JPH11502411A

JPH11502411A - アルカリ脂肪分解酵素

Info

Publication number: JPH11502411A
Application number: JP8528808A
Authority: JP
Inventors: 哲平山; ハレキエール，トルベン
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1995-03-30
Filing date: 1996-03-27
Publication date: 1999-03-02
Also published as: DE69628642T2; EP0817838A1; WO1996030502A1; EP0817838B1; AU5002096A; DE69628642D1

Abstract

(57)【要約】アルカリ脂肪分解酵素は、脂肪分解酵素を産生することが以前には報告されていない２つの密接に関連した属であるボトリオスファエリア（Botryosphaeria）又はグイグナルジア（Guignardia）の真菌株から得ることができる。その新規の脂肪分解酵素は、pH10周辺で最適活性を有し、界面活性剤に用いるのに十分に適している。有利には、その微生物は、適切な発現系が十分に開発されている子嚢菌類である。

Description

【発明の詳細な説明】アルカリ脂肪分解酵素技術分野本発明は、アルカリ脂肪分解酵素に、脂肪分解酵素産生微生物株に、脂肪分解酵素を生産するための方法に、及び前記脂肪分解酵素を含む界面活性組成物に関する。背景技術いくつかのイーストのために、布及び他の繊維から脂質又は脂肪染色を除去するために界面活性剤として脂肪分解酵素が用いられている。これにより、先行技術は、界面活性添加物としての種々の微生物のリパーゼの使用を示唆する。例としてはヒュミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)（サーモマイセス・ラヌギノスス(Thermomyces lanuginosus)とも呼ばれる、EP258 068及びEP305216）、リゾムコル・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)（EP238023）、カンジダ・アンタルクチカ（Candida antarctica）（EP214761）、Ｐ．アルカリゲネス（P．alcaligenes）及びＰ．シュードアルカリゲネス（P. pseudoalcalig enes ）のようなシュードモナス(Pseudomonas)の種々の種（EP218272）、Ｐ．セパシア（P ．cepacia）（EP331376）、バチルス（Bacillus）、例えばＢ．サブチリス(B ．subtilis)(Dartois ら、(1993)Biochemica et Biophysica Acta 1131， 253〜260)、Ｂ．ステアロサーモフィルス(B．stearothermophilus)(JP−A 64−7 4992)及びＢ．プミルス(B ．pumilus)(WO 91／16422)由来のリパーゼを含む。リパーゼのような酵素の商業的生産のために、より高い収率で適切な宿主生物内で前記酵素を発現することが好ましい。アスペルギルス(Aspergillus)内での子嚢菌類(Ascomycetes)からの酵素の発現を含む種々の発現系が利用できる（EP2 38023）。多くの界面活性剤は溶液中の高いpH（例えばpH10周辺）でアルカリ性であり、高いpHにおいて高い活性を有する脂肪分解酵素についての必要性がある。脂肪分解酵素は、適切な発現系が利用できるタイプの微生物から得られるはずである。発明の概要驚くことに、我々は、アルカリ脂肪分解酵素が、以前には脂肪分解酵素を産生すると報告されていない２つの密接に関連する属であるボトリオスファエリア（Botryosphaeria ）又はグイグナルジア（Guignardia）の真菌株から得ることができることを見い出した。新規の脂肪分解酵素は、界面活性剤に用いるのに十分に適したpH10周辺で最適な活性を有する。有利には、微生物は、適切な発現系が十分に開発される子嚢菌類である。従って、本発明は、ボトリオスファエリアもしくはグイグナルジアの株から得られ、又はそれらの株により産生される精製された脂肪分解酵素に対して生ずる抗体と免疫学的に反応し、そして50mM Ca²⁺の存在下で９〜11の範囲のpHで最適活性を有する脂肪分解酵素を提供する。本発明の他の態様は、配列番号：１，２，３，４及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアルカリ脂肪分解酵素を提供する。本発明は、生物学的に純粋な培養物としてのボトリオスファエリアの新規な脂肪分解酵素産生株も提供する。他の態様において、本発明は、アルカリ脂肪分解酵素を生産するための方法であって、適切な栄養培地でボトリオスファエリア又はグイグナルジアの脂肪分解酵素産生株を培養し、次にアルカリ脂肪分解酵素を回収することを含むことを特徴とする方法を提供する。本発明は、更に、アルカリ脂肪分解酵素を生産するための方法であって、ａ）ボトリオスファエリア又はグイグナルジアの脂肪分解酵素産生株から脂肪分解酵素をコードするDNA フラグメントを単離するステップと、ｂ）適切なベクターにおいて適切な発現シグナルと前記DNA フラグメントを組み合わせるステップと、ｃ）前記ベクター又はその一部を適切な宿主内に導入するステップと、ｄ）脂肪分解酵素の発現を誘導する条件下で前記宿主生物を培養するステップと、ｅ）前記培養培地から脂肪分解酵素を回収するステップと、を含むことを特徴とする方法を提供する。最後に、本発明は、有効量の前記脂肪分解酵素と共に界面活性剤を含む界面活性組成物を提供する。図面の簡単な記載図１及び２は、各々ボトリオスファエリア種CBS 102.95及びＢ．リビス（B．r ibis）CBS 504.94により産生された脂肪分解酵素についての脂肪分解酵素活性対 pHのグラフを示す。