DE4447015C2 - Verfahren zur schnellen Isolierung und ggf. Lagerung von Ribonukleinsäuren - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung und ggf. Langzeitlagerung von Ribonukleinsäuren, welche aus unterschiedlichen Ausgangsmaterialien isoliert werden. Es ist für eine Vielzahl von biologisch-, molekularbiologisch-, medizinisch- analytisch- sowie biochemisch arbeitenden Laboratorien von großer Bedeutung. Damit sind Anwendungsgebiete der Erfindung die Molekularbiologie, Biochemie, Gentechnik, Medizin, Veterinärmedizin und alle angrenzenden Gebiete.

Üblicherweise werden Ribonukleinsäuren aus Zellen und Geweben dadurch gewonnen, daß die Ausgangsmaterialien unter stark denaturierenden und reduzierenden Bedingungen, teilweise auch unter Verwendung von proteinabbauenden Enzymen aufgeschlossen, die austretenden Ribonukleinsäuren über Phenol-Chloroform-Extraktionsschritte oder durch Ultrazentrifugation gereinigt und die Ribonukleinsäuren mittels Dialyse oder Ethanolpräzipitation aus der wäßrigen Phase gewonnen werden (Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., 1989, CSH, "Molecular Cloning").

Verschiedene alternative Verfahren zur Isolierung von Ribonukleinsäuren aus unterschiedlichen Ausgangsmaterialien ermöglichen zwar eine Reduzierung der sehr zeit- und arbeitsaufwendigen Präparationsmethoden (Chomcynski, P. und Sacchi, N., 1987, Anal. Biochem. 162: 156-159; Meier, R., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 2340- 2351), sind aber weiterhin auf die Durchführung einer finalen Ethanol- oder Isopropanolpräzipitation angewiesen. Eine solche Präzipitation ist zeitaufwendig und mit Verlusten an den zu isolierenden Ribonukleinsäuren verbunden.

Notwendige Präzipitationsschritte sind ferner gerade dann nicht mehr problemlos realisierbar, wenn Ribonukleinsäuren aus kleinsten Mengen an Ausgangsmaterialien isoliert werden sollen.

Weiterhin ist es von Vorteil, Verfahren zur Isolierung von Ribonukleinsäuren zu besitzen, welche es gestatten, einen großen Probenumfang sehr schnell sowie parallel zu bearbeiten. Herkömmlich genutzte Verfahren werden einer solchen Zielstellung nur ungenügend gerecht.

In der Patentanmeldung P 4422044.8 wurde vorgeschlagen, Nukleinsäuren durch Lyse biologischer Materialien, Inkubation mit einem nichtporösen, hochdispersen SiO₂-Träger, Abtrennung des Trägers mit den gebundenen Nukleinsäuren und Ablösung mit einem Puffer geringer Salzkonzentration zu gewinnen. Als chaotrope Salze werden Natriumjodid bzw. Guanidinthiocyanat mit molaren Konzentrationen <5M eingesetzt. Dieses Verfahren ist in der vorliegenden Form nur für die Isolierung von Desoxyribonukleinsäuren, nicht aber Ribonukleinsäuren geeignet. Die verwendeten chaotropen Salze, als Hauptbestandteile der verwendeten Puffer, bewirken eine Bindung von Desoxyribonukleinsäuremolekülen an das Trägermaterial, nicht aber von Ribonukleinsäuren.

Ferner werden Ribonukleinsäuren sehr schnell von RNAsen abgebaut und sind damit sehr viel instabiler als Desoxyribonukleinsäuren.

Die Erfindung hat das Ziel, eine Isolierung und ggf. Lagerung von Ribonukleinsäuren aus unterschiedlichen Ausgangsmaterialien zu erreichen.

Dabei soll das Verfahren sehr einfach handhabbar sein, nur geringe apparative Ausrüstung benötigen, unter bestimmten Bedingungen auf die Verwendung einer Phenol- Chloroform- Extraktion verzichten sowie generell keine Ethanolpräzipitation benötigen und damit mit einem sehr geringen zeitlichen Aufwand realisierbar sein, was gestatten soll, einen großen Probenumfang parallel zu bearbeiten.

