JPH10507642A

JPH10507642A - 脂肪分解活性を有する酵素

Info

Publication number: JPH10507642A
Application number: JP8514262A
Authority: JP
Inventors: サンダル，トーマス; カウッピネン，サカリ; ベンケコフォド，レネ
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1994-10-26
Filing date: 1995-10-26
Publication date: 1998-07-28
Also published as: FI971749A; US5827719A; CA2203398A1; FI971749A0; MX9703062A; KR970707275A; EP0785994A1; CN1167503A; AU3697995A; BR9509525A; WO1996013580A1

Abstract

(57)【要約】本発明は中でも、脂肪分解活性を示す酵素をコードするDNA構造体に関し、ここで前記DNA配列は、ａ）配列番号１に示されるDNA配列、及び／又は配列番号１に示されるDNA配列の類似体を含んで成り、そして前記類似体は、ｉ）配列番号１に示されるDNA配列と相同であり、そして／又はii）配列番号１に示されるDNA配列と同じオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズし、そして／又はiii）配列番号１に示されるDNA配列を含んで成るDNA配列によりコードされるポリペプチドと相同であるポリペプチドをコードし、そして／又はiv）配列番号１に示されるDNA配列によりコードされ、そして／又はヒューミコラインソレンスDSM1800に由来する精製された脂肪分解酵素に対して生ぜしめられた抗体と免疫学的に反応性であるポリペプチドをコードする。また、中でも、そのようなDNA構造体によりコードされる脂肪分解酵素；及びそのような脂肪分解酵素を含んで成る酵素調製物、洗剤添加物及び洗剤組成物も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】脂肪分解活性を有する酵素発明の分野本発明は脂肪分解活性を有する酵素、前記酵素をコードするDNA配列を含んで成るDNA構造体、及び前記酵素の生成方法に関する。本発明はさらに、中でも、前記酵素を含む酵素調製物、洗剤添加物及び洗剤組成物、並びに多くの産業及び家庭用途のための前記酵素の使用に関する。発明の背景多くの脂肪分解酵素（脂肪、たとえばトリグリセリドの加水分解を触媒する酵素）が文献に記載され、そして特徴づけられているが、種々の産業又は家庭用途、たとえば洗濯洗浄又は皿洗いのための洗剤組成物又は硬質表面洗浄、脱脂／脱脂肪及び同様のための組成物におけるそれらの有用性を改良する性質を有する、単一成分形の新規脂肪分解性酵素を供給するための必要性が常に存在する。発明の要約本発明者は、驚くべきことには、今や、脂肪分解活性を示す酵素をコードする、ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）株からDNA配列を単離し、そして特徴づけ、それにより単一成分脂肪分解性酵素を調製を可能にすることに成功した。本発明の脂肪分解酵素は、中でも、上記タイプの多くの用途にそれらの酵素を非常に良く適合するようにする性質を有することが見出された（下記参照のこと）。従って、第１の観点において、本発明は脂肪分解活性を示す酵素をコードする DNA配列を含んで成るDNA構造体に関し、ここで前記DNA配列は、ａ）サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）DSM9975中のプラスミドから得ることができる、配列番号１に示されるDNA配列及び／又は脂肪分解酵素をコードするDNA配列、又はｂ）サッカロミセス・セレビシアエDSM9975中のプラスミドから得ることができる、配列番号１に示されるDNA配列及び／又は脂肪分解酵素をコードするDNA配列の類似体を含んで成り、ここで前記類似体が、ｉ）サッカロミセス・セレビシアエDSM9975中のプラスミドから得ることができる、配列番号１に示されるDNA配列及び／又は脂肪分解酵素をコードするDNA配列と相同であり、そして／又は、 ii）サッカロミセス・セレビシアエDSM9975中のプラスミドから得ることができる、配列番号１に示されるDNA配列及び／又は脂肪分解酵素をコードするDNA配列と同じオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズし、そして／又は iii）サッカロミセス・セレビシアエDSM9975中のプラスミドから得ることができる、配列番号１に示されるDNA配列及び／又は脂肪分解酵素をコードするDNA配列を含んで成るDNA配列によりコードされるペプチドと相同であるポリペプチドをコードし、そして／又は iv）サッカロミセス・セレビシアエDSM9975中のプラスミドから得ることができ、そして／又はヒューミコラ・インソレンスDSM1800に由来する、配列番号１に示されるDNA配列及び／又は脂肪分解酵素をコードするDNA配列によりコードされる精製された脂肪分解酵素に対して生ぜしめられた抗体と免疫学的に反応性であるポリペプチドをコードすることを特徴とする。配列番号１に示されるDNA配列は、サッカロミセスセレビシアエDSM9975から得ることができる、脂肪分解酵素をコードするDNA配列と同一である。配列番号１に示されるDNA配列は、その天然のシグナルペプチドと共に成熟酵素をコードする。同様に、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、そのシグナルペプチド（アミノ酸１〜35）と共に成熟酵素(アミノ酸36〜246)を構成する。本発明の酵素又はDNA構造体（たとえば、上記セクションａ）及びｂ）ｉ）−i v）に使用されるような）に関して“配列番号１に示されるDNA配列”が言及される場合いつでも、前記配列は配列番号１に示される完全な配列であり得るが、しかしより好ましくは、成熟脂肪分解酵素をコードする配列の一部であることが理解されるべきである。相応して、本発明の酵素又はDNA構造体に関して“配列番号２に示されるアミノ酸配列”が言及される場合いつでも、前記配列は配列番号２に示される完全な配列であり得るが、しかしより好ましくは、成熟脂肪分解酵素を構成する配列の一部(すなわち、アミノ酸残基36〜246)であることが理解されるべきである。本発明において、配列番号１において示されるDNA配列の“類似体”とは、脂肪分解活性を示す酵素をコードし、そして１又は複数の又はすべての性質ｉ）− iv）を有するいづれかのDNA配列を示すことが意図される。そのような類似DNA配列は、 −たとえば本明細書に記載される方法を用いて、配列番号１に示されるDNA配列又はその適切なサブ配列(たとえば20〜500bp)に基づいて脂肪分解活性を有する酵素を生成する他の又は関連する（たとえば同じ）生物から単離され得、そして従って、本明細書に示されるDNA配列を含んで成るDNA配列の対立遺伝子又は種変異体であり得、又は −たとえば、前記DNA配列によりコードされる脂肪分解酵素の他のアミノ酸配列を生ぜしめないが、しかし酵素の生成のために意図された宿主生物のコドン使用法に対応するヌクレオチド置換の導入により、又は異なったアミノ酸配列を生ぜしめ得るヌクレオチド置換の導入により、配列番号１に示されるDNA配列に基づいて構成され得る。しかしながら、後者の場合、アミノ酸変化は好ましくは、マイナーな性質、すなわちタンパク質の折りたたみ又は活性に有意に影響を及ぼさない保存性アミノ酸置換；典型的には、１〜約30個のアミノ酸の小さな欠失；アミノ−又はカルボキシル−末端の小さな延張、たとえばアミノ末端メチオニン残基の延張、約20〜25個までの残基の小さなリンカーペプチドの延張、又は精製を促進する小さな延張、たとえばポリ−ヒスチジン路、抗原エピトープ又は結合ドメインの小さな延張のものである。一般的には、Fordなど，Protein Expressi on and Purification 2 ：95-107，1991を参照のこと。