JPH11501812A - 減少した吸着性と増加した加水分解性を有するズブチリシンCarlsberg変種 - Google Patents
減少した吸着性と増加した加水分解性を有するズブチリシンCarlsberg変種Info
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- JPH11501812A JPH11501812A JP8527598A JP52759896A JPH11501812A JP H11501812 A JPH11501812 A JP H11501812A JP 8527598 A JP8527598 A JP 8527598A JP 52759896 A JP52759896 A JP 52759896A JP H11501812 A JPH11501812 A JP H11501812A
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、野生型ズブチリシンCarlsberg アミノ酸配列の修飾されたアミノ酸配列を有するズブチリシンCarlsberg 変種に関する(野生型アミノ酸配列は第一ループ領域、第二ループ領域、第三ループ領域、第四ループ領域、第五ループ領域及び第六ループ領域を含んでいる);修飾されたアミノ酸配列は1以上のループ領域で具体的な特定の位置に野生型ズブチリシンCarlsberg に存在する場合とは異なるアミノ酸(即ち、置換)を含み、それによりズブチリシンCarlsberg 変種は野生型ズブチリシンCarlsberg と比較して不溶性基質に対する減少した吸着性と増加した加水分解性を有している。本発明はこのようなズブチリシンCarlsberg 変種についてコードする遺伝子にも関する。本発明は様々な表面をクリーニングする上でこのようなズブチリシンCarlsberg 変種を含んでなる組成物にも関する。
Description
【発明の詳細な説明】
減少した吸着性と増加した加水分解性を有するズブチリシンCarlsberg 変種
技術分野
本発明は、様々なクリーニング組成物で有用な新規酵素変種と、このような酵
素変種をコードする遺伝子に関する。
背景
酵素は最大類の天然タンパク質を構成している。各類の酵素は通常異なる種類
の化学反応を触媒する(消費されずに反応を促進する)。プロテアーゼとして知
られる酵素の1種は、他のタンパク質を加水分解する(開裂される化学結合のい
ずれかの側における水分子のH及びOH部分の取込みで、化合物を2以上のより
簡単な化合物に分解する)それらの能力について知られている。タンパク質を加
水分解するこの能力は、洗濯洗剤製品に添加物として天然及びタンパク質工学処
理プロテアーゼを配合することにより利用されてきた。衣類上の多くの汚れはタ
ンパク質性であり、広域特異性プロテアーゼはこのような汚れの除去性を実質上
改善することができる。
残念ながら、天然細菌環境下におけるこれらタンパク質の効力レベルは相対的
に非天然の洗浄環境中にしばしば移行していない。特に、熱安定性、pH安定性
、酸化安定性及び基質特異性のようなプロテアーゼ特徴は、酵素の天然環境外で
の利用上必ずしも最良になっていない。
プロテアーゼのアミノ酸配列がプロテアーゼの特徴を決定する。プロテアーゼ
のアミノ酸配列の変化は、酵素の性質を様々な程度に変えるかもしれないし、あ
るいはアミノ酸配列における変化の位置、性質及び/又は大きさに応じて酵素を
不活化させることさえある。洗浄環境下でプロテアーゼの効力を増加させること
を目標として、それらの性質を改善する試みに際し、プロテアーゼの野生型アミ
ノ酸配列を変えるいくつかのアプローチが行われてきた。これらのアプローチに
は、全く多様な条件下で熱安定性を高めて酸化安定性を改善するために、アミノ
酸配列を変えることを含む。
当業界で記載された様々なアプローチにもかかわらず、様々な表面をクリーニ
ングする上で有用なプロテアーゼの有効な新規変種について必要性が継続してい
る。
本発明の目的
本発明の目的は、野生型の酵素と比較して改善された加水分解性を有するズブ
チリシンCarlsberg 酵素変種を提供することである。
これらのズブチリシン酵素変種を含んでなるクリーニング組成物を提供するこ
とも本発明の目的である。
要旨
本発明は、野生型ズブチリシンCarlsberg アミノ酸配列の修飾されたアミノ酸
配列を有するズブチリシンCarlsberg 変種に関し、野生型アミノ酸配列は第一ル
ープ領域、第二ループ領域、第三ループ領域、第四ループ領域及び第五ループ領
域を含んでいて、修飾されたアミノ酸配列は1以上のループ領域において具体的
な特定の位置で野生型ズブチリシンCarlsberg に存在する場合とは異なるアミノ
酸(即ち、置換)を含み、それによりズブチリシンCarlsberg 変種は野生型ズブ
チリシンCarlsberg と比較して不溶性基質に対する減少した吸着性と増加した加
水分解性を有している。本発明はこのようなズブチリシンCarlsberg 変種につい
てコードする遺伝子にも関する。本発明は様々な表面をクリーニングする上でこ
のようなズブチリシンCarlsberg 変種を含んでなる組成物にも関する。
説明
I.ズブチリシン変種
本発明は、酵素についてコードする様々なヌクレオチド配列を変異させて酵素
のアミノ酸配列を変えることにより修飾されたズブチリシン酵素、特にズブチリ
シンCarlsberg に関する。本発明の修飾ズブチリシン酵素(以下、“ズブチリシ
ンCarlsberg 変種”)は、野生型ズブチリシンと比較して、不溶性基質に対して
減少した吸着性と増加した加水分解性を有している。本発明はこのようなズブチ
リシンCarlsberg 変種についてコードする変異遺伝子にも関する。
本発明のズブチリシン酵素は、プロテアーゼとして知られる酵素の1種に属す
る。プロテアーゼはペプチド結合の開裂用の触媒である。1タイプのプロテアー
ゼはセリンプロテアーゼである。セリンプロテアーゼは、活性部位に必須セリン
残基があるという事実により区別される。
可溶性基質の酵素加水分解速度が酵素濃度に応じて増加するという観察は、詳
しく文献に記載されている。したがって、多くのクリーニング適用例で遭遇する
ような表面結合基質にとり、加水分解の速度は表面濃度の増加に従い増加するこ
とはもっともであろう。これは事例として示された(Brode,P.F.III 及びD.S.Ra
uch,LANGMUIR,"Subtilisin BPN':Activity on an Immobilized Substrate",Vol
.8,pp.1325-1329(1992))。実際に、表面濃度に対する速度の直線的依存性は、
酵素の表面濃度が変えられたときに不溶性基質でみられた(Rubingh,D.N.及び M
.D.Bauer,"Catalysis of Hydrolysis by Proteases at the Protein-Solution I
nterface",in POLYMER SOLUTIONS,BLENDS AND INTERFACES,Ed.by I.Noda及びD.N
.Rubingh,Elsevier,p.464(1992))。意外にも、より良いクリーニング性能を与
える変種プロテアーゼに関するサーチでこの原理を適用しようとしたとき、我々
は多く吸着する酵素ほど良い性能を与えるということを見い出せなかった。実際
上、我々は意外にも、基質への酵素による吸着性が減少すると基質の
加水分解性が増加する(即ち、クリーニング性能が良くなる)という、反対の事
例があることをみつけた。
理論に拘束されないが、ある変種を他と比較してみて改善された性能は、少な
く吸着する酵素ほど強く結合されず、したがって不溶性タンパク質基質が除去さ
れるべき表面上においてより高度に移動性であるという事実の結果であると考え
られる。匹敵する酵素溶液濃度のとき、この増加した移動性はより高濃度の酵素
を表面にデリバリーすることで付与されるいかなる利点よりも十分にまさってい
る。
本明細書で記載された変異は、表面結合汚れへの酵素の吸着性を変える(即ち
、減少させる)ように考えられている。ズブチリシンCarlsberg において、ある
アミノ酸は酵素分子上で外部ループを形成している。説明の目的から、これらの
ループは第一、第二、第三、第四及び第五ループ領域と称される。特に、58〜
65位は第一ループ領域を形成し、94〜106位は第二ループ領域を形成し、
125〜132位は第三ループ領域を形成し、153〜166位は第四ループ領
域を形成し、186〜190位は第五ループ領域を形成し、199〜219位は
第六ループ領域を形成している(野生型ズブチリシンCarlsberg (SEQ ID
NO:1)でのアミノ酸配列の位置と同様の位置ナンバリング)。
これらのループ領域は表面結合ペプチドへの酵素分子の吸着にとり重要な役割
を果たして、これらループ領域の1以上における特異的変異はこの吸着にとり重
要な効果を有していると考えられる。理論に拘束されないが、ループ領域は少く
とも2つの理由からズブチリシンCarlsberg 分子の吸着にとり重要であると考え
られる。第一に、ループ領域を含めたアミノ酸は分子が暴露されるいかなる表面
とも密に接触することができる。第二に、ズブチリシンCarlsberg 分子の活性部
位及び結合ポケットに対してループ領域の近位部分は、表面結合基質(ペプチド
/タンパク質汚れ)への酵素の触媒生産的吸着に際して役割を有する。
本明細書で用いられる“変種”とは、野生型の場合とは異なるアミノ酸配列を
有した酵素を意味する。
本明細書で用いられる“変異ズブチリシンCarlsberg 遺伝子”とは、ズブチリ
シンCarlsberg 変種についてコードする遺伝子を意味する。
本明細書で用いられる“野生型ズブチリシンCarlsberg ”とは、SEQ ID
NO:1で表されるズブチリシン酵素に関する。ズブチリシンCarlsberg のア
ミノ酸配列は、参考のため本明細書に組み込まれる、Smith,E.L.,Delange,R.J.E
vans,W.H.,Landon,M.及びMarkland,F.S.,J.BIOL.CHEM.,Vol.243,pp.2184-2191(
1968)で更に記載されている。
本明細書で用いられる“ズブチリシンCarlsberg 野生型アミノ酸配列”という
用語は、SEQ ID NO:1と、58〜65位、94〜106位、125〜
132位、153〜166位、186〜190位及び199〜219位以外のア
ミノ酸配列に修飾を有するSEQ ID NO:1とを包含している。
本明細書で用いられる“より親水性のアミノ酸”とは、下記親水性表で参照の
