JPH1143500A - 均一な単量体b−アミロイドペプチド - Google Patents
均一な単量体b−アミロイドペプチドInfo
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 均一な単量体b−アミロイドペプチドを提供
する。 【構成】 均一な単量体b−アミロイドペプチドの製造
及び精製方法であって、a)式: A−B−C (式中、Aは嵩高い親水性ペプチドであり、Bは選択的
開裂部位であり、そしてCはb−アミロイドペプチド又
は位置35においてメチオニン又はメチオニンスルホキ
シド残基の代わりにロイシン、セリン、グルタミン又は
グルタミン酸残基を有するb−アミロイドペプチドの点
突然変異体である)の融合タンパク質を含有する水溶液
を疎水性マトリックスカラムに通し、 b)開裂試薬又は酵素を含有する溶液を該カラムに流
し、そして c)生成したb−アミロイドペプチドを水性水混和性溶
媒で溶離する、ことを含んでなる方法。
する。 【構成】 均一な単量体b−アミロイドペプチドの製造
及び精製方法であって、a)式: A−B−C (式中、Aは嵩高い親水性ペプチドであり、Bは選択的
開裂部位であり、そしてCはb−アミロイドペプチド又
は位置35においてメチオニン又はメチオニンスルホキ
シド残基の代わりにロイシン、セリン、グルタミン又は
グルタミン酸残基を有するb−アミロイドペプチドの点
突然変異体である)の融合タンパク質を含有する水溶液
を疎水性マトリックスカラムに通し、 b)開裂試薬又は酵素を含有する溶液を該カラムに流
し、そして c)生成したb−アミロイドペプチドを水性水混和性溶
媒で溶離する、ことを含んでなる方法。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、疎水性ポリペプチド、
タンパク質又はペプチドを含有する融合タンパク質、そ
れを用いる疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチ
ドの製造方法、これら融合タンパク質をコードする遺伝
子、これら遺伝子を含有する発現ベクター、これら発現
ベクターで形質転換された微生物、並びに前記遺伝子、
発現ベクター及び形質転換微生物の作製方法に関する。
タンパク質又はペプチドを含有する融合タンパク質、そ
れを用いる疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチ
ドの製造方法、これら融合タンパク質をコードする遺伝
子、これら遺伝子を含有する発現ベクター、これら発現
ベクターで形質転換された微生物、並びに前記遺伝子、
発現ベクター及び形質転換微生物の作製方法に関する。
【0002】
【従来の技術】遺伝子技術によるハイブリッド遺伝子の
作製の可能性は、組換えタンパク質の作製に新たなルー
トを切り開いている。目的のタンパク質のコーディング
遺伝子配列をあるリガンドに対して高い親和性を有する
タンパク質断片(親和性ペプチド)のコーディング遺伝
子配列と連結することによって、該親和性ペプチドを用
いて1段階で目的の組換えタンパク質を融合タンパク質
の形で精製することが可能である。部位特異的変異誘発
法により、該親和性ペプチドと目的の組換えタンパク質
との連結点に特異的な化学又は酵素開裂部位を導入する
ことも可能であり、その結果、適当な親和性樹脂による
該融合タンパク質の精製後に、目的の組換えタンパク質
を化学又は酵素開裂により回収することができる。
作製の可能性は、組換えタンパク質の作製に新たなルー
トを切り開いている。目的のタンパク質のコーディング
遺伝子配列をあるリガンドに対して高い親和性を有する
タンパク質断片(親和性ペプチド)のコーディング遺伝
子配列と連結することによって、該親和性ペプチドを用
いて1段階で目的の組換えタンパク質を融合タンパク質
の形で精製することが可能である。部位特異的変異誘発
法により、該親和性ペプチドと目的の組換えタンパク質
との連結点に特異的な化学又は酵素開裂部位を導入する
ことも可能であり、その結果、適当な親和性樹脂による
該融合タンパク質の精製後に、目的の組換えタンパク質
を化学又は酵素開裂により回収することができる。
【0003】しかしながら、目的の組換えタンパク質の
回収は、該目的の組換えタンパク質もそのアミノ酸配列
内にかかる化学又は酵素開裂部位を含有する場合には、
極端に難しいことが分かる。かかる場合には、該目的の
組換えタンパク質はついには急速に分解されてしまう。
回収は、該目的の組換えタンパク質もそのアミノ酸配列
内にかかる化学又は酵素開裂部位を含有する場合には、
極端に難しいことが分かる。かかる場合には、該目的の
組換えタンパク質はついには急速に分解されてしまう。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】上記分解を阻止するた
め、本発明は、目的の組換えタンパク質を害することな
しに特異的な化学又は酵素開裂部位で選択的に開裂する
融合タンパク質及び方法を提供することを目的とする。
本発明の方法は、とりわけ、疎水性ポリペプチド、タン
パク質又はペプチドの製造に応用できる。
め、本発明は、目的の組換えタンパク質を害することな
しに特異的な化学又は酵素開裂部位で選択的に開裂する
融合タンパク質及び方法を提供することを目的とする。
本発明の方法は、とりわけ、疎水性ポリペプチド、タン
パク質又はペプチドの製造に応用できる。
【0005】
【課題を解決するための手段】より詳しくは、本発明
は、式: A−B−C (式中、Aは嵩高い親水性ペプチドであり、Bは選択的
開裂部位であり、そしてCは目的の疎水性ポリペプチ
ド、タンパク質又はペプチドである。)の融合タンパク
質に関する。
は、式: A−B−C (式中、Aは嵩高い親水性ペプチドであり、Bは選択的
開裂部位であり、そしてCは目的の疎水性ポリペプチ
ド、タンパク質又はペプチドである。)の融合タンパク
質に関する。
【0006】本発明による融合タンパク質に関連して用
いられる“嵩高い親水性ペプチド”という用語は、その
サイズと明確に構造化されたドメインのもとになる親水
性アミノ酸の含量とにより特徴付けられる親水性ペプチ
ドをいう。本発明による融合タンパク質の嵩高い親水性
ペプチドAは、a)該融合タンパク質の高発現を促進
し、b)疎水性マトリックスカラムの移動相に開裂部位
Cを露出させるという二重の機能を果たす。本発明によ
る融合タンパク質の好ましい嵩高い親水性ペプチドは、
式: (NANP)x (式中、xは10〜40であり、19が最も好まし
い。)のペプチド配列を有するペプチドである。
いられる“嵩高い親水性ペプチド”という用語は、その
サイズと明確に構造化されたドメインのもとになる親水
性アミノ酸の含量とにより特徴付けられる親水性ペプチ
ドをいう。本発明による融合タンパク質の嵩高い親水性
ペプチドAは、a)該融合タンパク質の高発現を促進
し、b)疎水性マトリックスカラムの移動相に開裂部位
Cを露出させるという二重の機能を果たす。本発明によ
る融合タンパク質の好ましい嵩高い親水性ペプチドは、
式: (NANP)x (式中、xは10〜40であり、19が最も好まし
い。)のペプチド配列を有するペプチドである。
【0007】選択的開裂部位としては、化学又は酵素開
裂部位が挙げられる。適する選択的酵素開裂部位として
は、プロテアーゼであるエンテロキナーゼ及び凝固因子
Xaによってそれぞれ特異的に認識され得るアミノ酸配
列−(Asp)n −Lys−(nは2、3又は4を表
す)又は−Ile−Glu−Gly−Arg−、トリプ
シンにより開裂されるアルギニン残基又はリシン残基、
リシルエンドペプチダーゼにより開裂されるリシン残
基、又はV8プロテアーゼにより開裂されるグルタミン
残基が挙げられる。適する選択的化学開裂部位として
は、3−ブロモ−3−メチル−2−(2−ニトロフェニ
ルメルカプト)−3H−インドールにより開裂されるト
リプトファン残基、2−ニトロソ−5−チオシアノ安息
香酸により開裂されるシステイン残基、それぞれ酸及び
ヒドロキシルアミンにより開裂され得るアミノ酸ジペプ
チドAsp−Pro又はAsn−Glyが挙げられ、臭
化シアン(CNBr)により特異的に開裂されるメチオ
ニン残基が好ましい。
裂部位が挙げられる。適する選択的酵素開裂部位として
は、プロテアーゼであるエンテロキナーゼ及び凝固因子
Xaによってそれぞれ特異的に認識され得るアミノ酸配
列−(Asp)n −Lys−(nは2、3又は4を表
す)又は−Ile−Glu−Gly−Arg−、トリプ
シンにより開裂されるアルギニン残基又はリシン残基、
リシルエンドペプチダーゼにより開裂されるリシン残
基、又はV8プロテアーゼにより開裂されるグルタミン
残基が挙げられる。適する選択的化学開裂部位として
は、3−ブロモ−3−メチル−2−(2−ニトロフェニ
ルメルカプト)−3H−インドールにより開裂されるト
リプトファン残基、2−ニトロソ−5−チオシアノ安息
