JPH10500479A - 定量ルミネセンス比率顕微鏡法における高速多重波長照明源 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 光の異なる波長を提供する第１光源（３２）、第２光源（３３）、および電流を第１光源および第２光源に電流を調節するための制御装置（３１）を具備する機械的ではない高速多重波長照明源が提供される。照明源は、定量ルミネセンス測光法またはルミネセンス比率イメージングあるいはその両方のための装置において、およびルミネセンス放出比率測光学およびルミネセンス放出比率イメージングの方法において特に有効であり、写真用顕微鏡学および顕微鏡イメージングで特定の優位点を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 定量ルミネセンス比率顕微鏡法における高速多重波長照明源 技術分野 本発明は、高速多重波長照明源、照明源を具備する装置、照明源および装置を 使用する定量比率ルミネセンス顕微鏡法（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒａｔｉ ｏ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）の発光サンプルを照射 する方法に関する。 発明の背景 定量蛍光顕微鏡法で拡大しつつある分野が、２つ以上の光の波長で検体の同じ フィールドを連続的に照らし出し、各イメージを捕捉してから、２つの結果とし て生じるイメージ（あるいはイメージ内での関心のある領域）の強度を分割し、 ２つのイメージの強度率を求めることを必要とする比率イメージングである。典 型的なケースでは、検体は蛍光染料により分類され、その蛍光率は染料の定量特 性または蛍光染料の蛍光性に影響を及ぼす別の物質との相互作用と関係付けられ る。多重放出率測光法および多重放出比率イメージング用の方法および装置の一 例は、１９９２年８月２６日に提出された米国出願番号０７／９３５，８７３、 現在は１９９４年７月２６ 日に発行された米国特許第５，３３２，９０５号に記述され、その全内容は参照 により本明細書中に取り入れられている。 定量蛍光比率イメージングまたは（「定量比率イメージング」または「定量比 率測光法」としても既知の）蛍光比率測光法において、蛍光化合物または種を含 有する検体は、２つの異なる波長の光（λ₁およびλ₂）により照らし出される。 その結果生じる各蛍光強度（Ｉ₁およびＩ₂）が、測光器により蛍光検体上の関心 のある事前に決定された任意の数の領域で測定される。代わりに、蛍光強度Ｉ₁ およびＩ₂は、蛍光検体のイメージの作成または観察、あるいはその両方を行う ことができるように、イメージング検出器により１列のピクセルとして検出する こともできる。 ２つのそれぞれの励起波長λ₁およびλ₂のそれぞれでの蛍光放出強度の比率（ Ｉ₁／Ｉ₂）の関係性は、蛍光染料と関連または相互作用する物質の濃度の関数で ある。蛍光性に影響を及ぼす物質（［物質］）は、以下に示す等式（１）により 定義される。 強度は、サンプルの同じロケーション（複数の場合がある）で測定される。し たがって、蛍光化合物の濃度 （［染料］）は、両方の励起波長で同じとなる。このようにして、等式（１）に 従った測定での唯一の相違点とは、励起の波長である。ゆえに、染料濃度の項は 、等式（１）から相殺し合い、等式は以下に変形する。 現在の慣行では、サンプルの比率イメージを求めることができる速度は、検体 を励起波長のそれぞれにより交互に照らし出すことができる周波数により制限さ れている。波長の変化は、すべてのケースでなんらかの機械的な装置（例えば、 フィルター・ホイール）により制御され、照射の波長を交番する。励起の波長を 交番するもっとも典型的な方法は、（光の幅広いスペクトルを実現する）アーク ・ランプ１１でサンプルを照らし、図１に図示されるように検体１３にだけ光の 希望の波長を通すフィルター・ホイール１２上でフィルターを切り換えることに より照明の波長を変更する方法である。 もう一つの方法は、サンプル上に焦点が合った２つの光源の単色光の間で交番 する方法である。これは、現在では、図２に示されるように、２つの光源２２と ２３および検体２４の間に配置される機械的手段２１により達成される。機械的 手段２１は、一般的には、シャッターを交互に開閉するか、チョッパー・ホイー ルを回転させ ることのどちらかにより、光の１つのビームを選択式で遮る。光ビームは、機械 的手段２１を通過した後、検体２４を照射する前にフィルター２５または２６を 通過する。 フィルター・ホイール、シャッターまたはチョッパー・ブレードを利用するア プローチは、フィルター、シャッター、チョッパー・ブレードを変更するのに必 要となる機械的な運動の速度により制限を受ける。対照的に、新しい測定を行っ たり新しい測定を処理するために検出器を交番する速度は、測定装置を制御する 電子回路によってのみ制限される。一般的に、電子インパルスは、フィルター・ ホイール、シャッター、またはチョッパー・ブレードのような機械的装置よりか なり高速な速度で変化できる。したがって、測光技術においては、機械的な運動 の速度でではなく、電子回路の速度で異なる波長の光源を（繰り返し）変更する または異なる波長の光源間で切り換えるための手段の実現が望ましい目標となる 。 さらに、機械的に切り替わるフィルター、シャッター、またはチョッパー・ブ レードは、測定装置の振動も引き起こす。このような振動は、（特に検体が顕微 鏡の下で見られている場合に）測定中のサンプルの位置の変化につながり、それ により測定から求められるデータの信頼性を破壊する可能性がある。 