JPH11501812A

JPH11501812A - 減少した吸着性と増加した加水分解性を有するズブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ変種

Info

Publication number: JPH11501812A
Application number: JP8527598A
Authority: JP
Inventors: フレデリックザ、サードブロウド，フィリップ; リーバーネット，ボビー; ネルトンラビング，ドン
Original assignee: Procter and Gamble Co
Current assignee: Procter and Gamble Co
Priority date: 1995-03-08
Filing date: 1996-02-14
Publication date: 1999-02-16
Also published as: CN1183119A; HUP9800765A3; EP0813596A2; CA2214348C; MA23818A1; US6455295B1; CA2214348A1; CZ279397A3; ZA961631B; MX9706851A; HUP9800765A2; AU4868896A; IL117266A0; WO1996028566A3; BR9607356A; WO1996028566A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、野生型ズブチリシンCarlsberg アミノ酸配列の修飾されたアミノ酸配列を有するズブチリシンCarlsberg 変種に関する（野生型アミノ酸配列は第一ループ領域、第二ループ領域、第三ループ領域、第四ループ領域、第五ループ領域及び第六ループ領域を含んでいる）；修飾されたアミノ酸配列は１以上のループ領域で具体的な特定の位置に野生型ズブチリシンCarlsberg に存在する場合とは異なるアミノ酸（即ち、置換）を含み、それによりズブチリシンCarlsberg 変種は野生型ズブチリシンCarlsberg と比較して不溶性基質に対する減少した吸着性と増加した加水分解性を有している。本発明はこのようなズブチリシンCarlsberg 変種についてコードする遺伝子にも関する。本発明は様々な表面をクリーニングする上でこのようなズブチリシンCarlsberg 変種を含んでなる組成物にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】減少した吸着性と増加した加水分解性を有するズブチリシンCarlsberg 変種技術分野本発明は、様々なクリーニング組成物で有用な新規酵素変種と、このような酵素変種をコードする遺伝子に関する。背景酵素は最大類の天然タンパク質を構成している。各類の酵素は通常異なる種類の化学反応を触媒する（消費されずに反応を促進する）。プロテアーゼとして知られる酵素の１種は、他のタンパク質を加水分解する（開裂される化学結合のいずれかの側における水分子のＨ及びＯＨ部分の取込みで、化合物を２以上のより簡単な化合物に分解する）それらの能力について知られている。タンパク質を加水分解するこの能力は、洗濯洗剤製品に添加物として天然及びタンパク質工学処理プロテアーゼを配合することにより利用されてきた。衣類上の多くの汚れはタンパク質性であり、広域特異性プロテアーゼはこのような汚れの除去性を実質上改善することができる。残念ながら、天然細菌環境下におけるこれらタンパク質の効力レベルは相対的に非天然の洗浄環境中にしばしば移行していない。特に、熱安定性、ｐＨ安定性、酸化安定性及び基質特異性のようなプロテアーゼ特徴は、酵素の天然環境外での利用上必ずしも最良になっていない。プロテアーゼのアミノ酸配列がプロテアーゼの特徴を決定する。プロテアーゼのアミノ酸配列の変化は、酵素の性質を様々な程度に変えるかもしれないし、あるいはアミノ酸配列における変化の位置、性質及び／又は大きさに応じて酵素を不活化させることさえある。洗浄環境下でプロテアーゼの効力を増加させることを目標として、それらの性質を改善する試みに際し、プロテアーゼの野生型アミノ酸配列を変えるいくつかのアプローチが行われてきた。これらのアプローチには、全く多様な条件下で熱安定性を高めて酸化安定性を改善するために、アミノ酸配列を変えることを含む。当業界で記載された様々なアプローチにもかかわらず、様々な表面をクリーニングする上で有用なプロテアーゼの有効な新規変種について必要性が継続している。本発明の目的本発明の目的は、野生型の酵素と比較して改善された加水分解性を有するズブチリシンCarlsberg 酵素変種を提供することである。これらのズブチリシン酵素変種を含んでなるクリーニング組成物を提供することも本発明の目的である。要旨本発明は、野生型ズブチリシンCarlsberg アミノ酸配列の修飾されたアミノ酸配列を有するズブチリシンCarlsberg 変種に関し、野生型アミノ酸配列は第一ループ領域、第二ループ領域、第三ループ領域、第四ループ領域及び第五ループ領域を含んでいて、修飾されたアミノ酸配列は１以上のループ領域において具体的な特定の位置で野生型ズブチリシンCarlsberg に存在する場合とは異なるアミノ酸（即ち、置換）を含み、それによりズブチリシンCarlsberg 変種は野生型ズブチリシンCarlsberg と比較して不溶性基質に対する減少した吸着性と増加した加水分解性を有している。本発明はこのようなズブチリシンCarlsberg 変種についてコードする遺伝子にも関する。本発明は様々な表面をクリーニングする上でこのようなズブチリシンCarlsberg 変種を含んでなる組成物にも関する。説明Ｉ．ズブチリシン変種本発明は、酵素についてコードする様々なヌクレオチド配列を変異させて酵素のアミノ酸配列を変えることにより修飾されたズブチリシン酵素、特にズブチリシンCarlsberg に関する。本発明の修飾ズブチリシン酵素（以下、“ズブチリシンCarlsberg 変種”）は、野生型ズブチリシンと比較して、不溶性基質に対して減少した吸着性と増加した加水分解性を有している。本発明はこのようなズブチリシンCarlsberg 変種についてコードする変異遺伝子にも関する。本発明のズブチリシン酵素は、プロテアーゼとして知られる酵素の１種に属する。プロテアーゼはペプチド結合の開裂用の触媒である。１タイプのプロテアーゼはセリンプロテアーゼである。セリンプロテアーゼは、活性部位に必須セリン残基があるという事実により区別される。可溶性基質の酵素加水分解速度が酵素濃度に応じて増加するという観察は、詳しく文献に記載されている。したがって、多くのクリーニング適用例で遭遇するような表面結合基質にとり、加水分解の速度は表面濃度の増加に従い増加することはもっともであろう。これは事例として示された（Brode,P.F.III 及びD.S.Ra uch,LANGMUIR,"Subtilisin BPN'：Activity on an Immobilized Substrate",Vol .8,pp.1325-1329(1992)）。実際に、表面濃度に対する速度の直線的依存性は、酵素の表面濃度が変えられたときに不溶性基質でみられた（Rubingh,D.N.及び M .D.Bauer,"Catalysis of Hydrolysis by Proteases at the Protein-Solution I nterface",in POLYMER SOLUTIONS,BLENDS AND INTERFACES,Ed.by I.Noda及びD.N .Rubingh,Elsevier,p.464(1992)）。意外にも、より良いクリーニング性能を与える変種プロテアーゼに関するサーチでこの原理を適用しようとしたとき、我々は多く吸着する酵素ほど良い性能を与えるということを見い出せなかった。実際上、我々は意外にも、基質への酵素による吸着性が減少すると基質の加水分解性が増加する（即ち、クリーニング性能が良くなる）という、反対の事例があることをみつけた。理論に拘束されないが、ある変種を他と比較してみて改善された性能は、少なく吸着する酵素ほど強く結合されず、したがって不溶性タンパク質基質が除去されるべき表面上においてより高度に移動性であるという事実の結果であると考えられる。匹敵する酵素溶液濃度のとき、この増加した移動性はより高濃度の酵素を表面にデリバリーすることで付与されるいかなる利点よりも十分にまさっている。本明細書で記載された変異は、表面結合汚れへの酵素の吸着性を変える（即ち、減少させる）ように考えられている。ズブチリシンCarlsberg において、あるアミノ酸は酵素分子上で外部ループを形成している。説明の目的から、これらのループは第一、第二、第三、第四及び第五ループ領域と称される。特に、５８〜６５位は第一ループ領域を形成し、９４〜１０６位は第二ループ領域を形成し、１２５〜１３２位は第三ループ領域を形成し、１５３〜１６６位は第四ループ領域を形成し、１８６〜１９０位は第五ループ領域を形成し、１９９〜２１９位は第六ループ領域を形成している（野生型ズブチリシンCarlsberg （ＳＥＱＩＤＮＯ：１）でのアミノ酸配列の位置と同様の位置ナンバリング）。これらのループ領域は表面結合ペプチドへの酵素分子の吸着にとり重要な役割を果たして、これらループ領域の１以上における特異的変異はこの吸着にとり重要な効果を有していると考えられる。理論に拘束されないが、ループ領域は少くとも２つの理由からズブチリシンCarlsberg 分子の吸着にとり重要であると考えられる。第一に、ループ領域を含めたアミノ酸は分子が暴露されるいかなる表面とも密に接触することができる。第二に、ズブチリシンCarlsberg 分子の活性部位及び結合ポケットに対してループ領域の近位部分は、表面結合基質（ペプチド／タンパク質汚れ）への酵素の触媒生産的吸着に際して役割を有する。本明細書で用いられる“変種”とは、野生型の場合とは異なるアミノ酸配列を有した酵素を意味する。本明細書で用いられる“変異ズブチリシンCarlsberg 遺伝子”とは、ズブチリシンCarlsberg 変種についてコードする遺伝子を意味する。