PL195223B1

PL195223B1 - Mikrocząsteczka leku o spowolnionym uwalnianiu, preparat iniekcyjny i preparat aerozolowy

Info

Publication number: PL195223B1
Application number: PL98330230A
Authority: PL
Inventors: Myung-Jim Kim; Sun-Jin Kim; Oh-Ryong KWON
Original assignee: Lg Life Sciences Ltd
Priority date: 1997-04-01
Filing date: 1998-03-26
Publication date: 2007-08-31
Also published as: JPH11513047A; DE69828252D1; ATE285245T1; ID20584A; DE69828252T2; TW514532B; KR100236771B1; IL127220A; PT918535E; JP3445283B2; KR19980075759A; AR011208A1; EP0918535A1; ES2232939T3; WO1998043664A1; US20130230598A1; NZ333019A; CN1222857A; TR199802500T1; US20080063727A1

Abstract

1. Mikrocz asteczka leku o spowolnionym uwalnianiu, znamienna tym, ze zawiera kwas hialu- ronowy lub jego sole nieorganiczne oraz lek bia lkowy lub peptydowy, srodek stabilizuj acy wybrany z grupy obejmuj acej polisacharyd, bia lko, aminokwas, sól nieorganiczn a, srodek powierzchniowo czynny i ich mieszanin e, przy czym wytwarzana jest przez rozpuszczenie kwasu hialuronowego lub jego nieorganicznej soli, leku bia lkowego lub peptydowego i srodka stabilizuj acego w wodzie lub wod- nym roztworze buforu i suszenie rozpy lowe roztworu i ma sredni rozmiar od 0,1 do 40 µm. 5. Preparat iniekcyjny, znamienny tym, ze zawiera mikrocz asteczk e o spowolnionym uwalnia- niu jak okre slono w zastrz. 1 zdyspergowan a w medium iniekcyjnym. 9. Preparat aerozolowy, znamienny tym, ze zawiera mikrocz asteczk e o spowolnionym uwal- nianiu, jak okre slono w zastrz. 1. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest mikrocząsteczka leku o spowolnionym uwalnianiu, preparat iniekcyjny i preparat aerozolowy.

Leki białkowe i peptydowe podaje się na ogół drogą iniekcyjną z powodu ich słabej absorpcji po podaniu drogą doustną. Po podaniu iniekcji, jej działanie in vivo trwa przez jedynie krótki okres czasu, stąd też iniekcje należy ciągle powtarzać, jeśli wymagane jest leczenie długotrwałe. Przykładowo, leczenie dzieci z niedoborem przysadkowego hormonu wzrostu prowadzi się przez codzienne podawanie iniekcji rekombinantowego ludzkiego hormonu wzrostu w czasie ponad 6 miesięcy. Do tego typu zastosowań byłby więc pożądany preparat o spowolnionym uwalnianiu, dzięki któremu nie byłoby potrzebne uciążliwe, codzienne podawanie leku.

Typowe preparaty o spowolnionym uwalnianiu leku białkowego lub peptydowego, np. ludzkiego hormonu wzrostu, wytwarza się przez zamknięcie tego leku w mikrokapsułkach biodegradowalnego materiału matrycy polimerycznej, z której powoli uwalnia się lek, w miarę jak materiał matrycy ulega rozkładowi in vivo. W tym kierunku prowadzono szerokie badania zmierzające do opracowania ulegających degradacji biologicznej polimerów, odpowiednich do użycia w preparatach o przedłużonym uwalnianiu leków. Efektywne w tego typu zastosowaniach okazały się ulegające degradacji biologicznej poliestry, takie jak polilaktyd, poliglikolid, kopoli(laktydo-glikolid), poliortoester i polibezwodnik [M. Chasin i R. Langer i wsp., Biodegradable Polymers as Drug Delivery System (Biodegradowalne polimery jako układy dostarczania leków), Marcel Dekker (1990) i J. Heller, Adv. Drug Del. Rev. 10, 163 (1993)].

Prowadzono również inne badania nad opracowaniem preparatów o spowolnionym uwalnianiu leku, stosując polimery naturalne, takie jak żelatyna, kolagen, chitozan, karboksymetyloceluloza, alginian i kwas hialuronowy. Naturalny polimer, jeśli zostanie umieszczony w środowisku wodnym, z reguły tworzy żel. Ten typ bardzo lepkiej matrycy żelowej, z której lek dyfunduje bardzo wolno stosowano w preparatach leków o spowolnionym uwalnianiu.

Przykładowo, w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 416 017 ujawniony jest iniekcyjny preparat o spowolnionym uwalnianiu erytropoetyny, w którym to preparacie użyto żel zawierający od 0,01% do 3% kwasu hialuronowego. W publikacji opisu patentowego Japonii nr 1-287041 z 1989 r. opisany jest iniekcyjny preparat o spowolnionym uwalnianiu insuliny oparty na żelu utworzonym z 1% kwasu hialuronowego a w publikacji opisu patentowego Japonii nr 2-00213 z 1990 r. opisana jest forma o spowolnionym uwalnianiu kalcytoniny, elkatoniny i ludzkiego hormonu wzrostu, w której to formie został użyty żel zawierający 5% kwasu hialuronowego. Meyer i wsp. podobnie opracowali preparat o spowolnionym uwalnianiu czynnika stymulującego kolonie granulocytów stosując żel zawierający od 0,5% do 4% kwasu hialuronowego [James Meyer i wsp., J. Controlled Release, 35, 67 (1995)].

Podawanie tych preparatów drogą iniekcyjną wymaga jednak użycia strzykawek z igłami o dużej średnicy otworu, gdyż żel zawierający kilka procent kwasu hialuronowego ma dużą lepkość, rzędu 10 Pa · s. Poza tym, jeśli wstrzyknięty żel zostanie rozcieńczony przez płyny ustrojowe, wówczas jego zdolność zatrzymywania leku gwałtownie się zmniejsza i w rezultacie przedłużone uwalnianie leku trwa nie dłużej niż jeden dzień. Przykładowo, w publikacji opisu patentowego Japonii nr 1-287041 z 1989r. ujawniono, że po podaniu królikom preparatu iniekcyjnego insuliny o przedłużonym uwalnianiu, zawierającego 1% kwasu hialuronowego, efekt terapeutyczny obniżania poziomu glukozy we krwi nie trwał dłużej niż 24 godziny. Donoszono również, że stężenie leku we krwi spadało do poniżej 1/10 stężenia początkowego w czasie krótszym niż 24 godziny, jeśli badanym zwierzętom wstrzykiwano zawierający 2% kwasu hialuronowego preparat czynnika stymulującego kolonie granulocytów [James Meyer i wsp., J. Controlled Release, 35, 67 (1995)] albo zawierający 1,5% kwasu hialuronowego preparat α-interferonu i białka osocza (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 416 017). Tak więc, preparaty o spowolnionym uwalnianiu leków oparte na żelach kwasu hialuronowego posiadają tę poważną wadę, że uwalniania leku nie można utrzymać przez czas dłuższy niż 24 godziny.

Naturalny kwas hialuronowy i jego sole nieorganiczne rozpuszczają się tylko w wodzie, natomiast ester benzylowy kwasu hialuronowego o nazwie handlowej HYAFF™ nie rozpuszcza się w wodzie, a rozpuszcza się w rozpuszczalniku organicznym, np. w dimetylosulfotlenku. Kompozycje leków zawierające stałe mikrocząstki takich hydrofobowych pochodnych kwasu hialuronowego i leki w nich zamknięte, wytworzono znaną techniką ekstrakcji rozpuszczalnika z emulsji [N. S. Nightlinger i wsp., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. XXII, numer referatu: 3205 (1995); L. Ilum i wsp., J. Controlled Rel. 29, 133 (1994)]. W metodzie tej postępuje się następująco.