現在利用できる最高速度のフィルター・ホイールは、異なる励起波長間の切り 替えを約２．５−５ミリ秒（ｍ ｓ）からの時間期間で行う機能を提供する。しかしながら、このようなフィルタ ー・ホイールは動作中一定運動を行う。一定運動は、サンプルを照射できる期間 を制限するだけではなく、励起光をフィルターする上で非均一な干渉パターンを 生じさせる。 発明の開示 したがって、本発明の第１の目的は、光の２つの波長の間で変更するための電 子手段を具備する新規の照明源を提供することである。 本発明のさらなる目的は、照明源を具備する発光サンプルを照射するための新 規装置を提供することである。 本発明のさらなる目的は、照明源および装置を使用する発光放射比率測光法お よび多重放出比率イメージングの新規の方法を提供することである。 本発明のさらなる目的とは、フィルター・ホイール、フィルター・アーム、チ ョッパー・ホイール、および照射の波長あるいは励起光の波長を変更するための それ以外の過去の装置に固有な振動というリスクが生じるのを回避する放出比率 イメージングおよび放出比率測光法を実施するための新規の方法および装置を提 供することである。 本発明のさらなる目的とは、異なった波長、または機械的な切換装置により制 限されない速度での光の強度、あるいはその両方の間での切り替えを可能にする 、サン プルを照射するための新規の方法および装置を提供することである。 本発明のさらなる目的とは、ミリ秒およびミリ秒以下の規模で発光物質と発光 性に影響を及ぼす物質（を含む運動現象）の間の相互作用の変化をモニターする ことができる発光放出比率測光およびイメージングを実施するための新規の方法 および装置を提供することである。 本発明のさらなる目的とは、ミリ秒およびミリ秒以下の規模で蛍光物質とルミ ネセンスに影響を及ぼす物質を含む運動現象をモニターすることができる、蛍光 放出比率測光法およびイメージングを実施するための新規の方法および装置を提 供することである。 本発明のそれ以外のさまざまな目的、特徴および付随する優位点は、類似する 参照文字がいくつかの図面全体で類似する部分または対応する部分を指定し、実 施例の次に示す詳細な記述が、前記の問題を克服する本発明により提供されてい る、付随の図面に関連して考慮される場合に、以下の詳細な記述から同発明がさ らによく理解されるに従い、より完全に認識される。 図面の簡単な説明 本発明および付随するその優位点のより完全な理解は、同発明が、付随する図 面に関連して考慮される場合に以下の詳細な説明を参照することによりさらによ く理解されるに従い、容易に得られるであろう。 図１は、フィルター・ホイールを使用することにより照射の波長を変更する従 来の方法を図解する。 図２は、シャッターまたは回転するチョッパー・ホイールを使用して照射の波 長を変更する従来の方法を図解する。 図３は、２つの独立した光源を電子的に制御することにより励起エネルギーの 波長を変更する方法を図解する。 図４は、放出比率測光法または放出比率イメージングあるいはその両方を実施 するための装置の概要図である。 図５は、多重アーク切り替え源の性能特性を図解する。 図６Ａおよび図６Ｂは、電子制御および切り替えの結果として、２つの独立し た光源のそれぞれのアーク電流および光出力の変化を図表で描画する。 図７は、アーク電流と光強度の間の一般的な関係性を図解する。 図８は、ビーム結合装置と組み合わせた本発明の照明源の代替実施例を図解す る。 図９は、パイロット・アークおよび運転アークを利用する多重アーク・ランプ を具備する本発明の照明源の代替実施例を図解する。 発明を実施するための最良の形態 類似する参照数字が、複数の図面で同一部分または対応する部分を示す図面、 さらに特定するとその図３を参照すると、本発明の方法の光の２つの異なる波長 でサン プルを連続して照射する方法および方法に適した装置の第１ステップが、静的に 図解されている。図３では、電子電流制御手段３１は、第１光源３２に対し比較 的高い電流を提供する。第１光源３２は、第１波長特殊フィルター３４を通過す る励起光を提供し、それから発光（蛍光性であることが望ましい）物質を含有す る検体３６に当たる（または照射する）第１波長λ₁の光を生成する。と同時に 、相対的に低い電流が、第２光源３３に対し電子電流制御手段３１により提供さ れる。電流の第２光源３３に対する相対的な割合は、第１波長λ₁の励起光での 照射により引き起こされ、第１光源３２および第１波長特殊フィルター３４によ り生成される、検体３６の発光放出（複数の場合がある）に干渉しない、あるい は検体３６の発光放出（複数の場合がある）に影響を及ぼさないほど十分に低い 。 技術において理解されているように、光のエネルギーはその波長に反比例する 。用語「エネルギー」および「波長」は、光に関しては取り換えて使用できる。 さらに用語「発光」および「ルミネセンス」は、両方とも蛍光性の現象および燐 光性の現象を指す。 励起光の波長を変更するためには、電子電流制御手段３１は、それぞれの光源 （例えば、アーク・ランプ３２および３３）を通って流れる電流の相対量を交互 に変更する。その結果、電子電流制御手段３１は、第１光源３２および第２光源 ３３の強度も交互に変更する。図３に 示される第１ステップから、第２光源３３を通って流れる電流を増大させ、第１ 光源３２を通って流れる電流を減少させることにより、サンプル３６に当たる光 の波長が変化する。 このようにして電流を変更すると、各光源の光強度の瞬間的な変化が引き起こ される。