香酸により開裂されるシステイン残基、それぞれ酸及び
ヒドロキシルアミンにより開裂され得るアミノ酸ジペプ
チドAsp−Pro又はAsn−Glyが挙げられ、臭
化シアン(CNBr)により特異的に開裂されるメチオ
ニン残基が好ましい。
【0008】本発明による融合タンパク質に関連して用
いられる“疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチ
ド”という用語は、水性緩衝液中30〜60%、好まし
くは約40%の有機溶媒の濃度で、例えば、水性緩衝液
中40%より高いエタノール濃度で逆相HPLCカラム
から溶出する疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプ
チドをいう。
いられる“疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチ
ド”という用語は、水性緩衝液中30〜60%、好まし
くは約40%の有機溶媒の濃度で、例えば、水性緩衝液
中40%より高いエタノール濃度で逆相HPLCカラム
から溶出する疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプ
チドをいう。
【0009】疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプ
チドとしては、例えば、表面抗原、リンフォカインレセ
プター、HIV−1及びHIV−2のエンベロープ及び
構造タンパク質、C型肝炎ウィルスのエンベロープ及び
構造タンパク質又は膜アンカー配列を有するあらゆるペ
プチドが挙げられる。好ましい疎水性ポリペプチド、タ
ンパク質又はペプチドは、配列: 1 42 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(配列番号1) を有するb−アミロイドペプチド(bA4−アミロイ
ド)、位置35においてメチオニン又はメチオニンスル
ホキシド残基の代わりにロイシン(配列番号3)、セリ
ン(配列番号4)、グルタミン(配列番号5)又はグル
タミン酸(配列番号6)残基を有するbA4−ペプチド
の点突然変異体、及び配列: 1 35 RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS (配列番号11) を有するHIV−1エンベロープペプチドである。
チドとしては、例えば、表面抗原、リンフォカインレセ
プター、HIV−1及びHIV−2のエンベロープ及び
構造タンパク質、C型肝炎ウィルスのエンベロープ及び
構造タンパク質又は膜アンカー配列を有するあらゆるペ
プチドが挙げられる。好ましい疎水性ポリペプチド、タ
ンパク質又はペプチドは、配列: 1 42 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(配列番号1) を有するb−アミロイドペプチド(bA4−アミロイ
ド)、位置35においてメチオニン又はメチオニンスル
ホキシド残基の代わりにロイシン(配列番号3)、セリ
ン(配列番号4)、グルタミン(配列番号5)又はグル
タミン酸(配列番号6)残基を有するbA4−ペプチド
の点突然変異体、及び配列: 1 35 RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS (配列番号11) を有するHIV−1エンベロープペプチドである。
【0010】本発明による融合タンパク質の嵩高い親水
性ペプチド及び選択的開裂部位は、疎水性ポリペプチ
ド、タンパク質又はペプチドのアミノ末端アミノ酸か、
カルボキシ末端アミノ酸のいずれかに連結することがで
きる。本発明による融合タンパク質は、好ましくは親和
性キャリヤー物質に結合する特異的配列を任意に含有し
てもよい。かかる配列の例は、少なくとも2つの隣接す
るヒスチジン残基を含有する配列である(この点に関し
てヨーロッパ特許出願公報第282042号を参照のこ
と)。かかる配列は、ニトリロトリ酢酸ニッケルキレー
ト樹脂に選択的に結合する(ホチュリ(Hochuli) 及びド
ベリ (Dobeli),Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368, 748 (1
987) ;ヨーロッパ特許第253303号)。従って、
かかる特異的配列を含有する本発明の融合タンパク質
は、他のポリペプチドから選択的に分けることができ
る。該特異的配列は、嵩高い親水性ペプチドのアミノ酸
配列か、疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチド
のアミノ酸配列のいずれかに連結することができる。
性ペプチド及び選択的開裂部位は、疎水性ポリペプチ
ド、タンパク質又はペプチドのアミノ末端アミノ酸か、
カルボキシ末端アミノ酸のいずれかに連結することがで
きる。本発明による融合タンパク質は、好ましくは親和
性キャリヤー物質に結合する特異的配列を任意に含有し
てもよい。かかる配列の例は、少なくとも2つの隣接す
るヒスチジン残基を含有する配列である(この点に関し
てヨーロッパ特許出願公報第282042号を参照のこ
と)。かかる配列は、ニトリロトリ酢酸ニッケルキレー
ト樹脂に選択的に結合する(ホチュリ(Hochuli) 及びド
ベリ (Dobeli),Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368, 748 (1
987) ;ヨーロッパ特許第253303号)。従って、
かかる特異的配列を含有する本発明の融合タンパク質
は、他のポリペプチドから選択的に分けることができ
る。該特異的配列は、嵩高い親水性ペプチドのアミノ酸
配列か、疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチド
のアミノ酸配列のいずれかに連結することができる。
【0011】本発明は、これら融合タンパク質をコード
する遺伝子、これら遺伝子を含有する発現ベクター、こ
れら発現ベクターで形質転換された微生物、並びに前記
遺伝子、発現ベクター及び形質転換微生物の作製方法に
も関する。本発明による融合タンパク質の作製は、文献
に記載されている組換えDNA技術の方法に従って行う
ことができる。好ましくは、まず、目的の疎水性ポリペ
プチド、タンパク質又はペプチドをコードする核酸配列
を合成し、次いでこれを嵩高い親水性ペプチド及び選択
的開裂部位をコードする核酸配列に連結する。
する遺伝子、これら遺伝子を含有する発現ベクター、こ
れら発現ベクターで形質転換された微生物、並びに前記
遺伝子、発現ベクター及び形質転換微生物の作製方法に
も関する。本発明による融合タンパク質の作製は、文献
に記載されている組換えDNA技術の方法に従って行う
ことができる。好ましくは、まず、目的の疎水性ポリペ
プチド、タンパク質又はペプチドをコードする核酸配列
を合成し、次いでこれを嵩高い親水性ペプチド及び選択
的開裂部位をコードする核酸配列に連結する。
【0012】こうして得られたハイブリッド遺伝子の発
現ベクター内への組み込みも、自体公知の方法で行われ
る。これに関連して、マニアチス (Maniatis) ら ("Mol
ecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 19
82) 及びサムブルーク (Sambrook) ら ("Molecular Clo
ning-A Laboratory Manual", 2nd. ed., Cold SpringHa
rbor Laboratory, 1989) のテキストを参考にすること
ができる。
現ベクター内への組み込みも、自体公知の方法で行われ
る。これに関連して、マニアチス (Maniatis) ら ("Mol
ecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 19
82) 及びサムブルーク (Sambrook) ら ("Molecular Clo
ning-A Laboratory Manual", 2nd. ed., Cold SpringHa
rbor Laboratory, 1989) のテキストを参考にすること
ができる。
【0013】本発明による融合タンパク質の発現方法も
自体公知であり、前記のテキストに詳細に記載されてい
る。それらは次の操作を含む。 a)前述のハイブリッド遺伝子を発現制御配列に機能で
きるように結合した発現ベクターで適当な宿主生物(大
腸菌が有利である)を形質転換し; b)こうして得られた宿主生物を適当な成育条件下で培
養し;そして c)該宿主生物から目的の融合タンパク質を抽出して単
離する。
自体公知であり、前記のテキストに詳細に記載されてい
る。それらは次の操作を含む。 a)前述のハイブリッド遺伝子を発現制御配列に機能で
きるように結合した発現ベクターで適当な宿主生物(大
腸菌が有利である)を形質転換し; b)こうして得られた宿主生物を適当な成育条件下で培