発明の詳細な記載微生物本発明に用いた微生物の株はボトリオスファエリア（Botryosphaeria）又はグイグナルジア（Guignardia）属に属する。その２つの属は密接に関連し、M．E． Barrにより同義語であると考えられた(Contrib．Univ．Mich．Herb.，９： 532 〜638，1972)が、ほとんどの著者はそれらは別個の属であると考える。例えばA ．Sivanesan(J．Cramer，Vaduz，701 pp 1984)を参照のこと。両方の属は、Richard．T．Hanlin（Illustrated Genera of Ascomycetes，APS Press；The American Phytopathological Society，St．Paul，Minnesota，199 0，p．46〜49）により記載される。ボトリオスファエリア属は、Punithalingam ，E及びHolliday，P．(1973)（CMI Descriptions of Pathogenic Fungi and Bac teria No．395）によっても記載される。培養した場合、その株はフシコッカム（Fusicoccum）状態又は微小分生子（microconidal）状態に進展し得る。２つの株は単離されており、Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS)，Oos terstraat 1，Postbus 273， NL−3740 AG Baarn，Netherlandsに特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、本発明者らにより寄託されている。その２つの株は、普通の分類法により分類される。株の寄託データ及び分類学的同定は次の通りである：また、次の公的に利用できる株を本発明に用いることができる。上述の株は以下の微生物のための寄託機関から自由に利用できる。 MAFF：Ministry of Agriculture，Forestry and Fisheries，National Instit ute of Agro-Biological Research，1-2 Kannon-dai 2-chome，Tsukuba，Ibarak i 305，Japan． JCM：Japan Collection of Microorganisms，RIKEN，Wako，Sai tama 351-01，Japan． IFO：Institute for Fermentation，Osaka，17-85，Juso-honmachi 2-chome， Yodogawa-ku，Osaka 532，Japan． CBS：Centraal Bureau voor Schimmelcultures，Oosterstraatl，3740 AG Baa rn，Netherlands． ATCC：American Type Culture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockvill e，Maryland 20852，USA。脂肪分解酵素を産生することができるこれらの株の変異体及び突然変異体も本発明に用いることができる。脂肪分解酵素の生産脂肪分解酵素は、当該技術で公知である方法に従って、又は本明細書の実施例に記載されるように、適切な栄養培地中で上述の微生物のいずれかを培養し、必要に応じて次に回収及び精製することにより生産することができる。本脂肪分解酵素は、それ自体当該技術で周知である方法、例えば脂肪分解酵素をコードするDNA フラグメントを単離し、適切なベクター内で適切な発現シグナルにDNA フラグメントを組み合わせ、自己複製プラスミド又は染色体内に一体化されるもののいずれかとして、適切な宿主（例えば糸状菌、好ましくはアスペルギルス属のメンバー）内に前記ベクター又はその一部を導入し、前記脂肪分解酵素の発現を導く条件下で宿主生物を培養し、そしてその培地から脂肪分解酵素を回収することにより、組換えDNA 技術によっても得ることができる。 DNA 配列の単離は、次のステップ：ａ）ボトリオスファエリア又はグイグナルジアの脂肪分解酵素産生株からのcD NAライブラリーを適切なベクター内にクローニングするステップと、ｂ）適切なイースト宿主細胞を前記ベクターで形質転換するステップと、ｃ）アルカリ脂肪分解酵素を発現するために適切な条件下で、形質転換されたイースト宿主細胞を培養するステップと、ｄ）ステップ（ｃ）で発現された脂肪分解酵素活性を決定することにより陽性クローンについてスクリーニングするステップと、を含むいわゆる発現クローニングにより行うことができる。発現クローニングは、WO93／11249 に又はH．Dalboge及び H．P．Heldt−Hans en(Mol．Gen．Genet.（１994）243：253〜260)に記載されるように行うことができる。好ましい異種宿主細胞は、例えばEP−Ａ−0 238 023 に記載される発現系を用いる、アスペルギルスの株、例えばＡ．オリザエ(A ．oryzae)又はＡ．ニゲル（A ．niger）である。培養の後、脂肪分解酵素は、疎水クロマトグラフィーイオン交換クロマトグラフィー及びそれらの組み合わせのような慣用的方法によって培養ブイヨンから回収し、精製することができる。脂肪分解酵素本発明の酵素は脂肪分解酵素である。本文脈において、“脂肪分解酵素”という用語は、Recommendations（1992）of the International Union of Biochemis try and Molecular Biology（IUBMB）に従って、酵素分類番号E．C．3．1．1.− （カルボン酸エステルヒドロラーゼ）下に分類される酵素を示す。これにより脂肪分解酵素は、E．C．3．1．1.の文脈に言及されるエステル結合のタイプの少くとも１つに対して加水分解活性を示す。