本明細書で用いられる“野生型ズブチリシンCarlsberg ”とは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で表されるズブチリシン酵素に関する。ズブチリシンCarlsberg のアミノ酸配列は、参考のため本明細書に組み込まれる、Smith,E.L.,Delange,R.J.E vans,W.H.,Landon,M．及びMarkland,F.S.,J.BIOL.CHEM.,Vol.243,pp.2184-2191( 1968)で更に記載されている。本明細書で用いられる“ズブチリシンCarlsberg 野生型アミノ酸配列”という用語は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１と、５８〜６５位、９４〜１０６位、１２５〜１３２位、１５３〜１６６位、１８６〜１９０位及び１９９〜２１９位以外のアミノ酸配列に修飾を有するＳＥＱＩＤＮＯ：１とを包含している。本明細書で用いられる“より親水性のアミノ酸”とは、下記親水性表で参照の対象アミノ酸よりも大きな親水性を有したあらゆる他のアミノ酸に関する。下記親水性表（表１）は親水性の増加に従って下降するようにアミノ酸を掲載している（Hopp,T.P．及びWoods,K.R.,"Prediction of Protein Antigenic Determinan ts from Amino Acid Sequences",PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCI ENCE USA,Vol.78,pp.3824-3828,1981 参照；参考のため本明細書に組み込まれる）。表１はアミノ酸がどんな電荷を有するかについても示している（この特徴は約８〜９のｐＨに基づいている）。正荷電アミノ酸はＡｒｇ及びＬｙｓであり、負荷電アミノ酸はＧｌｕ及びＡｓｐであり、残りのアミノ酸は中性である。本発明の好ましい態様において、置換アミノ酸は中性又は負荷電であり、更に好ましくは負荷電（即ち、Ｇｌｕ又はＡｓｐ）である。したがって、例えば、“中性であるか又は負電荷を有する同等又はより親水性のアミノ酸でＧｌｎを置換する”という表現は、ＧｌｎがＡｓｎ（Ｇｌｎと同等の親水性である）あるいはＳｅｒ、Ｇｌｕ又はＡｓｐ（Ｇｌｎより親水性である）で置換されることを意味する；それら各々は中性であるか又は負電荷を有して、Ｇｌｎと比較して大きな親水価を有している。同様に、“中性であるか又は負電荷を有するより親水性のアミノ酸でＰｒｏを置換する”という表現は、ＰｒｏがＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ又はＡｓｐで置換されることを意味する。本発明の１つの態様において、ズブチリシンCarlsberg 変種はズブチリシンCa rlsberg 野生型アミノ酸配列の修飾されたアミノ酸配列を有しており、野生型アミノ酸配列は第一ループ領域、第二ループ領域、第三ループ領域、第四ループ領域、第五ループ領域又は第六ループ領域の１以上に１以上の位置で置換を含んでいて、それによりズブチリシンCarlsberg 変種は野生型ズブチリシンCarlsberg と比較して不溶性基質に対する減少した吸着性と増加した加水分解性を有している。本発明の好ましい態様において、１以上のループ領域で１以上の位置における置換アミノ酸は、表１を参考にすると、中性又は負荷電であり、野生型アミノ酸配列の対象位置にあるアミノ酸と等しいか又はそれより親水性、好ましくはより親水性である。Ａ．第一ループ領域の置換置換が第一ループ領域で生じるとき、置換は５８、５９、６０、６１、６２、６４又は６５位のうち１以上で生じる。置換が５８位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。置換が５９位で生じるとき、置換アミノ酸はＧｌｕである。置換が６０位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。置換が６１位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ又はＳｅｒである。置換が６２位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。置換が６４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。置換が６５位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。Ｂ．第二ループ領域の置換置換が第二ループ領域で生じるとき、置換は９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５又は１０６位のうち１以上で生じる。置換が９４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ又はＴｈｒである。置換が９５位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌである。置換が９６位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒである。置換が９７位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕである。置換が９８位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕである。置換が９９位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。置換が１００位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕである。置換が１０１位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。置換が１０２位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕである。置換が１０３で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌである。置換が１０４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕである。置換が１０５位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。置換が１０６位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌである。Ｃ．第三ループ領域の置換置換が第三ループ領域で生じるとき、置換は１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１又は１３２位のうち１以上で生じる。置換が１２５位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌである。置換が１２６位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。置換が１２７位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。置換が１２８位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ又はＴｈｒである。置換が１２９位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕである。置換が１３０位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。置換が１３１位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕである。置換が１３２位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。Ｄ．第四ループ領域の置換置換が第四ループ領域で生じるとき、置換は１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５又は１６６位のうち１以上で生じる。置換が１５３位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。置換が１５４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ又はＳｅｒである。置換が１５５位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕである。置換が１５６位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。置換が１５７位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒである。置換が１５８位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕである。置換が１５９位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。置換が１６０位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕである。置換が１６１位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。置換が１６２位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ又はＳｅｒである。置換が１６３位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。置換が１６４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌである。置換が１６５位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。及び置換が１６６位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌである。Ｅ．第五ループ領域の置換置換が第五ループ領域で生じるとき、置換は１８６、１８７、１８８、１８９又は１９０位のうち１以上で生じる。置換が１８６位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＴｈｒである。置換が１８７位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕである。置換が１８８位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ又はＶａｌである。置換が１８９位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕである。置換が１９０位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕである。Ｆ．第六ループ領域の置換置換が第六ループ領域で生じるとき、置換は１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８又は２１９位のうち１以上で生じる。置換が１９９位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＴｈｒである。置換が２００位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ又はＳｅｒである。置換が２０１位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。置換が２０２位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ又はＴｈｒである。置換が２０３位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。置換が２０４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ又はＴｈｒである。置換が２０５位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌである。置換が２０６位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕである。置換が２０７位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。置換が２０８位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌである。置換が２０９位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ又はＳｅｒである。置換が２１０位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。置換が２１１位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ又はＳｅｒである。置換が２１２位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。置換が２１３位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌである。置換が２１４位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ又はＴｈｒである。置換が２１５位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。置換が２１６位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌである。置換が２１７位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ又はＳｅｒである。置換が２１８位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｃｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。置換が２１９位で生じるとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ又はＳｅｒである。Ｇ．酵素変種の製造例１変異ズブチリシンCarlsberg 遺伝子野生型ズブチリシンCarlsberg 遺伝子を含んだファージミド（“ＣＰ”）を作る。プラスミドｐＵＣ１１９（Vieira,J．及びMessing,J.,"Production of Sing le-Stranded Plasmid DNA",153,METHODS IN ENZYMOLOGY,3-11(1989)）の２．８ＫｂｐＰｖｕII制限酵素断片をプラスミドｐＵＢ１１０（Bacillus Genetic Stock Center,Columbus,OH 1E9）のＰｖｕII部位中にクローニングする。ｐＵＣ１１９‐ｐＵＢ１１０ハイブリッドプラスミドはｐＪＭＡ６０１と称する。ｐＪＭＡ６０１のＢａｍＨＩ制限部位中にポリメラーゼ連鎖反応‐増幅ズブチリシンCarlsberg 遺伝子をクローニングして、ＣＰを得る。ファージミドＣＰをEscherichia coli ｕｎｇ−株ＣＪ２３６中に組み込んで形質転換させ、一本鎖ウラシル保有ＤＮＡ鋳型をＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを用いて作製する（ Kunkel,T.A.,J.D.Roberts 及びR.A.Zakour,"Rapid and efficient site-specifi c mutagenesis without phenotypic selection",METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.15 4,pp.367-382(1987)；Yuckenberg,P.D.,F.Witney,J.Geisselsoder 及びJ.McClar y,"Site-directed in vitro mutagenesis using uracil-containing DNA and ph agemid vectors",DIRECTED MUTAGENESIS - A PRACTICAL APPROACH,ed.M.J.McPhe rson,pp.27-48(1991)により修飾；双方とも参考のため本明細書に組み込まれる）。Zoller及びSmith の単一プライマー部位特異的変異誘発修飾法（Zoller,M.J ．及びM.Smith,"Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived ve ctors: an efficient and general procedure for the production of point mu tations in any fragment of DNA",NUCLEIC ACIDS RESEARCH,Vol.10,pp.6487-65 00(1982)；参考のため本明細書に組み込まれる）を用いて、すべての変異体を作製する（基本的には、前掲のYuckenbergら,1991 で表されたとおり）。オリゴヌクレオチドはApplied Biosystem Inc.３８０ＢＤＮＡシンセサイザーを用いて作る。変異誘発反応産物をEscherichia coli株ＭＭ２９４（American Type Cult ure Collection E.coli ３３６２５）に組み込んで形質転換させる。すべての変異体をＤＮＡ配列決定により確認し、単離されたＤＮＡをBacillus subtilis 発現株ＢＧ２０３６（Yang,M.Y.,E.Ferrari 及びD.J.Hermer,(1984),"Cloning o f the Neutral Protease Gene of Bacillus subtillis and the Use of the Clo ned Gene to Create an In Vitro-derived Deletion Mutation",JOURNAL OF BACTERIOLOGY,Vol.160,pp.15-21）に組み込んで形質転換させる。一部のループ変異体では、対応ループにフレームシフト停止コドン変異がある修飾ＣＰを用いて、ウラシル鋳型を作製する。オリゴヌクレオチドは、適正なリーディングフレームを復元して、５８、５９、６０、６１、６２、６４、６５、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８及び／又は２１９位のランダム置換についてコードするようにデザインされる（これらのコドンにおいて３つすべての塩基に関する全部で４つのヌクレオチドの等モル及び／又は可変混合物）。フレームシフト停止を訂正して機能性酵素を産生する変異は、カゼインを切断するそれらの能力により同定する。ランダム置換はＤＮＡ配列決定により調べる。例２発酵関心あるズブチリシン変異体を含んだBacillus subtilis 細胞（ＢＧ２０３６）をＬＢ‐グルコースブロスの１ｌ培養物中で中間対数期まで増殖させ、全容量１０ｌのBiostat ＥＤ醗酵槽（B.Braun Biotech,Inc.,Allentown,Pennsylvania ）中に接種する。発酵培地は酵母エキス、デンプン、消泡剤、緩衝剤及び微量ミネラルを含有している（FERMENTATION: A PRACTICAL APPROACH,Ed.B.McNeil及び L.M.Harvey,1990 参照）。ブロスを発酵ラン中に７．０の一定ｐＨに保つ。クロラムフェニコールを変異誘発プラスミドの抗生物質選択用に加える。