DE102021130283B4

DE102021130283B4 - Verfahren und testkit zur preiswerten und ressourcensparenden extraktion von nukleinsäuren

Info

Publication number: DE102021130283B4
Application number: DE102021130283.8A
Authority: DE
Inventors: Timo Hillebrand
Original assignee: IST Innuscreen GmbH
Current assignee: IST Innuscreen GmbH
Priority date: 2021-11-19
Filing date: 2021-11-19
Publication date: 2024-03-21
Anticipated expiration: 2041-11-20
Also published as: WO2023089180A1; DE102021130283A1

Abstract

Verfahren zur ressourcensparenden Extraktion von Nukleinsäuren mit folgenden Schritten:a) Zugabe eines Bindungspuffers zu einer Nukleinsäure enthaltenden Lösung, wobei die Nukleinsäuren an eine feste Phase angebunden werdenb) Waschen der angebundenen Nukleinsäurenc) Eluieren der gewaschenen Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass als feste Phase ein Reaktionsgefäß dient, welche an seiner Innenseite Rillen oder einen Gewindeschnitt aufweist, woran die Anbindung der Nukleinsäuren erfolgt.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein neuartiges Mittel zur ressourcensparenden, schnellen und einfach durchführbaren Isolierung von Nukleinsäuren aus Nukleinsäuren enthaltenden unterschiedlichsten Ausgangsmaterialien, welches sowohl eine sehr hohe Qualität der zu isolierenden Nukleinsäuren garantiert als auch die Isolierung sehr hoher Nukleinsäure-Ausbeuten ermöglicht und darüber hinaus auf Grund der schonenden Durchführung die Extraktion hochmolekularer DNA ermöglicht.
Stand der Technik
Die weltweit am häufigsten durchgeführte Extraktion von Nukleinsäuren aus Nukleinsäuren enthaltenden Proben ist dem Fachmann hinlänglich bekannt und basiert auf der Bindung von Nukleinsäuren an mineralische Träger unter Anwesenheit von Lösungen unterschiedlicher chaotroper Salze, bei welchen als Trägermaterial feingemahlene Glaspulver (BIO 101, La Jolla, CA), Diatomenerden (Fa. Sigma) oder auch Silicagele bzw. Silcasuspensionen oder Glasfaserfilter oder mineralische Erden ( DE 41 39 664 A1 ; US 5,234,809 ; WO-A 95/34569 DE 4321904 ; DE 20207793 ) zum Einsatz kommen. All diese technischen Lösungen basieren auf der Anbindung von Nukleinsäuren an ein mineralisches Trägermaterial auf der Basis von Glas oder Silizium unter Anwesenheit chaotroper Salzlösungen. Des Weiteren kann die Bindung von Nukleinsäuren an mineralische feste Phasen auch mittels sogenannter antichaotrope Salze als Bestandteil von Lyse-/ Bindungspuffer- Systemen sehr effizient erfolgen ( EP 1135479 ). Und es ist auch möglich, Nukleinsäuren mit Puffern, die eine Kombination von chaotropen und nichtchaotropen Salzen enthalten, zu isolieren, da auch diese Puffer die Bindung der Nukleinsäuren an mineralische Träger vermitteln. Zusammenfassend kann man den Stand der Technik also dahingehend beschreiben, dass Nukleinsäuren an mineralische Materialien in Anwesenheit von Puffern, die chaotrope oder antichaotrope Salze enthalten oder auch in Anwesenheit von Puffern die Mischungen chaotroper und antichaotroper Salze enthalten, binden und auf diesem Wege dann auch isoliert werden können. Dabei gibt es auch Vorzugsvarianten, bei denen zusätzlich aliphatische Alkohole zur Bindungsvermittlung eingesetzt werden. Dem Fachmann ist auch bekannt, dass alle gängigen kommerziellen Produkte zur Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren auf dieser Grundlage basieren. Die eingesetzten mineralischen Träger liegen dabei in Form von losen Schüttungen, in Form von Filtermembranen oder auch in Form von Suspensionen vor. Für die Durchführung von automatisierten Extraktionsabläufen werden häufig paramagnetische oder magnetische Partikel eingesetzt. Dabei handelt es sich z.B. um silikatische Materialien, die einen magnetischen oder paramagnetischen Kern besitzen oder aber auch um Eisenoxydpartikel, deren Oberfläche so modifiziert wird, dass diese die für die Anbindung der Nukleinsäuren notwendigen Funktionalitäten tragen. Die Extraktionsabläufe zur Isolierung von Nukleinsäuren basieren dabei auch auf prinzipiell gleichen Schemata: Lyse der Ausgangsprobe zur Freisetzung der Nukleinsäure, binden der Nukleinsäure an das entsprechende mineralische Trägermaterial, waschen der