対象アミノ酸よりも大きな親水性を有したあらゆる他のアミノ酸に関する。下記
親水性表(表1)は親水性の増加に従って下降するようにアミノ酸を掲載してい
る(Hopp,T.P.及びWoods,K.R.,"Prediction of Protein Antigenic Determinan
ts from Amino Acid Sequences",PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCI
ENCE USA,Vol.78,pp.3824-3828,1981 参照;参考のため本明細書に組み込まれる
)。
表1はアミノ酸がどんな電荷を有するかについても示している(この特徴は約
8〜9のpHに基づいている)。正荷電アミノ酸はArg及びLysであり、負
荷電アミノ酸はGlu及びAspであり、残りのアミノ酸は中性である。本発明
の好ましい態様において、置換アミノ酸は中性又は負荷電であり、更に好ましく
は負荷電(即ち、Glu又はAsp)である。
したがって、例えば、“中性であるか又は負電荷を有する同等又はより親水性
のアミノ酸でGlnを置換する”という表現は、GlnがAsn(Glnと同等
の親水性である)あるいはSer、Glu又はAsp(Glnより親水性である
)で置換されることを意味する;それら各々は中性であるか又は負電荷を有して
、Glnと比較して大きな親水価を有している。同様に、“中性であるか又は負
電
荷を有するより親水性のアミノ酸でProを置換する”という表現は、Proが
Gln、Asn、Ser、Glu又はAspで置換されることを意味する。
本発明の1つの態様において、ズブチリシンCarlsberg 変種はズブチリシンCa
rlsberg 野生型アミノ酸配列の修飾されたアミノ酸配列を有しており、野生型ア
ミノ酸配列は第一ループ領域、第二ループ領域、第三ループ領域、第四ループ領
域、第五ループ領域又は第六ループ領域の1以上に1以上の位置で置換を含んで
いて、それによりズブチリシンCarlsberg 変種は野生型ズブチリシンCarlsberg
と比較して不溶性基質に対する減少した吸着性と増加した加水分解性を有してい
る。
本発明の好ましい態様において、1以上のループ領域で1以上の位置における
置換アミノ酸は、表1を参考にすると、中性又は負荷電であり、野生型アミノ酸
配列の対象位置にあるアミノ酸と等しいか又はそれより親水性、好ましくはより
親水性である。
A.第一ループ領域の置換
置換が第一ループ領域で生じるとき、置換は58、59、60、61、62、
64又は65位のうち1以上で生じる。
置換が58位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Glu
、Gly、Pro又はSerである。
置換が59位で生じるとき、置換アミノ酸はGluである。
置換が60位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Glu
、Pro又はSerである。
置換が61位で生じるとき、置換アミノ酸はAsp、Gln、Glu又はSe
rである。
置換が62位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Glu
、Pro又はSerである。
置換が64位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Glu
、Pro又はSerである。
置換が65位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Glu
、Gly、Pro又はSerである。
B.第二ループ領域の置換
置換が第二ループ領域で生じるとき、置換は94、95、96、97、98、
99、100、101、102、103、104、105又は106位のうち1
以上で生じる。
置換が94位で生じるとき、置換アミノ酸はAla、Asn、Asp、Cys
、Gln、Glu、Gly、His、Met、Pro、Ser又はThrである
。
置換が95位で生じるとき、置換アミノ酸はAla、Asn、Asp、Cys
、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Met、Pro、Ser、Thr
又はValである。
置換が96位で生じるとき、置換アミノ酸はAsp、Gln、Glu、Ser
である。
置換が97位で生じるとき、置換アミノ酸はAsp又はGluである。
置換が98位で生じるとき、置換アミノ酸はAsp又はGluである。
置換が99位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Glu
、Pro又はSerである。
置換が100位で生じるとき、置換アミノ酸はAsp又はGluである。
置換が101位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Pro又はSerである。
置換が102位で生じるとき、置換アミノ酸はAsp又はGluである。
置換が103で生じるとき、置換アミノ酸はAla、Asn、Asp、Cys
、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser
、
Thr又はValである。
置換が104位で生じるとき、置換アミノ酸はAsp又はGluである。
置換が105位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Pro又はSerである。
置換が106位で生じるとき、置換アミノ酸はAla、Asn、Asp、Cy
s、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Met、Pro、Ser、Th
r又はValである。
C.第三ループ領域の置換
置換が第三ループ領域で生じるとき、置換は125、126、127、128
、129、130、131又は132位のうち1以上で生じる。
置換が125位で生じるとき、置換アミノ酸はAla、Asn、Asp、Cy
s、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Met、Pro、Ser、Th
r又はValである。
置換が126位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Pro又はSerである。
置換が127位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Pro又はSerである。
置換が128位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Gly、His、Pro、Ser又はThrである。
置換が129位で生じるとき、置換アミノ酸はAsp又はGluである。
置換が130位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Pro又はSerである。
置換が131位で生じるとき、置換アミノ酸はAsp又はGluである。
置換が132位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Gly、Pro又はSerである。
D.第四ループ領域の置換
置換が第四ループ領域で生じるとき、置換は153、154、155、156
、157、158、159、160、161、162、163、164、165
又は166位のうち1以上で生じる。
置換が153位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Pro又はSerである。
置換が154位で生じるとき、置換アミノ酸はAsp、Gln、Glu又はS
erである。
置換が155位で生じるとき、置換アミノ酸はAsp又はGluである。
置換が156位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Pro又はSerである。
置換が157位で生じるとき、置換アミノ酸はAsp、Gln、Glu、Se
rである。
置換が158位で生じるとき、置換アミノ酸はAsp又はGluである。
置換が159位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Pro又はSerである。
置換が160位で生じるとき、置換アミノ酸はAsp又はGluである。
置換が161位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Gly、Pro又はSerである。
置換が162位で生じるとき、置換アミノ酸はAsp、Gln、Glu又はS
erである。
置換が163位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Gly、Pro又はSerである。
置換が164位で生じるとき、置換アミノ酸はAla、Asn、Asp、Cy
s、Gln、Glu、Gly、His、Met、Pro、Ser、Thr又
はValである。
置換が165位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Pro又はSerである。及び
置換が166位で生じるとき、置換アミノ酸はAla、Asn、Asp、Cy
s、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Se
r、Thr又はValである。
E.第五ループ領域の置換
置換が第五ループ領域で生じるとき、置換は186、187、188、189
又は190位のうち1以上で生じる。
置換が186位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Gly、His、Pro、Ser及びThrである。
置換が187位で生じるとき、置換アミノ酸はAsp又はGluである。
置換が188位で生じるとき、置換アミノ酸はAla、Asn、Asp、Cy
s、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Se
r、Thr、Tyr又はValである。
置換が189位で生じるとき、置換アミノ酸はAsp又はGluである。
置換が190位で生じるとき、置換アミノ酸はAsp又はGluである。
F.第六ループ領域の置換
置換が第六ループ領域で生じるとき、置換は199、200、201、202
、203、204、205、206、207、208、209、210、211
、212、213、214、215、216、217、218又は219位のう
ち1以上で生じる。
