JPH10309191A - 血管内皮細胞増殖因子の製造 - Google Patents
血管内皮細胞増殖因子の製造Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 血管内皮細胞に対して***促進性があり、従
って新たな血管新生(脈管形成)および血管内表面の内
皮新生を促進するのに有用な創傷治癒剤の製造方法を提
供すること、ならびに、組換えDNA技術によって血管
内皮細胞増殖因子を製造する方法および手段を提供する
こと。 【解決手段】 哺乳動物の血管内皮細胞増殖因子をコー
ドする単離されたDNA配列。
って新たな血管新生(脈管形成)および血管内表面の内
皮新生を促進するのに有用な創傷治癒剤の製造方法を提
供すること、ならびに、組換えDNA技術によって血管
内皮細胞増殖因子を製造する方法および手段を提供する
こと。 【解決手段】 哺乳動物の血管内皮細胞増殖因子をコー
ドする単離されたDNA配列。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、創傷治癒の分野に
関する。特に本発明は、血管内皮細胞に対して***促進
性があり、従って新たな血管新生(脈管形成)および血
管内表面の内皮新生を促進するのに有用な創傷治癒剤の
製造に関する。本発明は、組換えDNA技術によって血
管内皮細胞増殖因子を製造する方法および手段を提供す
る。
関する。特に本発明は、血管内皮細胞に対して***促進
性があり、従って新たな血管新生(脈管形成)および血
管内表面の内皮新生を促進するのに有用な創傷治癒剤の
製造に関する。本発明は、組換えDNA技術によって血
管内皮細胞増殖因子を製造する方法および手段を提供す
る。
【0002】
【従来の技術】発明の背景 脈管形成、すなわち新しい毛細血管の増殖は、多くの型
の創傷の適正な治癒に決定的に重要なプロセスである。
従って、脈管形成を促進し得る因子は、創傷治癒剤とし
て有用である。脈管形成は複数工程のプロセスであり、
毛細血管内皮細胞の増殖、移動、および組織浸透を含
む。塩基性および酸性の線維芽細胞増殖因子、形質転換
増殖因子α、および表皮増殖因子を含む、多くの公知の
増殖因子は、様々な細胞の型に対し広く***促進性であ
り、そして脈管形成性である。従って、このような因子
は、潜在的に組織の修復を促進するのに有用である。多
くの型の創傷治癒への適用では、広範囲の細胞***促進
性が望ましい。しかし、より細胞特異的な***促進活性
を有することが望ましい特異的な型の創傷治癒への適用
もある。例えば、血管移植手術、バルーン血管形成、あ
るいは心筋梗塞発症後の患者で側副血行を促進する場
合、血管内皮細胞に高度に特異的な***促進活性を有す
る、細胞***促進因子を導入した創傷治癒剤を用いるこ
とが望ましい。なぜならば内皮細胞の増殖と共に他の細
胞の型が増殖すると、血流のブロックおよび/あるいは
減少が引き起こされ得るからである。現在のところ、こ
の型の適用に広く利用できる非常に適切な細胞***促進
因子はない。
の創傷の適正な治癒に決定的に重要なプロセスである。
従って、脈管形成を促進し得る因子は、創傷治癒剤とし
て有用である。脈管形成は複数工程のプロセスであり、
毛細血管内皮細胞の増殖、移動、および組織浸透を含
む。塩基性および酸性の線維芽細胞増殖因子、形質転換
増殖因子α、および表皮増殖因子を含む、多くの公知の
増殖因子は、様々な細胞の型に対し広く***促進性であ
り、そして脈管形成性である。従って、このような因子
は、潜在的に組織の修復を促進するのに有用である。多
くの型の創傷治癒への適用では、広範囲の細胞***促進
性が望ましい。しかし、より細胞特異的な***促進活性
を有することが望ましい特異的な型の創傷治癒への適用
もある。例えば、血管移植手術、バルーン血管形成、あ
るいは心筋梗塞発症後の患者で側副血行を促進する場
合、血管内皮細胞に高度に特異的な***促進活性を有す
る、細胞***促進因子を導入した創傷治癒剤を用いるこ
とが望ましい。なぜならば内皮細胞の増殖と共に他の細
胞の型が増殖すると、血流のブロックおよび/あるいは
減少が引き起こされ得るからである。現在のところ、こ
の型の適用に広く利用できる非常に適切な細胞***促進
因子はない。
【0003】最近、明らかに血管内皮細胞に特異的な分
裂促進物質が、ウシ濾胞星状細胞(bovine folliculo s
tellate cells)の馴化培地から単離された。そしてそ
の部分的なアミノ酸配列が決定された(Gospodarowicz
ら、PNAS(1989) 88(19):7311-7315:FerraraおよびHenze
l、BBRC(1989) 161(2):851-858)。この因子は、2つの
約23kDのサブユニットのホモダイマーのようである。Go
spodarowiczら、およびFerarraらが記載の、このウシタ
ンパク質に部分的に相同性のあるマウスの相同物因子
が、マウスAtT20細胞(ATCC CCL 89)の馴化培地から単
離されており、そのN末端側のアミノ酸配列が決定され
た(Plouёtら、EMBO J.(1989) 8(12):3801-3806)。両
方の因子は、血管内皮細胞に対する***促進活性を有し
ており、そして試験された他の細胞の型に対する***促
進活性は有さないことが示されている。従って、これら
の因子は、多くの型の創傷治癒への適用に有用である。
残念ながら、これらの因子をその天然原科からの精製に
よって商業的な量で得ることは、実用的および経済的で
ない。
裂促進物質が、ウシ濾胞星状細胞(bovine folliculo s
tellate cells)の馴化培地から単離された。そしてそ
の部分的なアミノ酸配列が決定された(Gospodarowicz
ら、PNAS(1989) 88(19):7311-7315:FerraraおよびHenze
l、BBRC(1989) 161(2):851-858)。この因子は、2つの
約23kDのサブユニットのホモダイマーのようである。Go
spodarowiczら、およびFerarraらが記載の、このウシタ
ンパク質に部分的に相同性のあるマウスの相同物因子
が、マウスAtT20細胞(ATCC CCL 89)の馴化培地から単
離されており、そのN末端側のアミノ酸配列が決定され
た(Plouёtら、EMBO J.(1989) 8(12):3801-3806)。両
方の因子は、血管内皮細胞に対する***促進活性を有し
ており、そして試験された他の細胞の型に対する***促
進活性は有さないことが示されている。従って、これら
の因子は、多くの型の創傷治癒への適用に有用である。
残念ながら、これらの因子をその天然原科からの精製に
よって商業的な量で得ることは、実用的および経済的で
ない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、血管
内皮細胞に対して***促進性があり、従って新たな血管
新生(脈管形成)および血管内表面の内皮新生を促進す
るのに有用な創傷治癒剤の製造方法を提供することであ
る。本発明の目的はまた、組換えDNA技術によって血
管内皮細胞増殖因子を製造する方法および手段を提供す
ることである。
内皮細胞に対して***促進性があり、従って新たな血管
新生(脈管形成)および血管内表面の内皮新生を促進す
るのに有用な創傷治癒剤の製造方法を提供することであ
る。本発明の目的はまた、組換えDNA技術によって血
管内皮細胞増殖因子を製造する方法および手段を提供す
ることである。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、哺乳動
物の血管内皮細胞増殖因子をコードする単離されたDN
A配列が提供される。
物の血管内皮細胞増殖因子をコードする単離されたDN
A配列が提供される。
【0006】1つの実施態様において、上記DNA配列
は、図3aのDNA配列と標準的なハイブリダイゼーシ
ョン条件下でハイブリダイズ可能である。
は、図3aのDNA配列と標準的なハイブリダイゼーシ
ョン条件下でハイブリダイズ可能である。
【0007】1つの実施態様において、上記DNA配列
は、ウシおよびヒトの血管内皮細胞増殖因子から選択さ
れる血管内皮細胞増殖因子をコードする。
は、ウシおよびヒトの血管内皮細胞増殖因子から選択さ
れる血管内皮細胞増殖因子をコードする。
【0008】1つの実施態様において、上記DNA配列
は、ウシ血管内皮細胞増殖因子をコードする。
は、ウシ血管内皮細胞増殖因子をコードする。
【0009】1つの実施態様において、上記DNA配列
は、bVEGF120およびbVEGF164から選択される
ウシ血管内皮細胞増殖因子をコードする。
は、bVEGF120およびbVEGF164から選択される
ウシ血管内皮細胞増殖因子をコードする。
【0010】1つの実施態様において、上記DNA配列
は、図6に示されるヌクレオチドの1位から492位を包
含する。
は、図6に示されるヌクレオチドの1位から492位を包
含する。
【0011】1つの実施態様において、上記DNA配列
は、図6に示されるヌクレオチドの1位から341位に続
いてヌクレオチド474位から492位を包含する。
は、図6に示されるヌクレオチドの1位から341位に続
いてヌクレオチド474位から492位を包含する。
【0012】1つの実施態様において、上記DNA配列
は、ヒト血管内皮細胞増殖因子をコードする。
は、ヒト血管内皮細胞増殖因子をコードする。
【0013】1つの実施態様において、上記DNA配列
は、hVEGF121およびhVEGF165から選択される
ヒト血管内皮細胞増殖因子をコードする。
は、hVEGF121およびhVEGF165から選択される
ヒト血管内皮細胞増殖因子をコードする。
【0014】1つの実施態様において、上記DNA配列
は、図7に示されるヌクレオチドの1位から495位の配
列を包含する。
は、図7に示されるヌクレオチドの1位から495位の配
列を包含する。
【0015】1つの実施態様において、上記DNA配列
は、図7に示されるヌクレオチドの1位から344位に続
いてヌクレオチド477位から495位の配列を包含する。
は、図7に示されるヌクレオチドの1位から344位に続
いてヌクレオチド477位から495位の配列を包含する。
【0016】本発明によれば、哺乳動物の血管内皮細胞
増殖因子をコードするDNA配列が、宿主細胞中で直接
に該配列を発現することができる調節配列に作動可能に
連結されて包含される複製可能な発現ベクターが提供さ
れる。
増殖因子をコードするDNA配列が、宿主細胞中で直接
に該配列を発現することができる調節配列に作動可能に
連結されて包含される複製可能な発現ベクターが提供さ
れる。
【0017】1つの実施態様では、本発明の発現ベクタ
ーにおいて、上記DNAコード配列は、図3aのDNA
配列と標準的なハイブリダイゼーション条件下でハイブ
リダイズ可能な配列である。
ーにおいて、上記DNAコード配列は、図3aのDNA
配列と標準的なハイブリダイゼーション条件下でハイブ
リダイズ可能な配列である。
【0018】1つの実施態様では、本発明の発現ベクタ
ーにおいて、上記DNAコード配列は、ウシおよびヒト
の血管内皮細胞増殖因子から選択されるタンパク質をコ
ードする。
ーにおいて、上記DNAコード配列は、ウシおよびヒト
の血管内皮細胞増殖因子から選択されるタンパク質をコ
ードする。
【0019】1つの実施態様では、本発明の発現ベクタ
ーにおいて、上記DNAコード配列は、bVEGF120
およびbVEGF164から選択されるタンパク質をコー
ドする。
ーにおいて、上記DNAコード配列は、bVEGF120
およびbVEGF164から選択されるタンパク質をコー
ドする。
【0020】1つの実施態様では、本発明の発現ベクタ
ーにおいて、上記DNAコード配列は、図6に示される
ヌクレオチドの1位から492位の配列を包含する。
ーにおいて、上記DNAコード配列は、図6に示される
ヌクレオチドの1位から492位の配列を包含する。
【0021】1つの実施態様では、本発明の発現ベクタ
ーにおいて、上記DNAコード配列は、図6に示される
ヌクレオチドの1位から341位に続いてヌクレオチド474
位から492位を包含する。
ーにおいて、上記DNAコード配列は、図6に示される
ヌクレオチドの1位から341位に続いてヌクレオチド474
位から492位を包含する。
【0022】1つの実施態様では、本発明の発現ベクタ
ーにおいて、上記DNAコード配列は、hVEGF121
およびhVEGF165から選択されるタンパク質をコー
ドする。
ーにおいて、上記DNAコード配列は、hVEGF121
およびhVEGF165から選択されるタンパク質をコー
ドする。
【0023】1つの実施態様では、本発明の発現ベクタ
ーにおいて、上記DNAコード配列は、図7に示される
ヌクレオチドの1位から495位の配列を包含する。
ーにおいて、上記DNAコード配列は、図7に示される
ヌクレオチドの1位から495位の配列を包含する。
【0024】1つの実施態様では、本発明の発現ベクタ
ーにおいて、上記DNAコード配列は、図7に示される
ヌクレオチドの1位から344位に続いてヌクレオチド477
位から495位の配列を包含する。
ーにおいて、上記DNAコード配列は、図7に示される
ヌクレオチドの1位から344位に続いてヌクレオチド477
位から495位の配列を包含する。
【0025】本発明によれば、上記の発現ベクターで形
質転換された宿主細胞が提供される。
質転換された宿主細胞が提供される。
【0026】1つの実施態様では、本発明の形質転換さ
れた宿主細胞において、上記宿主細胞は、E.coliであ
る。
れた宿主細胞において、上記宿主細胞は、E.coliであ
る。
【0027】1つの実施態様では、本発明の形質転換さ
れた宿主細胞において、上記宿主細胞は、真核細胞であ
る。
れた宿主細胞において、上記宿主細胞は、真核細胞であ
る。
【0028】1つの実施態様では、本発明の形質転換さ
れた宿主細胞において、上記宿主細胞は、CHO細胞であ
る。
れた宿主細胞において、上記宿主細胞は、CHO細胞であ
る。
【0029】本発明によれば、血管内皮細胞増殖因子を
製造する方法が提供される。この方法は、(a)血管内
皮細胞増殖因子のポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコー
ドするDNA配列を包含する発現ベクターで形質転換さ
れた細胞を該ポリペプチドが発現される条件下で培養
し、(b)発現された該ポリペプチドを回収し、および
(c)該ポリペプチド鎖のジスルフィド結合を形成させ
る工程、を包含する。
製造する方法が提供される。この方法は、(a)血管内
皮細胞増殖因子のポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコー
ドするDNA配列を包含する発現ベクターで形質転換さ
れた細胞を該ポリペプチドが発現される条件下で培養
し、(b)発現された該ポリペプチドを回収し、および
(c)該ポリペプチド鎖のジスルフィド結合を形成させ
る工程、を包含する。
【0030】1つの実施態様では、本発明の製造方法に
おいて、上記DNA配列は、ウシおよびヒトの血管内皮
細胞増殖因子から選択される血管内皮細胞増殖因子をコ
ードする。
おいて、上記DNA配列は、ウシおよびヒトの血管内皮
細胞増殖因子から選択される血管内皮細胞増殖因子をコ
ードする。
【0031】1つの実施態様では、本発明の製造方法に
おいて、上記DNA配列は、bVEGF120、bVEG
F164、hVEGF121およびhVEGF165から選択さ
れるタンパク質をコードする。
おいて、上記DNA配列は、bVEGF120、bVEG
F164、hVEGF121およびhVEGF165から選択さ
れるタンパク質をコードする。
【0032】1つの実施態様では、本発明の製造方法に
おいて、上記宿主細胞は哺乳動物宿主細胞であり、そし
て生じる血管内皮細胞増殖因子はグリコシル化される。
おいて、上記宿主細胞は哺乳動物宿主細胞であり、そし
て生じる血管内皮細胞増殖因子はグリコシル化される。
【0033】1つの実施態様では、本発明の製造方法に
おいて、上記細胞は哺乳動物細胞であり、そして前記D
NA配列は図8のエキソンI−VおよびVIIIによってコ
ードされる予測されるアミノ酸配列をコードするDNA
配列である。
おいて、上記細胞は哺乳動物細胞であり、そして前記D
NA配列は図8のエキソンI−VおよびVIIIによってコ
ードされる予測されるアミノ酸配列をコードするDNA
配列である。
【0034】1つの実施態様では、本発明の製造方法に
おいて、上記発現の結果、培養培地中に分泌された成熟
型hVEGF121が得られる。
おいて、上記発現の結果、培養培地中に分泌された成熟
型hVEGF121が得られる。
【0035】本発明によれば、単離されたbVEGF
120が提供される。
120が提供される。
【0036】本発明によれば、単離されたhVEGF
121が提供される。
121が提供される。
【0037】1つの実施態様では、本発明の単離された
hVEGF121は、75位のアスパラギン(Asn)残基で
N-結合グリコシル化を包含する。
hVEGF121は、75位のアスパラギン(Asn)残基で
N-結合グリコシル化を包含する。
【0038】1つの実施態様では、本発明の単離された
hVEGF121は、約50%のhVEGF121がグリコシル
化されている。
hVEGF121は、約50%のhVEGF121がグリコシル
化されている。
【0039】本発明によれば、単離されたhVEGF
165が提供される。
165が提供される。
【0040】本発明によれば、両方のサブユニットがど
ちらもグリコシル化されていないホモダイマーである単
離されたhVEGF121が提供される。
ちらもグリコシル化されていないホモダイマーである単
離されたhVEGF121が提供される。
【0041】本発明によれば、両方のサブユニットがグ
リコシル化されているホモダイマーである単離されたh
VEGF121が提供される。
リコシル化されているホモダイマーである単離されたh
VEGF121が提供される。
【0042】本発明によれば、サブユニットの一方がグ
リコシル化されており、他方のサブユニットがグリコシ
ル化されていないヘテロダイマーである単離されたhV
EGF121が提供される。
リコシル化されており、他方のサブユニットがグリコシ
ル化されていないヘテロダイマーである単離されたhV
EGF121が提供される。
【0043】本発明によれば、それぞれがhVEGF
121、hVEGF165およびhVPF189から選択され
る、2つの異なるサブユニット、からなるヘテロダイマ
ーを包含する、脈管形成の阻害に有用なタンパク質が提
供される。
121、hVEGF165およびhVPF189から選択され
る、2つの異なるサブユニット、からなるヘテロダイマ
ーを包含する、脈管形成の阻害に有用なタンパク質が提
供される。
【0044】本発明によれば、血管内皮細胞増殖因子に
対する中和抗体の有効量を投与する治療を必要とする哺
乳動物に投与することを包含する、哺乳動物における脈
管形成を阻害する方法が提供される。
対する中和抗体の有効量を投与する治療を必要とする哺
乳動物に投与することを包含する、哺乳動物における脈
管形成を阻害する方法が提供される。
【0045】1つの実施態様では、本発明の阻害方法に
おいて、上記哺乳動物はヒトであり、抗体は抗-hVE
GF121である。
おいて、上記哺乳動物はヒトであり、抗体は抗-hVE
GF121である。
【0046】本発明によれば、治療を必要とする個体
に、それぞれがhVEGF121、hVEGF165およびh
VPF189から選択される2つの異なるサブユニットか
らなるヘテロダイマーを包含するタンパク質の有効量を
投与することを包含する脈管形成を阻害する方法が提供
される。
に、それぞれがhVEGF121、hVEGF165およびh
VPF189から選択される2つの異なるサブユニットか
らなるヘテロダイマーを包含するタンパク質の有効量を
投与することを包含する脈管形成を阻害する方法が提供
される。
【0047】本発明によれば、116番目のシステイン残
基が異なるアミノ酸残基に置換されているhVEGF
121アナログが提供される。
基が異なるアミノ酸残基に置換されているhVEGF
121アナログが提供される。