本発明の脂肪分解酵素は、好ましくは（基質としてトリグリセリドとの）リパーゼ活性を有する。酵素の特性本発明の脂肪分解酵素は、アルカリ性pHでの高い活性を特徴とする。更に詳しくは、それらは50mM Ca²⁺の存在下で９超、特に９〜11の範囲のpHで最適活性を有する。図１及び２は、各々ボトリオスファエリアCBS 102.95及びＢ．リビスCBS 504. 94により産生された脂肪分解酵素についての脂肪分解酵素活性対pHのグラフを示す。等電点はCBS 102.95からの脂肪分解酵素について3.8であり、CBS 504.94からの脂肪分解酵素について 3.4である。分子量にCBS 102.95からの脂肪分解酵素について55,000ダルトンであり、CBS 504.94からの脂肪分解酵素について64,000である。特異的脂肪分解酵素活性は、CBS 102.95からの脂肪分解酵素について400L U／Ａ₂₈₀であり、CBS 504.94からの脂肪分解酵素について300LU／Ａ₂₈₀である（Ａ₂₈₀＝280nm における吸光度から決定された蛋白質のmg）。１脂肪分解酵素単位（LU）は、標準的条件（即ち30.0℃；pH 7.0；及びトリブチリン基質）下で、分当りに１μmol の滴定可能な酪酸を遊離する酵素の量である。免疫化学特性ボトリオスファエリア又はグイグナルジアの株に対してネイティブであり、言及される特性を有する脂肪分解酵素の特性と同一又は部分的に同一である免疫化学特性を有するアルカリ脂肪分解酵素は本発明の範囲内である。免疫化学特性は、免疫学的交差反応同一性テストにより決定することができる。その同一性テストは、公知のオクタロニ−二重免疫拡散法により、又はI ．M． Roitt（Immunology，Gower Medical Publishing(1985)及びN ．H．Axelsen（Hand book of Immunoprecipitation−in−Gel Techniques，Blackwell Scientific Pu blications(1983)，Chapters５及び14）に従う双頭交差免疫電気泳動により行うことができる。免疫化学的同一性（抗原同一性）及び部分的免疫化学的同一性（部分的抗原同一性）という用語はAxelsen、前掲、Chapters５，19及び20 並びにRoitt、前掲、Chapter ６に記載される。免疫学的テストに用いるための一特異的抗血清は、例えばN．H．Axelsen、前掲のChapter 41又はN．H．Axelsen ら（A Manual of Quantitative Immunoelect rophoresis，Blackwell Scientific Publications(1973)）のChapter 23に記載されるように、精製された脂肪分解酵素に対して、例えばウサギにおいて発生させることができる。界面活性添加物本発明によれば、脂肪分解酵素は、典型的には、界面活性組成物中の添加物として用いることができる。この添加物は、非ダスト性粒子、安定化液、スラリー又は保護酵素として便利には製剤化される。本発明の脂肪分解酵素を含む界面活性添加物についての適切な活性範囲は、界面活性添加物のｇ当り純粋な酵素蛋白質0.01〜100mgである。界面活性剤本発明の脂肪分解酵素は、界面活性剤中に便利に用いられる濃度で組み込むことができる。脂肪分解酵素蛋白質の量は、界面活性剤のグラム当り 0.001〜10mg 又は洗浄液のリッター当り0.01〜100mgであり得る。界面活性組成物本発明によれば、脂肪分解酵素は、典型的には、界面活性組成物の構成物であり得る。これにより、それは非ダスト性粒子、安定化液、保護された酵素の形態における界面活性組成物中に含まれ得る。非ダスト性粒子は、US 4,106,991及び 4,661,452(両方ともNovo Industri A/S )に開示されるように製造することができ、必要に応じて当該技術で周知である方法によって、被覆することができる。ワックス様被覆材料の例は、平均分子量 1000〜20000 のポリ（エチレンオキシド）製品（ポリエチレングリコール、PEG ）；16〜50エチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール；アルコールが12〜20炭素原子を含み、15〜80エチレンオキシド単位があるエトキシ化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ−、ジ−及びトリグリセリドである。流動床技術による適用に適したフィルム形成性被覆材料の例は、特許GB 1483591に供される。液状酵素調製物は、例えば確立された方法に従って、プロピレングリコール、糖もしくは糖アルコール、乳酸又はホウ酸のようなポリオールを添加することにより安定化することができる。他の酵素安定剤は、当該技術で公知である。保護された酵素は、EP 238,216に開示される方法に従って調製することができる。本発明の界面活性組成物は、いずれかの便利な形態、例えば粉末、粒状体、ペースト又は液体としての形態であり得る。液体状界面活性剤は、典型的には70％までの水及び０〜30％の有機溶媒を含む水性又は非水性であり得る。本界面活性組成物は、その各々が陰イオン性、非イオン性、陽イオン性又は双性イオン性であり得る１又は複数の界面活性剤を含む。本界面活性剤は、通常、０〜50％の直鎖アルキルベンゼンスルホネート(LAS)、α−オレフィンスルホネート(AOS)、アルキルスルフェート（脂肪アルコールスルフェート）（AS）、アルコールエトキシスルフェート(AEOS又はAES)、第２アルカンスルホネート(SAS) 、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−もしくはアルケニルコハク酸、又はセッケンのような陰イオン性界面活性剤を含むであろう。