置換が199位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Gly、His、Pro、Ser及びThrである。
置換が200位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、
Glu、Gly又はSerである。
置換が201位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Pro又はSerである。
置換が202位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Gly、His、Pro、Ser又はThrである。
置換が203位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Pro又はSerである。
置換が204位で生じるとき、置換アミノ酸はAla、Asn、Asp、Cy
s、Gln、Glu、Gly、His、Met、Pro、Ser又はThrであ
る。
置換が205位で生じるとき、置換アミノ酸はAla、Asn、Asp、Cy
s、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Se
r、Thr又はValである。
置換が206位で生じるとき、置換アミノ酸はAsp又はGluである。
置換が207位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Gly、Pro又はSerである。
置換が208位で生じるとき、置換アミノ酸はAla、Asn、Asp、Cy
s、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Se
r、Thr又はValである。
置換が209位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Gly又はSerである。
置換が210位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Gly、Pro又はSerである。
置換が211位で生じるとき、置換アミノ酸はAsp、Gln、Glu又はS
erである。
置換が212位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Gly、Pro又はSerである。
置換が213位で生じるとき、置換アミノ酸はAla、Asn、Asp、Cy
s、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Se
r、Thr又はValである。
置換が214位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Gly、His、Pro、Ser又はThrである。
置換が215位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Gly、Pro又はSerである。
置換が216位で生じるとき、置換アミノ酸はAla、Asn、Asp、Cy
s、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Met、Pro、Ser、Th
r又はValである。
置換が217位で生じるとき、置換アミノ酸はAsp、Gln、Glu又はS
erである。
置換が218位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Cl
u、Pro又はSerである。
置換が219位で生じるとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln、Gl
u、Gly、Pro又はSerである。
G.酵素変種の製造
例1
変異ズブチリシンCarlsberg 遺伝子
野生型ズブチリシンCarlsberg 遺伝子を含んだファージミド(“CP”)を作
る。プラスミドpUC119(Vieira,J.及びMessing,J.,"Production of Sing
le-Stranded Plasmid DNA",153,METHODS IN ENZYMOLOGY,3-11(1989))の2.8
Kbp PvuII制限酵素断片をプラスミドpUB110(Bacillus
Genetic Stock Center,Columbus,OH 1E9)のPvuII部位中にクローニングする
。pUC119‐pUB110ハイブリッドプラスミドはpJMA601と称す
る。pJMA601のBamHI制限部位中にポリメラーゼ連鎖反応‐増幅ズブ
チリシンCarlsberg 遺伝子をクローニングして、CPを得る。ファージミドCP
をEscherichia coli ung−株CJ236中に組み込んで形質転換させ、一本
鎖ウラシル保有DNA鋳型をVCSM13ヘルパーファージを用いて作製する(
Kunkel,T.A.,J.D.Roberts 及びR.A.Zakour,"Rapid and efficient site-specifi
c mutagenesis without phenotypic selection",METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.15
4,pp.367-382(1987);Yuckenberg,P.D.,F.Witney,J.Geisselsoder 及びJ.McClar
y,"Site-directed in vitro mutagenesis using uracil-containing DNA and ph
agemid vectors",DIRECTED MUTAGENESIS - A PRACTICAL APPROACH,ed.M.J.McPhe
rson,pp.27-48(1991)により修飾;双方とも参考のため本明細書に組み込まれる
)。Zoller及びSmith の単一プライマー部位特異的変異誘発修飾法(Zoller,M.J
.及びM.Smith,"Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived ve
ctors: an efficient and general procedure for the production of point mu
tations in any fragment of DNA",NUCLEIC ACIDS RESEARCH,Vol.10,pp.6487-65
00(1982);参考のため本明細書に組み込まれる)を用いて、すべての変異体を作
製する(基本的には、前掲のYuckenbergら,1991 で表されたとおり)。オリゴヌ
クレオチドはApplied Biosystem Inc.380B DNAシンセサイザーを用いて
作る。変異誘発反応産物をEscherichia coli株MM294(American Type Cult
ure Collection E.coli 33625)に組み込んで形質転換させる。すべての
変異体をDNA配列決定により確認し、単離されたDNAをBacillus subtilis
発現株BG2036(Yang,M.Y.,E.Ferrari 及びD.J.Hermer,(1984),"Cloning o
f the Neutral Protease Gene of Bacillus subtillis and the Use of the Clo
ned Gene to Create an In Vitro-derived
Deletion Mutation",JOURNAL OF BACTERIOLOGY,Vol.160,pp.15-21)に組み込ん
で形質転換させる。一部のループ変異体では、対応ループにフレームシフト停止
コドン変異がある修飾CPを用いて、ウラシル鋳型を作製する。オリゴヌクレオ
チドは、適正なリーディングフレームを復元して、58、59、60、61、6
2、64、65、94、95、96、97、98、99、100、101、10
2、103、104、105、106、125、126、127、128、12
9、130、131、132、153、154、155、156、157、15
8、159、160、161、162、163、164、165、166、18
6、187、188、189、190、199、200、201、202、20
3、204、205、206、207、208、209、210、211、21
2、213、214、215、216、217、218及び/又は219位のラ
ンダム置換についてコードするようにデザインされる(これらのコドンにおいて
3つすべての塩基に関する全部で4つのヌクレオチドの等モル及び/又は可変混
合物)。フレームシフト停止を訂正して機能性酵素を産生する変異は、カゼイン
を切断するそれらの能力により同定する。ランダム置換はDNA配列決定により
調べる。
例2
発酵
関心あるズブチリシン変異体を含んだBacillus subtilis 細胞(BG2036
)をLB‐グルコースブロスの1l培養物中で中間対数期まで増殖させ、全容量
10lのBiostat ED醗酵槽(B.Braun Biotech,Inc.,Allentown,Pennsylvania
)中に接種する。発酵培地は酵母エキス、デンプン、消泡剤、緩衝剤及び微量ミ
ネラルを含有している(FERMENTATION: A PRACTICAL APPROACH,Ed.B.McNeil及び
L.M.Harvey,1990 参照)。ブロスを発酵ラン中に7.0の一定pHに保つ。クロ
ラムフェニコールを変異誘発プラスミドの抗生物質選択用に加える。細胞を
A600約60まで37℃で一夜増殖させて、回収する。
例3
精製
発酵ブロスは純粋な酵素を得るために下記ステップで使う。ブロスから遠心に
よりBacillus subtilis 細胞を除き、100Kカットオフ膜で細かな粒子を除去
することにより清澄化する。この後10Kカットオフ膜で遠心し、フロー透析し
てイオン強度を減少させ、0.025M MES緩衝剤(2‐(N‐モルホリノ
)エタンスルホン酸)を用いてpHを5.5に調整する。酵素は、それを陽イオ
ン交換クロマトグラフィーカラム又はアフィニティ吸着クロマトグラフィーカラ
ムにいれて、それをNaCl又はプロピレングリコール勾配でカラムから溶出さ
せることにより更に精製する(Scopes,R.K.,PROTEIN PURIFICATION PRINCIPLES
AND PRACTICE,Springer-Verlag,New York(1984) 参照;参考のため本明細書に組
み込まれる)。
pNAアッセイ(DelMar,E.G.,C.Largman,J.W.Brodrick及びM.C.Geokas,ANAL.
