ES2692407T3 - Dispositivo de ensayo de punto de cuidado de bajo coste - Google Patents

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Abstract

Un microdispositivo fluídico configurado para realizar un ensayo de una muestra líquida, el dispositivo comprende: un lugar de aplicación de muestra en comunicación con un canal capilar; una salida de respiradero en comunicación con el canal capilar; y un elemento de capuchón configurado para sellar la salida de respiradero y el lugar de aplicación de muestra contra un ambiente exterior, en donde el elemento de capuchón permite un volumen sellado sobre el lugar de aplicación de muestra y la salida de respiradero separado del ambiente exterior.

Description

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DESCRIPCION
Dispositivo de ensayo de punto de cuidado de bajo coste Introduccion
La diagnosis en punto de cuidado (lugar de atencion) se refiere al proceso de obtener una muestra biologica de un sujeto, probar en la muestra la presencia de uno o mas analitos de interes para obtener un resultado y entonces proporcionar una diagnosis al sujeto basada en los resultados de analisis de muestra, todo en la misma ubicacion. La diagnosis de punto de cuidado ofrece beneficios significativos desde el punto de vista de ahorro en coste y satisfaccion del paciente, dado que los diagnosticos a menudo se pueden hacer mas rapidamente y por menos coste que procedimientos de pruebas de diagnostico mas tradicionales, p. ej., cuando se obtiene una muestra en una primera ubicacion y entonces se envfa para realizar pruebas a una segunda ubicacion.
La mayona de los ensayos actuales en punto de cuidado para enfermedades infecciosas ofrecen unicamente una unica diagnosis por prueba. Una diagnosis rapida de multiples enfermedades infecciosas con una unica gota de sangre de pinchazo de dedo usando una tecnologfa barata y facil disponible en la ubicacion de punto de cuidado mejorana enormemente los resultados sanitarios globales. Los inmunoensayos de micropartfculas basados en citometna de flujo proporcionan excelente precision y multiplexion, pero son inapropiados para ambientes de punto de cuidado debido a una preparacion engorrosa de muestras e instrumentacion cara.
Sistemas y metodos para deteccion de multiples analitos que incluyen un sistema para la distribucion de una muestra biologica que incluye un sustrato, en donde el sustrato incluye una pluralidad de camaras de muestra, un canal de introduccion de muestra para cada camara de muestra, y un canal de respiro para cada camara de muestra se describen en el documento WO 2006/116616 A2.
Compendio
La presente invencion esta relacionada con un microdispositivo flmdico segun las reivindicaciones 1-6, 12.
La invencion tambien esta relacionada con un metodo para realizar un ensayo de una muestra lfquida segun las reivindicaciones 7-10.
La invencion tambien esta relacionada con un metodo para formar un microdispositivo flmdico como se describe en la reivindicacion 11.
Ademas la invencion esta relacionada con un sistema segun la reivindicacion 13 y un kit segun la reivindicacion 14.
Se describe un metodo para producir un cartucho de ensayo que incluye formar un lugar de aplicacion de muestra y un canal capilar en comunicacion de fluidos entre sf El dispositivo puede incluir un canal capilar y un canal de respiro. Los canales se pueden formar formando un camino surcado en un material plastico (p. ej., polfmero de ciclooleifina) y tratando el camino surcado con plasma a fin de aumentar la hidrofilicidad del area tratada. Una parte del area superficial del camino surcado puede recibir el contacto de un solvente organico no polar (p. ej., hexano, heptano, pentano, cloroformo cualquier combinacion de los mismos) en donde el tratamiento reduce la hidrofilicidad del area superficial. El camino surcado puede ser sellado para formar un canal capilar y un empalme hidrofobo.
Breve descripcion de las figuras
La figura 1 proporciona una ilustracion esquematica de un dispositivo de ensayo de una realizacion de esta invencion. Las figuras 2A y 2B proporcionan ilustraciones de dispositivos de ensayo segun realizaciones de esta invencion. Descripcion detallada
La presente descripcion proporciona metodos y sistemas para analizar una muestra lfquida. Se describe un microdispositivo flmdico para realizar un ensayo de una muestra lfquida que incluye un lugar de aplicacion de muestra y una salida de respiradero en comunicacion de fluidos con el canal capilar. Se proporciona un capuchon que se configura para sellar tanto la salida de respiradero como el lugar de aplicacion de muestra en un volumen compartido y separado de un ambiente exterior.
Antes de que se describa la presente invencion en mayor detalle, se tiene que entender que esta invencion no se limita a las realizaciones particulares descritas, ya que estas pueden variar. Tambien se tiene que entender que la terminologfa usada en esta memoria tiene la finalidad de describir realizaciones particulares unicamente y no pretende ser limitativa, dado que el alcance de la presente invencion sera limitado unicamente por las reivindicaciones anexas.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, a la decima de la unidad del lfmite inferior a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo, entre el lfmite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o interviniente en ese intervalo indicado, esta abarcado dentro de la invencion. Los lfmites superior e inferior de estos intervalos mas pequenos se pueden incluir independientemente en los intervalos
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mas pequenos y tambien estan abarcados dentro de la invencion, sujetos a cualquier Kmite excluido espedficamente en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos Kmites, intervalos que excluyen cualquiera o ambos de esos lfmites incluidos tambien se incluyen en la invencion.
Salvo que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en esta memoria tienen el sentido que comunmente entiende un experto en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Aunque tambien se pueden usar metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria en la practica o al probar la presente invencion, ahora se describen metodos y materiales ilustrativos representativos.
Cabe senalar que, como se emplea en esta memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo dictamine claramente de otro modo. Cabe senalar ademas que las reivindicaciones pueden ser redactadas para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaracion pretende servir como base precedente para el uso de tal terminologfa exclusiva como “unicamente”, “solo” y similares, en conexion con la relacion de los elementos de reivindicacion, o del uso de una limitacion “negativa”.
La practica de la presente invencion puede emplear, a menos que se indique de otro modo, tecnicas convencionales de biologfa molecular (incluidas tecnicas recombinantes), biologfa celular, tecnologfa de inmunoensayos, microscopfa, analisis de imagenes, y qmmica analftica, que estan dentro de la experiencia en la tecnica. Tales tecnicas convencionales incluyen, pero no se limitan a ellos, deteccion de senales fluorescentes, analisis de imagenes, seleccion de fuentes de iluminacion y componentes de deteccion de senales opticas, etiquetado de celulas biologicas, y similares. Tales tecnicas y descripciones convencionales se pueden encontrar en manuales estandares de laboratorio tales como Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV), Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cells: A Laboratory Manual, PCR Primer: A Laboratory Manual, and Molecular Cloning: A Laboratory Manual (todos de Cold Spring Harbor Laboratory Press); Murphy, Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging (Wiley-Liss, 2001); Shapiro, Practical Flow Cytometry, Fourth Edition (Wiley-Liss, 2003); Herman et al, Fluorescence Microscopy, 2nd Edition (Springer, 1998).
Al describir aun mas diversos aspectos de la invencion, primero se revisan en mayor detalle realizaciones de microdispositivos flmdicos de la invencion, seguido por una revision de diversas realizaciones de los metodos para hacer y usar los dispositivos, asf como realizaciones de kits que incluyen los dispositivos.
Dispositivos
Se describe un microdispositivo flmdico que incluye un canal capilar en comunicacion con un lugar de aplicacion de muestra y una salida de respiradero. Por microdispositivo flmdico se entiende un dispositivo que se configura para controlar y manipular fluidos geometricamente restringidos a una pequena escala (p. ej., submilfmetro). Ademas del lugar de aplicacion de muestra, canal capilar y salida de respiradero, aspectos de los dispositivos incluyen un capuchon que se configura para sellar la salida de respiradero y el lugar de aplicacion de muestra dentro del mismo volumen y separar los dos componentes de un ambiente exterior.
Como los dispositivos incluyen un canal capilar, incluyen una estructura alargada que se configura para permitir flujo capilar del lfquido a traves de la misma. El dispositivo puede utilizan cualquier fuerza tal como gravedad o fuerza centnfuga ademas de fuerza capilar para proporcionar movimiento de la muestra a traves del canal capilar. Como el canal capilar tiene una estructura alargada, tiene una longitud que es mas larga que su anchura. Si bien la relacion de longitud a anchura puede variar, en algunos casos la relacion de longitud a anchura va de 2 a 5000, tal como de 5 a 500 e incluye de 15 a 20. En algunos casos, la longitud del canal va de 10 a 500, tal como de 20 a 250 e incluye de 50 a 75 mm. En algunos casos, los canales tienen una dimension de seccion transversal mas larga dimensionadas en micrometros, p. ej., una dimension en seccion transversal mas larga (p. ej., diametro en caso del canal tubular) que va de 0,1 a 20, tal como de 1 a 10 e incluyendo de 3 a 5 mm. En algunos casos la anchura del canal va de 0,1 a 20, tal como de 1 a 10 e incluyendo de 3 a 5 mm. En algunos casos la altura del canal va de 5 a 500, tal como de 10 a 150 e incluyendo de 20 a 70 micrometros. Si bien la forma en seccion transversal de los canales capilares puede variar, en algunos casos, formas en seccion transversal de canales de interes incluyen, pero no se limitan a ellas: formas en seccion transversal rectilmea, p. ej., cuadrados, rectangulos, trapecios, triangulos, hexagonos, etc., formas en seccion transversal curvilmea, p. ej., drculos, ovalos, etc., asf como formas irregulares, p. ej., una parte inferior parabolica acoplada a una parte superior plana, etc.