保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（たとえばアルギニン、リシン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（たとえばグルタミン酸、及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（たとえばグルタミン及びアスパラジン）、疎水性アミノ酸（たとえばロイシン、イソロイシン、バリン）、芳香族アミノ酸（たとえばフェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）及び小さなアミノ酸（たとえばグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン）のグループ内の置換である。そのような置換は分子の機能に対して臨界である領域外で行なわれ得、そしてさらに、活性ポリペプチドをもたらすことは当業者に明らかであろう。本発明のDNA構造体によりコードされるポリペプチドの活性に必須であり、そして従って、好ましくは置換を受けやすくないアミノ酸が、当業界において知られている方法、たとえば特定部位の突然変異誘発又はアラニン− スキャンニング突然変異誘発に従って同定され得る(Cunningham and Wells，Sci ence 244 ，1081-1085，1989)。後者の技法においては、突然変異は、分子中のあらゆる残基に導入され、そして得られる変異分子は、分子の活性に対して臨界的であるアミノ酸残基を同定するために生物学的（すなわち脂肪分解）活性について試験される。置換体−酵素の相互作用の部位はまた、核磁気共鳴、結晶学又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、結晶構造の分析により決定され得る。たとえば、de Vosなど、Science 255 ：306-312，1992 ；Smithなど、J ．Mol．Biol．244 ：899-904，1992 ；Wlodaverなど、FFBS Lett ．309 ：59-64，1992を参照のこと。上記ｉ）に関する相同性は、第２配列からの第１配列の誘導体化を示す２つの配列間での同一性の程度として決定される。相同性は、適切には、当業界において知られているコンピュータープログラム、たとえばGCGプログラムパッケージで供給されるGAPにより決定され得る(Needleman，S.B．and Wunsch，C.D.，Jour nal of Molecular Biology，48：443-453，1970)。DNA配列比較のために次の設定： 5.0のGAP創造ペナルティー及び0.3のGAP延張ペナルティーを有するGAPを用いれば、DNA配列のコード領域は、サッカロミセス・セレビシアエDSM9975中のプラスミドから得ることができる、配列番号１に示されるDNA配列又は脂肪分解酵素をコードするDNA配列のコード領域と、好ましくは少なくとも40％、より好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、さらにより好ましくは少なくとも80％、特に少なくとも90％の同一性の程度を示す。上記ii）に言及されるハイブリダイゼーションは、類似するDNA配列がこの後の材料及び方法のセクションに詳細される特定の条件下で脂肪分解酵素をコードするDNA配列と同じプローブにハイブリダイズすることを示すことを意図される。通常、類似するDNA配列は、DNA配列と高い相同性、たとえば本発明の脂肪分解酵素をコードする配列番号１に示される配列に対して少なくとも70％の相同性、たとえば配列番号１に示されるDNA配列に対して少なくとも75％、少なくとも80 ％、少なくとも85％、少なくとも90％、又はさらに少なくとも95％の相同性を有する。上記iii）に言及される相同性の程度は、第２配列からの第１配列の誘導体化を示す２つの配列間での同一性の程度として決定される。相同性は、適切には、当業界において知られているコンピュータープログラム、たとえばGCGプログラムパッケージで供給されるGAPにより決定され得る(Needleman，S.B．and Wunsch ，C.D.，Journal of Molecular Biology，48：443-453，1970)。ポリペプチド配列比較のために次の設定： 3.0のGAP創造ペナルティー及び0.1のGAP延張ペナルティーを有するGAPを用いれば、類似DNA配列によりコードされるポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシアエDSM9975中のプラスミドから得ることができる、配列番号１に示されるDNA配列又は脂肪分解酵素（この酵素のアミノ酸配列は配列番号２に示されている）をコードするDNA配列を含んで成るDNA構造体によりコードされる酵素と、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80 ％、特に少なくとも90％の同一性の程度を示す。上記性質iv）に関する用語“由来する”とは、Ｈ．インソレンス株DSM1800により生成される脂肪分解酵素を示すのみならず、さらに、株DSM1800から単離されたDNA配列によりコードされ、そして前記DNA配列により形質転換された宿主生物により生成される脂肪分解酵素もまた示すことが意図される。免疫学的反応性は、下記材料及び方法に記載される方法により決定され得る。さらなる観点においては、本発明は、本発明のDNA構造体を有する発現ベクター、DNA構造体又は発現ベクターを含んで成る細胞、及び脂肪分解活性を示す酵素を生成するための方法に関し、ここで前記方法は酵素の生成を可能にする条件下で前記細胞を培養し、そしてその培養物から酵素を回収することを含んで成る。さらにもう１つの観点において、本発明は、ａ）本発明のDNA構造体によりコードされ、そして／又はｂ）本発明の方法により生成され、そして／又はｃ）サッカロミセス・セレビシアエDSM9975中のプラスミドから得ることができ、そして／又はヒューミコラインソレンスDSM1800に由来する、配列番号１に示されるDNA配列及び／又は脂肪分解活性をコードするDNA配列によりコードされる精製された脂肪分解酵素に対して生ぜしめられた抗体と免疫学的に反応性である、脂肪分解活性を示す酵素に関する。さらにもう１つの観点においては、本発明は、本発明の酵素を含んで成る洗剤添加物又は洗剤組成物に関する。発明の詳細な記載脂肪分解活性を示す酵素をコードする本発明のDNA配列は、 −Ｈ．インソレンスからのDNAライブラリーを適切なベクターにおいてクローニングし、 −前記ベクターにより適切な酵母宿主細胞を形質転換し、 −DNAライブラリーにおけるクローンによりコードされるいづれかの興味ある酵素を発現するために適切な条件下で宿主細胞を培養し、 −陽性クローンにより生成される酵素のいづれかの脂肪分解活性を決定することによってそのような陽性クローンについてスクリーンし、そして −そのようなクローンから酵素−コードのDNAを単離することを包含する一般的方法により単離され得る。一般的な方法はさらに、WO94／14953に開示されている。スクリーニング法のさらなる詳細な記載は、下記例１に与えられている。たとえば、酵素をコードするDNA配列は、Ｈ．インソレンス、たとえばDSM（De utsche Sammiung von Mikroorgonismen und Zellkulturen，Mascheroder Weg lb ，D-38124 Braunschweig，Germany）から入手できる菌株DSM1800のcDNAライブラリーをスクリーンし、そして適切な酵素活性（すなわち、脂肪分解活性）を発現するクローンについて選択することによって単離され、又はDSMで1995年５月11 日、ブダペスト条約下で寄託されたサッカロミセス・セレビシアエDSM9975から単離され得る。次に、適切なDNA配列は、標準の方法、たとえば例１に記載される方法によりクローンから単離され得る。相同性酵素をコードするDNA配列、すなわち類似DNA配列が他の微生物から得ることができることが予測される。たとえば、DNA配列は、他の微生物、特に真菌類、特に、ソルダリアレス(Sordariales)目からの菌類、たとえばチエラビア(Th ielavia)sp．