細胞をＡ₆₀₀約６０まで３７℃で一夜増殖させて、回収する。例３精製発酵ブロスは純粋な酵素を得るために下記ステップで使う。ブロスから遠心によりBacillus subtilis 細胞を除き、１００Ｋカットオフ膜で細かな粒子を除去することにより清澄化する。この後１０Ｋカットオフ膜で遠心し、フロー透析してイオン強度を減少させ、０．０２５ＭＭＥＳ緩衝剤（２‐（Ｎ‐モルホリノ）エタンスルホン酸）を用いてｐＨを５．５に調整する。酵素は、それを陽イオン交換クロマトグラフィーカラム又はアフィニティ吸着クロマトグラフィーカラムにいれて、それをＮａＣｌ又はプロピレングリコール勾配でカラムから溶出させることにより更に精製する（Scopes,R.K.,PROTEIN PURIFICATION PRINCIPLES AND PRACTICE,Springer-Verlag,New York(1984) 参照；参考のため本明細書に組み込まれる）。ｐＮＡアッセイ（DelMar,E.G.,C.Largman,J.W.Brodrick及びM.C.Geokas,ANAL. BIOCHEM.,Vol.99,pp.316-320(1979)；参考のため本明細書に組み込まれる）を用いて、勾配溶出中に集められた画分について活性酵素濃度を調べる。このアッセイでは、酵素が可溶性合成基質サクシニル‐アラニン‐アラニン‐プロリン‐フェニルアラニン−ｐ‐ニトロアニリド（ｓＡＡＰＦ‐ｐＮＡ）を加水分解するとｐ‐ニトロアニリンが放出されるときの速度を測定する。加水分解反応による黄色の発生速度を分光光度計において４１０ｎｍで測定するが、これは活性酵素濃度と比例している。加えて、２８０ｎｍの吸光度測定も全タンパク質濃度を調べるために行う。活性酵素／全タンパク質比は酵素純度を示し、ストック溶液としてプールされる画分を確認するために用いる。貯蔵中に酵素の自己分解を避けるため、等重量のプロピレングリコールをクロマトグラフィーカラムから得られたプール画分に加える。精製操作の終了後、ストック酵素溶液の純度をＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）でチェックし、絶対酵素濃度をトリプシンインヒビタータイプII‐Ｔ：Sigma Chemical Company（St.Louis,Missouri）から購入した七面鳥卵白を用いて活性部位滴定法により調べる。測定された変換ファクターは、酵素分子の様々な位置で起きたどの変化が可溶性基質ｐＮＡに対して野生型よりも増加した活性を有する酵素変種を生じているのかについて示す。使用向け製造に際して、酵素ストック溶液は、プロピレングリコールを除去して緩衝剤を交換するために、Sephadex‐Ｇ２５（Pharmacia,Piscataway,New Jer sey）サイズ排除カラムで溶出させる。酵素ストック溶液中のＭＥＳ緩衝剤は、０．０１ＭＣａＣｌ₂を含有してＨＣｌで８．６にｐＨ調整された０．１ＭTri s 緩衝剤（トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン））と交換する。すべての実験は２５℃に恒温された Tris 緩衝液中ｐＨ８．６で行う。Ｈ．酵素変種の特徴付け例４モデル表面作製ＣＰＧ Inc．（Fairfield,New Jersey）から購入したアミノプロピル制御多孔質ガラス（ＣＰＧ）を、Bachem,Inc．（Torrence,California）から購入したｓＡＡＰＦ‐ｐＮＡ基質を共有結合させるための支持体として用いる。反応はジメチルスルホキシド中で行い、１‐エチル‐３‐〔３‐（ジメチルアミノ）プロピル〕カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）をカップリング剤として用いる。完了時（ｐＮＡアッセイでモニターする）、過剰溶媒を除去し、ＣＰＧ：ｓＡＡＰＦ‐ｐＮＡをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び二重蒸留水ですすぐ。この後、約７０℃でＮ₂パージしながらオーブン乾燥させる。固定基質の反応スキーム及び製造は、参考のため本明細書に組み込まれるBrode,P.F.III 及びD.S.Rauch,"Sub tilisin BPN'：Activity on an Immobilized Substrate",LANGMUIR,Vol.8,p. 1325-1329(1992)で記載されたように行う。ＣＰＧ表面は６２，０００±７０００ｐＮＡ分子／μｍ²を有する。表面積は受け取ったＣＰＧに関してＣＰＧ Inc．により報告された５０．０ｍ²／ｇの値から変わっていない。これはｓＡＡＰＦ‐ｐＮＡをＣＰＧに加えるために用いた操作が多孔質構造にダメージを与えていないことを示唆している（平均径は４８６Åである）。例５表面加水分解アッセイＣＰＧ：ｓＡＡＰＦ‐ｐＮＡを用いると、酵素変種の吸着とＣＰＧ結合ペプチドの加水分解が単一実験で測定できる。少量の酵素変種ストック溶液を脱気された Tris 緩衝液及びＣＰＧ：ｓＡＡＰＦ‐ｐＮＡ含有のフラスコに加える。フラスコを９０分間にわたりリスト式シェーカー上で振盪させ、その間にシェーカーを様々な時間間隔で停止させる（例えば、吸着加水分解の初期段階では２分毎に ‐例えば最初の２０分間‐実験の最後では１０分毎に）。ＣＰＧ：ｓＡＡＰＦ‐ ｐＮＡを静置して、溶液をサンプリングする。実験操作と吸着及び加水分解の計算はいずれも前掲のBrode ら,1992 で記載されたようにして行う。すべての酵素は、自己分解に対する安定性についてモニターしたところ、この実験の過程で明らかな自己分解喪失を示さない。したがって、酵素吸着は溶液からの減少分を測定することにより調べることができる。初期酵素変種濃度と個々の各時点に測定された濃度との差異が、吸着された酵素変種の量を表す。表面から加水分解されたｐＮＡの量は、４１０ｎｍでサンプルの一部について吸光度読取りを行うことにより測定する。加水分解されたｐＮＡの全量は、サンプリングされた量とフラスコに残存する量とを加えることにより計算する。この値は、酵素が存在しないときにｐＨ８．６で Tris 緩衝液により加水分解されたｐＮＡの量を差引くことにより補正する。この塩基加水分解は、酵素の効力に応じて、全加水分解の７〜２９％である。例６可溶性基質速度論的分析可溶性基質ｓＡＡＰＦ‐ｐＮＡの加水分解速度は、ＤＵ‐７０分光光度計において４１０ｎｍで時間の関数として吸光度増加を測定することによりモニターする。酵素濃度は一定に保ち、６〜１０ナノモルの範囲内であるように調整するが、基質濃度は各速度測定毎に９０〜７００μＭｓＡＡＰＦ‐ｐＮＡと様々である。吸光度データポイントは９００秒間にわたり毎秒測り、データを LOTUS^TMスプレッドシート（Lotus Development Corporation,Cambridge,Massachusetts）に移す。速度パラメーターの分析は標準Lineweaver Burk 分析により行い、その場合にランの初期部分（通常、最初の１分間）のデータを直線的回帰曲線に合わせて、ｖ_oを求める。ｖ_o及びｓ_oデータを標準逆関数式にプロットして、Ｋ_M及びｋ_catを求める。Ｉ．ズブチリシンCarlsberg 変種例表面結合基質に対して減少した吸着性と増加した加水分解性を有する本発明のズブチリシンCarlsberg 変種は、下記表３〜３６で例示されている。特定の変異を表す上で、野生型に存在する本来のアミノ酸が最初に、位置番号が２番目に、置換アミノ酸が３番目に示されている。 II．クリーニング組成物本発明のもう１つの態様において、１種以上の酵素変種の有効量がタンパク質汚れ除去の必要な様々な表面をクリーニングする上で有用な組成物中に含有される。このようなクリーニング組成物には、形態上制限されない、硬質表面をクリーニングするための洗剤組成物（例えば、液体及び顆粒）；形態上制限されない、布帛をクリーニングするための洗剤組成物（例えば、顆粒、液体及び固形処方物）；皿洗い組成物（形態上制限されない）；形態上制限されないオーラルクリーニング組成物（例えば、歯磨剤、練歯磨剤及び洗口液処方物）；形態上制限されない義歯クリーニング組成物（例えば、液体、錠剤）；形態上制限されないコンタクトレンズクリーニング組成物（例えば、液体、錠剤）がある。クリーニング組成物は、前記ズブチリシンCarlsberg 変種に加えて、プロテアーゼ酵素と適合する１種以上のクリーニング組成物物質も含む。本明細書で用いられる“クリーニング組成物物質”という用語は、望まれるクリーニング組成物の具体的タイプと製品の形態（例えば、液体、顆粒、固形、スプレー、スティック、ペースト、ゲル）からみて選択されるいずれかの液体、固体又は気体物質を意味し、その物質は組成物で用いられるズブチリシンCarlsberg 変種とも適合しうるものである。クリーニング組成物物質の具体的選択はクリーニングされる表面物質、使用（例えば、洗剤使用）時のクリーニング条件からみて望まれる組成物の形態を考慮することにより容易に行われる。本明細書で用いられる“適合性 ”という用語は、プロテアーゼが通常の使用状況下で望まれるほど有効でなくなるような程度までクリーニング組成物物質がズブチリシンCarlsberg 変種のタンパク質分解活性を減少させないことを意味する。具体的なクリーニング組成物物質は以下で詳細に例示されている。本明細書で用いられる“酵素変種の有効量”とは、特定のクリーニング組成物で必要な酵素活性を出すために要される酵素変種の量に関する。このような有効量は当業者により容易に確認でき、用いられる具体的酵素変種、クリーニング適用例、クリーニング組成物の具体的組成と、液体又は乾燥（例えば、顆粒、固形）組成物が必要かどうかなどのような多くのファクターに基づいている。好ましくは、クリーニング組成物は本発明の１種以上の酵素変種を約０．０００１〜約１０％、更に好ましくは約０．００１〜約１％、更に一層好ましくは約０．０１〜約０．１％含有する。酵素変種が用いられた様々なクリーニング組成物のいくつかの例が、以下で更に詳細に記載されている。本明細書で用いられているすべての部、パーセンテージ及び比率は、他で指摘されないかぎり重量による。