BIOCHEM.,Vol.99,pp.316-320(1979);参考のため本明細書に組み込まれる)を用
いて、勾配溶出中に集められた画分について活性酵素濃度を調べる。このアッセ
イでは、酵素が可溶性合成基質サクシニル‐アラニン‐アラニン‐プロリン‐フ
ェニルアラニン−p‐ニトロアニリド(sAAPF‐pNA)を加水分解すると
p‐ニトロアニリンが放出されるときの速度を測定する。加水分解反応による黄
色の発生速度を分光光度計において410nmで測定するが、これは活性酵素濃
度と比例している。加えて、280nmの吸光度測定も全タンパク質濃度を調べ
るために行う。活性酵素/全タンパク質比は酵素純度を示し、ストック溶液とし
てプールされる画分を確認するために用いる。
貯蔵中に酵素の自己分解を避けるため、等重量のプロピレングリコールをクロ
マトグラフィーカラムから得られたプール画分に加える。精製操作の終了後、ス
トック酵素溶液の純度をSDS‐PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動)でチェックし、絶対酵素濃度をトリプシンインヒビター
タイプII‐T:Sigma Chemical Company(St.Louis,Missouri)から購入した七
面鳥卵白を用いて活性部位滴定法により調べる。測定された変換ファクターは、
酵素分子の様々な位置で起きたどの変化が可溶性基質pNAに対して野生型より
も増加した活性を有する酵素変種を生じているのかについて示す。
使用向け製造に際して、酵素ストック溶液は、プロピレングリコールを除去し
て緩衝剤を交換するために、Sephadex‐G25(Pharmacia,Piscataway,New Jer
sey)サイズ排除カラムで溶出させる。酵素ストック溶液中のMES緩衝剤は、
0.01M CaCl2を含有してHClで8.6にpH調整された0.1MTri
s 緩衝剤(トリス(ヒドロキシメチルアミノメタン))と交換する。すべての実
験は25℃に恒温された Tris 緩衝液中pH8.6で行う。
H.酵素変種の特徴付け
例4
モデル表面作製
CPG Inc.(Fairfield,New Jersey)から購入したアミノプロピル制御多孔
質ガラス(CPG)を、Bachem,Inc.(Torrence,California)から購入したs
AAPF‐pNA基質を共有結合させるための支持体として用いる。反応はジメ
チルスルホキシド中で行い、1‐エチル‐3‐〔3‐(ジメチルアミノ)プロピ
ル〕カルボジイミド塩酸塩(EDC)をカップリング剤として用いる。完了時(
pNAアッセイでモニターする)、過剰溶媒を除去し、CPG:sAAPF‐p
NAをジメチルスルホキシド(DMSO)及び二重蒸留水ですすぐ。この後、約
70℃でN2パージしながらオーブン乾燥させる。固定基質の反応スキーム及び
製造は、参考のため本明細書に組み込まれるBrode,P.F.III 及びD.S.Rauch,"Sub
tilisin BPN':Activity on an Immobilized Substrate",LANGMUIR,Vol.8,p.
1325-1329(1992)で記載されたように行う。
CPG表面は62,000±7000pNA分子/μm2を有する。表面積は
受け取ったCPGに関してCPG Inc.により報告された50.0m2/gの値
から変わっていない。これはsAAPF‐pNAをCPGに加えるために用いた
操作が多孔質構造にダメージを与えていないことを示唆している(平均径は48
6Åである)。
例5
表面加水分解アッセイ
CPG:sAAPF‐pNAを用いると、酵素変種の吸着とCPG結合ペプチ
ドの加水分解が単一実験で測定できる。少量の酵素変種ストック溶液を脱気され
た Tris 緩衝液及びCPG:sAAPF‐pNA含有のフラスコに加える。フラ
スコを90分間にわたりリスト式シェーカー上で振盪させ、その間にシェーカー
を様々な時間間隔で停止させる(例えば、吸着加水分解の初期段階では2分毎に
‐例えば最初の20分間‐実験の最後では10分毎に)。CPG:sAAPF‐
pNAを静置して、溶液をサンプリングする。実験操作と吸着及び加水分解の計
算はいずれも前掲のBrode ら,1992 で記載されたようにして行う。
すべての酵素は、自己分解に対する安定性についてモニターしたところ、この
実験の過程で明らかな自己分解喪失を示さない。したがって、酵素吸着は溶液か
らの減少分を測定することにより調べることができる。初期酵素変種濃度と個々
の各時点に測定された濃度との差異が、吸着された酵素変種の量を表す。表面か
ら加水分解されたpNAの量は、410nmでサンプルの一部について吸光度読
取りを行うことにより測定する。加水分解されたpNAの全量は、サンプリング
された量とフラスコに残存する量とを加えることにより計算する。この値は、酵
素が存在しないときにpH8.6で Tris 緩衝液により加水分解されたpNAの
量を差引くことにより補正する。この塩基加水分解は、酵素の効力に応じて、全
加水分解の7〜29%である。
例6
可溶性基質速度論的分析
可溶性基質sAAPF‐pNAの加水分解速度は、DU‐70分光光度計にお
いて410nmで時間の関数として吸光度増加を測定することによりモニターす
る。酵素濃度は一定に保ち、6〜10ナノモルの範囲内であるように調整するが
、基質濃度は各速度測定毎に90〜700μM sAAPF‐pNAと様々であ
る。吸光度データポイントは900秒間にわたり毎秒測り、データを LOTUSTMス
プレッドシート(Lotus Development Corporation,Cambridge,Massachusetts)
に移す。速度パラメーターの分析は標準Lineweaver Burk 分析により行い、その
場合にランの初期部分(通常、最初の1分間)のデータを直線的回帰曲線に合わ
せて、voを求める。vo及びsoデータを標準逆関数式にプロットして、KM及び
kcatを求める。
I.ズブチリシンCarlsberg 変種例
表面結合基質に対して減少した吸着性と増加した加水分解性を有する本発明の
ズブチリシンCarlsberg 変種は、下記表3〜36で例示されている。特定の変異
を表す上で、野生型に存在する本来のアミノ酸が最初に、位置番号が2番目に、
置換アミノ酸が3番目に示されている。
II.クリーニング組成物
本発明のもう1つの態様において、1種以上の酵素変種の有効量がタンパク質
汚れ除去の必要な様々な表面をクリーニングする上で有用な組成物中に含有され
る。このようなクリーニング組成物には、形態上制限されない、硬質表面をクリ
ーニングするための洗剤組成物(例えば、液体及び顆粒);形態上制限されない
、布帛をクリーニングするための洗剤組成物(例えば、顆粒、液体及び固形処方
物);皿洗い組成物(形態上制限されない);形態上制限されないオーラルクリ
ーニング組成物(例えば、歯磨剤、練歯磨剤及び洗口液処方物);形態上制限さ
れない義歯クリーニング組成物(例えば、液体、錠剤);形態上制限されないコ
ンタクトレンズクリーニング組成物(例えば、液体、錠剤)がある。
クリーニング組成物は、前記ズブチリシンCarlsberg 変種に加えて、プロテア
ーゼ酵素と適合する1種以上のクリーニング組成物物質も含む。本明細書で用い
られる“クリーニング組成物物質”という用語は、望まれるクリーニング組成物
の具体的タイプと製品の形態(例えば、液体、顆粒、固形、スプレー、スティッ
ク、ペースト、ゲル)からみて選択されるいずれかの液体、固体又は気体物質を
意味し、その物質は組成物で用いられるズブチリシンCarlsberg 変種とも適合し
うるものである。クリーニング組成物物質の具体的選択はクリーニングされる表
面物質、使用(例えば、洗剤使用)時のクリーニング条件からみて望まれる組成
物の形態を考慮することにより容易に行われる。本明細書で用いられる“適合性
”という用語は、プロテアーゼが通常の使用状況下で望まれるほど有効でなくな
るような程度までクリーニング組成物物質がズブチリシンCarlsberg 変種のタン
パク質分解活性を減少させないことを意味する。具体的なクリーニング組成物物
質は以下で詳細に例示されている。
本明細書で用いられる“酵素変種の有効量”とは、特定のクリーニング組成物
で必要な酵素活性を出すために要される酵素変種の量に関する。このような有効
量は当業者により容易に確認でき、用いられる具体的酵素変種、クリーニング適
用例、クリーニング組成物の具体的組成と、液体又は乾燥(例えば、顆粒、固形
)組成物が必要かどうかなどのような多くのファクターに基づいている。好まし
くは、クリーニング組成物は本発明の1種以上の酵素変種を約0.0001〜約
10%、更に好ましくは約0.001〜約1%、更に一層好ましくは約0.01
〜約0.1%含有する。酵素変種が用いられた様々なクリーニング組成物のいく
つかの例が、以下で更に詳細に記載されている。本明細書で用いられているすべ
ての部、パーセンテージ及び比率は、他で指摘されないかぎり重量による。
本発明で用いられる“非布帛クリーニング組成物”には、硬質表面クリーニン
グ組成物、皿洗い組成物、オーラルクリーニング組成物、義歯クリーニング組成
物及びコンタクトレンズクリーニング組成物がある。
A.硬質表面、皿及び布帛用のクリーニング組成物
本発明の酵素変種は、高い起泡性及び良好な不溶性基質除去性が望まれる様々
な洗剤組成物で用いることができる。このため、酵素変種は、完全に処方された
硬質表面クリーナー、皿洗い組成物、布帛洗濯組成物などを提供するために、様
々な慣用成分と共に用いることができる。このような組成物は液体、顆粒、固形
物などの形態をとることができる。このような組成物は30〜60重量%もの界
面活性剤を含有した最新の“濃縮”洗剤として処方してもよい。
本クリーニング組成物は、場合により、好ましくは、様々なアニオン系、ノニ
オン系、双極性などの界面活性剤を含有することができる。このような界面活性
剤は、典型的には組成物の約5〜約35%のレベルで存在する。
本発明で有用な界面活性剤の非制限例には、慣用的なC11‐C18アルキルベン
ゼンスルホネートと一級及びランダムアルキルサルフェート、
式CH3(CH2)x(CHOSO3 -M+)CH3及びCH3(CH2)y
(CHOSO3 -M+)CH2CH3のC10‐C18二級(2,3)アルキルサルフェ
ート(式中x及び(y+1)は少くとも約7、好ましくは少くとも約9の整数で
