JPH11225672A - テアフラビンを豊富に含む茶抽出物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 茶の醗酵の間に生じる酸化的生物変換、特
に、茶製品における色の発生について、その反応機構を
解明し、その研究結果を応用して、優れた色調の液体を
生じる茶製品を提供すること。 【解決手段】 緑茶（グリーン・リーフ・ティー）のス
ラリーをタンナーゼで処理し、且つ、当該スラリーを醗
酵させてテアフラビンを豊富に含む茶抽出物を生ぜしめ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、緑茶葉（グリーン
・ティー・リーフ）の酸化醗酵の間に生成される着色ポ
リフェノール類の一種中の一つである、テアフラビン
（Theaflavin）の製造に関する。本発明は、テアフラビ
ンを製造する方法、より具体的には、スラリー醗酵によ
るテアフラビンの製造方法と、テアフラビンを精製する
方法、及び、テアフラビンを多量に含む冷水可溶性茶粉
末とその製造方法を提供する。

【０００２】

【従来の技術】緑茶葉（摘み取られたもの）は、カテキ
ン類として知られている無色のポリフェノール類を含
む。緑茶葉中の四大カテキン類は、エピカテキン（Ｅ
Ｃ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、及びこれらのカテ
キン類の没食子酸エステルの形態のもの［没食子酸（Ｇ
Ａ）残基を有するもの］、即ち、エピカテキン−３−ガ
レート（ＥＣＧ）及びエピガロカテキン−３−ガレート
（ＥＧＣＧ）である。これらの化合物の化学構造は、次
の通りである。

【０００３】

【化１】

【０００４】紅茶を製造するための茶の緑葉の酸化醗酵
［紅茶葉（ブラック・リーフ）を製造するための固体状
態での醗酵、又は、紅茶抽出物を製造するためのスラリ
ー醗酵］の間、カテキン類は、それらのキノン骨格部分
に酸化的生物変換を受け、テアフラビン類（ＴＦｓ）と
して知られている二量化化合物及びテアルビジン類（Ｔ
Ｒｓ）として知られている高分子量化合物となる。テア
フラビン類及びテアルビジン類は、紅茶煎じ液のオレン
ジ色及び褐色の元であり、且つ、生成された紅茶の渋味
及びこくにはっきりと寄与する生成物でもある。テアル
ビジン類は、テアフラビン類よりも、大きさが大きく且
つより暗色である。酸化重合は、葉の中に存在するポリ
フェノール・オキシダーゼ及び／又はペルオキシダーゼ
によって媒介される生化学的酸化と、反応性種（スピー
シーズ）の化学反応との組み合わせである。テアフラビ
ン類は、テアフラビン（ＴＦ又はＴＦ１）と、ある範囲
内の関連する没食子酸エステル誘導体とを包含する。そ
れらの中の４種の化学構造式は、次の通りである。

【０００５】

【化２】

【０００６】テアフラビン及びテアフラビン類は、紅茶
の「透明性（Brightness）」と「すがすがしさ（Brisknes
s）」の品質に寄与することが認識されている。それらは
また、紅茶の色にも影響を与える。大部分のテアフラビ
ン類は、抗酸化性を有し、それゆえ、食品及び健康産業
に大きな利益をもたらす。

【０００７】米国特許第５,５３２,０１２号［バレンタ
イン（Ballentine）等］は、紅茶クリーム（紅茶を熱水
で煎じることによって得られる冷水不溶性物質）からの
テアフラビン類の混合物であって、紅茶クリーム中に見
出されるテアフラビン類の生来の混合物にまったく近似
しているものの抽出について記載している。抽出された
テアフラビン類の混合物は、テアフラビン、テアフラビ
ン一没食子酸エステル及びテアフラビン二没食子酸エス
テルを含む。

【０００８】本発明者等は、茶の醗酵の間に生じる酸化
的生物変換、特に、茶製品における色の発生について、
研究した。

【０００９】当該研究においては、スラリーの醗酵前に
おける、緑茶葉（グリーン・ティー・リーフ）のタンナ
ーゼ［フラバノール・ガレート・エステラーゼ（flavan
ol gallate esterase）］での前処理を利用した。これ
は、スラリー醗酵生成物に改良された赤みを与えること
が公知である。タンナーゼの触媒作用を受ける一般的な
反応は、緑茶葉中の没食子酸エステル化されたカテキン
類及び他の没食子酸エステル化された化合物類の、没食
子酸エステル結合の解裂である。ガロイル基が、クリー
ム醗酵に重要であり、且つ、タンナーゼは、紅茶クリー
ムの脱没食子酸エステル化及び可溶化に広範に使用され
ているので、タンナーゼは、茶製品の透明性を改良する
ことがよく知られている。スラリー醗酵の前の、緑茶の
前処理のためのタンナーゼの使用もまた、例えば米国特
許第３,８１２,２６６号［サンダーソン（Sanderson）
等］において開示されている。当該特許では、タンナー
ゼは、液体（リカー）中の茶クリームの量の低減を第一
の目的として使用されている。当該特許は、当該プロセ
スによって生ずる改良された色についても言及してい
た。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】エピガロカテキン−３
−ガレート（ＥＧＣＧ）及びエピカテキン−３−ガレー
ト（ＥＣＧ）は、新鮮な茶葉中において、最も豊富なカ
テキン類であり、且つ、それらの没食子酸エステル結合
は、タンナーゼ処理によって解裂され、ＥＧＣ、ＥＣ及
び没食子酸を生じる。スラリー醗酵前のタンナーゼ前処
理の全体としての影響は、それゆえ、醗酵の開始時に存
在するカテキン類の混合物を単純にすることである。従
来は、一般的に、その後の酸化の間に、量が増えた没食
子酸が単純な（ジヒドロキシ−Ｂ環）カテキン類（例え
ばＥＣ）と結合し、テアフラビン酸類の量を増やすと思
われていた。つまり、テアフラビン酸類の合成の間、没
食子酸は、これらのテアフラビン類縁体（アナログ）類
の合成において、ガロカテキン（トリヒドロキシ−Ｂ
環）として作用する。没食子酸は、ベンゾトロポロン
（benzotropolone）環構造を形成するように、他のガロ
カテキン類（即ち、ＥＧＣＧ及びＥＧＣ）と反応しはし
ないであろう。テアフラビン酸類は、その色が特徴的な
明赤色であり、そのため、それらの蓄積の結果として、
著しくよりよい色調の液体（リカー）が製造されるであ
ろう。米国特許第３,８１２,２６６号では、タンナーゼ
前処理によって生ずる改良された色の説明として、エピ
テアフラビン酸（これは、明赤色の紅茶様の色を有す
る）の生成が高められたことが提案されている。

【００１１】この提案が事実であるか否かについての確
認を含めて、本発明者等は、茶の醗酵の間に生じる酸化
的生物変換、特に、茶製品における色の発生について、
更に研究し、その反応機構を解明した。本発明は、その
研究結果を応用して、優れた色調の液体を生じる茶製品
を提供することを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】研究の結果、本発明者等
は、少なくともサンダーソン等の系においては、タンナ
ーゼ前処理によって生ずる改良された色は、エピテアフ
ラビン酸の生成が高められたことによるという説明は誤
りであること、及び、実際、タンナーゼ前処理の後に生
じた改良された色は、テアフラビンの量が増えたために
もたらされていること（実施例３を参照されたい）を知
見した。タンナーゼ処理により、没食子酸エステル化さ
れたカテキン類であるＥＣＧ及びＥＧＣＧの脱没食子酸
エステル化が行われ、脱没食子酸エステル化されたカテ
キン類、即ちＥＣ及びＥＧＣが生ずる。その後の醗酵の
間の酸化において、カテキン類であるＥＣ及びＥＧＣ
は、もしそうでなければ製造されるかもしれない、先に
その化学構造式を示したテアフラビン類の混合物という
よりはむしろ、テアフラビンを生ずるように反応する。
モデルとなる酸化研究の結果、ＥＣとＥＧＣがより高い
効率で反応し、それら各々の没食子酸エステル化された
対応化合物よりも、テアフラビンが形成されることが示
された。そして、タンナーゼ処理は、テアフラビンを最
大量で生成するために、好ましくはスラリー状態で醗酵
された茶葉中の没食子酸エステル化されたカテキン類
の、実質的に完全な脱没食子酸エステル化を引き起こす
のである。この反応機構の説明により、高い収率で実質
的に純粋なテアフラビンを製造するための新規な方法へ
の道が開かれ、更に、テアフラビンが豊富な抽出物（エ
キストラクト）及び粉末を作るための鍵も提供された。