Posicionado en un extremo del canal capilar (es decir, el extremo proximal) hay un lugar de aplicacion de muestra. El lugar de aplicacion de muestra es un lugar o ubicacion configurado para recibir un volumen de muestra, p. ej., una muestra biologica, que se va a analizar. En algunos casos, el lugar de aplicacion de muestra es una estructura configurada para recibir una muestra que tiene un volumen que va de 5 a 100, tal como de 10 a 50 e incluyendo de 20 a 30 microlitros. El lugar de aplicacion de muestra puede tener cualquier forma conveniente, siempre que permita acceso de fluido, ya sea directamente o a traves de un componente(s) intermedio(s) que permite comunicacion flmdica, al canal capilar.
Tambien presente en el microdispositivos flmdicos hay una salida de respiradero. Las salidas de respiradero se configuran para permitir comunicacion flmdica, p. ej., para gas, desde el extremo distal del canal capilar a la superficie exterior del dispositivo. Si bien la forma en seccion transversal de la salida de respiradero puede variar, en algunos
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casos, formas en seccion transversal de salidas de respiradero de interes incluyen, pero no se limitan a ellas: formas en seccion transversal rectilmea, p. ej., cuadrados, rectangulos, trapecios, triangulos, hexagonos, etc., formas en seccion transversal curvilmea, p. ej., drculos, ovalos, etc., as^ como formas irregulares, p. ej., una parte inferior parabolica acoplada a una parte superior plana, etc. La longitud de la dimension en seccion transversal mas larga (p. ej., diametro en caso de un respiradero en forma circular) de la salida de respiradero tambien puede variar, yendo en algunos casos de 0,2 a 2, tal como de 0,5 a 1,5 e incluyendo 0,8 a 1,2. El respiradero de salida se posiciona en el dispositivo en una ubicacion que es proximal o cercana al lugar de aplicacion de muestra. Si bien la distancia mas corta entre el lugar de aplicacion de muestra y el respiradero de salida puede variar, en algunos casos la distancia mas corta entre estos dos componentes del dispositivo va de 1 a 20, tal como de 5 a 15 e incluyendo de 8 a 10 mm.
Como se resume anteriormente, ademas de lugar de aplicacion de muestra, canal capilar y salida de respiradero, aspectos de los dispositivos incluyen un capuchon que se configura para sellar la salida de respiradero y el lugar de aplicacion de muestra dentro del mismo volumen y separar los dos componentes de un ambiente exterior. El capuchon es un componente que se cubre para cubrir tanto la aplicacion de muestra como el respiradero de salida de una manera sellada, p. ej., como se describe en mayor detalle mas adelante. Si bien las dimensiones del capuchon pueden variar, en algunos casos, el capuchon se dimensiona para cubrir un area superficial que va de 10 a 1000, tal como de 50 a 500 e incluyendo 100 a 300 mm2. En algunos casos, el capuchon se conecta de manera movible a otra ubicacion del dispositivo, p. ej., como se describe en mayor detalle mas adelante.
En algunos aspectos el capuchon sella sobre el lugar de aplicacion de muestra que se conecta a un canal capilar en el dispositivo a fin de contener biomuestra peligrosa dentro del dispositivo y/o para impedir la evaporacion. El canal capilar que llena desde el lugar de aplicacion con muestra lfquido se puede conectar a traves de un canal de respiro a una salida de respiradero que termina dentro del mismo volumen que puede ser cubierto por el capuchon. El mismo capuchon puede impedir que salga biomaterial peligroso por la salida de respiradero o el lugar de aplicacion de muestra y al mismo tiempo asegura que haya igualacion de presion en la parte delantera y la posterior de la columna de lfquido en el canal capilar. En algunas realizaciones el capuchon puede ser cerrado tan pronto como se aplica lfquido al dispositivo, sin impacto en la tasa con la que se llena el dispositivo. Si falla una barrera de lfquido (p. ej., empalme hidrofobo) dentro del dispositivo, el lfquido todavfa esta contenido dentro del dispositivo porque ninguna parte del lugar de aplicacion o la salida de respiradero esta abierta al ambiente exterior despues de que el capuchon haya sido cerrado.
Ademas de canal capilar, lugar de aplicacion de muestra, salida de respiradero y capuchon (p. ej., como se ha descrito anteriormente) el dispositivo para realizar el ensayo puede incluir cualquier numero de caractensticas para realizar un ensayo deseado, dichas caractensticas incluyen, pero no se limitan a ellas, una camara de mezcla (es decir, combinacion muestra/reactivo), un canal de reaccion, un dominio de captura espedfico de analito, un empalme hidrofobo, un canal de respiro, etc., o cualquier combinacion de los mismos.
En algunos casos, posicionada en el camino flrndico entre el lugar de aplicacion de muestra y el canal capilar hay una camara de mezcla. Por camara de mezcla se entiende un area o ubicacion en el camino flrndico que se configura para combinar muestra que ha sido aplicada a la aplicacion de muestra y esta fluyendo al canal capilar con uno o mas reactivos. La camara de mezcla puede incluir o no componentes de mezcla activos, p. ej., barras para remover, etc. En algunos casos, la camara de mezcla incluye una estructura que permite alta area superficial sobre la que se puede posicionar uno o mas reactivos, donde la estructura de alta area superficial puede configurarse o no para filtrar uno o mas componentes de la muestra que fluye a traves de la misma. En algunos casos, la estructura de alta area superficial puede ser una que se configura para no filtrar uno o mas componentes de la muestra que fluyen a traves de la misma. Por ejemplo, cuando la muestra es una muestra de sangre completa, la estructura de alta area superficial puede ser una que se configura para no impedir el flujo de ninguno de los componentes de sangre completa, p. ej., globulos blancos, globulos rojos, plaquetas, etc., a traves de la estructura de alta area superficial. En tales casos, la estructura de alta area superficial puede tener una porosidad que va de 20 a 80, tal como de 30 a 70 e incluyendo de 40 a 60. La estructura de alta area superficial, cuando esta presente, se puede fabricar de material adecuado, p. ej., materiales polimericos, materiales vftreos, materiales ceramicos, materiales metalicos, etc. Materiales espedficos de interes incluyen, pero no se limitan a ellos: polietileno, polipropileno, poli(fluoruro de vinilideno), y similares.
Presente en la camara de mezcla hay uno o mas reactivos, dichos reactivos pueden estar presentes en una superficie de una estructura de alta area superficial cuando esta presente. Una variedad de diferentes reactivos pueden estar presentes en la camara de mezcla o dominio del dispositivo, dependiendo del ensayo particular para el que se configura el dispositivo. Reactivos de interes incluyen miembros de union espedfica etiquetada, enzimas, sustratos, oxidantes, etc., entre otros.
En algunas realizaciones, el reactivo(s) de la camara de mezcla incluye un miembro de union espedfico etiquetado. Un miembro de union espedfica etiquetada puede incluir un dominio de union espedfico y un dominio de etiqueta. Los terminos “union espedfica”, “se une espedficamente” y similares, se refieren a la union preferencial de un dominio (p. ej., un miembro de pareja de union al otro miembro de pareja de union de la misma pareja de union) respecto a otras moleculas o fracciones en una solucion o mezcla de reaccion. El dominio de union espedfico puede unirse (p. ej., covalentemente o no covalentemente) a un epitope espedfico de un analito de interes. En ciertos aspectos, el dominio de union espedfico se une no covalentemente a un objetivo. En tales casos, la asociacion de dominio de union espedfico con el objetivo de union (p. ej., marcador superficial celular) se puede caracterizar por un KD
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(constante de disociacion) de 10-5 M o menos, 10-6 M o menos, tal como 10-7 M o menos, que incluye 10-8 M o menos, p. ej., 10-9 M o menos, 10-10 M o menos, 10-11 M o menos, 10-12 M o menos, 10-13 M o menos, 10-14 M o menos, 10-15 M o menos, que incluye 10-16 M o menos.
Como ligandos de captura se puede emplear una variedad de diferentes tipos de dominios de union espedficos. Dominios de union espedficos de interes incluyen, pero no se limitan a ellos, agentes de union a anticuerpos, protemas, peptidos, haptenos, acidos nucleicos, etc. El expresion "agente de union a anticuerpo" como se emplea en esta memoria incluye anticuerpos o fragmentos policlonicos o monoclonicos que son suficientes para unirse a un analitos de interes. Los fragmentos de anticuerpo pueden ser, por ejemplo, fragmentos Fab monomericos, fragmentos Fab' monomericos, o fragmentos F(ab)'2 dimericos. Tambien dentro del alcance de la expresion "agente de union a anticuerpo" estan moleculas producidas por ingeniena de anticuerpos, tales como moleculas de anticuerpo de unica cadena (scFv) o anticuerpos humanizados o quimericos producidos de anticuerpos monoclonales por sustitucion de las regiones constantes de las cadenas pesadas y ligeras para producir anticuerpos quimericos o sustitucion de las regiones constantes y las partes de estructura de las regiones variables para producir anticuerpos humanizados.