あり、Mは水溶性カチオン、特にナトリウムである)、C10‐C18アルキルアル
コキシサルフェート(特に、EO1〜5エトキシサルフェート)、C10‐C18ア
ルキルアルコキシカルボキシレート(特に、EO1〜5エトキシカルボキシレー
ト)、C10‐C18アルキルポリグリコシド及びそれらの対応サルフェート化ポリ
グリコシド、C12‐C18α‐スルホネート化脂肪酸エステル、C12‐C18アルキ
ル及びアルキルフェノールアルコキシレート(特に、エトキシレート及び混合エ
トキシ/プロポキシ)、C12‐C18ベタイン及びスルホベタイン(“スルタイン
”)、C10‐C18アミンオキシドなどがある。アルキルアルコキシサルフェート
(AES)及びアルキルアルコキシカルボキシレート(AEC)が本発明では好
ましい(このような界面活性剤と前記アミンオキシド及び/又はベタインもしく
はスルタイン界面活性剤との併用も、処方業者の希望に応じて好ましい)。他の
慣用的で有用な界面活性剤は標準テキストに掲載されている。特に有用な界面活
性剤には、参考のため本明細書に組み込まれる、1993年3月16日付で発行
されたConnorらの米国特許第5,194,639号明細書に開示されるC10‐C18
N‐メチルグルカミドがある。
他の活性成分、キャリヤ、ヒドロトロープ、加工助剤、色素又は顔料、液体処
方用溶媒などを含めて、洗剤クリーニング組成物で有用な様々な他の成分が本組
成物に含有させうる。起泡性の一層の増加が望まれるならば、C10‐C16アルコ
ールアミドのような起泡増進剤が典型的には約1〜約10%レベルで組成物中に
配合できる。C10‐C14モノエタノール及びジエタノールアミドがこのような起
泡増進剤の典型的種類である。このような起泡増進剤と前記のアミンオキシド、
ベタイン及びスルタインのような高起泡性補助界面活性剤との併用も有利である
。所望であれば、MgCl2、MgSO4などのような可溶性マグネシウム塩が、
起泡性を追加するために、典型的には約0.1〜約2%のレベルで添加される。
本液体洗剤組成物は、キャリヤとして水及び他の溶媒を含有することができる
。メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールで例示される低
分子量一級又は二級アルコールが適切である。一価アルコールが界面活性剤を溶
解させる上で好ましいが、約2〜約6の炭素原子と約2〜約6のヒドロキシ基を
含むもののようなポリオール(例えば、1,3‐プロパンジオール、エチレング
リコール、グリセリン及び1,2‐プロパンジオール)も使用できる。組成物は
このようなキャリヤを約5〜約90%、典型的には約10〜約50%含有する。
本洗剤組成物は、水性クリーニング操作で使用中に、洗浄水が約6.8〜約1
1.0のpHを有するように処方されることが好ましい。このため、最終製品は
典型的にはこの範囲で処方される。推奨される使用レベルでpHをコントロール
するための技術には緩衝剤、アルカリ、酸などの使用があり、これは当業者に周
知である。
本発明の硬質表面クリーニング組成物及び布帛クリーニング組成物を処方する
ときに、処方業者は約5〜約50重量%のレベルで様々なビルダーを用いたいと
望むかもしれない。典型的ビルダーには1〜10ミクロンゼオライト、ポリカル
ボキシレート、例えばシトレート及びオキシジサクシネート、積層シリケート、
ホスフェートなどがある。他の慣用的ビルダーは標準処方集に掲載されている。
同様に、処方業者はこのような組成物中にセルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼ
及びプロテアーゼのような様々な追加酵素を、典型的には約0.001〜約1重
量%のレベルで用いたいと望むかもしれない。様々な洗浄及び布帛ケア酵素が洗
濯洗剤業界で周知である。
ペルカーボネート、ペルボレートなどのような様々な漂白化合物が、典型的に
は約1〜約15重量%のレベルでこのような組成物中に使用できる。所望であれ
ば、このような組成物はテトラアセチルエチレンジアミン、ノナノイルオキシベ
ンゼンスルホネートなどのようなブリーチ活性剤も含有することができ、これら
も当業界で知られている。使用レベルは、典型的には約1〜約10重量%の範囲
である。
様々な汚れ放出剤、特にアニオン系オリゴエステルタイプ、様々なキレート化
剤、特にアミノホスホネート及びエチレンジアミンジサクシネート、様々な土汚
れ除去剤、特にエトキシル化テトラエチレンペンタミン、様々な分散剤、特にポ
リアクリレート及びポリアスパラテート、様々な増白剤、特にアニオン系増白剤
、様々な起泡抑制剤、特にシリコーン及び二級アルコール、様々な布帛柔軟剤、
特にスメクタイトクレーなどは、すべて約1〜約35重量%範囲のレベルでこの
ような組成物に使用できる。標準処方集と公開特許では、このような慣用物質に
ついて多数の詳細な記載を含んでいる。
酵素安定剤もクリーニング組成物に用いてよい。このような酵素安定剤にはプ
ロピレングリコール(好ましくは、約1〜約10%)、ギ酸ナトリウム(好まし
くは、約0.1〜約1%)及びギ酸カルシウム(好ましくは、約0.1〜約1%
)がある。
1.硬質表面クリーニング組成物
本発明で用いられる“硬質表面クリーニング組成物”とは、床、壁、浴室タイ
ルなどのような硬質表面をクリーニングするための液体及び顆粒洗剤組成物に関
する。本発明の硬質表面クリーニング組成物は、本発明の1種以上の酵素変種を
有効量で、好ましくは組成物の約0.001〜約10重量%、更に好ましくは約
0.01〜約5%、更に一層好ましくは約0.05〜約1%の活性酵素を含有す
る。1種以上の酵素変種を含有することに加えて、このような硬質表面クリーニ
ング組成物は典型的には界面活性剤と水溶性金属イオン封鎖ビルダーを含有する
。しかしながら、スプレーウィンドークリーナーのようなある特殊製品では界面
活性剤が時には用いられないこともあり、その理由はそれらがガラス表面で薄膜
状
/すじ状残留物を形成することがあるためである。
界面活性剤成分は存在するとき本組成物の0.1%と少量であるが、典型的に
は組成物は約0.25〜約10%、更に好ましくは約1〜約5%の界面活性剤を
含有する。
典型的には、組成物は約0.5〜約50%、好ましくは約1〜約10%の洗浄
ビルダーを含有する。
好ましくは、pHは約8〜12の範囲にあるべきである。水酸化ナトリウム、
炭酸ナトリウム又は塩酸のような慣用的pH調整剤が、調整が必要ならば使用で
きる。
溶媒も組成物に含有させてよい。有用な溶媒にはジエチレングリコールモノヘ
キシルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコー
ルモノブチルエーテル、エチレングリコールモノヘキシルエーテル、プロピレン
グリコールモノブチルエーテル、ジプロピレングリコールモノブチルエーテルの
ようなグリコールエーテルと、2,2,4−トリメチル‐1,3‐ペンタンジオ
ール及び2‐エチル‐1,3‐ヘキサンジオールのようなジオールがあるが、そ
れらに限定されない。用いられる場合、このような溶媒は典型的には約0.5〜
約15%、好ましくは約3〜約11%のレベルで存在する。
加えて、イソプロパノール又はエタノールのような高揮発性溶媒は、表面への
組成物の“フルストレングス(full strength)”適用後に表面が洗い流されな
いとき表面から組成物の速い蒸発を促進するために、本組成物で用いることがで
きる。用いられる場合、揮発性溶媒は典型的には組成物中に約2〜約12%のレ
ベルで存在する。
本発明の硬質表面クリーニング組成物態様は、下記例で説明される。
例7〜12
例7〜10では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種が
Thr58Asnの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
例11〜12では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種
のいずれの組合せがThr58Asn及びThr58Gln+Asn61Glu
の代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
例13〜18
例13〜16では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種
がVal94Alaの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
例17〜18では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種
のいずれの組合せがVal94Ala及びLeu125Asn+Gly126P
ro+Ser129Gluの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
2.皿洗い組成物
本発明のもう1つの態様において、皿洗い組成物は本発明の1種以上の酵素変
種を含有している。本発明で用いられる“皿洗い組成物”とは、限定されないが
顆粒及び液体形態を含めた、皿をクリーニングするためのすべての形態の組成物
に関する。本発明の皿洗い組成物態様は下記例で説明されている。
例19〜24
例19〜22では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種
がGly153Asnの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
例23〜24では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種
のいずれの組合せがGly153Asn及びAla186Asp+Phe188
Glnの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
3.布帛クリーニング組成物
本発明のもう1つの態様において、布帛クリーニング組成物は本発明の1種以
上の酵素変種を含有している。本発明で用いられる“布帛クリーニング組成物”
とは、限定されないが、顆粒、液体及び固形を含めた、布帛をクリーニングする
ためのすべての形態の洗剤組成物に関する。
a.顆粒布帛クリーニング組成物