【0048】本発明によれば、160番目のシステイン残
基が異なるアミノ酸残基に置換されているhVEGF
165アナログが提供される。
基が異なるアミノ酸残基に置換されているhVEGF
165アナログが提供される。
【0049】発明の要旨 本発明は、創傷治癒剤として用いるための血管内皮細胞
増殖因子を商業的規模の量得るための方法および手段を
提供する。特に本発明は、哺乳類動物の血管内皮細胞増
殖因子のアミノ酸配列をコードするDNA配列を提供す
る。これらのDNA配列は、発現ベクターの調節エレメ
ントの制御下に挿入される。このエレメントは、適切な
発現宿主の中で、コードされたアミノ酸配列の表現を行
わせる。このようにして発現させた血管内皮細胞増殖因
子は、回収され、そして脈管形成および/あるいは再内
皮新生が重要な役割を果たす、様々な創傷治癒への適用
に有用な薬学的組成物中に調合され得る。
増殖因子を商業的規模の量得るための方法および手段を
提供する。特に本発明は、哺乳類動物の血管内皮細胞増
殖因子のアミノ酸配列をコードするDNA配列を提供す
る。これらのDNA配列は、発現ベクターの調節エレメ
ントの制御下に挿入される。このエレメントは、適切な
発現宿主の中で、コードされたアミノ酸配列の表現を行
わせる。このようにして発現させた血管内皮細胞増殖因
子は、回収され、そして脈管形成および/あるいは再内
皮新生が重要な役割を果たす、様々な創傷治癒への適用
に有用な薬学的組成物中に調合され得る。
【0050】本明細書の血管内皮細胞増殖因子をコード
するDNA配列を提供する過程で、我々はこの因子に、
2つの異なった型のコーディング領域のmRNAが作られる
ことを発見した。これらの2つの型は、明らかに異なっ
たメッセージスプライシングから生じており、オープン
リーディングフレームの長さが異なっている。これは、
成熟タンパク質のコーディング領域の44個のコドンの挿
入の存在あるいは非存在による。予想される高い分子量
の方の因子は、ウシの場合164個のアミノ酸配列を含
み、そしてヒトの場合は165個のアミノ酸配列を含み、G
ospodarowiczら(前出)、およびFerraraおよびHenzel
(前出)によって単離された約23kDのサブユニットに相
当すると考えられる。挿入が欠如しているコーディング
領域から予想される新規な分子量の低い方の因子は、ウ
シの場合では120個のアミノ酸配列およびヒトの場合で
は121個のアミノ酸配列を含む。低分子量型は、アミノ
酸配列の長さが異なるだけでなく、高分子量の型には存
在しない、ウシタンパク質の114位のLys残基(ヒトタン
パク質では115位)の存在において異なっている。この
違いは、この位置に相当するコドン内で起こっているメ
ッセージスプライシングが異なるために起こる。便宜
上、これらの血管内皮細胞増殖因子の2つの型を、ウシ
因子ではそれぞれbVEGF164およびbVEGF
120(ヒト因子では、hVEGF165およびhVEGF
121)と呼ぶ。
するDNA配列を提供する過程で、我々はこの因子に、
2つの異なった型のコーディング領域のmRNAが作られる
ことを発見した。これらの2つの型は、明らかに異なっ
たメッセージスプライシングから生じており、オープン
リーディングフレームの長さが異なっている。これは、
成熟タンパク質のコーディング領域の44個のコドンの挿
入の存在あるいは非存在による。予想される高い分子量
の方の因子は、ウシの場合164個のアミノ酸配列を含
み、そしてヒトの場合は165個のアミノ酸配列を含み、G
ospodarowiczら(前出)、およびFerraraおよびHenzel
(前出)によって単離された約23kDのサブユニットに相
当すると考えられる。挿入が欠如しているコーディング
領域から予想される新規な分子量の低い方の因子は、ウ
シの場合では120個のアミノ酸配列およびヒトの場合で
は121個のアミノ酸配列を含む。低分子量型は、アミノ
酸配列の長さが異なるだけでなく、高分子量の型には存
在しない、ウシタンパク質の114位のLys残基(ヒトタン
パク質では115位)の存在において異なっている。この
違いは、この位置に相当するコドン内で起こっているメ
ッセージスプライシングが異なるために起こる。便宜
上、これらの血管内皮細胞増殖因子の2つの型を、ウシ
因子ではそれぞれbVEGF164およびbVEGF
120(ヒト因子では、hVEGF165およびhVEGF
121)と呼ぶ。
【0051】121個のアミノ酸型のhVEGFおよびこ
れに対応する120個のアミノ酸のウシタンパク質は、こ
のタンパク質の臨床上の使用に治療的な利点を提供する
という点で、hVEGF165およびbVEGF164の性質
とは異なっている。特にhVEGF121およびbVEG
F120はヘパリンに結合しないが、長い型の方は、強い
ヘパリン結合能によって特徴付けられる。ヘパリン結合
親和性がないことで、そのタンパク質がより血管内皮細
胞増殖因子のレセプターに結合しやすくなり、半減期お
よび循環系の中でのタンパク質の分布が増大される。
れに対応する120個のアミノ酸のウシタンパク質は、こ
のタンパク質の臨床上の使用に治療的な利点を提供する
という点で、hVEGF165およびbVEGF164の性質
とは異なっている。特にhVEGF121およびbVEG
F120はヘパリンに結合しないが、長い型の方は、強い
ヘパリン結合能によって特徴付けられる。ヘパリン結合
親和性がないことで、そのタンパク質がより血管内皮細
胞増殖因子のレセプターに結合しやすくなり、半減期お
よび循環系の中でのタンパク質の分布が増大される。
【0052】驚くべきことに、N末端配列分析から推定
されるアミノ酸配列および単離されたDNA配列(図3
aに示してある)は、ウシ血管内皮細胞増殖因子、およ
びヒト血小板由来増殖因子(PDGF)のサブユニットのA
鎖およびB鎖それぞれの、これに対応する配列との間に
有意なレベルの配列相同性があることを示す。このうち
8個のシステイン残基が、これら3つのすべての配列の
成熟型で完全に保存されている。従って、第一のポリペ
プチド鎖および第二のポリペプチド鎖を含むハイブリッ
ドのダイマータンパク質が調製され得る。ここで鎖のう
ちの1つは、血小板由来増殖因子のA鎖サブユニットあ
るいはB鎖サブユニットのアミノ酸配列の少なくとも一
部を含み、そしてもう一方の鎖は、血管内皮細胞増殖因
子のアミノ酸配列の少なくとも一部を含む。このような
ハイブリッドタンパク質の調製によって、このハイブリ
ッドが、血管内皮細胞増殖因子および血小板由来増殖因
子の細胞***促進活性の間のプロフィールを持つよう
に、分子の性質を「仕立てる」ことができるようにな
る。PDGF B-Bホモダイマーは、血管平滑筋細胞に対して
***促進性があり、血管内皮細胞に対してはない。逆
に、本発明の血管内皮細胞増殖因子は、逆の特異性を有
している。ハイブリッド因子は、両方のタイプの細胞を
刺激し得、従って、創傷治癒における、より広範囲の細
胞***促進剤として有用である。
されるアミノ酸配列および単離されたDNA配列(図3
aに示してある)は、ウシ血管内皮細胞増殖因子、およ
びヒト血小板由来増殖因子(PDGF)のサブユニットのA
鎖およびB鎖それぞれの、これに対応する配列との間に
有意なレベルの配列相同性があることを示す。このうち
8個のシステイン残基が、これら3つのすべての配列の
成熟型で完全に保存されている。従って、第一のポリペ
プチド鎖および第二のポリペプチド鎖を含むハイブリッ
ドのダイマータンパク質が調製され得る。ここで鎖のう
ちの1つは、血小板由来増殖因子のA鎖サブユニットあ
るいはB鎖サブユニットのアミノ酸配列の少なくとも一
部を含み、そしてもう一方の鎖は、血管内皮細胞増殖因
子のアミノ酸配列の少なくとも一部を含む。このような
ハイブリッドタンパク質の調製によって、このハイブリ
ッドが、血管内皮細胞増殖因子および血小板由来増殖因
子の細胞***促進活性の間のプロフィールを持つよう
に、分子の性質を「仕立てる」ことができるようにな
る。PDGF B-Bホモダイマーは、血管平滑筋細胞に対して
***促進性があり、血管内皮細胞に対してはない。逆
に、本発明の血管内皮細胞増殖因子は、逆の特異性を有
している。ハイブリッド因子は、両方のタイプの細胞を
刺激し得、従って、創傷治癒における、より広範囲の細
胞***促進剤として有用である。
【0053】
【発明の実施の形態】本明細書の用語「血管内皮細胞増
殖因子」は、血管内皮細胞に対する***促進活性を有
し、そして以下の(a)、および(b)である、哺乳類
動物のタンパク質を言う: (a)標準的なハイブリダイゼーションの条件下で、図
3aに示したDNA配列にハイブリダイズし得るDNA
配列にコードされるアミノ酸配列を有するか、あるいは
(b)図6および図7に示された、bVEGF120、b
VEGF164、hVEGF121あるいはhVEGF165の
アミノ酸配列に実質的に相同である。
殖因子」は、血管内皮細胞に対する***促進活性を有
し、そして以下の(a)、および(b)である、哺乳類
動物のタンパク質を言う: (a)標準的なハイブリダイゼーションの条件下で、図
3aに示したDNA配列にハイブリダイズし得るDNA
配列にコードされるアミノ酸配列を有するか、あるいは
(b)図6および図7に示された、bVEGF120、b
VEGF164、hVEGF121あるいはhVEGF165の
アミノ酸配列に実質的に相同である。
【0054】本明細書では、関連のタンパク質と比較し
て、アミノ酸配列の相同性のレベルが少なくとも50%で
あり、そして好ましくは少なくとも80%であるとき、
「実質的に相同である」と考えられる。本明細書の用語
「標準的なハイブリダイゼーション条件」とは、プレハ
イブリダイゼーション/ハイブリダイゼーションバッフ
ァーとして40%のホルムアミドバッファーを用い(以下
に記載)、そして50℃で1×SSC、0.1%SDS中で洗浄す
ることを言う。
て、アミノ酸配列の相同性のレベルが少なくとも50%で
あり、そして好ましくは少なくとも80%であるとき、
「実質的に相同である」と考えられる。本明細書の用語
「標準的なハイブリダイゼーション条件」とは、プレハ
イブリダイゼーション/ハイブリダイゼーションバッフ
ァーとして40%のホルムアミドバッファーを用い(以下
に記載)、そして50℃で1×SSC、0.1%SDS中で洗浄す
ることを言う。
【0055】本明細書で用いられている、血管内皮細胞
増殖因子のアミノ酸配列の番号付けシステムは、タンパ
ク質の成熟型、すなわち翻訳後のプロセシングがなされ
た型に基づいている。従って、ウシあるいはヒトタンパ
ク質中で1番とされる残基は、アラニンであり、これら
のタンパク質の単離された成熟型の第一番目の残基であ
る。
増殖因子のアミノ酸配列の番号付けシステムは、タンパ
ク質の成熟型、すなわち翻訳後のプロセシングがなされ
た型に基づいている。従って、ウシあるいはヒトタンパ
ク質中で1番とされる残基は、アラニンであり、これら
のタンパク質の単離された成熟型の第一番目の残基であ
る。
【0056】血管内皮細胞に対する細胞***促進活性
は、標的細胞として、副腎皮質由来の毛細血管内皮細胞
(ACE細胞)を用いるアッセイによって測定され得る。
このアッセイは、実質的には、本明細書で参考として援
用されている、GospodarowiczらのJ. Cell Physiol.(19
86) 127:121-136)に記載されているように行われる。一
般的には、ACE細胞のストックの培養物を10%仔牛血清
を補充したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM-21)の
存在下で維持する。抗生物質のペニシリン(50IU/m
l)、ストレプトマイシン(50μg/ml)、ゲンタマイシ
ン(50μg/ml)、およびファンジゾーン(0.25μg/m
l)および2mMのL-グルタミンもまた培地に添加し得
る。細胞を組織細胞ディッシュに分配比1:40および
1:200との間(好ましい分配比では、T75フラスコの15
mlの培地中に2.5×105の細胞が存在する)で毎週継代し
ていく。細胞***促進アッセイのために、Gospodarowic
zら、Europ. J. Cell. Biol. (1988) 46:144-151に記載
のように、12ウェルクラスタープレートに、1ウェルあ
たり10%仔牛血清および抗生物質を補充した1mlのダル
ベッコ変法イーグル培地中の5×103個の細胞密度の細
胞を蒔く。あるいは、GospodarowiczらJ. Cell. Physio
l.(1986) 127:121-136に記載のように、ACE細胞を、35m
mディッシュあるいは6ウェルクラスタープレートに、
1つのディッシュ当りあるいはウェル当り、2mlの培地
中の5〜10×103個の密度の細胞をプレートする。次に
それぞれのサンプルの適当な希釈物の10μlずつを、0
日目および2日目に2つあるいは3つのウェルに分注す
る。培養の4あるいは5日後にプレートをトリプシン処
理し、そしてコールターカウンターで細胞密度を測定す
る。本明細書で記載する目的では、このアッセイの最後
において、因子を添加しなかったコントロールウェルの
細胞密度の少なくとも1.5倍、および好ましくは少なく
とも3倍の細胞密度になる場合に、因子は血管内皮細胞
に対する***促進活性を有すると考えられる。
は、標的細胞として、副腎皮質由来の毛細血管内皮細胞
(ACE細胞)を用いるアッセイによって測定され得る。
このアッセイは、実質的には、本明細書で参考として援
用されている、GospodarowiczらのJ. Cell Physiol.(19
86) 127:121-136)に記載されているように行われる。一
般的には、ACE細胞のストックの培養物を10%仔牛血清
を補充したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM-21)の
存在下で維持する。抗生物質のペニシリン(50IU/m
l)、ストレプトマイシン(50μg/ml)、ゲンタマイシ
ン(50μg/ml)、およびファンジゾーン(0.25μg/m
l)および2mMのL-グルタミンもまた培地に添加し得
る。細胞を組織細胞ディッシュに分配比1:40および
1:200との間(好ましい分配比では、T75フラスコの15
mlの培地中に2.5×105の細胞が存在する)で毎週継代し
ていく。細胞***促進アッセイのために、Gospodarowic
zら、Europ. J. Cell. Biol. (1988) 46:144-151に記載
のように、12ウェルクラスタープレートに、1ウェルあ
たり10%仔牛血清および抗生物質を補充した1mlのダル
ベッコ変法イーグル培地中の5×103個の細胞密度の細
胞を蒔く。あるいは、GospodarowiczらJ. Cell. Physio
l.(1986) 127:121-136に記載のように、ACE細胞を、35m
mディッシュあるいは6ウェルクラスタープレートに、
1つのディッシュ当りあるいはウェル当り、2mlの培地
中の5〜10×103個の密度の細胞をプレートする。次に
それぞれのサンプルの適当な希釈物の10μlずつを、0
日目および2日目に2つあるいは3つのウェルに分注す
る。培養の4あるいは5日後にプレートをトリプシン処
理し、そしてコールターカウンターで細胞密度を測定す
る。本明細書で記載する目的では、このアッセイの最後
において、因子を添加しなかったコントロールウェルの
細胞密度の少なくとも1.5倍、および好ましくは少なく
とも3倍の細胞密度になる場合に、因子は血管内皮細胞
に対する***促進活性を有すると考えられる。
【0057】図3aに記載のDNA配列は、ウシ細胞c
DNAライブラリーから得られ、従って、ウシタンパク
質をコードする配列を表すが、提供されているDNA配
列は、他の哺乳類の種から得られる相同物タンパク質を
コードする配列の回収も可能となる。従って、我々は示
されているウシの配列をプローブとして、対応するヒト
タンパク質をコードするDNA配列を回収するのに用い
た。
DNAライブラリーから得られ、従って、ウシタンパク
質をコードする配列を表すが、提供されているDNA配
列は、他の哺乳類の種から得られる相同物タンパク質を
コードする配列の回収も可能となる。従って、我々は示
されているウシの配列をプローブとして、対応するヒト
タンパク質をコードするDNA配列を回収するのに用い
た。
【0058】さらに本明細書の「血管内皮細胞増殖因
子」の範囲には、それらの生物学的に活性なフラグメン
ト、およびそれらのN末端あるいはC末端を延長した
形、または1つ以上のアミノ酸残基を置換および/ある
いは欠失あるいは挿入した、質的に本明細書に記載のタ
ンパク質の活性を保持しているアナログも含む。好まし
いアナログには、生物学的な活性に必要ではない1つ以
上のシステイン残基を異なるアミノ酸残基、好ましくは
セリンで置き換えたものが含まれる。1つ以上のシステ
イン残基を置換することによって、分子内および分子間
のジスルフィド結合形成の機会が減少し、それによって
分子がより安定になる。hVEGF121、bVEG
F120、hVEGF165およびbVEGF164中には、9
個のシステイン残基が存在する。このうち8個はPDGFに
も保存されている。従って最も好ましいアナログは、9
番目のシステイン残基がセリンで置換されているもので
ある。このシステイン残基は、hVEGF165の160位お
よびhVEGF121の116位およびウシ型の対応する位置
に存在する。アミノ酸置換は、公知の技術を用いて、本
明細書に記載のDNA配列の部位特異的変異導入によっ
て行われ得る(例えば、Zoller, M.J. およびSmith,
M., Nucleic Acids Research (1982)10:6487-6500)。
子」の範囲には、それらの生物学的に活性なフラグメン
ト、およびそれらのN末端あるいはC末端を延長した
形、または1つ以上のアミノ酸残基を置換および/ある
いは欠失あるいは挿入した、質的に本明細書に記載のタ
ンパク質の活性を保持しているアナログも含む。好まし
いアナログには、生物学的な活性に必要ではない1つ以
上のシステイン残基を異なるアミノ酸残基、好ましくは
セリンで置き換えたものが含まれる。1つ以上のシステ
イン残基を置換することによって、分子内および分子間
のジスルフィド結合形成の機会が減少し、それによって
分子がより安定になる。hVEGF121、bVEG
F120、hVEGF165およびbVEGF164中には、9
個のシステイン残基が存在する。このうち8個はPDGFに
も保存されている。従って最も好ましいアナログは、9
番目のシステイン残基がセリンで置換されているもので
ある。このシステイン残基は、hVEGF165の160位お
よびhVEGF121の116位およびウシ型の対応する位置
に存在する。アミノ酸置換は、公知の技術を用いて、本
明細書に記載のDNA配列の部位特異的変異導入によっ
て行われ得る(例えば、Zoller, M.J. およびSmith,
M., Nucleic Acids Research (1982)10:6487-6500)。
【0059】本明細書のウシ血管内皮細胞増殖因子の天
然の型は、明らかに糖が付加されているが、現在のとこ
ろ生物学的活性に糖付加が必須であるという証拠はな
い。従って、本明細書に提供されている発現配列を使用
して原核細胞宿主あるいは真核細胞宿主によって産生さ
れる、生物学的に活性な糖が付加されていない型あるい
は部分的に糖が付加されている型は、「血管内皮細胞増
殖因子」の範囲に含まれる。
然の型は、明らかに糖が付加されているが、現在のとこ
ろ生物学的活性に糖付加が必須であるという証拠はな
い。従って、本明細書に提供されている発現配列を使用
して原核細胞宿主あるいは真核細胞宿主によって産生さ
れる、生物学的に活性な糖が付加されていない型あるい
は部分的に糖が付加されている型は、「血管内皮細胞増
殖因子」の範囲に含まれる。
【0060】血管内皮細胞増殖因子をコードするDNA
配列を、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物中で本
明細書の条件下で発現させると、発現するVEGFの約
50%がN結合糖付加により修飾されている。hVEGF
121の75位のAsn残基に1つのN結合糖付加部位がある