【００１３】即ち、本発明は、その第一の態様として、
広くは、テアフラビンを豊富に含む茶抽出物の製造方法
を提供する。当該方法は、緑茶（グリーン・リーフ・テ
ィー）のスラリーをタンナーゼで処理し、且つ、当該ス
ラリーを醗酵させてテアフラビンを豊富に含む茶抽出物
を生ぜしめることを含む。

【００１４】本発明は、第二の態様として、テアフラビ
ンを豊富に含む、冷水可溶性茶粉末の製造方法を提供す
る。当該方法は、緑茶（グリーン・リーフ・ティー）の
スラリーをタンナーゼで処理し、当該スラリーを醗酵さ
せ、当該スラリーから葉を除去してテアフラビンを豊富
に含む茶液（ティー・リカー）を得、且つ、当該茶液を
乾燥してテアフラビンを豊富に含む冷水可溶性茶粉末を
生ぜしめることを含む。

【００１５】本発明は、第三の態様として、テアフラビ
ンを豊富に含む、冷水可溶性茶製品の他の製造方法を提
供する。当該方法は、緑茶（グリーン・リーフ・ティ
ー）のスラリーをタンナーゼで処理し、当該スラリーを
醗酵させ、当該スラリーから葉を除去してテアフラビン
を豊富に含む茶液（ティー・リカー）と使用後の葉（ド
ール）とを得、即ち、茶液と使用後のドールとに分け、
当該茶液を乾燥して茶液に由来するテアフラビンを豊富
に含む冷水可溶性茶粉末を生ぜしめ、当該ドールの溶剤
抽出を一回以上行い、当該抽出物を乾燥して使用後のド
ールに由来するテアフラビンを豊富に含む粉末を生ぜし
め、且つ、茶液に由来するテアフラビンを豊富に含む冷
水可溶性茶粉末を、使用後のドールに由来するテアフラ
ビンを豊富に含む粉末と混合して、テアフラビンを豊富
に含む冷水可溶性茶粉末を生ぜしめることを含む。

【００１６】本発明は、第四の態様として、テアフラビ
ンを豊富に含む、冷水可溶性茶製品の更に他の製造方法
を提供する。当該方法は、緑茶（グリーン・リーフ・テ
ィー）のスラリーをタンナーゼで処理し、当該スラリー
を醗酵させ、当該スラリーから葉を除去してテアフラビ
ンを豊富に含む茶液（ティー・リカー）と使用後の葉
（ドール）とを得、即ち、茶液と使用後のドールとに分
け、当該ドールにつき溶剤抽出を一回以上行って抽出物
を得、当該茶液と当該抽出物とを混合し、且つ、得られ
た混合物を乾燥してテアフラビンを豊富に含む冷水可溶
性茶粉末を生ぜしめることを含む。

【００１７】本発明は、第五の態様として、テアフラビ
ンの製造方法を提供する。当該方法は、スラリー醗酵の
前に、緑茶（グリーン・リーフ・ティー）のスラリーを
タンナーゼで処理し、スラリー醗酵を行い、且つ、スラ
リー醗酵の生成物からテアフラビンを分離することを含
む。

【００１８】本発明は、第六の態様として、テアフラビ
ンの精製方法を提供する。当該方法は、緑茶（グリーン
・リーフ・ティー）のスラリーをタンナーゼで処理し、
当該スラリーを醗酵させ、当該スラリーから葉を除去し
てテアフラビンを豊富に含む茶液（ティー・リカー）を
得、当該茶液を乾燥してテアフラビンを豊富に含む冷水
可溶性茶粉末を生ぜしめ、当該粉末を水に再懸濁させ、
当該再懸濁された粉末を有機溶剤で抽出し、即ち、当該
粉末中の成分を有機溶剤で抽出し、且つ、抽出された粉
末中の成分を、テアフラビンを溶出するクロマトグラフ
ィー・カラムに通すことを含む。

【００１９】本発明は、第七の態様として、テアフラビ
ンの他の精製方法を提供する。当該方法は、緑茶（グリ
ーン・リーフ・ティー）のスラリーをタンナーゼで処理
し、当該スラリーを醗酵させ、当該スラリーから葉を除
去してテアフラビンを豊富に含む茶液（ティー・リカ
ー）と使用後の葉（ドール）とを得、即ち、茶液と使用
後のドールとに分け、当該茶液を乾燥して茶液に由来す
るテアフラビンを豊富に含む冷水可溶性茶粉末を生ぜし
め、当該ドールにつき溶剤抽出を一回以上行い、当該抽
出物を乾燥して使用後のドールに由来するテアフラビン
を豊富に含む粉末を生ぜしめ、茶液に由来するテアフラ
ビンを豊富に含む冷水可溶性茶粉末を、使用後のドール
に由来するテアフラビンを豊富に含む粉末と混合して、
テアフラビンを豊富に含む冷水可溶性茶生成物、即ち粉
末を生ぜしめ、当該生成物（粉末）を水に再懸濁させ、
当該再懸濁された生成物（粉末）からの有機溶剤抽出を
行い、即ち、当該再懸濁された粉末中の成分を有機溶剤
で抽出し、且つ、抽出された成分を、テアフラビンを溶
出するクロマトグラフィー・カラムに通すことを含む。

【００２０】本発明は、第八の態様として、テアフラビ
ンの更に他の精製方法を提供する。当該方法は、緑茶
（グリーン・リーフ・ティー）のスラリーをタンナーゼ
で処理し、当該スラリーを醗酵させ、当該スラリーから
葉を除去してテアフラビンを豊富に含む茶液（ティー・
リカー）と使用後の葉（ドール）とに分け、当該ドール
につき溶剤抽出を一回以上行って抽出物を得、茶液と抽
出物とを混合し、得られた混合物を乾燥してテアフラビ
ンを豊富に含む冷水可溶性茶粉末を生ぜしめ、当該粉末
を水に再懸濁させ、当該再懸濁された粉末中の成分を有
機溶剤で抽出し、且つ、抽出された成分を、テアフラビ
ンを溶出するクロマトグラフィー・カラムに通すことを
含む。

【００２１】本発明は、第九の態様として、上記のテア
フラビンの製造方法又は精製方法によって製造されたテ
アフラビンを提供する。

【００２２】本発明は、第十の態様として、このように
して製造されたテアフラビンを含む、茶を基本とする飲
み物又は他の食品を提供する。

【００２３】上記の発明において、タンナーゼでの処理
は、不活性雰囲気中（特に、窒素の存在下）等の、醗酵
が進行しない条件下に行うのが好ましい。

【００２４】また、スラリーのタンナーゼでの処理は、
茶の固体１ｋｇ当たり少なくとも約３２００タンナーゼ
活性単位の量でタンナーゼを用い、約２５℃にて約６０
分間行うのが好ましい。

【００２５】スラリーの醗酵は、４.０〜５.５の範囲内
のｐＨにて、１５〜３０℃の範囲内の温度にて、３０〜
７５分間の範囲内の時間行うのがよい。

【００２６】緑茶として、ＥＧＣ（Ｇ）：ＥＣ（Ｇ）比
が約３：１であるものを使用するのがよい。

【００２７】溶剤抽出に用いる溶剤は、水及び有機溶剤
類の中から選択されるのが好ましい。

【００２８】その水は、１５℃と２５℃との間の温度を
有するか、９０℃と１００℃との間の温度を有するのが
よい。

【００２９】最も好ましい溶剤抽出は、冷水（１５℃〜
２５℃）、熱水（９０℃〜１００℃）、及び有機溶剤
（特にメタノール）での連続的な抽出である。

【００３０】テアフラビンの精製方法においては、冷水
可溶性茶粉末を水に再懸濁させた後に水に溶解させ、そ
の水溶液について有機溶剤抽出を行うのがよく、また、
その抽出の結果得られる有機溶剤抽出物を、乾燥して粉
末とし、その粉末を適切な溶剤に溶かし、得られた溶液
をクロマトグラフィー・カラムにのせる（アプライす
る）のがよい。