２つの源を使用するシステムのケースでは、電流が（λ₁を制御する） 第１ランプ３２で増加し、電流が（λ₂を制御する）第２ランプ３３で減少する と、その結果生じる効果は、λ₁光で検体３６を照明することである。それから 電流が（λ₂を制御する）第２ランプ３３で上昇し、電流が（λ₁を制御する）第 １ランプ３２で減少すると、その結果として生じる効果は、λ₂光で検体３６を 照明することである。その結果、光のこれらの２つの波長で検体を交互に照らし 出すために、電子電流制御手段３１が提供することができる周波数でサイクルを 繰り返すことができる。 また、光の異なる波長を変更したり、光の異なる波長の間で切り替えるための 前記の同じ方法で、第１光源および第２光源により生成される光の異なる強度を 変更したり、第１光源および第２光源により生成される光の異なる強度の間で切 り替える、あるいはその両方を行うこともできる。したがって、光の異なる強度 を変更したり、光の異なる強度間で切り替えたり、あるいはその両方を行う場合 には、第１光源および第２光源、ならびにそれと関連するあらゆる波長選択手段 により提供される第１ 光ビームおよび第２光ビームは、同じである場合（λ₁＝λ₂）もあれば、異なる 場合（λ₁≠λ₂）もある。 したがって、本発明のある面は、 （Ａ）第１波長、第１強度、または第１波長と第１強度の両方を有する光で前記 サンプルを照射するステップと、 （Ｂ）第２波長、第２強度、または第２波長と第２強度の両方を有する光で、前 記照射ステップ（Ａ）の１ナノ秒（１ｎｓ）から１秒（１ｓ）の時間期間内で前 記サンプルを照射するステップと、 から構成される、サンプルを照射する方法に関する。 便宜上、以下の説明（複数の場合がある）では、同じ技法は、光の異なる強度 へ変更したり、光の異なる強度の間で交互に切り替えたりすることにも適用でき るが、光の異なる波長を変更したり、光の異なる波長の間で交互に切り替えたり するための方法および装置に集中する。 本発明のサンプルを照射する方法の照射ステップ（Ａ）は、第１値を有する電 流に第１光源を通過させることを含むのが望ましく、照射ステップ（Ｂ）は、第 ２値を有する電流に第２光源を通過させることを含むのが望ましい。照射ステッ プ（Ａ）は、第３値が電流の第２値を下回る、第３値を有する電流に第２光源を 通過させることも含み、照射ステップ（Ｂ）が、第４値が電流の第１値を下回る 、第４値を有する電流に第１光源を通過させることも含むのが更に望ましい。 本発明の別の面では、サンプルを照射する方法は、照 射ステップ（Ａ）の後で、照射ステップ（Ｂ）の前に、 （Ａ‘）第１光源の電流の第１値を電流の第４値まで減少させるステップと、 （Ａ“）第２光源の電流の第３値を電流の第２値まで増大させるステップと、 をさらに具備する。 本発明のさらに別の面では、サンプルを照射する方法の高速かつ正確な反復性 が優位に利用されている。したがって、方法は、さらに、照射ステップ（Ｂ）の 後の１ｎｓから１ｓの時間期間内で、照射ステップ（Ａ）を反復することを含む 。 本発明のさらに別の面は、 （Ａ）第１波長、第１強度、または第１波長と第１強度の両方を有する第１光 ビームを生成する第１光源と、 （Ｂ）第２波長、第２強度、または第２波長と第２強度の両方を有する第２光 ビームを生成する第２光源であって、前記第２波長が前記第１波長と異なるか、 前記第２強度が前記第１強度と異なるか、あるいは前記第２波長および第２強度 が前記第１波長および第１強度と異なる第２光源と、 （Ｃ）前記第１光源および前記第２光源のそれぞれに対する電流を制御するた めの制御手段であって、前記制御手段が前記第１光源および第２光源に電気的に 接続されている制御手段と、 を具備する、２つまたはそれ以上の波長、強度、あるい は光の波長と強度でサンプルを連続して照射するための装置に関する。 光の第１波長および第２波長のそれぞれは、光の波長のバンドまたは範囲の中 間波長あるいは平均波長（例えば、３００ｎｍから３４０ｎｍあるいは３８０ｎ ｍから４００ｎｍ）を表すか、あるいは選択されたまたは希望の波長より大きな バンドまたは範囲［例えば、５００ｎｍまたはそれ以上の波長を持つ光が通過で きるようにする長パス・フィルターのような「長パス・フィルター」］を表す場合 がある。したがって、本発明の装置は、さらに、光のバンドを選択するための第 １手段および第２手段も具備し、その場合、手段は、フィルター、回折格子モノ クロメーター、あるいは光の波長の選択されたバンドを実現するそれ以外の同等 な装置である可能性がある。本発明の光のバンドを選択するための手段は、光源 により生成された後で、サンプルに当たるまたはサンプルを照射する前に、各光 ビームを遮る。 任意のバンド幅を持つ光のバンドを選択できるが、波長の第１バンドおよび第 ２バンドのそれぞれが４０ｎｍまたはそれ以下の帯域幅となるか、あるいは希望 の波長または選択された波長より大きいか、希望の波長または選択された波長に 等しくなることが望ましい。このような光の波長のバンドは、それぞれが第１光 源および第２光源により生成される光の経路内に配置される第１フィルターおよ び第２フィルターにより実現される。このよ うなフィルターは、任意の数の適切な従来の波長選択物質からできている可能性 があり、一般的に技術で既知である。代わりに、希望の励起波長を提供する従来 の回折格子モノクロメーターが、第１フィルターおよび第２フィルターのどちら かまたは両方の代わりに使用される場合がある。このようにして、優位な実施例 においては、本発明の装置が、光の２つまたは３つ以上の波長でサンプルを照射 する。