ溶出試験 （段階１）微細粒子剤形の製造 ｈＧＨ ２．０ｍｇ／ｍｌを含有する５ｍＭ ＰＢＳにツイーン８０を０．０１ 重量％の濃度で加えた。これに、ナトリウム−カルボキシルメチルセルロース（ Ｎａ−ＣＭＣ、中粘度級）を１．８ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた。得られた溶液を ３ｍｌ／分の流速で噴霧乾燥機（Buchi １９０）に供給した。この際、噴霧乾燥 機へ流入される乾燥空気の温度は８５℃であり、得られた微細粒子の平均粒子は ３．０μｍである。 （段階２）インビトロ溶出試験 段階１で製造した微細粒子剤形を試験例１と同様な方法でインビトロ溶出試験 を行って、その結果を表１に示す。 【表１】 表１から分かるように、段階１で製造した微細粒子剤形のインビトロ放出の経 時変化は本発明の微細粒子の場合と異なる。すなわち、初期１時間の間３０％が 放出され、以降４８時間までまた３０％程度が放出され、その後はｈＧＨがほと んど放出されなかった。この結果から、ヒアルロン酸より疎水性が強い天然炭水 化物系の高分子をマトリックス物質として用いる場合には、タンパク質薬物とマ トリックスとの相互作用によって薬物の放出量が不均衡になり、薬物の変性可能 性が非常に高いことが分かる。 （段階３）インビボ溶出試験 段階１で製造した微細粒子を綿実油に分散した。得られた分散剤を生後７週齢 の矮小ラットに３００μｇの量で投与し、非投与群を対照群として用いた。ラッ トの体重増加を７日間観察し、その結果を体重増加の累積値（ｇ）として下記表 ２に示す。 【表２】 表２から分かるように、段階１で製造した微細粒子で処理したラットは比較例 ２においてのヒアルロン酸ゲル剤形と類似な体重増加様相を示した。すなわち、 初日にのみ体重の増加を示し、２日目は体重の減少を示した。また、その以降に は対照群より体重増加率がさらに低く、最後の７日には対照群と類似な体重増加 を示した。この結果からヒアルロン酸と同様にＮａ−ＣＭＣは天然炭水化物系重 合体であるが、Ｎａ−ＣＭＣ剤形は本発明のヒアルロン酸微細粒子より遥かに劣 る放出特性および力価を有することが分かる。比較例４：ヒアルロン酸−ベンジルエステルを用いた微細粒子剤形の製造ならび にインビボおよびインビトロ溶出試験 （段階１）微細粒子剤形の製造 天然ヒアルロン酸およびベンジルアルコールを化学的に反応させてヒアルロン 酸−ベンジルエステルを製造した後、ｈＧＨを含む微細粒子を下記のように製造 した。 ｈＧＨ ２ｍｇ／ｍｌを含む５ｍＭ ＰＢＳにツイーン８０を０．０１重量％の 濃度で加えた。得られた溶液を３ｍｌ／分の流速で噴霧乾燥機（Buchi１９０） に供給して微細粒子を製造した。この際、噴霧乾燥機へ流入される乾燥空気の温 度は８５℃であった。得られた微細粒子の平均粒径は２．５μｍである。 製造された粒子を６％のヒアルロン酸−ベンジルエステルを含有するジメチル スルホキシド（ＤＭＳＯ）に分散した後、得られた分散液を界面活性剤、Aracel ATM（ＩＣＩ，Ｕ.Ｓ.Ａ.）を含有するミネラル油に加えた後、混合物を均質化 してマイクロエマルジョンを作った。得られたマイクロエマルジョンは、ミネラ ル油連続相と、その中に分散されたｈＧＨを含有するヒアルロン酸−ベンジルエ ステル／ＤＭＳＯ溶液の分散相からなる。 得られたマイクロエマルジョンに酢酸エチルを撹拌しながら加えた後、ＤＭＳ Ｏを酢酸エチルで抽出し、ヒアルロン酸−ベンジルエステルが硬化してｈＧＨ粒 子を含有するヒアルロン酸−ベンジルエステル粒子が形成した。得られた最終粒 子の大きさは５．５μｍであり、ｈＧＨの含量は４５％であった。 （段階２）インビボ溶出試験 段階１で製造した微細粒子を試験例１と同様な方法で試験し、その結果を下記 表３に示す。 【表３】 表３から分かるように、天然ヒアルロン酸に疎水性を与えたヒアルロン酸−ベ ンジルエステルを用いることによって製造した微細粒子剤形からのｈＧＨの放出 は初期５時間以後にはほとんどなかった。