PL 195 223 B1

Lek o budowie białkowej dysperguje się w dimetylosulfotlenkowym roztworze estru benzylowego kwasu hialuronowego i wytworzoną dyspersję dodaje się do oleju mineralnego, wytwarzając emulsję. Do tej emulsji dodaje się rozpuszczalnik organiczny, np. octan etylowy w celu wyekstrahowania dimetylosulfotlenku. Następnie odzyskuje się mikrocząstki, w skład których wchodzi lek i ester benzylowy kwasu hialuronowego.

W sposobie tym występuje jednak problem, polegający na tym, że lek o budowie białkowej może ulegać denaturacji w wyniku kontaktu z rozpuszczalnikiem organicznym albo z hydrofobowym estrem benzylowym kwasu hialuronowego. Faktycznie, kompozycja mikrocząstek zawierająca czynnik stymulujący kolonie granulocytów/makrofagów (GM-CSF), wytworzona przy użyciu całkowicie zestryfikowanej pochodnej kwasu hialuronowego, uwalniała jedynie około 25% GM-CSF podczas kilku pierwszych dni, a już po 17 dniach lek nie uwalniał się wcale [N. S. Nightlinger i wsp., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. XXII, numer referatu: 3205 (1995)]. W tym przypadku, większa część leku białkowego została stracona, najprawdopodobniej z powodu jego denaturacji poprzez interakcję z estrem benzylowym kwasu hialuronowego i/lub z rozpuszczalnikiem organicznym.

Europejski opis patentowy nr EP 486 959 ujawnia kompozycje leku o spowolnionym uwalnianiu w postaci mikrocząstek, których średni rozmiar wynosi od 0,1 do 150 pm. Zawierają one polimer ulegający biodegradacji, polimer amfifilowy i środek modyfikujący właściwości oddziaływania i substancję aktywną. Europejski opis patentowy nr EP 486 959 wskazuje, że w poprzednich sposobach wytwarzania kompozycji farmaceutycznych z zastosowaniem polimerów ulegających biodegradacji próbowano modyfikować przepuszczalność lub szybkość degradacji polimerów w celu modulowania szybkości uwalniania leku, ale miały one poważne niedociągnięcia. Zatem przedstawiono rozwiązanie powyższych problemów i dlatego europejski opis patentowy nr EP 486 959 zapewnia nowe kompozycje farmaceutyczne, które zawierają polimer ulegający biodegradacji, polimer amfifilowy i środek modyfikujący właściwości oddziaływania między powierzchniami cząsteczek i substancję farmaceutycznie aktywną. Europejski opis patentowy nr EP 486 959 ujawnia zastosowanie polimeru ulegającego biodegradacji, polimeru amfifilowego i środka modyfikującego właściwości oddziaływania w celu umożliwienia opóźnionego uwalniania substancji aktywnej. Polimer amfifilowy jest wykorzystywany do roztwarzania polimeru ulegającego biodegradacji i/lub polimeru polisacharydowego oraz polimer amfifilowy i środek modyfikujący właściwości oddziaływania między powierzchniami cząsteczek jest wykorzystany jako modulator rozpuszczalności substancji aktywnej. Europejski opis patentowy nr EP 486 959 ujawnia w kolumnie 3, wiersze 16 do 20, że: „jako pierwszy etap w przygotowywaniu jednej z kompozycji, polimer ulegający biodegradacji i/lub żelujący polisacharyd i/lub polimer bioadhezyjny oraz środek modyfikujący właściwości oddziaływania między powierzchniami cząsteczek są roztwarzane w polimerze amfifilowym, „ten sposób wytwarzania jest szczególnie użyteczny, ponieważ dzięki niemu unika się zanieczyszczenia rozpuszczalników oraz „jako opcja alternatywna, polimery i środek modyfikujący właściwości oddziaływania między powierzchniami cząsteczek mogą być solubilizowane w minimalnej ilości rozpuszczalnika lub mieszaniny rozpuszczalnikowej potrzebnej do rozpuszczenia. W przypadku stosowania rozpuszczalników - we wszystkich przykładach z europejskiego opisu patentowego EP 486 959 stosowane są rozpuszczalniki organiczne. W szczególności w przykładzie 16 stosuje się kwas hialuronowy jako polimer i sześciowodny HFA jako rozpuszczalnik (kwas 2-fluorooctowy C2H3FO2· 6H₂O).

Opis patentowy EP 522 491 ujawnia kompozycję rozpuszczalną w wodzie, zawierającą substancję aktywną farmakologicznie, rozpuszczalne w wodzie cząstki kwasu hialuronowego, rozpuszczalne w wodzie białka do podawania przez iniekcję bez wskazania jakiejkolwiek aktywności farmakologicznej (strona 3, wiersze 8-13). EP 522 491 ujawnia, że chociaż efekt substancji aktywnej farmakologicznie może być przedłużony poprzez zastosowanie kwasu hialuronowego o relatywnie wysokim stężeniu i wyższej lepkości, to bardziej utrudnione jest podawanie poprzez iniekcję z uwagi na tworzenie się bąbli (str. 2, wiersze 31,32 i 45 do 52). W celu rozwiązania tego problemu stosowano dodawanie białka rozpuszczalnego w wodzie, takiego jak surowica albuminy, do kompozycji rozpuszczalnej w wodzie zawierającej substancję aktywną i kwas hialuronowy. EP 522 491 ujawnia, że ciekła postać lub postać proszkowa liofilizatu kwasu hialuronowego, leku białkowego i surowicy albuminy może być rozpuszczana lub dyspergowana w roztworze polimeru ulegającego biodegradacji, takiego jak kopolimer poli(kwasu mlekowego-kwasu glikolowego) i formułowana w mikrokapsułki lub nanokapsułki (str. 7, wiersze 38 do 42). EP 522 491 ujawnia jedynie mikrocząsteczki zawierające co najmniej cztery powyższe składniki. Ponadto, mikrocząstka z EP 522 491 może być wytwarzana poprzez rozpuszczenie lub dyspersję ciekłej postaci lub postaci proszkowej liofilizatu kwasu hialuronowego, leku białkowego

PL 195 223 B1 i surowicy albuminy w roztworze polimeru ulegającego biodegradacji i formułowana w mikrokapsułki. Wszystkie polimery ulegające biodegradacji, wymienione w EP 522 491, są hydrofobowe, dlatego wymagane jest zastosowanie rozpuszczalnika organicznego podczas tworzenia mikrokapsułki. Mikrocząstka wytwarzana poprzez liofilizację uwalnia ponad 90% leku białkowego podczas 1 godziny.

Przedmiotem wynalazku jest mikrocząstka leku o spowolnionym uwalnianiu, charakteryzująca się tym, że zawiera kwas hialuronowy lub jego sole nieorganiczne oraz lek białkowy lub peptydowy, środek stabilizujący wybrany z grupy obejmującej polisacharyd, białko, aminokwas, sól nieorganiczną, środek powierzchniowo czynny i ich mieszaninę, przy czym wytwarzana jest przez rozpuszczenie kwasu hialuronowego lub jego nieorganicznej soli, leku białkowego lub peptydowego i środka stabilizującego w wodzie lub wodnym roztworze buforu i suszenie rozpyłowe roztworu i ma średni rozmiar od 0,1 do 40 pm.