gebundenen Nukleinsäure, Trocknung des Trägermaterials und finale Elution der gebundenen Nukleinsäure vom Trägermaterial. Auch wenn sich diese Verfahren bewährt haben, gibt es doch auch eine Reihe von Nachteilen. So ist die Bindungskapazität der eingesetzten Materialien begrenzt, insbesondere bei der Verwendung von Spin Filtermembranen. Wenn die Ausgangsprobe zu viel Nukleinsäure enthält, verstopfen Membranen auch oftmals. Die automatisierten Prozessabläufe unter Verwendung von magnetischen Partikeln sind aufwändig und benötigen je nach Anwendung auch einen relativ hohen Zeitaufwand. Die einfache Durchführung einer Nukleinsäure-Isolierung unter Feldbedingungen ist nicht gegeben. Wesentlich ist auch, dass insbesondere bei der manuellen Spin Filter-basierten Durchführung einer Nukleinsäureextraktion im Labor je Präparation eine große Menge an Plastikmüll entsteht. Die Patentanmeldung WO 2016/169677 A1 offenbart eine ganz andere Methode zur Extraktion von Nukleinsäuren. Dabei wird auf die mineralischen Trägermaterialien verzichtet. Die Nukleinsäuren werden unter Verwendung von rauen Oberflächen isoliert. Dabei wird Material mit einer rauen oder strukturierten Oberfläche zur Anbindung der Nukleinsäuren verwendet. Dieses Material wird in WO 2016/169677 A1 stets in das Reaktionsgefäß, in dem die Anbindung der Nukleinsäuren stattfindet, hineingegeben bzw. befindet sich dort bereits.
Zum Stand der Technik zählen auch die Druckschriften WO 2016/169679 A1 und WO 2016/169678 A1 . Dort wird auch die Anbindung von Nukleinsäuren an raues bzw. „strukturiertes“ Material offenbart. Allerdings wird das Material, welches für die Anbindung verantwortlich ist, von einer Flüssigkeit umspült oder befindet sich an der Außenseite von Pipettenspitzen.
Ein Material, das Rillen oder ein Gewinde an der Innenseite eines Reaktionsgefäßes aufweist, wurde für die Anbindung von Nukleinsäuren bisher nicht beschrieben.
Aufgabe der Erfindung
Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die technischen Lösungen der Druckschriften WO 2016/169677A1 , WO 2016/169679 A1 und WO 2016/169678 A1 im Hinblick auf die Plastik-Müll-Problematik zu verbessern.
Lösung der Aufgabe
Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst. Erfindungsgemäß wurden ein Verfahren und ein Testkit bereitgestellt, das den Reaktionsablauf in einem Reaktionsgefäß mit Rillen oder einem Gewinde an deren Innenseite ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Aufgabenstellung, ein Mittel zur Extraktion von Nukleinsäuren bereitzustellen, welches es erlaubt, schnell und einfach qualitativ hochwertige Nukleinsäuren aus nukleinäurehaltigen Proben zu isolieren und dabei den bisher anfallenden Plastikmüll im Labor drastisch zu reduzieren. Das neuartige Mittel basiert auf den offenbarten Erkenntnissen der Patentanmeldung WO 2016/169677A1 und löst die Aufgabenstellung in idealer Weise. Zum Einsatz kommen vorzugsweise herkömmliche Plastik Gefäße (1.5 ml, 2.0 ml), wobei auch Gefäße für größere Volumen (15 ml oder 50 ml) genutzt werden könnten. Mittels eines Gewindeschneiders wird in die Gefäße ein Gewinde geschnitten. Dieses Gewinde befindet sich in der unteren Hälfte der Reaktionsgefäße. Vorzugsweise befindet sich das Gewinde nicht ganz bis zum Gefäßboden, sondern etwas oberhalb des Gefäßbodens. Dabei reichen wenige Gewindewindungen aus. Im Falle kommerzieller 1.5 ml Reaktionsgefäße wird das Gewinde mit einem Gewindeschneider vorzugsweise mit der Größe M7 geschnitten und bei kommerziell verfügbaren 2.0 ml Reaktionsgefäßen verwendet man einen Gewindeschneider vorzugsweise der Größe M19. Die mittels des eingebrachten Gewindes veränderten Gefäße eignen sich nun in hervorragender Weise zur Extraktion von Nukleinsäuren. Dabei kann in einer speziellen Ausführungsform der gesamte Prozess der Extraktion von der Lyse bis zur finalen Desorption der Nukleinsäuren in nur einem Gefäß durchgeführt werden. Dies reduziert den Verbrauch an Plastik sowie den anfallenden Plastik-Müll gängiger Extraktionsverfahren deutlich. Die Extraktion der Nukleinsäuren folgt dem Ablauf, welcher dem Fachmann hinlänglich bekannt ist und folgt damit den Schritten Lysieren-Binden-Waschen-Eluieren. Für den Fall, dass