【００３１】この明細書において、「茶」とは、カメリ
ア・シンセンシス（Camellia sinsensis）又はカメリア
・アサミカ（Camellia assamica）に由来する葉物を意
味する。「茶」は、また、これらの植物の葉物のブレン
ド物を含むことも意図されている。

【００３２】「リーフ・ティー」は、煎じる前の形態
の、一種以上の茶の原体を含む茶製品を意味する。

【００３３】「テアフラビン」とは、（−）−エピカテ
キン及び（−）−エピガロカテキンの酸化及び縮合生成
物である、化合物である。「テアフラビン」は、ＴＦ１
又は単にＴＦとしても知られている。「テアフラビン
類」とは、茶カテキン類の、ジ−及びトリ−ヒドロキシ
化Ｂ環での酵素的酸化及び縮合によって形成される化合
物類（テアフラビンを含む）を、集合的に述べている。
これらの化合物の中の幾つかの化学構造式は、先に記載
した通りである。本発明は、テアフラビン類というより
はむしろテアフラビンが豊富な、抽出物、粉末及び製品
の製造に関する。

【００３４】「ドール（dhool）」とは、液体に浸して
柔らかくされ、しおれさせられた緑茶葉（グリーン・テ
ィー・リーフ）をいう。

【００３５】「含む」という語は、必ずではないが、
「のみからなる」又は「から構成される」を含む意味を有
することが意図されている。換言すれば、一覧で挙げら
れた工程又は任意の工程は、必ずしも網羅的である必要
はない。

【００３６】

【発明の実施の形態】本発明では、スラリー醗酵に先立
ち、ドールがタンナーゼで処理される。これは、適切な
時間、適切な温度にて、窒素雰囲気中（醗酵が生じるの
を防ぐため）で、懸濁液状態で、ドールとタンナーゼと
を混合することによって行うのが都合がよい。適切な条
件は、実験によって容易に決定され得る。キッコーマン
（KIKKOMAN、KIKKOMANは商標である）のタンナーゼを、
茶固体の重量の少なくとも約０.００６４重量％の量
［即ち、３２００タンナーゼ活性単位（Ｔ．Ａ．Ｕ．）
／ｋｇ−茶固体（ここで、茶葉固体含有量は、葉の水分
量を測定した後に決定される）、キッコーマンのタンナ
ーゼは、５０,０００Ｔ．Ａ．Ｕ．／ｇである。］で用
い、２５℃にて６０分間処理したときに、良好な結果が
得られた。即ち、没食子酸エステル化されたカテキン類
の定量的な脱没食子酸エステル化がもたらされた。

【００３７】スラリー醗酵生成物（テアフラビン及び任
意にその他の物質を含む）は、一般的には、当業者には
よく知られている従来の技術によって、例えば、一般的
には、米国特許第３,８１２,２６６号に開示されている
ような方法で調製され得る。スラリー醗酵は、一般的に
は、制御された時間、制御された温度（例えば２５℃）
で、ドールのスラリーに空気又は酸素をバブリングさせ
て、カテキン類を酸化的生物変換させることを含む。固
体がスラリーから除去され（脱葉され）、得られた液体
（リカー）が任意に濃縮され、その後乾燥（例えば噴霧
乾燥又は凍結乾燥）されて、粉末又は微粒が生じる。

【００３８】スラリー醗酵条件は、好ましくは、可能な
限りテアフラビンの生成が最大化されるように調整され
る。

【００３９】醗酵は、好ましくは、４.０〜５.５の範囲
内のｐＨにて行われる。醗酵温度は、好ましくは１５〜
３５℃の範囲内である。醗酵は、好ましくは３０〜１２
０分の、より好ましくは３０〜７５分の範囲内の時間行
われる。テアフラビンの生成を最大化するために、醗酵
は、ＥＧＣが用い尽くされたときに、止められるべきで
ある。この後では、残留ＥＣによる酸化のために、テア
フラビン量は減少するからである。醗酵は、米国特許第
３,８１２,２６６号で使用されているような過酸化水素
を添加せずに行われるべきでもある。過酸化水素の添加
は、（全体として色を濃くしつつ）テアフラビンを分解
するからである。同様に、外来的なペルオキシダーゼ
類、ラッカーゼ（laccase）類及びポリフェノール・オ
キシダーゼ類等の酵素類は、これらはテアフラビン量を
低減させるかもしれないので、存在すべきではない。

【００４０】緑葉（グリーン・リーフ）原料物質は、テ
アフラビン生成量を最適化するために、選択されること
もできる。好ましい原料物質は、約３：１のＥＧＣ
（Ｇ）：ＥＣ（Ｇ）比を有する（実施例３を参照された
い）。１モルのＥＧＣは、１モルのＥＣと反応する（脱
没食子酸エステル化された後）けれども、酸化速度が異
なるため、３：１が好ましいモル比である。適切なモル
比を有する茶のクローンが、この要求のために選択され
得る。

【００４１】本発明は、実質的に純粋なテアフラビン
を、高収量で製造することを可能にする。タンナーゼ処
理なしに得られるものの少なくとも１１倍のテアフラビ
ン収量が、本発明の方法に従って、その最も単純な形態
において達成される。少なくとも１１ｇ−テアフラビン
／ｋｇ−ドールというテアフラビン収量が、その方法に
よって達成される。

【００４２】水相の組成分析に基づく、スラリー醗酵の
時間の経過に沿った初期の研究から、テアフラビン量
は、所定時間の醗酵後にピークに達し、その後醗酵時間
の経過に伴って減少することが示された。これは、テア
フラビン酸化が生じている又はテアフラビンが細胞性物
質に結合していることを暗示している。モデル的な系で
の研究において、テアフラビンは、急速に蓄積し、その
後その量は一定となった（実施例３を参照されたい）。
これは、スラリー醗酵の間、テアフラビンが、酸化され
るよりはむしろ葉物質に結合していることを示唆した。

【００４３】それゆえ、徹底的な抽出のプロトコルが、
スラリー混合物からのテアフラビンのより完全な回収を
可能にするために開発された。この抽出手法の使用によ
り、醗酵の間であってテアフラビン量がピークに達した
後、テアフラビンは酸化されていたのではなく、実際に
は、ドールと結合していたことが示された。実際、液体
（リカー）中のＥＣ量とテアフラビンのピーク量との比
較の結果、テアフラビン生成量は、およそ理論最大値で
あり、且つ、テアフラビンを酸化できる「残留」ＥＣは、
殆どないことが明らかにされた。

【００４４】改良された抽出手法では、液体（リカー）
を除去した後に、ドールの冷水及び熱水洗浄を採用する
ことにより、かなりの量の追加のテアフラビンが、タン
ナーゼ処理スラリーから得られ得ることが示された。
「冷水」とは、１５℃と２５℃との間の温度を有する水を
意味し、これは、好ましくは、室温であるかもしれな
い。「熱水」とは、９０℃と１００℃との間の温度を有す
る水、好ましくは新たに沸騰された水を意味する。液体
（リカー）単独からは、テアフラビンのわずかに３０％
しか回収されないのに比べて、液体（リカー）と、冷水
及び熱水洗浄液とを一緒にすることにより、全体とし
て、テアフラビンの約９０％が回収されるかもしれな
い。

【００４５】改良された抽出法は、タンナーゼ処理スラ
リーの醗酵物からのテアフラビン収量を最大化するため
に、醗酵条件（温度−実施例５参照、ｐＨ−実施例６参
照）を最適化するために採用された。総テアフラビン量
を考慮すると、ｐＨ４.０及び１５℃が、これらの条件
下で得られる利益は、「自然」の醗酵条件と比べて少ない
ほうではあったけれども、最適操業条件であることが見
出された。しかしながら、スラリーの液相中に存在する
テアフラビンの量に、温度は影響を与えず、一方、その
割合は、醗酵温度の上昇と共に増加した。