養し;そして c)該宿主生物から目的の融合タンパク質を抽出して単
離する。
【0014】宿主生物としては、グラム陰性及びグラム
陽性菌、例えば、大腸菌及び枯草菌の菌株が挙げられ
る。大腸菌株M15が特に好ましい本発明の宿主生物で
ある。しかしながら、この大腸菌株に加えて、他の一般
に入手し易い大腸菌株、例えば、大腸菌294(ATC
C No.3144)、大腸菌RR1(ATCC No.313
43)及び大腸菌W3110(ATCC No.2732
5)も用いることができる。
陽性菌、例えば、大腸菌及び枯草菌の菌株が挙げられ
る。大腸菌株M15が特に好ましい本発明の宿主生物で
ある。しかしながら、この大腸菌株に加えて、他の一般
に入手し易い大腸菌株、例えば、大腸菌294(ATC
C No.3144)、大腸菌RR1(ATCC No.313
43)及び大腸菌W3110(ATCC No.2732
5)も用いることができる。
【0015】本発明による融合タンパク質は、目的の疎
水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチドを害するこ
となしに特異的な化学又は酵素開裂部位での選択的な開
裂を可能にする。疎水性マトリックスカラムの固相中に
目的の疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチドが
拡散することで、本発明による融合タンパク質を、目的
の疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチドを隠す
ように配向させることができる。一方、嵩高い親水性ペ
プチドは、選択的開裂部位を移動水性相に露出させる。
これにより、選択的開裂によって嵩高い親水性ペプチド
が除去され、目的の疎水性ポリペプチド、タンパク質又
はペプチドだけがカラムに結合したままになる。次い
で、有機溶媒の添加によって目的の疎水性ポリペプチ
ド、タンパク質又はペプチドを溶出させることができ
る。
水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチドを害するこ
となしに特異的な化学又は酵素開裂部位での選択的な開
裂を可能にする。疎水性マトリックスカラムの固相中に
目的の疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチドが
拡散することで、本発明による融合タンパク質を、目的
の疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチドを隠す
ように配向させることができる。一方、嵩高い親水性ペ
プチドは、選択的開裂部位を移動水性相に露出させる。
これにより、選択的開裂によって嵩高い親水性ペプチド
が除去され、目的の疎水性ポリペプチド、タンパク質又
はペプチドだけがカラムに結合したままになる。次い
で、有機溶媒の添加によって目的の疎水性ポリペプチ
ド、タンパク質又はペプチドを溶出させることができ
る。
【0016】従って、本発明は、目的の疎水性ポリペプ
チド、タンパク質又はペプチドを製造及び精製する方法
であって、次の工程: a)本発明による融合タンパク質を含有する水溶液を疎
水性マトリックスカラムに通し、 b)開裂試薬又は酵素を含有する溶液を該カラムに流
し、そして c)生成した目的の疎水性ポリペプチド、タンパク質又
はペプチドを水性水混和性溶媒で溶離するを含む方法も
提供する。
チド、タンパク質又はペプチドを製造及び精製する方法
であって、次の工程: a)本発明による融合タンパク質を含有する水溶液を疎
水性マトリックスカラムに通し、 b)開裂試薬又は酵素を含有する溶液を該カラムに流
し、そして c)生成した目的の疎水性ポリペプチド、タンパク質又
はペプチドを水性水混和性溶媒で溶離するを含む方法も
提供する。
【0017】疎水性マトリックスカラムとしては、シア
ノプロピル、シクロヘキシル、フェニル、オクチル又は
オクタデシル基結合シリカマトリックスカラムが挙げら
れる。本発明の好ましい実施態様においては、逆相高速
液体クロマトグラフィー(HPLC)条件下でRP−1
8(オクタデシル結合シリカ微粒子カラム)が用いられ
る。
ノプロピル、シクロヘキシル、フェニル、オクチル又は
オクタデシル基結合シリカマトリックスカラムが挙げら
れる。本発明の好ましい実施態様においては、逆相高速
液体クロマトグラフィー(HPLC)条件下でRP−1
8(オクタデシル結合シリカ微粒子カラム)が用いられ
る。
【0018】本発明による融合タンパク質を負荷する前
に、疎水性マトリックスカラムを水性緩衝液で平衡化す
るのが好都合である。平衡化緩衝液は、変性剤又はカオ
トロピック剤(例えば、グアニジン−HCl、尿素)又
は界面活性剤(例えば、トリトン)を含有してもよい。
かかる変性剤、カオトロピック剤又は界面活性剤を添加
すると、水溶液に溶解させるのが極端に難しい本発明に
よる融合タンパク質であっても、問題なく操作すること
ができる。
に、疎水性マトリックスカラムを水性緩衝液で平衡化す
るのが好都合である。平衡化緩衝液は、変性剤又はカオ
トロピック剤(例えば、グアニジン−HCl、尿素)又
は界面活性剤(例えば、トリトン)を含有してもよい。
かかる変性剤、カオトロピック剤又は界面活性剤を添加
すると、水溶液に溶解させるのが極端に難しい本発明に
よる融合タンパク質であっても、問題なく操作すること
ができる。
【0019】本発明による融合タンパク質は、やはり変
性剤又は界面活性剤、例えば、グアニジン−HCl、尿
素又はトリトンを含有してもよい水性緩衝液中で、疎水
性マトリックスカラムにかける。開裂は、開裂試薬又は
酵素を含有する水性緩衝液をカラムに流すことによって
行われる。最適な緩衝液組成は用いる開裂試薬又は酵素
に依存し、ケースバイケースで決めるのが好都合であ
る。
性剤又は界面活性剤、例えば、グアニジン−HCl、尿
素又はトリトンを含有してもよい水性緩衝液中で、疎水
性マトリックスカラムにかける。開裂は、開裂試薬又は
酵素を含有する水性緩衝液をカラムに流すことによって
行われる。最適な緩衝液組成は用いる開裂試薬又は酵素
に依存し、ケースバイケースで決めるのが好都合であ
る。
【0020】目的の疎水性ポリペプチド、タンパク質又
はペプチドの溶出は、水性水混和性溶媒の勾配を用いて
行うことができる。この目的に適する水混和性溶媒に
は、n−プロパノール、2−プロパノール、エタノー
ル、メタノール、tert−ブタノールの如きアルカノール
又はジオキサンの如き環状エーテルが含まれる。最適な
溶出条件は、精製する目的の疎水性ポリペプチド、タン
パク質又はペプチド、疎水性マトリックス、カラム寸法
等に依存し、ケースバイケースで決めるのが好都合であ
る。
はペプチドの溶出は、水性水混和性溶媒の勾配を用いて
行うことができる。この目的に適する水混和性溶媒に
は、n−プロパノール、2−プロパノール、エタノー
ル、メタノール、tert−ブタノールの如きアルカノール
又はジオキサンの如き環状エーテルが含まれる。最適な
溶出条件は、精製する目的の疎水性ポリペプチド、タン
パク質又はペプチド、疎水性マトリックス、カラム寸法
等に依存し、ケースバイケースで決めるのが好都合であ
る。
【0021】目的の疎水性ポリペプチド、タンパク質又
はペプチドの製造及び精製を可能にする前述の方法はバ
ッチ式で行うこともできる。その場合、本発明による融
合タンパク質を水性緩衝液中で疎水性マトリックスに吸
着させる。開裂は、開裂試薬又は酵素を含有する水性緩
衝液と共に該疎水性マトリックスをインキュベートする
ことによって行われる。目的の疎水性ポリペプチドは、
開裂試薬又は酵素及び嵩高い親水性ペプチドを除去した
後に、水性水混和性溶媒と共に該疎水性マトリックスを
インキュベートすることによって得ることができる。
はペプチドの製造及び精製を可能にする前述の方法はバ
ッチ式で行うこともできる。その場合、本発明による融
合タンパク質を水性緩衝液中で疎水性マトリックスに吸
着させる。開裂は、開裂試薬又は酵素を含有する水性緩
衝液と共に該疎水性マトリックスをインキュベートする
ことによって行われる。目的の疎水性ポリペプチドは、
開裂試薬又は酵素及び嵩高い親水性ペプチドを除去した
後に、水性水混和性溶媒と共に該疎水性マトリックスを
インキュベートすることによって得ることができる。
【0022】本発明の好ましい特定の態様においては、
目的の疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチドの
製造及び精製を可能にするこの新規な方法を用いて、単
量体形態にあるb−アミロイドペプチドを均一になるま
で精製する。単量体b−アミロイドペプチドを均一なペ
プチドとして製造するための特定の方法は、次の工程の
組み合わせを含む。 a)目的の疎水性ペプチドがb−アミロイドペプチドで
ある本発明による融合タンパク質を含有する水溶液を疎