Ferner sollte die sehr einfache Durchführbarkeit es gestatten, die doch prinzipiell komplizierte Methode der Isolierung von Ribonukleinsäure auch in medizinischen Diagnostik-Einrichtungen durchzuführen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 3 realisiert, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.

Die Isolierung von Ribonukleinsäuren aus kleinsten Mengen an Ausgangsmaterialien ist dadurch gekennzeichnet, daß die Ribonukleinsäuren enthaltenden Ausgangsmaterialien lysiert, das Lysat mit einem nichtporösen, hochdispersen SiO₂-Träger inkubiert, der Träger mit den gebundenen Nukleinsäuren abgetrennt und mit Pufferlösung gewaschen und nachfolgend die Nukleinsäuren mit einem Puffer geringer Salzkonzentration vom Träger abgelöst werden. Dabei erfolgt die Isolierung der Ribonukleinsäuren in diesem Falle vollständig ohne eine Verwendung von Phenol und Chloroform.

Die Fixierung der Nukleinsäuren erfolgt an der Oberfläche von hochdispersen und nichtporösen Feststoffpartikeln, mit einem Partikeldurchmesser von 7-40 nm, vorzugsweise von 40 nm, bei einer aktiven Oberfläche von 50-300 m²/g, vorzugsweise von ca. 50 m²/g unter Anwesenheit des speziell verwendeten Puffers.

Der im erfindungsgemäßen Verfahren das chaotrope Salz, Litiumchlorid in einer Ionenstärke <4 molar enthaltende Puffer vermittelt überraschender Weise eine sehr viel größere Bindungsaffinität von Ribonukleinsäuremolekülen an das Trägermaterial als von Desoxyribonukleinsäuremolekülen. Am effektivsten sind molare Konzentrationen von < 8, vorzugsweise 10 molar. Dabei wird durch den verwendeten Puffer sowohl die Lyse des Ausgangsmaterials als auch die Bindung an den Träger realisiert, wobei weiterhin ein Schutz der zu isolierenden Ribonukleinsäuren gegenüber einem nukleolytischen Abbau durch endogene und exogene Ribonukleasen erreicht wird. Somit kann das zu isolierende Material auch stabil unter zugegebenen Puffer ohne die Gefahr einer Degradierung der zu isolierenden Ribonukleinsäuren gelagert werden. Damit ist die Möglichkeit gegeben, Ribonukleinsäure-enthaltende Probematerialien unter Feldbedingungen wie auch nach einer Entnahme aus Patienten stabil aufzubewahren. Ferner erfolgt sowohl die Lyse des Ausgangsmaterials als auch die Bindung der austretenden Ribonukleinsäuren an den Träger im gleichen Reaktionsgefäß.

Im Falle der Isolierung von Ribonukleinsäuren aus größeren Mengen an Ausgangsmaterialien erfolgt die Lyse des Ausgangsmaterials in einem Puffer, welcher aus einer Lösung von saurem Phenol sowie Guanidinthiocyanat besteht.

Die Verwendung von saurem Phenol/Guanidinthiocyanat zur Isolierung von Ribonukleinsäuren dient der Reduzierung von kontaminierenden chromosomalen Desoxyribonukleinsäuren in der finalen Ribonukleinsäurepräparation.

Einige kommerziell angebotene Systeme zur Isolierung von Ribonukleinsäuren verwenden ebenfalls ähnliche Pufferzusammensetzungen. Jedoch kann keines dieser Systeme auf eine Ethanol- oder Isopropanolpräzipitation der isolierten Ribonukleinsäuren verzichten. Damit verbunden sind die schon aufgeführten erheblichen Nachteile eines solchen notwendigen Präzipitationsschrittes.

Weiterhin ist auch das schon beschriebene Problem einer Langzeitlagerung der Ribonukleinsäuren nicht zufriedenstellend gelöst.