【００４６】テアフラビンがドールに結合されているそ
のメカニズムは不明である。理論によって拘束されるこ
とを望んではいないが、タンナーゼで処理された醗酵物
から得られた結果からは、様々な異なる条件下で、熱水
及び溶剤画分中に見出されるテアフラビン（即ち、最も
強く結合されたテアフラビン）の量は、殆ど一定であ
り、且つ、総テアフラビンにおける違いは、液体（リカ
ー）及び冷水画分中に存在するテアフラビン（緩く結合
されたテアフラビン）の相対量に反映されていることが
示唆されている。これは、テアフラビンが、ドール上の
一部の「高親和」部位に優先的に結合し、且つ、それらが
「飽和された状態」となるとき、残りのテアフラビンは、
緩く結合した状態となる（冷水画分）か、又は、液体中
で溶液状態にあることを暗示するかもしれない。これら
後者の二種類の画分間のテアフラビンの均衡は、醗酵温
度の影響を受ける。即ち、より高温では、テアフラビン
のより多くの部分が液体（リカー）中に存在する。テア
フラビンの製造のための最適温度（１５℃）において醗
酵させ、その後、スラリーを３５℃まで加熱してより多
くのテアフラビンを液体中に「解き放つ」試みを行ったと
ころ、１５℃の一定温度での醗酵からみて、不十分な改
良しか生じなかった。これは、一旦「結合される」と、
テアフラビンは容易には移動されないことを暗示するで
あろう。

【００４７】使用後のドールから、冷水及び熱水で解き
放たれ得る追加の物質は、激しく着色されており、且
つ、それに比例して、液体（リカー）よりもテアフラビ
ン含有量はずっと高い。この物質は、粉末製品にブレン
ドするために使用され得、より濃い／異なる色を加える
か、あるいは、スラリーから分離した液体（リカー）と
一緒にされて、当該液体単独から作られたものに比べ
て、かなり暗赤色が強い冷水可溶性粉末を生ずる。この
ように、スラリー醗酵は、コスト的に有効で、天然の冷
水及び熱水に可溶性の茶粉末を製造する手段を提供す
る。

【００４８】テアフラビンの製造のための一つの方法と
しての、タンナーゼ・スラリーの使用に関して、最大の
抽出データでは、８ｇ（ＦＷ）のドールからの２００マ
イクロモルのテアフラビンの生成が可能であることが明
らかにされた。この数値は、テアフラビン１４.１ｇ／
ｋｇ（ＦＷ）−ドールに相当する。最適化されたプロセ
スを用いて、テアフラビンを１１.７質量（マス）％の
量で含む冷水可溶性茶粉末が生成された（表８の実施例
８を参照されたい）。これは、テアフラビン１１ｇ／ｋ
ｇ（ＦＷ）−ドールという最終収量に相当する。

【００４９】本発明のテアフラビンの精製方法の実施に
あたり、テアフラビンは、冷水可溶性粉末からの溶剤
（適切には酢酸エチル）抽出、当該抽出物のクロマトグ
ラフィー・カラムへのアプライ、及びエタノールによる
カラムからの溶出により、スラリー醗酵生成物から分離
されるのが都合がよい。テアフラビンが豊富な画分は、
色で同定され得る。

【００５０】スラリー醗酵生成物は、一般的には粉末の
形態である。当該粉末は、好都合なことには、水と混合
され、溶剤抽出を受けることができる水溶液／水懸濁液
を形成する。最初の抽出は、カフェイン類及び脂質類を
除去するために、好ましくはクロロホルムを用いて行わ
れ、その後に、テアフラビンを取り出すために、酢酸エ
チルが使用される。一般的には、酢酸エチル抽出物は、
その後、水で洗浄され且つ乾燥される。乾燥後に残った
物質は、その後、エタノールに溶解され、エタノールで
予め平衡化された適切な樹脂ビーズ［例えばセファデッ
クス（SEPHADEX）、SEPHADEXは、商標である］のクロマ
トグラフィー・カラムにのせられ、画分がエタノールで
溶出され得る。テアフラビンが豊富な画分（色で同定さ
れ、ＨＰＬＣ分析で確認される）が、集められ且つまと
められ得る。

【００５１】スラリー醗酵生成物からのテアフラビンの
分離のために、所望により、他の適切な技術が使用され
得る。

【００５２】前記したように、テアフラビンは、茶の
色、「透明性」及び「すがすがしさ」に影響を与えることが
知られている。その抗酸化性のために、テアフラビン
（及び恐らく他のテアフラビン類）は、加工食品類及び
油類等の食品における抗酸化成分として、健康増進用の
製品における成分として、及び茶製品における色特性及
び抗酸化性のための成分としてといった用途を含む、潜
在的な用途を有する。例えば、本発明の方法で製造され
たテアフラビンを、抗酸化成分として含むことが有利で
あるかもしれない食品材料としては、揚げ物用油脂類、
ポテト・フレーク類、ベーカリー製品類、肉乳化物類、
調理済穀物加工食品（シリアル）類、即席麺類、豆乳、
鶏製品類、ソーセージ、マヨネーズ及びマーガリン等の
乳化製品類、冷凍魚、冷凍ピザ、チーズ及び動物用食品
類が挙げられる。

【００５３】

【実施例】実施例１タンナーゼで処理されたスラリーの醗酵におけるテアフ
ラビンの製造及びこれに続く高純度での分離 原料 新鮮なケニア茶（クローン（Clone） ＢＢＫ ３５）
を摘み取り、一晩しおれさせ、次にドライアイス中で冷
凍して英国へ輸送した。

【００５４】醗酵 しおれさせた葉をＣＴＣ（粉砕／引き裂き／カール）機
を３回通過させることによって柔らかくし、１０ｍｇの
キッコーマン（KIKKOMAN）のタンナーゼ（キッコーマン
は商標である）の存在の下で、２５℃において６０分
間、（醗酵を避けるための）窒素散布の下、５ｌのスラ
リー醗酵槽中で、得られたドール（dhool）を水に懸濁
した（３８８ｇの葉／２．５ｌの水）。これらの条件
は、没食子酸エステル化されたカテキン類の定量的な脱
没食子酸エステル化をもたらす。醗酵は、６０分間、１
ｌ／分の空気流速で、６２５ｒｐｍで懸濁液を撹拌しな
がら進行される。

【００５５】テアフラビンの抽出／精製 醗酵液を４層のモスリンを通過させることによって葉を
除去した。残渣のドールを５００ｍｌの蒸留水で洗浄
し、洗浄液とモスリンを通過した液（リカー）とを混合
し、その混合物を４℃へ冷却し、遠心し、そして上清を
パイロット・スケールの凍結乾燥機を使用して凍結乾燥
させた。これは約２５ｇの粉末を生じた。

【００５６】実験室規模のテアフラビンの精製は、以下
の通りである。５ｇの粉末を１００ｍｌの水に再度懸濁
し、完全に溶解するまで撹拌した。次にその水性画分
（水溶液）から、１００ｍｌのヘキサン、１００ｍｌの
クロロホルムで２回、及び１００ｍｌの酢酸エチルで４
回、連続して抽出した。ヘキサンは脂質を除去する。ク
ロロホルムはカフェイン及び残余の脂質を除去する。酢
酸エチル画分を一緒にし、同体積の水で再抽出した。次
に、酢酸エチル画分を、約２ｇの無水ＭｇＳＯ₄で乾燥
させ、次に完全に乾燥させ、５０ｍｌの水に再懸濁さ
せ、凍結乾燥させた。このバッチ工程は、スラリー液に
由来する全体で２５ｇの凍結乾燥された粉末に対して繰
り返され得る。

【００５７】５ｇのスラリーに由来する粉末が約６２８
ｍｇの酢酸エチル可溶性物質を生じた。酢酸エチル画分
は、質量で、３４％の没食子酸と、６４％のテアフラビ
ンとを含んでいた。

【００５８】テアフラビンは、さらに以下の方法で精製
された。セファデックス（SEPHADEX、これは商標であ
る）ＬＨ２０のカラムを１ｌの水性アセトンで洗浄し、
その後１ｌの無水アルコールで洗浄した。約１ｇの酢酸
エチル可溶性物質を１００％エタノールに溶解し、カラ
ムにのせ、次に１００％エタノールで溶出した。５０の
１００ｍｌの画分を集めた。テアフラビン含有画分（画
分３３乃至５０）を色で同定し、ＨＰＬＣによって分析
した。