El dominio de etiqueta puede ser detectable sobre la base de, por ejemplo, maxima emision de fluorescencia, polarizacion de fluorescencia, tiempo de vida de fluorescencia, dispersion de luz, masa, masa molecular, o combinaciones de los mismos. En ciertos aspectos, el dominio de etiqueta puede ser un fluoroforo (es decir, una etiqueta fluorescente, tinte fluorescente, etc.). Se pueden seleccionar fluoroforos de cualquiera de los muchos tintes adecuados para uso en aplicaciones analtticas (p. ej., flujo citometna, obtencion de imagenes, etc.). Un gran numero de tintes estan disponibles comercialmente de una variedad de fuentes, tales como, por ejemplo, Molecular Probes (Eugene, O) y Exciton (Dayton, OH). Ejemplos de fluoroforos que se pueden incorporar en las micropartmulas incluyen, pero no se limitan a ellos, acido disulfonico de 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'; acridina y derivados tales como acridina, acridina naranja, acrindina amarilla, acridina roja, y isotiocianato de acridina; 5-(2'- aminoetil)aminonaftaleno-1-acido sulfonico (EDANS); 4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 disulfonato (Lucifer Yellow VS); N-(4-anilino-1-naftil)maleimida; antranilamida; Brilliant Yellow; coumarina y derivados tales como coumarina, 7-amino-4-metilcoumarina (AMC, Coumarin 120), 7-amino-4-trifluorometilcouluarin (Coumaran 151); cianina y derivados tales como cianosina, Cy3, Cy5, Cy5.5, y Cy7; 4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI); 5', 5"- dibromopirogallol-sulfoneftaleina (Bromopyrogallol Red); 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcoumarina; dietilaminocoumarina; dietilenetriamina pentaacetato; 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2'-acido disulfonico; 4,4'- diisotiocianatoestilbeno-2,2'-acido disulfonico; 5-[dimetilamino]naftaleno-1-cloruro de sulfonilo (DNS, dansil cloruro); acido benzoico 4-(4'-dimetilaminofenilazo) (DABCYL); 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC); eosina y derivados tales como eosina y isotiocianato de eosina; eritrosina y derivados tales como eritrosina B y isotiocianato de eritrosina; etidio; fluorescema y derivados tales como 5-carboxifluorescema (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2- il)aminofluorescema (DTAF), 2'7'-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluorescema (JOE), isotiocianato de fluorescema (FITC), clorotriazinil de fluorescema, naftofluorescema, y QFITC (XRITC); fluorescamina; IR144; IR1446; Green Fluorescent Protein (GFP); Reef Coral Fluorescent Protein (RCFP); Lissamine™; Lissamine rodamina, Lucifer yellow; Malachite Green isotiocianato; 4-metilumbelliferona; orto cresolftaleina; nitrotirosina; pararosanilina; Nile Red; Oregon Green; Phenol Red; B-ficoeritrina; o-ftaldialdehido; pireno y derivados tales como pireno, butirato de pireno y succinimidil 1-pireno butirato; Reactive Red 4 (Cibacron™ Brilliant Red 3B-A); rodamina y derivados tales como 6- carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirodamina (R6G), 4,7-diclororodamina lissamina, rodamina B cloruro de sulfonilo, rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, isotiocianato de rodamina X, sulforodamina B, sulforodamina 101, cloruro de sulfonilo derivado de sulforodamina 101 (Texas Red), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), tetrametil rodamina, y tetrametil rodamina isotiocianato (TRITC); riboflavin; acido rosolico y derivados de quelato de terbio; xanteno; o combinaciones de los mismos. Tambien se pueden usar otros fluoroforos o combinaciones de los mismos conocidos por los expertos en la tecnica, por ejemplo los disponibles de Molecular Probes (Eugene, O) y Exciton (Dayton, OH). La etiqueta fluorescente puede ser distinguible sobre la base de maxima emision de fluorescencia, y opcionalmente ademas sobre la base de dispersion o extincion de luz.
La cantidad de reactivo(s) presente(s) en la camara de mezcla o dominio puede variar, p. ej., dependiendo del tipo particular de ensayo para el que se configura el dispositivo. En algunos casos, la cantidad de un reactivo es suficiente para permitir una concentracion de reactivo en la muestra que sigue el flujo a traves de la camara de mezcla que va de 0,002 a 100, tal como de 0,02 a 10 e incluyendo de 0,2 a 1 microgramos/mL. Si bien el peso en seco de un reactivo presente en la camara de mezcla puede variar, en algunos casos el peso en seco va de 0,01 a 500, tal como de 0,3 a 120 e incluyendo 3 a 12 ng.
En algunas realizaciones el microdispositivo flmdico incluye un canal capilar separado de un canal de respiro por un empalme hidrofobo. Cuando esta presente, el canal de respiro puede tener una variedad de configuraciones diferentes y se configura para acoplar la salida de respiradero con el extremo del canal capilar mas lejos del lugar de aplicacion de muestra en comunicacion flmdica. El canal de respiro puede ser una estructura alargada, de manera que tiene una longitud que es mas larga que su anchura. Si bien la relacion de longitud a anchura puede variar, en algunos casos la relacion de longitud a anchura va de 5 a 2000, tal como de 10 a 200 e incluye de 50 a 60. En algunos casos, la longitud del canal de respiro va de 5 a 200, tal como de 10 a 100 e incluye de 50 a 75 mm. En algunos casos, los canales de respiro tienen una dimension de seccion transversal mas larga dimensionada en micrometros, p. ej., una dimension en seccion transversal mas larga (p. ej., diametro en caso del canal tubular) que va de 0,1 a 10, tal como 0.5 a 5 e incluyendo 1 a 2 mm. En algunos casos la anchura del canal de respiro va de 0,1 a 10, tal como de 0,5 a 5 e incluyendo de 1 a 2 mm. En algunos casos la altura del canal va de 0,5 a 5, tal como de 0,2 a 2 e incluyendo de 0,5 a 1 mm. Si
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bien la forma en seccion transversal de los canales de respiro puede variar, en algunos casos, formas en seccion transversal de los canales de respiro de interes incluyen, pero no se limitan a ellas: formas en seccion transversal rectilmea, p. ej., cuadrados, rectangulos, trapecios, triangulos, hexagonos, etc., formas en seccion transversal curvilmea, p. ej., drculos, ovalos, etc., as^ como formas irregulares, p. ej., una parte inferior parabolica acoplada a una parte superior plana, etc.
Como se ha revisado anteriormente, el canal capilar puede estar separado del canal de respiro por una region hidrofoba. Por region hidrofoba se entiende una region o dominio que es resistente a ser humedecida por agua, p. ej., repele medios acuosos. La region hidrofoba puede ser una que tenga energfa superficial que sea menor que la energfa superficial de las superficies del canal capilar. La magnitud de diferencia en energfas de superficie puede variar, yendo en algunos casos de 5 a 500, tal como de 10 a 30 dinas/cm. La energfa superficial del dominio hidrofobo tambien puede variar, yendo en algunos casos de 20 a 60, tal como de 30 a 45 dinas/cm, p. ej., medido usando el protocolo descrito en la norma ASTM D2578. Las dimensiones de la region hidrofoba se configuran para impedir al menos parcialmente si no completamente el flujo de lfquido de la muestra que pasa la region hidrofoba. Si bien las dimensiones de la region pueden variar, en algunos casos la region hidrofoba tiene un area superficial que va de 0,5 a 50, tal como de 2 a 20 e incluyendo de 7 a 15 mm2. La region hidrofoba se puede proporcionar usando cualquier planteamiento conveniente, p. ej., fabricando el dispositivo de un material hidrofobo adecuado en la region hidrofoba, tratando una superficie del dispositivo con un material hidrofobo, etc., p. ej., como se describe en mayor detalle mas adelante.
En algunos casos, el dispositivo puede incluir un dominio de captura espedfico de analito. Un dominio de captura espedfico de analito es un dominio o region del canal capilar del que se puede leer un resultado durante el uso del dispositivo. El dominio de captura espedfico de analito se posiciona a alguna distancia aguas abajo del lugar de aplicacion de muestra del dispositivo. Por "aguas abajo" se entiende la direccion en la que la muestra fluye por accion capilar, es decir, la direccion de flujo de fluido desde el lugar de aplicacion de muestra. La distancia total que fluye el fluido entre la region de recepcion de muestra y la region de deteccion puede variar, yendo en algunos casos de 2 a 500 cm, tal como de 10 a 100 cm e incluyendo de 20 a 50 cm.
El dominio de captura espedfico de analito es una region que incluye una cantidad de una sonda de captura, a la que tambien se le hace referencia en esta memoria como “sonda de captura de deteccion”. Una sonda de captura de deteccion se inmoviliza en el dominio de captura espedfico de analito y espedficamente se une a molecula objetivo de interes, p. ej., un analito, una molecula de control, etc. El tamano de la region de sonda de captura de deteccion puede variar, y en algunos casos la region de sonda de captura puede tener un area que va de 0,01 a 0,5 cm2, tales como 0,05 a 0,1 cm2 e incluyendo 0,1 a 0,2 cm2. Un dominio de captura espedfico de analito puede tener una variedad de configuraciones diferentes, donde la configuracion puede ser aleatoria o la configuracion puede tener una forma espedfica tal como una lmea, drculo, cuadrado, o forma mas compleja, tal como un "+", segun se desee. Un dominio dado de captura espedfico de analito puede incluir una unica sonda de captura o dos o mas sondas de captura diferentes, donde cada una de las dos o mas sondas de captura diferentes, donde cuando la region de deteccion incluye dos o mas sondas de captura, las sondas de captura pueden ser distintas entre sf (es decir, unirse a moleculas objetivo diferentes), segun se desee.