第１波長は、波長の第１バンドの中間波長または平均波長であり、第２波 長は、波長の第２バンドの中間波長または平均波長であり、波長の第１バンドお よび第２バンドのそれぞれは、（ａ）４０ｎｍまたはそれ以下の帯域幅となるか 、（ｂ）希望の波長または事前に選択された波長を上回るか、希望の波長または 事前に選択された波長と等しくなる。 本発明の別の面では、サンプルを光の２つまたは３つ以上の波長で連続して照 射するための装置での第１光源（Ａ）は第１アークであり、第２光源（Ｂ）は第 ２アークである。装置の１つの実施例では、第１アークは第１アーク・ランプで あり、第２アークは第２アーク・ランプである。 本発明では、サンプルにおいて任意の数の発光放出を作成するために十分な励 起光を提供するアーク・ランプが使用されることがある。光源は、例えば１０Ｗ から２０００Ｗのワット数のアーク・ランプである場合がある。適切なアーク・ ランプの選択は、必要となる照明（励起 光）の量、光源により作り出される光の強度、またはそれ以外の関連する要因（ 複数の場合がある）、あるいはそのすべてに基づいて決定される。本発明による 装置および方法の１つの優位点は、利用できる光源の柔軟性にある。例えば、第 １源を光の第１強度を提供するアーク・ランプ（例えば、５００ワット（Ｗ）の アーク・ランプ）とし、第２光源が光の第２の相対的に高い強度または相対的に 低い強度（例えば、１０Ｗまたは２０００Ｗのアーク・ランプ）を提供する場合 がある。 本発明の方法および装置の別の優位点とは、光の２つの異なる波長でサンプル を同時に照射できるという点である。例えば、第１光源は、発光化合物または染 料を励起する照射光の第１波長を実現し、第２光源が技術（Ann．Rev．Biophys ．Chem.,第１８巻、２３９頁（１９８９年）のＪ．Ａ．マックレイ（ＭｃＣｒａ ｙ）その他、およびオレゴン州、ジャンクション・シティーにある分子プローブ 社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）により配布されるカタログの品目番号４ ２８７を参照のこと）で既知の方法で光活性化可能なケージに入れられた（ｃａ ｇｅｄ）プローブを「アンケージ（ｕｎｃａｇｅ）する」か、起動するために照 射光の第２波長を提供することができる。代わりに、第１光源が、光の第１波長 でサンプルの連続照射を行い、第２光源がサンプルの間欠照射を行う（例えば「 点滅」照射）場合がある。したがって、本発明の方法は、照射ステップの任意の 特定な時相 シーケンスに制限されない。 本発明は、２つ以上の光源および２つ以上の光の波長を含むように拡張される こともある。理論的には、生成される光ビームが照射のためにサンプルに向ける ことができる限り、光源の数に制限は存在しない。同様に、選択された波長のそ れぞれを、サンプルを照射するために作り出し使用できる限り、選択可能な光の 波長の数に制限はない。 図４は、放出比率測光法またはイメージングを実施するためのある特定な装置 の典型的な図を示す。光源４１は、希望の放出現象を生じさせるために、適切な 励起エネルギーの光を提供する。本発明では、光源４１は、電子電流制御手段３ １および第１光源３２と第２光源３３を具備する図３に図示される装置であるの が望ましい。光源４１からの光は（図３に図示されるように、第１フィルター３ ４および第２フィルター３５を具備することがある）濾過装置４２を通過してか ら、二色性ミラー４３によりサンプル取付け領域または取付けプラットホーム４ ４に向かって反射される。それから、励起光は取付けプラットホーム４４上に配 置または取り付けられたサンプルにより吸収される。サンプルは、発光（蛍光性 または燐光性）物質または発光合成物を含有し、合成物は、発光物質および発光 性に影響を及ぼす種類を含む。発光物質または合成物は、励起状態になり、その 後励起光より低いエネルギーで、長い波長の光を放出する。発光物 質から放出される光は、二色性ミラー４３を通過し、放出が測定される検出器４ ６に向かって、一連のミラー４５（ａ）、４５（ｂ）、および４５（ｃ）により 反射される。 それから、第２放出を得るために、プロセスが繰り返される。任意の数の追加 発光物質または合成物を有するサンプルの場合、プロセスは追加発光物質または 合成物ごとにさらに二度繰り返される。放出のそれぞれが、適切に装備された検 出器により個別にモニターされる。 本発明に従って、光波長を変更するためのこのような機械的な装置は、本発明 の慣行には使用されないという点は除くが、任意の数のランプ源が、シャッター またはチョッパーを使用して前記の従来の方法（複数の場合がある）でのように 検体を照らし出すことができるように配置される。 図５に図解されるように、励起光の第１波長（λ₁）から励起光の第２波長（ λ₂）への変更は、電子電流制御手段５１を使用して電子的に達成される。電流 を光源に制御する制御手段が、ソリッド・ステートの電子回路により提供される のが望ましい。 図５により示される静的図解では、電子電流制御手段５１は、この静的図解で は活性光源である第１光源５２に対して相対的に高い電流を提供する。例えば、 第１光源に流れる電流の相対パーセンテージは、電子電流制御手段５１により第 １光源５２および第２光源５３の両方 に供給される総電流の＞９０％となることがある。不活性光源を通して小さな電 流を維持することの方が望まれることを考えると、電流の活性光源に対する最大 相対パーセンテージは、すべての光源に対して電子電流制御手段により供給され る総電流の９５％から９９％となるのが望ましい。