本発明の顆粒布帛クリーニング組成物は、本発明の1種以上の酵素変種を有効
量で、好ましくは組成物の約0.001〜約10重量%、更に好ましくは約0.
005〜約5%、更に好ましくは約0.01〜約1%の活性酵素を含有する。1
種以上の酵素変種に加えて、顆粒布帛クリーニング組成物は典型的には少くとも
1種の界面活性剤、1種以上のビルダーと、一部の場合には漂白剤を含有してい
る。
本発明の顆粒布帛クリーニング組成物態様は下記例で説明されている。
例25〜28
例25〜26では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種
がPro200Asnの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
例27〜28では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種
のいずれの組合せがPro200Asn及びGly203Asp+Tyr205
Ala+Tyr208Serの代わりに用いられても、実質上同様の結果である
。
例29〜32
例29〜30では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種
がPro200Asn+Ala202Asn+Val204Gly+Asn21
1Asp+Thr219Glyの代わりに用いられても、実質上同様の結果であ
る。
例31〜32では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種
のいずれの組合せがPro200Asn+Ala202Asn+Val204G
ly+Asn211Asp+Thr219Gly及びLeu95Gly+Gly
203Proの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
例33〜36
例33〜34では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種
がThr58Gln+Asp59Glu+Leu216Glnの代わりに用いら
れても、実質上同様の結果である。
例35〜36では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種
のいずれの組合せがThr58Gln+Asp59Glu+Leu216Gln
及びPro200Asn+Ala202Gln+Tyr208Cys+Thr2
10Pro+Tyr213Asn+Ala214Asn+Thr219Serの
代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
例37〜40
例37〜38では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種
がAsp59Glu+Gly60Pro+Gly62Asn+Gly64Glの
代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
例39〜40では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種
のいずれの組合せがAsp59Glu+Gly60Pro+Gly62Asn+
Gly64Gl及びLeu125Alaの代わりに用いられても、実質上同様の
結果である。
例41〜42
例43〜44
例45
例46
例47
b.液体布帛クリーニング組成物
本発明の液体布帛クリーニング組成物は、本発明の1種以上の酵素変種を有効
量で、好ましくは組成物の約0.005〜約5重量%、更に好ましくは約0.0
1〜約1%の活性酵素を含有する。このような液体布帛クリーニング組成物は、
典型的にはアニオン系界面活性剤、脂肪酸、水溶性洗浄ビルダーと水を更に含有
する。
本発明の液体布帛クリーニング組成物態様は下記例で説明されている。
例48〜52
例48〜50では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種
がLeu125Ala+Gly126Gluの代わりに用いられても、実質上同
様の結果である。
例51〜52では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種
のいずれの組合せがLeu125Ala+Gly126Glu及びGly153
Glu+Ile164Alaの代わりに用いられても、実質上同様の結果である
。
例53〜57
例53〜55では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種
がPhe188Serの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
例56〜57では、特に表212で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種の
いずれの組合せがPhe188Ser及びAla186Gln+Ser187G
lu+Phe188Aspの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
例58〜59
例58及び59の各々では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsb
erg 変種がThr58Ser+Ser100Asp+Ile164Met+Ty
r205Alaの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
例60〜62
c.固形布帛クリーニング組成物
手洗い汚れ布帛用に適した本発明の固形布帛クリーニング組成物は、本発明の
1種以上の酵素変種を有効量で、好ましくは組成物の約0.001〜約10重量
%、更に好ましくは約0.01〜約1%で含有する。
本発明の固形布帛クリーニング組成物態様は下記例で説明されている。
例63〜66
例63〜64では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種
がThr207Gluの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
例65〜66では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種
のいずれの組合せがThr207Glu及びLeu125Ile+Ser131
Gluの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
例67〜70
例67では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種がPr
o200Ser+Ala214Gly+Asn217Gluの代わりに用いられ
ても、実質上同様の結果である。
例68では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種がPr
o200Ser+Ala214Gly+Asn217Glu及びGly101A
sp+Ala128Asp+Ser155Asp+Ser187Asp+Thr
207Gly+Thr212Glnの代わりに用いられても、実質上同様の結果
である。
例69〜70では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種
のいずれの組合せがVal203Glu及びGly100Glu+Ile107
Serの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
B.追加クリーニング組成物
前記の硬質表面クリーニング、皿洗い及び布帛クリーニング組成物に加えて、
本発明の1種以上の酵素変種も不溶性基質の加水分解が望まれる様々な他のクリ
ーニング組成物中に配合してよい。このような追加クリーニング組成物にはオー
ラルクリーニング組成物、義歯クリーニング組成物及びコンタクトレンズクリー
ニング組成物があるが、それらに限定されない。
1.オーラルクリーニング組成物
本発明のもう1つの態様では、薬学上許容される量の本発明の1種以上の酵素
変種が歯又は義歯からタンパク質汚れを除去する上で有用な組成物に含有される
。本発明で用いられる“オーラルクリーニング組成物”とは、歯磨剤、練歯磨剤
、歯磨ゲル、歯磨粉、洗口液、マウススプレー、マウスゲル、チューインガム、
ロゼンジ、小包、錠剤、バイオゲル、予防ペースト、歯処理溶液などに関する。
好ましくは、オーラルクリーニング組成物は組成物の約0.0001〜約20重
量%、更に好ましくは約0.001〜約10%、更に一層好ましくは約0.01
〜約5%の本発明の1種以上の酵素変種と、薬学上許容されるキャリヤを含む。
本明細書で用いられる“薬学上許容される”とは、その用語が表す薬物、薬剤又
は不活性成分が妥当な利益/危険比で釣り合って過度の毒性、不適合性、不安定
性、刺激、アレルギー反応などなくヒト及びそれより下等の動物の組織と接触す
る使用に適していることを意味する。
典型的には、オーラルクリーニング組成物のオーラルクリーニング成分の薬学
上許容されるオーラルクリーニングキャリヤ成分は、通常組成物の約50〜約9
9.99重量%、好ましくは約65〜約99.99%、更に好ましくは約65〜
約99%である。
本発明のオーラルクリーニング組成物に含有させてもよい薬学上許容されるキ
ャリヤ成分と任意成分は、当業者に周知である。オーラルクリーニング組成物で
有用な様々な組成タイプ、キャリヤ成分と任意成分は、1992年3月17日付
で発行されたSeibelの米国特許第5,096,700号;1991年7月2日付
で発行されたSampathkumarの米国特許第5,028,414号;1991年7月
2日付で発行されたBenedict,Bush 及びSunberg の米国特許第5,028,41
5号明細書で開示されており、それらはすべて参考のため本明細書に組み込まれ
る。
本発明のオーラルクリーニング組成物態様は下記例で説明されている。
例71〜74
例71〜74では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種
がThr212Glnの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
例75〜78