の株、特にＴ．テレストリス(T．terrestris)、カエトミウム（Cha etomiwm）sp．株、特にＣ．エラタム(C．elatum)又はＣ．グロボサム(C. globos um)、ゲラシノスポラ(Gelasinospora)sp．の株、特にＧ．セレアリス(G．cereal is)、ニューロスポラ（Neurospora）sp．の株、特にＮ．クラサ(N．crassa)、ポドスポラ(Podospora)sp．の株、特にＰ．アンセリナ(P．anserina)、サルダリア（Sordaria）sp．の株、特にＳ．フィミコラ(S．fimicola)もしくはＳ．マクロスポラ(S．macrospora)、又は他のヒューミコラsp．の株のcDNAライブラリーを同様にスクリーニングすることによって誘導され得る。興味ある他の菌類は、アスペルギルス(Aspergillus)sp．株、たとえばＡ．アキュレアタス（A．aculeatus）もしくはＡ．ニガー（A．niger）、トリコダーマ(Trichoderma)sp．の株、たとえばＴ．ハルジアナム（T．harzianum）、Ｔ．リセイ（T．reeseii）、Ｔ．ビリデ(T．viride)、Ｔ．ロンジブラキアタム（T．longibrachiatum）もしくはＴ．コニンジ(T．Koningii)、又はフサリウム（Fusarium）sp．の株、たとえばＦ．オキシスポラム（F．Oxysporum）を包含する。他方、本発明の脂肪分解酵素をコードするDNAは、本明細書に開示されるDNA配列に基づいて調製された合成オリゴヌクレオチドプローブの使用により、適切な分離源、たとえば上記生物のいづれかからのDNAから、良く知られた方法に従って単離され得る。たとえば、適切なオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１に示されるDNA配列、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列、又はそれらの配列のいづれかの適切なサブ配列に基づいて調製され得る。続いて、DNA配列は、組換え発現ベクター中に挿入され得る。これは、組換えD NA方法に便利にゆだねられ得るいづれかのベクターであり、そしてベクターの選択はしばしば、それが導入される予定である宿主細胞に依存するであろう。従って、ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち染色体複製に無関係である、染色体外実在物として存在するベクター、たとえばプラスミドであり得る。他方、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組込まれ、そしてそれが組込まれた染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。ベクターにおいて、脂肪分解酵素をコードするDNA配列は、適切なプロモーター及びターミネーター配列に作用可能に連結されるべきである。プロモーターは、選択される宿主細胞において転写活性を示すいづれかのDNA配列であり、そして宿主細胞に対して同種の又は異種のいづれかのタンパク質をコードする遺伝子から誘導され得る。脂肪分解酵素をコードするDNA配列、プロモーター及びターミネーターをそれぞれ連結するために使用される方法、及びそれらを適切なベクターに挿入するために使用される方法は、当業者に良く知られている（たとえば、Sambrookなど、Molecular Cloning: A Laboratory Manual ， Cold Spring Har bor，NY，1989を参照のこと）。本発明の酵素をコードするDNA配列により形質転換される宿主細胞は好ましくは、真核細胞、特に真菌細胞、たとえば酵母又は糸状菌細胞である。特に、その細胞は、アスペルギルス属の種、最とも好ましくは、Ａ．オリザエ又はＡ．ニガーに属する。他方、その細胞は、トリコダーマ種、たとえばＴ．リセイ、又はフサリウム種、たとえばＦ．オキシスポラム又はＦ．グレミネアラムにも属する。菌細胞は、プロトプラスト形成、及びプロトプラストの形質転換、続く細胞壁の再生を包含する工程により形質転換され得る。宿主微生物としてのアスペルギルスの使用は、EPO238023(Novo Nordisk A/S)に記載されている。宿主細胞はまた、酵母細胞、たとえばサッカロミセス株、特にサッカロミセス・セレビシアエ、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）又はサッカロミセス・ウバリウム（Saccharomyces uvarum）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomy ces）sp.株、たとえばシゾサッカロミセスポンベ(Sc hizosaccharomyces pombe)、又はハンセニューラ(Hansenula)sp．の株、ピチア（Pichia）sp．ヤロウィア（Yarrowia）sp．たとえばヤロウィアリ・ポライチカ (Yarrowia lipolytica)、又はクルイベロミセス（Kluyveromyces）sp.たとえばクルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）でもあり得る。さらなる観点においては、本発明は本発明の酵素を生成するための方法に関し、ここで酵素をコードするDNA配列により形質転換された適切な宿主細胞はその酵素の生成を可能にする条件下で培養され、そして得られる酵素がその培養物から回収される。形質転換された宿主細胞を培養するために使用される培地は、問題の宿主細胞を増殖するのに適切ないづれかの従来の培地であり得る。発現された脂肪分解酵素は便利には、培養培地中に分泌され、そして良く知られている方法、たとえば遠心分離又は濾過により培地から細胞を分離し、塩、たとえば硫酸アンモニウムにより培地のタンパク質成分を沈殿させ、続いてクロマトグラフィー方法、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、又は同様の手段を用いて、それらから回収され得る。本発明酵素本発明の酵素は、本発明のDNA構造体によりコードされる酵素である。本発明の好ましい酵素はまた、１又は複数の次の特徴を有することによって特徴づけられ得る： −それは約20〜21KDaの分子量を有し、 −それは７〜９の範囲、たとえば約８のpIを有し、 −それは約６〜10の範囲、たとえば７〜９の範囲、たとえば約８の最適pHを有し、 −それは特異性を有し、又は短鎖の脂質基質に対して最大の脂肪分解活性を少なくとも示す。本発明の酵素は好ましくは、ヒューミコラの株、たとえばＨ．インソレンスの株、又は相同の酵素をコードするDNA配列の適切な源として言及される種々の生物のいづれかの株から得ることができる。洗剤組成物本発明によれば、本発明の脂肪分解酵素は典型的には、洗剤組成物（たとえば洗濯又は繊維洗浄のための洗剤組成物）の成分であり得る。それは、無粉塵性顆粒、安定化された液体、又は保護された酵素の形で洗剤組成物に含まれ得る。無粉塵性顆粒は、アメリカ特許第4,106,991号及び第4,661,452号（両者ともNovo I ndustri A/Sのもの）に開示されるようにして製造され、そして当業界に知られている方法により任意に被覆され得る。ロウ質の被覆材料の例は、1000〜20000 の平均分子量を有するポリ（エチレンオキシド）生成物(ポリエチレングリコール、PEG)、16〜50個のエチレンオキサイド単位を有するエトキシル化されたノニルフェノール；アルコールが12〜20個の炭素原子を有し、そして15〜80個のエチレンオキシド単位が存在するエトキシル化された脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ−、ジ−及びトリ−グリセリドを有する。流動床技法による適用のために適切なフィルム形成被覆材料の例は、特許GB1483591 に開示されている。液体酵素調製物はたとえば、確立された方法に従って、ポリオール、たとえばプロピレングリコール、糖もしくは糖アルコール、乳酸又は硼酸を添加することによって安定化され得る。他の酵素安定剤は当業界において良く知られている。