En algunas realizaciones se puede proporcionar un dominio de captura espedfico de analito que incluye partfculas que muestran un miembro(s) de union espedfico para una molecula(s) objetivo, p. ej., un analito(s) de interes, una molecula de control o referencia, etc. Por ejemplo, en algunas realizaciones el dispositivo puede incluir un dominio de captura espedfico de analito que comprende cuencas de captura inmovilizadas sobre una superficie conveniente, p. ej., la superficie superior, de un dominio del canal capilar, p. ej., una camara capilar en el canal capilar, p. ej., como se describe en la solicitud PCT n.° de serie PCT/US2012/065683 presentada el 16 de noviembre de 2012. Las cuencas de captura pueden ser recubiertas con un reactivo de union que se une espedficamente a los analitos de interes. En algunas realizaciones, las cuencas de captura se recubren con un antfgeno al que se une espedficamente el anticuerpo de interes. En tales casos, se puede anadir un reactivo etiquetado fluorescentemente para deteccion que se une espedficamente al analito, permitiendo la deteccion por sus emisiones de fluorescencia del analito capturado. Las cuencas de captura pueden ser inmovilizadas a un punto en la superficie superior de la camara capilar a traves de cualesquiera medios adecuados. En algunos casos, cuencas quedan localizadas en el punto por interacciones pasivas entre las cuencas y la superficie de camara capilar, pero se puede usar union covalente, segun se desee.
Cuencas de captura recubiertas con diferentes antfgenos se pueden localizar en diferentes puntos dentro de la camara capilar para permitir la deteccion multiplexada de multiples analitos. Como alternativa, cuencas de captura recubiertas con diferentes antfgenos se pueden etiquetar distinguiblemente usando tintes fluorescentes que son distinguibles entre sf y de los reactivos de deteccion etiquetados con tinte que se usan para medir los analitos capturados. De esta manera, las cuencas pueden ser inmovilizadas en el mismo punto, pero distinguidas por sus emisiones fluorescentes. En otras realizaciones, se pueden disponer reactivos de etiquetado en un dominio de captura espedfico de analito dispuesto en el lugar de aplicacion de muestra y puede fluir muestra etiquetada a una camara de reaccion en el canal capilar para deteccion.
En algunos casos, el dispositivo puede incluir un dominio de control de calidad en el canal capilar, p. ej., posicionado cerca del extremo del canal mas alejado del lugar de aplicacion de muestra. El canal de control de calidad puede variar, y, por ejemplo, puede incluir un miembro de captura, p. ej., anticuerpo, espedfico para un reactivo etiquetado,
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etc., tal como se describe en mayor detalle mas adelante, p. ej., para proporcionar una confirmacion de que fluye muestra a traves del dispositivo durante un ensayo dado.
En algunos casos, el dispositivo puede incluir uno o mas identificadores, dichos identificadores pueden proporcionar informacion acerca del dispositivo, p. ej., el ensayo particular para el que esta configurado, numero de lote de fabricacion, etc., dichos identificadores pueden ser identificadores unicos. Los identificadores pueden ser legibles por humano y/o por maquina, p. ej., pueden ser texto o un codigo de barras, segun se desee.
Habiendose descrito ahora generalmente aspectos de los dispositivos, ahora se revisan en gran detalle ciertas realizaciones de los dispositivos desde el punto de vista de las figuras. Haciendo referencia a la figura 1, se describe un dispositivo para realizar un ensayo de una muestra lfquida. El dispositivo 100 puede comprender un canal capilar 10 formado de cualquier material ngido o semirngido (p. ej. vidrio, polfmero, ceramica, etc.). Se ilustra un capuchon 20 separado del dispositivo pero puede ser conectado por cualquier mecanismo tal como una bisagra o articulacion. El capuchon 20 puede sellar un area 30 contra el ambiente en el que se ubica un lugar de aplicacion de muestra 40. En algunos casos, el material de dispositivo y/o capuchon es flexible de modo entre el capuchon 20 y el material subyacente se puede formar una buena junta de sellado. Por supuesto, para el capuchon 20 puede ser posible usar un material ngido o semirngido. Por ejemplo, para formar el capuchon 20 se puede usar vidrio o plastico. Opcionalmente se puede utilizar una empaquetadura u otra ayuda de sellado (no se muestra).
El lugar de aplicacion de muestra 40 esta en comunicacion de fluidos con el canal capilar 10. El lugar de aplicacion de muestra 40 puede comprender reactivos secados para etiquetar o reaccionar con la muestra conforme fluye a traves del lugar de aplicacion de muestra, que se puede asociar o no con una estructura de alta area superficial, p. ej., como se describe en mayor detalle anteriormente. Un canal de respiro 14 se puede conectar al canal capilar en cualquier punto a lo largo del canal capilar (p. ej., respiro extremo o respiro lateral). En algunas realizaciones el canal capilar 10 puede estar separado del canal de respiro 14 por una region de empalme hidrofobo 15. El empalme hidrofobo puede ser un area predeterminada de hidrofilicidad reducida respecto a la hidrofilicidad del canal capilar, p. ej., como se ha descrito anteriormente.
La hidrofilicidad del canal capilar y el empalme hidrofobo se pueden ajustar por medio de tratamiento con plasma de una primera area predeterminada del microdispositivo flrndico. El area predeterminada puede ser un area de surco o canal en un material plastico tal como un polfmero de cicloolefina. Todo o parte del material o area de canal puede ser tratado con un campo de plasma para aumentar la hidrofilicidad del area tratada. Una region hidrofoba puede ser preparada por cualesquiera medios usados para disminuir la hidrofilicidad de una segunda area predeterminada del material de microdispositivo flrndico respecto al area de canal. La primera y segunda areas predeterminadas se pueden superponer.
En algunos casos, la region hidrofoba se produce por medio de aplicacion de un solvente adecuado. Por ejemplo, la region hidrofoba se puede formar por aplicacion de cualquier solvente que pueda provocar licuefaccion o hinchamiento temporales del material de microdispositivo flrndico. La region hidrofoba se forma por aplicacion de solucion que comprende un solvente organico no polar, tal como hexano, heptano, pentano y cloroformo, o cualquier combinacion de dos o mas de tales solventes, a una segunda area predeterminada del material plastico (p. ej., polfmero de cicloolefina) durante un periodo de tiempo suficiente para producir la hidrofobicidad deseada en la region. Se puede usar un solvente polar para reducir la hidrofilicidad de una segunda area predeterminada del microdispositivo flrndico. La segunda area predeterminada se puede superponer a la primera area predeterminada. El solvente posteriormente se puede evaporar del area, dejando una region de hidrofilicidad reducida. El canal capilar y el empalme hidrofobo pueden ser creados aplicando una cubierta sellada al surco o area de canal. El empalme hidrofobo puede proporcionar un impedimento al flujo de lfquido en el canal capilar entre el canal capilar y la salida de respiradero o canal de respiro.
Como se ha revisado anteriormente, en algunas realizaciones el microdispositivo flrndico puede comprender reactivos para reaccion con la muestra. Esos reactivos se pueden ubicar en areas predeterminadas del dispositivo, este tipo de camara de mezcla (no se muestra) o el lugar de aplicacion de muestra 40 o a lo largo del canal capilar 10. El canal capilar 10 puede comprender una pared opticamente trasmisora 13 o pared(es) (p. ej., parte superior y parte inferior) para la deteccion de (y/o irradiacion de) analitos en una muestra. El canal capilar se puede conectar a un canal de respiro 14 o salida de respiradero 60 ubicada en el area 40 que esta cubierta por el capuchon 30. El lugar de aplicacion de muestra y la salida de respiradero pueden ser cubiertos por el capuchon y por lo tanto aislarse del ambiente en un espacio compartido. El espacio compartido puede permitir un volumen aislado compartido con la salida de respiradero y el lugar de aplicacion de muestra. Las dos aberturas pueden protegerse contra comunicacion de lfquido entre sf por cualesquiera medios, tales como un canto elevado 70 o fosa (no se muestra) que separan el lugar de aplicacion de muestra de la salida de respiradero. Si se proporciona un canto elevado, la altura que puede subir puede variar, en algunos casos yendo de 0,2 a 5, tal como de 0,5 a 1,5 mm. Si se proporciona una fosa o depresion, la profundidad de dicha estructura puede variar, en algunos casos yendo de 0,2 a 5, tal como de 0,5 a 1,5 mm.
El capuchon sella el lugar de aplicacion y la salida de respiradero contra el ambiente exterior dentro de un espacio de aire compartido, al tiempo que no impacta negativamente al flujo adentro del canal capilar. El capuchon puede tener juntas de sellado u otras partes flexibles que pueden provocar que se cambie el volumen y presion del aire dentro del capuchon y canal de respiro. Cambios en la presion de aire dentro del espacio de aire compartido debidos a cambios de temperatura durante la incubacion y deteccion del dispositivo se aplican igualmente a la parte delantera y posterior
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de la columna de Kquido en el microdispositivo flmdico y por lo tanto no dan como resultado sustancial movimiento de fluido. Una vez saturado con vapor de agua de la muestra, el volumen de espacio de aire compartido no permite mas evaporacion derivada ya sea del lugar de aplicacion de muestra o la salida de respiradero.