水性マトリックスカラムに通し、 b)開裂試薬又は酵素を含有する溶液を該カラムに流
し、 c)水性水混和性溶媒で溶出することにより単量体b−
アミロイドペプチドを得、 d)該単量体b−アミロイドペプチドを蒸留水で希釈し
た後に凍結乾燥し、そして e)所望により、凍結乾燥後に該単量体b−アミロイド
ペプチドを精製して最大の均一性を達成する。
目的の疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチドの
製造及び精製を可能にするこの新規な方法を用いて、単
量体形態にあるb−アミロイドペプチドを均一になるま
で精製する。単量体b−アミロイドペプチドを均一なペ
プチドとして製造するための特定の方法は、次の工程の
組み合わせを含む。 a)目的の疎水性ペプチドがb−アミロイドペプチドで
ある本発明による融合タンパク質を含有する水溶液を疎
水性マトリックスカラムに通し、 b)開裂試薬又は酵素を含有する溶液を該カラムに流
し、 c)水性水混和性溶媒で溶出することにより単量体b−
アミロイドペプチドを得、 d)該単量体b−アミロイドペプチドを蒸留水で希釈し
た後に凍結乾燥し、そして e)所望により、凍結乾燥後に該単量体b−アミロイド
ペプチドを精製して最大の均一性を達成する。
【0023】単量体b−アミロイドペプチドを均一なペ
プチドとして製造するための該特定方法を行うに際して
は、目的の疎水性ペプチドがb−アミロイドペプチドで
ある融合タンパク質を含有する、好ましくは変性剤(例
えば、グアニジン−HCl又は尿素)を含有する水性緩
衝液中の溶液を疎水性マトリックスカラムに通す。好ま
しい実施態様においては、逆相高速液体クロマトグラフ
ィー(HPLC)条件下でRP−18(オクタデシル結
合シリカ微粒子カラム)を用いる。このために適する他
のカラムには、シアノプロピル、シクロヘキシル、フェ
ニル又はオクチルカラム(ビーズサイズ=5〜30m
m)が含まれる。これらカラムは、商標バイダック(Vyd
ac) 又はヌクレオシル(Nucleosil) の下でバイダック社
又はマーシャリー・ナーゲル (Macherey-Nagel) 社から
市販されている商品である。開裂は、開裂試薬又は酵素
を含有する水性緩衝液をカラムに流すことによって行わ
れる。好ましい実施態様においては、開裂は、緩衝化し
た水性水混和性溶媒中の臭化シアンをカラムに流すこと
によって行われる。単量体b−アミロイドペプチドの溶
出は、水性水混和性溶媒の勾配、好ましくはエタノール
勾配を用いて行われる。単量体b−アミロイドペプチド
を蒸留水で、例えば、蒸留水を含有する容器の中に溶出
液を落とすことによって即座に希釈してから凍結乾燥す
る。最大の均一性を達成するため、所望により、凍結乾
燥後に単量体b−アミロイドペプチドを既知の方法によ
り、例えば、分取ゲル電気泳動により又はサイズ排除ク
ロマトグラフィーにより精製してもよい。好ましい実施
態様においては、(大量の単量体b−アミロイドペプチ
ドを単離するためには)分取未変性ゲル電気泳動及び
(少量の単量体b−アミロイドペプチドを単離するため
には)HPLC条件下でのゲル濾過が適用される。
プチドとして製造するための該特定方法を行うに際して
は、目的の疎水性ペプチドがb−アミロイドペプチドで
ある融合タンパク質を含有する、好ましくは変性剤(例
えば、グアニジン−HCl又は尿素)を含有する水性緩
衝液中の溶液を疎水性マトリックスカラムに通す。好ま
しい実施態様においては、逆相高速液体クロマトグラフ
ィー(HPLC)条件下でRP−18(オクタデシル結
合シリカ微粒子カラム)を用いる。このために適する他
のカラムには、シアノプロピル、シクロヘキシル、フェ
ニル又はオクチルカラム(ビーズサイズ=5〜30m
m)が含まれる。これらカラムは、商標バイダック(Vyd
ac) 又はヌクレオシル(Nucleosil) の下でバイダック社
又はマーシャリー・ナーゲル (Macherey-Nagel) 社から
市販されている商品である。開裂は、開裂試薬又は酵素
を含有する水性緩衝液をカラムに流すことによって行わ
れる。好ましい実施態様においては、開裂は、緩衝化し
た水性水混和性溶媒中の臭化シアンをカラムに流すこと
によって行われる。単量体b−アミロイドペプチドの溶
出は、水性水混和性溶媒の勾配、好ましくはエタノール
勾配を用いて行われる。単量体b−アミロイドペプチド
を蒸留水で、例えば、蒸留水を含有する容器の中に溶出
液を落とすことによって即座に希釈してから凍結乾燥す
る。最大の均一性を達成するため、所望により、凍結乾
燥後に単量体b−アミロイドペプチドを既知の方法によ
り、例えば、分取ゲル電気泳動により又はサイズ排除ク
ロマトグラフィーにより精製してもよい。好ましい実施
態様においては、(大量の単量体b−アミロイドペプチ
ドを単離するためには)分取未変性ゲル電気泳動及び
(少量の単量体b−アミロイドペプチドを単離するため
には)HPLC条件下でのゲル濾過が適用される。
【0024】本発明は、該新規な方法により得られる純
粋で均一な毒性単量体b−アミロイドペプチドにも関す
る。本発明によるb−アミロイドペプチドは、アルツハ
イマー薬品のスクリーニングに用いることができる。目
的の疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチドの製
造及び精製を可能にするこの新規な方法は、単量体b−
アミロイドペプチドの精製に用いられる条件に類似した
条件を用いてHIV−1エンベロープペプチド(配列番
号11)を均一になるまで精製するのにも用いられる
(実施例7)。
粋で均一な毒性単量体b−アミロイドペプチドにも関す
る。本発明によるb−アミロイドペプチドは、アルツハ
イマー薬品のスクリーニングに用いることができる。目
的の疎水性ポリペプチド、タンパク質又はペプチドの製
造及び精製を可能にするこの新規な方法は、単量体b−
アミロイドペプチドの精製に用いられる条件に類似した
条件を用いてHIV−1エンベロープペプチド(配列番
号11)を均一になるまで精製するのにも用いられる
(実施例7)。
【0025】該新規な方法で得られるHIV−1エンベ
ロープペプチド(配列番号11)をHIV感染を診断す
るのに用いることができる。ここまで本発明を一般的に
説明してきたので、次の実施例は本発明を詳細に説明す
ることを意図したものであり、如何なる意味においても
それによって本発明を限定することを意図したものでは
ない。
ロープペプチド(配列番号11)をHIV感染を診断す
るのに用いることができる。ここまで本発明を一般的に
説明してきたので、次の実施例は本発明を詳細に説明す
ることを意図したものであり、如何なる意味においても
それによって本発明を限定することを意図したものでは
ない。
【0026】これら実施例は、添付の図面を参照しなが
ら読めばより充分に理解できる。次の記号がこれら図面
に用いられている:‘N25OPSN25OP29’
は、調節可能なプロモーター/オペレーター要素N25
OPSN25OP29を表し;‘RBSII’は、合成リ
ボソーム結合部位RBSIIを表し;‘〔His〕6 ’、
‘〔NANP〕19’及び‘amy’は、本発明の6xH
is−NANP−アミロイド融合タンパク質をコードす
る遺伝子を表し;‘bla’、‘cat’、‘lac
I’及び‘neo’は、それぞれβ−ラクタマーゼ、ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、la
cリプレッサー及びネオマイシンホスホトランスフェラ
ーゼを表し;‘to’、‘TE’及び‘T1’は、ファ
ージλの転写終結因子to、ファージT7の転写終結因
子TE、及び大腸菌rrnBオペロンの転写終結因子T
1を表し;‘repl.’は、プラスミドpBR322
及びpREP4の複製領域を表す。
ら読めばより充分に理解できる。次の記号がこれら図面
に用いられている:‘N25OPSN25OP29’
は、調節可能なプロモーター/オペレーター要素N25
OPSN25OP29を表し;‘RBSII’は、合成リ
ボソーム結合部位RBSIIを表し;‘〔His〕6 ’、
‘〔NANP〕19’及び‘amy’は、本発明の6xH
is−NANP−アミロイド融合タンパク質をコードす
る遺伝子を表し;‘bla’、‘cat’、‘lac
I’及び‘neo’は、それぞれβ−ラクタマーゼ、ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、la
cリプレッサー及びネオマイシンホスホトランスフェラ
ーゼを表し;‘to’、‘TE’及び‘T1’は、ファ
ージλの転写終結因子to、ファージT7の転写終結因
子TE、及び大腸菌rrnBオペロンの転写終結因子T
1を表し;‘repl.’は、プラスミドpBR322
及びpREP4の複製領域を表す。
【0027】図1は、プラスミドpREP4の模式図で
ある。図2は、プラスミドp6xHis−NANP−M
et−Amyの模式図である。図3は、融合タンパク質
6xHis−NANP−Met−Amy(配列番号8)