それは、０〜40％のアルコールエトキシレート(AEO又はAE)、カルボキシル化アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミン、脂肪酸モノエタノールアミン、又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミドのような非イオン性界面活性剤（例えばWO92／06154 に記載）も含むことができる。本界面活性組成物は、アミラーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、及びオキシダーゼ、例えばラッカーゼのような１又は複数の他の酵素を更に含むことができる。本界面活性剤は、１〜65％のゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、シトレート、ニトリロトリ酢酸(NTA)、エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTMPA)、アルキル−もしくはアルケニルコハク酸、可溶性シリケート又は層状シリケート（例えばHoechst からの SKS−６）のような界面活性剤ビルダー又は錯化剤を含むことができる。本界面活性剤は、１又は複数のポリマーを含むことができる。例としては、カルボキシメチルセルロース(CMC)、ポリ（ビニルピロリドン）(PVP)ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ（ビニルアルコール）(PVA)、ポリアクリレートのようなポリカルボキシレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマー及びラウリル・メタクリル酸／アクリル酸コポリマーである。本界面活性剤は、テトラアセチルエチレンジアミン（TAED）又はノナノイロキシベンゼンスルホネート（NOBS）のような過酸形成性漂白アクティベーターと組み合わせることができるペルボレート又はペルカーボネートのようなH₂O₂源を含むことができる漂白系を含むことができる。あるいは、漂白系は、例えばアミド、イミド又はスルホンタイプの過酸を含むことができる。本発明の界面活性組成物の酵素は、慣用的な安定化剤、例えばプロピレングリコールもしくはグリセロールのようなポリオール、糖もしくは糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又は例えば芳香族ホウ酸エステルのようなホウ酸誘導体を用いて安定化することができ、そして本組成物は、例えばWO92／19709 及びWO92／19708 に記載されるように製剤化することができる。本界面活性剤は、クレー、泡ブースター、セッケン泡抑制剤、防腐剤、汚れ懸濁剤、抗汚れ再沈着剤、染料、殺菌剤、光沢剤、又は香料のような他の慣用的界面活性剤成分も含むことができる。（使用濃度において水溶液中で測定された）pHは、通常、中性又はアルカリ性、例えば７〜11の範囲であろう。本発明の範囲内の界面活性剤の特定の形態は次のものを含む。１）次のものを含む少くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒状体として製剤化された界面活性組成物。２）次のものを含む少くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒状体として製剤化された界面活性組成物。３）次のものを含む少くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒状体として製剤化された界面活性組成物。４）次のものを含む少くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒状体として製剤化された界面活性組成物。５）次のものを含む水溶液界面活性組成物。６）次のものを含む水性構造液体界面活性剤組成物。７）次のものを含む少くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒状体として製剤化された界面活性組成物。８）次のものを含む粒状体として製剤化された界面活性組成物。９）次のものを含む粒状体として製剤化された界面活性組成物。 10）次のものを含む水溶液界面活性組成物。 11）次のものを含む水溶液界面活性組成物。 12）次のものを含む少くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒状体として製剤化された界面活性組成物。 13）直鎖アルキルベンゼンスルホネートの全部又は一部を（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈）アルキルスルフェートで置換した１）〜12）に記載されるように製剤化された界面活性剤。 14）次のものを含む少くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒状体として製剤化された界面活性組成物。 15）次のものを含む少くとも 600ｇ／ｌのかさ密度を有する粒状体として製剤化された界面活性組成物。 16）既に特定される漂白システムのための更なる構成物又は基質のいずれかとして、安定化又は被包された過酸を含む１）〜15）に記載の界面活性剤。 17）過ホウ酸塩が過炭酸塩で置換された１），３），７），９）及び12）に記載の界面活性組成物。 18）マンガン触媒を更に含む１），３），７），９），12），14）及び15）に記載される界面活性組成物。マンガン触媒は、例えば“Ffficient manganese ca talysts for low-temperature bleaching ”，Nature 369，1994，pp．637〜639 に記載される化合物の１つであり得る。 19）例えば直鎖アルコキシル化第１アルコール、ビルダーシステム（例えばホスホネート）、酵素及びアルカリのような液状非イオン性界面活性剤を含む非水性界面活性剤として製剤化された界面活性組成物。本発明の脂肪分解酵素は、界面活性剤に便利に用いられる濃度で組み込むことができる。