保護された酵素は、EP238,216に開示される方法に従って調製され得る。本発明の洗剤組成物は、いづれかの便利な形、たとえば粉末、顆粒、ペースト又は液体で存在することができる。液体洗剤は、典型的には、70％までの水及び０〜30％の有機溶媒を含む水性、又は非水性であり得る。洗剤組成物は１又は複数の界面活性剤を含んで成り、それらの界面活性剤の各々はアニオン性、非イオン性、カチオン性又は両性イオン性であり得る。洗剤は通常、０〜50％のアニオン性界面活性剤、たとえば線状アルキルベンゼンスルホネート(LAS)、α−オレフィンスルホネート(AOS)、アルキルスルフェート(脂肪アルコールスルフェート)(AS)、アルコールエトキシスルフェート(AEOS又はAES) 、第２アルカンスルホネート(SAS)、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアルケニル琥珀酸、又は石鹸を含むであろう。それはまた、０〜40％の非イオン性界面活性剤、たとえばアルコールエトキシレート(AEO又はAE)、カルボキシル化されたアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化された脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（たとえば、WO92／06154に記載されるような）も含むことができる。洗剤組成物はさらに、１又は複数の他の酵素、たとえば他の脂肪分解酵素（リパーゼ）、アミラーゼ、クチナーゼ（cutinase）、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、又はオキシダーゼ、たとえばラッカラーゼを含むことができる。洗剤は、１〜65％の洗剤ビルダー、又は錯化剤、たとえばゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、シトレート、ニトロ三酢酸(NTA) 、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミン五酢酸(DTMPA)、アルキル−又はアルケニル琥珀酸、可溶性シリケート、又は積層シリケート（たとえば、Hoech stからのSKS−６）を含むことができる。洗剤はまた、ビルドされなくても良く、すなわち洗剤ビルダーを実質的に有さなくても良い。洗剤は１又は複数のポリマーを含むことができる。それらの例は、カルボキシメチルセルロース(CMC)、ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、ポリカルボキシレート、たとえばポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸のコポリマー、及びラウリルメタクリレート／アクリル酸のコポリマーを包含する。洗剤は、H₂O₂源、たとえば過酸形成漂白活性剤、たとえばテトラアセチルエチレンジアミン（TAED）又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート（NOBS）と組合され得る過硼酸塩又は過炭酸塩を含んで成る漂白システムを含むことができる。他方、漂白システムは、たとえばアミド、イミド又はスルホン型のペルオキシ酸を含むことができる。本発明の洗剤組成物の酵素は、従来の安定剤、たとえばポリオール、たとえばプロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、乳酸、硼酸、又は硼酸誘導体、たとえば芳香族ボレートエステルを用いて安定化され得、そしてその組成物は、たとえばWO92／19709及びWO92／19708に記載されるようにして配合され得る。洗剤はまた、他の従来の洗剤成分、たとえば布コンディショナー、たとえばクレー、発泡増進剤、泡抑制剤、耐蝕剤、土壌−沈殿防止剤、染料、殺菌剤、螢光増白剤、又は香料を含むことができる。 pH（使用濃度での水溶液において測定される）は通常、中性又はアルカリ性、たとえば７〜11の範囲であろう。本発明の範囲内の洗剤組成物の特定の形は、下記のものを包含する：１）下記成分を含んで成る、少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する顆料として配合された洗剤組成物：２）下記成分を含んで成る、少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する顆料として配合された洗剤組成物：３）下記成分を含んで成る、少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する顆料として配合された洗剤組成物：４）下記成分を含んで成る、少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する顆料として配合された洗剤組成物：５）下記成分を含んで成る水性液体洗剤組成物：６）下記成分を含んで成る水性構造液体洗剤組成物：７）下記成分を含んで成る、少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する顆粒として配合される洗剤組成物：８）下記成分を含んで成る顆粒として配合された洗剤組成物：９）下記成分を含んで成る顆粒として配合された洗剤組成物： 10）下記成分を含んで成る水性液体洗剤組成物： 11）下記成分を含んで成る水性液体洗剤組成物： 12）下記成分を含んで成る、少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する顆粒として配合された洗剤組成物： 13）すべての又は一部の線状アルキルベンゼンスルホネートが（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈）アルキルスルフェートにより置換されている、１）〜12）に記載されるような洗剤配合物 14）下記成分を含んで成る、少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する顆粒として配合される洗剤組成物： 15）下記成分を含んで成る、少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する顆粒として配合された洗剤組成物： 16）すでに特定された漂白システムのための追加の成分又は置換体のいづれかとして安定化され又は封入された過酸を含む、１）〜15）に記載されるような洗剤配合物。 17）過硼酸塩が過炭酸塩により置換されている、１），３），７），９）及び 12）に記載されるような洗剤組成物。 18）マンガン触媒をさらに含む、１），３），７），９），12），14）及び15 ）に記載されるような洗剤組成物。マンガン触媒は、たとえば“低温漂白のための効果的なマンガン触媒(Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching)”，Nature 369 ，1994，637〜639pに記載される化合物の１つであり得る。 19）液体非イオン性界面活性剤、たとえば線状アルコキシル化第一アルコール、ビルダーシステム（たとえばホスフェート）、酵素及びアルカリを含んで成る非水性洗浄液体として配合された洗剤組成物。その洗剤はまた、アニオン性界面活性剤及び／又は漂白システムを含むことができる。皿洗い洗剤組成物本発明の脂肪分解酵素は適切には、皿洗い洗剤組成物の成分であり得る。皿洗い洗剤組成物は、アニオン性、非イオン性、カチオン性、両性又はそれらのタイプの混合である界面活性剤を含むであろう。その洗剤はまた、０〜90％の非イオン性界面活性剤、たとえば低〜非−発泡性エトキシル化プロポキシル化直鎖アルコールを含むであろう。洗剤組成物は、無機及び／又は有機タイプの洗剤ビルダー塩を含むことができる。洗剤ビルダーは、リン含有及び非リン含有型に副分割され得る。洗剤組成物は通常、１〜90％の洗剤ビルダーを含む。リン含有無機アルカリ洗剤ビルダーの例は、存在するなら、水溶性塩、特にアルカリ金属ピロリン酸塩、オルトリン酸塩、ポリリン酸塩及びリン酸塩を包含する。非リン含有無機ビルダーの例は、存在するなら、水溶性アルカリ金属炭酸塩、硼酸塩及び珪酸塩、並びに種々のタイプの水不溶性結晶性又は非晶性アルミノ珪酸塩を包含し、それらの中で、ゼオライトが良く知られた代表物である。