Microdispositivos flmdicos de biodiagnostico que se llenan a traves de accion capilar lo hacen porque las superficies de flujo son hidrofilas, y el humedecimiento de las superficies es energeticamente favorable. Tales dispositivos se pueden configurar para que la muestra que viene desplace el gas, p. ej., aire, residente en el dispositivo. Es deseable que tanto la muestra aplicada asf como el aire respirado sean contenidos dentro del cartucho a fin de proteger a los usuarios de material potencialmente biopeligroso. Tambien es deseable que la muestra dentro del dispositivo no se evapore apreciablemente, lo que puede cambiar el ratio de componentes de muestra. Se puede usar un capuchon para sellar el material de muestra dentro del dispositivo despues de que se haya suministrado la muestra. Como algunos dispositivos se pueden llenar en un periodo de minutos, tambien es deseable que el usuario pueda asegurar el capuchon sobre el dispositivo despues de que la muestra haya sido aplicada pero antes de que la muestra haya rellenado completamente el canal capilar. Si no se proporcionan medios para impedirlo de otro modo, se impedira el flujo de lfquido por vado creado en el lugar de aplicacion tapado conforme el lfquido entra al capilar, pero el capuchon impide que entre aire al lugar de aplicacion. La solucion se encuentra terminando la salida de respiradero del microcanal flmdico en un espacio de aire que esta tanto sellado del exterior como compartido con el area de aplicacion de muestra. De esta manera, independientemente de si el capuchon se coloca antes o despues de que el flujo de lfquido este completo, la presion de aire es la misma delante y detras de la columna de lfquido en el canal capilar. El volumen de aire desplazado a traves de la salida de respiradero por el lfquido que llena el canal sustituye el volumen de lfquido que deja el lugar de aplicacion de muestra. Incluso si el aire dentro del capuchon se presuriza ligeramente durante la compresion de la empaquetadura de capuchon sobre su superficie de sellado, el aumento en la presion delante y detras de la columna de lfquido permanece constante por lo que no se impacta en la fuerza de impulsion para el flujo al canal capilar. Adicionalmente, en cualquier punto durante la incubacion (minutos a horas) o lectura del dispositivo, si cambia la temperatura del dispositivo, la presion dentro del capuchon puede cambiar, pero tales cambios no provocaran movimiento del fluido en el canal dado que la presion es la misma en ambas partes delantera y posterior de la columna de lfquido.
En el dispositivo se puede utilizar cualquier combinacion de las siguientes caractensticas. Por ejemplo el canal capilar o el lugar de aplicacion de muestra pueden incluir una camara de mezcla donde se pueden ubicar reactivos secos, p. ej., conservados. Las dimensiones del canal capilar pueden impactar en la obtencion de imagenes y el flujo de muestra en el canal. El canal puede ser entre 2 y 10 mm de ancho, tal como entre 3 y 5 mm o entre 3 y 4 mm de ancho. El canal capilar puede tener entre 1 y 1000 micrometros de profundo, tal como entre 20 y 60 micrometros de profundo o entre 40 y 60 micrometros de profundo. Profundidades menores de 60 micrometros de profundo pueden permitir beneficiosamente la obtencion de imagenes de globulos blancos en una muestra de sangre completa al minimizar los efectos de obstaculizacion de los globulos rojos. El canal capilar puede ser de cualquier longitud que permita flujo capilar a lo largo de un canal. El canal capilar puede tener entre 10 y 100 mm de largo.
El dispositivo es adecuado para que ensayos detecten analitos, tales como anticuerpos, en una muestra que comprende un fluido biologico, tales como orina, saliva, sangre, p. ej., sangre completa. El dispositivo puede comprender un dominio de captura espedfico de analito que comprende cuencas de captura inmovilizadas en la superficie superior de una camara capilar en el canal capilar, p. ej., como se describe en la solicitud PCT n.° de serie PCT/US2012/065683 presentada el 16 de noviembre de 2012. Las cuencas de captura pueden ser recubiertas con un reactivo de union que se une espedficamente a los analitos de interes. Las cuencas de captura pueden ser recubiertas con un antfgeno al que se une espedficamente el anticuerpo de interes. Se anade un reactivo etiquetado fluorescentemente para deteccion que se une espedficamente al analito, permitiendo la deteccion por sus emisiones de fluorescencia del analito capturado. Las cuencas de captura pueden ser inmovilizadas a un punto en la superficie superior de la camara capilar a traves de cualesquiera medios adecuados. En algunos casos, cuencas quedan localizadas en el punto por interacciones pasivas entre las cuencas y la superficie de camara capilar, pero se puede usar union covalente.
Cuencas de captura recubiertas con diferentes antfgenos se pueden localizar en diferentes puntos dentro de la camara capilar para permitir la deteccion multiplexada de multiples analitos. Como alternativa, cuencas de captura recubiertas con diferentes antfgenos se pueden etiquetar distinguiblemente usando tintes fluorescentes que son distinguibles entre sf y de los reactivos de deteccion etiquetados con tinte que se usan para medir los analitos capturados. De esta manera, las cuencas pueden ser inmovilizadas en el mismo punto, pero distinguidas por sus emisiones fluorescentes. Se pueden disponer reactivos de etiquetado en un dominio de captura espedfico de analito dispuesto en el lugar de aplicacion de muestra y puede fluir muestra etiquetada a una camara de reaccion en el canal capilar para deteccion.
La fluorescencia de los analitos capturados se puede medir usando un sistema barato digital de obtencion de imagenes/procesamiento de imagenes. Sistemas y metodos adecuados para obtencion de imagenes de muestras en canales capilares se describen la patente de EE. UU. 8.248.597 expedida el 21 de agosto de 2012 y la solicitud de patente de EE. UU. 13/590.114 presentada el 20 de agosto de 2012. Convertidores de imagenes adecuados se describen en las patentes de EE. UU. 7.927.561, y 7.738.094.
Las micropartroulas se pueden disponer en la superficie superior del canal capilar. Durante el tiempo de incubacion tfpico para inmunoensayos (p. ej. entre 2 y 60 minutos tales como entre 10 y 30 minutos), globulos rojos en sangre
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completa se posaran en la parte inferior, dejando un plasma mas claro en la parte superior. Al colocar las micropartfculas en la superficie superior del canal, se elimina la potencial interferencia de la deteccion de fluorescencia de globulos rojos, permitiendo un simple ensayo para sangre completa sin separacion.
La presente invencion se usa para detectar concentraciones serologicas de anticuerpos humanos en volumenes de pinchazo de dedo (5-50 pL) de sangre completa en un formato no lavado, p. ej., como se describe mas adelante en el seccion Experimental.
Metodos
Aspectos de los metodos incluyen aplicar una muestra a un lugar de aplicacion y permitir que la muestra (p. ej., una muestra biologica, tal como sangre o producto sangumeo que comprende un analito) fluya a traves de un canal capilar, seguido por deteccion de uno o mas analitos objetivo en la muestra.
Como tal, los metodos pueden incluir proporcionar un lugar de aplicacion de muestra que contactado por la muestra de un dispositivo de prueba de la invencion. Un “lugar de aplicacion de muestra contactado por muestra” es un lugar de aplicacion de muestra que ha recibido el contacto de una muestra. Al poner en practica metodos de la invencion, se proporciona un lugar de aplicacion de muestra contactado por muestra aplicando una muestra al lugar de aplicacion de muestra del dispositivo. La cantidad de muestra que se aplica al lugar de aplicacion de muestra puede variar, siempre que sea suficiente para permitir el flujo capilar deseado y la funcionalidad del ensayo. La muestra puede ser aplicada al lugar de aplicacion de muestra usando cualquier protocolo conveniente, p. ej., por medio de cuentagotas, pipeta, jeringa y similares. Ademas de proporcionar un lugar de aplicacion de muestra contactado por muestra, los metodos pueden incluir ademas aplicar una cantidad de un lfquido adecuado, p. ej., tampon, para permitir flujo de fluido adecuado a traves del miembro esponjoso. Se puede emplear cualquier lfquido adecuado, incluidos pero sin limitacion tampones, medios de cultivo celular (p. ej., DMEM), etc. Tampones incluyen, pero no se limitan a ellos: tris, tricina, MOPS, HEPES, PIPES, MES, PBS, TBS, y similares. Cuando se desee, puede haber presentes detergentes en el lfquido, p. ej., detergentes NP-40,TWEEN™ o TritonX100.