(hVEGF165の75位およびbVEGF120およびbV
EGF164の74位に相当する)。さらに、hVEGF121
の発現および細胞培養培地への分泌の後、我々はダイマ
ーのタンパク質の種を単離した。この種は、両方のサブ
ユニットが糖付加されているかあるいは糖付加されてい
ない、および一方のサブユニットが糖付加されておりも
う一方のサブユニットが糖付加されていない、血管内皮
細胞増殖因子のダイマーの分子量に相当する。
配列を、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物中で本
明細書の条件下で発現させると、発現するVEGFの約
50%がN結合糖付加により修飾されている。hVEGF
121の75位のAsn残基に1つのN結合糖付加部位がある
(hVEGF165の75位およびbVEGF120およびbV
EGF164の74位に相当する)。さらに、hVEGF121
の発現および細胞培養培地への分泌の後、我々はダイマ
ーのタンパク質の種を単離した。この種は、両方のサブ
ユニットが糖付加されているかあるいは糖付加されてい
ない、および一方のサブユニットが糖付加されておりも
う一方のサブユニットが糖付加されていない、血管内皮
細胞増殖因子のダイマーの分子量に相当する。
【0061】血管内皮細胞増殖因子(Gospodarowiczら
(前出)、およびFerraraおよびHenzel(前出)によっ
て単離された)は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動で測定すると、約45〜46kDのダイマーのタンパク質で
ある。ウシ血管内皮細胞増殖因子は、濾胞星状細胞の細
胞培養馴化培地から均一な型で得られた。このプロセス
には、硫酸アンモニウム沈澱;ヘパリン-セファロース
アフィニティークロマトグラフィー;サイズ排除ゲルク
ロマトグラフィー;カチオン交換クロマトグラフィー;
および逆相高速液体クロマトグラフィー、の工程が含ま
れる。血管内皮細胞増殖因子を産生することが知られて
いる、例えばマウスAtT20細胞の様な他の哺乳類動物種
由来の培養細胞の馴化培地から、対応するタンパク質を
精製する場合にも、同様の手順が用いられる。我々はま
た、ノーザンブロット分析によって、ヒト胎児血管平滑
筋細胞がヒト血管内皮細胞増殖因子およびこの因子をコ
ードするmRNAのよい供給源になるということも決定し
た。
(前出)、およびFerraraおよびHenzel(前出)によっ
て単離された)は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動で測定すると、約45〜46kDのダイマーのタンパク質で
ある。ウシ血管内皮細胞増殖因子は、濾胞星状細胞の細
胞培養馴化培地から均一な型で得られた。このプロセス
には、硫酸アンモニウム沈澱;ヘパリン-セファロース
アフィニティークロマトグラフィー;サイズ排除ゲルク
ロマトグラフィー;カチオン交換クロマトグラフィー;
および逆相高速液体クロマトグラフィー、の工程が含ま
れる。血管内皮細胞増殖因子を産生することが知られて
いる、例えばマウスAtT20細胞の様な他の哺乳類動物種
由来の培養細胞の馴化培地から、対応するタンパク質を
精製する場合にも、同様の手順が用いられる。我々はま
た、ノーザンブロット分析によって、ヒト胎児血管平滑
筋細胞がヒト血管内皮細胞増殖因子およびこの因子をコ
ードするmRNAのよい供給源になるということも決定し
た。
【0062】上述のようにして得られた、単離したウシ
血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸配列を、自動気相プロ
テインシークエンサーでエドマン分解法によって決定し
た。単一の主要な24アミノ酸のN末端配列が得られ、タ
ンパク質がホモダイマーであることが判った。タンパク
質のトリプシン消化および様々なペプチドフラグメント
のアミノ酸配列決定の後、オーバーラップしたアミノ酸
配列からウシタンパク質が以下のN末端の41アミノ酸配
列*を有することが判った: APMAEGGQKPHEVVKFMDVYQRSFC
RPIETLVDIFQEYPDE (*アミノ酸を表す標準的な1文字略号を用いる)。
血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸配列を、自動気相プロ
テインシークエンサーでエドマン分解法によって決定し
た。単一の主要な24アミノ酸のN末端配列が得られ、タ
ンパク質がホモダイマーであることが判った。タンパク
質のトリプシン消化および様々なペプチドフラグメント
のアミノ酸配列決定の後、オーバーラップしたアミノ酸
配列からウシタンパク質が以下のN末端の41アミノ酸配
列*を有することが判った: APMAEGGQKPHEVVKFMDVYQRSFC
RPIETLVDIFQEYPDE (*アミノ酸を表す標準的な1文字略号を用いる)。
【0063】上記のウシ血管内皮細胞増殖因子のN末端
のアミノ酸配列を用いて、このタンパク質の全長あるい
は部分的なcDNAを回収しようとする多くの不成功に
終わった試みがなされた。それはこのアミノ酸配列の部
分をコードする縮重させたオリゴヌクレオチドプローブ
の混合物を用いて、濾胞星状細胞のcDNAライブラリ
ーをプローブすることによってなされた。図3aのDN
Aセグメントは、ポリメラーゼチェーンリアクションの
改変法によって、アミノ酸の15位から38位(およびアミ
ノ酸39位のコドンの3分の2)をコードするヌクレオチ
ド配列を増殖させて作ったプローブを用いて、cDNA
ライブラリーから最終的に回収されたものである。所望
のDNA配列を増幅させるためのポリメラーゼチェーン
リアクション法は、米国特許第4,683,202号および第4,6
83,195号の中に詳細が記載されている。これらは参考と
して本明細書に適用されている。この方法によって、多
くの配列が知られていない場合でも、増幅したい配列の
どちらかの端にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
プライマーさえあれば、所望のヌクレオチド配列の増幅
が可能となる。ポリメラーゼチェーンリアクションのプ
ロセスには、cDNAの所望のセグメントを増幅するた
めに、プライマーとして縮重オリゴヌクレオチドが用い
られる(Leeら、Science(1988) 1288-1291)。
のアミノ酸配列を用いて、このタンパク質の全長あるい
は部分的なcDNAを回収しようとする多くの不成功に
終わった試みがなされた。それはこのアミノ酸配列の部
分をコードする縮重させたオリゴヌクレオチドプローブ
の混合物を用いて、濾胞星状細胞のcDNAライブラリ
ーをプローブすることによってなされた。図3aのDN
Aセグメントは、ポリメラーゼチェーンリアクションの
改変法によって、アミノ酸の15位から38位(およびアミ
ノ酸39位のコドンの3分の2)をコードするヌクレオチ
ド配列を増殖させて作ったプローブを用いて、cDNA
ライブラリーから最終的に回収されたものである。所望
のDNA配列を増幅させるためのポリメラーゼチェーン
リアクション法は、米国特許第4,683,202号および第4,6
83,195号の中に詳細が記載されている。これらは参考と
して本明細書に適用されている。この方法によって、多
くの配列が知られていない場合でも、増幅したい配列の
どちらかの端にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
プライマーさえあれば、所望のヌクレオチド配列の増幅
が可能となる。ポリメラーゼチェーンリアクションのプ
ロセスには、cDNAの所望のセグメントを増幅するた
めに、プライマーとして縮重オリゴヌクレオチドが用い
られる(Leeら、Science(1988) 1288-1291)。
【0064】図3aのcDNAを回収するのに用いたD
NAプローブは、図1に示す5つの類似の配列から選択
された。これらの配列は、図2に示す概略および以下に
実施例中で詳細に記載しているような手順で得られた。
示されている手順によれば、ウシ濾胞星状細胞由来のポ
リ(A)+RNAを、血管内皮細胞増殖因子の35位から39位
のアミノ酸配列に基づいて作製した16倍縮重の合成オリ
ゴヌクレオチド混合物からなるアンチセンスプライマー
とハイブリダイズさせる。24塩基のオリゴヌクレオチド
プライマーは、5’末端に10塩基のEcoRIリンカーを有
しており、14塩基がアミノ酸配列を反映していた。ポリ
(A)+RNAにハイブリダイズする混合物中のオリゴヌク
レオチドプライマー配列は、デオキシヌクレオチド三リ
ン酸(dNTPs))および逆転写酵素の存在下で、所望のm
RNAの部分に相補的なDNA鎖の合成を始めるのに用い
られた。次に第一の合成された鎖に相補的な第二のDN
A鎖を以下のようにして調製した。すなわちウシ血管内
皮細胞増殖因子の15位から19位のアミノ酸配列に基づい
て作製した、8倍縮重合成24塩基オリゴヌクレオチド混
合物からなるセンス鎖プライマーに第一の合成鎖をハイ
ブリダイズさせて作った。この第二の鎖のオリゴヌクレ
オチドプライマーは、5’末端に10塩基のHindIIIリン
カーを連結させており、アミノ酸配列を反映する14塩基
領域を含んでいた。第一の合成DNA鎖にハイブリダイ
ズする、混合物中のオリゴヌクレオチドプライマー配列
は、dNTPおよびDNAポリメラーゼI、すなわちクレノ
ウフラグメントの存在中で、第二のDNA鎖の合成を始
めるのに用いられた。プライマー中の10塩基リンカー配
列は、第一のDNA鎖にハイブリダイズし得ないため、
第二鎖の合成は、残りの14ヌクレオチドが第一のDNA
鎖にハイブリダイズしたまま残り得る28℃で行われた。
DNAポリメラーゼ、すなわちクレノウフラグメント
は、第二の合成に用いられる。なぜならば、通常ポリメ
ラーゼチェーンリアクションに用いられるThermus aqua
ticus(Taq) DNAポリメラーゼが、この温度でDNA
合成を触媒することができないからである。第二の鎖合
成によって、ウシ血管内皮細胞増殖因子の15位から38位
のアミノ酸の部分(および39位のアミノ酸のコドンの三
分の二)をコードするセンス鎖ができる。
NAプローブは、図1に示す5つの類似の配列から選択
された。これらの配列は、図2に示す概略および以下に
実施例中で詳細に記載しているような手順で得られた。
示されている手順によれば、ウシ濾胞星状細胞由来のポ
リ(A)+RNAを、血管内皮細胞増殖因子の35位から39位
のアミノ酸配列に基づいて作製した16倍縮重の合成オリ
ゴヌクレオチド混合物からなるアンチセンスプライマー
とハイブリダイズさせる。24塩基のオリゴヌクレオチド
プライマーは、5’末端に10塩基のEcoRIリンカーを有
しており、14塩基がアミノ酸配列を反映していた。ポリ
(A)+RNAにハイブリダイズする混合物中のオリゴヌク
レオチドプライマー配列は、デオキシヌクレオチド三リ
ン酸(dNTPs))および逆転写酵素の存在下で、所望のm
RNAの部分に相補的なDNA鎖の合成を始めるのに用い
られた。次に第一の合成された鎖に相補的な第二のDN
A鎖を以下のようにして調製した。すなわちウシ血管内
皮細胞増殖因子の15位から19位のアミノ酸配列に基づい
て作製した、8倍縮重合成24塩基オリゴヌクレオチド混
合物からなるセンス鎖プライマーに第一の合成鎖をハイ
ブリダイズさせて作った。この第二の鎖のオリゴヌクレ
オチドプライマーは、5’末端に10塩基のHindIIIリン
カーを連結させており、アミノ酸配列を反映する14塩基
領域を含んでいた。第一の合成DNA鎖にハイブリダイ
ズする、混合物中のオリゴヌクレオチドプライマー配列
は、dNTPおよびDNAポリメラーゼI、すなわちクレノ
ウフラグメントの存在中で、第二のDNA鎖の合成を始
めるのに用いられた。プライマー中の10塩基リンカー配
列は、第一のDNA鎖にハイブリダイズし得ないため、
第二鎖の合成は、残りの14ヌクレオチドが第一のDNA
鎖にハイブリダイズしたまま残り得る28℃で行われた。
DNAポリメラーゼ、すなわちクレノウフラグメント
は、第二の合成に用いられる。なぜならば、通常ポリメ
ラーゼチェーンリアクションに用いられるThermus aqua
ticus(Taq) DNAポリメラーゼが、この温度でDNA
合成を触媒することができないからである。第二の鎖合
成によって、ウシ血管内皮細胞増殖因子の15位から38位
のアミノ酸の部分(および39位のアミノ酸のコドンの三
分の二)をコードするセンス鎖ができる。
【0065】次に2つの合成DNA鎖を分離し、そして
反応の連続的な繰り返しによって所望の配列を増幅させ
た。この反応では、センスおよびアンチセンスの両方の
オリゴヌクレオチドプライマー混合物およびThermus aq
uaticus(Taq) DNAポリメラーゼの存在中で、一本鎖DN
Aを相補鎖の合成のための鋳型として用いた。相補鎖の
それぞれの合成の後、反応混合物を加熱して鎖を分離
し、そしてこの反応を操り返した。
反応の連続的な繰り返しによって所望の配列を増幅させ
た。この反応では、センスおよびアンチセンスの両方の
オリゴヌクレオチドプライマー混合物およびThermus aq
uaticus(Taq) DNAポリメラーゼの存在中で、一本鎖DN
Aを相補鎖の合成のための鋳型として用いた。相補鎖の
それぞれの合成の後、反応混合物を加熱して鎖を分離
し、そしてこの反応を操り返した。
【0066】増幅の30サイクルの後、ポリメラーゼチェ
ーンリアクション混合物から得たDNAを、6%ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけた。このゲル中のDN
Aを臭化エチジウムで染色し、15位から38位までのアミ
ノ酸に対するコード配列(およびアミノ酸39位のコドン
の三分の二)およびプライミングオリゴヌクレオチドの
HindIIIおよびEcoRIリンカーを含む大きさに相当するバ
ンドをゲルから切り出した。臭化エチジウム染色したゲ
ルを図5の写真に示す。ここで増幅された所望の配列を
表す主要なバンドは、視覚的にはっきりと見分け得る。
主要なバンドを含む切り出したゲル片から、DNAを電
気的に溶出し、HindIIIおよびEcoRIで消化し、HindIII-
およびEcoRI-カットしたM13mp19およびM13mp18ファージ
ベクター中にライゲーションして入れた。E. coli JM10
3宿主細胞にこのライゲーション混合物を入れて形質転
換した後単離した無色のプラークのDNA配列分析によ
って、血管内皮細胞増殖因子の15位から38位のアミノ酸
(および39位のアミノ酸のコドンの三分の二を含む)を
コードするcDNAが実際に得られたことが判った。こ
れらの組換えファージ(pET-19A)の1つに含まれてい
る増幅させたDNA配列を、ウシ濾胞星状細胞cDNA
ライブラリーからクローン化したcDNA配列を回収す
るためのプローブとして用いた。単離したクローン化配
列は、ウシ血管内皮細胞増殖因子の成熟型のうちの1つ
のN末端アミノ酸の14個以外の全てをコードする797塩
基対挿入部からなっていた。単離されたクローン化挿入
物を、pUC8のEcoRI部位にライゲーションしていれ、pST
800と名付けられたプラスミドを作製した。この挿入物
は、図3a(図3aでは、挿入物のそれぞれの端にある
EcoRIリンカーは示されていない;従って、配列には挿
入物の7位のヌクレオチドから番号をつけてある)に示
されるようなヌクレオチド配列を含んでいた。bVEG
F120の第15位から120位のアミノ酸のコード領域は、図
3aの第9位から326位のヌクレオチドで表されてい
る。
ーンリアクション混合物から得たDNAを、6%ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけた。このゲル中のDN
Aを臭化エチジウムで染色し、15位から38位までのアミ
ノ酸に対するコード配列(およびアミノ酸39位のコドン
の三分の二)およびプライミングオリゴヌクレオチドの
HindIIIおよびEcoRIリンカーを含む大きさに相当するバ
ンドをゲルから切り出した。臭化エチジウム染色したゲ
ルを図5の写真に示す。ここで増幅された所望の配列を
表す主要なバンドは、視覚的にはっきりと見分け得る。
主要なバンドを含む切り出したゲル片から、DNAを電
気的に溶出し、HindIIIおよびEcoRIで消化し、HindIII-
およびEcoRI-カットしたM13mp19およびM13mp18ファージ
ベクター中にライゲーションして入れた。E. coli JM10
3宿主細胞にこのライゲーション混合物を入れて形質転
換した後単離した無色のプラークのDNA配列分析によ
って、血管内皮細胞増殖因子の15位から38位のアミノ酸
(および39位のアミノ酸のコドンの三分の二を含む)を
コードするcDNAが実際に得られたことが判った。こ
れらの組換えファージ(pET-19A)の1つに含まれてい
る増幅させたDNA配列を、ウシ濾胞星状細胞cDNA
ライブラリーからクローン化したcDNA配列を回収す
るためのプローブとして用いた。単離したクローン化配
列は、ウシ血管内皮細胞増殖因子の成熟型のうちの1つ
のN末端アミノ酸の14個以外の全てをコードする797塩
基対挿入部からなっていた。単離されたクローン化挿入
物を、pUC8のEcoRI部位にライゲーションしていれ、pST
800と名付けられたプラスミドを作製した。この挿入物
は、図3a(図3aでは、挿入物のそれぞれの端にある
EcoRIリンカーは示されていない;従って、配列には挿
入物の7位のヌクレオチドから番号をつけてある)に示
されるようなヌクレオチド配列を含んでいた。bVEG
F120の第15位から120位のアミノ酸のコード領域は、図
3aの第9位から326位のヌクレオチドで表されてい
る。
【0067】図3aに示す、単離したDNA配列から推
定されるアミノ酸配列は、74位のアミノ酸であるアスパ
ラギン残基の位置(ヒト型の75位のアミノ酸に対応す
る)に1つのN結合糖付加の可能性のある部位を含む。
この部位での約3kDのN結合糖付加によって、コードさ
れるタンパク質は、約17kDの全分子量であることが予想
される。これはGospodarowiczら、そしてFerraraおよび
Henzelによって単離された血管内皮細胞増殖因子サブユ
ニットで見られた約23kDの見かけの分子量よりかなり小
さい。このため、単離されたcDNAが、以前に観察さ
れたものとは異なる型の血管内皮細胞増殖因子をコード
することは明らかである。ポリメラーゼチェーンリアク
ション実験によって、血管内皮細胞増殖因子コード領域
の別の型が存在することが判った。
定されるアミノ酸配列は、74位のアミノ酸であるアスパ
ラギン残基の位置(ヒト型の75位のアミノ酸に対応す
る)に1つのN結合糖付加の可能性のある部位を含む。
この部位での約3kDのN結合糖付加によって、コードさ
れるタンパク質は、約17kDの全分子量であることが予想
される。これはGospodarowiczら、そしてFerraraおよび
Henzelによって単離された血管内皮細胞増殖因子サブユ
ニットで見られた約23kDの見かけの分子量よりかなり小
さい。このため、単離されたcDNAが、以前に観察さ
れたものとは異なる型の血管内皮細胞増殖因子をコード
することは明らかである。ポリメラーゼチェーンリアク
ション実験によって、血管内皮細胞増殖因子コード領域
の別の型が存在することが判った。
【0068】ポリメラーゼチェーンリアクションは、図
6の70位から126位の塩基に相当するセンスオリゴヌク
レオチドおよび513位から572位の塩基に相当するアンチ
センスを用いて、濾胞星状ポリ(A)+RNAから始められ
た。できた産物をBstNI(それぞれのプライマーの中を
切断する)消化したのちにポリアクリルアミドゲル分析
したところ、約300bpおよび約450bpの2つの主要な種類
があることが判った。これらの産物の両方は、M13ベク
ター中にサブクローンされ、そして塩基配列の決定が行
われた。小さい方の産物(311bp)のDNA配列は、PCR
でpST800中のcDNAが増幅された場合に予想されるも
のに相当した。大きい方のフラグメントの配列は、132b
pの挿入物(図6の四角で囲んだ配列)以外は、311bpの
産物と同一であった。以下に示されるように得られた、