適切な有機ビルダーの例は、アルカリ金属、アンモニウム及び置換されたアンモニウムのシトレート、スクシネート、マロネート、脂肪酸スルホネート、カルボキシメトキシスクシネート、アンモニウムポリアセテート、カルボキシレート、ポリカルボキシレート、アミノポリカルボキシレート、ポリアセチルカルボキシレート及びポリヒドロキシスルホネートを包含する。他の適切な有機ビルダーは、ビルダー性質を有することが知られている高分子量ポリマー及びコポリマー、たとえば適切なポリアクリル酸、ポリマレイン酸及びポリアクリル酸／ポリマレイン酸のコポリマー及びそれらの塩を包含する。皿洗い洗剤組成物は、塩素／臭素タイプ又は酸素タイプの漂白剤を含むことができる。無機塩素／臭素タイプの漂白剤の例は、次亜塩素酸及び次亜臭素酸リチウム、ナトリウム又はカルシウム、及び塩素化されたリン酸三ナトリウムである。有機塩素／臭素タイプの漂白剤の例は、複素環式Ｎ−ブロモ−及びＮ−クロロ −イミド、たとえばトリクロロイソシアヌル酸、トリブロモイソシアヌル酸、ジブロモイソシアヌル酸及びジクロロイソシアヌル酸、及び水溶性カチオン、たとえばカリウム及びナトリウムとのそれらの塩である。水和化合物もまた適切である。好ましくは漂白前駆体と共に、又はペルオキシ酸化合物として、無機過酸塩の形での酸素漂白剤が好ましい。適切なペルオキシ漂白剤化合物の典型的な例は、アルカリ金属過硼酸塩（四水和物及び−水和物の両者）、アルカリ金属過炭酸塩、過珪酸塩及び過リン酸塩である。好ましい活性剤材料は、TAED及びグリセロールトリアセテートである。本発明の皿洗い洗剤組成物は、酵素のための従来の安定剤、たとえばポリオール、たとえばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸、硼酸、又は硼酸誘導体、たとえば芳香族硼酸エステルを用いて安定化され得る。皿洗い洗剤組成物はまた、他の酵素、特にアミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はセルラーゼを含むことができる。本発明の皿洗い洗剤組成物はまた、他の従来の洗剤成分、たとえば解膠剤材料、充填剤材料、発泡抑制剤、耐蝕剤、土壌−沈殿防止剤、金属イオン封鎖剤、抗−土壌再沈殿剤、脱水剤、染料、殺菌剤、螢光剤、増粘剤及び香料を含むことができる。下記に、特に好ましい皿洗い組成物が例示される：１）粉末自動皿洗い組成物２）粉末自動皿洗い組成物３）粉末自動皿洗い組成物４）粉末自動皿洗い組成物５）粉末自動皿洗い組成物６）清浄界面活性剤システムを有する粉末及び液体の皿洗い組成物７）非水性液体自動皿洗い組成物８）非水性液体皿洗い組成物９）チキソトロープ液体自動皿洗い組成物 10）液体自動皿洗い組成物 11）保護された漂白剤粒子を含む液体自動皿洗い組成物 12）過硼酸塩が過炭酸塩により置換されている、１），２），３），４），６）及び10）に記載されるような自動皿洗い組成物。 13）マンガン触媒をさらに含む１）〜６）に記載されるような自動皿洗い組成物。マンガン触媒は、たとえば“低温漂白のための効果的なマンガン触媒(Effic ient manganese catalysts for low-temperature bleaching)”，Nature 369 ，1994，637〜639pに記載される化合物の１つである。さらに、本発明の第１の洗浄用脂肪分解酵素は、軟化組成物に使用され得る。本発明の脂肪分解酵素は、たとえばSurfactant and Consumer Products，Ed． J．Falbe，1987，295〜296p；Tenside Surfactants Detergents，30，(1993)，6 ，394〜399p；JAOCS，Vol．61(1984)，2，367〜376p；EP517,762 ；EP123,400 ；WO92／19,714；WO93／19,147；US 5,082,578；EP494,769 ；EP544,493 ；EP54 3,562 ；US 5,235,082；EP568,297 ；EP570,237に記載されるように織物柔軟剤に使用され得る。本発明の脂肪分解酵素は、洗剤に従来使用される濃度で組込まれ得る。本発明の脂肪分解酵素は、洗浄流体１ｌ当たり脂肪分解酵素0.00001〜１mg（純粋な酵素タンパク質として計算された）に対応する量で本発明の洗剤組成物に組込まれ得る。本発明の脂肪分解酵素はまた、たとえば有機合成（たとえばエステル化、エステル交換又はエステル加水分解反応）における触媒としてベーキング産業において、製紙製造工業（たとえばピッチ除去のための）において、及び革、羊毛及び関連産業（たとえば動物皮革、羊革又は羊毛の脱脂のための）において、並びに脱脂／脱脂肪を包含する他の用途のためにも有用である。本発明は次の例によりさらに詳細に記載されるが、但しそれらは本発明を限定するものではない。材料及び方法ドナー生物：mRNAを、十分な通気を確保するために撹拌しながら、トウモロコシグリットー含有発酵培地において増殖されたヒューミコラ・インソレンスDMS1 800から単離した。菌糸体を３〜５日間の増殖の後に収穫し、すぐに液体窒素において凍結し、そして−80℃で貯蔵した。酵母株：使用されるサッカロミセス・セレビシアエ株は、yNG231（MAT α；le u２； ura３−52； his４−539 ； pep４−δ１； cir＋）又はJG169（MATα：u ra３−52； leu２−３，112 ； his３−Ｄ200 ； pep４−1137； prc１::HIS３；prb１::LEU２； cir＋）であった。プラスミド：発現プラスミドpYES2.0（Invitrogenからの）を使用した。アスペルギルス発現ベクターpHD414を使用した。pHD414はプラスミドp775の誘導体である（EPO238,023に記載される）。pHD414の構成はさらにWO93／11249に記載されている。合計のRNAの抽出は、グアニジンチオシアネート、続く5.7ＭのCsClクッションを通しての超遠心分離により行なわれ、そしてポリ(A)⁺RNAの単離はWO94／14953 に記載される方法を用いてオリゴ（dT）−セルロースアフィニティークロマトグラフィーにより実施された。 cDNA合成及び変性：二本鎖cDNAを、ヘアーピン変性を用いて、RNaseH方法（Gu bler & Hoffman 1983，Sambrookなど、1989）によりポリ(A)⁺RNA５μｇから合成した。その方法はさらに、WO95／02043に記載されている。ヤエナリのヌクレアーゼ（Bethesda Research Laboratories）により処理された後、そのds cDNAをＴ４ DNAポリメラーゼ（Invitrogen）によりブラント末端化し、そしてそのcDNA を製造業者の説明に従って、非−パリンドローム性Bst×Ｉアダプター（１μｇ／μｌ，Invitrogen）に連結した。 cDNAライブラリーの構成：適合されたds cDNAを、遠心分離により回収し、70 ％エタノールにより洗浄し、そして水25mlに再懸濁した。大規模なライブラリー連結の前、４回の試験連結を行ない、個々においては、１mlのds cDNA（反応管＃１〜＃３）、２単位のＴ４リガーゼ（Invitrogen）及び50ng（管＃１）、100n g（管＃２）及び200ng（管＃３及び＃４）のBst×Ｉ切断酵母発現ベクターpYES 2.0(Invitrogen)(合計体積10μｌ)を用いた。最適条件下で、大規模連結を、40μｌの連結緩衝液において設定した。１μｌのアリコートを用いて、電子コンピラントＥ．コリ1061細胞を形質転換し、そしてその形質転換された細胞を力価し、そしてライブラリーを5000〜7000コロニー形成単位（c.f.u.）／プレートによりLB＋アンピシリンプレート上にプレートした。個々のプレートに、３mlの培地を添加した。細菌をこすり取り、１mlのグリセロールを添加し、そしてプールとして−80℃で貯蔵した。残る２mlを、DNA連結のために使用した。さらなる詳細のためには、WO94／14953を参照のこと。酵母ライブラリーの構成：すべての細菌クローンが酵母において試験されることを確保するために、元のプールにおける細菌クローンの数よりも５倍多くの酵母形質転換体をその限界として設定した。