本発明で用いられる“非布帛クリーニング組成物”には、硬質表面クリーニング組成物、皿洗い組成物、オーラルクリーニング組成物、義歯クリーニング組成物及びコンタクトレンズクリーニング組成物がある。Ａ．硬質表面、皿及び布帛用のクリーニング組成物本発明の酵素変種は、高い起泡性及び良好な不溶性基質除去性が望まれる様々な洗剤組成物で用いることができる。このため、酵素変種は、完全に処方された硬質表面クリーナー、皿洗い組成物、布帛洗濯組成物などを提供するために、様々な慣用成分と共に用いることができる。このような組成物は液体、顆粒、固形物などの形態をとることができる。このような組成物は３０〜６０重量％もの界面活性剤を含有した最新の“濃縮”洗剤として処方してもよい。本クリーニング組成物は、場合により、好ましくは、様々なアニオン系、ノニオン系、双極性などの界面活性剤を含有することができる。このような界面活性剤は、典型的には組成物の約５〜約３５％のレベルで存在する。本発明で有用な界面活性剤の非制限例には、慣用的なＣ₁₁‐Ｃ₁₈アルキルベンゼンスルホネートと一級及びランダムアルキルサルフェート、式ＣＨ₃（ＣＨ₂）_x（ＣＨＯＳＯ₃ ^-Ｍ⁺）ＣＨ₃及びＣＨ₃（ＣＨ₂）_y （ＣＨＯＳＯ₃ ^-Ｍ⁺）ＣＨ₂ＣＨ₃のＣ₁₀‐Ｃ₁₈二級（２，３）アルキルサルフェート（式中ｘ及び（ｙ＋１）は少くとも約７、好ましくは少くとも約９の整数であり、Ｍは水溶性カチオン、特にナトリウムである）、Ｃ₁₀‐Ｃ₁₈アルキルアルコキシサルフェート（特に、ＥＯ１〜５エトキシサルフェート）、Ｃ₁₀‐Ｃ₁₈アルキルアルコキシカルボキシレート（特に、ＥＯ１〜５エトキシカルボキシレート）、Ｃ₁₀‐Ｃ₁₈アルキルポリグリコシド及びそれらの対応サルフェート化ポリグリコシド、Ｃ₁₂‐Ｃ₁₈α‐スルホネート化脂肪酸エステル、Ｃ₁₂‐Ｃ₁₈アルキル及びアルキルフェノールアルコキシレート（特に、エトキシレート及び混合エトキシ／プロポキシ）、Ｃ₁₂‐Ｃ₁₈ベタイン及びスルホベタイン（“スルタイン ”）、Ｃ₁₀‐Ｃ₁₈アミンオキシドなどがある。アルキルアルコキシサルフェート（ＡＥＳ）及びアルキルアルコキシカルボキシレート（ＡＥＣ）が本発明では好ましい（このような界面活性剤と前記アミンオキシド及び／又はベタインもしくはスルタイン界面活性剤との併用も、処方業者の希望に応じて好ましい）。他の慣用的で有用な界面活性剤は標準テキストに掲載されている。特に有用な界面活性剤には、参考のため本明細書に組み込まれる、１９９３年３月１６日付で発行されたConnorらの米国特許第５，１９４，６３９号明細書に開示されるＣ₁₀‐Ｃ₁₈ Ｎ‐メチルグルカミドがある。他の活性成分、キャリヤ、ヒドロトロープ、加工助剤、色素又は顔料、液体処方用溶媒などを含めて、洗剤クリーニング組成物で有用な様々な他の成分が本組成物に含有させうる。起泡性の一層の増加が望まれるならば、Ｃ₁₀‐Ｃ₁₆アルコールアミドのような起泡増進剤が典型的には約１〜約１０％レベルで組成物中に配合できる。Ｃ₁₀‐Ｃ₁₄モノエタノール及びジエタノールアミドがこのような起泡増進剤の典型的種類である。このような起泡増進剤と前記のアミンオキシド、ベタイン及びスルタインのような高起泡性補助界面活性剤との併用も有利である。所望であれば、ＭｇＣｌ₂、ＭｇＳＯ₄などのような可溶性マグネシウム塩が、起泡性を追加するために、典型的には約０．１〜約２％のレベルで添加される。本液体洗剤組成物は、キャリヤとして水及び他の溶媒を含有することができる。メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールで例示される低分子量一級又は二級アルコールが適切である。一価アルコールが界面活性剤を溶解させる上で好ましいが、約２〜約６の炭素原子と約２〜約６のヒドロキシ基を含むもののようなポリオール（例えば、１，３‐プロパンジオール、エチレングリコール、グリセリン及び1，２‐プロパンジオール）も使用できる。組成物はこのようなキャリヤを約５〜約９０％、典型的には約１０〜約５０％含有する。本洗剤組成物は、水性クリーニング操作で使用中に、洗浄水が約６．８〜約１１．０のｐＨを有するように処方されることが好ましい。このため、最終製品は典型的にはこの範囲で処方される。推奨される使用レベルでｐＨをコントロールするための技術には緩衝剤、アルカリ、酸などの使用があり、これは当業者に周知である。本発明の硬質表面クリーニング組成物及び布帛クリーニング組成物を処方するときに、処方業者は約５〜約５０重量％のレベルで様々なビルダーを用いたいと望むかもしれない。典型的ビルダーには１〜１０ミクロンゼオライト、ポリカルボキシレート、例えばシトレート及びオキシジサクシネート、積層シリケート、ホスフェートなどがある。他の慣用的ビルダーは標準処方集に掲載されている。同様に、処方業者はこのような組成物中にセルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼ及びプロテアーゼのような様々な追加酵素を、典型的には約０．００１〜約１重量％のレベルで用いたいと望むかもしれない。様々な洗浄及び布帛ケア酵素が洗濯洗剤業界で周知である。ペルカーボネート、ペルボレートなどのような様々な漂白化合物が、典型的には約１〜約１５重量％のレベルでこのような組成物中に使用できる。所望であれば、このような組成物はテトラアセチルエチレンジアミン、ノナノイルオキシベンゼンスルホネートなどのようなブリーチ活性剤も含有することができ、これらも当業界で知られている。使用レベルは、典型的には約１〜約１０重量％の範囲である。様々な汚れ放出剤、特にアニオン系オリゴエステルタイプ、様々なキレート化剤、特にアミノホスホネート及びエチレンジアミンジサクシネート、様々な土汚れ除去剤、特にエトキシル化テトラエチレンペンタミン、様々な分散剤、特にポリアクリレート及びポリアスパラテート、様々な増白剤、特にアニオン系増白剤、様々な起泡抑制剤、特にシリコーン及び二級アルコール、様々な布帛柔軟剤、特にスメクタイトクレーなどは、すべて約１〜約３５重量％範囲のレベルでこのような組成物に使用できる。標準処方集と公開特許では、このような慣用物質について多数の詳細な記載を含んでいる。酵素安定剤もクリーニング組成物に用いてよい。このような酵素安定剤にはプロピレングリコール（好ましくは、約１〜約１０％）、ギ酸ナトリウム（好ましくは、約０．１〜約１％）及びギ酸カルシウム（好ましくは、約０．１〜約１％）がある。１．硬質表面クリーニング組成物本発明で用いられる“硬質表面クリーニング組成物”とは、床、壁、浴室タイルなどのような硬質表面をクリーニングするための液体及び顆粒洗剤組成物に関する。本発明の硬質表面クリーニング組成物は、本発明の１種以上の酵素変種を有効量で、好ましくは組成物の約０．００１〜約１０重量％、更に好ましくは約０．０１〜約５％、更に一層好ましくは約０．０５〜約１％の活性酵素を含有する。１種以上の酵素変種を含有することに加えて、このような硬質表面クリーニング組成物は典型的には界面活性剤と水溶性金属イオン封鎖ビルダーを含有する。しかしながら、スプレーウィンドークリーナーのようなある特殊製品では界面活性剤が時には用いられないこともあり、その理由はそれらがガラス表面で薄膜状／すじ状残留物を形成することがあるためである。界面活性剤成分は存在するとき本組成物の０．１％と少量であるが、典型的には組成物は約０．２５〜約１０％、更に好ましくは約１〜約５％の界面活性剤を含有する。典型的には、組成物は約０．５〜約５０％、好ましくは約１〜約１０％の洗浄ビルダーを含有する。好ましくは、ｐＨは約８〜１２の範囲にあるべきである。水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム又は塩酸のような慣用的ｐＨ調整剤が、調整が必要ならば使用できる。溶媒も組成物に含有させてよい。有用な溶媒にはジエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノヘキシルエーテル、プロピレングリコールモノブチルエーテル、ジプロピレングリコールモノブチルエーテルのようなグリコールエーテルと、２，２，４−トリメチル‐１，３‐ペンタンジオール及び２‐エチル‐１，３‐ヘキサンジオールのようなジオールがあるが、それらに限定されない。用いられる場合、このような溶媒は典型的には約０．５〜約１５％、好ましくは約３〜約１１％のレベルで存在する。加えて、イソプロパノール又はエタノールのような高揮発性溶媒は、表面への組成物の“フルストレングス（full strength）”適用後に表面が洗い流されないとき表面から組成物の速い蒸発を促進するために、本組成物で用いることができる。用いられる場合、揮発性溶媒は典型的には組成物中に約２〜約１２％のレベルで存在する。本発明の硬質表面クリーニング組成物態様は、下記例で説明される。例７〜1２例７〜１０では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種がＴｈｒ５８Ａｓｎの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例１１〜１２では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種のいずれの組合せがＴｈｒ５８Ａｓｎ及びＴｈｒ５８Ｇｌｎ＋Ａｓｎ６１Ｇｌｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例１３〜１８例１３〜１６では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種がＶａｌ９４Ａｌａの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例１７〜１８では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種のいずれの組合せがＶａｌ９４Ａｌａ及びＬｅｕ１２５Ａｓｎ＋Ｇｌｙ１２６Ｐｒｏ＋Ｓｅｒ１２９Ｇｌｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。２．皿洗い組成物本発明のもう１つの態様において、皿洗い組成物は本発明の１種以上の酵素変種を含有している。