本発明の界面活性組成物において、脂肪分解酵素は、洗浄液のリッター当り 0.00001〜１mg（純粋な酵素蛋白質として計算）の脂肪分解酵素に相当する量で添加することができることが考慮される。実施例実施例１ボトリオスファエリア種からの脂肪分解酵素の産生本実施例に次の培地を用いた。 PDA のスラント（Difco の製品）からの株CBS 102.95を 100mlのYS−２培地を含む２つの振とうフラスコに接種し、そして27℃で２日間、振とうしながら振とうフラスコをインキュベートすることにより、種培養物を調製した。最終的なpH は 7.5であった。種培養物を用いて 100mlのYS−25培地を含む50の振とうフラスコに接種し、振とうしながら27℃で２日間、振とうすることにより、主要培養物を調製した。細胞量を除去した後、17LU／mlの脂肪分解酵素活性を有する無細胞ブイヨン 2 ,900mlを回収した。これを脱イオン化して凍結乾燥し、 3,540LU／ｇの脂肪分解酵素活性を有する11.9ｇの粉状サンプルを得た。実施例２ボトリオスファエリア・リビスからの脂肪分解酵素の産生株CBS 504.94を用い、主要な培養を３日間、行った他は、実施例１と同様に脂肪分解酵素を生産した。細胞量を除去した後、I0LU／mlの脂肪分解酵素活性を有する無細胞ブイヨンを回収した。これを脱イオン化して凍結乾燥して、3,050LU／ｇの脂肪分解酵素活性を有する17.8ｇの粉末状サンプルを得た。実施例３ボトリオスファエリア種からの脂肪分解酵素の精製及びキャラクタリゼーション精製手順ボトリオスファエリア種CBS 102.95からの粗脂肪分解酵素を、次のように陰イオン交換及び疎水クロマトグラフィーを用いて２段階プロトコルを用いて精製した。陰イオン交換クロマトグラフィー実施例１からの脂肪分解酵素調製物 6.2ｇを10mM Tris−HCl,pH７に溶かし、同じ緩衝液に対して透析した。その溶液を同じ緩衝液で平衡化されたQ Sepharos e（Pharmaciaの製品）が充填されたカラム上に５ml／分の流速で適用した。結合しない材料を同緩衝液で洗浄し、同緩衝液中０〜１ＭのNaCl濃度の直線勾配で脂肪分解酵素を溶出した。得られた画分を脂肪分解酵素活性についてアッセイし、プールした。このステップの収率は54％であった。疎水クロマトグラフィー脂肪分解酵素プールに、 0.8Ｍの最終濃度を供するように酢酸アンモニウムを加えた。その溶液を 0.8Ｍ酢酸アンモニウムで先に平衡化されたButyl Sepharos e（Pharmaciaの製品）で充填されたカラムに適用した。大量の同じ緩衝液で全体を洗浄した後、最初にミリＱ水で、次に30％イソプロパノールで溶出を行った。その水画分は59％の適用された活性を含んでおり、イソプロパノール画分は27％を含んでいた。精製の概要キャラクタリゼーション標準条件下で4.20％勾配 SDS−PAGEゲル(Novex)を用いて脂肪分解酵素の純度及び分子量を分析した。分子量マーカー蛋白質はPharmacia から購入した。電気泳動後、蛋白質をCoomassie ブリリアントブルーで染色した。水のプール及びイソプロパノールの両方からの脂肪分解酵素の分子量は55,000であることが見い出された。脂肪分解酵素のpIを、Ampholine PAG プレート、pH 3.5〜9.5（Pharmaciaの製品）を用いて測定した。Pharmacia からのpIマーカー蛋白質を用いた。両方のプールから脂肪分解酵素のpIはpI3.8 であった。これらの結果は、Butyl Sepharose から得られた２つのプールからの脂肪分解酵素が同じであることを示した。より高純度のためのキャラクタリゼーションに用いるために、水プールからの脂肪分解酵素を選択した。脂肪分解酵素の特異活性は、約400LU／Ａ₂₈₀（280nmにおける吸光度により決定された蛋白質成分）であることが見い出された。実施例４ボトリオスファエリア・リビスからの脂肪分解酵素の精製及びキャラクタリゼーション精製手順ボトリオスファエリアCBS 504.94からの粗脂肪分解酵素を以下の３段階により精製した。 STREAM LINE^TM カラムクロマトグラフィー最初のステップはSTREAM LINE カラムクロマトグラフィーであった。実施例２からの凍結乾燥粉末14.3ｇ及び（本質的に実施例２と同様に作られ、1780LU／ｇの脂肪分解酵素活性を有する）他の凍結乾燥粉末 3.5ｇを50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.6)に溶かした。その脂肪分解酵素を同緩衝液で平衡化されたDEAE樹脂のカラム上に吸着させ、そのカラムを同緩衝液で洗浄した。脂肪分解酵素を 0.5ＭのNaClを含む同緩衝液で溶出した。このステップの収率は45％であった。疎水カラムクロマトグラフィー第２のステップは、予め充填されたButyl Toyopearl（Toyo Sodaの製品）及び HPLCを用いる疎水カラムクロマトグラフィーであった。濃縮された脂肪分解酵素を、１Ｍ酢酸アンモニウムの塩濃度に調節した。１〜０Ｍ酢酸アンモニウムの直線勾配及び20％エタノールにより溶出を行った。脂肪分解酵素活性を示す画分を収集した。濃縮して脱塩するために限外ろ過を行った。このステップの収率は89 ％であった。陰イオン交換カラムクロマトグラフィー第３のステップは、予め充填されたDEAE Toyopearl（Toy Sodaの製品）を用いる陰イオン交換カラムクロマトグラフィーであった。脂肪分解酵素とpH7.6 及び 0.1Ｍ NaClに調節した。これを0.1Ｍ NaClを含む50mM Tris−HCl 緩衝液(pH 7.6)で平衡化されたカラムに適用し、脂肪分解酵素を 0.1〜２Ｍ NaCl の直線勾配で溶出した。そのクロマトグラムは脂肪分解酵素活性で２つのピークを示した。最初のピークに対応する画分を収集し、脂肪分解酵素のキャラクタリゼーションに用いるために透析した。精製の概要分子量精製された脂肪分解酵素の分子量を SDS−PAGE及びゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより計算した。