Eine Variante des Verfahrens zur Isolierung von Ribonukleinsäuren aus größeren Mengen an Ausgangsmaterialien kombiniert die Verwendung der sauren Phenol-Guanidinthiocyanat-Methode mit der Bindung der Ribonukleinsäuren an der Oberfläche von hochdispersen und nichtporösen Feststoffpartikeln, vorzugsweise mit einem Partikeldurchmesser von 40 nm, bei einer aktiven Oberfläche von ca. 50 m²/g. Dazu wird nach erfolgter Lyse des Ausgangsmaterials mittels einer Lösung aus saurem Phenol/Guanidinthiocyanat, Chloroform zugesetzt, und die entstehende wäßrige Phase nach Überführung in ein neues Reaktionsgefäß mit Trägermaterial versetzt. Das in dieser wäßrigen Phase enthaltene chaotrope Salz Guanidinthiocyanat aus dem Lysepuffer vermittelt damit wiederum auch gleichzeitig neben der Lyse des Ausgangsmaterials die Bindung der Ribonukleinsäuren an das Trägermaterial.

Die Modifikation dieses Verfahrens durch die Zugabe einer hochmolaren Lithiumchloridlösung zum wäßrigen Überstand führt zu einer Erhöhung der Ausbeute an den zu isolierenden Ribonukleinsäuren.

Damit verbindet dieses erfindungsgemäße Verfahren die Verwendung eines monophasischen Puffers aus saurem Phenol/Guanidinthiocyanat mit der Bindung der Ribonukleinsäuren an ein Trägermaterial.

Das Verfahren zeichnet sich durch eine drastische Reduzierung kontaminierender Anteile chromosomaler Desoxyribonukleinsäuremoleküle aus, ist sehr einfach in der Handhabung und zeitlich sehr schnell realisierbar, da durch die Bindung der Ribonukleinsäuren an das verwendete Trägermaterial eine Ethanol- oder Isopropanolpräzipitation nicht mehr notwendig ist. Ferner können die am Träger gebundenen Ribonukleinsäuren auch lange Zeit stabil gelagert werden.

Bisher ist noch kein methodisches Verfahren beschrieben worden, welches eine saure Phenol/Guanidinthiocyanat-Methode mit der Bindung der Ribonukleinsäuren an Trägermaterialien kombiniert.

Für die beiden erfindungsgemäßen Verfahrensvarianten zur Isolierung von Ribonukleinsäuren aus quantitativ unterschiedlichen Mengen an Ausgangsmaterialien gilt ferner, daß die trägergebundenen Ribonukleinsäuren mit einem Waschpuffer (50 mM NaCl; 10 mM Tris HCl; 1 mM EDTA; 70% v/v Ethanol) mehrmals gewaschen werden. Eine solche Waschpufferzusammensetzung erlaubt ein sehr intensives Waschen ohne Verlust an gebundenen Ribonukleinsäuren.

Das erfindungsgemäße Verfahren benötigt keine Ethanolpräzipitation. Die Elution der Ribonukleinsäuren erfolgt in einem RNAse freien Elutionspuffer (10 mM Tris HCl; 1 mM EDTA) bzw. in DEPC behandeltem Aqua Bidestilata bei einer Temperatur von vorzugsweise 52°C innerhalb von 5 Minuten. Die trägerfixierten Ribonukleinsäuren können in dieser Form auch lange Zeit stabil gelagert werden.