Mikrocząstka według wynalazku korzystnie ma średnią wielkość w zakresie od 1 do 10 pm i zawiera lek wybrany z grupy obejmującej ludzki hormon wzrostu, somatotropinę bydlęcą, somatotropinę świńską, hormon uwalniający hormon wzrostu, peptyd uwalniający hormon wzrostu, czynnik stymulujący kolonie granulocytów, czynnik stymulujący kolonie granulocytów/makro>fagów, czynnik stymulujący kolonie makrofagów, erytropoetynę, morfogenetyczne białko kości, interferon, insulinę, atriopeptynę III, przeciwciało monoklonalne, czynnik martwicy nowotworu (TNF), czynnik aktywujący makrofagi, interleukinę, czynnik denaturujący guza, insulino-podobny czynnik wzrostu, naskórkowy czynnik wzrostu, aktywator plazminogenu tkankowego i urokinazę oraz mieszaninę tych leków.

Korzystnie mikrocząstka zawiera sól nieorganiczną kwasu hialuronowego wybraną spośród soli sodowej, potasowej, litowej, wapniowej, amonowej, magnezowej, cynkowej, miedziowej i kobaltowej.

Przedmiotem wynalazku jest preparat iniekcyjny, charakteryzujący się tym, że zawiera mikrocząstkę o spowolnionym uwalnianiu według wynalazku zdyspergowaną w medium iniekcyjnym.

Korzystnie preparat iniekcyjny zawiera ponadto środek dyspergujący albo środek konserwujący.

Preparat iniekcyjny według wynalazku korzystnie zawiera medium iniekcyjne wybrane z grupy obejmującej buforowany roztwór wodny, etanol, glikol propylenowy, glikol polietylenowy, olej roślinny, olej mineralny, skwalen, tran z wątroby dorsza, mono-, di- i trójgliceryd albo ich mieszaninę.

Preparat iniekcyjny według wynalazku korzystnie zawiera olej roślinny wybrany spośród oleju kukurydzianego, oleju z oliwek, oleju sojowego, oleju słonecznikowego, oleju bawełnianego, oleju arachidowego, oleju sezamowego, oleju kokosowego, oleju rącznikowego i ich mieszanin.

Przedmiotem wynalazku jest preparat aerozolowy, charakteryzujący się tym, że zawiera mikrocząstkę o spowolnionym uwalnianiu według wynalazku.

Szczegółowy opis rysunków.

Powyższy i inne przedmioty i cechy wynalazku okażą się zrozumiałe na podstawie poniższego opisu wynalazku łącznie z towarzyszącymi rysunkami, na których: fig. 1 przedstawia zależne od czasu zmiany w ilości uwalnianego ludzkiego hormonu wzrostu (hGH) w próbach in vitro, fig. 2A i fig. 2B przedstawiają stabilność kompozycji o spowolnionym uwalnianiu, zawierającej hGH, oznaczoną metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (A: hGH uwolniony z preparatu, B: kontrolny, wodny roztwór hGH), fig. 3A i fig. 3B przedstawiają stabilność zawierającej hGH kompozycji o spowolnionym uwalnianiu, oznaczoną metodą chromatografii ekskluzyjnej (A: hGH uwolniony z preparatu, B: kontrolny, wodny roztwór hGH), fig. 4 przedstawia porównanie zależnych od czasu zmian w obrazach przyrostu wagi karłowatych szczurów, którym podawano preparat ludzkiego hormonu wzrostu o spowolnionym uwalnianiu ze zmianami po podaniu preparatów znanych, fig. 5 przedstawia różnice między zależnymi od czasu zmianami w obrazach przyrostu wagi karłowatych szczurów traktowanych preparatem ludzkiego hormonu wzrostu o spowolnionym uwalnianiu a zmianami po podaniu preparatów znanych, fig. 6 przedstawia zależne od czasu zmiany w stężeniu ludzkiego hormonu wzrostu (hGH) we krwi, fig. 7 przedstawia zależne od czasu zmiany w obrazach przyrostu wagi karłowatych szczurów traktowanych preparatem ludzkiego hormonu wzrostu o spowolnionym uwalnianiu w porównaniu z odpowiednimi zmianami po podaniu preparatów znanych.

Kompozycja o spowolnionym uwalnianiu zawiera stałe mikrocząstki kwasu hialuronowego lub jego soli oraz lek białkowy lub peptydowy zakapsułkowany w tych cząstkach. Kompozycja ta wykazuje zalety w porównaniu z preparatami znanymi, opartymi na żelach kwasu hialuronowego pod względem charakterystyki uwalniania i łatwości manipulacji, to znaczy, preparat iniekcyjny wytworzony z mikrocząstek według wynalazku jest łatwiejszy do wstrzyknięcia dzięki niskiej lepkości, a kompozycja uwalnia lek in vivo ze stałą szybkością w dłuższym okresie czasu.

PL 195 223 B1

Ponadto, kompozycja daje tę korzyść, że nie następuje denaturacja leku dopóki 100% tego leku nie uwolni się z tej kompozycji.

Kompozycję mikrocząstek posiadającą średnią wielkość cząstek w zakresie od 0,1 do 40 pm, korzystnie od 0,1 do 10 pm można wytworzyć przez suszenie rozpyłowe albo suszenie ze stanu zamrożenia wodnego roztworu zawierającego lek białkowy lub peptydowy oraz kwas hialuronowy lub jego sól. W razie potrzeby, do roztworu można dodać środek stabilizujący.

Przykłady leków, które mogą być stosowane do wytwarzania stałych mikrocząstek według wynalazku obejmują ludzki hormon wzrostu, somatotropinę bydlęcą, somatotropinę świńską, hormon uwalniający hormon wzrostu, peptyd uwalniający hormon wzrostu, czynnik stymulujący kolonie granulocytów, czynnik stymulujący kolonie granulocytów/makrofagów. czynnik stymulujący kolonie makrofagów, erytropoetynę, morfogenetyczne białko kości, interferon, insulinę, atriopeptynę III, przeciwciało monoklonalne, czynnik martwicy nowotworu (TNF), czynnik aktywujący makrofagi, interleukinę, czynnik denaturujący guza, insulino-podobny czynnik wzrostu, naskórkowy czynnik wzrostu, aktywator plazminogenu tkankowego i urokinazę.

Reprezentatywnymi solami nieorganicznymi kwasu hialuronowego, które można użyć do wytwarzania stałej kompozycji mikrocząstek są sól sodowa, potasowa, litowa, wapniowa, amonowa, magnezowa, cynkowa, miedziowa i kobaltowa.

W niniejszym wynalazku mogą być stosowane niektóre typy środków stabilizujących obejmujące polisacharyd, białko, aminokwas, lipid, kwas tłuszczowy, glikol polietylenowy, sól nieorganiczną i środek powierzchniowo czynny.

Mikrocząstki o spowolnionym uwalnianiu według wynalazku mogą zawierać lek białkowy albo peptydowy w ilości w zakresie od 1 do 90% wagowych w przeliczeniu na wagę całej mikrocząstki i ewentualnie środek stabilizujący w ilości od 1 do 90% wagowych w przeliczeniu na wagę mikrocząstki.