をコードするプラスミドp6xHis−NANP−Me
t−Amy(配列番号7)の核酸配列の一部を示す。こ
の配列には、図2に示した幾つかの制限酵素の認識配列
が示されている。示したアミノ酸配列は、融合タンパク
質6xHis−NANP−Met−Amyの配列を三文
字表記で表しており、bA4ペプチドに対応するアミノ
酸に番号を付してある。
ある。図2は、プラスミドp6xHis−NANP−M
et−Amyの模式図である。図3は、融合タンパク質
6xHis−NANP−Met−Amy(配列番号8)
をコードするプラスミドp6xHis−NANP−Me
t−Amy(配列番号7)の核酸配列の一部を示す。こ
の配列には、図2に示した幾つかの制限酵素の認識配列
が示されている。示したアミノ酸配列は、融合タンパク
質6xHis−NANP−Met−Amyの配列を三文
字表記で表しており、bA4ペプチドに対応するアミノ
酸に番号を付してある。
【0028】図4は、プラスミドpB/E1−6xHi
s−NANP−Met−huAmyの模式図である。
s−NANP−Met−huAmyの模式図である。
【0029】図5は、融合タンパク質6xHis−NA
NP−Met−huAmy(配列番号10)をコードす
るプラスミドpB/E1−6xHis−NANP−Me
t−huAmy(配列番号9)の核酸配列の一部を示
す。この配列には、図4に示した幾つかの制限酵素の認
識配列が示されている。示したアミノ酸配列は、融合タ
ンパク質6xHis−NANP−Met−huAmyの
配列を三文字表記で表しており、bA4ペプチドに対応
するアミノ酸に番号を付してある。該図の下方部分に
は、核酸配列及びそれによりコードされるアミノ酸が示
してあり、これによって融合タンパク質6xHis−N
ANP−Met−huAmy〔M35E〕をコードする
プラスミドpB/E1−6xHis−NANP−Met
−huAmy〔M35E〕、融合タンパク質6xHis
−NANP−Met−huAmy〔M35L〕をコード
するプラスミドpB/E1−6xHis−NANP−M
et−huAmy〔M35L〕、融合タンパク質6xH
is−NANP−Met−huAmy〔M35Q〕をコ
ードするプラスミドpB/E1−6xHis−NANP
−Met−huAmy〔M35Q〕、及び融合タンパク
質6xHis−NANP−Met−huAmy〔M35
S〕をコードするプラスミドpB/E1−6xHis−
NANP−Met−huAmy〔M35S〕は、プラス
ミドpB/E1−6xHis−NANP−Met−hu
Amyと異なっている。
NP−Met−huAmy(配列番号10)をコードす
るプラスミドpB/E1−6xHis−NANP−Me
t−huAmy(配列番号9)の核酸配列の一部を示
す。この配列には、図4に示した幾つかの制限酵素の認
識配列が示されている。示したアミノ酸配列は、融合タ
ンパク質6xHis−NANP−Met−huAmyの
配列を三文字表記で表しており、bA4ペプチドに対応
するアミノ酸に番号を付してある。該図の下方部分に
は、核酸配列及びそれによりコードされるアミノ酸が示
してあり、これによって融合タンパク質6xHis−N
ANP−Met−huAmy〔M35E〕をコードする
プラスミドpB/E1−6xHis−NANP−Met
−huAmy〔M35E〕、融合タンパク質6xHis
−NANP−Met−huAmy〔M35L〕をコード
するプラスミドpB/E1−6xHis−NANP−M
et−huAmy〔M35L〕、融合タンパク質6xH
is−NANP−Met−huAmy〔M35Q〕をコ
ードするプラスミドpB/E1−6xHis−NANP
−Met−huAmy〔M35Q〕、及び融合タンパク
質6xHis−NANP−Met−huAmy〔M35
S〕をコードするプラスミドpB/E1−6xHis−
NANP−Met−huAmy〔M35S〕は、プラス
ミドpB/E1−6xHis−NANP−Met−hu
Amyと異なっている。
【0030】図6は、未変性アガロースゲル電気泳動に
よるbA4分析の結果示す。この分析は、ベックマンか
らの“セラム・プロテイン・エレクトロフォレーシス・
システム・パラゴン (Serum Protein Electrophoresis
System Paragon) ”で、該供給業者の推奨するところに
従って行った。それぞれ8μg(2μlH2O中)のペプ
チドを加えた。染色はクマシーブリリアントブルーで3
時間行い、脱染色は10%酢酸、45%メタノール及び
45%水で行った。サンプルは、実験の直前に蒸留水で
調製する(f)か又は2日間熟成させた(a)。試験し
たサンプルを以下に掲げる。
よるbA4分析の結果示す。この分析は、ベックマンか
らの“セラム・プロテイン・エレクトロフォレーシス・
システム・パラゴン (Serum Protein Electrophoresis
System Paragon) ”で、該供給業者の推奨するところに
従って行った。それぞれ8μg(2μlH2O中)のペプ
チドを加えた。染色はクマシーブリリアントブルーで3
時間行い、脱染色は10%酢酸、45%メタノール及び
45%水で行った。サンプルは、実験の直前に蒸留水で
調製する(f)か又は2日間熟成させた(a)。試験し
たサンプルを以下に掲げる。
【0031】ゲルa ゲルb レーン1 ヒトbA4洗浄1f レーン1 M35S bA4洗浄1f レーン2 ヒトbA4洗浄2f レーン2 M35S bA4洗浄2f レーン3 ヒトbA4洗浄3f レーン3 M35S bA4洗浄3f レーン4 ヒトbA4洗浄4f レーン4 M35S bA4洗浄4f レーン5 ヒトbA4洗浄4a レーン5 M35S bA4洗浄4a レーン6 スタンダードBSA2mg レーン6 スタンダードBSA10mg レーン7 M35L bA4洗浄1f レーン7 M35Q bA4洗浄1f レーン8 M35L bA4洗浄2f レーン8 M35Q bA4洗浄2f レーン9 M35L bA4洗浄3f レーン9 M35Q bA4洗浄3f レーン10 M35L bA4洗浄3a レーン10 ラットbA4
【0032】ゲルcは、点突然変異体M35QbA4と
M35EbA4を比較した結果を示す。点突然変異体M
35EbA4は、ベックマンゲル上で高い移動性をもた
らす過剰の負電荷を含有している(レーン8:M35E
bA4;レーン9:M35QbA4)。開裂後にM35
EbA4をM35QbA4と混合する(レーン1)か、
又はM35QbA4を含有する融合タンパク質とM35
EbA4を含有する融合タンパク質とを混合して本発明
の方法に従って開裂する(レーン:3、4、5及び6
(洗浄1、2、3及び4))と、明確な分離が認めら
れ、単量体bA4の存在を示している。
M35EbA4を比較した結果を示す。点突然変異体M
35EbA4は、ベックマンゲル上で高い移動性をもた
らす過剰の負電荷を含有している(レーン8:M35E
bA4;レーン9:M35QbA4)。開裂後にM35
EbA4をM35QbA4と混合する(レーン1)か、
又はM35QbA4を含有する融合タンパク質とM35
EbA4を含有する融合タンパク質とを混合して本発明
の方法に従って開裂する(レーン:3、4、5及び6
(洗浄1、2、3及び4))と、明確な分離が認めら
れ、単量体bA4の存在を示している。
【0033】図7は、サイズ排除カラムでのbA4クロ
マトグラフィーの結果を示す。それぞれ250mlの画
分を取り、未変性電気泳動により分析した。レーン1は
該カラムに適用したbA4であり、レーン2〜10はピ
ーク画分である。bA4のサイズを確認するために用い
たマーカータンパク質は次の通りである。 血清アルブミン (MW=65000;保持時間=19.89分)、 卵白アルブミン (MW=45000;保持時間=20.10分)、 ラクトアルブミン (MW=14200;保持時間=21.43分)及び インシュリン (MW= 5734;保持時間=21.68分)。
マトグラフィーの結果を示す。それぞれ250mlの画
分を取り、未変性電気泳動により分析した。レーン1は
該カラムに適用したbA4であり、レーン2〜10はピ
ーク画分である。bA4のサイズを確認するために用い
たマーカータンパク質は次の通りである。 血清アルブミン (MW=65000;保持時間=19.89分)、 卵白アルブミン (MW=45000;保持時間=20.10分)、 ラクトアルブミン (MW=14200;保持時間=21.43分)及び インシュリン (MW= 5734;保持時間=21.68分)。
【0034】22.54分の保持時間は、約4500ダル
トンのMWを有する単量体を指し示している。これは、
光散乱データ及びイファンチス法(イファンチス (D.A.
Yphantis), Annals of the N.Y. Acad. Sci. 88, 586-
601 (1960))による超遠心分離実験と一致している。
トンのMWを有する単量体を指し示している。これは、
光散乱データ及びイファンチス法(イファンチス (D.A.