【００５９】画分を一緒にし、乾燥させ、水に再懸濁
し、凍結乾燥した。一緒にした画分の詳細、テアフラビ
ン収量、及びテアフラビン純度（％）（ＨＰＬＣにより
測定）を、以下の表１に示す。

【００６０】

【表１】

【００６１】図１は、ｍＡＵ＊ｓ単位で測定された画分
３３乃至５０中のテアフラビンの量を示すグラフであ
る。この単位は、ＨＰＬＣ分析で測定された各画分中の
テアフラビンのピーク面積を表わす。ピーク高さは、ミ
リ吸光度単位（ｍＡＵ）で記録され、ピーク幅は秒で記
録され、これらがｍＡＵ＊ｓ単位における面積を与え
る。

【００６２】この実施例において、醗酵プロセスは、テ
アフラビン製造のために十分に最適化されてはいなかっ
た。タンナーゼ処理のみが最適化され、カテキン類の定
量的な脱没食子酸エステル化がなされた。醗酵時間、温
度、ｐＨ、原料（最初のカテキン組成物）などのような
他の工程要素は、テアフラビン製造を最大化するのに最
適化され得た。従って、得られたテアフラビンの収率
は、実例としてのみ扱われるべきである。テアフラビン
抽出法は、非常に効率的である。

【００６３】実施例２タンナーゼ前処理されたドールを用いる小規模醗酵 原料 ＢＢＫクローン３５の冷凍された、しおれさせられた葉
を、ＣＴＣ機を４回通過させてドールを製造し、−８０
℃において冷凍保存した。

【００６４】醗酵 振蘯フラスコ・スラリー醗酵を以下のように実施した。
ドール（８ｇ）を、振蘯フラスコ中の４２ｍｌの水に添
加し、窒素の流れの下で１０分間、磁気スターラーで撹
拌しながら解凍させた。キッコーマン（登録商標）のタ
ンナーゼを添加し（１ｍｇ／フラスコ）、スラリーをさ
らに６０分間窒素の下でインキュベーションした。その
後、フラスコを振蘯インキュベーター・テーブルに移
し、２００ｒｐｍにて７５分間醗酵させた。標準的な醗
酵を同様に実施したが、タンナーゼの添加をせず、窒素
の下でのインキュベーションも行わなかった。

【００６５】タンナーゼ処理の始めと終り、及び醗酵の
間１５分おきにサンプル（１ｍｌ）をスラリーから採取
した。これらをすぐに遠心分離し、ＨＰＬＣ分析の前
に、上清２００μｌを、８００μｌの酸化防止溶剤（１
５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、１．７％（ｖ／ｖ）酢
酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２１．２ｍＭアスコルビン酸）
へ添加した。

【００６６】メタノール抽出 ドール（１ｇ）を４０ｍｌの７０％（ｖ／ｖ）メタノー
ル水溶液中で３０分間還流させた。一旦冷却し、抽出物
の最終的な体積を測定し、ＨＰＬＣ分析の前に、２００
μｌを８００μｌの酸化防止溶剤へ添加した。

【００６７】ＨＰＬＣ分析 サンプルを、二極管配列検出器（diode array detectio
n）を有するＨＰ１１００ ＨＰＬＣを使用して分析し
た。

【００６８】タンナーゼ処理によって生じる化学的変化
を研究するために、小規模（５０ｍｌ）での醗酵を、タ
ンナーゼ処理をして、及びタンナーゼ処理をしないで実
施し、非処理ドール（ｔ＝０）、窒素散布下で６０分間
懸濁した後（ｔ＝６０）、及び７５分間の醗酵後（ｔ＝
１３５）において、ＨＰＬＣ分析を行った。得られたＨ
ＰＬＣの軌跡を図２乃至図６に示す。

【００６９】図２において（ｔ＝０）、種々のピークは
以下の化合物を表わしている。 ＧＡ＝没食子酸 ＥＧＣ＝エピガロカテキン ＣＡＦ＝カフェイン ＥＣ＝エピカテキン ＥＧＣＧ＝エピガロカテキン−３−ガレート ＥＣＧ＝エピカテキン−３−ガレート

【００７０】図３及び４は、タンナーゼ処理を行わなか
った場合と行った場合についての、窒素散布下で６０分
間懸濁した後の代表的な軌跡である。タンナーゼ処理な
し（図３）では、図２に同定されるピークに変化は殆ど
ない。これに対し、タンナーゼ処理した後では、ＥＣＧ
及びＥＧＣＧについては明白ではないが、ＥＣ、ＥＧ
Ｃ、及びＧＡについては、そのピークが増大した。これ
らの結果は、没食子酸エステル化されたカテキン類の完
全な脱没食子酸エステル化（ＥＣＧからＥＣへ、ＥＧＣ
ＧからＥＧＣへ）が、使用したタンナーゼ処理によって
達成されることを示している。

【００７１】図５及び図６は、最初の６０分間の懸濁に
続いて、７５分間醗酵を行った後のＨＰＬＣの軌跡であ
る。図５は、タンナーゼ処理なしの場合の結果を示し、
図６は醗酵前にタンナーゼ処理をした場合の結果を示
す。図５（ｔ＝１３５、タンナーゼ処理なし）は、「標
準の」テアフラビン類全てについてのピークを示してい
る。

【００７２】ＴＦ＝テアフラビン ＴＦＭＧ＝テアフラビン−３−ガレート ＴＦ′ＭＧ＝テアフラビン−３′−ガレート ＴＦＤｉＧ＝テアフラビン−３，３′−ジガレート

【００７３】これに対し、図６（ｔ＝１３５、タンナー
ゼ処理あり）は、テアフラビンのみの形成を示してい
る。テアフラビンは、タンナーゼ処理をしなかったサン
プルにおけるよりもずっと多い量で存在しもする。タン
ナーゼ処理に続く醗酵の後に、大量の没食子酸（ＧＡ）
も存在する。

【００７４】結果（μｍｏｌ・ｇ^-1（ＦＷ）の量で示
す）を以下の表２に要約する。表中、ｔ＝０における値
は、溶剤抽出されたドールについての値であり、他の値
は、タンナーゼ処理なし（−タンナーゼ）での５分及び
７５分後、及びタンナーゼ処理（＋タンナーゼ）の６０
分後、及びタンナーゼ処理（＋タンナーゼ）後の７５分
間の醗酵後のスラリー液の組成である。

【００７５】

【表２】

【００７６】実施例３基質の変化を伴うモデル酸化 所定のカテキンの混合物と茶葉抽出物とを使用して、モ
デル酸化の研究を実施した。ＥＧＣ／ＥＣ／ＧＡを異な
る割合で含むこれらの混合物を、茶葉抽出物と反応さ
せ、種々の時間の後に生じたテアフラビン（ＴＦ）とエ
ピテアフラビン酸（eTF acid）の量を測定した。インス
タント緑茶から精製したカテキン類を、種々の濃度（総
カテキン濃度６ｍＭ）において、１ｍｌの総反応体積に
おいて、リン酸／クエン酸緩衝液（ｐＨ５.５）及び０.
０５Ｕのポリフェノール・オキシダーゼ（ＰＰＯ）活性
を含む茶葉酵素抽出物と混合した。酵素抽出物は、約１
ｇの冷凍された、しおれさせられたＢＢＫクローン３５
リーフを、５０ｍＭのＭＥＳ（２−［Ｎ−モノモルホリ
ノ］エタンスルホン酸）緩衝液［ｐＨ５.５、０.３％ト
リトン（Triton）Ｘ−１００、１Ｍ ＮａＣｌ、７５０
ｍｇＰＶＰＰ（ポリビニルポリピロリドン）］中にて粉
砕し、次に遠心分離を行い、ＰＤ−１０カラム［ファル
マシア（Pharmacia）］を通して脱塩することによって
調製した。ＰＰＯ活性は、総体積３ｍｌのリン酸／クエ
ン酸緩衝液中で脱塩された抽出物１００μｌの△Ａ₄₀₀
を７５μｌの０.２Ｍカテキンを添加して反応を開始さ
せて測定することによって測定した。１ユニット（Ｕ）
とは、△Ａ₄₀₀／分が１.０であることを示す。混合物は
３０℃において軌道混合器（orbital shaker）で、２０
０ｒｐｍでインキュベーションした。サンプルを適当な
間隔で採取し、４００μｌの酸化防止溶剤（１５％（ｖ
／ｖ）アセトニトリル、１.７％（ｖ／ｖ）酢酸、２５
０ｐｐｍアスコルビン酸、２５０ｐｐｍＥＤＴＡ）を添
加することによって反応を停止した。次に、テアフラビ
ン及びエピテアフラビン酸の生成を、逆相ＨＰＬＣによ
って測定した。