Objęty przedmiotem wynalazku preparat iniekcyjny o spowolnionym uwalnianiu wytwarza się przez zdyspergowanie w medium iniekcyjnym kompozycji mikrocząstek o spowolnionym uwalnianiu, użytej w ilości od 0,01 do 10% wagowych w przeliczeniu na wagę preparatu iniekcyjnego. O ile to potrzebne, do tego preparatu można dodać środek dyspergujący albo konserwujący. Do typowych mediów iniekcyjnych, jakie można użyć do wytworzenia preparatu iniekcyjnego według wynalazku należą: buforowany roztwór wodny, etanol, glikol propylenowy, glikol polietylenowy, olej roślinny, olej mineralny, skwalen, tran z wątroby dorsza, mono-, di- i trójgliceryd albo ich mieszanina.

Przykładami olejów roślinnych są: olej kukurydziany, olej z oliwek, olej sojowy, olej słonecznikowy, olej bawełniany, olej arachidowy, olej sezamowy i ich mieszaniny.

Z kompozycji mikrocząstek o przedłużonym uwalnianiu można poza tym wytworzyć preparat aerozolowy. Wytworzony preparat aerozolowy według wynalazku można stosować do nosa albo na błony śluzowe oskrzeli, gdzie kompozycja mikrocząstek uwalnia lek w sposób kontrolowany.

Wynalazek jest bardziej szczegółowo zilustrowany w poniższych przykładach i w przykładach biologicznych, nie ograniczających jego zakresu.

P r z y k ł a d I

Wytwarzanie mikrocząstek

Do 5 mM buforowanego fosforanem roztworu soli fizjologicznej (PBS) zawierającego 2 mg/ml ludzkiego hormonu wzrostu (hGH) dodano Tween 80 do stężenia 0,01% wagowych. Do tej mieszaniny dodano hialuronian sodu o masie cząsteczkowej 1000000 do stężenia 2 mg/ml. Otrzymany roztwór podawano do suszarni rozpyłowej typu Buchi 190 z szybkością 3 ml/minutę, wytwarzając mikrocząstki. Temperaturę powietrza wpływającego do suszarni utrzymywano na poziomie 85°C. Uzyskane mikrocząstki miały średnią średnicę 3,0 pm.

P r z y k ł a d II

Wytwarzanie mikrocząstek

Do 5 mM PBS zawierającego 1 mg/ml hGH dodano Tween 80 do stężenia 0,01% wagowych. Do tej mieszaniny dodano hialuronian sodu o masie cząsteczkowej 2000000 do stężenia 1 mg/ml. Otrzymany roztwór podawano do suszarni rozpyłowej typu Buchi 190 z szybkością 2 ml/minutę, wytwarzając mikrocząstki. Temperaturę powietrza wpływającego do suszarni utrzymywano na poziomie 85°C. Uzyskane mikrocząstki miały średnią średnicę 2,0 pm.

P r z y k ł a d III

Wytwarzanie mikrocząstek

Do 5 mM PBS zawierającego 0,1 mg/ml hGH dodano Tween 80 do stężenia 0,01% wagowych. Do tej mieszaniny dodano hialuronian sodu o masie cząsteczkowej 2000000 do stężenia 0,9 mg/ml.

PL 195 223 B1

Otrzymany roztwór podawano do suszarni rozpyłowej typu Buchi 190 z szybkością 3 ml/minutę, wytwarzając mikrocząstki. Temperaturę powietrza wpływającego do suszarni utrzymywano na poziomie 85°C. Uzyskane mikrocząstki miały średnią średnicę 2,0 pm.

Przykład próby biologicznej 1. Próba uwalniania in vitro

Mikrocząstki wytworzone w przykładach I, II i III zawieszono w buforze o składzie: 150 mM chlorku sodu, 10 mM fosforanu i 0,05% azydku sodu (pH = 7,4) w takiej ilości, aby stężenie hGH wynosiło 1,0 mg/ml. Otrzymaną zawiesinę umieszczono w termostacie i oznaczano uwalnianie hGH w naczyniu z mieszadłem w temperaturze 37°C. W określonych czasach pobierania próbek zawiesinę wirowano z szybkością 800 g przez 10 minut w celu uzyskania supernatantu i pobierano frakcję supernatantu odpowiadającą 1/10 całej zawiesiny. Zawiesinę uzupełniano ilością buforu równą ilości pobranego supernatantu i kontynuuowano próbę na uwalnianie w temperaturze 37°C. Stężenie hGH w supernatancie oznaczano metodą Lowry'ego i metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w celu oznaczenia ilości uwolnionego hGH względem czasu. Wyniki są przedstawione na fig. 1.

Figura 1 obrazuje zależne od czasu zmiany w ilości uwalnianego hGH in vitro. Jak widać na tej figurze, szybkość uwalniania hGH jest niższa, jeśli masa cząsteczkowa kwasu hialuronowego jest wyższa, a zawartość hGH jest niższa. I rzeczywiście, mikrocząstki otrzymane w przykładzie III wykazują uwalnianie najwolniejsze. Wyniki te wskazują, że czas spowolnionego uwalniania leku można regulować przez odpowiednie dobranie masy cząsteczkowej kwasu hialuronowego, zawartości hGH podobnych parametrów. Ponadto, otrzymane mikrocząstki charakteryzują się stałą szybkością uwalniania in vitro aż do czasu uwolnienia 70% hGH, bez pojawiania się początkowego ostrego uwalniania.

Przykład próby biologicznej 2. Stabilność hGH w mikrocząstkach.

W celu zbadania, czy hGH w mikrocząstkach według wynalazku jest identyczny z wodnym roztworem hGH użytym do wytwarzania mikrocząstek, oznaczano hGH uwolniony z mikrocząstek w próbie uwalniania in vitro metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP-HPLC) i metodą chromatografii ekskluzyjnej (SEC).

Denaturację hGH w wyniku utleniania i deaminacji można oznaczyć metodą RP-HPLC. Wyniki tego oznaczenia są przedstawione na fig. 2A i fig. 2B.

Na fig. 2A i fig. 2B wykazana jest metodą RP-HPLC stabilność zawierającej hGH kompozycji o spowolnionym uwalnianiu. Na fig. 2A jest przedstawiony, uzyskany z RP-HPLC, profil uwalniania hGH z preparatu według wynalazku, a na fig. 2B są przedstawione dane dla kontrolnego wodnego roztworu hGH.

Denaturację hGH w wyniku agregacji można potwierdzić metodą SEC. Wyniki są przedstawione na fig. 3A i fig. 3B.

Na figurach 3A i fig. 3B wykazana jest metodą SEC stabilność zawierającej hGH kompozycji o spowolnionym uwalnianiu według wynalazku. Na fig. 3A jest przedstawiony profil SEC uwalniania hGH z preparatu a na fig. 3B są przedstawione dane dla kontrolnego wodnego roztworu hGH.

Jak to obrazują fig. 2A, 2B, 3A i 3B, hGH uwalniany z mikrocząstek według wynalazku jest identyczny z tym, jaki jest zawarty w kontrolnym roztworze wodnym hGH, a zawartość monomeru hGH wynosi ponad 95%. Wyniki te wykazują, że ani podczas wytwarzania mikrocząstek według wynalazku, ani podczas uwalniania leku w temperaturze 37°C nie zachodzi denaturacja hGH.

Przykład próby biologicznej 3. Próba uwalniania in vivo

Do próby oceniającej właściwości spowolnionego uwalniania mikrocząsteczek według wynalazku użyto szczury - karły z dziedziczną niską sekrecją hormonu wzrostu.