本発明で用いられる“皿洗い組成物”とは、限定されないが顆粒及び液体形態を含めた、皿をクリーニングするためのすべての形態の組成物に関する。本発明の皿洗い組成物態様は下記例で説明されている。例１９〜２４例１９〜２２では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種がＧｌｙ１５３Ａｓｎの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例２３〜２４では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種のいずれの組合せがＧｌｙ１５３Ａｓｎ及びＡｌａ１８６Ａｓｐ＋Ｐｈｅ１８８Ｇｌｎの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。３．布帛クリーニング組成物本発明のもう１つの態様において、布帛クリーニング組成物は本発明の１種以上の酵素変種を含有している。本発明で用いられる“布帛クリーニング組成物” とは、限定されないが、顆粒、液体及び固形を含めた、布帛をクリーニングするためのすべての形態の洗剤組成物に関する。ａ．顆粒布帛クリーニング組成物本発明の顆粒布帛クリーニング組成物は、本発明の１種以上の酵素変種を有効量で、好ましくは組成物の約０．００１〜約１０重量％、更に好ましくは約０．００５〜約５％、更に好ましくは約０．０１〜約１％の活性酵素を含有する。１種以上の酵素変種に加えて、顆粒布帛クリーニング組成物は典型的には少くとも１種の界面活性剤、１種以上のビルダーと、一部の場合には漂白剤を含有している。本発明の顆粒布帛クリーニング組成物態様は下記例で説明されている。例２５〜２８例２５〜２６では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種がＰｒｏ２００Ａｓｎの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例２７〜２８では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種のいずれの組合せがＰｒｏ２００Ａｓｎ及びＧｌｙ２０３Ａｓｐ＋Ｔｙｒ２０５Ａｌａ＋Ｔｙｒ２０８Ｓｅｒの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例２９〜３２例２９〜３０では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種がＰｒｏ２００Ａｓｎ＋Ａｌａ２０２Ａｓｎ＋Ｖａｌ２０４Ｇｌｙ＋Ａｓｎ２１１Ａｓｐ＋Ｔｈｒ２１９Ｇｌｙの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例３１〜３２では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種のいずれの組合せがＰｒｏ２００Ａｓｎ＋Ａｌａ２０２Ａｓｎ＋Ｖａｌ２０４Ｇｌｙ＋Ａｓｎ２１１Ａｓｐ＋Ｔｈｒ２１９Ｇｌｙ及びＬｅｕ９５Ｇｌｙ＋Ｇｌｙ２０３Ｐｒｏの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例３３〜３６例３３〜３４では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種がＴｈｒ５８Ｇｌｎ＋Ａｓｐ５９Ｇｌｕ＋Ｌｅｕ２１６Ｇｌｎの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例３５〜３６では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種のいずれの組合せがＴｈｒ５８Ｇｌｎ＋Ａｓｐ５９Ｇｌｕ＋Ｌｅｕ２１６Ｇｌｎ及びＰｒｏ２００Ａｓｎ＋Ａｌａ２０２Ｇｌｎ＋Ｔｙｒ２０８Ｃｙｓ＋Ｔｈｒ２１０Ｐｒｏ＋Ｔｙｒ２１３Ａｓｎ＋Ａｌａ２１４Ａｓｎ＋Ｔｈｒ２１９Ｓｅｒの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例３７〜４０例３７〜３８では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種がＡｓｐ５９Ｇｌｕ＋Ｇｌｙ６０Ｐｒｏ＋Ｇｌｙ６２Ａｓｎ＋Ｇｌｙ６４Ｇｌの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例３９〜４０では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種のいずれの組合せがＡｓｐ５９Ｇｌｕ＋Ｇｌｙ６０Ｐｒｏ＋Ｇｌｙ６２Ａｓｎ＋Ｇｌｙ６４Ｇｌ及びＬｅｕ１２５Ａｌａの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例４１〜４２例４３〜４４例４５例４６例４７ｂ．液体布帛クリーニング組成物本発明の液体布帛クリーニング組成物は、本発明の１種以上の酵素変種を有効量で、好ましくは組成物の約０．００５〜約５重量％、更に好ましくは約０．０１〜約１％の活性酵素を含有する。このような液体布帛クリーニング組成物は、典型的にはアニオン系界面活性剤、脂肪酸、水溶性洗浄ビルダーと水を更に含有する。本発明の液体布帛クリーニング組成物態様は下記例で説明されている。例４８〜５２例４８〜５０では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種がＬｅｕ１２５Ａｌａ＋Ｇｌｙ１２６Ｇｌｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例５１〜５２では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種のいずれの組合せがＬｅｕ１２５Ａｌａ＋Ｇｌｙ１２６Ｇｌｕ及びＧｌｙ１５３Ｇｌｕ＋Ｉｌｅ１６４Ａｌａの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例５３〜５７例５３〜５５では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種がＰｈｅ１８８Ｓｅｒの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例５６〜５７では、特に表２１２で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種のいずれの組合せがＰｈｅ１８８Ｓｅｒ及びＡｌａ１８６Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ１８７Ｇｌｕ＋Ｐｈｅ１８８Ａｓｐの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例５８〜５９例５８及び５９の各々では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsb erg 変種がＴｈｒ５８Ｓｅｒ＋Ｓｅｒ１００Ａｓｐ＋Ｉｌｅ１６４Ｍｅｔ＋Ｔｙｒ２０５Ａｌａの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例６０〜６２ｃ．固形布帛クリーニング組成物手洗い汚れ布帛用に適した本発明の固形布帛クリーニング組成物は、本発明の１種以上の酵素変種を有効量で、好ましくは組成物の約０．００１〜約１０重量％、更に好ましくは約０．０１〜約１％で含有する。本発明の固形布帛クリーニング組成物態様は下記例で説明されている。例６３〜６６例６３〜６４では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種がＴｈｒ２０７Ｇｌｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例６５〜６６では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種のいずれの組合せがＴｈｒ２０７Ｇｌｕ及びＬｅｕ１２５Ｉｌｅ＋Ｓｅｒ１３１Ｇｌｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例６７〜７０例６７では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種がＰｒｏ２００Ｓｅｒ＋Ａｌａ２１４Ｇｌｙ＋Ａｓｎ２１７Ｇｌｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例６８では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種がＰｒｏ２００Ｓｅｒ＋Ａｌａ２１４Ｇｌｙ＋Ａｓｎ２１７Ｇｌｕ及びＧｌｙ１０１Ａｓｐ＋Ａｌａ１２８Ａｓｐ＋Ｓｅｒ１５５Ａｓｐ＋Ｓｅｒ１８７Ａｓｐ＋Ｔｈｒ２０７Ｇｌｙ＋Ｔｈｒ２１２Ｇｌｎの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例６９〜７０では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種のいずれの組合せがＶａｌ２０３Ｇｌｕ及びＧｌｙ１００Ｇｌｕ＋Ｉｌｅ１０７Ｓｅrの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。Ｂ．追加クリーニング組成物前記の硬質表面クリーニング、皿洗い及び布帛クリーニング組成物に加えて、本発明の１種以上の酵素変種も不溶性基質の加水分解が望まれる様々な他のクリーニング組成物中に配合してよい。このような追加クリーニング組成物にはオーラルクリーニング組成物、義歯クリーニング組成物及びコンタクトレンズクリーニング組成物があるが、それらに限定されない。１．オーラルクリーニング組成物本発明のもう１つの態様では、薬学上許容される量の本発明の１種以上の酵素変種が歯又は義歯からタンパク質汚れを除去する上で有用な組成物に含有される。本発明で用いられる“オーラルクリーニング組成物”とは、歯磨剤、練歯磨剤、歯磨ゲル、歯磨粉、洗口液、マウススプレー、マウスゲル、チューインガム、ロゼンジ、小包、錠剤、バイオゲル、予防ペースト、歯処理溶液などに関する。