ヒト血管内皮細胞増殖因子のゲノムのクローンの分析に
よって、この挿入物がエクソンとイントロンのつなぎ目
にあることがわかった。これによって、2つのコード領
域の型は、別々のエクソンスプライシングによってでき
たことが示唆される。
6の70位から126位の塩基に相当するセンスオリゴヌク
レオチドおよび513位から572位の塩基に相当するアンチ
センスを用いて、濾胞星状ポリ(A)+RNAから始められ
た。できた産物をBstNI(それぞれのプライマーの中を
切断する)消化したのちにポリアクリルアミドゲル分析
したところ、約300bpおよび約450bpの2つの主要な種類
があることが判った。これらの産物の両方は、M13ベク
ター中にサブクローンされ、そして塩基配列の決定が行
われた。小さい方の産物(311bp)のDNA配列は、PCR
でpST800中のcDNAが増幅された場合に予想されるも
のに相当した。大きい方のフラグメントの配列は、132b
pの挿入物(図6の四角で囲んだ配列)以外は、311bpの
産物と同一であった。以下に示されるように得られた、
ヒト血管内皮細胞増殖因子のゲノムのクローンの分析に
よって、この挿入物がエクソンとイントロンのつなぎ目
にあることがわかった。これによって、2つのコード領
域の型は、別々のエクソンスプライシングによってでき
たことが示唆される。
【0069】図1あるいは図3aに示してあるDNA配
列は、全長のウシ血管内皮細胞増殖因子、あるいは対応
するヒトのタンパク質を含む、他の種の血管内皮細胞増
殖因子、あるいは血管内皮細胞増殖因子としての同じ遺
伝子ファミリー中の関連タンパク質、をコードするDN
Aを回収するのに有用である。
列は、全長のウシ血管内皮細胞増殖因子、あるいは対応
するヒトのタンパク質を含む、他の種の血管内皮細胞増
殖因子、あるいは血管内皮細胞増殖因子としての同じ遺
伝子ファミリー中の関連タンパク質、をコードするDN
Aを回収するのに有用である。
【0070】pST800の配列の上流の配列情報を有する、
ウシ血管内皮細胞増殖因子のcDNAクローン(図3
a)を得るために、Frohman, M.A.ら、PNAS(USA)(1988)
85, 8998-9002に記載の"RACE"ポリメラーゼチェーン反
応法の変法を用いた。リンカーを血管内皮細胞増殖因子
のmRNAのプライマー伸長で得た2本鎖の5’末端にライ
ゲートした。その後、この元来のプライマー伸長オリゴ
ヌクレオチドおよびリンカーに相補的なオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして用いてポリメラーゼチェーン反
応を行った。プライマーをHindIIIで消化し、M13ベクタ
ーにサブクローニング後、得られたポリメラーゼチェー
ン反応生成物の配列分折を行い、血管内皮細胞増殖因子
の成熟アミノ末端をコードする配列(図6)を得た。得
られた最も長いcDNAクローンは、成熟タンパク質の
コード領域(AGTGGTCCCAGGCTGCACCC...)の始まりから1
4bp、5’末端側に延長しており、血管内皮細胞増殖因
子の前駆体の4つの付加アミノ酸(WSQAAPMA...)を明
らかにした。
ウシ血管内皮細胞増殖因子のcDNAクローン(図3
a)を得るために、Frohman, M.A.ら、PNAS(USA)(1988)
85, 8998-9002に記載の"RACE"ポリメラーゼチェーン反
応法の変法を用いた。リンカーを血管内皮細胞増殖因子
のmRNAのプライマー伸長で得た2本鎖の5’末端にライ
ゲートした。その後、この元来のプライマー伸長オリゴ
ヌクレオチドおよびリンカーに相補的なオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして用いてポリメラーゼチェーン反
応を行った。プライマーをHindIIIで消化し、M13ベクタ
ーにサブクローニング後、得られたポリメラーゼチェー
ン反応生成物の配列分折を行い、血管内皮細胞増殖因子
の成熟アミノ末端をコードする配列(図6)を得た。得
られた最も長いcDNAクローンは、成熟タンパク質の
コード領域(AGTGGTCCCAGGCTGCACCC...)の始まりから1
4bp、5’末端側に延長しており、血管内皮細胞増殖因
子の前駆体の4つの付加アミノ酸(WSQAAPMA...)を明
らかにした。
【0071】ヒト型の血管内皮細胞増殖因子のDNA配
列を回収するために、図1、図3a、あるいは図6の配
列、好ましくは図3aあるいは図6の配列、あるいはそ
れらのセグメントを、cDNAライブラリーあるいはゲ
ノムライブラリーから所望の配列を回収するためのプロ
ーブとして用いた。ゲノムライブラリーは、公知の技術
によって調製され得るし、今では商業的に入手可能であ
る。ヒト血管内皮細胞増殖因子をコードするゲノムDN
A配列が単離され得る適切なゲノムDNAライブラリー
は、ヒト腺維芽細胞のゲノムライブラリーである(Stra
tagene Inc. LaJolla, CA)。W138細胞株から得たこの
ライブラリーは、λ FIX(登録商標)ベクター中に>15kb
のDNA挿入物を有する。あるいは、ゲノムライブラリ
ーは、Frischauf,A.M.の、Methods in Enzymology、Be
rger,S.L. およびKimmel,A.R.編,Vol. 152,pp.190-
199(1987) Academic Press,N.Y.に記載の方法によって
調製され得る。cDNAライブラリーを調製する方法
は、また当業者にはよく知られている(例えば、Kimme
l,A.R.およびBerger,S.L.,同誌、pp、307-316を参
照)。好ましくは、cDNAライブラリーは、活発に血
管内皮細胞増殖因子を生産している細胞株あるいは組織
から調製される。ヒトタンパク質をコードするcDNA
配列の単離のためには、胎児ヒト血管平滑筋細胞から調
製されたcDNAライブラリーを用いるのが好ましい。
前記のようにして得られた血管内皮細胞増殖因子をコー
ドするDNA配列は、所望の宿主中でDNA配列の発現
を指令し得る調節配列の制御下に、適切な発現ベクター
に挿入される。回収されるDNA配列がイントロンを含
むゲノム配列である場合には、次に、真核宿主に適した
発現ベクターにその配列を挿入することが望ましい。原
核宿主における血管内皮細胞増殖因子をコードするゲノ
ムDNAの発現は、イントロン配列を除くためのコード
されたRNAの正確なスプライシングを伴う。このことに
よって所望のタンパク質をコードするmRNAの鋳型を生産
する。あるいは、合成DNA配列が、ゲノム配列中のイ
ントロン配列を除去した後に得られるコード配列を提示
する合成オリゴヌクレオチドから構築され得る。血管内
皮細胞増殖因子をコードする、この合成配列あるいはc
DNA配列を含有する発現ベクターは、原核あるいは真
核宿主でタンパク質を発現するために使用され得る。例
示的な制御配列のDNAおよび宿主は下記の標準工程の
項に記載されている。
列を回収するために、図1、図3a、あるいは図6の配
列、好ましくは図3aあるいは図6の配列、あるいはそ
れらのセグメントを、cDNAライブラリーあるいはゲ
ノムライブラリーから所望の配列を回収するためのプロ
ーブとして用いた。ゲノムライブラリーは、公知の技術
によって調製され得るし、今では商業的に入手可能であ
る。ヒト血管内皮細胞増殖因子をコードするゲノムDN
A配列が単離され得る適切なゲノムDNAライブラリー
は、ヒト腺維芽細胞のゲノムライブラリーである(Stra
tagene Inc. LaJolla, CA)。W138細胞株から得たこの
ライブラリーは、λ FIX(登録商標)ベクター中に>15kb
のDNA挿入物を有する。あるいは、ゲノムライブラリ
ーは、Frischauf,A.M.の、Methods in Enzymology、Be
rger,S.L. およびKimmel,A.R.編,Vol. 152,pp.190-
199(1987) Academic Press,N.Y.に記載の方法によって
調製され得る。cDNAライブラリーを調製する方法
は、また当業者にはよく知られている(例えば、Kimme
l,A.R.およびBerger,S.L.,同誌、pp、307-316を参
照)。好ましくは、cDNAライブラリーは、活発に血
管内皮細胞増殖因子を生産している細胞株あるいは組織
から調製される。ヒトタンパク質をコードするcDNA
配列の単離のためには、胎児ヒト血管平滑筋細胞から調
製されたcDNAライブラリーを用いるのが好ましい。
前記のようにして得られた血管内皮細胞増殖因子をコー
ドするDNA配列は、所望の宿主中でDNA配列の発現
を指令し得る調節配列の制御下に、適切な発現ベクター
に挿入される。回収されるDNA配列がイントロンを含
むゲノム配列である場合には、次に、真核宿主に適した
発現ベクターにその配列を挿入することが望ましい。原
核宿主における血管内皮細胞増殖因子をコードするゲノ
ムDNAの発現は、イントロン配列を除くためのコード
されたRNAの正確なスプライシングを伴う。このことに
よって所望のタンパク質をコードするmRNAの鋳型を生産
する。あるいは、合成DNA配列が、ゲノム配列中のイ
ントロン配列を除去した後に得られるコード配列を提示
する合成オリゴヌクレオチドから構築され得る。血管内
皮細胞増殖因子をコードする、この合成配列あるいはc
DNA配列を含有する発現ベクターは、原核あるいは真
核宿主でタンパク質を発現するために使用され得る。例
示的な制御配列のDNAおよび宿主は下記の標準工程の
項に記載されている。
【0072】生物学的に活性な血管内皮細胞増殖因子
は、本発明の方法に従って、ホモダイマー分子として生
産される。これに関連して、用語「ホモダイマーの」
は、2個のサブユニットが同じアミノ酸の一次構造を有
するダイマーである。前に示したように、サブユニット
の1個あるいは両方が、N-結合のグリコシル化によっ
て修飾され得るか、あるいはサブユニットの両方とも修
飾され得ない。完全に活性なタンパク質は、ダイマーを
形成するジスルフィド結合を形成させる条件下で、本発
明のDNA配列によってコードされるポリペプチド配列
の発現および/または回収により産生される。
は、本発明の方法に従って、ホモダイマー分子として生
産される。これに関連して、用語「ホモダイマーの」
は、2個のサブユニットが同じアミノ酸の一次構造を有
するダイマーである。前に示したように、サブユニット
の1個あるいは両方が、N-結合のグリコシル化によっ
て修飾され得るか、あるいはサブユニットの両方とも修
飾され得ない。完全に活性なタンパク質は、ダイマーを
形成するジスルフィド結合を形成させる条件下で、本発
明のDNA配列によってコードされるポリペプチド配列
の発現および/または回収により産生される。
【0073】本発明は、さらに、アミノ酸の一次構造の
一部が、血小板由来の増殖因子のA鎖サブユニットある
いはB鎖サブユニットのいずれかの部分、あるいは血管
内皮細胞増殖因子の部分に対応するアミノ酸の一次構造
の部分に対応する、キメラのダイマータンパク質の生産
法を提供する。特に、第1のポリペプチド鎖および第2
のポリペプチド鎖を有するキメラ増殖因子が提供されて
いて、該鎖間はジスルフィド結合されており、第1のポ
リペプチド鎖は、少なくとも血小板由来の増殖因子のA
鎖サブユニットあるいはB鎖サブユニットのいずれかの
アミノ酸配列の一部分を有し、そして第2の鎖は、少な
くとも血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸配列の一部分を
有する。
一部が、血小板由来の増殖因子のA鎖サブユニットある
いはB鎖サブユニットのいずれかの部分、あるいは血管
内皮細胞増殖因子の部分に対応するアミノ酸の一次構造
の部分に対応する、キメラのダイマータンパク質の生産
法を提供する。特に、第1のポリペプチド鎖および第2
のポリペプチド鎖を有するキメラ増殖因子が提供されて
いて、該鎖間はジスルフィド結合されており、第1のポ
リペプチド鎖は、少なくとも血小板由来の増殖因子のA
鎖サブユニットあるいはB鎖サブユニットのいずれかの
アミノ酸配列の一部分を有し、そして第2の鎖は、少な
くとも血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸配列の一部分を
有する。
【0074】血小板由来の増殖因子は、約30kDのダイマ
ーであって、ホモダイマーおよびヘテロダイマー型で単
離されている。血小板由来の増殖因子のヘテロダイマー
は、A鎖およびB鎖と呼ばれる2つのポリペプチド鎖を
有している。成熟A鎖およびB鎖は、約40%のアミノ酸
配列の相同性を示し、8個のシステイン残基が完全に保
存されている。血小板由来の増殖因子は、インビボでA
-AあるいはB-Bホモダイマーのいずれか、あるいはA
-Bヘテロダイマーとして存在する。
ーであって、ホモダイマーおよびヘテロダイマー型で単
離されている。血小板由来の増殖因子のヘテロダイマー
は、A鎖およびB鎖と呼ばれる2つのポリペプチド鎖を
有している。成熟A鎖およびB鎖は、約40%のアミノ酸
配列の相同性を示し、8個のシステイン残基が完全に保
存されている。血小板由来の増殖因子は、インビボでA
-AあるいはB-Bホモダイマーのいずれか、あるいはA
-Bヘテロダイマーとして存在する。
【0075】血小板由来の増殖因子のA鎖およびB鎖サ
ブユニットをコードするDNA配列は、単離され配列分
析されている(A鎖cDNA(ヒト)は、Betsholtz,
C.ら、Nature(1986)320に記載されている;A鎖ゲノム
DNA(ヒト)は、Bonthron,D.T.ら、PNAS(1988)85:14
96に記載されている;B鎖cDNA(ヒト)は、Collin
s, T. ら、Nature(1985)316:748に記載されている;お
よびB鎖ゲノムDNA(ヒト)は、Chin,I. -M.ら、Ce
ll (1984) 37:123に記載されている)。図4は、ヒト血
小板由来の増殖因子の、5’末端にBamHIリンカー結合
のおよび3’末端にEcoRVリンカー結合の、それぞれの
A鎖およびB鎖サブユニットの単離されたcDNA配列
および推定される前駆体のアミノ酸配列を示している。
これらの配列のそれぞれは、適切な調節エレメントの制
御の下に、適当な発現ベクターに挿入し、適当な宿主、
例えば、E. coli あるいはチャイニーズハムスター卵巣
(CHO)細胞あるいは酵母などの原核宿主において発現さ
れ得る。
ブユニットをコードするDNA配列は、単離され配列分
析されている(A鎖cDNA(ヒト)は、Betsholtz,
C.ら、Nature(1986)320に記載されている;A鎖ゲノム
DNA(ヒト)は、Bonthron,D.T.ら、PNAS(1988)85:14
96に記載されている;B鎖cDNA(ヒト)は、Collin
s, T. ら、Nature(1985)316:748に記載されている;お
よびB鎖ゲノムDNA(ヒト)は、Chin,I. -M.ら、Ce
ll (1984) 37:123に記載されている)。図4は、ヒト血
小板由来の増殖因子の、5’末端にBamHIリンカー結合
のおよび3’末端にEcoRVリンカー結合の、それぞれの
A鎖およびB鎖サブユニットの単離されたcDNA配列
および推定される前駆体のアミノ酸配列を示している。
これらの配列のそれぞれは、適切な調節エレメントの制
御の下に、適当な発現ベクターに挿入し、適当な宿主、
例えば、E. coli あるいはチャイニーズハムスター卵巣
(CHO)細胞あるいは酵母などの原核宿主において発現さ
れ得る。
【0076】本発明が意図するキメラ増殖因子タンパク
質の例には、ジスルフィド結合によって、血管内皮細胞
増殖因子のポリペプチド鎖の全長に結合された血小板由
来の増殖因子のA鎖サブユニットの全長を有するダイマ
ータンパク質;およびジスルフィド結合によって、血管
内皮細胞増殖因子のポリペプチド鎖の全長に結合された
血小板由来の増殖因子のB鎖サブユニットの全長を有す
るダイマータンパク質が含まれる。他の上記よりは望ま
しくない実施態様において、ダイマータンパク質は、ジ
スルフィド結合された2つのポリペプチド鎖で、片方の
鎖あるいは両方の鎖が、血小板由来の増殖因子あるいは
血管内皮細胞増殖因子のA鎖あるいはB鎖サブユニット
のいずれかのN末端部分に対応するアミノ酸配列を有す
るN末端セグメントであり、そして選択されなかった他
の2つの鎖の1つから選ばれたC末端配列に対応するC
末端セグメントからなり得る。例えば、血小板由来の増
殖因子のA鎖のN末端の1/2が、血管内皮細胞増殖因
子のC末端の1/2にペプチド結合された1つのポリペ
プチド鎖;および血管内皮細胞増殖因子の全アミノ酸配
列からなるもう一方のペプチド鎖であるダイマーが調製
され得る。逆に、1つのポリペプチド鎖は、血小板由来
の増殖因子のA鎖あるいはB鎖サブユニットのC末端セ
グメントに結合された血管内皮細胞増殖因子のN末端部
分からなり得、そして、もう一方のポリペプチド鎖は、
血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸配列を有し得る。容易
に明らかになるように、多くの異なるハイブリッドの組
み合せが調製される。
質の例には、ジスルフィド結合によって、血管内皮細胞
増殖因子のポリペプチド鎖の全長に結合された血小板由
来の増殖因子のA鎖サブユニットの全長を有するダイマ
ータンパク質;およびジスルフィド結合によって、血管
内皮細胞増殖因子のポリペプチド鎖の全長に結合された
血小板由来の増殖因子のB鎖サブユニットの全長を有す
るダイマータンパク質が含まれる。他の上記よりは望ま
しくない実施態様において、ダイマータンパク質は、ジ
スルフィド結合された2つのポリペプチド鎖で、片方の
鎖あるいは両方の鎖が、血小板由来の増殖因子あるいは
血管内皮細胞増殖因子のA鎖あるいはB鎖サブユニット
のいずれかのN末端部分に対応するアミノ酸配列を有す
るN末端セグメントであり、そして選択されなかった他
の2つの鎖の1つから選ばれたC末端配列に対応するC
末端セグメントからなり得る。例えば、血小板由来の増
殖因子のA鎖のN末端の1/2が、血管内皮細胞増殖因
子のC末端の1/2にペプチド結合された1つのポリペ
プチド鎖;および血管内皮細胞増殖因子の全アミノ酸配
列からなるもう一方のペプチド鎖であるダイマーが調製
され得る。逆に、1つのポリペプチド鎖は、血小板由来
の増殖因子のA鎖あるいはB鎖サブユニットのC末端セ
グメントに結合された血管内皮細胞増殖因子のN末端部
分からなり得、そして、もう一方のポリペプチド鎖は、
血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸配列を有し得る。容易
に明らかになるように、多くの異なるハイブリッドの組
み合せが調製される。
【0077】本発明のキメラ増殖因子を調製するため
に、各々の所望の鎖をコードするDNA配列は、プラス
ミドなどの適当な発現ベクター内に、宿主細胞でその発
現を指令し得る調節配列の制御下に挿入される。次に、
宿主細胞は発現ベクターによって形質転換される。所望
であれば、1つの宿主を、2つの鎖用の各発現ベクター
で同時形質転換し得る。あるいは、別の宿主細胞を、2
つのポリペプチド鎖を同時にコードするベクターで形質
転換し得る。次に、このポリペプチド鎖を、従来の方法
によって発現させ、そして回収する。そのペプチド鎖
が、宿主細胞から分泌されるように分泌シグナル配列と
共に発現されるときには、それらは、合成および分泌の
間に自然に正確なダイマー構造を形成し得る。次に、そ
のダイマーは、Gospodarowiczら、PNAS(1989)86(19):73
11-7316、およびFerraraおよびHenzel、BBRC(1989)161
(2):851-858に記載の方法を用いて精製し得る。この経
路で正確なダイマー構造が得られない場合には、あるい
は、キメラの2つの鎖が異なる宿主で合成される場合に
は、次に、鎖の再折り畳みおよびダイマー化の手段の1
つの例は、下記の実施例により詳細に記載されているよ
うに、グアニジン-HCl、Na2SO3およびNa2S4O6で部分的
に精製された鎖あるいは精製された鎖を処理することで
ある。次に、得られたS-スルホン化され、変性されたタ
ンパク質は、最終精製の前に、5mMのグルタチオン、0.