freie Nukleinsäuren vorliegen und der Lyseschritt entfallen kann, lauten die Schritte Binden-Waschen-Eluieren - gemäß des Anspruchs 1. Mit einem Lyseschritt gestaltet sich die Extraktion von Nukleinsäuren aus Zellen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Mittels wie folgt: Die Zellen werden in das Reaktionsgefäß mit dem Gewinde verbracht und mittels eines Lysepuffers sowie unter Zugabe von Proteinase K aus einem kommerziell verfügbaren Kit (Smart DNA Mini Kit; IST Innuscreen GmbH) lysiert. Nach Zelllyse werden in das Gefäß mit dem Lysat Isopropanol sowie Binding Optimizer (ebenfalls aus dem Kit) zugegeben. Das Gefäß wird auf einem Shaker für 5 min bei 1500 rpm inkubiert. Nach diesem Schritt wird die Probe abgegossen. Die Nukleinsäure befindet sich jetzt am Gewinde. Nachfolgend wird das Gefäß mehrmals mit alkoholischen Puffern gewaschen. Nach Ethanolentfernung wird die gebundene Nukleinsäure vom Gewinde mittels der Zugabe von Wasser oder unter Zugabe eines Niedrigsalzpuffers abgelöst und steht für weitere Anwendungen zur Verfügung. Das Verfahren ist insbesondere für die Extraktion von DNA sehr schonend. Dies ermöglicht es, hochmolekulare DNA zu isolieren. Es gibt keinerlei Limitationen in Hinblick auf Bindungskapazitäten wie dies bei Spin Filter -oder Magnetpartikel-basierten Extraktionen der Fall ist. Es ist keine Zentrifugation und keine Magnetpartikelseparation notwendig, damit ist auch kein Equipment dafür notwendig. Darüber hinaus wird für die exemplarisch beschriebene Extraktion nur ein Gefäß verwendet. Alternativ ist es aber auch möglich, den Lyseschritt in einem zusätzlichen Gefäß zu machen und erst nach erfolgter Lyse in das erfindungsgemäße Gefäß zu wechseln. Dies ist dann angezeigt, wenn es sich um Proben handelt, die nicht vollständig lysiert werden und deshalb einen Zentrifugationsschritt benötigen, um unlösliche Komponenten vom Lysat zu trennen.
Die erfindungsgemäßen Reaktionsgefäße mit Rillen oder einem Gewinde an der Innenseite bestehen vorzugsweise aus Kunststoff. Es können aber auch andere Materialien eingesetzt werden, die mit Rillen oder einem Gewinde ausgestattet werden.
Ressourcenschonend im Sinne dieser Erfindung bedeutet die Vermeidung Plastik-Abfall.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen beschrieben, wobei die Beispiele keine Limitierung der Anwendungen bedeuten.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1: DNA-Extraktion aus kernhaltigen Blutzellen mittels eines 1.5 ml Reaktionsgefäßes, mit einem im Reaktionsgefäß eingeschnittenen Gewinde im Vergleich mit zwei kommerziell verfügbaren Referenz-Extraktionskits auf der Basis von Spin Filter Säulen (Qiagen; DNeasy Blood&Tissue Kit und IST Innuscreen GmbH innuprep DNA Mini Kit 2.0)
Vollblutproben von 3 ml wurden eingesetzt, um aus ihnen die kernhaltigen Zellen zu isolieren. Für die Extraktion wurden dann diese Zellen eingesetzt. Die Extraktionen mit den beiden kommerziell verfügbaren Produkten erfolgte nach Benutzerhandbuch. Die Extraktion mittels des erfindungsgemäßen Mittels wurde wie folgt durchgeführt. Dabei wurden alle notwendigen Reagenzien aus einem ebenfalls kommerziell verfügbaren Kit (IST Innuscreen GmbH; Smart Blood DNA midi Kit (m)) eingesetzt. Die Zellen wurden in 120 µl 1 x PBS Puffer resuspendiert und in das erfindungsgemäße Reaktionsgefäß überführt. Nach Zugabe von 200 µl Lysepuffer und 30 µl Proteinase K wurde das Reaktionsgefäß in einem Thermoshaker bei 55°C für 30 min inkubiert. Nach Zelllyse wurden in das Reaktionsgefäß 350 µl Isopropanol und 40 µl Binding Optimizer zugegeben. Das Gefäß wurde danach für 5 min auf einem Shaker bei 1500 rpm inkubiert. Danach wurde die Probe abgegossen. Die am Gewinde gebundenen DNA wurde dreimal mit einem alkoholischen Waschpuffer gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurde das Gefäß für 10 min mit geöffnetem Deckel bei 40°C inkubiert. Abschließend wurde dem Gefäß 300 µl eines Elutionspuffers (10 mM Tris-HCl) zugegeben und die DNA bei 50°C für ca. 30 min gelöst. Nachfolgend wurde die DNA spektrophotometrisch vermessen und auf einem Agarosegel visualisiert. Dies erfolgte auch mit den extrahierten DNA-Proben aus den beiden Referenz Kits.