【００７７】実験は、ＥＧＣ／ＥＣ／ＧＡのモル比が、
３：１：２及び０.５：１：１のＥＧＣ／ＥＣ／ＧＡ混
合物を用いて実施した。結果を図７に示す。

【００７８】これらの結果は、３：１：２のモル比のＥ
ＧＣ／ＥＣ／ＧＡ混合物［タンナーゼ処理されたドール
において通常見受けられる比に近付けている（実施例２
の表２を参照のこと）］を用いた場合は、得られる主要
な反応生成物はテアフラビンであり、実際、エピテアフ
ラビン酸は形成されていない。しかし、ＥＣＧ量が低減
されると、例えば、０.５：１：１のモル比のＥＧＣ／
ＥＣ／ＧＡ混合物を使用すると、エピテアフラビン酸が
形成され得、それはテアフラビンの量に等しい。

【００７９】従って、この実施例は、米国特許３,８１
２,２６６号における記載とは反対に、タンナーゼ処理
されたドールの醗酵の間に生じた濃い色は、エピテアフ
ラビン酸の形成のためではなくて、むしろテアフラビン
の量が高められたことによるということを示している。

【００８０】実施例４改良された抽出法 タンナーゼ前処理された醗酵 ドール由来の成分の抽出効率を増加させるために、タン
ナーゼ処理された物質について、種々の替わりの方法が
試験された。まず、タンナーゼ処理されたスラリーを、
モスリンを通して葉を除去し、残渣のドールを５０ｍｌ
の冷水で４回、５０ｍｌの沸騰水で４回洗浄し、最後に
沸騰した７０％のメタノールで抽出した。この方法で
は、テアフラビンの大部分（＞９３％）が冷水／熱水洗
浄の組み合わせにより抽出された（図８を参照のこ
と）。初めの熱水洗浄液中のテアフラビンの量は、最後
の冷水洗浄液中での量よりも多く、溶剤抽出物中の量
は、最後の熱水抽出物中よりも量が多い。この発見は、
全てのテアフラビンを抽出するためには、異なる抽出段
階が必要であることを示した。すなわち、抽出に熱水を
必要とする物質は、冷水で抽出されず、有機溶剤画分中
の物質は、熱水中には抽出されないということを示し
た。

【００８１】他の試験された方法は以下の通りであっ
た。 ＃１.２００ｍｌの室温の水に懸濁されたスラリーを濾
過するのに使用されたモスリンは、「ティー・バック」
として使用され、ドールは１０分間浸出された。葉を除
去した後、残渣のドールは沸騰水中で同様に浸出され
た。 ＃２．上記の１のようにするが、各濾過工程の後に、ド
ールの追加の洗浄を行った。 ＃３．使用後のドールは、モスリンからかき集められ、
５０ｍｌの室温の水で４回浸出され、その後５０ｍｌの
沸騰水で４回浸出された。 ＃４．使用後のドールは、モスリンからかき集められ、
２００ｍｌの冷水で１０分間浸出された。濾過した後
に、これを沸騰水を用いて繰り返した。 ＃５．上記の４のようにするが、２００ｍｌでなく１０
０ｍｌの容量で１０分間の浸出を行った。

【００８２】全ての場合において、残渣のドールは、残
りの物質を抽出するために、次に沸騰した７０％（ｖ／
ｖ）のメタノール水溶液にて抽出された。

【００８３】これらの方法全てにおいて、類似の結果が
得られ、従って、＃５の方法、すなわち、「密でない葉
の」ドールの１００ｍｌの冷水、１００ｍｌの熱水での
浸出、及び次にメタノールでの抽出（図９参照）が、受
容可能な結果を与え、実施するのに最も簡単なプロトコ
ルであったために、全てのその後の研究のために選択さ
れた。この方法では、テアフラビンの９１％超（及び没
食子酸／カフェインの９９％超）が水で抽出された。最
適化された抽出プロトコルは、以下の通りである。

【００８４】抽出 醗酵の終りに、スラリーをブフナー漏斗を使用して４層
のモスリンを通過させて葉を除去し、液体（リカー）の
体積を測定し、上記のようにサンプルをＨＰＬＣ分析の
ために採取した。次に、残渣のドールから以下のように
して抽出を行った。ドールをモスリンからかき集め、１
００ｍｌの室温の水中で１０分間浸出させた。次にこの
スラリーをモスリンを通して濾過させ、この「冷水」抽
出物の体積を測定し、サンプルをＨＰＬＣ分析のために
採取した。ドールを再度モスリンからかき集め、１００
ｍｌの沸騰水中で１０分間浸出させ、次に濾過し、この
「熱水」抽出物を冷水抽出物と同様にサンプリングし
た。残渣のドールは、実施例２に記載したように、最後
に沸騰した７０％（ｖ／ｖ）のメタノール水溶液中にお
いて抽出された。

【００８５】実施例５テアフラビン収量に対する醗酵温度の影響 次に、最適化された抽出プロトコルを、タンナーゼ処理
されたスラリー中でのテアフラビン生成に対する醗酵温
度の影響に関する研究に使用した。スラリー液（リカ
ー）のサンプルは、７５分間の醗酵の間、１５分間隔で
採取し、その液中のテアフラビン量を監視した（図１０
を参照のこと）。醗酵の終りに、上記のようにスラリー
からの抽出を行い、種々の画分中のテアフラビンの総量
を測定した（図１１を参照のこと）。

【００８６】ａ）液中のテアフラビン量 全ての温度において、液（リカー）中のテアフラビン量
は、醗酵の最初の３０分間において迅速に増加し、より
高い温度においてより高いレベルに到達した。３０分を
越えると、１５乃至２５℃において実施された醗酵と３
０乃至４０℃において実施された醗酵との間には顕著な
違いがあることが明らかとなった。より低い温度におい
ては、特に２５℃においては、液中のテアフラビン量は
このピークから迅速に低下し始めた。これに対し、より
高い温度、３０℃及び３５℃では、テアフラビン量は、
その量が低下し始める６０分までは一定のままであっ
た。４０℃においては、４５分からテアフラビン量は低
下し始め、液の最終的なテアフラビン量は、３０℃及び
３５℃において見られた量と同様であった。これらの結
果は、より高い温度においては、テアフラビン合成は最
も多く、代謝（ターンオーバー）は最も低いということ
を示すと考えられるが、これらのいずれもが予期されな
かった。

【００８７】ｂ）スラリーから抽出された総テアフラビ
ン 醗酵の終り（７５分）でのスラリーの徹底的な抽出の結
果を図１１に示す。テアフラビンの合計量は、比較的温
度に影響されなかったように思われる（実際、より低温
において僅かにより高いレベルである）ため、醗酵の間
のスラリー液のテアフラビン測定は、総テアフラビン生
成量が誤解される事態を引き起こすことが理解され得
る。形成されたテアフラビンの総量、及び溶剤及び熱水
画分における量は、異なる温度においても広範に同様で
ある。醗酵温度を変化させることの主たる影響は、実際
に、液（リカー）画分と冷水画分（おそらく緩くドール
に結合している）の間のテアフラビン分布を変化させる
ことである。つまり、１５℃においては液（リカー）中
のテアフラビンの量は３２％であったが、これは４０℃
において６３％へと増加し、これに対応して、冷水画分
中のテアフラビンの量の、１５℃における４２％から４
０℃における１０％の減少があった。これは、３０分間
の醗酵の際のピークに続く、液（リカー）中のテアフラ
ビンの減少は、テアフラビンがドールに結合するように
なるためであり、更なる酸化のためではないことを示
す。