5mMのグルタチオンジスルフィド、および尿素の存在下
に再折り畳みおよびダイマー化の両方がなされる。
に、各々の所望の鎖をコードするDNA配列は、プラス
ミドなどの適当な発現ベクター内に、宿主細胞でその発
現を指令し得る調節配列の制御下に挿入される。次に、
宿主細胞は発現ベクターによって形質転換される。所望
であれば、1つの宿主を、2つの鎖用の各発現ベクター
で同時形質転換し得る。あるいは、別の宿主細胞を、2
つのポリペプチド鎖を同時にコードするベクターで形質
転換し得る。次に、このポリペプチド鎖を、従来の方法
によって発現させ、そして回収する。そのペプチド鎖
が、宿主細胞から分泌されるように分泌シグナル配列と
共に発現されるときには、それらは、合成および分泌の
間に自然に正確なダイマー構造を形成し得る。次に、そ
のダイマーは、Gospodarowiczら、PNAS(1989)86(19):73
11-7316、およびFerraraおよびHenzel、BBRC(1989)161
(2):851-858に記載の方法を用いて精製し得る。この経
路で正確なダイマー構造が得られない場合には、あるい
は、キメラの2つの鎖が異なる宿主で合成される場合に
は、次に、鎖の再折り畳みおよびダイマー化の手段の1
つの例は、下記の実施例により詳細に記載されているよ
うに、グアニジン-HCl、Na2SO3およびNa2S4O6で部分的
に精製された鎖あるいは精製された鎖を処理することで
ある。次に、得られたS-スルホン化され、変性されたタ
ンパク質は、最終精製の前に、5mMのグルタチオン、0.
5mMのグルタチオンジスルフィド、および尿素の存在下
に再折り畳みおよびダイマー化の両方がなされる。
【0078】組成物および使用 本発明によって提供される血管内皮細胞増殖因子(bV
EGF120、bVEGF164、hVEGF121、あるいは
hVEGF165)は、創傷治癒剤として有用であり、特
に、血管組織に内皮を再形成したい部位あるいは新しい
毛細血管床(脈管形成)の増殖が重要である場所に塗布
するのに有用である。
EGF120、bVEGF164、hVEGF121、あるいは
hVEGF165)は、創傷治癒剤として有用であり、特
に、血管組織に内皮を再形成したい部位あるいは新しい
毛細血管床(脈管形成)の増殖が重要である場所に塗布
するのに有用である。
【0079】従って、血管内皮細胞増殖因子は、床ず
れ、静脈潰瘍、および糖尿病性の潰瘍の種類を含む皮膚
潰瘍などの、十分に深い創傷の処置に用いられ得る。さ
らに、血管内皮細胞増殖因子は、火傷あるいは外傷の部
位に皮膚移植あるいは皮弁を調製するために脈管形成が
必要とされる十分に深い火傷あるいは外傷の処置に用い
られ得る。この場合には、血管内皮細胞増殖因子は、部
位に直接に塗布されるか、移植する前に移植される皮膚
あるいは皮弁を浸すのに用いられる。同様に、血管内皮
細胞増殖因子は、火傷、他の外傷後、あるいは化粧の目
的に、再成形が必要とされる成形外科に用いられ得る。
れ、静脈潰瘍、および糖尿病性の潰瘍の種類を含む皮膚
潰瘍などの、十分に深い創傷の処置に用いられ得る。さ
らに、血管内皮細胞増殖因子は、火傷あるいは外傷の部
位に皮膚移植あるいは皮弁を調製するために脈管形成が
必要とされる十分に深い火傷あるいは外傷の処置に用い
られ得る。この場合には、血管内皮細胞増殖因子は、部
位に直接に塗布されるか、移植する前に移植される皮膚
あるいは皮弁を浸すのに用いられる。同様に、血管内皮
細胞増殖因子は、火傷、他の外傷後、あるいは化粧の目
的に、再成形が必要とされる成形外科に用いられ得る。
【0080】脈管形成はさらに、傷を清潔に感染しない
ように保つのに重要である。従って、血管内皮細胞増殖
因子は、外科全般および切口および裂傷の修復に関して
使用し得る。特に、感染の危険性の高い腹の傷の処置に
有用である。さらに、新生血管の形成は、骨折の修復に
重要である。なぜなら、骨の損傷部位に血管が成長発達
するからである。従って、血管内皮細胞増殖因子の骨折
部位への投与は、もう一つの使用法である。
ように保つのに重要である。従って、血管内皮細胞増殖
因子は、外科全般および切口および裂傷の修復に関して
使用し得る。特に、感染の危険性の高い腹の傷の処置に
有用である。さらに、新生血管の形成は、骨折の修復に
重要である。なぜなら、骨の損傷部位に血管が成長発達
するからである。従って、血管内皮細胞増殖因子の骨折
部位への投与は、もう一つの使用法である。
【0081】血管内皮細胞増殖因子が、上記のように局
部の創傷治癒に用いられる場合には、脈管組織の内皮再
形成のために、下記に示すいずれかの経路、あるいは、
より好ましくは、局所的な方法によって投与され得る。
これらの場合には、溶液、スプレー、ゲル、クリーム、
軟膏あるいは乾燥粉末のいずれかとして直接に損傷部位
に投与される。血管内皮細胞増殖因子を損傷部分にゆっ
くりと放出するように制御する素子もまた用いられる。
局部塗布では、血管内皮細胞増殖因子は、1回投与、あ
るいは1週間から数週間の期間毎日あるいは数日毎の投
与処方のいずれかで、50から1000μg/mlの濃度範囲で塗
布される。一般的に、投与される局所調合の量は、創傷
の表面積に基づいて約0.1から100μg/cm2の血管内皮細
胞増殖因子の塗布で十分である。
部の創傷治癒に用いられる場合には、脈管組織の内皮再
形成のために、下記に示すいずれかの経路、あるいは、
より好ましくは、局所的な方法によって投与され得る。
これらの場合には、溶液、スプレー、ゲル、クリーム、
軟膏あるいは乾燥粉末のいずれかとして直接に損傷部位
に投与される。血管内皮細胞増殖因子を損傷部分にゆっ
くりと放出するように制御する素子もまた用いられる。
局部塗布では、血管内皮細胞増殖因子は、1回投与、あ
るいは1週間から数週間の期間毎日あるいは数日毎の投
与処方のいずれかで、50から1000μg/mlの濃度範囲で塗
布される。一般的に、投与される局所調合の量は、創傷
の表面積に基づいて約0.1から100μg/cm2の血管内皮細
胞増殖因子の塗布で十分である。
【0082】血管内皮細胞増殖因子は、その工程で血管
内皮細胞が除去あるいは破壊され、アテロームプラーク
の圧縮を伴うバルーン血管形成術後の創傷治癒剤として
使用され得る。血管内皮細胞増殖因子は、全身的にある
いは局所的に静脈内に、静脈内ボーラス注入あるいは点
滴のいずれかで、血管内部表面に塗布され得る。所望で
あれば、血管内皮細胞増殖因子は、長時間にわたり、マ
イクロメータリングポンプを用いて投与され得る。血管
内投与に適した組成物は、内皮細胞の増殖を促進するの
に効果的な量の血管内皮細胞増殖因子、および非経口用
のキャリアー物質を含有する。血管内皮細胞増殖因子
は、広い濃度範囲の組成物として存在し得る。例えば、
単回あるいは複数回の塗布処方で投与される、患者当り
3から10mlの注射を用いる場合には約50μg/mlから約1,
000μg/mlの濃度である。通常の生理食塩水あるいは5
から10%のデキストロースなどの、公知のあらゆる非経
口キャリアー溶液が使用され得る。
内皮細胞が除去あるいは破壊され、アテロームプラーク
の圧縮を伴うバルーン血管形成術後の創傷治癒剤として
使用され得る。血管内皮細胞増殖因子は、全身的にある
いは局所的に静脈内に、静脈内ボーラス注入あるいは点
滴のいずれかで、血管内部表面に塗布され得る。所望で
あれば、血管内皮細胞増殖因子は、長時間にわたり、マ
イクロメータリングポンプを用いて投与され得る。血管
内投与に適した組成物は、内皮細胞の増殖を促進するの
に効果的な量の血管内皮細胞増殖因子、および非経口用
のキャリアー物質を含有する。血管内皮細胞増殖因子
は、広い濃度範囲の組成物として存在し得る。例えば、
単回あるいは複数回の塗布処方で投与される、患者当り
3から10mlの注射を用いる場合には約50μg/mlから約1,
000μg/mlの濃度である。通常の生理食塩水あるいは5
から10%のデキストロースなどの、公知のあらゆる非経
口キャリアー溶液が使用され得る。
【0083】血管内皮細胞増殖因子は、血管移植手術で
の内皮の形成を促進するために使用され得る。移植血管
あるいは合成物質のいずれかを用いる血管移植の場合
に、例えば、血管内皮細胞増殖因子は、血管内皮細胞の
増殖を促進するために、移植片の表面に塗布され得る
か、および/または、移植片およびそこにある血管との
つなぎ目に塗布され得る。このような塗布の場合、血管
内皮細胞増殖因子は、前記のバルーン脈管形成用のよう
に静脈内に、あるいは手術前あるいは手術中のいずれか
に、移植片および/またはそこのある血管の表面に直接
塗布され得る。このような場合には、病巣の表面に付着
され、肉厚のキャリアー物質中にいれた血管内皮細胞増
殖因子を塗布するのが望ましい。適切なキャリアー物質
には、例えば、1−5%のカルボポール(carbopol)が
含まれる。血管内皮細胞増殖因子は、キャリアー中には
広い濃度範囲、例えば約50μg/mgから約1,000μg/mgで
含まれ得る。あるいは、血管内皮細胞増殖因子は、非経
口溶液として、部位にマイクロメータリングポンブで送
られ得る。
の内皮の形成を促進するために使用され得る。移植血管
あるいは合成物質のいずれかを用いる血管移植の場合
に、例えば、血管内皮細胞増殖因子は、血管内皮細胞の
増殖を促進するために、移植片の表面に塗布され得る
か、および/または、移植片およびそこにある血管との
つなぎ目に塗布され得る。このような塗布の場合、血管
内皮細胞増殖因子は、前記のバルーン脈管形成用のよう
に静脈内に、あるいは手術前あるいは手術中のいずれか
に、移植片および/またはそこのある血管の表面に直接
塗布され得る。このような場合には、病巣の表面に付着
され、肉厚のキャリアー物質中にいれた血管内皮細胞増
殖因子を塗布するのが望ましい。適切なキャリアー物質
には、例えば、1−5%のカルボポール(carbopol)が
含まれる。血管内皮細胞増殖因子は、キャリアー中には
広い濃度範囲、例えば約50μg/mgから約1,000μg/mgで
含まれ得る。あるいは、血管内皮細胞増殖因子は、非経
口溶液として、部位にマイクロメータリングポンブで送
られ得る。
【0084】血管内皮細胞増殖因子は、さらに、側副循
環の血管の内皮細胞の増殖を促進することによって、心
筋梗塞形成後の血管破壊の修復のために、および冠状動
脈のバイパス手術用の包囲に使用され得る。血管内皮細
胞増殖因子はこの目的に、静脈内に個々の注射によっ
て、または前述のようにある期間マイクロメータリング
ポンプによって、あるいは直接注入によって、あるいは
心臓の損傷した筋肉の部位への注射によって投与され
る。
環の血管の内皮細胞の増殖を促進することによって、心
筋梗塞形成後の血管破壊の修復のために、および冠状動
脈のバイパス手術用の包囲に使用され得る。血管内皮細
胞増殖因子はこの目的に、静脈内に個々の注射によっ
て、または前述のようにある期間マイクロメータリング
ポンプによって、あるいは直接注入によって、あるいは
心臓の損傷した筋肉の部位への注射によって投与され
る。
【0085】血管内皮細胞増殖因子は、さらにインビト
ロでの血管細胞培養用の増殖因子として使用され得る。
このような使用には、血管内皮細胞増殖因子は、約10pg
/mlから約10ng/mlの濃度で細胞培養培地に添加され得
る。
ロでの血管細胞培養用の増殖因子として使用され得る。
このような使用には、血管内皮細胞増殖因子は、約10pg
/mlから約10ng/mlの濃度で細胞培養培地に添加され得
る。
【0086】本発明のハイブリッド増殖因子分子は、血
小板由来の増殖因子と血管内皮細胞増殖因子との中間の
有糸***促進活性を示すと予想され、あるいは、ある場
合には、脈管形成のインヒビターとして用いられ得る。
2つの因子の活性の間の最も大きな違いは、血小板由来
の増殖因子は、実質的な有糸***活性を平滑筋細胞およ
び腺維芽細胞には示すが、内皮細胞には示さないことで
ある。一方、血管内皮細胞増殖因子は逆の特性を示す。
PDGF A鎖および/またはB鎖の平滑筋細胞および腺維
芽細胞に対する有糸***活性は、創傷治癒のための張力
を与える。従って、血小板由来の増殖因子と血管内皮細
胞増殖因子とのハイブリッドであるその増殖因子は、新
生血管の形成の誘導、および治癒の間および治癒後に創
傷部分に張力を与えるために塗布され得る。このハイブ
リッド増殖因子は、前記の血管内皮細胞増殖因子と基本
的には同様の様式で、同様の投与量で付与される。
小板由来の増殖因子と血管内皮細胞増殖因子との中間の
有糸***促進活性を示すと予想され、あるいは、ある場
合には、脈管形成のインヒビターとして用いられ得る。
2つの因子の活性の間の最も大きな違いは、血小板由来
の増殖因子は、実質的な有糸***活性を平滑筋細胞およ
び腺維芽細胞には示すが、内皮細胞には示さないことで
ある。一方、血管内皮細胞増殖因子は逆の特性を示す。
PDGF A鎖および/またはB鎖の平滑筋細胞および腺維
芽細胞に対する有糸***活性は、創傷治癒のための張力
を与える。従って、血小板由来の増殖因子と血管内皮細
胞増殖因子とのハイブリッドであるその増殖因子は、新
生血管の形成の誘導、および治癒の間および治癒後に創
傷部分に張力を与えるために塗布され得る。このハイブ
リッド増殖因子は、前記の血管内皮細胞増殖因子と基本
的には同様の様式で、同様の投与量で付与される。
【0087】種々の型の血管内皮細胞増殖因子をコード
するDNA配列、およびそれらの推定アミノ酸配列の解
明は、さらに血管内皮細胞増殖因子活性のインヒビター
を生産する方法を提供する。血管内皮細胞増殖因子の脈
管形成活性の阻害は、増殖中の癌に必要な血液供給を提
供するには新生血管の形成が必要とされるので、例えば
癌の増殖を遅らせたり阻むのに有用である。血管内皮細
胞増殖因子に対する抗体、あるいは血管内皮細胞増殖因
子のレセプターには結合し得るが、全長の血管内皮細胞
増殖因子の脈管形成活性は示さない血管内皮細胞増殖因
子のフラグメントが投与され得る。
するDNA配列、およびそれらの推定アミノ酸配列の解
明は、さらに血管内皮細胞増殖因子活性のインヒビター
を生産する方法を提供する。血管内皮細胞増殖因子の脈
管形成活性の阻害は、増殖中の癌に必要な血液供給を提
供するには新生血管の形成が必要とされるので、例えば
癌の増殖を遅らせたり阻むのに有用である。血管内皮細
胞増殖因子に対する抗体、あるいは血管内皮細胞増殖因
子のレセプターには結合し得るが、全長の血管内皮細胞
増殖因子の脈管形成活性は示さない血管内皮細胞増殖因
子のフラグメントが投与され得る。
【0088】発現され単離された血管内皮細胞増殖因子
タンパク質に対する抗体は、公知の技術で生産され得
る。治療用抗体はポリクローナル抗体あるいはモノクロ
ーナル抗体であり得る。抗体は、ウサギ、マウスあるい
は他の適当な動物で、標準的な免疫のプロトコールを用
い、そして抗血清を回収することにより調製される。さ
らに、免疫された動物の抗体分泌細胞は、血管内皮細胞
増殖因子と免疫反応する抗体によりスクリーニングされ
得るハイブリドーマを生産する細胞融合法を用いて、株
化され得る(例えば、"Antibodies: A Laboratory Manu
al",E. Harlow,およびD.Lane著、Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor,N.Y.を参照)。適切
な処置の処方(すなわち、投与量、投与頻度、全身的投
与あるいは局所的投与など)の決定は、当分野の技術範
囲内である。投与には、抗体は、薬学的に受容可能な非
経口溶液と共に、単位投与量の注射用形態(溶液、懸濁
液、乳液など)に調合される。このような溶液は、通常
無毒性および非治療性である。このような溶液には、
水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、お
よびハンク液がある。不揮発油およびエチルオレイン酸
などの非水溶液もまた使用され得る。好ましい溶媒は、
5%(w/w)のヒトアルブミン生理食塩水溶液である。
溶媒は、等張性および化学安定性を増大する物質のよう
な少量の添加剤、例えばバッファーおよび保存剤を含有
し得る。抗体は、このような溶媒中に、典型的には、約
20μg/mlから約20mg/mlの濃度に調合される。
タンパク質に対する抗体は、公知の技術で生産され得
る。治療用抗体はポリクローナル抗体あるいはモノクロ
ーナル抗体であり得る。抗体は、ウサギ、マウスあるい
は他の適当な動物で、標準的な免疫のプロトコールを用
い、そして抗血清を回収することにより調製される。さ
らに、免疫された動物の抗体分泌細胞は、血管内皮細胞
増殖因子と免疫反応する抗体によりスクリーニングされ
得るハイブリドーマを生産する細胞融合法を用いて、株
化され得る(例えば、"Antibodies: A Laboratory Manu
al",E. Harlow,およびD.Lane著、Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor,N.Y.を参照)。適切
な処置の処方(すなわち、投与量、投与頻度、全身的投
与あるいは局所的投与など)の決定は、当分野の技術範
囲内である。投与には、抗体は、薬学的に受容可能な非
経口溶液と共に、単位投与量の注射用形態(溶液、懸濁
液、乳液など)に調合される。このような溶液は、通常
無毒性および非治療性である。このような溶液には、
水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、お
よびハンク液がある。不揮発油およびエチルオレイン酸
などの非水溶液もまた使用され得る。好ましい溶媒は、
5%(w/w)のヒトアルブミン生理食塩水溶液である。
溶媒は、等張性および化学安定性を増大する物質のよう
な少量の添加剤、例えばバッファーおよび保存剤を含有
し得る。抗体は、このような溶媒中に、典型的には、約
20μg/mlから約20mg/mlの濃度に調合される。
【0089】さらに、本明細書には、例えば、腫瘍の増
殖を遅らせるかあるいは阻むための脈管形成を阻害する
方法が提供される。この方法には、2つの異なるサブユ
ニットを有するヘテロダイマーのタンパク質の投与が含
まれ、この各々のサブユニットは、hVEGF121、h
VEGF165、およびhVPF189の成熟アミノ酸配列か
ら選択される。用語hVPF189とは、図8に示されて
いる転写されたゲノムDNA配列の現在では分化メッセ
ージのスプライシングから生じることが見い出されてい
る、189個のアミノ酸のタンパク質である。hVPF189
のホモダイマー型は、血管透過性因子と呼ばれている。
hVPFのアミノ酸配列は、hVEGF121およびhV
EGF165の両者と、成熟タンパク質のN末端の114個の
アミノ酸およびC末端の5個のアミノ酸が相同である。
しかし、hVPF189は、hVEGF121には存在しな
い、115位から始まる68個のアミノ酸の配列を有する。
hVPF189の全cDNAコード配列および推定アミノ
酸配列は、Keck, P. ら、Science(1989)246:1309-1312
に記載されている。この記載は、本明細書に参考として
援用されている。特定の理論あるいは作用の機構に束縛
されることを望んではいないが、ダイマーPDGF様の増殖
因子は、そのダイマーの各々のサブユニットが、細胞表
面の別々のレセプターサブユニットに結合する機構、す
なわちレセプター活性を誘起するのに必要な2つの隣接