個々のプールからの精製されたプラスミドDNA（100ng／μｌ）の１μｌアリコートを、40μｌのコンピラントＳ．セレビシアエ JG169細胞(OD600＝500mlYPDにおいて1.5)中にエレクトロポレート(200オーム、1.5kV，25μＦ)、冷脱イオン水により２度及び１Ｍの冷ソルビトールにより１度洗浄し、１Ｍのソルビトール0. 5mlに再懸濁した(Becker & Guarante，1991)。１Ｍの冷ソルビトール１ml の添加の後、80μｌのアリコートをSC-URA＋グルコース上にプレートし、250〜4 00c.f.u．／プレートを得、そして30℃で３〜５日間インキュベートした。陽性コロニーの同定：３〜５日間の増殖の後、寒天プレートを、SC−オリーブ油／ブリリアントグリーンプレート上にレプリカ培養し、そして次に脂肪分解活性の検出のために30℃で２〜４日間インキュベートした。SC−URA−オリーブ油／ブリリアントグリーンプレートは、SC−URA＋２％グルコース＋0.6％オリーブ油＋１％ブリリアントグリーン溶液＋0.036％ポリビニルアルコール（MW70,000 〜100,000Sigma Ｐ−1763−ウラシル）である。インキュベーションの後、脂肪分解酵素−陽性コロニーを、グリーンの光輪をまわりに有する白色コロニーとして同定した。酵素−陽性コロニーからの細胞を寒天上に単一のコロニー単離のために広げ、そして酵素を生成する単一のコロニーを、同定される脂肪分解酵素−生成コロニーの各々のために選択した。陽性クローンの特徴化：陽性クローンを単一のコロニーとして得、そのcDNA挿入体をビオチニル化ポリリンカープライマーを用いて酵母コロニーから直接増幅し、磁気ビーズ(Dynabead M-280，Dynal)システムにより精製し、そしてチェイン−ターミネーション法（Sangerなど、1977）及びSequenase System(United St ates Biochemical)を用いて個々のcDNAクローンの５′端を配列決定することによってそれぞれ特徴づけた。アスペルギルスにおける発現のためのcDNA遺伝子の単離：１又は複数の脂肪分解性酵素生成酵母コロニーを、50mlのガラス製試験管における20mlのYPDブイヨン中に接種した。その管を２日間30℃で振盪した。細胞を、3000rpmでの10分間の遠心分離により収穫した。 DNAをWO94／14953に従って単離し、そして水50μｌに溶解した。DNAを用いて、WO94／14953に記載されるようにしてＥ．コリを形質転換した。プラスミドDNA を標準方法を用いてＥ．コリから単離し、そして制限酵素分析により分析した。 cDNA挿入体を適切な制限酵素を用いて切断し、そしてアスペルギラス発現ベクター中に連結した。アスペルギルス・オリザエ又はアスペルギルス・ニガーの形質転換：プロトプラストをWO95／02043，p16，21行〜p17，12行に記載されるようにして調製することができる。 100μｌのプロトプラスト懸濁液を、STC(1.2Ｍのソルビトール、10mMのトリス −HCl，pH7.5，10mMのCaCl₂)10μｌ中、適切なDNA５〜25μｇと共に混合する。プロトプラストをp3sr2(Ａ．ニジュランスamdS遺伝子担持のプラスミド)と共に混合する。その混合物を室温で25分間、放置する。0.2mlの60％ PEG4000(BDH 29 576)，10mMのCaCl₂及び10mMのトリス−HCl，pH7.5を添加し、そして注意して混合し（２度）、そして最後に、前記同じ溶液0.85mlを添加し、そして注意して混合する。その混合物を室温で25分間放置し、2500ｇで15分間回転せしめ、そしてペレットを1.2Ｍのソルビトール２mlに再懸濁する。さらに１回の沈降の後、バックグラウンド増殖を防止するために、1.0Ｍのスクロース、pH7.0、窒素源としての10mMのアセトアミド及び20mMのCsClを含む最少プレート〔Cove；Biochem ．B iophys．Acta 113 （1966）51−56〕上に、プロトプラストを広げる。37℃で４〜７日間のインキュベーション後、胞子を取り、そして単一コロニーのために広げる。この方法をくり返し、そして第２の再単離の後、単一のコロニーの胞子を定義された形質転換体として貯蔵する。Ａ．オリザエ形質転換体の試験：個々の形質転換体を10mlのYPM に接種し、そして増殖せしめた。30℃で２〜５日間のインキュベーションの後、 10mlの上清液を除去した。脂肪分解活性が、10μｌの上清液を、0.1Ｍのトリス、pH９、0.1ＭのCaCl₂、１％のTritonＸ−100、0.5％のオリーブ油を含む寒天プレートにパンチされた４mmの直径の穴に適用することによって同定された。脂肪分解活性は、濁った光輪の形成により示される。ハイブリダイゼーション条件（本発明のDNA構造体の性質ii）の評価に使用される）：オリゴヌクレオチドプローブと、“類似する”DNA配列との間のハイブリダイゼーションを決定するための適切な条件は、５×SSCにおいてハイブリダイズするDNA配列を含むフィルターのプレソーク、及び５×SSC、５×Denhardt's 溶液、50mMのリン酸ナトリウム、pH6.8及び50μｇの変性された音波処理ウシ胸腺DNAの溶液における−50℃で１時間の配列のプレハイブリダイゼーション、続いて、50℃で30分間、２×SSC，0.2％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)での３回の洗浄を包含する。ハイブリダイゼーションに使用される適切なオリゴヌクレオチドプローブを、配列番号１に示されるDNA配列又は前記配列の適切なサブ配列（たとえばその20 個のヌクレオチドフラグメント）に基づいて調製することができる。他方、適切なオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に基づいても調製され得る。免疫学的交差反応性：免疫学的交差反応性を決定することに使用されるべき抗体を、精製された脂肪分解酵素の使用により調製することができる。より詳しくは、本発明の酵素に対する抗血清は、N．Axelsenなど、A ．Manual of Quantitat ive Immunoelectrophoresis ，Blackwell Scientific Publications，1973，Cha pter 23、又はA．Johnstone and R．Thorpe，Immunochemistry in Practice ， Blackwell Scientific Publications，1982(より特定には27〜31ページ)により記載される方法に従ってウサギ（又は他のゲッ歯動物）を免疫化することによって生成され得る。精製された免疫グロブリンを、前記抗血清から、たとえば塩沈殿〔(NH₄)₂SO₄〕、続く透析及びDEAE−Sephadex^TM上でのイオン交換クロマトグラフィー処理により得ることができる。タンパク質の免疫化学的特徴化は、Qutc herlong二重拡散分析（O．Quchterlong：Handbook of Experimental Immunology (D．M．Weir，Ed.)，Blackwell Scientific Publications，1967，655〜706p）により、交差された免疫電気泳動（N．Axelsenなど、前記、Chapter３及び４）により、又はロケット免疫電気泳動（N．Axelsenなど、前記、Chapter２）により実施され得る。培地： YPD ：10ｇの酵母抽出物、20ｇのペプトン、900mlまでの水。オートクレーブされた20％グルコース(滅菌フィルター処理された)100mlが添加された。 YPM ：10ｇの酵母抽出物、20ｇのペプトン、900mlまでの水。オートクレーブされた20％マルトデキストリン(滅菌フィルター処理された)100mlが添加された。 10×Basal塩：66.8ｇの酵母窒素基材、100ｇの琥珀酸、60ｇのNaOH、1000mlまでの水、滅菌フィルター処理された。 SC−URA ：90mlの10×Basal塩、20％カサミノ酸22.5ml、１％トリプトファン９ml、806mlまでの水、オートクレーブされた５％トレオニン3.6ml及び20％グルコース又は20％ガラクトース90mlが添加された。 SC−URA寒天：SC−URA, 20ｇ／ｌの寒天が添加された。