Wytworzone w przykładzie I mikrocząstki o spowolnionym uwalnianiu zdyspergowano w mieszaninie glikolu propylenowego i etanolu (7:3, objętościowo) użytej w takiej ilości, aby otrzymać stężenie hGH wynoszące 5 mg/ml. Powstałą dyspersję rozcieńczono buforowanym roztworem wodnym o składzie: 150 mM NaCl i 10 mM fosforanu (pH = 7,4), użytym w takiej proporcji, aby stężenie hGH wynosiło 0,5 mg/ml.

Osiemnaście siedmiotygodniowych szczurów-karłów o średniej masie ciała 103 g podzielono na trzy grupy, po 6 szczurów. Szczurom z pierwszej grupy podawano podskórną iniekcję 0,1 ml zawiesiny mikrocząstek sporządzonej powyżej (odpowiadającą ilości 50 pg hGH), codziennie, przez okres tygodni (grupa eksperymentalna). Szczurom z drugiej grupy podawano preparat Eutropin®, handlowy preparat hGH do infekcji wodnych, w tych samych warunkach. Szczurom z trzeciej grupy nie podawano żadnego preparatu hGH (nie traktowana grupa kontrolna). Szczury ważono codziennie w celu oznaczenia zmian w masie ciała.

PL 195 223 B1

Na figurze 4 porównane są zależne od czasu zmiany w obrazie przyrostów masy ciała u szczurów w grupie eksperymentalnej, w grupie porównawczej i w grupie kontrolnej.

Jak to jest przedstawione na fig. 4, u szczurów w grupie eksperymentalnej obserwowano stały przyrost wagi w czasie 2 tygodni i przyrost ten był większy niż u szczurów w grupie porównawczej i w grupie kontrolnej. Wyniki te świadczą o tym, że mikrocząstki według wynalazku są bardziej skuteczne niż znane preparaty, dzięki właściwości spowolnionego uwalniania.

Przykład próby biologicznej 4. Próba uwalniania in vivo

Wytworzone w przykładzie II mikrocząstki o spowolnionym uwalnianiu zdyspergowano w oleju bawełnianym użytym w takiej ilości, aby stężenie hGH wynosiło 1,5 mg/ml.

Dwadzieścia cztery siedmiotygodniowe szczury-karły o średniej masie ciała 105 g podzielono na cztery grupy, po 6 szczurów. Szczurom z pierwszej grupy podawano podskórną iniekcję 0,1 ml dyspersji mikrocząstek sporządzonej powyżej (odpowiadającą ilości 150 pg hGH) co trzy dni przez okres 2 tygodni (grupa eksperymentalna). Szczurom z drugiej grupy podawano preparat Eutropin®, (R) w tych samych warunkach (grupa porównawcza 1). Szczurom z trzeciej grupy podawano Eutropin w ilości odpowiadającej 50 pg hGH dziennie przez okres 2 tygodni (grupa porównawcza 2). Szczurom z czwartej grupy nie podawano żadnego preparatu hGH (nie traktowana grupa kontrolna). Szczury ważono codziennie w celu oznaczenia zmian w masie ciała.

Na figurze 5 przedstawione są różnice między zależnymi od czasu zmianami w obrazach przyrostu wagi szczurów w grupie eksperymentalnej, w grupach porównawczych i w grupie kontrolnej.

Jak to obrazuje fig. 5, u szczurów w grupie eksperymentalnej obserwowano większy przyrost masy ciała niż u szczurów w grupach porównawczych i w grupie kontrolnej. Szczury z grupy porównawczej 1 przyrastały znacząco na wadze w pierwszym dniu, jednakże mniej przybierały na wadze niż szczury z grupy kontrolnej w drugim i trzecim dniu po podaniu. Szczury z grupy eksperymentalnej i z grupy porównawczej 2 wykazywały stały wzrost wagi. Wyniki tej próby wykazują, że mikrocząstki według wynalazku wykazują właściwości przedłużonego uwalniania trwającego co najmniej trzy dni.

Przykład próby biologicznej 5. Próba uwalniania in vivo

Wytworzone w przykładzie II mikrocząstki o spowolnionym uwalnianiu zdyspergowano w oleju bawełnianym użytym w takiej ilości, aby stężenie hGH wynosiło 1,5 mg/ml. Osiem królików o średniej masie ciała 2,5 kg podzielono na dwie grupy po 4 króliki. Królikom z jednej grupy podano iniekcję dyspersji mikrocząstek wytworzonej powyżej w ilości odpowiadającej 3700 pg hGH (grupa eksperymentalna). Królikom z drugiej grupy nie podano hGH (grupa kontrolna). Po podaniu, od królików codziennie pobierano próbki krwi w czasie 6 dni. Ilość hGH w próbkach krwi oznaczano ilościowo metodą radioimmunologiczną (RIA).

Na figurze 6 są przedstawione zależne od czasu zmiany w stężeniu ludzkiego hormonu wzrostu we krwi.

Jak to jest widoczne na fig. 6, ilość hGH we krwi utrzymywała się w zakresie od 0 do 11 ng/ml przez 4 dni po podaniu, a następnie stopniowo zmniejszała się po 5 dniach. Ten wynik jest dowodem na to, że mikrocząstki według wynalazku dają stałą szybkość uwalniania w ciągu 4 dni, a po tym czasie szybkość uwalniania stopniowo spada. Ten wynik jest zgodny z wynikiem próby z przykładu próby biologicznej 1, gdzie szybkość uwalniania hGH in vivo była liniowa do czasu uwolnienia 70% hGH. Stężenie hGH we krwi zwierząt z grupy kontrolnej było natomiast poniżej stężenia wykrywalnego metodą RIA (1 ng/ml) i z tego względu zostało zignorowane.

P r z y k ł a d IV

Wytwarzanie mikrocząsteczek i próba uwalniania in vitro (Etap 1). Wytwarzanie mikrocząsteczek

Do 5 mM PBS zawierającego 2 mg/ml bydlęcej somatotropiny (bST) dodano Tween 80 do stężenia 0,01% wagowych. Do tej mieszaniny dodano hialuronian sodu o masie cząsteczkowej 1000000 do stężenia 2 mg/ml. Otrzymany roztwór podawano do suszarni rozpyłowej typu Buchi 190 z szybkością 3 ml/minutę, wytwarzając mikrocząstki. Temperaturę powietrza wpływającego do suszarni utrzymywano na poziomie 85°C. Uzyskane mikrocząstki miały średnią średnicę 3,0 pm.

(Etap 2). Próba uwalniania in vitro

Próbę uwalniania in vitro z użyciem mikrocząstek wytworzonych w etapie 1 prowadzono zgodnie z opisem podanym w przykładzie próby biologicznej 1, a stabilność uwalnianej bST badano w sposób opisany w przykładzie próby biologicznej 2.

Uwalnianą bST analizowano jakościowo i ilościowo metodą chromatografii ekskluzyjnej. Wyniki analiz wykazały, że ponad 85% bST uwalniało się przez 72 godziny i że nie następowała jej denaturacja.

PL 195 223 B1

P r z y k ł a d V

Do 5 mM PBS zawierającego 2 mg/ml świńskiej somatotropiny (pST) dodano Tween 80 do stężenia 0,01% wagowych. Do tej mieszaniny dodano hialuronian sodu o masie cząsteczkowej 1000000 do stężenia 2 mg/ml. Otrzymany roztwór podawano do suszarni rozpyłowej typu Buchi 190 z szybkością 3 ml/minutę, wytwarzając mikrocząstki. Temperaturę powietrza wpływającego do suszarni utrzymywano na poziomie 85°C. Uzyskane mikrocząstki miały średnią średnicę 3,0 pm.