【００８８】実施例６テアフラビン収量に対する醗酵ｐＨの影響 本発明者らは、タンナーゼ処理されたスラリーの醗酵で
のテアフラビン収量に対する、ｐＨ４.０とｐＨ５.６と
の間での醗酵ｐＨの変動の影響を研究した。タンナーゼ
前処理の後、スラリーのｐＨは４.７付近であり、この
ｐＨを、塩酸又は水酸化ナトリウムの添加によって調整
した。醗酵ｐＨを４.０から５.４へ変化させても、液
（リカー）中に存在するテアフラビン量にはほとんど影
響はしなかったが（図１２を参照のこと）、ｐＨ５.６
においてはその量は幾分低かった（ｐＨ４.０において
テアフラビン量のピークは３０分よりも４５分において
生じた）。抽出可能なテアフラビンの合計量を考慮する
と（図１３を参照のこと）、ｐＨ４.７とｐＨ５.４との
間にはほとんど差はなかったが、ｐＨ５.６では幾分そ
の量が減少した。しかし、ｐＨを４.０へ下げると、
「標準」のｐＨ４.７の場合と比べて総テアフラビン収
量は高められ、その追加のテアフラビンは冷水／熱水洗
浄液中に存在した。

【００８９】実施例７冷水洗浄及び熱水洗浄画分の説明 タンナーゼ処理された１５℃及び３５℃醗酵物からの、
液（リカー）、冷水抽出物及び熱水抽出物のサンプル
を、冷蔵し、脱クリーム（decream）し、凍結乾燥させ
て、得られた粉末を同濃度（０.３２％（ｗ／ｖ））で
再懸濁させた。色の測定を行い、かつ、脱クリーム前
に、各画分の質量による組成について測定した。二つの
醗酵物からの各画分の組成をＨＰＬＣ分析によって決定
した。これらを表３及び表４にそれぞれ示し、色のデー
タを表５に示す。

【００９０】

【表３】

【００９１】

【表４】

【００９２】

【表５】

【００９３】各ケースにおいて、冷水及び熱水抽出物中
の物質は、液（リカー）よりも高い割合でテアフラビン
を含み、例えば、熱水抽出物は、液（リカー）に比べ
て、百分率ベースで約２．５倍の多量のテアフラビンを
含んだ。冷水及び熱水抽出物中における固体の絶対量
は、液（リカー）中よりも低いが、１５℃におけるタン
ナーゼ醗酵では３５％追加され、３５℃におけるタンナ
ーゼ醗酵では２５％追加されることを示しており、これ
らはなお非常に重要である。表５は、固体量が同じであ
る場合において、対応する液（リカー）画分と比較し
て、冷水及び熱水画分が顕著により暗色であり（Ｌ^*値
がより低い）、より赤く（ａ^*値がより高い）、かつよ
り黄色い（ｂ^*値がより高い）ことを示している。

【００９４】追加で抽出された物質が最終的なスラリー
粉末の色に違いを生じるかどうかを決定するために、個
々の画分から調製された粉末と、使用後のドールから二
度熱水で抽出し、脱クリーム及び凍結乾燥前に、液（リ
カー）と一緒にすることによって調製した粉末につい
て、色の特徴を比較した。個々の画分及び粉末の組成を
以下の表６に示す。個々の粉末及び混合物の色は、以下
の表７に示す。

【００９５】

【表６】

【００９６】

【表７】

【００９７】色の値は、追加の着色された物質の回収
が、スラリー醗酵物から製造され得る冷水可溶性粉末の
色との実質的な違い（Ｌは１０単位分より暗く、ａ^*は
１４単位分より赤く、かつｂ^*は１９単位分よりも黄色
い）を生じることを示す。組成のデータは、茶の粉末を
製造する間（４℃における一晩の冷蔵、４℃における遠
心分離、及び凍結乾燥）の物質のかなりの量の損失、例
えば、混合物についてテアフラビンでは４０％の損失が
存在することを示す。しかし、混合された画分から調製
された粉末は、液（リカー）のみに由来する粉末中に存
在するテアフラビン量、４％に比べて、依然として９％
のテアフラビンを含む。従って、スラリー液（リカー）
へ冷水及び熱水洗浄液を加えることそれ自体が、スラリ
ー醗酵を経て調製された粉末の、最終的な特性に実質的
な違いを生じ得、かつほとんど確実な経費の有効化をな
し得る。

【００９８】実施例８テアフラビン収量における脱クリーム条件の影響 茶粉末の調製 サンプルを一晩冷蔵（４℃）し、次に１５，０００ｇ
で、１５分間遠心分離を行い、ワットマン（WHATMAN、
これは商標である）Ｎｏ.５４濾紙を通過させた。濾過
物を、ドライアイス／アセトン槽を使用して冷凍し、そ
して凍結乾燥した。粉末を蒸留水中に０.３２％（ｗ／
ｖ）となるように再懸濁し、ミノルタ（MINOLTA、これ
は商標である）のＣＴ−２１０比色計を使用して色を測
定した。

【００９９】本発明者らは、延長された一晩の冷蔵が、
標準的な脱クリームの間において、テアフラビンの不必
要な損失を導いているかどうかを研究するために、遠心
分離の前の、４℃における時間の効果を測定した。抽出
されたスラリーに由来するアリコートを４℃において直
後に遠心分離を行うか、又は、遠心分離の前に１時間又
は一晩冷蔵した。これらの処理の間の違いは小さいもの
の（以下の表８を参照のこと）、直後の遠心分離は、よ
り高いａ^*、及び最も高いテアフラビン含量（粉末の１
１.７質量％）を有する冷水可溶性粉末をもたらした。
粉末中に存在する、抽出物からのテアフラビンの回収率
は、一晩冷蔵した後では７７％であったのに比べて、直
後に遠心分離をした場合は９１％であった。

【０１００】

【表８】

【０１０１】この結果は、直後の遠心分離が、テアフラ
ビンの損失を最小とし、その上、依然として冷水中に完
全に可溶な粉末を生じることを示した。延長された冷蔵
の間のテアフラビンの損失が、複合体化によるのでなく
酸化によるのであれば、アスコルビン酸の添加又は金属
イオン複合体を通じてテアフラビンを保持することが可
能であるかもしれない。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、クロマトグラフのカラムから溶出され
た様々な画分中のテアフラビン（ＴＦ）の量を示すグラ
フである。

【図２】図２は、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）の軌跡である。

【図３】図３は、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）の軌跡である。

【図４】図４は、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）の軌跡である。

【図５】図５は、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）の軌跡である。

【図６】図６は、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）の軌跡である。

【図７】図７は、異なるＥＧＣ：ＥＣ：ＧＡ混合物につ
いての、時間に対するテアフラビン（ＴＦ）及びエピテ
アフラビン酸（ｅＴＦ ａｃｉｄ）の生成量を示すグラ
フである。

【図８】図８は、タンナーゼで前処理されたスラリー
の、抽出の間の成分分布を示すグラフである。

【図９】図９は、最適のプロトコル（＃５）での、タン
ナーゼで前処理されたスラリーの、抽出の間の成分分布
を示すグラフである。

【図１０】図１０は、タンナーゼで前処理されたスラリ
ーのｐＨ４.７での醗酵の間のテアフラビン生成に対す
る、温度の影響を示すグラフである。

【図１１】図１１は、タンナーゼで前処理されたスラリ
ーの醗酵の間のテアフラビン生成に対する、温度の影響
を示すグラフである。

【図１２】図１２は、タンナーゼで前処理されたスラリ
ーの醗酵の間のテアフラビン生成に対する、ｐＨの影響
を示すグラフである。

【図１３】図１３は、タンナーゼで前処理されたスラリ
ーの醗酵の間のテアフラビン生成に対する、醗酵当初の
ｐＨの影響を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｄ 311/62 Ａ２３Ｌ 2/00 Ｆ (72)発明者 アンドリュ・デビッド・パリー 英国、エムケイ44・１エルキュー、ベッド フォード、シャーンブルック、コルワー ス・ハウス、シー／オー・ユニリーバー・ リサーチ・コルワース（番地なし) (72)発明者 リチャード・サフォード 英国、エムケイ44・１エルキュー、ベッド フォード、シャーンブルック、コルワー ス・ハウス、シー／オー・ユニリーバー・ リサーチ・コルワース（番地なし) (72)発明者 アンバラヴァナー・ティル 英国、エムケイ44・１エルキュー、ベッド フォード、シャーンブルック、コルワー ス・ハウス、シー／オー・ユニリーバー・ リサーチ・コルワース（番地なし)