例75〜78では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種
がVal204Asn+Thr215Asnの代わりに用いられても、実質上同
様の結果である。
例79〜82
例79〜82では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種
がThr65Asp+Thr132Glu+Asn154Asp+Thr212
Glu+Leu216Gly+Asn217Serの代わりに用いられても、実
質上同様の結果である。
例83〜86
例83〜86では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種
がTyr103Alaの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
2.義歯クリーニング組成物
本発明のもう1つの態様において、口腔外で義歯をクリーニングするための義
歯クリーニング組成物は本発明の1種以上の酵素変種を含有する。このような義
歯クリーニング組成物は、有効量の1種以上の酵素変種、好ましくは組成物の約
0.0001〜約50重量%、更に好ましくは約0.001〜約35%、更に一
層好ましくは約0.01〜約20%の1種以上の酵素変種と、義歯クリーニング
キャリヤを含有する。発泡錠などのような様々な義歯クリーニング組成物フォー
マットが当業界で周知であり(例えば、参考のため本明細書に組み込まれる、Yo
ung の米国特許第5,055,305号明細書参照)、義歯からタンパク質汚れ
を除去する上で1種以上の酵素変種の配合に通常適している。
本発明の義歯クリーニング組成物態様は下記例で説明されている。
例87〜90
例87〜90において、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg
変種がLeu216Proの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
3.コンタクトレンズクリーニング組成物
本発明のもう1つの態様において、コンタクトレンズクリーニング組成物は本
発明の1種以上の酵素変種を含有する。このようなコンタクトレンズクリーニン
グ組成物は、有効量の1種以上の酵素変種、好ましくは組成物の約0.01〜約
50重量%、更に好ましくは約0.01〜約20%、更に一層好ましくは約1〜
約5%の1種以上の酵素変種と、コンタクトレンズクリーニングキャリヤを含有
する。錠剤、液体などのような様々なコンタクトレンズクリーニング組成物フォ
ーマットが当業界で周知であり(例えば、1989年9月5日付で発行されたDa
vies,Meaken 及びReesの米国特許第4,863,627号;1988年5月2
4日付で再発行されたHuth,Lam及びKirai の米国特許Re第32,672号;1
986年9月2日付で発行されたSchafer の米国特許第4,609,493号;
1987年9月1日付で発行されたOgunbiyi及びSmith の米国特許第4,690
,793号;1986年9月30日付で発行されたOgunbiyi,Riedhammer 及びSm
ith の米国特許第4,614,549号;1981年8月25日付で発行された
Ogata の米国特許第4,285,738号明細書参照;これら各々は参考のため
本明細書に組み込まれる)、コンタクトレンズからタンパク質汚れを除去する上
で本発明の1種以上の酵素変種の配合に通常適している。
本発明のコンタクトレンズクリーニング組成物態様は下記例で説明されている
。
例91〜94
例91〜94では、特に表3〜36で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種
がAla199Thr+Val204Glnの代わりに用いられても、実質上同
様の結果である。
本発明の具体的態様が記載されてきたが、本発明の様々な変更及び修正が本発
明の精神及び範囲から逸脱せずに行えることは当業者にとり明らかであろう。添
付された請求の範囲では、本発明の範囲内に属するすべてのこのような修正をカ
バーしていると考えられる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG
,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN,
TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,SZ,U
G),UA(AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM
),AL,AM,AT,AU,AZ,BB,BG,BR
,BY,CA,CH,CN,CZ,DE,DK,EE,
ES,FI,GB,GE,HU,IS,JP,KE,K
G,KP,KR,KZ,LK,LR,LS,LT,LU
,LV,MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO,
NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG,S
I,SK,TJ,TM,TR,TT,UA,UG,UZ
,VN
(72)発明者 ラビング,ドン ネルトン
アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナチ、
シード、ロード、8224
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. ズブチリシンCarlsberg 野生型アミノ酸配列の修飾されたアミノ酸配列 を有したズブチリシンCarlsberg 変種であって(野生型アミノ酸配列は第一ルー プ領域、第二ループ領域、第三ループ領域、第四ループ領域、第五ループ領域及 び第六ループ領域を含んでいる)、 修飾されたアミノ酸配列が1以上のループ領域で1以上の位置に置換を含み、 A.置換が第一ループ領域で生じているとき、置換は58、59、60、61、 62、64又は65位のうち1以上で生じ、 a.置換が58位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln 、Glu、Gly、Pro又はSerであり、 b.置換が59位で生じているとき、置換アミノ酸はGluであり、 c.置換が60位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln 、Glu、Pro又はSerであり、 d.置換が61位で生じているとき、置換アミノ酸はAsp、Gln、Glu 又はSerであり、 e.置換が62位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln 、Glu、Pro又はSerであり、 f.置換が64位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln 、Glu、Pro又はSerであり、及び g.置換が65位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln 、Glu、Gly、Pro又はSerであり; B.置換が第二ループ領域で生じているとき、置換は94、95、96、97、 98、99、100、101、102、103、104、105又は106位の うち1以上で生じ、 a.置換が94位で生じているとき、置換アミノ酸はAla、Asn、Asp 、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Met、Pro、Ser又はTh rであり、 b.置換が95位で生じているとき、置換アミノ酸はAla、Asn、Asp 、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Met、Pro、Ser 、Thr又はValであり、 c.置換が96位で生じているとき、置換アミノ酸はAsp、Gln、Glu 、Serであり、 d.置換が97位で生じているとき、置換アミノ酸はAsp又はGluであり 、 e.置換が98位で生じているとき、置換アミノ酸はAsp又はGluであり 、 f.置換が99位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gln 、Glu、Pro又はSerであり、 g.置換が100位で生じているとき、置換アミノ酸はAsp又はGluであ り、 h.置換が101位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Pro又はSerであり、 i.置換が102位で生じているとき、置換アミノ酸はAsp又はGluであ り、 j.置換が103位で生じているとき、置換アミノ酸はAla、Asn、As p、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pr o、Ser、Thr又はValであり、 k.置換が104位で生じているとき、置換アミノ酸はAsp又はGluであ り、 l.置換が105位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Pro又はSerであり、及び m.置換が106位で生じているとき、置換アミノ酸はAla、Asn、As p、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Met、Pro、Se r、Thr又はValであり; C.置換が第三ループ領域で生じているとき、置換は125、126、127、 128、129、130、131又は132位のうち1以上で生じ、 a.置換が125位で生じているとき、置換アミノ酸はAla、Asn、As p、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Met、Pro、Se r、Thr又はValであり、 b.置換が126位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Pro又はSerであり、 c.置換が127位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Pro又はSerであり、 d.