したレセプターサブユニットに結合して生物学的活性を
誘発すると考えられる。血管内皮細胞増殖因子ファミリ
ーの異なるサブユニットからなるヘテロダイマーの投与
によって、サブユニットの各々は、各々のサブユニット
は特定のレセプターのサブタイプに結合し得る。そのこ
とによって、結合レセプターを、外来のホモダイマー血
管内皮細胞増殖因子との相互作用から効果的に阻害す
る。しかし、投与されたホモダイマーの他のサブユニッ
トは、異なる血管内皮細胞増殖因子のサブタイプである
ので、そのダイマーは、同じサブタイプの第2のレセプ
ターサブユニットに結合してレセプターの生物学的活性
を誘発することができない。
殖を遅らせるかあるいは阻むための脈管形成を阻害する
方法が提供される。この方法には、2つの異なるサブユ
ニットを有するヘテロダイマーのタンパク質の投与が含
まれ、この各々のサブユニットは、hVEGF121、h
VEGF165、およびhVPF189の成熟アミノ酸配列か
ら選択される。用語hVPF189とは、図8に示されて
いる転写されたゲノムDNA配列の現在では分化メッセ
ージのスプライシングから生じることが見い出されてい
る、189個のアミノ酸のタンパク質である。hVPF189
のホモダイマー型は、血管透過性因子と呼ばれている。
hVPFのアミノ酸配列は、hVEGF121およびhV
EGF165の両者と、成熟タンパク質のN末端の114個の
アミノ酸およびC末端の5個のアミノ酸が相同である。
しかし、hVPF189は、hVEGF121には存在しな
い、115位から始まる68個のアミノ酸の配列を有する。
hVPF189の全cDNAコード配列および推定アミノ
酸配列は、Keck, P. ら、Science(1989)246:1309-1312
に記載されている。この記載は、本明細書に参考として
援用されている。特定の理論あるいは作用の機構に束縛
されることを望んではいないが、ダイマーPDGF様の増殖
因子は、そのダイマーの各々のサブユニットが、細胞表
面の別々のレセプターサブユニットに結合する機構、す
なわちレセプター活性を誘起するのに必要な2つの隣接
したレセプターサブユニットに結合して生物学的活性を
誘発すると考えられる。血管内皮細胞増殖因子ファミリ
ーの異なるサブユニットからなるヘテロダイマーの投与
によって、サブユニットの各々は、各々のサブユニット
は特定のレセプターのサブタイプに結合し得る。そのこ
とによって、結合レセプターを、外来のホモダイマー血
管内皮細胞増殖因子との相互作用から効果的に阻害す
る。しかし、投与されたホモダイマーの他のサブユニッ
トは、異なる血管内皮細胞増殖因子のサブタイプである
ので、そのダイマーは、同じサブタイプの第2のレセプ
ターサブユニットに結合してレセプターの生物学的活性
を誘発することができない。
【0090】脈管形成を阻害するためにこのような方法
に用いられるヘテロダイマータンパク質は、hVEGF
121、hVEGF165あるいはhVPF189の所望のアミ
ノ酸配列を、別々の宿主で発現させることによって、あ
るいは同じ宿主で同時発現させることによって生産し得
る。次に、ダイマー化を、本明細書の他のところに記載
した方法でなし得る。所望のヘテロダイマーは、タンパ
ク質のサイズ分離に都合のよい任意の方法によってホモ
ダイマー型と分け得る。ヘテロダイマーは、血管内皮細
胞増殖因子を脈管形成賦剤として投与する同じ様式で、
抗脈管形成処置が必要な宿主、例えば、癌にかかってい
る患者に投与される。正確な投与処方および投与量の決
定は、当分野の技術範囲内である。
に用いられるヘテロダイマータンパク質は、hVEGF
121、hVEGF165あるいはhVPF189の所望のアミ
ノ酸配列を、別々の宿主で発現させることによって、あ
るいは同じ宿主で同時発現させることによって生産し得
る。次に、ダイマー化を、本明細書の他のところに記載
した方法でなし得る。所望のヘテロダイマーは、タンパ
ク質のサイズ分離に都合のよい任意の方法によってホモ
ダイマー型と分け得る。ヘテロダイマーは、血管内皮細
胞増殖因子を脈管形成賦剤として投与する同じ様式で、
抗脈管形成処置が必要な宿主、例えば、癌にかかってい
る患者に投与される。正確な投与処方および投与量の決
定は、当分野の技術範囲内である。
【0091】脈管形成を阻害する他の方法は、1つのサ
ブユニットが、hVEGF121、hVEGF165あるいは
hVPF189から選択され;他のサブユニットが生物学
的に不活性なフラグメント、あるいは、1つあるいはそ
れ以上のアミノ酸が、そのサブユニットを不活性にする
異なるアミノ酸で置換されている、hVEGF121、h
VEGF165あるいはhVPF189のアナログである;ヘ
テロダイマーの投与である。
ブユニットが、hVEGF121、hVEGF165あるいは
hVPF189から選択され;他のサブユニットが生物学
的に不活性なフラグメント、あるいは、1つあるいはそ
れ以上のアミノ酸が、そのサブユニットを不活性にする
異なるアミノ酸で置換されている、hVEGF121、h
VEGF165あるいはhVPF189のアナログである;ヘ
テロダイマーの投与である。
【0092】血管内皮細胞増殖因子は癌細胞中では高い
レベルで産生されるので、従来の免疫アッセイで、抗血
管内皮細胞増殖因子抗体を用い、患者の腫瘍の存在を検
出するのに用いられ得る。血管内皮細胞増殖因子に対す
る抗体、好ましくはhVEGF121あるいはhVEGF
165などのヒト血管内皮細胞増殖因子に対する抗体は、
公知の技術によって生産し得る。抗体はポリクローナル
抗体あるいはモノクローナル抗体であり得る。血管内皮
細胞増殖因子のレベルは、液体サンプル、好ましくは、
腫瘍を有すると思われる患者の血清サンプル中で、測定
される物質に対する抗体を用いて、任意の従来の免疫ア
ッセイ法を用いて定量される。好ましいアッセイは、サ
ンドイッチタイプの酵素免疫アッセイあるいは放射免疫
アッセイなどの、サンドイッチタイプの免疫アッセイで
ある。血管内皮細胞増殖因子の循環レベルは、これらの
方法によって、1−1000pg/mlレベルが、よい信頼性測
定され得る。血管内皮細胞増殖因子の測定されたレベル
を、正常人、すなわち腫瘍を有さないヒトから得たコン
トロールレベルと比較する。血管内皮細胞増殖因子の増
加した循環レベルは、腫瘍と判断される。
レベルで産生されるので、従来の免疫アッセイで、抗血
管内皮細胞増殖因子抗体を用い、患者の腫瘍の存在を検
出するのに用いられ得る。血管内皮細胞増殖因子に対す
る抗体、好ましくはhVEGF121あるいはhVEGF
165などのヒト血管内皮細胞増殖因子に対する抗体は、
公知の技術によって生産し得る。抗体はポリクローナル
抗体あるいはモノクローナル抗体であり得る。血管内皮
細胞増殖因子のレベルは、液体サンプル、好ましくは、
腫瘍を有すると思われる患者の血清サンプル中で、測定
される物質に対する抗体を用いて、任意の従来の免疫ア
ッセイ法を用いて定量される。好ましいアッセイは、サ
ンドイッチタイプの酵素免疫アッセイあるいは放射免疫
アッセイなどの、サンドイッチタイプの免疫アッセイで
ある。血管内皮細胞増殖因子の循環レベルは、これらの
方法によって、1−1000pg/mlレベルが、よい信頼性測
定され得る。血管内皮細胞増殖因子の測定されたレベル
を、正常人、すなわち腫瘍を有さないヒトから得たコン
トロールレベルと比較する。血管内皮細胞増殖因子の増
加した循環レベルは、腫瘍と判断される。
【0093】標準的な方法 細胞の形質転換、ベクターの構築、メッセンジャーRNA
の抽出、cDNAライブラリーの調製などに用いられる
ほとんどの手順は、当分野では広く行われていて、ほと
んどの専門家には、特定の条件および手順が記載されて
いる標準的な資材はよく知られている。しかし、便宜
上、以下の項にガイドラインとして掲げた。
の抽出、cDNAライブラリーの調製などに用いられる
ほとんどの手順は、当分野では広く行われていて、ほと
んどの専門家には、特定の条件および手順が記載されて
いる標準的な資材はよく知られている。しかし、便宜
上、以下の項にガイドラインとして掲げた。
【0094】宿主および制御配列 原核および真核系の両者が、血管内皮細胞増殖因子のコ
ード配列を発現するために使用され得る。もちろん原核
宿主は、クローニングの方法に最も都合がよい。最も頻
用される原核宿主は、種々のE. coli株に代表される;
しかし、他の微生物株もまた使用され得る。宿主微生物
に適した種由来の、複製部位、選択マーカーおよび制御
配列を有するプラスミドベクターが使用され得る;例え
ば、E. coliは、典型的には、Salmonellaから得た2
つ、およびBolivarら、Gene(1977)2:95に記載のE. coli
から単離された1つの、3つの天然に存在するプラスミ
ドの部分から構築されたプラスミドであるpBR322の誘導
体を用いて形質転換される。pBR322は、アンピシリンお
よびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含有し、所望のベ
クターの構築で保存あるいは破壊し得る、複数の選択マ
ーカーを提供する。一般的に用いられる原核制御配列
(または、本明細書では「調節エレメント」とも呼ばれ
る)は、本明細書では転写開始プロモーター、必要に応
じてオペレーターを伴って、リボソーム結合部位配列を
含むと定義されていて、この制御配列には、β-ラクタ
マーゼ(ペニシリナーゼ)およびラクトース(lac)プ
ロモーター系(Changら、Nature(1977)198:1056)、お
よびトリブトファン(trp)プロモーター系(Goeddel
ら、Nucleic Acids Res. (1980) 8:4057)およびλ由来
PLプロモーターおよびN-遺伝子リボソーム結合部位
(Shimatakeら、Nature (1981) 292:128)などの一般に
用いられているプロモーターが含まれる。
ード配列を発現するために使用され得る。もちろん原核
宿主は、クローニングの方法に最も都合がよい。最も頻
用される原核宿主は、種々のE. coli株に代表される;
しかし、他の微生物株もまた使用され得る。宿主微生物
に適した種由来の、複製部位、選択マーカーおよび制御
配列を有するプラスミドベクターが使用され得る;例え
ば、E. coliは、典型的には、Salmonellaから得た2
つ、およびBolivarら、Gene(1977)2:95に記載のE. coli
から単離された1つの、3つの天然に存在するプラスミ
ドの部分から構築されたプラスミドであるpBR322の誘導
体を用いて形質転換される。pBR322は、アンピシリンお
よびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含有し、所望のベ
クターの構築で保存あるいは破壊し得る、複数の選択マ
ーカーを提供する。一般的に用いられる原核制御配列
(または、本明細書では「調節エレメント」とも呼ばれ
る)は、本明細書では転写開始プロモーター、必要に応
じてオペレーターを伴って、リボソーム結合部位配列を
含むと定義されていて、この制御配列には、β-ラクタ
マーゼ(ペニシリナーゼ)およびラクトース(lac)プ
ロモーター系(Changら、Nature(1977)198:1056)、お
よびトリブトファン(trp)プロモーター系(Goeddel
ら、Nucleic Acids Res. (1980) 8:4057)およびλ由来
PLプロモーターおよびN-遺伝子リボソーム結合部位
(Shimatakeら、Nature (1981) 292:128)などの一般に
用いられているプロモーターが含まれる。
【0095】細菌に加えて、酵母などの真核微生物も宿
主として用い得る。多くの他の菌株や種が一般に入手可
能であるが、Saccharomyces cerevisiae、パン酵母の研
究用菌株が最も用いられる。例えば、Broach, J.R., Me
th. Enz.(1983)101:307の2μの複製起点、あるいは酵
母適合の他の複製起点(例えば、Stinchcombら、Nature
(1979) 282:39,Tschumper, G. ら、Gene(1980) 10:15
7およびClarke, L.ら、Meth. Enz.(1983)101:300を参
照)を含んだベクターが使用し得る。酵母ベクターの制
御配列には、解糖系酵素の合成のプロモーターが含まれ
る(Hessら、J.Adv. Enzyme Reg.(1968)7:149:Holland
ら、Biochemistry(1978)17:4900)。当分野に公知の他
のプロモーターには、3-ホスホグリセレートキナーゼ
のプロモーターが含まれる(Hitzemanら、J. Biol. Che
m.(1980)255:2073)。さらに、増殖条件および/または
遺伝的背景によって制御される転写の利点を有する他の
プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソ
チトクロームC、酸性ホスファターゼ、窒素代謝関連の
分解酵素、αファクター系、およびマルトースおよびガ
ラクトースの利用に関する酵素のプロモーター領域であ
る。ターミネーター配列は、コード配列の3’末端にあ
ることが望ましい。このようなターミネーターは、酵母
由来の遺伝子のコード配列の後の3’非翻訳領域に見い
出される。
主として用い得る。多くの他の菌株や種が一般に入手可
能であるが、Saccharomyces cerevisiae、パン酵母の研
究用菌株が最も用いられる。例えば、Broach, J.R., Me
th. Enz.(1983)101:307の2μの複製起点、あるいは酵
母適合の他の複製起点(例えば、Stinchcombら、Nature
(1979) 282:39,Tschumper, G. ら、Gene(1980) 10:15
7およびClarke, L.ら、Meth. Enz.(1983)101:300を参
照)を含んだベクターが使用し得る。酵母ベクターの制
御配列には、解糖系酵素の合成のプロモーターが含まれ
る(Hessら、J.Adv. Enzyme Reg.(1968)7:149:Holland
ら、Biochemistry(1978)17:4900)。当分野に公知の他
のプロモーターには、3-ホスホグリセレートキナーゼ
のプロモーターが含まれる(Hitzemanら、J. Biol. Che
m.(1980)255:2073)。さらに、増殖条件および/または
遺伝的背景によって制御される転写の利点を有する他の
プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソ
チトクロームC、酸性ホスファターゼ、窒素代謝関連の
分解酵素、αファクター系、およびマルトースおよびガ
ラクトースの利用に関する酵素のプロモーター領域であ
る。ターミネーター配列は、コード配列の3’末端にあ
ることが望ましい。このようなターミネーターは、酵母
由来の遺伝子のコード配列の後の3’非翻訳領域に見い
出される。
【0096】もちろん、多細胞生物由来の真核宿主細胞
培養物中のポリペプチドをコードする遺伝子を発現させ
ることもまた、可能である。例えば、Axelら、4,399,21
6を参照されたい。これらのシステムは、イントロンを
スプライスして除く能力という付加的な利点があるた
め、ゲノムフラグメントを直接発現させるのに用いられ
得る。これらのシステムにおいてはまた、ある種の天然
のタンパク質において生じるのと類似した翻訳後修飾が
行われ得る。有用な宿主細胞系にはVEROおよびHeLa細
胞、およびチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が
包含される。そのような細胞の発現ベクターは、通常、
哺乳類細胞に適合するプロモーターおよび制御配列を有
する。それらには、例えば、一般に使用されているシミ
アンウイルス40(SV40)由来の初期および後期プロモ
ーター(Fiersら、Nature(1978)273:113)あるいは例え
ばポリオーマ、アデノウイルス2、ウシパピローマウイ
ルス、またはトリ肉腫ウイルス由来の他のウイルスプロ
モーターがある。制御可能なプロモーターであるhMT-II
A(Karin, M. ら、Nature(1982) 299:797-802)もまた
使用され得る。哺乳類細胞宿主システムの形質転換の一
般的な状況はAxel(前出)に記載されている。「エンハ
ンサー」領域もまた、発現を最適化するのに重要である
ことは明らかである。これは一般に非コードDNA領域
においてプロモーター領域の上流または下流に見出され
る配列である。必要に応じて、ウイルス源から複製の起
点が得られうる。しかし、真核生物でのDNA複製にお
いては、染色体への組み込みは一般的なメカニズムであ
る。
培養物中のポリペプチドをコードする遺伝子を発現させ
ることもまた、可能である。例えば、Axelら、4,399,21
6を参照されたい。これらのシステムは、イントロンを
スプライスして除く能力という付加的な利点があるた
め、ゲノムフラグメントを直接発現させるのに用いられ
得る。これらのシステムにおいてはまた、ある種の天然
のタンパク質において生じるのと類似した翻訳後修飾が
行われ得る。有用な宿主細胞系にはVEROおよびHeLa細
胞、およびチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が
包含される。そのような細胞の発現ベクターは、通常、
哺乳類細胞に適合するプロモーターおよび制御配列を有
する。それらには、例えば、一般に使用されているシミ
アンウイルス40(SV40)由来の初期および後期プロモ
ーター(Fiersら、Nature(1978)273:113)あるいは例え
ばポリオーマ、アデノウイルス2、ウシパピローマウイ
ルス、またはトリ肉腫ウイルス由来の他のウイルスプロ
モーターがある。制御可能なプロモーターであるhMT-II
A(Karin, M. ら、Nature(1982) 299:797-802)もまた
使用され得る。哺乳類細胞宿主システムの形質転換の一
般的な状況はAxel(前出)に記載されている。「エンハ
ンサー」領域もまた、発現を最適化するのに重要である
ことは明らかである。これは一般に非コードDNA領域
においてプロモーター領域の上流または下流に見出され
る配列である。必要に応じて、ウイルス源から複製の起
点が得られうる。しかし、真核生物でのDNA複製にお
いては、染色体への組み込みは一般的なメカニズムであ
る。
【0097】形質転換 使用する宿主細胞に依存して、そのような細胞に適切な
標準的手法を用い、形質転換が行われる。原核生物ある
いは実質的に細胞壁バリアーを有する他の細胞には、塩
化カルシウムを用いたカルシウム処理[Cohen, S. N., P
NAS (1972) 69:2110に記載]あるいはRbCl2法[Maniatis
ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)
Cold Spring Harbor Press,p. 254およびHanahan, D.,
J. Mol.Biol. (1983)166:577-580に記載]が使用され得
る。そのような細胞壁を持たない哺乳類細胞について
は、リン酸カルシクム沈澱法[Grahamおよびvan der Eb,
Virology (1978) 52:546;必要に応じてWigler,M.