(Etap 2). Próba uwalniania in vitro

Próbę uwalniania in vitro z użyciem mikrocząstek wytworzonych w etapie 1 prowadzono zgodnie z opisem podanym w przykładzie próby biologicznej 1, a stabilność uwalnianej pST badano w sposób opisany w przykładzie próby biologicznej 2.

Uwalnianą pST analizowano jakościowo i ilościowo metodą chromatografii ekskluzyjnej (SEC). Wyniki analiz wykazały, że ponad 90% pST uwalniało się przez 72 godziny i że nie następowała jej denaturacja.

P r z y k ł a d VI

Do 5 mM PBS zawierającego 0,4 mg/ml czynnika stymulującego kolonie granulocytów/makrofagów (GM-CSF) dodano Tween 80 do stężenia 0,01% wagowych. Do tej mieszaniny dodano hialuronian sodu o masie cząsteczkowej 1000000 do stężenia 1,6 mg/ml. Otrzymany roztwór podawano do suszarni rozpyłowej typu Buchi 190 z szybkością 3 ml/minutę, wytwarzając mikrocząstki. Temperaturę powietrza wpływającego do suszarni utrzymywano na poziomie 85°C. Uzyskane mikrocząstki miały średnią średnicę 3,0 pm.

(Etap 2). Próba uwalniania in vitro

Próbę uwalniania in vitro z użyciem mikrocząstek wytworzonych w etapie 1 prowadzono zgodnie z opisem podanym w przykładzie próby biologicznej 1, a stabilność uwalnianego GM-CSF badano w sposób opisany w przykładzie próby biologicznej 2.

Uwalniany GM-CSF analizowano jakościowo i ilościowo metodą chromatografii ekskluzyjnej (SEC). Wyniki analizy wykazały, że ponad 92% GM-CSF uwalniało się w ciągu 72 godzin i że nie następowała denaturacja bST.

P r z y k ł a d VII

Do 5 mM PBS zawierającego 1000 jednostek międzynarodowych (j.m.) erytropoetyny (EPO) i 0,5 mg/ml albuminy surowicy dodano Tween 80 do stężenia 0,01% wagowych. Do tej mieszaniny dodano hialuronian sodu o masie cząsteczkowej 1000000 do stężenia 2,5 mg/ml. Otrzymany roztwór podawano do suszarni rozpyłowej typu Buchi 190 z szybkością 3 ml/minutę, wytwarzając mikrocząstki. Temperaturę powietrza wpływającego do suszarni utrzymywano na poziomie 85°C. Uzyskane mikrocząstki miały średnią średnicę 3,5 pm.

(Etap 2). Próba uwalniania in vitro

Próbę uwalniania in vitro, z użyciem mikrocząstek wytworzonych w etapie 1, prowadzono zgodnie z opisem podanym w przykładzie próby biologicznej 1, a stabilność uwalnianej EPO badano w sposób opisany w przykładzie próby biologicznej 2.

Uwalnianą EPO analizowano jakościowo i ilościowo metodą chromatografii ekskluzyjnej (SEC). Wyniki analiz wykazały, że ponad 72% EPO uwalniało się w czasie 72 godzin i że nie następowała denaturacja EPO.

P r z y k ł a d VIII

Do 5 mM PBS zawierającego 2 x 10⁵ jednostek międzynarodowych/ml α-interferonu, 0,2 mg/ml D-mannitolu i 0,2 mg/ml albuminy surowicy dodano Tween 80 do stężenia 0,01% wagowych. Do tej mieszaniny dodano hialuronian sodu o masie cząsteczkowej 1000000 do stężenia 2,5 mg/ml. Otrzymany roztwór podawano do suszarni rozpyłowej typu Buchi 190 z szybkością 3 ml/minutę, wytwarzając mikrocząstki. Temperaturę powietrza wpływającego do suszarni utrzymywano na poziomie 105°C. Uzyskane mikrocząstki miały średnią średnicę 3,5 pm.

PL 195 223 B1 (Etap 2). Próba uwalniania in vitro

Próbę uwalniania in vitro, z użyciem mikrocząstek wytworzonych w etapie 1, prowadzono zgodnie z opisem podanym w przykładzie próby biologicznej 1, a stabilność uwalnianego α-interferonu badano w sposób opisany w przykładzie próby biologicznej 2.

Uwalniany α-interferon analizowano jakościowo i ilościowo metodą RP-HPLC. Wyniki analiz wykazały, że ponad 90% α-interferonu uwalniało się w ciągu 72 godzin i że nie następowała jego denaturacja.

P r z y k ł a d IX

Do 5 mM PBS zawierającego 2 x 10⁵jednostek międzynarodowych/ml γ-interferonu, 0,2 mg/ml glicyny i 0,2 mg/ml albuminy surowicy dodano Tween 80 do stężenia 0,01% wagowych. Do tej mieszaniny dodano hialuronian sodu o masie cząsteczkowej 1000000 do stężenia 2,5 mg/ml. Otrzymany roztwór podawano do suszarni rozpyłowej typu Buchi 190 z szybkością 3 ml/minutę, wytwarzając mikrocząstki. Temperaturę powietrza wpływającego do suszarni utrzymywano na poziomie 105°C. Uzyskane mikrocząstki miały średnią średnicę 3,5 pm.

(Etap 2). Próba uwalniania in vitro

Próbę uwalniania in vitro z użyciem mikrocząstek wytworzonych w etapie 1, prowadzono zgodnie z opisem podanym w przykładzie próby biologicznej 1, a stabilność uwalnianego γ-interferonu badano w sposób opisany w przykładzie próby biologicznej 2.

Uwalniany γ-interferon analizowano jakościowo i ilościowo metodą RP-HPLC. Wyniki analiz wykazały, że ponad 85% γ-interferonu uwalniało się w ciągu 72 godzin i że nie następowała jego denaturacja.

P r z y k ł a d X

Do 10 mM PBS zawierającego 20 jednostek międzynarodowych/ml insuliny dodano Tween 80 do stężenia 0,01% wagowych. Do tej mieszaniny dodano hialuronian sodu o masie cząsteczkowej 1000000 do stężenia 2 mg/ml.

Otrzymany roztwór podawano do suszarni rozpyłowej typu Buchi 190 z szybkością 3 ml/minutę, wytwarzając mikrocząstki. Temperaturę powietrza wpływającego do suszarni utrzymywano na poziomie 85°C. Uzyskane mikrocząstki miały średnią średnicę 3,0 pm.

(Etap 2). Próba uwalniania in vitro

Próbę uwalniania in vitro, z użyciem mikrocząstek wytworzonych w etapie 1, prowadzono zgodnie z opisem podanym w przykładzie próby biologicznej 1, a stabilność uwalnianej insuliny badano w sposób opisany w przykładzie próby biologicznej 2.

Uwalnianą insulinę analizowano jakościowo i ilościowo metodą RP-HPLC. Wyniki analiz wykazały, że ponad 95% insuliny uwalniało się w ciągu 72 godzin i że nie następowała denaturacja insuliny.

P r z y k ł a d XI

Do 5 mM PBS zawierającego 2 mg/ml insulinopodobnego czynnika wzrostu, dodano Tween 80 do stężenia 0,01% wagowych. Do tej mieszaniny dodano hialuronian sodu o masie cząsteczkowej 1000000 do stężenia 2 mg/ml.