標準条件下で10〜15勾配ゲル（Pharmacia の製品）及びPhast System^TMを用いて SDS−PAGEを行った。分子量マーカー蛋白質はPharma cia から購入した。加水分解した後、蛋白質をクーマシーブリリアントブルーで染色した。脂肪分解酵素の分子量は64,000であることが見い出された。 Superdex 200pg 26／60（Pharmacia の製品）及びHPLCでゲルろ過クロマトグラフィーを行った。精製された脂肪分解酵素２mlを 0.1Ｍ NaCl を含む50mM Tr is−HCl 緩衝液で平衡化したカラム上に適用し、同緩衝液で脂肪分解酵素を溶出した。流速は３ml／分であった。ゲルろ過較正キット（Gel Filtration Calibra tion Kit）（Pharmacia の製品）を標準蛋白質として用いた。分子量は54,000であることが見い出された。等電点脂肪分解酵素のpIを３〜９勾配ゲル及びPhast System^TMを用いて IEF−PAGEにより決定した。Pharmacia からのpIマーカー蛋白質を用いた。電気泳動後、クーマシーブリリアントブルー染色でpH3.5 未満の１つのバンドがあった。脂肪分解酵素活性はオリーブ油エマルション及びブリリアントグリーンを用いて同じ位置に見い出された。特異活性特異活性は約 300LU／mgであることが見い出された。蛋白質量を蛋白質アッセイキットにより測定し、ウシ血奨グロブリン凍結乾燥物（Bovine Plasma Globul in Lyophilized）を(Bio-Rad の製品)を標準として用いた。実施例５種々の種からの脂肪分解酵素の産生以下に列記される各々の株を寒天スラント上で培養した。そのスラント培養物の約１cm²を削り取り、２つのバッフルを備えた 500mlの振とうフラスコ中のYS −２培地 100mlに接種するのに用いた。この種培養物を２日間、振とうしながら（約220rpm）30℃でインキュベートした。２つのバッフルを備えた 500ml振とうフラスコ中 100mlのYS−25に種培養物３ mlを接種し、振とうしながら（約220rpm）30℃で培養することにより主要培養物を調製した。その培養を、他の株よりゆっくりと増殖することが観察されたので、株NN102563及びNN102564については６日間まで延長した他は、３日間、続けた。培養の終りに、ブイヨンの脂肪分解活性を測定した。各々の実験を２回行った。結果（２つの実験の平均）は次の通りであった。脂肪分解酵素はテストした株全てから得ることができたことが分かる。本発明者らにより単離された株ボトリオスアエリアNN143554（CBS 102.95）での収率は他の株より著しく高いことが更にわかる。実施例６ pH10における脂肪分解酵素についてのプレートテスト（JP−Ｗ１−501120に対応する）WO88／02775 の実施例11に記載されるプレートテストを、先の実施例からの培養ブイヨンを用いて、Ca²⁺の添加あり及びなしでのpH10における脂肪分解酵素活性について検査するのに用いた。実施例５でテストされた全ての株からのサンプルが、Ca²⁺の添加あり及びなしの両方でpH10において脂肪分解酵素活性を示すことが見い出された。実施例７部分的アミノ酸配列の決定Ｂ．リビスNN115210及びボトリオスアエリア種NN143554からの精製されたリパーゼを配列決定した。２つのリパーゼの直接の配列決定によってはＮ末端アミノ酸配列は得られなかった。これは、Ｎ末端アミノ基がブロックされていることを示す。２つのリパーゼをリシル特異的プロテアーゼでのデグラデーションの前に還元し、Ｓ−カルボキシメチル化した。結果として生ずるペプチドを、逆相HPLCを用いて分画して再精製し、次にＮ末端アミノ酸配列にかけた。 NN115210リパーゼから５つのペプチド配列を得た。それらを配列番号：１〜５として配列表に示す。配列番号：４のXaa 残基はおそらくグリコシル化Asn 残基である。 NN143554リパーゼから１つのペプチド配列を得た。このアミノ酸配列はNN1152 10リパーゼからの配列番号：１に示されるアミノ酸配列と同一であった。そのペプチド配列を、534アミノ酸を有するカンジダシリンドラセア(Candida cylindracea )CBS 6330からのリパーゼLIP１の周知の配列にアラインした。５つのペプチドはLIP１の次の位置にアラインされることが見い出された。そのペプチド中の適合したアミノ酸及び全体のアミノ酸の数を括弧で示す。アラインメントを改良するために、LIP１配列の位置 374〜374 の間にギャップを挿入した。配列番号：１：位置35−47（12／13）配列番号：２：位置 148−187（22／40）配列番号：３：位置 255−276（７／22）配列番号：４：位置 296−331（11／36）配列番号：５：位置 365−403（18／40、ギャップを挿入）このアラインメントに基づいて、この５つのペプチドはこの順番で存在する部分的配列であることが確信される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年４月２日【補正内容】請求の範囲８．ボトリオスファエリア種CBS 102.95又はその脂肪分解酵素産生性変異体の生物学的に純粋な培養物。９．脂肪分解酵素を生産するための方法であって、適切な栄養培地中でボトリオスファエリア又はグイグナルジアの脂肪分解酵素産生株を培養し、次にアルカリ脂肪分解酵素を回収することを含むことを特徴とする方法。 10．前記脂肪分解酵素が、50mM Ca²⁺の存在下で９〜11の範囲のpHで最適活性を有するアルカリ脂肪分解酵素であることを特徴とする請求項９に記載の方法。 11．前記株が、Ｂ．ベレンゲリアナMAFF06−45001、Ｂ．ベレンゲリアナｆ．種ピリコラMAFF06−45002、Ｂ．ドチデアJCM 2733，JCM 2735，JCM 2736，JCM 2 737，JCM 2738、Ｂ．