ら、Cell(1979)16:777-785のように改変される]が用い
られ得る。酵母への形質転換は、Beggs, J. D., Nature
(1978) 275:104-109またはHinnen, A. ら、PNAS(1978)7
5:1929の方法により行われ得る。
標準的手法を用い、形質転換が行われる。原核生物ある
いは実質的に細胞壁バリアーを有する他の細胞には、塩
化カルシウムを用いたカルシウム処理[Cohen, S. N., P
NAS (1972) 69:2110に記載]あるいはRbCl2法[Maniatis
ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)
Cold Spring Harbor Press,p. 254およびHanahan, D.,
J. Mol.Biol. (1983)166:577-580に記載]が使用され得
る。そのような細胞壁を持たない哺乳類細胞について
は、リン酸カルシクム沈澱法[Grahamおよびvan der Eb,
Virology (1978) 52:546;必要に応じてWigler,M.
ら、Cell(1979)16:777-785のように改変される]が用い
られ得る。酵母への形質転換は、Beggs, J. D., Nature
(1978) 275:104-109またはHinnen, A. ら、PNAS(1978)7
5:1929の方法により行われ得る。
【0098】ベクターの構築 ここで提供されるDNA配列の発現のための所望のコー
ドエレメントおよび制御エレメントを含む適切なベクタ
ーの構築には、当該技術分野で充分に理解されている標
準的な連結および制御酵素による手法が採用される。単
離されたプラスミド、DNA配列または合成されたオリ
ゴヌクレオチドを、開裂させ、整え、そして所望の形に
再連結させる。
ドエレメントおよび制御エレメントを含む適切なベクタ
ーの構築には、当該技術分野で充分に理解されている標
準的な連結および制御酵素による手法が採用される。単
離されたプラスミド、DNA配列または合成されたオリ
ゴヌクレオチドを、開裂させ、整え、そして所望の形に
再連結させる。
【0099】ベクターを形成するDNA配列は、多くの
ソースから入手可能である。バックボーンのベクターお
よび制御システムは、通常、構築における配列の大部分
として用いられる利用可能な「宿主」ベクターに見い出
される。典型的な配列は上記の宿主および制御配列に述
べられている。適切なコード配列については、構築の最
初の工程は、cDNAまたはゲノムDNAライブラリー
から適切な配列を回収することであり得、通常そうであ
る。しかし、ひとたびその配列が開示されれば、遺伝子
配列の全体を、個々のヌクレオチド誘導体からインビト
ロで合成することが可能である。かなり長い遺伝子の全
体の配列、例えば500-1000bpは、オーバーラップする相
補的な個々のヌクレオチドを合成し、そして、デオキシ
リボヌクレオチド三リン酸の存在下でDNAポリメラー
ゼを用いて一本鎖のオーバーラップしない部分を埋める
ことにより、調製され得る。このアプローチは、既知の
配列のいくつかの遺伝子の構築に成功裏に用いられてい
る。例えば、Edge, M.D.,Nature(1981) 292:756;Nambai
r, K.P.ら、Science(1984)223:1299;Jay, Ernest,J. B
iol. Chem.(1984)259:6311を参照されたい。
ソースから入手可能である。バックボーンのベクターお
よび制御システムは、通常、構築における配列の大部分
として用いられる利用可能な「宿主」ベクターに見い出
される。典型的な配列は上記の宿主および制御配列に述
べられている。適切なコード配列については、構築の最
初の工程は、cDNAまたはゲノムDNAライブラリー
から適切な配列を回収することであり得、通常そうであ
る。しかし、ひとたびその配列が開示されれば、遺伝子
配列の全体を、個々のヌクレオチド誘導体からインビト
ロで合成することが可能である。かなり長い遺伝子の全
体の配列、例えば500-1000bpは、オーバーラップする相
補的な個々のヌクレオチドを合成し、そして、デオキシ
リボヌクレオチド三リン酸の存在下でDNAポリメラー
ゼを用いて一本鎖のオーバーラップしない部分を埋める
ことにより、調製され得る。このアプローチは、既知の
配列のいくつかの遺伝子の構築に成功裏に用いられてい
る。例えば、Edge, M.D.,Nature(1981) 292:756;Nambai
r, K.P.ら、Science(1984)223:1299;Jay, Ernest,J. B
iol. Chem.(1984)259:6311を参照されたい。
【0100】合成オリゴヌクレオチドは、ホスホトリエ
ステル法[Edgeら、Nature(前出)およびDuckworthら、
Nucleic Acids Res.(1981) 9:1691に記載]またはホスホ
ルアミダイト法[Beaucage, S. L., およびCaruthers,
M.H. Tet. Letts. (1981)22:1859およびMatteucci, M.
D., およびCaruthers, M. H., J. Am. Chem. Soc.(198
1) 103:3185に記載]により調製され、そして、市販の自
動オリゴヌクレオチド合成装置により調製され得る。ア
ニーリングに先立つ一本鎖のリン酸化または標識のため
のリン酸化は、1ナノモルの基質に対して過剰量(例え
ば約10ユニット)のポリヌクレオチドキナーゼを用い、
50mM Tris、pH7.6、10mM MgCl2、5mMジチオスレイトー
ル、1-2mM ATP、1.7ピコモル γ-32P-ATP(2.9mCi/mmo
le)、0.1mMスペルミジン、0.1mM EDTAの存在下で達成
される。
ステル法[Edgeら、Nature(前出)およびDuckworthら、
Nucleic Acids Res.(1981) 9:1691に記載]またはホスホ
ルアミダイト法[Beaucage, S. L., およびCaruthers,
M.H. Tet. Letts. (1981)22:1859およびMatteucci, M.
D., およびCaruthers, M. H., J. Am. Chem. Soc.(198
1) 103:3185に記載]により調製され、そして、市販の自
動オリゴヌクレオチド合成装置により調製され得る。ア
ニーリングに先立つ一本鎖のリン酸化または標識のため
のリン酸化は、1ナノモルの基質に対して過剰量(例え
ば約10ユニット)のポリヌクレオチドキナーゼを用い、
50mM Tris、pH7.6、10mM MgCl2、5mMジチオスレイトー
ル、1-2mM ATP、1.7ピコモル γ-32P-ATP(2.9mCi/mmo
le)、0.1mMスペルミジン、0.1mM EDTAの存在下で達成
される。
【0101】所望のベクターの成分がひとたびこのよう
にして利用可能となれば、それらは、標準的な制限切断
および連結の方法を用いて切断および連結され得る。
にして利用可能となれば、それらは、標準的な制限切断
および連結の方法を用いて切断および連結され得る。
【0102】部位特異的なDNAの切断は、当該技術分
野で一般に理解されている条件下で、適当な制限酵素
(または酵素)で処理することにより達成され、そし
て、その詳細は、これらの市販の制限酵素の製造者によ
り規定されている。例えば、NewEngland Biolabsの製品
カタログを参照されたい。通常、約1μgのプラスミド
またはDNA配列は、バッファー溶液約20μ中の1ユニ
ットの酵素で切断される。ここでの実施例においては、
典型的には、DNA基質の消化を完全にするために過剰
の制限酵素が用いられる。実施可能なインキュベートの
時間は約37℃において約1時間から2時間であるが、そ
れは変更され得る。インキュベートの後、タンパク質
は、フェノール/クロロホルムによる抽出によって除去
され、そしてその後にエーテル抽出し得、そして核酸
は、エタノール沈澱により水性フラクションから回収さ
れる。必要であれば、標準法を用いたポリアクリルアミ
ドゲルまたはアガロースゲル電気泳動による、切断され
たフラグメントのサイズ分離がなされ得る。サイズ分離
の一般的な記載は、Methods in Enzymology(1980) 65:4
99-560に見い出される。
野で一般に理解されている条件下で、適当な制限酵素
(または酵素)で処理することにより達成され、そし
て、その詳細は、これらの市販の制限酵素の製造者によ
り規定されている。例えば、NewEngland Biolabsの製品
カタログを参照されたい。通常、約1μgのプラスミド
またはDNA配列は、バッファー溶液約20μ中の1ユニ
ットの酵素で切断される。ここでの実施例においては、
典型的には、DNA基質の消化を完全にするために過剰
の制限酵素が用いられる。実施可能なインキュベートの
時間は約37℃において約1時間から2時間であるが、そ
れは変更され得る。インキュベートの後、タンパク質
は、フェノール/クロロホルムによる抽出によって除去
され、そしてその後にエーテル抽出し得、そして核酸
は、エタノール沈澱により水性フラクションから回収さ
れる。必要であれば、標準法を用いたポリアクリルアミ
ドゲルまたはアガロースゲル電気泳動による、切断され
たフラグメントのサイズ分離がなされ得る。サイズ分離
の一般的な記載は、Methods in Enzymology(1980) 65:4
99-560に見い出される。
【0103】制限切断フラグメントは、次の条件で平滑
末端とされ得る。つまり、4種のデオキシヌクレオチド
三リン酸(dNTP)の存在下でE. coli DNAポリメラーゼ
Iのラージフラグメント(クレノウ)で、50mM Tris pH
7.6, 50mM NaCl, 6mM MgCl2,6mM DTTおよび0.1-1.0mM d
NTP中において20から25℃で約15から25分間インキュベ
ートして処理することにより、平滑末端とされ得る。。
クレノウフラグメントは、5’の一本鎖のオーバーハン
グを埋めるが、4種のdNTPが存在しているときにも突出
している3’の一本鎖を削っていく。必要に応じて、オ
ーバーハングの性質により指示される制限の範囲内にお
いて、dNTPのうちのただ1種、または選択されたdNTPを
供給することにより、選択的修復がなされ得る。クレノ
ウ処理した後、混合物をフェノール/クロロホルムで抽
出し、エタノール沈澱させる。S1ヌクレアーゼまたは
BAL-31を用いた適当な条件での処理により、一本鎖部分
のいずれもが加水分解される。
末端とされ得る。つまり、4種のデオキシヌクレオチド
三リン酸(dNTP)の存在下でE. coli DNAポリメラーゼ
Iのラージフラグメント(クレノウ)で、50mM Tris pH
7.6, 50mM NaCl, 6mM MgCl2,6mM DTTおよび0.1-1.0mM d
NTP中において20から25℃で約15から25分間インキュベ
ートして処理することにより、平滑末端とされ得る。。
クレノウフラグメントは、5’の一本鎖のオーバーハン
グを埋めるが、4種のdNTPが存在しているときにも突出
している3’の一本鎖を削っていく。必要に応じて、オ
ーバーハングの性質により指示される制限の範囲内にお
いて、dNTPのうちのただ1種、または選択されたdNTPを
供給することにより、選択的修復がなされ得る。クレノ
ウ処理した後、混合物をフェノール/クロロホルムで抽
出し、エタノール沈澱させる。S1ヌクレアーゼまたは
BAL-31を用いた適当な条件での処理により、一本鎖部分
のいずれもが加水分解される。
【0104】連結は、次の標準条件および温度で、15-5
0μlの容量でなされ得る。例えば、60mM Tris-Cl pH7.
5、16mM MgCl2、10mM DTT、33μg/ml BSA、および0℃
にて40μM ATP 0.01-0.02(Weiss)ユニットのT4 DNAリガ
ーゼ(「粘着末端」の連結用)、または14℃にて1mM A
TP, 0.3-0.6(Weiss)ユニットのT4 DNAリガーゼ(「平滑
末端」の連結用)の条件および温度でなされ得る。分子
間の「粘着末端」の連結は、通常、DNAの総濃度が33
-100μg/ml(最終総濃度5-100nM)で、達成される。分
子間の平滑末端の連結は、最終総濃度1μMにて達成さ
れる。
0μlの容量でなされ得る。例えば、60mM Tris-Cl pH7.
5、16mM MgCl2、10mM DTT、33μg/ml BSA、および0℃
にて40μM ATP 0.01-0.02(Weiss)ユニットのT4 DNAリガ
ーゼ(「粘着末端」の連結用)、または14℃にて1mM A
TP, 0.3-0.6(Weiss)ユニットのT4 DNAリガーゼ(「平滑
末端」の連結用)の条件および温度でなされ得る。分子
間の「粘着末端」の連結は、通常、DNAの総濃度が33
-100μg/ml(最終総濃度5-100nM)で、達成される。分
子間の平滑末端の連結は、最終総濃度1μMにて達成さ
れる。
【0105】「ベクターフラグメント」を用いるベクタ
ーの構築においては、該ベクターフラグメントは、5’
リン酸を除去し該ベクターの自己連結を阻止するために
通常、細菌アルカリホスファターゼ(BAP)または仔ウ
シ腸アルカリホスファターゼ(CIP)により処理され
る。消化は、1μgのベクターあたり1ユニットのBAP
を用い、pH8で約10mM Tris-HCl, 1mM EDTA中、60℃にて
約1時間;あるいは、50mMTris-HCl (pH9.0)、1mM MgCl
2、0.1mM ZnCl2、1mMスペルミジン、1ユニットのCIP
中、37℃にて60分間(5’末端突出用)または、37℃に
て15分間、次いで56℃にて15分間(平滑末端または凹部
5’末端用)、なされる。核酸フラグメントを回収する
ために、調製物は、フェノール/クロロホルムで抽出さ
れ、エタノール沈澱がなされる。あるいは、2回消化さ
れたベクターにおいて、さらに制限酵素による消化を行
い、所望でないフラグメントを分離することにより、該
ベクターの再結合が阻止され得る。
ーの構築においては、該ベクターフラグメントは、5’
リン酸を除去し該ベクターの自己連結を阻止するために
通常、細菌アルカリホスファターゼ(BAP)または仔ウ
シ腸アルカリホスファターゼ(CIP)により処理され
る。消化は、1μgのベクターあたり1ユニットのBAP
を用い、pH8で約10mM Tris-HCl, 1mM EDTA中、60℃にて
約1時間;あるいは、50mMTris-HCl (pH9.0)、1mM MgCl
2、0.1mM ZnCl2、1mMスペルミジン、1ユニットのCIP
中、37℃にて60分間(5’末端突出用)または、37℃に
て15分間、次いで56℃にて15分間(平滑末端または凹部
5’末端用)、なされる。核酸フラグメントを回収する
ために、調製物は、フェノール/クロロホルムで抽出さ
れ、エタノール沈澱がなされる。あるいは、2回消化さ
れたベクターにおいて、さらに制限酵素による消化を行
い、所望でないフラグメントを分離することにより、該
ベクターの再結合が阻止され得る。
【0106】配列の改変を必要とする、ベクターのcD
NAあるいはゲノムDNA由来の部分には、部位特異的
プライマー変異導入が用いられる(Zoller, M.J.および
Smith, M. のNucleic Acids Res. (1982) 10:6487-6500
およびAdelman, J.P.らのDNA(1983)2:183-193)。こ
れは、所望の変異を表す限局された変異以外は変異させ
る一本鎖ファージDNAに相補的な、合成オリゴヌクレ
オチドプライマーを用いて行った。簡単に説明すると、
合成オリゴヌクレオチドはファージに相補的なDNA鎖
の合成を開始させるプライマーとして使用され、得られ
た部分的あるいは全長の二本鎖DNAでファージを養っ
ている宿主細菌を形質転換する。形質転換された細菌の
培養物を上部寒天に蒔き、ファージを有する単一の細胞
からプラークを形成させる。
NAあるいはゲノムDNA由来の部分には、部位特異的
プライマー変異導入が用いられる(Zoller, M.J.および
Smith, M. のNucleic Acids Res. (1982) 10:6487-6500
およびAdelman, J.P.らのDNA(1983)2:183-193)。こ
れは、所望の変異を表す限局された変異以外は変異させ
る一本鎖ファージDNAに相補的な、合成オリゴヌクレ
オチドプライマーを用いて行った。簡単に説明すると、
合成オリゴヌクレオチドはファージに相補的なDNA鎖
の合成を開始させるプライマーとして使用され、得られ
た部分的あるいは全長の二本鎖DNAでファージを養っ
ている宿主細菌を形質転換する。形質転換された細菌の
培養物を上部寒天に蒔き、ファージを有する単一の細胞
からプラークを形成させる。
【0107】理論的には、新しいプラークの50%は、変
異した一本鎖を有するファージを持ち、50%は元の配列
を有する。得られたプラークのニトロセルロース上のプ
ラークリフトを、キナーゼ処理した合成プライマーとハ
イブリダイズさせた後、正確にマッチするものは結合さ
せるが、元のストランドとマッチしないものは結合させ
ないのに充分な洗浄温度で洗浄する。次に、プローブと
ハイブリダイズするプラークを取り出し、培養し、そし
てDNAを回収する。
異した一本鎖を有するファージを持ち、50%は元の配列
を有する。得られたプラークのニトロセルロース上のプ
ラークリフトを、キナーゼ処理した合成プライマーとハ
イブリダイズさせた後、正確にマッチするものは結合さ
せるが、元のストランドとマッチしないものは結合させ
ないのに充分な洗浄温度で洗浄する。次に、プローブと
ハイブリダイズするプラークを取り出し、培養し、そし
てDNAを回収する。
【0108】構築の確認 以下に述べる構築では、プラスミド構築のためのライゲ
ーションが正しく行われていることを、M. Casadaban博
士より得たE. coli株MC1061(Casadaban, M.ら、J. Mol.
Biol.(1980)138:179-207)、あるいは他の適切な宿主を
先ずライゲーション反応混合物で形質転換することによ
って確認する。成功した形質転換体を、当該分野で知ら
れているように、プラスミド構築の形態によって、アン
ピシリン、テトラサイクリン、あるいは他の抗生物質へ
の耐性によって、あるいは他のマーカーを用いて選択す
る。次に、Clewell, D.B.ら、PNAS(1969)62:1159の方法
に準じて、必要に応じてクロラムフェニコールでの増幅
(Clewell, D.B., J.Bacterial.(1972)110:667)後、形質
転換体からプラスミドを調製する。通常、例えば、Holm
es, D.S.ら、Anal. Biochem. (1981)114:193-197および
Birnboim, H.C.ら、Nucleic Acids Res. (1979) 7:1513
-1523のようにいくつかのミニDNAプレップが使用さ
れる。単離されたDNAを制限酵素によって分析し、お
よび/あるいは、Sanger, F. ら、PNAS(1977) 74:5463
の方法であり、さらにMessingらのNucleic Acids Res.
(1981)9:309に記載のジデオキシヌクレオチド法、ある
いはMaxamらのMethods in Enzymology(1980)65:499の方
法により配列決定される。
ーションが正しく行われていることを、M. Casadaban博
士より得たE. coli株MC1061(Casadaban, M.ら、J. Mol.