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 緑茶（グリーン・リーフ・ティー）のス
   ラリーをタンナーゼで処理し、且つ、当該スラリーを醗
   酵させてテアフラビンを豊富に含む茶抽出物を生ぜしめ
   ることを含む、テアフラビンを豊富に含む茶抽出物の製
   造方法。
2. 【請求項２】 スラリーのタンナーゼでの処理を、醗酵
   が進行しない条件下に行う、請求項１の方法。
3. 【請求項３】 スラリーのタンナーゼでの処理を、茶の
   固体１ｋｇ当たり少なくとも約３２００タンナーゼ活性
   単位の量でタンナーゼを用い、約２５℃にて約６０分間
   行う、請求項１の方法。
4. 【請求項４】 スラリーの醗酵を、４．０〜５．５の範
   囲内のｐＨにて、１５〜３０℃の範囲内の温度にて、３
   ０〜７５分間の範囲内の時間行う、請求項１の方法。
5. 【請求項５】 緑茶が、約３：１のＥＧＣ（Ｇ）：ＥＣ
   （Ｇ）比を有する、請求項１の方法。
6. 【請求項６】 緑茶（グリーン・リーフ・ティー）のス
   ラリーをタンナーゼで処理し、当該スラリーを醗酵さ
   せ、当該スラリーから葉を除去してテアフラビンを豊富
   に含む茶液（ティー・リカー）を得、且つ、当該茶液を
   乾燥してテアフラビンを豊富に含む冷水可溶性茶粉末を
   生ぜしめることを含む、テアフラビンを豊富に含む、冷
   水可溶性茶粉末の製造方法。
7. 【請求項７】 緑茶（グリーン・リーフ・ティー）のス
   ラリーをタンナーゼで処理し、当該スラリーを醗酵さ
   せ、当該スラリーから葉を除去してテアフラビンを豊富
   に含む茶液（ティー・リカー）と使用後の葉（ドール）
   とに分け、当該茶液を乾燥して茶液に由来するテアフラ
   ビンを豊富に含む冷水可溶性茶粉末を生ぜしめ、当該ド
   ールにつき溶剤抽出を一回以上行い、当該抽出物を乾燥
   して使用後のドールに由来するテアフラビンを豊富に含
   む粉末を生ぜしめ、且つ、茶液に由来するテアフラビン
   を豊富に含む冷水可溶性茶粉末を、使用後のドールに由
   来するテアフラビンを豊富に含む粉末と混合して、テア
   フラビンを豊富に含む冷水可溶性茶粉末を生ぜしめるこ
   とを含む、テアフラビンを豊富に含む、冷水可溶性茶粉
   末の製造方法。
8. 【請求項８】 溶剤が水及び有機溶剤類の中から選択さ
   れる、請求項７の方法。
9. 【請求項９】 溶剤が、１５℃と２５℃との間の温度を
   有する水である、請求項８の方法。
10. 【請求項１０】 溶剤が、９０℃と１００℃との間の温
    度を有する水である、請求項８の方法。
11. 【請求項１１】 使用後のドールの溶剤抽出を、先ず初
    めに１５℃と２５℃との間の温度を有する水を用いて、
    次には９０℃と１００℃との間の温度を有する水を用い
    て、その後には有機溶剤を用いて行う、請求項８の方
    法。
12. 【請求項１２】 緑茶（グリーン・リーフ・ティー）の
    スラリーをタンナーゼで処理し、当該スラリーを醗酵さ
    せ、当該スラリーから葉を除去してテアフラビンを豊富
    に含む茶液（ティー・リカー）と使用後の葉（ドール）
    とに分け、当該ドールにつき溶剤抽出を一回以上行って
    抽出物を得、当該茶液と当該抽出物とを混合し、且つ、
    得られた混合物を乾燥してテアフラビンを豊富に含む冷
    水可溶性茶粉末を生ぜしめることを含む、テアフラビン
    を豊富に含む、冷水可溶性茶粉末の製造方法。
13. 【請求項１３】 スラリー醗酵の前に緑茶（グリーン・
    リーフ・ティー）のスラリーをタンナーゼで処理し、ス
    ラリー醗酵を行い、且つ、スラリー醗酵の生成物からテ
    アフラビンを分離することを含む、テアフラビンの製造
    方法。
14. 【請求項１４】 緑茶（グリーン・リーフ・ティー）の
    スラリーをタンナーゼで処理し、当該スラリーを醗酵さ
    せ、当該スラリーから葉を除去してテアフラビンを豊富
    に含む茶液（ティー・リカー）を得、当該茶液を乾燥し
    てテアフラビンを豊富に含む冷水可溶性茶粉末を生ぜし
    め、当該粉末を水に再懸濁させ、当該再懸濁された粉末
    中の成分を有機溶剤で抽出し、且つ、抽出された成分を
    テアフラビンを溶出するクロマトグラフィー・カラムに
    通すことを含む、テアフラビンの精製方法。
15. 【請求項１５】 冷水可溶性茶粉末を水に再懸濁させた
    後に水に溶解させ、その水溶液について有機溶剤抽出を
    行う、請求項１４の方法。
16. 【請求項１６】 有機溶剤抽出物を乾燥して粉末とし、
    その粉末を適切な溶剤に溶かし、得られた溶液をクロマ
    トグラフィー・カラムにのせる（アプライする）、請求
    項１４の方法。
17. 【請求項１７】 緑茶（グリーン・リーフ・ティー）の
    スラリーをタンナーゼで処理し、当該スラリーを醗酵さ
    せ、当該スラリーから葉を除去してテアフラビンを豊富
    に含む茶液（ティー・リカー）と使用後の葉（ドール）
    とに分け、当該茶液を乾燥して茶液に由来するテアフラ
    ビンを豊富に含む冷水可溶性茶粉末を生ぜしめ、当該ド
    ールにつき溶剤抽出を一回以上行い、当該抽出物を乾燥
    して使用後のドールに由来するテアフラビンを豊富に含
    む粉末を生ぜしめ、茶液に由来するテアフラビンを豊富
    に含む冷水可溶性茶粉末を、使用後のドールに由来する
    テアフラビンを豊富に含む粉末と混合して、テアフラビ
    ンを豊富に含む冷水可溶性茶粉末を生ぜしめ、当該粉末
    を水に再懸濁させ、当該再懸濁された粉末中の成分を有
    機溶剤で抽出し、且つ、抽出された成分を、テアフラビ
    ンを溶出するクロマトグラフィー・カラムに通すことを
    含む、テアフラビンの精製方法。
18. 【請求項１８】 緑茶（グリーン・リーフ・ティー）の
    スラリーをタンナーゼで処理し、当該スラリーを醗酵さ
    せ、当該スラリーから葉を除去してテアフラビンを豊富
    に含む茶液（ティー・リカー）と使用後の葉（ドール）
    とに分け、当該ドールにつき溶剤抽出を一回以上行って
    抽出物を得、茶液と抽出物とを混合し、得られた混合物
    を乾燥してテアフラビンを豊富に含む冷水可溶性茶粉末
    を生ぜしめ、当該粉末を水に再懸濁させ、当該再懸濁さ
    れた粉末中の成分を有機溶剤で抽出し、且つ、抽出され
    た成分を、テアフラビンを溶出するクロマトグラフィー
    ・カラムに通すことを含む、テアフラビンの精製方法。
19. 【請求項１９】 請求項１３に記載の製造方法、又は請
    求項１４〜１８のいずれかに記載の精製方法よって製造
    されたテアフラビン。
20. 【請求項２０】 請求項１９のテアフラビンを含む、茶
    を基本とする飲み物又は他の食品。