Tabelle 1 zeigt die spektrophotometrische Vermessung der DNA. Tabelle 1

Probe	Probenart	Ausbeute (µg)	A ₂₆₀:A ₂₈₀	A ₂₆₀:A ₂₃₀
1	Referenz Kit Qiagen; Probe 1	32	1.9	2.1
2	Referenz Kit Qiagen; Probe 2	31	1.9	2.1
3	Referenz Kit IST Innuscreen; Probe 1	34	1.9	2.0
4	Referenz Kit IST Innuscreen; Probe 2	33	19	2.2
5	erfindungsgemäßes Mittel; Probe 1	82	1.9	2.1
6	erfindungsgemäßes Mittel; Probe 2	79	1.9	2.1

Beispiel 2: DNA-Extraktion aus kernhaltigen Blutzellen mittels eines 1.5 ml Reaktionsgefäßes, mit einem im Reaktionsgefäß eingeschnittenen Gewinde im Vergleich mit dem kommerziell verfügbaren Referenz-Extraktionskit (Qiagen; DNeasy Blood&Tissue Kit) in Bezug auf die anfallende Menge an Plastikmüll.
Zu Grunde gelegt wurden 100 Reaktionen. Dabei benötigt der Referenz Kit 100 Reaktionsgefäße zur Proben-Lyse, 100 Spin-Filter Säulen, 300 Auffanggefäße für die Spin Filter Säule und 100 Reaktionsgefäße für die Aufnahme der eluierten DNA. Das Verfahren mittels des erfindungsgemäßen Mittels benötigt 100 Reaktionsgefäße mit Gewinde.
Menge Plastikmüll Referenz Kit (100 Reaktionen): 0,6 kg
Menge Plastikmüll erfindungsgemäßes Mittel (100 Reaktionen): 0,1 kg
Damit ist die Extraktion mittels des erfindungsgemäßen Mittels deutlich mehr ressourcensparend und führt zur drastischen Einsparung von Labormüll.
Figur ein zeigt die gelelektrophoretische Analyse der DNA (0.8% Agarose Gel) zum Beispiel 1. Die Daten zeigen, dass die mit dem erfindungsgemäßen Mittel extrahierte DNA-Ausbeute deutlich größer ist als die Ausbeute, die mit den beiden Referenz-Kits auf der Basis von Filter-Säulen erhalten wurde.

Claims

Verfahren zur ressourcensparenden Extraktion von Nukleinsäuren mit folgenden Schritten: a) Zugabe eines Bindungspuffers zu einer Nukleinsäure enthaltenden Lösung, wobei die Nukleinsäuren an eine feste Phase angebunden werden b) Waschen der angebundenen Nukleinsäuren c) Eluieren der gewaschenen Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass als feste Phase ein Reaktionsgefäß dient, welche an seiner Innenseite Rillen oder einen Gewindeschnitt aufweist, woran die Anbindung der Nukleinsäuren erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Schritt unter 1a) ein Lyseschritt und ggf. eine Zentrifugation erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsgefäß aus Kunststoff besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Rillen oder das Gewinde im unteren Teil des Reaktionsgefäßes befinden.
Testkit zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend: a) mindestens ein Reaktionsgefäß, das an seiner Innenseite Rillen oder einen Gewindeschnitt aufweist b) mindestens einen Bindungspuffer zum Anbinden der Nukleinsäuren an die Innenseite des Reaktionsgefäßes c) mindestens einen Waschpuffer zum Waschen der angebundenen Nukleinsäuren d) mindestens einen Elutionspuffer zum Eluieren der gewaschenen Nukleinsäuren.
Testkit nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich mindestens einen Lysepuffer aufweist.