(Etap 2). Próba uwalniania in vitro

Próbę uwalniania in vitro, zużyciem mikrocząstek wytworzonych w etapie 1, prowadzono zgodnie z opisem podanym w przykładzie próby biologicznej 1, a stabilność uwalnianego insulinopodobnego czynnika wzrostu badano w sposób opisany w przykładzie próby biologicznej 2.

Uwalniany insulinopodobny czynnik wzrostu analizowano jakościowo i ilościowo metodą RP-HPLC.

Wyniki analiz wykazały, że ponad 90% insulinopodobnego czynnika wzrostu uwalniało się w ciągu 72 godzin i że nie następowała jego denaturacja.

PL 195 223 B1

Przykład porównawczy 1

Wytwarzanie preparatu żelowego i próba uwalniania in vitro (Etap 1). Wytwarzanie preparatu żelowego

Do 5 mM PBS zawierającego 2,3 mg/ml hGH dodano hialuronian sodu o masie cząsteczkowej 2000000 do stężenia 20 mg/ml, uzyskując żelowy preparat hGH zawierający 2% hialuronianu.

(Etap 2). Próba uwalniania in vitro

Preparat żelowy wytworzony w etapie 1 badano według procedury opisanej w przykładzie próby biologicznej 1. Próba wykazała, że w ciągu jednej godziny uwolniło się 100% hGH. Wynik tej próby wykazuje, że preparat żelowy uwalnia lek w krótszym okresie czasu niż mikrocząstki według wynalazku, gdyż żel jest łatwo rozcieńczany przez wodę.

Przykład porównawczy 2

Wytwarzanie preparatu żelowego i próba uwalniania in vivo (Etap 1). Wytwarzanie preparatu żelowego

Do 5 mM PBS zawierającego 1,5 mg/ml hGH dodano hialuronian sodu o masie cząsteczkowej 2000000 do stężenia 20 mg/ml, uzyskując nie ciekłą postać żelowego preparatu hGH.

Ilość 1 ml tego preparatu żelowego zdyspergowano w 2 ml oleju bawełnianego i mieszaninę homogenizowano do utworzenia emulsji.

(Etap 2). Próba uwalniania in vitro

Dwadzieścia cztery siedmiotygodniowe szczury-karły o średniej masie ciała 95 g podzielono na cztery grupy, po 6 szczurów. Szczurom z pierwszej grupy podano podskórną iniekcję 0,3 ml emulsji sporządzonej w etapie 1 (odpowiadającą ilości 150 pg hGH) (grupa 1).

Dla porównania skuteczności tego preparatu emulsyjnego z innymi preparatami, szczurom z dwu pozostałych grup podano albo dyspersję zawierającą mikrocząstki o spowolnionym uwalnianiu wytworzoną w przykładzie II, zdyspergowaną w oleju bawełnianym w takim stężeniu, aby podana ilość hGH wyniosła 150 pg (grupa 2), albo preparat Eutropin®w ilości odpowiadającej 150 pg hGH (grupa 3). Szczurom z ostatniej grupy nie podano żadnego preparatu hGH (grupa kontrolna). Zmiany w przyroście wagi szczurów obserwowano przez 6 dni po podaniu preparatów.

Na figurze 7 przedstawione są zależne od czasu zmiany w obrazach przyrostu masy ciała szczurów-karłów traktowanych preparatem ludzkiego hormonu wzrostu o spowolnionym uwalnianiu w porównaniu ze zmianami po podaniu preparatów znanych. Okazało się, że zależne od czasu zmiany w obrazach przyrostu masy ciała szczurów-karłów traktowanych żelowym preparatem hialuronianu były podobne do tych, jakie uzyskano w grupie szczurów traktowanych preparatem Eutropin . Tak więc, masa ciała szczurów-karłów, którym podano żelowy preparat hialuronianu spadła po 2 albo 3 dniach od podania i w następnych dniach była podobna, jak u szczurów z grupy kontrolnej. U szczurów z grupy, której podano preparat według wynalazku obserwowano jednakże w okresie 6 dni stały przyrost masy ciała, przewyższający o 150% przyrosty masy ciała w innych grupach szczurów.

Przykład porównawczy 3

Wytwarzanie preparatu mikrocząstek z użyciem karboksymetylocelulozy sodowej i próby uwalniania in vivo i in vitro (Etap 1). Wytwarzanie preparatu mikrocząstek

Do 5 mM PBS zawierającego 0,2 mg/ml hGH dodano Tween 80 do stężenia 0,01% wagowych. Do tej mieszaniny dodano karboksymetylocelulozę sodową (Na-CMC) o średniej lepkości do stężenia 1,8 mg/ml. Otrzymany roztwór podawano do suszarni rozpyłowej typu Buchi 190 z szybkością 3 ml/minutę, wytwarzając mikrocząstki. Temperaturę powietrza wpływającego do suszarni utrzymywano na poziomie 85°C. Uzyskane mikrocząstki miały średnią średnicę 3,0 pm.

(Etap 2). Próba uwalniania in vitro

Preparat mikrocząstek wytworzony w etapie 1 badano w sposób opisany w przykładzie próby biologicznej 1. Wyniki próby są podane w tabeli 1.

T a b e l a 1

Czas (godziny)	0	1	3	5	7	24	48	72	144
Uwolniona ilość hGH (%)	0	32	40	48	52	57	63	65	65

PL 195 223 B1

Jak wskazują dane w tabeli 1, zależne od czasu zmiany w obrazie uwalniania in vitro z preparatu mikrocząstek wytworzonego w etapie 1 różnią się od zmian oznaczonych dla preparatu mikrocząstek według wynalazku. Mianowicie, wykazują one nieprawidłowo zrównoważony obraz uwalniania, w którym ponad 30% hGH ulegało uwolnieniu podczas pierwszej godziny, następne 30% leku uwalniało się do 48 godzin, a po tym czasie prawie wcale nie zachodziło uwalnianie hGH. Uzyskane wyniki świadczą o tym, że występuje nieprawidłowość w równowadze obrazu uwalniania leku w wyniku interakcji między lekiem białkowym a matrycą i że prawdopodobieństwo denaturacji leku jest bardzo wysokie wówczas, gdy jako materiał matrycy zostanie użyty naturalny polimer węglowodanowy o hydrofobowości wyższej niż kwasu hialuronowego.

(Etap 3). Próba uwalniania in vivo

Preparat mikrocząstek wytworzony w etapie 1 zdyspergowano w oleju bawełnianym. Otrzymaną dyspersję podano siedmiotygodniowym szczurom-karłom w ilości 300 pg hGH na szczura. Kontrolnej grupie szczurów nie podano żadnego preparatu. Przyrosty wagi szczurów oznaczano przez okres 7 dni. Wyniki są podane w tabeli 2. Są one wyrażone jako łączny przyrost wagi.

T a b e l a 2

Czas (dni)	Dzień 1	Dzień 2	Dzień 3	Dzień 4	Dzień 5	Dzień 6	Dzień 7
Grupa kontrolna	0,6	0,8	3,3	5,5	7,6	6,7	7,4
Grupa, która otrzymała preparat Na-CMC	5,2	3,3	6,4	8,3	10,5	9,4	9,0

Jak to przedstawia tabela 2, u szczurów, którym podano mikrocząstki wytworzone w etapie 1 obserwowano obrazy przyrostu wagi podobne do tych, jakie występowały u szczurów, którym podano żelowy preparat hialuronianu z przykładu porównawczego 2. U tych szczurów przyrost wagi występował tylko w dniu 1, natomiast w dniu 2 masa ciała ulegała obniżeniu.