Yphantis), Annals of the N.Y. Acad. Sci. 88, 586-
601 (1960))による超遠心分離実験と一致している。
【0035】
【実施例】実施例1 融合タンパク質6xHis−NANP−Met−Amy
の作製に用いる発現プラスミド 融合タンパク質6xHis−NANP−Met−Amy
の作製のために発現プラスミドp6xHis−NANP
−Met−Amy(図2及び3を参照)を用いた。プラ
スミドpREP4及びp6xHis−NANP−Met
−Amyで形質転換した大腸菌M15細胞を、ブダペス
ト条約に従って、ブラウンシュバイグ,BRDのドイツ
微生物収集所(the Deutsche Sammlung von Mikroorgan
ismen:DSM)に、1993年5月18日に、受託番号
DSM8310の下に寄託した。
の作製に用いる発現プラスミド 融合タンパク質6xHis−NANP−Met−Amy
の作製のために発現プラスミドp6xHis−NANP
−Met−Amy(図2及び3を参照)を用いた。プラ
スミドpREP4及びp6xHis−NANP−Met
−Amyで形質転換した大腸菌M15細胞を、ブダペス
ト条約に従って、ブラウンシュバイグ,BRDのドイツ
微生物収集所(the Deutsche Sammlung von Mikroorgan
ismen:DSM)に、1993年5月18日に、受託番号
DSM8310の下に寄託した。
【0036】実施例2 融合タンパク質6xHis−NANP−Met−huA
myの作製に用いる発現プラスミド 融合タンパク質6xHis−NANP−Met−huA
myの作製のために発現プラスミドpB/E1−6xH
is−NANP−Met−huAmy(図4及び5を参
照)を用いた。プラスミドpREP4及びpB/E1−
6xHis−NANP−Met−huAmyで形質転換
した大腸菌M15細胞を、ブダペスト条約に従って、ブ
ラウンシュバイグ,BRDのドイツ微生物収集所(DS
M)に、1993年5月18日に、受託番号DSM83
11の下に寄託した。
myの作製に用いる発現プラスミド 融合タンパク質6xHis−NANP−Met−huA
myの作製のために発現プラスミドpB/E1−6xH
is−NANP−Met−huAmy(図4及び5を参
照)を用いた。プラスミドpREP4及びpB/E1−
6xHis−NANP−Met−huAmyで形質転換
した大腸菌M15細胞を、ブダペスト条約に従って、ブ
ラウンシュバイグ,BRDのドイツ微生物収集所(DS
M)に、1993年5月18日に、受託番号DSM83
11の下に寄託した。
【0037】実施例3 融合タンパク質6xHis−NANP−Met−huA
my〔M35L〕、6xHis−NANP−Met−h
uAmy〔M35Q〕、6xHis−NANP−Met
−huAmy〔M35S〕、及び6xHis−NANP
−Met−huA my〔M35E〕の作製に用いる発現
プラスミド 融合タンパク質6xHis−NANP−Met−huA
my〔M35L〕、6xHis−NANP−Met−h
uAmy〔M35Q〕、6xHis−NANP−Met
−huAmy〔M35S〕及び6xHis−NANP−
Met−huAmy〔M35E〕の作製のために、bA
4アミロイドペプチドのアミノ酸35をコードするヌク
レオチドだけがプラスミドpB/E1−6xHis−N
ANP−Met−huAmyと異なる発現プラスミドp
B/E1−6xHis−NANP−Met−huAmy
〔M35L〕、pB/E1−6xHis−NANP−M
et−huAmy〔M35Q〕、pB/E1−6xHi
s−NANP−Met−huAmy〔M35S〕及びp
B/E1−6xHis−NANP−Met−huAmy
〔M35E〕(図5を参照)をそれぞれ用いた。プラス
ミドpREP4とpB/E1−6xHis−NANP−
Met−huAmy〔M35L〕、pREP4とpB/
E1−6xHis−NANP−Met−huAmy〔M
35Q〕、pREP4とpB/E1−6xHis−NA
NP−Met−huAmy〔M35S〕、及びpREP
4とpB/E1−6xHis−NANP−Met−hu
Amy〔M35E〕でそれぞれ形質転換した大腸菌M1
5細胞を、ブダペスト条約に従って、ブラウンシュバイ
グ,BRDのドイツ微生物収集所(DSM)に、199
3年5月18日に、それぞれ受託番号DSM8313、
DSM8314、DSM8315及びDSM8312の
下に寄託した。
my〔M35L〕、6xHis−NANP−Met−h
uAmy〔M35Q〕、6xHis−NANP−Met
−huAmy〔M35S〕、及び6xHis−NANP
−Met−huA my〔M35E〕の作製に用いる発現
プラスミド 融合タンパク質6xHis−NANP−Met−huA
my〔M35L〕、6xHis−NANP−Met−h
uAmy〔M35Q〕、6xHis−NANP−Met
−huAmy〔M35S〕及び6xHis−NANP−
Met−huAmy〔M35E〕の作製のために、bA
4アミロイドペプチドのアミノ酸35をコードするヌク
レオチドだけがプラスミドpB/E1−6xHis−N
ANP−Met−huAmyと異なる発現プラスミドp
B/E1−6xHis−NANP−Met−huAmy
〔M35L〕、pB/E1−6xHis−NANP−M
et−huAmy〔M35Q〕、pB/E1−6xHi
s−NANP−Met−huAmy〔M35S〕及びp
B/E1−6xHis−NANP−Met−huAmy
〔M35E〕(図5を参照)をそれぞれ用いた。プラス
ミドpREP4とpB/E1−6xHis−NANP−
Met−huAmy〔M35L〕、pREP4とpB/
E1−6xHis−NANP−Met−huAmy〔M
35Q〕、pREP4とpB/E1−6xHis−NA
NP−Met−huAmy〔M35S〕、及びpREP
4とpB/E1−6xHis−NANP−Met−hu
Amy〔M35E〕でそれぞれ形質転換した大腸菌M1
5細胞を、ブダペスト条約に従って、ブラウンシュバイ
グ,BRDのドイツ微生物収集所(DSM)に、199
3年5月18日に、それぞれ受託番号DSM8313、
DSM8314、DSM8315及びDSM8312の
下に寄託した。
【0038】実施例4 融合タンパク質の醗酵及び精製 醗酵 p6xHis−NANP−Met−Amy、pB/E1
−6xHis−NANP−Met−huAmy、pB/
E1−6xHis−NANP−Met−huAmy〔M
35L〕、pB/E1−6xHis−NANP−Met
−huAmy〔M35Q〕、pB/E1−6xHis−
NANP−Met−huAmy〔M35S〕及びpB/
E1−6xHis−NANP−Met−huAmy〔M
35E〕それぞれを、既にプラスミドpREP4を含有
する大腸菌M15細胞の中に標準的方法(サムブルーク
ら,前記文献)により形質転換した。該形質転換細胞
を、100mg/lアンピシリン及び25mg/lカナ
マイシンを含有するスーパー(Super) 培地(ストゥバー
(Stuber) ら, Immunological Methods, eds. レフコビ
ッツ(Lefkovits) 及びパーニス (Pernis), Academic Pr
ess, Inc., Vol.IV, 121-152 (1990) )中、100L醗
酵器内で37℃で成育させた。600nmにおける光学
密度約1.0で、IPTGを2mMの最終濃度になるよう
に添加した。37℃で更に3時間経過後、遠心分離によ
り細胞を採取した。代表的醗酵実験において、少なくと
も3gの組換え融合タンパク質を含有する約500gの
バイオマスを得た。
−6xHis−NANP−Met−huAmy、pB/
E1−6xHis−NANP−Met−huAmy〔M
35L〕、pB/E1−6xHis−NANP−Met
−huAmy〔M35Q〕、pB/E1−6xHis−
NANP−Met−huAmy〔M35S〕及びpB/
E1−6xHis−NANP−Met−huAmy〔M
35E〕それぞれを、既にプラスミドpREP4を含有
する大腸菌M15細胞の中に標準的方法(サムブルーク
ら,前記文献)により形質転換した。該形質転換細胞
を、100mg/lアンピシリン及び25mg/lカナ
マイシンを含有するスーパー(Super) 培地(ストゥバー
(Stuber) ら, Immunological Methods, eds. レフコビ
ッツ(Lefkovits) 及びパーニス (Pernis), Academic Pr
ess, Inc., Vol.IV, 121-152 (1990) )中、100L醗
酵器内で37℃で成育させた。600nmにおける光学
密度約1.0で、IPTGを2mMの最終濃度になるよう
に添加した。37℃で更に3時間経過後、遠心分離によ
り細胞を採取した。代表的醗酵実験において、少なくと
も3gの組換え融合タンパク質を含有する約500gの
バイオマスを得た。
【0039】精製 0.1Mリン酸水素二ナトリウムを含有する2.5Lの6M
グアニジン・HCl(pH8)を細胞に添加して24時
間攪拌した。遠心分離により粗細胞破片を除去してか
ら、0.3mmメンブランを用いるクロス−フロー濾過に
より上澄み液を更に澄明にした。次いで、濾液中に含ま
れるタンパク質をNi−NTAカラム(5cm×24c
m,流速20ml/分)に吸着させた。混入している大
腸菌タンパク質を、まず8M尿素(pH7.5)で洗浄す
ることによって除去した。溶出は8M尿素(pH4)で
行った。SDS−PAGEによりクロマトグラムをモニ
ターし、融合タンパク質を含有する画分をプールした。
そのプールの小部分をEDTAと混合し、水に対して透
析することによって脱塩し、凍結乾燥してから電子スプ
レー式マススペクトルにより分析した(表1)。
グアニジン・HCl(pH8)を細胞に添加して24時
間攪拌した。遠心分離により粗細胞破片を除去してか
ら、0.3mmメンブランを用いるクロス−フロー濾過に
より上澄み液を更に澄明にした。次いで、濾液中に含ま
れるタンパク質をNi−NTAカラム(5cm×24c
m,流速20ml/分)に吸着させた。混入している大
腸菌タンパク質を、まず8M尿素(pH7.5)で洗浄す
ることによって除去した。溶出は8M尿素(pH4)で
行った。SDS−PAGEによりクロマトグラムをモニ
ターし、融合タンパク質を含有する画分をプールした。
そのプールの小部分をEDTAと混合し、水に対して透
析することによって脱塩し、凍結乾燥してから電子スプ