したがって、図５の静的な図 解においては、第１光源５２に対して供給される電流の相対パーセンテージは、 第１光源５２および第２光源５３の両方に電子電流制御装置５１により供給され る総電流の、９５−９９％となるのが望ましく、第２光源５３に供給される電流 の相対パーセンテージは１−５％となるのが望ましい。 第１光源５２は、第１波長特殊フィルター５４を通過する第１光ビームを提供 し、それから第１検出器５６にあたる第１波長λ₁の光を生成する。同時に、相 対的に低い電流が、第２波長特殊フィルター５５を通過する第２光ビームを提供 し、それから第２検出器５７にあたる第２波長λ₂の光を生成する。 励起光の異なる波長の間で切り替えを行うために、電子電流制御手段５１は、 各光源５２および５３を通って流れる電流の量を交互に変更することによって、 各光源５２および５３の相対強度を交互に変更する。光源５２および５３は、例 えば、アーク・ランプである。光源５３を通って流れる電流を増大させ、第１光 源５２を通って流れる電流を減少させることによって、第１検出器５６および第 ２検出器５７にあたる光の各波長の強度は、 互いに対して変化する。代わりに、あるいはさらに、電子電流制御手段５１を使 用することによって、励起光の異なる強度を切り替え、各光源５２および５３を 通って流れる電流の相対量を交互に変更することができる。 光源（例えば、アーク・ランプ）の強度が減少状態にあるときには、光源で最 小の電流を維持することが優位である。光源の、およびさらに特定するとアーク ・ランプでの「最小電流」とは、小さなアークをサポートするのに十分な電流で はあるが、相対的に大きな電流にそれを通過させる光源からの光での照射から生 じる放出の測定との干渉を生じさせない電流のことである。最小電流で動作する アークを「パイロット」状態にあると考えることができる。ランプにかけられる 最大電流の最低１％またはそれ以下の電流でアークを活性状態で維持できる。ア ークが活性状態である限り、増大した電流をかけると瞬間的に新しいレベルの照 明になる。パイロット状態にあるアークが消えてしまうと、高速切り替えは可能 ではない。アークを確立し直すには、比較的に長い時間量（例えば、約１−２０ 秒）が必要である。 パイロット状態にアークを維持すると、新しく安定した光の強度を瞬間的に確 立することが容易になる。新しい強度の安定性および再現性は、発光種または発 光性に影響を及ぼす種の未知の濃度分布を含むサンプルの放出強度を照射または 測定する前に、適切な基準により校正することにより優位に強化できる。したが って、アーク ・ランプ源は、瞬間的な非機械的な振動を免れた電子制御という重要な特徴によ り、高速切り替えされる光強度の幅広い動的な範囲を実現するために優位に利用 できる。 図５に示されるように、電流の相対的に高い割合および相対的に低い割合が、 第１光源５２と第２光源５３の間で交番され、生成される各光ビームの強度は、 第１検出器５６および第２検出器５７でモニターされ、図６Ａおよび図６Ｂに示 される光対時間強度が観測される。第１検出器５６および第２検出器５７は、例 えば、高速光ダイオード検出器である。増大した電流を瞬間的にかけると、光強 度はただちに増加する。同様にして、電流の即座の減少は、光出力（強度）の即 座の比例する損失につがなる。図６Ａおよび図６Ｂに示される例では、λ₁また はλ₂による１回の照射は、１ナノ秒ほどの短さから理論的には無限に近づく長 さまで変化するが、実際上の理由から、図６Ａおよび図６Ｂに示される結果とし て生じる反復性で２時間から４時間の長さになる場合がある。 図６Ａおよび図６Ｂを参照すると、サンプルがλ₂光で照射される時間期間「 ａ」およびサンプルがλ₁で照射される時間期間「ｂ」は、電子的に制御可能な 任意の期間とすることができる。理論的には、サンプルを光の片方の波長または 両方の波長で照射可能な時間の長さに上限はない。ただし、実際的な見地から、 サンプルは、１ｎｓから２４ｈまで、さらに優位には１ｎｓから１ｓ まで、あるいはさらに優位には１ｎｓから２．５ｍｓまでの時間の長さの間光の １つの波長で照射される。 さらに、片方の光源（例えば、アーク・ランプ）からの光出力の強度は、光源 にかけられる電流の量に線状に比例する。 図８に示されるように、２つの光源８２および８３（例えば、アーク・ランプ ・ビーム）が、検体を照らし出すために従来のビーム結合装置８４内で結合され るように、装置の構成要素を配置することにより、本発明を顕微鏡内の蛍光比率 測光法およびイメージングのために構成することもできる。例えば、適切なビー ム結合装置は、ドイツ、オベルコチェン（Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ）のカール・ザ イス（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）社製のものである。電子電流制御８１は、希望す るようにサイクルごとに１ｎｓから２４ｈの周波数でλ₁光源８２とλ₂光源８３ の間で照明を交番する。 本発明による照明源のオプションの実施例では、互いに電気的に接続されるの が望ましいパイロット・アークおよび運転アークを備える多重アーク・ランプが 利用される。このようにして、アーク強度切り替えの代替方法および本発明に従 った代替装置は、２つまたは３つ以上のアークが維持される（多重アーク・ラン プ）の光源の内少なくとも１つを利用し、その場合、一方のアークはパイロット ・アークであり、もう一方のアークが運転アークである。 本発明の多重アーク・ランプでは、各光源の一方のアークは光源内で最小の電 流を維持するために「パイロット」状態にある光学軸から外れたままであり、各 光源のもう一方のアークは光学軸内に配置される（「運転」アーク）。