Die sehr einfache und nur wenige experimentelle Schritte umfassenden Verfahren sind in idealster Weise für eine Anwendung in medizinischen Diagnostik- Laboratorien geeignet und stehen in diesem Zusammenhang auch Anwendern zur Verfügung, welche nicht über spezielle molekularbiologisch-biochemische Kenntnisse verfügen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist u. a. die Voraussetzung gegeben, Ribonukleinsäuren für die Diagnostik viraler Erkrankungen (virale Hepatiden; HIV- Infektionen u. a.) sehr schnell zu isolieren, eine prognostische Vorhersage bestimmter Tumorerkrankungen anhand exprimierter Markersequenzen zu treffen und maligne transformierte Zellen z. B. im Knochenmark von Patienten, bei denen ein Verdacht auf Mikrometastasierung nach erfolgter Tumoroperation besteht, zu detektieren. Da ein solcher Nachweis mit hochsensiblen molekularbiologischen Methoden (z.B. RT- PCR, quantifizierte RT-PCR) erfolgen muß, ist es ferner sehr bedeutend, über Methoden zu verfügen, welche aus kleinsten Mengen an Biopsiematerialien (z. B. nur einige 100 Zellen, < 1 m/g Gewebematerial, < 50 µl Blutserum) Ribonukleinsäuren isoliert, wobei das entsprechende Patientenmaterial sofort nach dessen Gewinnung mit Lysepuffer versetzt und somit dem abbauenden Wirken sowohl endogener als auch exogener Ribonukleasen entzogen wird, da ansonsten eine Aussage über die quantitative Expression regulierter DNA-Sequenzen mittels quantitativer RT-PCR nicht mehr realistisch ist.

Als sehr wichtig erscheint auch der Umstand, daß mittels den erfindungsgemäßen Verfahrensvarianten die isolierten Ribonukleinsäuren ohne Verlust ihrer biologischen Eigenschaften am verwendeten Trägermaterial gebunden und über lange Zeiträume gelagert werden können. Damit ist die Möglichkeit gegeben, neben einer umfänglich großen Probenaufbereitung die isolierten Ribonukleinsäuren für eine spätere Untersuchung zur Verfügung zu haben. Die trägerfixierten Nukleinsäuren können dann ohne großen zeitlichen Aufwand vom Trägermaterial eluiert werden und stehen sofort einer weiteren Verwendung zur Verfügung. Damit ist es nicht mehr wie bei herkömmlichen Verfahren notwendig, isolierte Ribonukleinsäuren unter Ethanol bei -80°C zu lagern, um sie dann durch eine erneute Ethanolpräzipitation wieder zu gewinnen. Alle zur Zeit verwendeten Methoden zur Isolierung und Lagerung von Ribonukleinsäuren sind auf eine solche Prozedur angewiesen.

Mit den erfindungsgemäßen Methoden ist somit vor allem für klinische Anwender ein methodisches Instrumentarium verfügbar, welches es gestattet, neben der parallelen Isolierung von Ribonukleinsäuren sowohl aus großen Probenumfängen als auch aus kleinsten Mengen an Ausgangsmaterial, die isolierten Ribonukleinsäuren über lange Zeiträume stabil zu lagern und im Bedarfsfall ohne Durchführung von Präzipitationen sehr schnell zur Verfügung zu haben.

Die isolierten Nukleinsäuren sollen neben einer Anwendung im Bereich der klinischen Diagnostik auch einem breiten Spektrum unterschiedlicher Anwendungen in der biochemischen oder molekularbiologischen Forschung wie z. B. RT-PCR, Hybridisierungen, mRNS-Isolierung oder RNAse Protection Assays, zugänglich sein. Das für beide beschriebenen Verfahrensvarianten verwendete Trägermaterial besitzt eine Reihe von Vorteilen. So besitzt es eine wesentlich kleinere Korngröße als von anderen Autoren verwendete Materialien zur Fixierung von Nukleinsäuren. Es setzt sich unter Einfluß der Schwerkraft nicht ab und verbleibt damit in Suspension. Dies ist von nicht unerheblichem Einfluß auf das RNA-Bindungsvermögen je Zeiteinheit. Eine hohe Bindungskapazität sowie Rückgewinnungseffizienz fixierter Ribonukleinsäuren wird zudem durch die sehr große spezifische Oberfläche der Trägerpartikel erreicht. Weiterhin wirkt sich die direkte Exponierung trägerfixierter Ribonukleinsäuren auf der Oberfläche der SiO₂-Partikel günstig auf die Reinigung der Ribonukleinsäuren von Proteinen, Salzen und anderen möglichen Kontaminationen aus, was in diesem Zusammenhang auch einen wesentlichen Vorteil vor allem gegenüber verwendeten porösen Trägermaterialien bedeutet.