レー式マススペクトルにより分析した(表1)。
【0040】
【表1】 表1:融合タンパク質の特性 ──────────────────────────────────── 融合タンパク質 100L醗酵器当た 理論質量 電子スプレー式MS りの精製収量(g) による平均質量 ──────────────────────────────────── ヒトWT 3.0 13817 13820 ヒトMut.M35S 5.5 13773 13776 ヒトMut.M35L 5.7 13799 13802 ヒトMut.M35Q 4.5 13814 13817 ヒトMut.M35E 6.0 13813 試験せず ラットWT 6.0 13724 13728 ──────────────────────────────────── WT=野生型、Mut=突然変異体、例えば、M35S(位置35におけるMet がSerに変異している)
【0041】実施例5 1〜42b−アミロイドペプチドを生成する融合タンパ
ク質の開裂 まず、半分取RP−18HPLC(バイダック (Vida
c), 仕様218TP152010、250mm×10m
m)カラムを8M尿素(pH4)で2ml/分の流速で
平衡化した。次いで、8M尿素(pH4)中に400m
gの融合タンパク質を含有するNTA溶出液の小部分を
1ml/分の流速でカラムに汲み上げた。次いで、カラ
ムを8M尿素(pH4)で2ml/分の流速で洗浄し
た。カラム出口での吸光度がベースラインに達するま
で、2ml/分の流速の水で尿素を洗い落とした。20
%エタノール、40%ギ酸及び40%水からなる溶液中
の45mg/mlCNBrを、22℃で0.5ml/分の
流速で該カラムに24時間流すことによって開裂を行っ
た。次いで、0.1M EDTAを2ml/分の流速で該
カラムに流し、CNBrと遊離したMRGSHHHHH
HGS−(NANP)19−RSMとを、0.05%トリフ
ルオロ酢酸で2.0ml/分の流速で洗い落とした。時間
を区切って設定された次のエタノール勾配を用いて、1
〜42残基b−アミロイドペプチドを2ml/分の流速
で溶出させた:(分/エタノール(%))0/0、40
/40、45/50、50/65、55/100、60
/100、65/0。
ク質の開裂 まず、半分取RP−18HPLC(バイダック (Vida
c), 仕様218TP152010、250mm×10m
m)カラムを8M尿素(pH4)で2ml/分の流速で
平衡化した。次いで、8M尿素(pH4)中に400m
gの融合タンパク質を含有するNTA溶出液の小部分を
1ml/分の流速でカラムに汲み上げた。次いで、カラ
ムを8M尿素(pH4)で2ml/分の流速で洗浄し
た。カラム出口での吸光度がベースラインに達するま
で、2ml/分の流速の水で尿素を洗い落とした。20
%エタノール、40%ギ酸及び40%水からなる溶液中
の45mg/mlCNBrを、22℃で0.5ml/分の
流速で該カラムに24時間流すことによって開裂を行っ
た。次いで、0.1M EDTAを2ml/分の流速で該
カラムに流し、CNBrと遊離したMRGSHHHHH
HGS−(NANP)19−RSMとを、0.05%トリフ
ルオロ酢酸で2.0ml/分の流速で洗い落とした。時間
を区切って設定された次のエタノール勾配を用いて、1
〜42残基b−アミロイドペプチドを2ml/分の流速
で溶出させた:(分/エタノール(%))0/0、40
/40、45/50、50/65、55/100、60
/100、65/0。
【0042】b−アミロイドペプチドを含有する幅広い
ピークが45分から60分の間に現れている。該ペプチ
ドが単量体であるためには、(例えば、200mlのH2
Oを含有する攪拌したビーカー中に溶出液を落とすこと
により)蒸留水で即座に希釈して即座に凍結乾燥するこ
とが重要であった。得られた粉末をW1と命名した。か
なりの量のb−アミロイドペプチドがカラム内に残存し
たので、上記の手順を用いて溶出を3回繰り返し、サン
プルW2、W3及びW4を得た。これらサンプルを純度
(表2)及び単量体bA4の量(図6)について試験し
た。該ペプチドの正確な化学構造を、電子スプレー式マ
ススペクトル(表3)、アミノ酸分析及びアミノ末端配
列決定(表3)によって確認した。
ピークが45分から60分の間に現れている。該ペプチ
ドが単量体であるためには、(例えば、200mlのH2
Oを含有する攪拌したビーカー中に溶出液を落とすこと
により)蒸留水で即座に希釈して即座に凍結乾燥するこ
とが重要であった。得られた粉末をW1と命名した。か
なりの量のb−アミロイドペプチドがカラム内に残存し
たので、上記の手順を用いて溶出を3回繰り返し、サン
プルW2、W3及びW4を得た。これらサンプルを純度
(表2)及び単量体bA4の量(図6)について試験し
た。該ペプチドの正確な化学構造を、電子スプレー式マ
ススペクトル(表3)、アミノ酸分析及びアミノ末端配
列決定(表3)によって確認した。
【0043】
【表2】 表2:1〜42b−アミロイドペプチドの製造 ──────────────────────────────────── ペプチド 試験回数 洗浄回数 生成した質量(mg) 純度(%) ──────────────────────────────────── ラットWT 4 1 100±14 90±2 (配列番号2) 2 28±8 89±2 3/4 9±3 90±1 ヒトWT 3 1 96±23 79±9 (配列番号1) 2 52±10 73±5 3 32±9 78±4 4 15±8 86±5 ヒトM35S 3 1 71±13 80±8 (配列番号4) 2 31±5 74±2 3 18±7 83±2 4 2±7 88±2 ヒトM35L 3 1 59±15 72±8 (配列番号3) 2 23±9 71±4 3 8±3 78±3 ヒトM35Q 4 1 37±4 70±2 (配列番号5) 2 10±5 82±3 ヒトM35E 1 1 95 試験せず (配列番号6) 2 68 試験せず 3 46 試験せず 4 31 試験せず ────────────────────────────────────
【0044】純度はアミノ酸分析に基づくものであり、
融合タンパク質の含量はGluに対するAspの比によ
り求めている。純粋な1〜42b−アミロイドペプチド
は4Gluと4Asp残基を有し、純粋な融合タンパク
質は4Gluに対し42Aspの比率を有する。
融合タンパク質の含量はGluに対するAspの比によ
り求めている。純粋な1〜42b−アミロイドペプチド
は4Gluと4Asp残基を有し、純粋な融合タンパク
質は4Gluに対し42Aspの比率を有する。
【0045】
【表3】 表3:1〜42b−アミロイドペプチドの同定 ──────────────────────────────────── サンプル マススペクトル エドマン分解 理論値 実測値 10〜15サイクル ──────────────────────────────────── ヒトWT 4515.1 4531** DAEFRHDSGYEVHHQ ヒトM35S 4471.0 4472 DAEFRHDSGY ヒトM35L 4497.1 4498 DAEFRHDSGY ヒトM35Q 4512.0 4512 試験せず ヒトM35E 4513.0 4512 試験せず ラットWT 4417.0 4435** DAEFGHDSGF ──────────────────────────────────── **ヒトWT及びラットWTのメチオニンが、開裂操作の間にメチオニンスルホ キシドに変換した。
【0046】実施例6 単量体1〜42bA4の精製 小スケール法 1mgのb4Aを含有するサンプルをLKBウルトロパ
ック (UltroPac) HPLCカラム(直径:7.5mm、長
さ:600mm、流速0.5ml/分、緩衝液:200m
Mグリシンを含有する12mMトリス(ヒドロキシメチ
ル)アミノメタン(pH7.8))にかけた。b4Aは鋭
いピークで現れ、該ピーク画分は図7に示すアガロース
電気泳動ゲルでクマシーブルーのバンドを含有した。光
散乱実験からは高分子量型(凝集体又は繊維)の存在は
示されず、同一条件下でクロマトグラフィーにかけた較
正スタンダードから約4500の分子量であることが示
された。これはb4Aが単量体として存在していること
を示すものである。
ック (UltroPac) HPLCカラム(直径:7.5mm、長
さ:600mm、流速0.5ml/分、緩衝液:200m
Mグリシンを含有する12mMトリス(ヒドロキシメチ
ル)アミノメタン(pH7.8))にかけた。b4Aは鋭
いピークで現れ、該ピーク画分は図7に示すアガロース
電気泳動ゲルでクマシーブルーのバンドを含有した。光
散乱実験からは高分子量型(凝集体又は繊維)の存在は
示されず、同一条件下でクロマトグラフィーにかけた較
正スタンダードから約4500の分子量であることが示
された。これはb4Aが単量体として存在していること
を示すものである。
【0047】分取スケール法 バイオラッドからの“連続溶出電気泳動システムモデル
491プレプセル (Continuous Elution Electrophores
is system Model 491 Prep Cell)”を用いた。未変性不
連続アクリルアミドゲルは、0.375Mトリス(ヒドロ
キシメチル)アミノメタン(pH8.8)中の4%アクリ
ルアミド/2.7%N,N'−メチレンビスアクリルアミド分
離ゲルからなり、長さ3cm及び直径37mmを有し、
20mm直径の冷却管を備えたものであった。
491プレプセル (Continuous Elution Electrophores
is system Model 491 Prep Cell)”を用いた。未変性不
連続アクリルアミドゲルは、0.375Mトリス(ヒドロ
キシメチル)アミノメタン(pH8.8)中の4%アクリ
ルアミド/2.7%N,N'−メチレンビスアクリルアミド分
離ゲルからなり、長さ3cm及び直径37mmを有し、
20mm直径の冷却管を備えたものであった。
【0048】スタッキングゲルは、0.125Mトリス
(ヒドロキシメチル)アミノメタン(pH6.8)中の4
%アクリルアミド/2.7%N,N'−メチレンビスアクリル
アミドからなり、長さ2cmを有した。泳動緩衝液は、
25mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/0.