好ましくは、オーラルクリーニング組成物は組成物の約０．０００１〜約２０重量％、更に好ましくは約０．００１〜約１０％、更に一層好ましくは約０．０１〜約５％の本発明の１種以上の酵素変種と、薬学上許容されるキャリヤを含む。本明細書で用いられる“薬学上許容される”とは、その用語が表す薬物、薬剤又は不活性成分が妥当な利益／危険比で釣り合って過度の毒性、不適合性、不安定性、刺激、アレルギー反応などなくヒト及びそれより下等の動物の組織と接触する使用に適していることを意味する。典型的には、オーラルクリーニング組成物のオーラルクリーニング成分の薬学上許容されるオーラルクリーニングキャリヤ成分は、通常組成物の約５０〜約９９．９９重量％、好ましくは約６５〜約９９．９９％、更に好ましくは約６５〜約９９％である。本発明のオーラルクリーニング組成物に含有させてもよい薬学上許容されるキャリヤ成分と任意成分は、当業者に周知である。オーラルクリーニング組成物で有用な様々な組成タイプ、キャリヤ成分と任意成分は、１９９２年３月１７日付で発行されたSeibelの米国特許第５，０９６，７００号；１９９１年７月２日付で発行されたSampathkumarの米国特許第５，０２８，４１４号；１９９１年７月２日付で発行されたBenedict,Bush 及びSunberg の米国特許第５，０２８，４１５号明細書で開示されており、それらはすべて参考のため本明細書に組み込まれる。本発明のオーラルクリーニング組成物態様は下記例で説明されている。例７１〜７４例７１〜７４では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種がＴｈｒ２１２Ｇｌｎの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例７５〜７８例７５〜７８では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種がＶａｌ２０４Ａｓｎ＋Ｔｈｒ２１５Ａｓｎの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例７９〜８２例７９〜８２では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種がＴｈｒ６５Ａｓｐ＋Ｔｈｒ１３２Ｇｌｕ＋Ａｓｎ１５４Ａｓｐ＋Ｔｈｒ２１２Ｇｌｕ＋Ｌｅｕ２１６Ｇｌｙ＋Ａｓｎ２１７Ｓｅｒの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。例８３〜８６例８３〜８６では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種がＴｙｒ１０３Ａｌａの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。２．義歯クリーニング組成物本発明のもう１つの態様において、口腔外で義歯をクリーニングするための義歯クリーニング組成物は本発明の１種以上の酵素変種を含有する。このような義歯クリーニング組成物は、有効量の１種以上の酵素変種、好ましくは組成物の約０．０００１〜約５０重量％、更に好ましくは約０．００１〜約３５％、更に一層好ましくは約０．０１〜約２０％の１種以上の酵素変種と、義歯クリーニングキャリヤを含有する。発泡錠などのような様々な義歯クリーニング組成物フォーマットが当業界で周知であり（例えば、参考のため本明細書に組み込まれる、Yo ung の米国特許第５，０５５，３０５号明細書参照）、義歯からタンパク質汚れを除去する上で１種以上の酵素変種の配合に通常適している。本発明の義歯クリーニング組成物態様は下記例で説明されている。例８７〜９０例８７〜９０において、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種がＬｅｕ２１６Ｐｒｏの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。３．コンタクトレンズクリーニング組成物本発明のもう１つの態様において、コンタクトレンズクリーニング組成物は本発明の１種以上の酵素変種を含有する。このようなコンタクトレンズクリーニング組成物は、有効量の１種以上の酵素変種、好ましくは組成物の約０．０１〜約５０重量％、更に好ましくは約０．０１〜約２０％、更に一層好ましくは約１〜約５％の１種以上の酵素変種と、コンタクトレンズクリーニングキャリヤを含有する。錠剤、液体などのような様々なコンタクトレンズクリーニング組成物フォーマットが当業界で周知であり（例えば、１９８９年９月５日付で発行されたDa vies,Meaken 及びReesの米国特許第４，８６３，６２７号；１９８８年５月２４日付で再発行されたHuth,Lam及びKirai の米国特許Ｒｅ第３２，６７２号；１９８６年９月２日付で発行されたSchafer の米国特許第４，６０９，４９３号；１９８７年９月１日付で発行されたOgunbiyi及びSmith の米国特許第４，６９０，７９３号；１９８６年９月３０日付で発行されたOgunbiyi,Riedhammer 及びSm ith の米国特許第４，６１４，５４９号；１９８１年８月２５日付で発行された Ogata の米国特許第４，２８５，７３８号明細書参照；これら各々は参考のため本明細書に組み込まれる）、コンタクトレンズからタンパク質汚れを除去する上で本発明の１種以上の酵素変種の配合に通常適している。本発明のコンタクトレンズクリーニング組成物態様は下記例で説明されている。例９１〜９４例９１〜９４では、特に表３〜３６で列挙されたズブチリシンCarlsberg 変種がＡｌａ１９９Ｔｈｒ＋Ｖａｌ２０４Ｇｌｎの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。本発明の具体的態様が記載されてきたが、本発明の様々な変更及び修正が本発明の精神及び範囲から逸脱せずに行えることは当業者にとり明らかであろう。添付された請求の範囲では、本発明の範囲内に属するすべてのこのような修正をカバーしていると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ラビング，ドンネルトンアメリカ合衆国オハイオ州、シンシナチ、シード、ロード、8224

Claims

【特許請求の範囲】１．ズブチリシンCarlsberg 野生型アミノ酸配列の修飾されたアミノ酸配列を有したズブチリシンCarlsberg 変種であって（野生型アミノ酸配列は第一ループ領域、第二ループ領域、第三ループ領域、第四ループ領域、第五ループ領域及び第六ループ領域を含んでいる）、修飾されたアミノ酸配列が１以上のループ領域で１以上の位置に置換を含み、Ａ．置換が第一ループ領域で生じているとき、置換は５８、５９、６０、６１、６２、６４又は６５位のうち１以上で生じ、ａ．置換が５８位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、ｂ．置換が５９位で生じているとき、置換アミノ酸はＧｌｕであり、ｃ．置換が６０位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、ｄ．置換が６１位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ又はＳｅｒであり、ｅ．置換が６２位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、ｆ．置換が６４位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、及びｇ．置換が６５位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり；Ｂ．置換が第二ループ領域で生じているとき、置換は９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５又は１０６位のうち１以上で生じ、ａ．置換が９４位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ又はＴｈｒであり、ｂ．置換が９５位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌであり、ｃ．置換が９６位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒであり、ｄ．置換が９７位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕであり、ｅ．置換が９８位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕであり、ｆ．置換が９９位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、ｇ．置換が１００位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕであり、ｈ．置換が１０１位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、ｉ．置換が１０２位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕであり、ｊ．置換が１０３位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌであり、ｋ．置換が１０４位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕであり、ｌ．置換が１０５位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、及びｍ．置換が１０６位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌであり；Ｃ．