オリーブ油：Sigma O−1500。ブリリアントグリーン溶液：水中、４ml／ｌのブリリアントグリーン(Sigma B −6756)。例１ 50のプールにおいて約10⁶の個々のクローンから成るＨ．インソレンスDSM1800 からのＥ．コリライブラリー構成した。ライブラリーからの20の個々のクローンからDNAを単離し、そしてcDNA挿入についての分析にゆだねた。その挿入頻度は90％以上であることが見出され、そしてその平均挿入サイズは約1400bpであった。いくつかのプールからのDNAを用いて、酵母を形質転換し、そして200〜500個の酵母コロニーを含む50〜100のプレートを個々のプールから得た。 70個以上の陽性コロニーを同定し、そして寒天プレート上で単離した。cDNA挿入体を酵母コロニーから直接的に増幅し、そして上記の材料及び方法セクションに記載されているようにして特徴づけた。脂肪分解酵素をコードするcDNA配列を、配列番号１に示す。続いて、脂肪分解酵素をコードするcDNAを、上記のようにしてアスペルギルスにおける発現のために単離し、そして標準の方法を用いてＥ．コリを形質転換した。２つのＥ．コリコロニーを個々の形質転換体から単離し、そしてDNA挿入体を切断する制限酵素HindIII及びXbaＩにより分析した。それらのクローンの１つからのDNAを用いて、酵母株JG169を形質転換した。例２アスペルギルスにおいて遺伝子を発現するために、cDNAを単離し、そしてHind III／XbaＩにより消化し、ゲル及び精製に基づくサイズ分別にゆだね、そして続いてpHD414に連結し、プラスミドpA2L79をもたらした。Ｅ．コリにおける増幅の後、そのプラスミドを用いて、上記一般的な方法に従ってＡ．オリザエ又はＡ．ニガーを形質転換した。Ａ．オリザエ形質転換体の試験個々の形質転換体を、上記のようにして脂肪分解活性について試験した。いくつかの形質転換体は、アスペルギルス・オリザエのバックグラウンドよりも有意に高い脂肪分解活性を有した。これは、アスペルギルス・オリザエにおける脂肪分解酵素の有意な発現を示す。最高の脂肪分解活性を有する形質転換体を選択し、そしてYPM培地を有する500 mlの振盪フラスコに接種した。良好な換気を確保するために十分な撹拌を伴っての３〜５日間の発酵の後、培養物ブイヨンを2000ｇで10分間、遠心分離し、そして上清液を回収し、そして分析した。上清液における脂肪分解活性は、上記のようにして同定された。バッチ発酵バッチ発酵を、炭素源としてのマルトースシロップ、窒素源としての尿素及び酵母抽出物を含んで成る培地において実施した。バッチ発酵を、3.0％の前記炭素源及び0.4％の前記窒素源を含んで成る培地中に問題のＡ．オリザエ宿主細胞の振盪フラスコ培養物を接種することによって行なった。pH7.0及び34℃での24 時間の培養の後、発酵を停止し、この後、酵素を遠心分離、限外濾過、透明濾過及び細菌濾過により回収した。例３Ｈ．インソレンス脂肪分解酵素の精製及び特徴化バッチ発酵上清液を遠心分離し、そして細胞残骸を含む沈殿物を捨てた。上清液を固体硫酸アンモニウムにより60％飽和に調節し、そして一晩、放置した。クチナーゼ活性を含む沈殿物を遠心分離により分離した。硫酸アンモニウム沈殿物を水に溶解し、そして希酢酸によりpH６に調節した。脂肪分解活性を含むサンプルをBucitracinアガロースカラムに通し、Ａ．オリザエに存在するアルカリプロテアーゼ活性を除いた。Bacitracinアガロースに結合しない脂肪分解活性を流出液として集めた。活性を含むプールをpH5.8に調節し、そしてイオン強度を２ミリジーメンスに調節した。サンプルを、25mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.8)により平衡化されたカチオン交換体SP-Sepharose^TM高性能Pharmacia^TMカラム上に適用した。結合された活性を、同じ緩衝液を用いて線状塩グラジエントにより溶離した。精製されたタンパク質の分子量を、SDS−PAGE PHAST８−25％グラジエントゲル(PHAST System^TM，Pharmacia)を用いて決定した。その分子量は、20〜21KDであると評価された。タンパク質の等電点を、製造業者の説明書に従って、Ampholine^TMPAGEプレート、pH3.5−9.5（Pharmacia LKB）を用いて決定した。pIは８であることが見出された。脂肪分解酵素は、フェニルメチルスルホニルフルオリドにより阻害されることが見出され、これは溶媒−感受性活性部位及び従って、エステラーゼ活性を示す。脂肪分解酵素のリパーゼ活性及び比活性についてのアッセイリパーゼ活性を、乳化剤としてアラビアゴムを用いてグリセロールトリブチレート(MERCK)を乳化することによって調製された基質を用いて決定した。リパーゼ活性を、pH−stat法（Radiometer VTT Titrator Tmを用いる）を用いて、pH７でアッセイした。１単位のリパーゼ活性（LU）を、１分当たり脂肪酸１ μモルを生成するために必要とされる量として定義した。 pH７での比活性は、少なくとも約12000LU／mgであることが決定された。基質特異性：長鎖基質（オリーブ油）及び短鎖基質（グリセロールトリブチレート）に対する本発明のＨ．インソレンス脂肪分解酵素（配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する）の脂肪分解活性を比較するために、下記２つのアッセイをpH９で実施した：１）Sigmaリパーゼ基質エマルジョン(Sigmaカタログ＃800−１)を用いてのSig maオリーブ油基質アッセイ、及び２）乳化剤としてアラビアゴムを用い、そして基質としてトリブチリン（グリセロールトリブチレート）を用いてのアッセイ。両アッセイは、pH９でpH−stat 法を用いて行なわれた。pH９で、脂肪分解酵素の活性は、それぞれアッセイ１及び２において約500Sigmaリパーゼ単位／OD280及び約1500LU／OD280であり、これは脂肪分解酵素が短鎖基質、たとえばトリブチリンに対して良好な活性を有することを示唆する。Ｈ．インソレンス脂肪分解酵素のpH最適異なったpH値での酵素の脂肪分解活性を、pH-stat法を用い、基質としてグリセロールトリブチレート及び乳化剤としてアラビアゴムを用いて調査した。pH（ pH６，７，８，９，10）の関数としての酵素の活性が図１に示される。最適pHは約８であると思われ、そして高い％の最大活性がpH10でまだ保持された。Ｎ−末端配列決定最後に、本発明のＨ．インソレンスDSM1800脂肪分解酵素を、逆相HPLCを用いて精製した。前記酵素のＮ−末端アミノ酸配列を、Applied Biosystems配列決定機を用いて27個の残基について決定した。その得られる配列は配列番号３に示されており、ここでＸaaはほとんど確実にシステイン残基である割り当てられていない残基を示す。位置12において、Gly 及びAlaの両者は等量で見出された。例４ “最初の洗浄”の脂肪分解効果を評価するためのアッセイにおける本発明のＨ．インソレンスDSM1800脂肪分解酵素の性能本発明の脂肪分解酵素の織物／洗濯物洗浄性能を、温度調節されたTerg-O-Tom eter(TOM)、続く乾燥で実施される１サイクルの洗浄試験により試験した。実験条件は次の通りであった：洗浄流体：ビーカー当り1000ml。スワッチ：ビーカー当たり７個の綿スワッチ（９×９cm）。染色：Sudan Red（Sigma）により着色されたラード(１ｇのラード当たり0.75m gのSudan Red)。70℃に加熱された、50μｌの着色されたラードを個々のスワッチの中央に適用した。次に、スワッチを75℃で25分間、オーブン中で加熱し、そして最初の洗浄の前、室温で一晩、貯蔵した。水の硬度：3.2mMのCa²⁺／Mg²⁺（５：１の比）。洗剤：５ｇ／ｌの標準市販のEuropeanコンパクト粉末洗剤(Ariel^TMFutur)。pH 調節はされていない。脂肪分解酵素の濃度：０LU／ｌ（対照）及び12500LU／ｌ。洗浄時間：20分間。洗浄温度：30℃。すすぎ：水道水で15分間。乾燥：室温で一晩（約20℃、30〜40％RH）。評価：スワッチを洗浄し、すすぎ、そして乾燥した後、残留する脂肪脂質を、 Soxhlet抽出装置を用いて石油エーテルにより抽出した。