運転アー クは、オンまたはオフに切り替えたり、その強度をそれを通過する電流を電子的 に変化させることにより調整させることができる。 パイロット・アークおよび運転アーク付きの多重アーク・ランプは、図９に図 示される。メイン・アーク９１（「運転」アーク）は、多重アーク・ランプによ り生成される光のビームの光学軸９３と一直線になる。相対的に高い事前に選択 された電流量または希望の電流量が、電子電流制御手段（図示されていない）に より供給され、メイン・アーク９１を通過し、サンプルの照射のために光λ₁の 第１波長を提供する。電子電流制御手段は、「パイロット」状態を維持するため に、パイロット・アーク９２に最小電流を提供する。 パイロット・アークが電気的に運転アークに接続されている場合、パイロット ・アークの機能は、光源の光提供手段（多重アーク）を通して最小電流を維持す ることである。この実施例は、特に、運転アークがオンとオフに交互に切り替え られる方法で優位である。運転アークを通過する電流が、（相対的に低い値から またはゼロ電流から）相対的に高い値に上昇すると、パイロット・アークは、運 転アーク内でアークを瞬間的に確立し直す電 流を実現する。本発明の多重アーク・ランプの別の優位点とは、パイロット・ア ークにより生成される光が光学軸と一列になっていない（実質上または完全に整 列状態から外れている）という点である。したがって、多重アーク・ランプは、 単独アーク・ランプより「パイロット」状態で維持されるアークから生成する干 渉光が少なくなる。 サンプル照射光の波長をλ₁からλ₂に切り換えるには、電子電流制御手段がメ イン・アーク９１の電流を最小電流、あるいは望ましくはゼロ電流に減少させる 。同時にあるいは連続的に、（図９には図示されていない、単独アーク・ランプ または多重アーク・ランプのどちらかである）第２光源への電流がサンプルの照 射のために励起波長λ₂を提供するのに十分なほど上昇する。パイロット・アー ク９２に提供される電流は（前記に定義されるように）最小電流で維持され、優 位なことに一定電流で維持される。特に優位な実施例では、第２光源が第２多重 アーク・ランプであり、サンプル照射光の波長または強度を切り換えることは、 波長λ₂のまたは第２強度を持つ光ビームを提供するのに十分なほど第２光多重 アーク・ランプの運転アークに対する電流を増大させることを含む。 本発明の照明源および装置は、特に、多重放出比率測光法およびイメージング 、ならびに蛍光放出比率測光法およびイメージングを含む、放出比率測光法およ び放出 比率イメージングの方法で有効である。ただし、本発明は、これらの特殊な有用 性に制限されていない。 したがって、本発明の別の面は、 （ａ）サンプル内の少なくとも１つの発光化合物を電子的に励起するために十分 なエネルギーを持つ第１光ビームを生成する第１光源と、 （ｂ）前記サンプル内で少なくとも１つの発光化合物を電子的に励起するために 十分なエネルギーを持つ第２光ビームを生成する第２光源と、 （ｃ）第１光源および第２光源のそれぞれに対する電流を制御するための制御手 段であって、第１光源および第２光源のそれぞれに電気的に接続されている制御 手段と、 （ｄ）第１光ビームに第１波長を提供するために、第１光ビームの経路に配置さ れる光の波長を選択するための第１手段と、 （ｅ）第２光ビームに第２波長を提供するために第２光ビームの経路に配置され る光の波長を選択するための第２手段であって、第２波長が第１波長と異なる第 ２手段と、 （ｆ）前記サンプル用の取付けプラットホームであって、発光化合物が発光放出 を作り出すように、第１光ビームおよび第２光ビームのそれぞれがサンプルにあ たるように配置される取付けプラットホームと、 （ｇ）発光放出を受け取るために配置される検出器と、 を具備するルミネセンス放出測光法用の装置に関する。 望ましい実施例においては、ルミネセンス放出測光法用の本発明の装置は、さ らに、 （ｈ−１）サンプルが位置する可能性がある取付けプラットホーム上のロケーシ ョンに第１光ビームおよび第２光ビームのそれぞれを反射するために、（それぞ れ第１波長および第２波長を有する）第１光ビームおよび第２光ビームのそれぞ れの経路内に配置される二色性ミラーと、 （ｈ−２）ビーム結合装置と、 （ｈ−３）第２検出器と、 あるいはそのあらゆる組み合わせと、 を具備する。 ルミネセンス放出測光法用の本発明の装置の別の面では、検出器（ｄ）（また は第２検出器（ｈ−３）あるいはその両方）は、約２ｎｓから１分の時間期間内 で少なくとも２回検出器の感度を調整するための電子切換装置を具備する。 望ましい実施例では、検出器は、１９９２年８月２６日に提出され、現在では 許可されている米国出願番号０７／９３５，８７３に記述される検出器のような 感光要素を備えるカメラおよび感光要素内で作り出される電気信号を増加させる ための手段を具備する。当業者には既知である、従来の増強された電荷結合素子 （ＣＣＤ）が、検出器としての使用に適している。ただし、望ましい感光要素お よび電気信号を増加させるための手段を具備す る望ましいカメラは、ＡＴＴＯＦＬＵＯＲ（登録商標）デジタル蛍光顕微鏡法シ ステム（商標、Ａｔｔｏ計器、ロックビル、メリーランド）を伴うカメラである 。 第２検出器を具備する実施例では、第１検出器（前記検出器（ｇ））は、第１ 光ビームによる励起に応えてサンプルからの放出を検出する。第２検出器は、第 ２光ビームによる励起に応えてサンプルからの放出を検出する。 オプションで、検出器には、第１カメラおよび第２カメラを取り付けることが できる。