パルバATCC 58191、Ｂ．リビスCBS 504.94，ATCC 56125、Ｂ．リビス変種クロモゲナCBS 121.26、Ｂ．キサントセファラATCC 60638、ボトリオスファエリア種CBS 102.95、Ｇ．ラルシナIFO 7887，IFO 7888又はＧ．パウロウニアエMAFF03−05151 であることを特徴とする請求項９又は10に記載の方法。 12．脂肪分解酵素を生産するための方法であって、ａ）ボトリオスファエリア又はグイグナルジアの脂肪分解酵素産生株から、脂肪分解酵素をコードするDNA 配列を単離するステップと、ｂ）そのDNA フラグメントを、適切なベクター内で適切な発現シグナルと組み合わせるステップと、ｃ）前記ベクターで適切な異種宿主生物を形質転換するステップと、ｄ）脂肪分解酵素の発現を誘導する条件下で前記形質転換された宿主生物を培養するステップと、ｅ）その培養培地から脂肪分解酵素を回収するステップと、を含むことを特徴とする方法。 13．前記脂肪分解酵素が、50mM Ca²⁺の存在下で９〜11の範囲のpHで最適活性を有するアルカリ脂肪分解酵素であることを特徴とする請求項12に記載の方法。 14．前記脂肪分解酵素産生株が、Ｂ．ベレンゲリアナMAFF06−45001、Ｂ．ベレンゲリアナｆ．種ピリコラMAFF06−45002、Ｂ．ドチデアJCM 2733，JCM 2735 ，JCM 2736，JCM 2737，JCM 2738、Ｂ．パルバATCC 58191、Ｂ．リビスCBS 504. 94，ATCC 56125、Ｂ．リビス変種クロモゲナCBS 121.26、Ｂ．キサントセファラ ATCC 60638、ボトリオスファエリア種CBS 102.95、Ｇ．ラルシナIFO 7887，IFO 7888又はＧ．パウロウニアエMAFF03−05151 であることを特徴とする請求項12又は13に記載の方法。 15．前記宿主生物が糸状菌、好ましくはアスペルギルス(Aspergillus)属の株であることを特徴とする請求項12〜14のいずれかに記載の方法。 16．請求項12〜15のいずれかに記載の方法であって、前記DNA 配列が、ａ）ボトリオスファエリア又はグイグナルジアの脂肪分解酵素産生株からのcD NAライブラリーを適切なベクター内にクローニングするステップと、ｂ）前記ベクターで適切なイースト宿主細胞を形質転換するステップと、ｃ）アルカリ脂肪分解酵素を発現するための適切な条件下で前記形質転換されたイースト宿主細胞を培養するステップと、ｄ）ステップ（ｃ）で発現された脂肪分解酵素活性を決定することにより、陽性クローンについてスクリーニングするステップと、を含む方法により単離されることを特徴とする方法。 17．ａ）ボトリオスファエリア又はグイグナルジアの株から得ることができ、ｂ）50mM Ca²⁺の存在下で９〜11の範囲のpHで最適活性を有し、そしてｃ）配列番号：１，２，３，４及び５からなる群から選択されるアミノ酸を含むアルカリ脂肪分解酵素と、界面活性剤と、を含む界面活性組成物。【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年５月３０【補正内容】請求の範囲１．ａ）ボトリオスファエリア（Botryosphaeria）又はグイグナルジア（Guig nardia ）の株から得ることができ、ｂ）50mM Ca²⁺の存在下で９〜11の範囲のpHで最適活性を有し、そしてｃ）配列番号：２，３，４及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とするアルカリ脂肪分解酵素。２．前記株が、ボトリオスファエリア、好ましくはＢ．ベレンゲリアナ(B ．be rengeriana )、Ｂ．ベレンゲリアナｆ．種ピリコラ(B ．berengeriana f．sp．pil icola )、Ｂ．ドチデア(B ．dothidea)、Ｂ．パルバ（B ．parva）、Ｂ．リビス（B ．ribis ）、Ｂリビス変種クロモゲナ（B ．ribis var，chromogena）又はＢ．キサントセファラ（B ．xanthocephala）に属することを特徴とする請求項１に記載の脂肪分解酵素。３．前記株が、Ｂ．ベレンゲリアナMAFF06−45001、Ｂ．ベレンゲリアナｆ．種ピリコラMAFF06−45002、Ｂ．ドチデアJCM 2733，JCM 2735，JCM 2736，JCM 2 737，JCM 2738、Ｂ．パルバATCC 58191、Ｂ．リビスCBS 504.94，ATCC 56125、Ｂ．リビス変種クロモゲナCBS 121.26、Ｂ．キサントセファラATCC 60638又はボトリオスファエリア種CBS 102.95であることを特徴とする請求項２に記載の脂肪分解酵素。４．前記株がグイグナルジア、好ましくはＧ．ラリシナ(G ．laricina)又はＧ．パウロウニアエ(G ．paulowniae)に属することを特徴とする請求項１に記載の脂肪分解酵素。５．前記株がＧ．ラリシナIFO 7887，IFO 7888又はＧ．パウロウニアエMAFF03−05151 に属することを特徴とする請求項４に記載の脂肪分解酵素。６．前記配列が前記配列の全てを、好ましくは示される順番で含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれに記載の脂肪分解酵素。７．非ダスト性粒状体、安定化された液体、スラリー、又は保護された酵素の形態で、界面活性剤添加物として供される請求項１〜６のいずれかに記載の脂肪分解酵素。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ）ボトリオスファエリア（Botryosphaeria）又はグイグナルジア（Guig nardia ）の株により産生される精製された脂肪分解酵素に対して生ずる抗体と免疫学的に反応し、そしてｂ）50mM Ca^2-の存在下で９〜11の範囲のpHで最適活性を有することを特徴とするアルカリ脂肪分解酵素。２．