El lugar de aplicacion de muestra contactado por muestra se puede proporcionar combinando la muestra con uno o mas componentes de ensayo (p. ej., un reactivo, un tampon, y similares) antes de aplicar la muestra que tiene el componente(s) de ensayo al lugar de aplicacion de muestra. Cuando la muestra se combina con uno o mas componentes de ensayo antes de la aplicacion de la muestra que tiene el componente(s) de ensayo al lugar de aplicacion de muestra, la combinacion se puede lograr usando cualquier protocolo conveniente. La cantidad de un componente(s) de ensayo, cuando se combina con la muestra, puede variar segun se desee. El lugar de aplicacion de muestra contactado por muestra se puede proporcionar aplicando uno o mas componentes de ensayo (p. ej., como se ha descrito anteriormente) al lugar de aplicacion de recepcion de muestra antes de aplicar la muestra al lugar de aplicacion de muestra. El lugar de aplicacion de muestra contactado por muestra se puede proporcionar aplicando la muestra al lugar de aplicacion de muestra antes de aplicar uno o mas componentes de ensayo (p. ej., como se ha descrito anteriormente) al lugar de aplicacion de muestra. Como se ha mencionado anteriormente, el dispositivo puede incluir uno o mas componentes de ensayo (p. ej., reactivo, tales como se ha descrito anteriormente). En tales casos, el lugar de aplicacion de muestra contactado por muestra se proporciona aplicando la muestra al lugar de aplicacion de muestra, p. ej., sin combinacion previa con uno o mas componentes de ensayo.
Tras la aplicacion de muestra, se permite que la muestra fluya a traves del canal capilar, y entonces se lee o evalua una o mas partes del canal, p. ej., la region de deteccion, que incluye el canal entero, para determinar si el analito(s) de interes esta presente en la muestra. El canal o una o mas partes del mismo puede ser lefdo tras un periodo de tiempo predeterminado tras la aplicacion de muestra, donde este periodo de tiempo puede ir de 10 s. a 1 hora, tales como de 30 s. a 30 min., p. ej., de 30 s. a 10 min., incluido de 30 s. a 1 min.
El canal capilar o una o mas partes del mismo puede ser lefdo usando un protocolo que depende de la naturaleza del ensayo y analito a detectar. Por ejemplo, se pueden detectar radioetiquetas usando pelfcula fotografica o contadores de destellos, se pueden detectar marcadores fluorescentes usando uno o mas iluminadores, p. ej., laseres, ledes, y uno o mas fotodetectores, p. ej., PMT, CCD, para detectar luz emitida. Las etiquetas enzimaticas se detectan tfpicamente proporcionando la enzima con un sustrato y detectando el producto de reaccion producido por la accion de la enzima en el sustrato, las etiquetas metalicas se pueden detectar simplemente visualizando la etiqueta coloreada o se pueden detectar usando equipos de laboratorio que puedan detectar metal, y las etiquetas colorimetricas se detectan simplemente visualizando la etiqueta coloreada. En consecuencia, en esos casos donde la etiqueta empleada es una etiqueta fluorescente, el metodo puede incluir irradiar la muestra en el canal capilar o una parte del mismo con luz de una longitud de onda adecuada para excitar la etiqueta y entonces detectar luz emitida desde la etiqueta fluorescente, p. ej., a traves de la ventana de visualizacion de un alojamiento del dispositivo. Como tal, una etapa subsiguiente en metodos de la invencion puede incluir leer una region de deteccion del canal capilar del dispositivo para determinar si el analito esta presente en la muestra.
Como se ha indicado anteriormente, metodos de la invencion pueden incluir una etapa de colocar el dispositivo cargado con muestra en un lector adecuado y obtener un resultado de ensayo del lector. Por ejemplo, la fluorescencia de los analitos capturados se puede medir usando un sistema barato digital de obtencion de imagenes/procesamiento de imagenes. Sistemas y metodos adecuados para obtencion de imagenes de muestras en canales capilares se
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describen la patente de EE. UU. 8.248.597 expedida el 21 de agosto de 2012 y la solicitud de patente de EE. UU. 13/590.114 presentada el 20 de agosto de 2012. Convertidores de imagenes adecuados se describen en las patentes de EE. UU. 7.927.561, y 7.738.094.
El metodo puede determinar si un analito esta presente en la muestra en una cantidad que cumple o supera un umbral predeterminado. Como tal, cuando la cantidad de analitos de interes en la muestra sobrepasa un umbral particular (tambien se le hace referencia como un “umbral predeterminado”), la senal en la region de deteccion (resultante de la union del competidor para capturar sonda en la region de deteccion) es detectable. El umbral o umbral predeterminado puede ser determinado por multiples factores ponderados diferencialmente (p. ej., el numero de sondas de captura en la region de recepcion de muestra que se unen al analito, la afinidad de union del sonda de captura para el analito, y similares).
Utilidad
Los metodos, dispositivos, y kits de la invencion encontraran uso en una variedad de diferentes aplicaciones y se pueden usar para determinar si un analito esta presente en una multitud de diferentes tipos de muestra de una multitud de fuentes posibles. Dependiendo de la aplicacion y el resultado deseado de los metodos descritos en esta memoria, un analito puede ser detectado de una manera cualitativa (“presente” vs “ausente”; “'sf, por encima de un umbral predeterminado” vs “no, no por encima de un umbral predeterminado”; etc.) o una manera cuantitativa, p. ej., como cantidad en una muestra (tal como concentracion en la muestra). Muchos tipos diferentes de analito pueden ser analitos de interes, incluidos pero sin limitacion: protemas (incluidos ambos protemas libres y protemas unidas a la superficie de una estructura, tal como un celda), acidos nucleicos, partmulas virales, y similares. Ademas, las muestras pueden ser fuentes in vitro o in vivo, y las muestras pueden ser muestras de diagnostico.
Al poner en practica metodos de la invencion, las muestras se pueden obtener de fuentes in vitro (p. ej., extraer de un cultivo celular que crece en laboratorio) o de fuentes in vivo (p. ej., un sujeto mairnfero, un sujeto humano, un animal en investigacion, etc.). La muestra se puede obtener de una fuente in vitro. Fuentes in vitro incluyen, pero no se limitan a ellas, cultivos celulares procariantes (p. ej., bacteriano), cultivos celulares eucariantes (p. ej., marnffero, fungico) (p. ej., cultivos de lmeas celulares establecidas, cultivos de lmeas celulares conocidas o adquiridas, cultivos de lmeas celulares inmortalizadas, cultivos de celulas primarias, cultivos de levadura de laboratorio, etc.), cultivos de tejido, eluyentes de cromatograffa en columna, lisados/extractos celulares (p. ej., lisados/extractos que contienen protemas, lisados/extractos que contienen acido nucleico, etc.), sobrenadantes de paquete viral, y similares. La muestra se puede obtener de una fuente in vivo. Fuentes in vivo incluyen organismos multicelulares vivos y pueden producir muestras de diagnostico.
El analito puede ser un analito de diagnostico. Un "analito de diagnostico" es un analito de una muestra que ha sido obtenido o derivado de un organismo multicelular vivo, p. ej., mam^era, a fin de hacer una diagnosis. En otras palabras, la muestra ha sido obtenida para determinar la presencia de uno o mas analitos de enfermedad a fin de diagnosticar una enfermedad o condicion. En consecuencia, los metodos son metodos de diagnostico. Como los metodos son "metodos de diagnostico", son metodos que diagnostican (es decir, determinan la presencia o ausencia) una enfermedad (p. ej., nausea, diabetes, etc.) o condicion (p. ej., embarazo) en un organismo vivo, tal como un marnffero (p. ej., un humano). Como tal, ciertas realizaciones de la presente descripcion son metodos que se emplean para determinar si un sujeto vivo tiene una enfermedad o condicion dadas (p. ej., diabetes). Los “Metodos de diagnostico” tambien incluyen metodos que determinan la gravedad o estado de una enfermedad o condicion dadas.
Los metodos estan relacionados con metodos para determinar si un analito esta presente en una muestra de diagnostico, y como tal estan relacionados con metodos que son metodos para evaluar una muestra en la que los analitos de interes pueden estar presentes o no. En algunos casos, se desconoce si el analito esta presente en la muestra antes de realizar el ensayo. En otros casos, antes de realizar el ensayo, se desconoce si el analito esta presente en la muestra en una cantidad que es mayor que (supera) una cantidad de umbral predeterminado. En tales casos, los metodos son metodos para evaluar una muestra en la que los analitos de interes pueden estar presentes o no en una cantidad que es mayor que (supera) un umbral predeterminado.
Muestras de diagnostico incluyen las obtenidas de fuentes in vivo (p. ej., un sujeto mamnfero, un sujeto humano, y similares.) y pueden incluir muestras obtenidas de tejidos o celulas de un sujeto (p. ej., biopsias, muestras de tejido, sangre completa, sangre fraccionada, pelo, piel, y similares). En algunos casos, celulas, fluidos, o tejidos derivados de un sujeto se cultivan, almacenan o manipulan antes de la evaluacion y este tipo de muestra se puede considerar una muestra de diagnostico si los resultados se usan para determinar la presencia, ausencia, estado o gravedad de una enfermedad (p. ej., nausea, diabetes, etc.) o condicion (p. ej., embarazo) en un organismo vivo.
En algunos casos, una muestra de diagnostico es una muestra de tejido (p. ej., sangre completa, sangre fraccionada, plasma, suero, saliva, y similares) o se obtiene de una muestra de tejido (p. ej., sangre completa, sangre fraccionada, plasma, suero, saliva, piel, pelo, y similares). Un ejemplo de una muestra de diagnostico incluye, aunque sin limitarse a estos cultivos celulares y tisulares derivados de un sujeto (y derivados del mismo, tales como sobrenadantes, lisados, y similares); muestras de tejidos y fluidos corporales; muestras no celulares (p. ej., eluyentes de columna; biomoleculas acelulares tales como protemas, lfpidos, carbohidratos, acidos nucleicos; mezclas de reaccion de smtesis; mezclas de reaccion de amplificacion de acido nucleico; soluciones de ensayo o reacciones enzimaticas y bioqmmicas in vitro; o
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productos de otras reacciones in vitro e in vivo, etc.); etc.