Mit den erfindungsgemäßen Verfahren besteht die Möglichkeit der Isolierung von Ribonukleinsäuren aus bakteriellen Lysaten, aus Zellkulturen, intakten oder gefrorenen Gewebeproben, Gewebeschnitten, Spermien, Körperflüssigkeiten, Pflanzenzellen, Hefezellen sowie die direkte Isolierung viraler Ribonukleinsäuren aus verschiedensten Ausgangsmaterialien, wie Blutserum, Blutplasma, Vollblut, Urin, Zellkulturüberstand u. a.

Die erfindungsgemäßen Verfahrensvarianten erlauben die Isolierung von Ribonukleinsäuren mit einem extrem geringen zeitlichen sowie apparativen Aufwand.

Die verwendeten Lysepuffer verbinden ferner die Lyse des Ausgangsmaterials und die Inaktivierung endogener Ribonukleasen mit der Bindung der Ribonukleinsäuren an das verwendete Trägermaterial.

Es sind keine zeitaufwendige Proteinase-Verdauung oder aufwendige Ultr­ azentrifugationsschritte sowie Ethanolpräzipitationen notwendig.

Die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen die Isolierung von Ribonukleinsäuren in Abhängigkeit vom verwendeten Ausgangsmaterial und dessen Menge innerhalb von ca. 0,5-1,5 Stunden. Der geringe zeitliche Aufwand von solchen Präparationsmethoden stellt für eine Vielzahl von potentiellen Anwendern von Methoden zur Isolierung von Ribonukleinsäuren eine enorm wichtige Größe dar und bedeutet damit einen entscheidenden Vorteil gegenüber anderen Verfahren. Die beschriebene Kombination von Lyse und Bindungsreaktion gestattet es darüber hinaus, auch Ribonukleinsäuren aus Frischpräparaten unter Feldbedingungen (z. B. bei Expeditionen) zu isolieren, ohne zusätzliche Kühlbedingungen unter Lysepuffer zu lagern und zu transportieren und die Ribonukleinsäuren ohne Verlust ihrer biologischen Aktivität einer weiteren Verwendung zuzuführen.

Die Erfindung soll nachfolgend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Beispiel 1 Isolierung von total RNA aus Lebergewebe der Maus

Das Gewebe wird mittels eines Scalpells oder anderer Verfahren mechanisch zerkleinert, in einem 1,5 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 500 µl Lysepuffer (4 M Guanidinthiocyanat; Phenol, pH 4.0; 2 M Natriumacetat; 0,6% w/v Sarcosyl; 10 mM DTT) versetzt und unter zeitweiligem kurzen Vortexen bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erfolgter sichtbarer Lyse des Gewebematerials werden in das gleiche Reaktionsgefäß 100 µl Chloroform zugegeben und der Ansatz für 5 Minuten auf Eis inkubiert und anschließend auf einer Tischzentrifuge für 5 Minuten zentrifugiert. Die entstandene wäßrige Phase wird vorsichtig in ein neues Reaktionsgefäß überführt, mit 500 µl 10 M Litiumchlorid, sowie Trägersuspension versetzt und für 5 Minuten auf Eis inkubiert. Nach einer kurzen Zentrifugation wird das Trägerpellet zweimal mit Waschpuffer (50 mM NaCl; 10 mM Tris HCl; 1 mM EDTA; 70% v/v Ethanol) gewaschen. Die Elution der trägerfixierten Ribonukleinsäure erfolgt durch Zugabe von 100 µl DEPC Wasser oder RNAse freiem TE Puffer bei einer Inkubation bei 52°C für 5 Minuten. Der Ribonukleinsäure enthaltende Überstand wird nach kurzer Zentrifugation zur Pelletierung der Trägerpartikel in ein neues Reaktionsgefäß überführt und steht nun für weitere Verwendungen zur Verfügung.