従来のビーム・スプリッターは、一般的に技術で既知である任意の数の 適当な従来の波長選択物質から作られるフィルターによる放出ビームの妨害の前 に、構成要素波長範囲の中に反射された放出ビームを分離するために使用できる 。ビーム・スプリッター８によりカメラ７（ａ）に反射される放出ビーム波長範 囲は、プリズムまたはミラー１１によりフィルター１０（ａ）に向けられる。２ 台カメラ・システムは、２つの独立した放出を正確に同時モニタするという点で 優位点を提供する。ただし、２台カメラ・システムの不利な点とは、信頼できる 結果を実現するためには感光装置が正確に位置合わせされなければならないとい う点である。 本発明の別の面は、 （Ａ）第１波長を持ち、サンプルに第１発光放出を、１ｎｓから１分の時間期間 内に、放出させるのに十分なエネルギーを持つ光でサンプルを照射するステップ と、 （Ｂ）第２波長を持ち、サンプルに第２発光放出を放出させるのに十分なエネル ギーを持つ光でサンプルを照射するステップと、 （Ｃ）第１発光放出および第２発光放出のそれぞれの強度を測定するステップと 、 （Ｄ）発光放出強度の１つの発光放出強度の残りの一方に対する比率を決定する ステップと、 （Ｅ）サンプル中のルミネセンスに影響を及ぼす化学種の濃度に比率を相関付け るステップと、 を含む、発光放射を放出することができるサンプルでルミネセンスに影響を及ぼ す化学種の濃度を決定する方法に関する。 本発明の望ましい実施例では、ルミネセンスは蛍光性である。 本発明のその他の特徴は、本発明の図解のために示されるが、それを制限する ことを意図としていない典型的な実施例に関する以下の記述の過程で明らかにな る。 例１ ガラス製のカバースリップ上で育てられた培養星状細胞腫細胞は、５ｍＭのブ ドウ糖を含有する生理食塩溶液中で２０分間５μＭ Ｆｕｒａ−２ ＡＭ（オレゴ ン州、ジャンクション・シティーのモレキュラ・プローブ社が市販している蛍光 染料）で分類される。細胞は、媒体から過剰なＦｕｒａ−２ ＡＭを除去するた めに洗浄され る。それから細胞はザイス・アキシオバート（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ） １３５顕微鏡のステージ上に装填され、ザイス・アクロスチグマ４０パワー・オ イル浸漬対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ Ａｃｈｒｏｓｔｉｇｍａｔ ４０ ｐｏｗｅ ｒ ｏｉｌ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）で観察される。細胞は 、（第１アークまたは第１光源および第２アークまたは第２光源を備える）二重 励起光源により励起（照射）された。各光源のそれぞれの電流は、図５の概要図 に図示される制御手段５１により表されるコンピュータにより制御される。ビー ムは、図８に図示される（ドイツ、オバーコチェンのカール・ザイス（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）社製の）ビーム結合装置８４を使用して結合される。図５を参照 すると、第１アーク源５２および第２アーク源５３は、各１００ワットの水銀ア ーク・ソースであり、干渉フィルター５４は、平均波長３３４ｎｍの光を通過さ せる１０ｎｍのバンドパス（帯域幅）フィルターであり、干渉フィルター５５は 、平均波長３８０ｎｍの光を通過させる１０ｎｍの帯域フィルターである。３９ ５ｎｍ以下の光を反射し、この波長以上の光を通過させることにより、放出光か ら励起光を分離する二色性ミラーは、サンプルからの放出だけではなく二重励起 光源により生成される第１光ビームおよび第２光ビームの両方を妨害するために 配置される。例えば、図４を参照すると、光源４１により生成される（交番する ３３４ｎｍおよび３８０ｎｍ の光のある）励起ビームは、二色性ミラー４３に当り、細胞サンプル４４上に反 射される。Ｆｕｒａ−２（またはＦｕｒａ−２ ＡＭあるいはその両方）をロー ドされた細胞からの蛍光性放出は、５００ｎｍ光の範囲内にある。蛍光性放出は 、二色性ミラー４３を通過し、二色性ミラーと光検出器の間の光経路内に配置さ れる４９５ｎｍの長パス・フィルターを通過した後にカメラまたは光検出器４６ まで反射される。３３４ｎｍと３８０ｎｍの間の照明を交番させることにより、 細胞は、細胞内のカルシウム・イオンの濃度に比例して交互に蛍光を放出する。 明らかに、前記教示を鑑みると、本発明の多数の改良およびバリエーションが 可能である。したがって、本発明を、添付請求項の範囲内で本明細書に明記され る以外に実施できることが理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（Ａ）第１波長、第１強度、または第１波長および第１強度の両方を有す る光でサンプルを照射するステップと、 （Ｂ）第２波長、第２強度、または第２波長および第２強度の両方を有する光 で、前記照射ステップ（Ａ）の１ナノ秒（１ｎｓ）から１秒（１ｓ）の時間期間 内で、前記サンプルを照射するステップと、 を含むサンプルを照射する方法。 ２．前記照射ステップ（Ａ）が第１値を持つ電流に第１光源を通過させること を含み、前記照射ステップ（Ｂ）が第２値を持つ電流に第２光源を通過させるこ とを含む請求項１に記載される方法。 ３．前記照射ステップ（Ａ）が、さらに、第３の値を持つ電流に前記第２光源 を通過させることを含み、前記第３値が前記第２値より少なく、 前記照射ステップ（Ｂ）が、第４の値を持つ電流に前記第１光源を通過させる ことを含み、前記第４値が前記第１値より少ない請求項２に記載される方法。 ４．さらに、前記照射ステップ（Ａ）の後で、前記照射ステップ（Ｂ）の前に 、 （Ａ’）前記第１光源内の電流の前記第１値を前記第４値まで減少させること と、 （Ａ”）前記第２光源内の電流の前記第３値を前記第 ２値まで増加させることと、 を含む請求項３に記載される方法。 ５．前記照射ステップ（Ｂ）の後に１ｎｓから１ｓの時間期間内で前記照射ス テップ（Ａ）を反復することを含む請求項１に記載される方法。 ６．（Ａ）第１波長、第１強度、または第１波長および第１強度の両方を持つ 第１光ビームを生成する第１光源と、 （Ｂ）第２波長、第２強度、または第２波長および第２強度の両方を持つ第２ 光ビームを生成する第２光源であって、前記第２波長が前記第１波長と異なるか 、前記第２強度が前記第１強度と異なるか、あるいは前記第２波長および前記第 ２強度が前記第１波長及び前記第１強度と異なる第２光源と、 （Ｃ）前記第１光源および第２光源のそれぞれに対する電流を制御するための 制御手段であって、前記第１光源および第２光源に電気的に接続されている制御 手段と、を具備する２つまたはそれ以上の波長、強度または光の波長および強度 でサンプルを連続して照射するための装置。 ７．さらに、 （Ｄ）前記第１光ビームを妨害する光のバンドを選択するための第１手段と、 （Ｅ）前記第２光ビームを妨害する光のバンドを選択するための第２手段と、 を具備する請求項６に記載される装置。 ８．前記装置が２つまたはそれ以上の光の波長でサンプルを連続して照射し、 前記第１波長が波長の第１バンドの中間波長または平均波長であり、前記第２波 長が波長の第２バンドの中間波長または平均波長であり、波長の前記第１バンド および前記第２バンドのそれぞれが（ａ）４０ｎｍまたはそれ以下の帯域幅を持 つか、（ｂ）希望の波長または事前に選択された波長より大きいか、希望の波長 または事前に選択された波長に等しい請求項７に記載される装置。 ９．前記第１光源が第１アークであり、前記第２光源が第２アークである請求 項６に記載される装置。 １０．さらに、ビーム結合装置を具備する請求項６に記載される装置。 １１．（ａ）サンプル内で少なくとも１つの発光化合物を電子的に励起するの に十分なエネルギーを持つ第１光ビームを生成する第１光源と、 （ｂ）前記サンプル内で少なくとも１つの発光化合物を電子的に励起するのに 十分なエネルギーを持つ第２光ビームを生成する第２光源と、 （ｃ）前記第１光源と第２光源のそれぞれに対する電流を制御するための制御 手段であって、前記第１光源と第２光源のそれぞれに電気的に接続される制御手 段と、 （ｄ）光の波長を選択するための第１手段であって、前記第１光ビームに第１ 波長を提供するために前記第１ 光ビームの経路内に配置される第１手段と、 （ｅ）光の波長を選択するための第２手段であって、前記第２光ビームに第２ 波長を提供するために前記第２光ビームの経路内に配置され、前記第２波長が前 記第１波長と異なる第２手段と、 （ｆ）前記サンプル用の取付けプラットホームであって、前記発光化合物が発 光放出を作り出すように、前記第１光ビームおよび第２光ビームが前記サンプル に当たるように配置される取付けプラットホームと、 （ｇ）前記発光放出を受け取るために配置される検出器と、 を具備するルミネセンス放出測光法用の装置。 １２．さらに、 （ｈ）前記第１光ビームおよび第２光ビームのそれぞれを、前記サンプルが位 置する可能性がある前記取付けプラットホーム上のロケーションに反射するため に、前記第１光ビームおよび第２光ビームのそれぞれの経路内に配置される二色 性ミラーとを具備する請求項１１に記載される装置。 １３．前記検出器が約２ｎｓから１分の時間期間内に少なくとも２回前記検出 器の感度を調整するための電子切り替え手段を備える請求項１１に記載される装 置。 １４．さらにビーム結合装置を具備する請求項１１に記載される装置。 １５．前記検出器が前記第１光ビームによる励起に応 えて、前記サンプルからの放出を検出し、前記装置が、さらに、前記第２光ビー ムによる励起に応えて前記サンプルからの放出を検出する第２検出器を具備する 請求項１１に記載される装置。 １６．（Ａ）第１波長を持ち、サンプルに第１発光放出を放出させるのに十分 なエネルギーを持つ光で、１ｎｓから１ｓの時間期間内に前記サンプルを照射す るステップと、 （Ｂ）第２波長を持ち、前記サンプルに第２発光放出を放出させるのに十分な エネルギーを持つ光で、前記サンプルを照射するステップと、 （Ｃ）前記第１発光放出および第２発光放出のそれぞれの強度を測定するステ ップと、 （Ｄ）前記第１発光放出強度および第２発光放出強度の一方の前記第１発光放 出強度および第２発光放出強度の残りの一方に対する比率を決定するステップと 、 （Ｅ）前記比率を前記サンプル内の前記ルミネセンスに影響を及ぼす化学種の 前記濃度に相関付けるステップと、 を含む発光放射を放出することができるサンプル内で、ルミネセンスに影響を及 ぼす化学種の濃度を決定する方法。 １７．前記ルミネセンスが蛍光性である請求項１６に記載される方法。 １８．前記第１光源および第２光源の少なくとも１つ が、パイロット・アークおよび運転アークを具備する多重アーク・ランプである 請求項６に記載される装置。 １９．前記パイロット・アークおよび運転アークが電気的に互いに接続される 請求項１８に記載される装置。 ２０．前記多重アーク・ランプにより生成される光のビームに光学軸があり、 前記運転アークが前記光学軸と一列となり、前記パイロット・アークが前記光学 軸と一列にならない請求項１８に記載される装置。