2Mグリシン(pH8.3)であった。溶出には、同じ緩
衝液を流速0.75ml/分で用いた。概して洗浄2、3
及び4から得られる45mgのb4Aペプチドを7ml
のH2O及び1mlのグリセロール中に溶解させた。12
ワット(一定,500V及び40mAで制限)で電気泳
動を行い、代表的な泳動では4時間を要した。代表的な
泳動の結果を図7に示す。
(ヒドロキシメチル)アミノメタン(pH6.8)中の4
%アクリルアミド/2.7%N,N'−メチレンビスアクリル
アミドからなり、長さ2cmを有した。泳動緩衝液は、
25mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/0.
2Mグリシン(pH8.3)であった。溶出には、同じ緩
衝液を流速0.75ml/分で用いた。概して洗浄2、3
及び4から得られる45mgのb4Aペプチドを7ml
のH2O及び1mlのグリセロール中に溶解させた。12
ワット(一定,500V及び40mAで制限)で電気泳
動を行い、代表的な泳動では4時間を要した。代表的な
泳動の結果を図7に示す。
【0049】実施例7 1〜35HIV−1ペプチドの精製 単量体1〜42bA4を含有する融合タンパク質の調製
及び精製について記載した方法(実施例1〜4)と同じ
方法によって調製及び精製した融合タンパク質MRGS
(H)6GS(NANP)19RSMRILAVERYLK
DQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS
(配列番号12)400mgをバイダックRP−18カ
ラム(仕様218TP152010、250mm×10
mm)に負荷し、1〜42bA4タンパク質の開裂につ
いて記載した条件(実施例5)と同じ条件を用いて開裂
した。約20〜30mgの凍結乾燥粉末が得られた。こ
の粉末を電子スプレー分析法により分析した。1〜35
HIV−1ペプチド(配列番号11)に対応する390
2±2Daのピークが検出された。
及び精製について記載した方法(実施例1〜4)と同じ
方法によって調製及び精製した融合タンパク質MRGS
(H)6GS(NANP)19RSMRILAVERYLK
DQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS
(配列番号12)400mgをバイダックRP−18カ
ラム(仕様218TP152010、250mm×10
mm)に負荷し、1〜42bA4タンパク質の開裂につ
いて記載した条件(実施例5)と同じ条件を用いて開裂
した。約20〜30mgの凍結乾燥粉末が得られた。こ
の粉末を電子スプレー分析法により分析した。1〜35
HIV−1ペプチド(配列番号11)に対応する390
2±2Daのピークが検出された。
【0050】
【0051】配列番号:1 配列の長さ:42 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:N−末端 配列
【0052】
【化1】
【0053】配列番号:2 配列の長さ:42 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:N−末端 配列
【0054】
【化2】
【0055】配列番号:3 配列の長さ:42 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:N−末端 配列
【0056】
【化3】
【0057】配列番号:4 配列の長さ:42 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:N−末端 配列
【0058】
【化4】
【0059】配列番号:5 配列の長さ:42 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:N−末端 配列
【0060】
【化5】
【0061】配列番号:6 配列の長さ:42 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:N−末端 配列
【0062】
【化6】
【0063】配列番号:7 配列の長さ:520 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号:CDS 存在位置:115..516 他の情報:/産物=“アミロイドタンパク質AA” 配列
【0064】
【化7】
【0065】配列番号:8 配列の長さ:133 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:タンパク質 配列
【0066】
【化8】
【0067】配列番号:9 配列の長さ:520 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号:CDS 存在位置:115..516 他の情報:/産物=“アミロイドタンパク質AA” 配列
【0068】
【化9】
【0069】配列番号:10 配列の長さ:133 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:タンパク質 配列
【0070】
【化10】
【0071】配列番号:11 配列の長さ:35 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列
【0072】
【化11】
【0073】配列番号:12 配列の長さ:126 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:タンパク質 配列
【0074】
【化12】
【図1】プラスミドpREP4の模式図である。
【図2】プラスミドp6xHis−NANP−Met−
Amyの模式図である。
Amyの模式図である。
【図3】融合タンパク質6xHis−NANP−Met
−Amy(配列番号:8)をコードするプラスミドp6
xHis−NANP−Met−Amy(配列番号:7)
の核酸配列の一部を示す。
−Amy(配列番号:8)をコードするプラスミドp6
xHis−NANP−Met−Amy(配列番号:7)
の核酸配列の一部を示す。
【図4】プラスミドpB/E1−6xHis−NANP
−Met−huAmyの模式図である。
−Met−huAmyの模式図である。
【図5】融合タンパク質6xHis−NANP−Met
−huAmy(配列番号:10)をコードするプラスミ
ドpB/E1−6xHis−NANP−Met−huA
my(配列番号:9)の核酸配列の一部を示す。該図の
下方部分に、プラスミドpB/E1−6xHis−NA
NP−Met−huAmyとは異なる核酸配列及びそれ
によりコードされるアミノ酸を示す。
−huAmy(配列番号:10)をコードするプラスミ
ドpB/E1−6xHis−NANP−Met−huA
my(配列番号:9)の核酸配列の一部を示す。該図の
下方部分に、プラスミドpB/E1−6xHis−NA
NP−Met−huAmyとは異なる核酸配列及びそれ
によりコードされるアミノ酸を示す。
【図6】未変性アガロースゲル電気泳動によるbA4分
析の結果示す。
析の結果示す。
【図7】サイズ排除カラムでのbA4クロマトグラフィ
ーの結果を示す。それぞれの画分を未変性電気泳動によ
り分析した。レーン1は該カラムに適用したbA4であ
り、レーン2〜10はピーク画分である。
ーの結果を示す。それぞれの画分を未変性電気泳動によ
り分析した。レーン1は該カラムに適用したbA4であ
り、レーン2〜10はピーク画分である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI C12P 21/02 ZNA C12N 15/00 A //(C12N 1/21 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19) (72)発明者 ニコラス ドレガー スイス国 シーエイチ─4056 バーゼル ミュルハオサーシュトラーセ 70 (72)発明者 ゲルダ フーバー トロットマン スイス国 シーエイチ─4247 グリンデル ホーレンシュトラーセ 211 (72)発明者 ペーター ヤコブ スイス国 シーエイチ─4153 ライナッハ ランデラーシュトラーセ 4 (72)発明者 ディートリッヒ スチューバー ドイツ連邦共和国 ディー−79639 グレ ンツァッハ−ヴィーレン,バンドヴェーク 9
Claims (4)
- 【請求項1】 均一な単量体b−アミロイドペプチド。
- 【請求項2】 位置35においてメチオニン又はメチオ
ニンスルホキシド残基の代わりにロイシン(配列番号
3)、セリン(配列番号4)、グルタミン(配列番号
5)又はグルタミン酸(配列番号6)残基を有する、請
求項1記載の単量体b−アミロイドペプチド。 - 【請求項3】 アルツハイマー薬品のスクリーニングの
ための、請求項1又は2記載の単量体b−アミロイドペ
プチド。 - 【請求項4】 アルツハイマー薬品のスクリーニングの
ための、請求項1又は2記載の単量体b−アミロイドペ
プチドの使用法。
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