Beispiel 2 Isolierung von total RNA aus Hybridoma-Zellen (< 10³ Zellen)

Die Hybridomazellsuspension, welche sich in den Löchern einer Mikrotiterplatte Platte befindet, wird mit 200 µl Lysepuffer (10 M Litiumchlorid, 10 mM DTT, 1% Triton X-100) versetzt und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird die Zellysesuspension in ein Eppendorf Reaktionsgefäß überführt und mit 300 µl Lysepuffer sowie Trägersuspension versetzt, der Ansatz wird dann für 5 Minuten auf Eis inkubiert und anschließend für 20 Sekunden in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes wird das Pellet zweimal wie unter Beispiel 1 beschrieben gewaschen und abschließend in einem Volumen von 20-30 µl DEPC Wasser oder RNAse freiem TE-Puffer eluiert.

Beispiel 3 Langzeitlagerung trägerfixierter Ribonukleinsäuren

Die nach der Bindung an das Trägermaterial fixierten Ribonukleinsäuren werden nach dem letzten Waschschritt im Eppendorf-Reaktionsgefäß in einer Vakuumzentrifuge getrocknet und das Reaktionsgefäß anschließend verschlossen bei 4°C aufbewahrt. Die Elution der Ribonukleinsäuren erfolgt nach der Lagerung wiederum durch Zugabe von DEPC Wasser bzw. RNAse freiem TE-Puffer bei 52°C.

Claims (7)

1. Verfahren zur schnellen Isolierung und gegebenenfalls Lagerung von Ribonukleinsäuren durch Lyse von Ribonuklein­ säuren enthaltenden Materialien, Inkubation mit einem nicht­ porösen, hochdispersen SiO₂-Träger, Abtrennung des Trägers und Ablösung der Ribonukleinsäuren mit einem Puffer geringer Salzkonzentration, dadurch gekennzeichnet, daß
die Lyse mit Puffern, die als chaotropes Salz Lithiumchlorid <4 molar enthalten, durchgeführt wird und nachfolgend die Inkubation mit SiO₂-Partikeln mit einer Korn­ größe von 7-40 nm bei einer spezifischen Oberfläche von 50- 300 m²/g erfolgt, gegebenenfalls nach Phasentrennung nach Zusatz eines organischen Lösungsmittels, im gleichen Medium.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer 10 molares Lithiumchlorid enthält und die Lyse und Bindung der Ribonukleinsäuren an den SiO₂-Trägern im selben Reaktionsgefäß erfolgt.

3. Verfahren zur schnellen Isolierung und gegebenenfalls Lagerung von Ribonukleinsäuren durch Lyse von Ribonuklein­ säuren enthaltenden Materialien, Inkubation mit einem nicht­ porösen, hochdispersen SiO₂-Träger, Abtrennung des Trägers, und Ablösung der Ribonukleinsäuren mit einem Puffer geringer Salzkonzentration, dadurch gekennzeichnet, daß die Lyse zuerst mit saurem Phenol/Guanidinthiocyanat durch­ geführt wird, durch Zusatz von Chloroform eine Phasentrennung erfolgt, danach eine hochmolare Lithiumchloridlösung zum wäßrigen Überstand gegeben wird und nachfolgend die Inkubation mit SiO₂-Partikeln mit einer Korngröße von 7-40 nm bei einer spezifischen Oberfläche von 50-300 m²/g erfolgt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die trägerfixierten Nukleinsäuren mit einem Waschpuffer aus 50 mM NaCl, 10 mM Tris HCl und 1 mM EDTA sowie 70% v/v Ethanol gewaschen werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Elution mit 10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA bei einer Tempe­ ratur von 48-56°C erfolgt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es als batch-Verfahren durchgeführt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es als chromatographisches Verfahren durchgeführt wird.