前記株が、ボトリオスファエリア、好ましくはＢ．ベレンゲリアナ(B ．be rengeriana )、Ｂ．ベレンゲリアナｆ．種ピリコラ(B ．berengeriana f．sp．pil icola )、Ｂ．ドチデア(B ．dothidea)、Ｂ．パルバ（B ．parva）、Ｂ．リビス（B ．ribis ）、Ｂ．リビス変種クロモゲナ（B ．ribis var，chromogena）又はＢ．キサントセファラ（B ．xanthocephala）に属することを特徴とする請求項１に記載の脂肪分解酵素。３．前記株が、Ｂ．ベレンゲリアナMAFF06−45001、Ｂ．ベレンゲリアナｆ．種ピリコラMAFF06−45002、Ｂ．ドチデアJCM 2733，JCM 2735，JCM 2736，JCM 2 737，JCM 2738、Ｂ．パルバATCC 58191、Ｂ．リビスCBS 504.94，ATCC 56125、Ｂ．リビス変種クロモゲナCBS 121.26、Ｂ．キサントセファラATCC 60638又はボトリオスファエリア種CBS 102.95であることを特徴とする請求項２に記載の脂肪分解酵素。４．前記株がグイグナルジア、好ましくはＧ．ラリシナ（G ．laricina）又はＧ．パウロウニアエ(G ．paulowniae)に属することを特徴とする請求項１に記載の脂肪分解酵素。５．前記株がＧ．ラリシナIFO 7887，IFO 7888又はＧ．パウロウニアエMAFF03 −05151 に属することを特徴とする請求項４に記載の脂肪分解酵素。６．配列番号：１，２，３，４及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とするアルカリ脂肪分解酵素。７．前記配列が前記配列の全てを、好ましくは示される順番で含むことを特徴とする請求項６に記載の脂肪分解酵素。８．非ダスト性粒状体、安定化された液体、スラリー、又は保護された酵素の形態で、界面活性剤添加物として供される請求項１〜７のいずれかに記載の脂肪分解酵素。９．ボトリオスファエリア種CBS 102.95又はその脂肪分解酵素産生性変異体の生物学的に純粋な培養物。 10．脂肪分解酵素を生産するための方法であって、適切な栄養培地中でボトリオスファエリア又はグイグナルジアの脂肪分解酵素産生株を培養し、次にアルカリ脂肪分解酵素を回収することを含むことを特徴とする方法。 11．前記脂肪分解酵素が、50mM Ca²⁺の存在下で９〜11の範囲のpHで最適活性を有するアルカリ脂肪分解酵素であることを特徴とする請求項10に記載の方法。 12．前記株が、Ｂ．ベレンゲリアナMAFF06−45001、Ｂ．ベレンゲリアナｆ．種ピリコラMAFF06−45002、Ｂ．ドチデアJCM 2733，JCM 2735，JCM 2736，JCM 2 737，JCM 2738、Ｂ．パルバATCC 58191、Ｂ．リビスCBS 504.94，ATCC 56125、Ｂ．リビス変種クロモゲナCBS 121.26、Ｂ．キサントセファラATCC 60638、ボトリオスファエリア種CBS 102.95、Ｇ．ラルシナIFO 7887，IFO 7888又はＧ．パウロウニアエMAFF03−05151 であることを特徴とする請求項10又は11に記載の方法。 13．脂肪分解酵素を生産するための方法であって、ａ）ボトリオスファエリア又はグイグナルジアの脂肪分解酵素産生株から、脂肪分解酵素をコードするDNA 配列を単離するステップと、ｂ）そのDNA フラグメントを、適切なベクター内で適切な発現シグナルと組み合わせるステップと、ｃ）前記ベクターで適切な異種宿主生物を形質転換するステップと、ｄ）脂肪分解酵素の発現を誘導する条件下で前記形質転換された宿主生物を培養するステップと、ｅ）その培養培地から脂肪分解酵素を回収するステップと、を含むことを特徴とする方法。 14．前記脂肪分解酵素が、50mM Ca^2-の存在下で９〜11の範囲のpHで最適活性を有するアルカリ脂肪分解酵素であることを特徴とする請求項13に記載の方法。 15．前記脂肪分解酵素産生株が、Ｂ．ベレンゲリアナMAFF06−45001、Ｂ．ベレンゲリアナｆ．種ピリコラMAFF06−45002、Ｂ．ドチデアJCM 2733，JCM 2735 ，JCM 2736，JCM 2737，JCM 2738、Ｂ．パルバATCC 58191、Ｂ．リビスCBS 504. 94，ATCC 56125、Ｂ．リビス変種クロモゲナCBS 121.26、Ｂ．キサントセファラ ATCC 60638、ボトリオスファエリア種CBS 102.95、Ｇ．ラルシナIFO 7887，IFO7 888又はＧ．パウロウニアエMAFF03−05151 であることを特徴とする請求項13又は14に記載の方法。 16．前記宿主生物が糸状菌、好ましくはアスペルギルス(Aspergillus)属の株であることを特徴とする請求項13〜15のいずれかに記載の方法。 17．請求項13〜15のいずれかに記載の方法であって、前記DNA 配列が、ａ）ボトリオスファエリア又はグイグナルジアの脂肪分解酵素産生株からのcD NAライブラリーを適切なベクター内にクローニングするステップと、ｂ）前記ベクターで適切なイースト宿主細胞を形質転換するステップと、ｃ）アルカリ脂肪分解酵素を発現するための適切な条件下で前記形質転換されたイースト宿主細胞を培養するステップと、ｄ）ステップ（Ｃ）で発現された脂肪分解酵素活性を決定することにより、陽性クローンについてスクリーニングするステップと、を含む方法により単離されることを特徴とする方法。 18．ａ）ボトリオスファエリア又はグイグナルジアの株により産生される精製された脂肪分解酵素に対して生ずる抗体と免疫学的に反応し、そしてｂ）50mM Ca²⁺の存在下で９〜11の範囲のpHで最適活性を有するアルカリ脂肪分解酵素と、界面活性剤と、を含む界面活性組成物。 19．配列番号：１，２，３，４及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアルカリ脂肪分解酵素と、界面活性剤と、を含む界面活性組成物。