このようにｈＧＨが放出されない理由 はタンパク質薬物（ｈＧＨ）とヒアルロン酸−ベンジルエステルマトリックスと の相互作用があまりにも強いからである。 （段階３）インビボ溶出試験 段階１で製造した微細粒子を綿実油に分散した。得られた分散液を生後７週齢 の矮小ラットにｈＧＨの量が３００ｇになるように投与し、対照群として非投与 群を用いた。ラットの体重増加を７日間観察し、その結果を体重増加累積値（ｇ ）として下記表４に示す。 【表４】 Ａ：対照群 Ｂ：ヒアルロン酸−ベンジルエステル微細粒子剤形群 表４から分かるように、ヒアルロン酸−ベンジルエステル粒子剤形は１日以降 ほとんど効果がないことが分かる。 本発明を前記特定実施態様と関連して記述したが、添付した特許請求範囲によ って定義される本発明の範囲内で、当該分野の熟練者が本発明を多様に変形およ び変化させ得ることは勿論である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/22 Ａ６１Ｋ 37/24 38/27 37/66 Ｈ 38/28 37/26 (72)発明者 クォン，オー・リョン 大韓民国305―340デジョン、ユソン―グ、 ドリョン―ドン381―42番、エルジ・アパ ートメント７―305

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒアルロン酸またはその無機塩の微細粒子および前記微細粒子中に封入さ れたタンパク質またはペプチド薬物を含む徐放性薬物組成物であって、前記微細 粒子の平均粒径が０．１ないし４０μｍ範囲である組成物。 ２．安定剤をさらに含む請求項１に記載の組成物。 ３．前記微細粒子の平均粒径が１ないし１０μｍである請求項１に記載の組成 物。 ４．前記薬物が、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、 成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、顆粒球−コロニー刺激 因子、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子、マクロファージ−コロニー刺 激因子、エリスロポエチン、骨格形態発生タンパク質、インターフェロン、イン スリン、アトリオペプチン−III、モノクロナール抗体、腫瘍壊死因子、マクロ ファージ活性化因子、インターロイキン、腫瘍変性因子、インスリン−類似成長 因子、表皮成長因子、組織プラスミノゲンアクチベーターおよびウロキナーゼか らなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の組成物。 ５．前記ヒアルロン酸の無機塩が、ヒアルロン酸のナトリウム、カリウム、リ チウム、カルシウム、アンモニウム、マグネシウム、亜鉛、銅およびコバルトの 塩からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の組成物。 ６．前記安定剤が、多糖類、タンパク質、アミノ酸、脂質、脂肪酸、ポリエチ レングリコール、無機塩、界面活性剤およびこれらの混合物からなる群から選ば れることを特徴とする請求項２に記載の組成物。 ７．請求項１の徐放性組成物を注射剤用媒体に分散した注射剤。 ８．分散剤または防腐剤をさらに含む請求項７に記載の注射剤。 ９．前記注射剤用媒体が、緩衝水溶液、エタノール、プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール、植物油、ミネラル油、スクアレン、たら肝油、モノ− 、ジ−、およびトリ−グリセリド、およびこれらの混合物からなる群から選ばれ ることを特徴とする請求項７に記載の注射剤。 １０．前記植物油が、トウモロコシ油、オリーブ油、大豆油、紅花油、綿実油 、 落花生油、胡麻油、ココナツ油、ヒマシ油およびこれらの混合物からなる群から 選ばれることを特徴とする請求項９に記載の注射剤。 １１．請求項１の徐放性組成物を含むエアロゾル製剤。