Los metodos de asunto se pueden emplear con muestras de una variedad de tipos diferentes de sujetos. En algunas realizaciones, una muestra es de un sujeto dentro de la clase mairnferos, incluidos p. ej., el orden carnvoro (p. ej. perros y gatos), roedores (p. ej., raton, cerdos guineanos y ratas), lagomorfos (p. ej., conejos) y primates (p. ej., humanos, chimpances y monos), y similares. En ciertas realizaciones, los animales o anfitriones, es decir, sujetos, son humanos.
Kits
Aspectos de la invencion incluyen ademas kits, donde los kits incluyen uno o mas dispositivos de ensayo, p. ej., como se ha descrito anteriormente. En algunos casos, los kits pueden incluir uno o mas componentes de ensayo (p. ej., reactivos etiquetados, tampones, etc., tales como se ha descrito anteriormente). En algunos casos, los kits pueden incluir ademas un dispositivo de recogida de muestras, p. ej., una lanza o aguja configuradas para pinchar la piel para obtener una muestra de sangre completa, una pipeta, etc., segun se desee.
Los diversos componentes de ensayo de los kits pueden estar presentes en recipientes separados, o algunos o todos ellos pueden ser precombinados en una mezcla de reactivo. Por ejemplo, en algunos casos, uno o mas componentes del kit, p. ej., el dispositivo, estan presentes en un saquito sellado, p. ej., un saquito o sobre de lamina esteril.
Ademas de los componentes anteriores, los kits de asunto pueden incluir ademas (en ciertas realizaciones) instrucciones para practicar los metodos de asunto. Estas instrucciones pueden estar presentes en los kits de asunto en una variedad de formas, una o mas de las cuales puede estar presente en el kit. Una forma en la que estos instrucciones pueden estar presentes es como informacion impresa en un medio o sustrato adecuado, p. ej., un pedazo o pedazos de papel en lo que se imprime el informacion, en el paquete del kit, en un inserto de envase, y similares. Incluso otra forma de estas instrucciones es un medio legible por ordenador, p. ej., disquete, disco compacto (CD), unidad flash portatil, y similares, en los que se ha grabado la informacion. Incluso otra forma de estas instrucciones que puede estar presente es una direccion de pagina web que puede ser usada por medio de internet para acceder a la informacion en un lugar retirado.
Lo siguiente se ofrece a modo de ilustracion, y no a modo de limitacion.
Experimental
I. Ensayo de superficie celular CD4/Hb
La figura 2A proporciona una representacion de un dispositivo segun una realizacion de la invencion que se configura para realizar un ensayo de CD4 y hemoglobina (Hb). El ensayo se realiza esencialmente de la siguiente manera. Una cantidad de pinchado en dedo (5-50 pL) de sangre completa se carga en un lugar de aplicacion de muestra de un dispositivo capilar de esta invencion (mostrado en la figura 2A) donde se mezcla con anti-CD4 humano precargado, conservado seco, etiquetado con una etiqueta fluorescente adecuada, tal como aloficocianina o ficoeritrina, y posteriormente fluye a un canal capilar. Una vez cargado, se coloca un capuchon sobre el lugar de aplicacion de muestra, sellando el lugar de aplicacion de muestra y la salida de respiradero del canal capilar. El flujo capilar procede a lo largo del canal, sin impedimento del capuchon que sella el capilar contra el ambiente exterior. El flujo termina en un empalme hidrofobo. El anti-CD4 etiquetado se une a celulas que tienen CD4 superficial. Se realiza deteccion usando un led apropiado para iluminar el cartucho en una o mas ubicaciones a lo largo del canal, y se mide la fluorescencia por obtencion de imagenes a traves de la parte superior del cartucho usando un dispositivo adecuado de obtencion de imagenes, tal como un microscopio de baja potencia con un detector de camara CCD y un filtro apropiado a traves del pared opticamente trasmisora del canal capilar. La intensidad de fluorescencia de celulas en el canal puede ser cuantificada tras procesamiento y analisis de imagenes, segun se desee.
Para el ensayo de hemoglobina, se puede realizar cualquier protocolo conveniente, incluido un protocolo libre de reactivo, p. ej., como se describe en las patentes de EE. uU. n.os. 8.483.789; 7.952.692; 7.319.894; 7.303.922; 7.271.912; 7.096.124; 7.075.628; 6.862.534; 6.831.733; y 5.773.301; y similares. Tambien puede haber presente una region en el extremo del microcanal para cuencas de reactivo inmovilizadas de control de calidad (QC), que se recubren con una cantidad conocida de CD4 que se une con el reactivo de anticuerpo etiquetado. Una senal positiva detectada en esta region confirma que reactivo y muestra fluyeron a traves del canal capilar al empalme hidrofobo, y por lo tanto que el ensayo se comporto apropiadamente.
II. Ensayo Anti-gp41
El ensayo se realiza esencialmente de la siguiente manera. Una cantidad de pinchazo en dedo (5-50 pL) de sangre completa se carga en un lugar de aplicacion de muestra de un dispositivo capilar de esta invencion (mostrado en la figura 2B) donde se mezcla con anti-aloficocianina (APC) humana de anticuerpo precargada, conservada en seco, y posteriormente fluye a un canal capilar, que contiene micropartfculas recubiertas con antfgeno gp41 (usando VIH como ejemplo) inmovilizadas sobre la superficie superior del canal. Una vez cargado, se coloca un capuchon sobre el lugar de aplicacion de muestra, sellando el lugar de aplicacion de muestra y la salida de respiradero del canal capilar. El flujo capilar procede a lo largo del canal, sin impedimento del capuchon que sella el capilar contra el ambiente exterior.
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El flujo termina en un empalme hidrofobo. El anticuerpo anti-gp41 presente en la muestra se unira a la micropartfcula, dando como resultado la formacion de complejos cuenca-gp41/anti-gp41 anticuerpo/APC-anti-anticuerpo humano. Se realiza deteccion usando un led rojo para iluminar el cartucho donde se ubica el punto de las cuencas, y se mide la fluorescencia por obtencion de imagenes a traves de la parte superior del cartucho usando un microscopio de baja potencia con un detector de camara CCD y un filtro apropiado a traves del pared opticamente trasmisora del canal capilar. La intensidad de fluorescencia en las micropartfculas se cuantifica tras procesamiento y analisis de imagenes. Para ensayos multiplexados, micropartfculas recubiertas con diferentes antigenos asociados con enfermedad se fijan en ubicaciones unicas en el cartucho. Tambien se muestra una region en el extremo del microcanal para cuencas de reactivo inmovilizadas de control de calidad (QC, del ingles quality control), que son recubiertas con anticuerpo humano que se unen con el APC-anti-reactivo de anticuerpo humano. Una senal positiva detectada en esta region confirma que reactivo y muestra fluyeron a traves del canal capilar al empalme hidrofobo, y por lo tanto que el ensayo se comporto apropiadamente.
A pesar de las clausulas adjuntas, la descripcion tambien esta definida por las siguientes clausulas:
1. Un microdispositivo flmdico configurado para realizar un ensayo de una muestra lfquida, el dispositivo comprende:
un lugar de aplicacion de muestra en comunicacion con un canal capilar; una salida de respiradero en comunicacion con el canal capilar; y
un elemento de capuchon configurado para sellar la salida de respiradero y el lugar de aplicacion de muestra contra un ambiente exterior, en donde el elemento de capuchon permite un volumen sellado sobre el lugar de aplicacion de muestra y la salida de respiradero separado del ambiente exterior.
2. El dispositivo segun la clausula 1, que comprende ademas un canal de respiro entre la salida de respiradero y el canal capilar.
3. El dispositivo segun las clausulas 1 o 2, que comprende ademas una barrera de lfquido que rodea el lugar de aplicacion, en donde la barrera de lfquido se dispone entre el lugar de aplicacion y la salida de respiradero.
4. El dispositivo segun la clausula 3, en donde la barrera de lfquido comprende un canto elevado que rodea el lugar de aplicacion.
5. El dispositivo segun la clausula 3, en donde la barrera de lfquido comprende una depresion que rodea el lugar de aplicacion.
6. El dispositivo segun las clausulas 1 a 5, en donde el elemento de capuchon comprende una empaquetadura.
7. El dispositivo segun las clausulas 1 a 6, en donde el canal capilar tiene entre 20 y 70 micrometres de profundo.
8. Un microdispositivo flmdico configurado para realizar un ensayo de una muestra lfquida, el dispositivo comprende:
un lugar de aplicacion de muestra y un empalme hidrofobo en comunicacion con un canal capilar, en donde el empalme hidrofobo se configura para impedir flujo de lfquido;
una salida de respiradero en comunicacion con el empalme hidrofobo; y
un elemento de capuchon configurado para sellar la salida de respiradero y el lugar de aplicacion de muestra contra un ambiente exterior, en donde el elemento de capuchon cubre un volumen compartido alrededor del lugar de aplicacion de muestra y la salida de respiradero.
9. El dispositivo segun la clausula 8, en donde el empalme hidrofobo comprende un area tratada con hexano del microdispositivo flmdico.