W następnych dniach szybkość przyrostu masy ciała była niższa niż u szczurów z grupy kontrolnej i w końcu, w dniu 7, przyrost wagi u szczurów badanych był podobny do tego, jaki obserwowano w grupie kontrolnej.

Powyższe wyniki świadczą o tym, że preparat oparty na Na-CMC, wykazuje gorsze właściwości uwalniania i miano niż mikrocząstki hialuronianu według wynalazku, jakkolwiek Na-CMC jest naturalnym polimerem węglowodanowym, tak jak kwas hialuronowy.

Przykład porównawczy 4

Wytwarzanie preparatu mikrocząstek z użyciem estru benzylowego kwasu hialuronowego i próba uwalniania in vivo i in vitro (Etap 1). Wytwarzanie preparatu mikrocząstek

Naturalny kwas hialuronowy poddano reakcji chemicznej z alkoholem benzylowym. Otrzymano ester benzylowy kwasu hialuronowego, z którego następnie, w sposób opisany poniżej, wytworzono mikrocząstki zawierające hGH.

Do 5 mM PBS zawierającego 2 mg/ml hGH dodano Tween 80 do stężenia 0,01% wagowych. Otrzymany roztwór podawano do suszarni rozpyłowej typu Buchi 190 z szybkością 3 ml/minutę, wytwarzając mikrocząstki. Temperaturę powietrza wpływającego do suszarni utrzymywano na poziomie 85°C. Uzyskane mikrocząstki miały średnią średnicę 2,5 pm.

Otrzymane mikrocząstki zdyspergowano w dimetylosulfotlenku (DMSO) zawierającym 6% estru benzylowego kwasu hialuronowego i uzyskaną zawiesinę dodano do oleju mineralnego zawierającego środek powierzchniowo czynny, Aracel ATM (firmy ICI, Stany Zjednoczone).

Mieszaninę homogenizowano do czasu powstania mikroemulsji. Wytworzona emulsja składała się z ciągłej fazy oleju mineralnego i z dyspersyjnej fazy roztworu estru benzylowego kwasu hialuronowego w DMSO zawierającej zdyspergowany w niej hGH.

Do tak wytworzonej mikroemulsji dodano podczas mieszania octan etylowy i następnie prowadzono ekstrakcję DMSO octanem etylowym. Ester benzylowy kwasu hialuronowego zaczynał twardnieć i powstawały cząstki estru benzylowego kwasu hialuronowego zawierające cząstki hGH. Średnia średnica końcowych, otrzymanych w ten sposób cząstek wynosiła 5,5 pm, a zawartość w nich hGH wynosiła 45%.

PL 195 223 B1 (Etap 2). Próba uwalniania in vivo

Mikrocząstki wytworzone w etapie 1 badano według procedury opisanej w przykładzie próby biologicznej 1, a wyniki zestawiono w tabeli 3.

T a b e l a 3

Czas (godziny)	0	1	3	5	7	24	48	72	144
Uwolniona ilość hGH (%)	0	15	21	23	25	27	28	30	30

Jak podano w tabeli 3, z mikrocząstek, w których naturalnej cząsteczce kwasowi hialuronowego nadano hydrofobowość przez użycie estru benzylowego tego kwasu, prawie nie zachodziło uwalnianie hGH podczas pierwszych 5 godzin. Przyczyną braku uwalniania hGH jest zbyt silna interakcja między lekiem białkowym (hGH) a matrycą estru benzylowego kwasu hialuronowego.

(Etap 3). Próba uwalniania in vivo

Mikrocząstki wytworzone w etapie 1 zdyspergowano w oleju bawełnianym. Otrzymaną zawiesinę podano siedmiotygodniowym szczurom-karłom w ilości 300 pg hGH na szczura. Grupa, której nie podano preparatu służyła jako grupa kontrolna. Przyrosty wagi szczurów mierzono przez 7 dni. Wyniki pomiarów podano w tabeli 4 w postaci przyrostu skumulowanego.

T a b e l a 4

Czas (dni)	Dzień 1	Dzień 2	Dzień 3	Dzień 4	Dzień 5	Dzień 6	Dzień 7
A	1,2	2,3	3,6	5,7	6,6	7,3	8,2
B	3,6	2,7	5,4	6,3	7,1	8,4	8,0

A: Grupa kontrolna

B: Grupa, której podano preparat mikrocząstek estru benzylowego kwasu hialuronowego

Jak podano w tabeli 4, preparat mikrocząstek oparty na estrze benzylowym kwasu hialuronowego prawie nie wykazuje skuteczności po dniu 1.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Mikrocząsteczka leku o spowolnionym uwalnianiu, znamienna tym, że zawiera kwas hialuronowy lub jego sole nieorganiczne oraz lek białkowy lub peptydowy, środek stabilizujący wybrany z grupy obejmującej polisacharyd, białko, aminokwas, sól nieorganiczną, środek powierzchniowo czynny i ich mieszaninę, przy czym wytwarzana jest przez rozpuszczenie kwasu hialuronowego lub jego nieorganicznej soli, leku białkowego lub peptydowego i środka stabilizującego w wodzie lub wodnym roztworze buforu i suszenie rozpyłowe roztworu i ma średni rozmiar od 0,1 do 40 pm.
2. Mikrocząsteczka według zastrz. 1, znamienna tym, że ma średnią wielkość w zakresie od 1 do 10 pm.
3. Mikrocząsteczka według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera lek wybrany z grupy obejmującej ludzki hormon wzrostu, somatotropinę bydlęcą, somatotropinę świńską, hormon uwalniający hormon wzrostu, peptyd uwalniający hormon wzrostu, czynnik stymulujący kolonie granulocytów, czynnik stymulujący kolonie granulocytów/makro>fagów, czynnik stymulujący kolonie makrofagów, erytropoetynę, morfogenetyczne białko kości, interferon, insulinę, atriopeptynę III, przeciwciało monoklonalne, czynnik martwicy nowotworu (TNF), czynnik aktywujący makrofagi, interleukinę, czynnik denaturujący guza, insulinopodobny czynnik wzrostu, naskórkowy czynnik wzrostu, aktywator plazminogenu tkankowego i urokinazę oraz mieszaninę tych leków.
4. Mikrocząsteczka według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera sól nieorganiczną kwasu hialuronowego wybraną spośród soli sodowej, potasowej, litowej, wapniowej, amonowej, magnezowej, cynkowej, miedziowej i kobaltowej.
5. Preparat iniekcyjny, znamienny tym, że zawiera mikrocząsteczkę o spowolnionym uwalnianiu, jak określono w zastrz. 1 zdyspergowaną w medium iniekcyjnym.
6. Preparat iniekcyjny według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera ponadto środek dyspergujący albo środek konserwujący.

PL 195 223 B1
7. Preparat iniekcyjny według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera medium iniekcyjne wybrane z grupy obejmującej buforowany roztwór wodny, etanol, glikol propylenowy, glikol polietylenowy, olej roślinny, olej mineralny, skwalen, tran z wątroby dorsza, mono-, di- i trójgliceryd albo ich mieszaninę.
8. Preparat iniekcyjny według zastrz. 7, znamienny tym, że zawiera olej roślinny wybrany spośród oleju kukurydzianego, oleju z oliwek, oleju sojowego, oleju słonecznikowego, oleju bawełnianego, oleju arachidowego, oleju sezamowego, oleju kokosowego, oleju rącznikowego i ich mieszanin.
9. Preparat aerozolowy, znamienny tym, że zawiera mikrocząsteczkę o spowolnionym uwalnianiu, jak określono w zastrz. 1.