置換が第三ループ領域で生じているとき、置換は１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１又は１３２位のうち１以上で生じ、ａ．置換が１２５位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌであり、ｂ．置換が１２６位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、ｃ．置換が１２７位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、ｄ．置換が１２８位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ又はＴｈｒであり、ｅ．置換が１２９位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕであり、ｆ．置換が１３０位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、ｇ．置換が１３１位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕであり、及びｈ．置換が１３２位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり；Ｄ．置換が第四ループ領域で生じているとき、置換は１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５又は１６６位のうち１以上で生じ、ａ．置換が１５３位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、ｂ．置換が１５４位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ又はＳｅｒであり、ｃ．置換が１５５位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕであり、ｄ．置換が１５６位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、ｅ．置換が１５７位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒであり、ｆ．置換が１５８位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕであり、ｇ．置換が１５９位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、ｈ．置換が１６０位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕであり、ｉ．置換が１６１位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、ｊ．置換が１６２位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ又はＳｅｒであり、ｋ．置換が１６３位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、ｌ．置換が１６４位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌであり、ｍ．置換が１６５位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、及びｎ．置換が１６６位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌであり；Ｅ．置換が第五ループ領域で生じているとき、置換は１８６、１８７、１８８、１８９又は１９０位のうち１以上で生じ、ａ．置換が１８６位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＴｈｒであり、ｂ．置換が１８７位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕであり、ｃ．置換が１８８位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、ｄ．置換が１８９位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕであり、及びｅ．置換が１９０位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕであり；Ｆ．置換が第六ループ領域で生じているとき、置換は１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８又は２１９位のうち１以上で生じ、ａ．置換が１９９位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ又はＴｈｒであり、ｂ．置換が２００位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであり、ｃ．置換が２０１位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、ｄ．置換が２０２位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ又はＴｈｒであり、ｅ．置換が２０３位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、ｆ．置換が２０４位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ又はＴｈｒであり、ｇ．置換が２０５位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌであり、ｈ．置換が２０６位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕであり、ｉ．置換が２０７位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、ｊ．置換が２０８位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌであり、ｋ．置換が２０９位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであり、ｌ．置換が２１０位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、ｍ．置換が２１１位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ又はＳｅｒであり、ｎ．置換が２１２位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、ｏ．置換が２１３位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌであり、ｐ．置換が２１４位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ又はＴｈｒであり、ｑ．置換が２１５位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、ｒ．置換が２１６位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙs、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌであり、ｓ．置換が２１７位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ又はＳｅｒであり、ｔ．置換が２１８位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、及びｕ．置換が２１９位で生じているとき、置換アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、それにより、ズブチリシンCarlsberg 変種は野生型ズブチリシンCarlsberg と比較して不溶性基質に対する減少した吸着性と増加した加水分解性を有していることを特徴とする、ズブチリシンCarlsberg 変種。２．１以上の置換が第一ループ領域で生じている、請求項１に記載のズブチリシンCarlsberg 変種。３．１以上の置換が第二ループ領域で生じている、請求項１に記載のズブチリシンCarlsberg 変種。４．１以上の置換が第三ループ領域で生じている、請求項１に記載のズブチリシンCarlsberg 変種。５．１以上の置換が第四ループ領域で生じている、請求項１に記載のズブチリシンCarlsberg 変種。６．１以上の置換が第五ループ領域で生じている、請求項１に記載のズブチリシンCarlsberg 変種。７．１以上の置換が第六ループ領域で生じている、請求項１に記載のズブチリシンCarlsberg 変種。８．硬質表面クリーニング組成物、皿洗い組成物、オーラルクリーニング組成物、義歯クリーニング組成物、コンタクトレンズクリーニング組成物及び布帛クリーニング組成物からなる群より選択されるクリーニング組成物であって、クリーニング組成物が請求項１〜７のいずれか一項に記載されたズブチリシン Carlsberg 変種とクリーニング組成物キャリヤを含んでなり；好ましくは、クリーニング組成物が硬質表面クリーニング組成物であるか、又はクリーニング組成物が布帛クリーニング組成物であり；好ましくは、組成物が組成物の少くとも約５重量％の界面活性剤と少くとも約５％のビルダーを含み；好ましくは、組成物が溶媒、緩衝剤、酵素、汚れ放出剤、土汚れ除去剤、分散剤、増白剤、起泡抑制剤、布帛柔軟剤、起泡増進剤、酵素安定剤、漂白剤、色素、香料及びそれらの混合物からなる群より選択されるクリーニング組成物物質を更に含んでなることを特徴とする、クリーニング組成物。９．請求項１〜７のいずれか一項に記載されたズブチリシンCarlsberg 変種についてコードする変異ズブチリシンCarlsberg 遺伝子。