10. Un metodo para realizar un ensayo de una muestra lfquida, el metodo comprende:
aplicar una muestra lfquida a un lugar de aplicacion de muestra en comunicacion de fluidos con un canal capilar en donde la muestra lfquida fluye por medio de una fuerza de accion capilar a traves del canal capilar;
proporcionar respiro para la fuerza de accion capilar a traves de una salida de respiradero; y
sellar la muestra lfquida contra el ambiente exterior con un elemento de capuchon, en donde el elemento de capuchon proporciona un volumen sellado compartido alrededor del lugar de aplicacion de muestra y la salida de respiradero.
11. El metodo segun la clausula 10, en donde el dispositivo comprende ademas una barrera de lfquido que rodea el lugar de aplicacion y la barrera de lfquido se dispone entre el lugar de aplicacion y la salida de respiradero.
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12. El metodo segun la de aplicacion.
13. El metodo segun la aplicacion.
14. El metodo segun las clausulas 10 a 13, en donde el elemento de capuchon comprende una empaquetadura.
15. El metodo segun las clausulas 10 a 13, en donde la profundidad del canal capilar tiene entre 20 y 50 micrometros de profundo.
16. El metodo segun cualquiera de las clausulas 10 a 15, en donde el metodo comprende ademas leer al menos una parte del canal capilar para obtener un resultado.
17. El metodo segun la clausula 16, en donde el metodo comprende ademas hacer una diagnosis basada en el resultado obtenido.
18. Un metodo para formar un microdispositivo flmdico, el metodo comprende:
tratar una primera area predeterminada en un material plastico con plasma, en donde el tratamiento con plasma aumenta la hidrofilicidad de la primera area predeterminada;
contactar una segunda area predeterminada con un solvente organico no polar, en donde el tratamiento reduce la hidrofilicidad de la segunda area predeterminada y en donde la primera y segunda area predeterminada se pueden superponer; y
formar un canal capilar y un empalme hidrofobo desde la primera y segunda area predeterminada.
19. El metodo segun la clausula 18, en donde el microdispositivo flmdico de plastico contiene un polfmero de cicloolefina y el solvente organico comprende un solvente organico no polar.
20. El metodo de las clausulas 18 o 19 en donde formar un canal capilar y un empalme hidrofobo comprende conectar una cubierta a la primera y segunda areas predeterminadas para formar un canal capilar y un empalme hidrofobo.
21. El metodo segun la clausula 20, en donde el solvente organico se selecciona del grupo que consiste en solventes organicos no polares que incluyen hexano, heptano, pentano y cloroformo y combinaciones de los mismos.
22. El metodo segun la clausula 21, en donde el solvente organico es hexano.
23. Un microdispositivo flmdico configurado para realizar un ensayo de una muestra lfquida, el dispositivo comprende:
un lugar de aplicacion de muestra en comunicacion con un canal capilar; una salida de respiradero en comunicacion con el canal capilar;
un elemento de capuchon configurado para sellar la salida de respiradero y el lugar de aplicacion de muestra contra un ambiente exterior, en donde el elemento de capuchon permite un volumen sellado sobre el lugar de aplicacion de muestra y la salida de respiradero separado del ambiente exterior; y
una cantidad de una muestra biologica presente en el dispositivo.
24. El dispositivo segun la clausula 23, en donde la muestra biologica es sangre completa.
25. Un sistema que comprende:
(a) un lector; y
(b) un microdispositivo flmdico configurado para realizar un ensayo de una muestra lfquida y cargado en el lector, el dispositivo comprende:
un lugar de aplicacion de muestra en comunicacion con un canal capilar; una salida de respiradero en comunicacion con el canal capilar; y
un elemento de capuchon configurado para sellar la salida de respiradero y el lugar de aplicacion de muestra contra un ambiente exterior, en donde el elemento de capuchon permite un volumen sellado sobre el lugar de aplicacion de muestra y la salida de respiradero separado del ambiente exterior.
26. El sistema segun la clausula 25, en donde el lector comprende un iluminador y un detector.
clausula 11, en donde la barrera de lfquido comprende un canto elevado que rodea el lugar clausula 11, en donde la barrera de lfquido comprende una depresion que rodea el lugar de
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27. Un kit que comprende:
(a) un microdispositivo flmdico que comprende:
un lugar de aplicacion de muestra en comunicacion con un canal capilar; una salida de respiradero en comunicacion con el canal capilar; y
un elemento de capuchon configurado para sellar la salida de respiradero y el lugar de aplicacion de muestra contra un ambiente exterior, en donde el elemento de capuchon permite un volumen sellado sobre el lugar de aplicacion de muestra y la salida de respiradero separado del ambiente exterior; y
(b) un recipiente que aloja el dispositivo.
28. El kit segun la clausula 27, en donde el recipiente comprende un saquito.
Aunque la invencion precedente se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustracion y ejemplo por motivos de claridad y entendimiento, para los expertos en la tecnica a la luz de las ensenanzas de esta invencion sera facilmente evidente que a la misma se le pueden hacer ciertos cambios y modificaciones sin salir del espmtu y el alcance de las reivindicaciones anexas.
Por consiguiente, lo anterior meramente ilustra los principios de la invencion. Se apreciara que los expertos en la tecnica podran idear diversas disposiciones que, aunque no explfcitamente descritas o mostradas en esta memoria, plasman los principios de la invencion y se incluyen dentro de su espmtu y alcance. Ademas, todos los ejemplos y el lenguaje condicional citado en esta memoria pretenden principalmente ayudar al lector a entender los principios de la invencion y los conceptos contribuidos por los inventores para impulsar la tecnica, y se han de interpretar como sin limitacion a tales ejemplos y condiciones citados espedficamente. Ademas, todas declaraciones en esta memoria que citan principios, aspectos, y realizaciones de la invencion asf como ejemplos espedficos de la misma, pretenden abarcar equivalentes estructurales y funcionales de la misma. Adicionalmente, se pretende que tales equivalentes incluyan tanto equivalentes conocidos actualmente como equivalentes desarrollados en el futuro, es decir, elementos desarrollados que realizan la misma funcion, independientemente de estructura. El alcance de la presente invencion, por lo tanto, no pretende estar limitado a las realizaciones ejemplares mostradas y descritas en esta memoria. En cambio, el alcance de presente invencion es plasmado por las reivindicaciones anexas.

Claims (13)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un microdispositivo flmdico configurado para realizar un ensayo de una muestra Ifquida, el dispositivo comprende:
    un lugar de aplicacion de muestra en comunicacion con un canal capilar; una salida de respiradero en comunicacion con el canal capilar; y
    un elemento de capuchon configurado para sellar la salida de respiradero y el lugar de aplicacion de muestra contra un ambiente exterior, en donde el elemento de capuchon permite un volumen sellado sobre el lugar de aplicacion de muestra y la salida de respiradero separado del ambiente exterior.
  2. 2. El dispositivo segun la reivindicacion 1, que comprende ademas un canal de respiro entre la salida de respiradero y el canal capilar.
  3. 3. El dispositivo segun las reivindicaciones 1 o 2, que comprende ademas una barrera de lfquido que rodea el lugar de aplicacion, en donde la barrera de lfquido se dispone entre el lugar de aplicacion y la salida de respiradero.
  4. 4. El dispositivo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el elemento de capuchon comprende una empaquetadura.
  5. 5. El dispositivo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el canal capilar tiene entre 20 y 70 micrometros de profundo.
  6. 6. Un microdispositivo flmdico configurado para realizar un ensayo de una muestra lfquida, el dispositivo comprende:
    un lugar de aplicacion de muestra y un empalme hidrofobo en comunicacion con un canal capilar, en donde el empalme hidrofobo se configura para impedir flujo de lfquido;
    una salida de respiradero en comunicacion con el empalme hidrofobo; y
    un elemento de capuchon configurado para sellar la salida de respiradero y el lugar de aplicacion de muestra contra un ambiente exterior, en donde el elemento de capuchon cubre un volumen compartido alrededor del lugar de aplicacion de muestra y la salida de respiradero.
  7. 7. Un metodo para realizar un ensayo de una muestra lfquida, el metodo comprende:
    aplicar una muestra lfquida a un lugar de aplicacion de muestra en comunicacion de fluidos con un canal capilar en donde la muestra lfquida fluye por medio de una fuerza de accion capilar a traves del canal capilar;
    proporcionar respiro para la fuerza de accion capilar a traves de una salida de respiradero; y
    sellar la muestra lfquida contra el ambiente exterior con un elemento de capuchon, en donde el elemento de capuchon proporciona un volumen sellado compartido alrededor del lugar de aplicacion de muestra y la salida de respiradero.
  8. 8. El metodo segun la reivindicacion 7, en donde el dispositivo es un dispositivo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
  9. 9. El metodo segun la reivindicacion 7 u 8, en donde el metodo comprende ademas leer al menos una parte del canal capilar para obtener un resultado.
  10. 10. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en donde el metodo comprende ademas hacer una diagnosis basada en el resultado obtenido.
  11. 11. El microdispositivo flmdico segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1-6, que comprende ademas una cantidad de una muestra biologica presente en el dispositivo.
  12. 12. Un sistema que comprende:
    (a) un lector; y
    (b) un microdispositivo flmdico segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1-6.
  13. 13. Un kit que comprende:
    (a) un microdispositivo flmdico segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1-6 y
    (b) un recipiente que aloja el dispositivo
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