溶媒を蒸留し、そしてスワッチから抽出された残留脂肪物質の量を重量により決定した。結果：酵素を有さない洗浄液体により洗浄されたスワッチにおける残留脂肪物質の量に対して、酵素含有洗浄液体でのスワッチの洗浄は、脂肪物質の16％の除去をもたらした。問題の脂肪分解酵素（本発明の脂肪分解酵素）が、織物の洗浄において脂質の卓越した“最初の洗浄”除去が可能であることがそれらの結果から明らかである。例５本発明のＨ．インソレンスDSM1800脂肪分解酵素の基質親和性次の方法は、非イオン性界面活性剤の存在下で、酵素を含む緩衝されたアルカリ水性相と接触して存在する脂質基質相（この場合、オリーブ油）中に／上に蓄積する脂肪分解酵素の能力を評価するように企画される。この例において、本発明の上記脂肪分解酵素の基質親和性が、市販の脂肪分解酵素Lipolase^TM（Novo N ordisk A/S，Bagsvaerd，Denmarkから入手できる）の基質親和性とが比較された。方法１．緩衝溶液(100mMのグリシン、pH9.0)の５mlアリコートを、２種の同一の密封できる20mlのバイアルの各々に入れ；２．選択された酵素を、５〜10LU／mlの範囲の濃度を付与するよう両バイアルに添加し（両バイアルにおいて同じ濃度）；３．オリーブ油５mlを１つのバイアル（“サンプル”バイアル）に添加し、そして両バイアルを激しく振盪し、そして４℃で24時間インキュベートし；４．それぞれ、“サンプル”バイアル及び“対照”バイアルにおける水性相での残留する脂肪分解活性（下記にＹで示される；LU／ ml）を決定した。 Ys／Yrの比が、問題の酵素の基質親和性の測定を与える。結果：それぞれ、本発明の脂肪分解酵素及びLipolase^TMに関する結果が、次の表に示されている。本発明の酵素がオリーブ油に対して非常に高い親和性を示すことが、上記から明らかである。例６アルコールエトキシレートを含む混合された単分子層における本発明のＨ．インソレンスDSM1800脂肪分解酵素の脂肪分解活性混合された単分子層を、KSV−5000単層装置（KSV Instruments, Finland）を用いて、水性相（10mMのグリシン、pH10.0，0.1ＭのEDTA；25℃の温度）上に広げられたジグリセリド（ジカプロイン）及び−成分アルコールエトキシレート（ヘプタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル）から調製した。その表面圧力を所望する値（この場合、30mN／ｍ）に調節し、そして選択された酵素（10 LU）を水性相中に注入した。脂肪分解作用は、単分子層を圧縮する移動性バリヤーが、水不溶性基質分子がより水溶性の生成物を付与するために加水分解されるにつれて、一定の表面圧力を維持するために移動されるべきである速度を通してそれ自体明らかにする。この方法を用いれば、特定の脂肪分解酵素が、脂肪分解活性が終わるにつれて酵素により加水分解されないまま存続する基質の最終領域の％を示すパラメーターβにより特徴づけられる。この例において、本発明のＨ．インソレンスDSM1800酵素を、市販の酵素Lipol ase^TMと比較した。結果：結果は下記表に要約されている。本発明の脂肪分解酵素はアルコールエトキシレート（すなわち非イオン性界面活性剤）の存在下で脂質加水分解をひじょうに良く実施することが後者の結果から明らかである。配列の列挙配列番号１：Ｈ．インソレンス脂肪分解酵素をコードするDNA配列（成熟酵素＋シグナルペプチド）配列番号２：Ｈ．インソレンス脂肪分解酵素のアミノ酸配列（成熟酵素＋シグナルペプチド）配列番号３：Ｎ−末端アミノ酸配列（成熟酵素）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:645） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者コフォド，レネベンケデンマーク国，デーコー−2880 バグスバエルト，ノボアレ，ノボノルディスクアクティーゼルスカブ

Claims

【特許請求の範囲】１．脂肪分解活性を示す酵素をコードするDNA配列を含んで成るDNA構造体であって、前記DNA配列が、ａ）サッカロミセス・セレビシアエDSM9975中のプラスミドから得ることができる、配列番号１に示されるDNA配列及び／又は脂肪分解酵素をコードするDNA配列、又はｂ）サッカロミセス・セレビシアエDSM9975中のプラスミドから得ることができる、配列番号１に示されるDNA配列及び／又は脂肪分解酵素をコードするDNA配列の類似体を含んで成り、ここで前記類似体が、ｉ）サッカロミセス・セレビシアエDSM9975中のプラスミドから得ることができる、配列番号１に示されるDNA配列及び／又は脂肪分解酵素をコードするDNA配列と相同であり、そして／又は、 ii）サッカロミセス・セレビシアエDSM9975中のプラスミドから得ることができる、配列番号１に示されるDNA配列及び／又は脂肪分解酵素をコードするDNA配列と同じオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズし、そして／又は iii）サッカロミセス・セレビシアエDSM9975中のプラスミドから得ることができる、配列番号１に示されるDNA配列及び／又は脂肪分解酵素をコードするDNA配列を含んで成るDNA配列によりコートされるペプチドと相同であるポリペプチドをコードし、そして／又は iv）サッカロミセス・セレビシアエDSM9975中のプラスミドから得ることができ、そして／又はヒューミコラインソレンスDSM1800に由来する、配列番号１に示されるDNA配列及び／又は脂肪分解酵素をコードするDNA配列によりコードされる精製された脂肪分解酵素に対して生ぜしめられた抗体と免疫学的に反応性であるポリペプチドをコードすることを特徴とするDNA構造体。２．脂肪分解活性を示す酵素をコードする前記DNA配列が微生物から得ることができる請求の範囲第１項記載のDNA構造体。３．前記DNAが糸状菌又は酵母から得ることができる請求の範囲第２項記載のD NA構造体。４．前記DNA配列が、チエラビアの株、カエトミウムの株、ゲラシノスポラの株、ニューロスポラの株、ポドスポラの株、サルダリアの株又はヒューミコラの株から得ることができる請求の範囲第３項記載のDNA構造体。５．前記DNA配列が、カエトミウムの株又はヒューミコラの株、特にＨ．インソレンスの株から得ることができる請求の範囲第４項記載のDNA構造体。６．前記DNA配列が、Ｈ．インソレンスDSM1800のDNAライブラリーから単離され、又はそのライブラリーに基づいて生成される請求の範囲第５項記載のDNA構造体。７．請求の範囲第１〜６のいづれか１項記載のDNA構造体を含んで成る組換え発現ベクター。８．請求の範囲第１〜６のいづれか１項記載のDNA構造体又は請求の範囲第７項記載の組換え発現ベクターを含んで成る細胞。９．真核細胞、特に真菌細胞、たとえば酵母細胞又は糸状菌細胞である請求の範囲第８項記載の細胞。 10．前記細胞がアスペルギルス又はトリコダーマの株、特にアスペルギルス・オリザエ又はアスペルギルス・ニガーの株に属する請求の範囲第９項記載の細胞。 11．脂肪分解活性を示す酵素の製造方法であって、前記酵素の生成の助けとなる条件下で請求の範囲第８〜10のいづれか１項記載の細胞を培養し、そして前記培養物から酵素を回収することを含んで成る方法。 12．ａ）請求の範囲第１〜６のいづれか１項記載のDNA構造体によりコードされ、そして／又はｂ）請求の範囲第11項記載の方法により生成され、そして／又はｃ）サッカロミセス・セレビシアエDSM9975中のプラスミドから得ることができ、そして／又はヒューミコラインソレンスDSM1800に由来する、配列番号１に示されるDNA配列及び／又は脂肪分解活性をコードするDNA配列によりコードされる精製された脂肪分解酵素に対して生ぜしめられた抗体と免疫学的に反応性である、脂肪分解活性を示す酵素。 13．請求の範囲第12項記載の脂肪分解酵素を含んで成る酵素調製物。 14．請求の範囲第12項記載の脂肪分解酵素を含んで成る洗剤添加物。 15．請求の範囲第12項記載の脂肪分解酵素を含んで成る洗剤組成物。 16．洗濯物洗浄のための請求の範囲第15項記載の洗剤組成物。 17．皿洗いのための請求の範囲第15項記載の洗剤組成物。