置換が128位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Gly、His、Pro、Ser又はThrであり、 e.置換が129位で生じているとき、置換アミノ酸はAsp又はGluであ り、 f.置換が130位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Pro又はSerであり、 g.置換が131位で生じているとき、置換アミノ酸はAsp又はGluであ り、及び h.置換が132位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Gly、Pro又はSerであり; D.置換が第四ループ領域で生じているとき、置換は153、154、155、 156、157、158、159、160、161、162、163、164、 165又は166位のうち1以上で生じ、 a.置換が153位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Pro又はSerであり、 b.置換が154位で生じているとき、置換アミノ酸はAsp、Gln、Gl u又はSerであり、 c.置換が155位で生じているとき、置換アミノ酸はAsp又はGluであ り、 d.置換が156位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Pro又はSerであり、 e.置換が157位で生じているとき、置換アミノ酸はAsp、Gln、Gl u、Serであり、 f.置換が158位で生じているとき、置換アミノ酸はAsp又はGluであ り、 g.置換が159位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Pro又はSerであり、 h.置換が160位で生じているとき、置換アミノ酸はAsp又はGluであ り、 i.置換が161位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Gly、Pro又はSerであり、 j.置換が162位で生じているとき、置換アミノ酸はAsp、Gln、Gl u又はSerであり、 k.置換が163位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Gly、Pro又はSerであり、 l.置換が164位で生じているとき、置換アミノ酸はAla、Asn、As p、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Met、Pro、Ser、Th r又はValであり、 m.置換が165位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Pro又はSerであり、及び n.置換が166位で生じているとき、置換アミノ酸はAla、Asn、As p、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pr o、Ser、Thr又はValであり; E.置換が第五ループ領域で生じているとき、置換は186、187、188、 189又は190位のうち1以上で生じ、 a.置換が186位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Gly、His、Pro、Ser及びThrであり、 b.置換が187位で生じているとき、置換アミノ酸はAsp又はGluであ り、 c.置換が188位で生じているとき、置換アミノ酸はAla、Asn、As p、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pr o、Ser、Thr、Tyr又はValであり、 d.置換が189位で生じているとき、置換アミノ酸はAsp又はGluであ り、及び e.置換が190位で生じているとき、置換アミノ酸はAsp又はGluであ り; F.置換が第六ループ領域で生じているとき、置換は199、200、201、 202、203、204、205、206、207、208、209、210、 211、212、213、214、215、216、217、218又は219 位のうち1以上で生じ、 a.置換が199位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Gly、His、Pro、Ser又はThrであり、 b.置換が200位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、 Gln、Glu、Gly又はSerであり、 c.置換が201位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Pro又はSerであり、 d.置換が202位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Gly、His、Pro、Ser又はThrであり、 e.置換が203位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Pro又はSerであり、 f.置換が204位で生じているとき、置換アミノ酸はAla、Asn、As p、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Met、Pro、Ser又はT hrであり、 g.置換が205位で生じているとき、置換アミノ酸はAla、Asn、As p、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pr o、Ser、Thr又はValであり、 h.置換が206位で生じているとき、置換アミノ酸はAsp又はGluであ り、 i.置換が207位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Gly、Pro又はSerであり、 j.置換が208位で生じているとき、置換アミノ酸はAla、Asn、As p、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pr o、Ser、Thr又はValであり、 k.置換が209位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Gly又はSerであり、 l.置換が210位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Gly、Pro又はSerであり、 m.置換が211位で生じているとき、置換アミノ酸はAsp、Gln、 Glu又はSerであり、 n.置換が212位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Gly、Pro又はSerであり、 o.置換が213位で生じているとき、置換アミノ酸はAla、Asn、As p、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pr o、Ser、Thr又はValであり、 p.置換が214位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Gly、His、Pro、Ser又はThrであり、 q.置換が215位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Gly、Pro又はSerであり、 r.置換が216位で生じているとき、置換アミノ酸はAla、Asn、As p、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Met、Pro、Se r、Thr又はValであり、 s.置換が217位で生じているとき、置換アミノ酸はAsp、Gln、Gl u又はSerであり、 t.置換が218位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Pro又はSerであり、及び u.置換が219位で生じているとき、置換アミノ酸はAsn、Asp、Gl n、Glu、Gly、Pro又はSerであり、 それにより、ズブチリシンCarlsberg 変種は野生型ズブチリシンCarlsberg と 比較して不溶性基質に対する減少した吸着性と増加した加水分解性を有している ことを特徴とする、ズブチリシンCarlsberg 変種。 2. 1以上の置換が第一ループ領域で生じている、請求項1に記載のズブチ リシンCarlsberg 変種。 3. 1以上の置換が第二ループ領域で生じている、請求項1に記載のズブチ リシンCarlsberg 変種。 4. 1以上の置換が第三ループ領域で生じている、請求項1に記載のズブチ リシンCarlsberg 変種。 5. 1以上の置換が第四ループ領域で生じている、請求項1に記載のズブチ リシンCarlsberg 変種。 6. 1以上の置換が第五ループ領域で生じている、請求項1に記載のズブチ リシンCarlsberg 変種。 7. 1以上の置換が第六ループ領域で生じている、請求項1に記載のズブチ リシンCarlsberg 変種。 8. 硬質表面クリーニング組成物、皿洗い組成物、オーラルクリーニング組 成物、義歯クリーニング組成物、コンタクトレンズクリーニング組成物及び布帛 クリーニング組成物からなる群より選択されるクリーニング組成物であって、 クリーニング組成物が請求項1〜7のいずれか一項に記載されたズブチリシン Carlsberg 変種とクリーニング組成物キャリヤを含んでなり;好ましくは、クリ ーニング組成物が硬質表面クリーニング組成物であるか、又はクリーニング組成 物が布帛クリーニング組成物であり;好ましくは、組成物が組成物の少くとも約 5重量%の界面活性剤と少くとも約5%のビルダーを含み;好ましくは、組成物 が溶媒、緩衝剤、酵素、汚れ放出剤、土汚れ除去剤、分散剤、増白剤、起泡抑制 剤、布帛柔軟剤、起泡増進剤、酵素安定剤、漂白剤、色素、香料及びそれらの混 合物からなる群より選択されるクリーニング組成物物質を更に含んでなることを 特徴とする、クリーニング組成物。 9. 請求項1〜7のいずれか一項に記載されたズブチリシンCarlsberg 変種 についてコードする変異ズブチリシンCarlsberg 遺伝子。
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