Biol.(1980)138:179-207)、あるいは他の適切な宿主を
先ずライゲーション反応混合物で形質転換することによ
って確認する。成功した形質転換体を、当該分野で知ら
れているように、プラスミド構築の形態によって、アン
ピシリン、テトラサイクリン、あるいは他の抗生物質へ
の耐性によって、あるいは他のマーカーを用いて選択す
る。次に、Clewell, D.B.ら、PNAS(1969)62:1159の方法
に準じて、必要に応じてクロラムフェニコールでの増幅
(Clewell, D.B., J.Bacterial.(1972)110:667)後、形質
転換体からプラスミドを調製する。通常、例えば、Holm
es, D.S.ら、Anal. Biochem. (1981)114:193-197および
Birnboim, H.C.ら、Nucleic Acids Res. (1979) 7:1513
-1523のようにいくつかのミニDNAプレップが使用さ
れる。単離されたDNAを制限酵素によって分析し、お
よび/あるいは、Sanger, F. ら、PNAS(1977) 74:5463
の方法であり、さらにMessingらのNucleic Acids Res.
(1981)9:309に記載のジデオキシヌクレオチド法、ある
いはMaxamらのMethods in Enzymology(1980)65:499の方
法により配列決定される。
【0109】実施例の宿主 本明細書中のクローニングおよび原核細胞での発現に使
用される宿主は次のものである:クローニングおよびシ
ーケンシング、およびほとんどの細菌のプロモーター制
御下での構築物の発現には、B、MC1061、DH1、RR1、C6
00hfl-、K803、HB101、JA221、JM101およびJM103のよう
なE. coliの株を使用した。
用される宿主は次のものである:クローニングおよびシ
ーケンシング、およびほとんどの細菌のプロモーター制
御下での構築物の発現には、B、MC1061、DH1、RR1、C6
00hfl-、K803、HB101、JA221、JM101およびJM103のよう
なE. coliの株を使用した。
【0110】方法の説明 次の実施例は、本発明をより良く理解するために説明す
ることを目的とする。しかし、実施例は、本発明の範囲
をいかなる場合にも限定することを意図しない。血管内
皮細胞増殖因子をコードするDNAは、濾胞星状細胞ポ
リ(A)*RNAの調製物中の所望の配列を増幅して、重要
なプローブを先ず取ることから最初は得られる。しか
し、この方法を繰り返すことは必ずしも必要ではない。
なぜならば、重要なプローブの配列は、現在では知られ
ており、化学的にインビトロで構築し得るからである。
さらに、図3aに示す配列を有するプラスミドが、アメ
リカンタイプカルチャーコレクション(American Type
Culture Collection)、Rockville, MDに寄託されてい
る。
ることを目的とする。しかし、実施例は、本発明の範囲
をいかなる場合にも限定することを意図しない。血管内
皮細胞増殖因子をコードするDNAは、濾胞星状細胞ポ
リ(A)*RNAの調製物中の所望の配列を増幅して、重要
なプローブを先ず取ることから最初は得られる。しか
し、この方法を繰り返すことは必ずしも必要ではない。
なぜならば、重要なプローブの配列は、現在では知られ
ており、化学的にインビトロで構築し得るからである。
さらに、図3aに示す配列を有するプラスミドが、アメ
リカンタイプカルチャーコレクション(American Type
Culture Collection)、Rockville, MDに寄託されてい
る。
【0111】次の実施例では、以下に記載のバッファー
は、示されている組成物を含有する:
は、示されている組成物を含有する:
【0112】
【表1】
【0113】
【実施例】実施例1 濾胞星状細胞mRNAからのプローブの増幅 図2を参照して、ウシ濾胞星状細胞(細胞は、Ferrara,
N.らのMethods in Enzymology, Conn,P.M.編、 Vol.1
24, pp 245-253, Academic Press, N.Y.(1986):Ferrar
a, N.ら、(1987) PNAS, 84:5773-5777に記載のように単
離した)の5μgのポリ(A)+RNAを、ウシ血管内皮細
胞増殖因子の既知のアミノ酸35位から39位の配列に基づ
く1μgのアンチセンスプライマーオリゴヌクレオチド
とともに、エタノール沈澱した。#4296と命名したこの
オリゴヌクレオチドは、16倍の縮重(degeneracy)を有
する24-merである。縮重は、アミノ酸35位から39位をコ
ードするアンチセンスストランドに相当する14塩基の領
域に限定された。14塩基の5’側末端に、EcoRI制限部
位を有する10塩基のリンカーを加えた。オリゴヌクレオ
チドプライマーの配列は以下の通りである:
N.らのMethods in Enzymology, Conn,P.M.編、 Vol.1
24, pp 245-253, Academic Press, N.Y.(1986):Ferrar
a, N.ら、(1987) PNAS, 84:5773-5777に記載のように単
離した)の5μgのポリ(A)+RNAを、ウシ血管内皮細
胞増殖因子の既知のアミノ酸35位から39位の配列に基づ
く1μgのアンチセンスプライマーオリゴヌクレオチド
とともに、エタノール沈澱した。#4296と命名したこの
オリゴヌクレオチドは、16倍の縮重(degeneracy)を有
する24-merである。縮重は、アミノ酸35位から39位をコ
ードするアンチセンスストランドに相当する14塩基の領
域に限定された。14塩基の5’側末端に、EcoRI制限部
位を有する10塩基のリンカーを加えた。オリゴヌクレオ
チドプライマーの配列は以下の通りである:
【0114】
【化1】
【0115】mRNAおよびオリゴヌクレオチドを、55μl
の36mM KCl、9mM MgCl2、45mM Tris pH 7.5、12単位の
RNasinおよび各々0.5mMの4つのdNTPに溶解した。サン
プルを70℃まで2分間加熱し、次いで室温に戻した。プ
ライマーのハイブリダイゼーション部位に隣接するmRNA
の一部に相補的なDNAアンチセンスストランドの合成
のために、60単位のトリ骨髄芽球症ウイルス(avian my
eloblastosis virus)の逆転写酵素を加え、次いで室温
で2分間反応させ、そして42℃に45分間置いた。次にサ
ンプルをフェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタ
ノールで沈澱させて乾燥させた。
の36mM KCl、9mM MgCl2、45mM Tris pH 7.5、12単位の
RNasinおよび各々0.5mMの4つのdNTPに溶解した。サン
プルを70℃まで2分間加熱し、次いで室温に戻した。プ
ライマーのハイブリダイゼーション部位に隣接するmRNA
の一部に相補的なDNAアンチセンスストランドの合成
のために、60単位のトリ骨髄芽球症ウイルス(avian my
eloblastosis virus)の逆転写酵素を加え、次いで室温
で2分間反応させ、そして42℃に45分間置いた。次にサ
ンプルをフェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタ
ノールで沈澱させて乾燥させた。
【0116】次に、最初に合成したストランドの全てを
鋳型として使用して、第二のDNAストランドを合成し
た。第二のストランドの合成のために、乾燥したペレッ
トを50μlの50mM NaCl、7mM MgCl2、7mM Tris pH 7.5
および各々1mMの4つのdNTPに溶解した。さらに、ウシ
血管内皮細胞増殖因子の既知のアミノ酸の15位から19位
の配列に基づく、センスストランドオリゴヌクレオチド
プライマー1μgを加えた。#4295と命名されたオリゴ
ヌクレオチドは、8倍の縮重を有する24-merであった。
縮重は、アミノ酸の15位から19位のコード領域のセンス
ストランドに相当する14塩基の領域に限定された。これ
らの14塩基の5’側末端に、HindIII制限部位を有する1
0塩基のリンカーを加えた。オリゴヌクレオチドプライ
マーの配列は以下の通りである:
鋳型として使用して、第二のDNAストランドを合成し
た。第二のストランドの合成のために、乾燥したペレッ
トを50μlの50mM NaCl、7mM MgCl2、7mM Tris pH 7.5
および各々1mMの4つのdNTPに溶解した。さらに、ウシ
血管内皮細胞増殖因子の既知のアミノ酸の15位から19位
の配列に基づく、センスストランドオリゴヌクレオチド
プライマー1μgを加えた。#4295と命名されたオリゴ
ヌクレオチドは、8倍の縮重を有する24-merであった。
縮重は、アミノ酸の15位から19位のコード領域のセンス
ストランドに相当する14塩基の領域に限定された。これ
らの14塩基の5’側末端に、HindIII制限部位を有する1
0塩基のリンカーを加えた。オリゴヌクレオチドプライ
マーの配列は以下の通りである:
【0117】
【化2】
【0118】サンプルを100℃に2分間加熱し、次いで2
8℃に戻した。第二ストランドの合成は、10単位のDN
Aポリメラーゼ、すなわちクレノウフラグメントを加え
て、28℃で10分間行われた。その後、ポリメラーゼ酵素
を100℃で2分間加熱して不活化した。
8℃に戻した。第二ストランドの合成は、10単位のDN
Aポリメラーゼ、すなわちクレノウフラグメントを加え
て、28℃で10分間行われた。その後、ポリメラーゼ酵素
を100℃で2分間加熱して不活化した。
【0119】2つのプライマーのハイブリダイゼーショ
ン部位の間にわたるDNA配列を、自動サーマルサイク
ラー(Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler)での
酵素触媒による重合反応の一連の繰り返しにより増幅し
た。チェーン反応には、5μlの上述の反応物を、1×
の反応混合物に、10μlの10×Taq混合バッファー(Cetu
s Corp.のポリメラーゼチェーンリアクションキット中
に供給されている)、52μl dH2Oおよび4つのdNTPすべ
てを1.25mMずつ含有する16μlを加えて100μlとした。
さらに、10%(最終濃度)のDMSO、および上述の1μgの
各センスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドを、Cetus kitに入っているTaqポリメラー
ゼ2μlとともに加えた。反応混合物に200μlのミネラ
ルオイルを重層し、そしてサーマルサイクラーに入れ
た。サイクラーを次のサイクルを繰り返すようにプログ
ラムした: 1.94℃で1分間、変性 2.55℃で2分間、アニール 3.72℃で3.5分間、DNA合成。
ン部位の間にわたるDNA配列を、自動サーマルサイク
ラー(Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler)での
酵素触媒による重合反応の一連の繰り返しにより増幅し
た。チェーン反応には、5μlの上述の反応物を、1×
の反応混合物に、10μlの10×Taq混合バッファー(Cetu
s Corp.のポリメラーゼチェーンリアクションキット中
に供給されている)、52μl dH2Oおよび4つのdNTPすべ
てを1.25mMずつ含有する16μlを加えて100μlとした。
さらに、10%(最終濃度)のDMSO、および上述の1μgの
各センスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドを、Cetus kitに入っているTaqポリメラー
ゼ2μlとともに加えた。反応混合物に200μlのミネラ
ルオイルを重層し、そしてサーマルサイクラーに入れ
た。サイクラーを次のサイクルを繰り返すようにプログ
ラムした: 1.94℃で1分間、変性 2.55℃で2分間、アニール 3.72℃で3.5分間、DNA合成。
【0120】増幅反応は、30サイクル行った。
【0121】増幅反応物のDNAの一部(20μl)を、H
aeIIIで消化したpUC8 DNAをサイズマーカーに用いて、
6%のポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲル
を臭化エチジウムで染色した。染色したゲルを図5に示
す。主要なバンド(図5で、矢印で指す)は、80と100
塩基対との間の塩基対であり、2つのオリゴヌクレオチ
ドプライマーおよび2つのプライマーに囲まれたアミノ
酸コード領域のセグメントをコードするのに適切な長さ
のDNA(94塩基対)に相当した。このバンドをゲルか
ら切り出し、ゲル片からDNAを、0.5×Tris-ホウ酸
EDTAバッファー(0.045M Tris base、0.045Mホウ酸、0.
001M EDTA)中で30ボルトで電気溶出した。得られたD
NAをエタノールで沈澱させた。
aeIIIで消化したpUC8 DNAをサイズマーカーに用いて、
6%のポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲル
を臭化エチジウムで染色した。染色したゲルを図5に示
す。主要なバンド(図5で、矢印で指す)は、80と100
塩基対との間の塩基対であり、2つのオリゴヌクレオチ
ドプライマーおよび2つのプライマーに囲まれたアミノ
酸コード領域のセグメントをコードするのに適切な長さ
のDNA(94塩基対)に相当した。このバンドをゲルか
ら切り出し、ゲル片からDNAを、0.5×Tris-ホウ酸
EDTAバッファー(0.045M Tris base、0.045Mホウ酸、0.
001M EDTA)中で30ボルトで電気溶出した。得られたD
NAをエタノールで沈澱させた。
【0122】実施例2 増幅したプローブのサブクローニングおよび配列決定 実施例1に記載のようにゲルから電気溶出したDNA
を、バクテリオファージM13mp18およびM13mp19中にサブ
クローニングした。ゲルから得られたDNAの半分を、
20μlの水に溶解し、HindIII消化の標準的バッファー中
で、HindIIIで90分間、37℃で消化した。反応液のTris-
HCl(pH 7.5)の濃度を85mMに上げてEcoRIを加え、反応液
をさらに37℃で90分間インキュベートした。別の反応で
は、次に反応当り約10分の1の消化した調製物を、T4 D
NAリガーゼの存在下で、HindIIIおよびEcoRIで消化した
M13mp18ファージおよびM13mp19ファージの2本鎖DNA
(Yanisch-Perronら、Gene(1985) 33:103)とライゲー
トした。次に、標準の方法を用いて各々のライゲーショ
ン反応混合物でE. coli JM103をトランスフェクトし、
そして5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラ
クトピラノシド(X-gal)およびイソプロピル-β-D-チ
オガラクトピラノシド(IPTG)を含有するLプレート上
に蒔いた。M13mp19との反応の場合には、プレートにプ
ラークが形成された後、プラークの一部をニトロセルロ
ースフィルターペーパーに移し、標準の方法でNaOHで処
理して溶菌し、そして80℃で2時間、バキュームオーブ
ン中で焼き付けた。所望の挿入配列の存在をスクリーニ
ングするために、プラークリフトを放射標識したオリゴ
ヌクレオチドプライマー#4296のサンプルでプローブし
た。プローブ#4296は、プラークリフトの多くのプラー
クとハイブリダイズし、そのうちの4つをさらなる分析
のために選んだ。M13mp18との反応の場合には、白いプ
ラークが、挿入フラグメントがファージベクターのEcoR
IおよびHindIII部位との間にライゲートされたことを示
すことに基づいて、さらなる分析のために4つのプラー
クを拾い上げた。
を、バクテリオファージM13mp18およびM13mp19中にサブ
クローニングした。ゲルから得られたDNAの半分を、
20μlの水に溶解し、HindIII消化の標準的バッファー中
で、HindIIIで90分間、37℃で消化した。反応液のTris-
HCl(pH 7.5)の濃度を85mMに上げてEcoRIを加え、反応液
をさらに37℃で90分間インキュベートした。別の反応で
は、次に反応当り約10分の1の消化した調製物を、T4 D
NAリガーゼの存在下で、HindIIIおよびEcoRIで消化した
M13mp18ファージおよびM13mp19ファージの2本鎖DNA
(Yanisch-Perronら、Gene(1985) 33:103)とライゲー
トした。次に、標準の方法を用いて各々のライゲーショ
ン反応混合物でE. coli JM103をトランスフェクトし、
そして5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラ
クトピラノシド(X-gal)およびイソプロピル-β-D-チ
オガラクトピラノシド(IPTG)を含有するLプレート上
に蒔いた。M13mp19との反応の場合には、プレートにプ
ラークが形成された後、プラークの一部をニトロセルロ
ースフィルターペーパーに移し、標準の方法でNaOHで処
理して溶菌し、そして80℃で2時間、バキュームオーブ
ン中で焼き付けた。所望の挿入配列の存在をスクリーニ
ングするために、プラークリフトを放射標識したオリゴ
ヌクレオチドプライマー#4296のサンプルでプローブし
た。プローブ#4296は、プラークリフトの多くのプラー
クとハイブリダイズし、そのうちの4つをさらなる分析
のために選んだ。M13mp18との反応の場合には、白いプ
ラークが、挿入フラグメントがファージベクターのEcoR
IおよびHindIII部位との間にライゲートされたことを示
すことに基づいて、さらなる分析のために4つのプラー
クを拾い上げた。
【0123】M13mp18およびM13mp19で感染させたプレー
トの各々から拾い上げた4つのプラークをJM103に感染
させ、標準の方法を用いて感染した培養物から複製型
(RF)DNAを調製した。次に、各感染物からRF DNA
を、HaeIIIで切断し、ポリアクリルアミドゲルに流し
た。電気泳動は、サイズマーカーにHaeIIIで切断したpU
C8およびHaeIIIで切断したM13mp18 RFを用いて、行っ
た。臭化エチジウムで染色後、8つのサンプルのレーン
全てのDNAは、ポリメラーゼチェーンリアクションで
用いるプライマーの設計に使用されたアミノ酸配列を含
む、その2つのアミノ酸配列の間にあるアミノ配列をコ
ードする正しいサイズの挿入物を有することが示され
た。
トの各々から拾い上げた4つのプラークをJM103に感染
させ、標準の方法を用いて感染した培養物から複製型
(RF)DNAを調製した。次に、各感染物からRF DNA
を、HaeIIIで切断し、ポリアクリルアミドゲルに流し
た。電気泳動は、サイズマーカーにHaeIIIで切断したpU
C8およびHaeIIIで切断したM13mp18 RFを用いて、行っ
た。臭化エチジウムで染色後、8つのサンプルのレーン
全てのDNAは、ポリメラーゼチェーンリアクションで
用いるプライマーの設計に使用されたアミノ酸配列を含
む、その2つのアミノ酸配列の間にあるアミノ配列をコ
ードする正しいサイズの挿入物を有することが示され
た。
【0124】正しい長さの挿入配列を有することを示し
たM13mp19プラークの1つ、および4つのM13mp18プラー
クをさらなる分析のために、拾い上げた。次に一本鎖D
NAを、配列決定のために、標準の方法(Messing, J.,
Methods in Enzymology (1983)101:20-78)で調製し
た。5つの単離したクローン中の挿入配列を図1に示
す。4つのM13mp18クローンのシーケンシングゲルの1
つの領域(図1のヌクレオチド32-35)は、明確に解読
し得なかった。M13mp18の配列の解読できない領域を除
いて、5つの配列決定したクローンのうちの4つは、ポ
リメラーゼチェーンリアクションで使用した2つのプラ
イマー配列がハイブリダイズする部位およびその間にあ
るmRNAの領域にコードされる、ウシ血管内皮細胞増殖因
子のその部分に相当する同じアミノ酸配列をコードして
いた。5つ目の配列決定したクローンは、コードするア
ミノ酸の1つが異なり、それは、ウシ血管内皮細胞増殖
因子のアミノ酸27位に相当し、Pro(CCC)ではなくHis(CA
C)をコードする。図1は、5つのクローンの挿入物のD
NA配列および、M13mp19クローン挿入物のコンセンサ
スDNA配列および推定アミノ酸配列を示す。5つの単
離された配列のほとんどの非相同ヌクレオチドは、ポリ
メラーゼチェーンリアクションに使用したプライマー配
列にあり、これは、場合によっては、ヌクレオチドミス
マッチを1つ有するプライマーの縮重オリゴヌクレオチ
ドが、血管内皮細胞mRNA中のタンパク質をコードする配
列にハイブリダイズして、そして増幅されたことを示す
ことがわかる。他の配列の違いは、たぶん、ポリメラー
ゼのエラーか、あるいは血管内皮細胞増殖因子mRNAの多
型性であろう。これらの配列は、天然のDNA配列に正
確には対応しないが、それにもかかわらず、5つのうち
の4つは血管内皮細胞増殖因子の正しいアミノ酸配列
(M13mp18クローンの解読できない領域を除いて)をコ
ードする。さらに、それらは、ウシ血管内皮細胞増殖因
子の全長DNA配列の単離あるいはウシ以外の種のこれ
に相当するタンパク質をコードするDNAの単離のため
のプローブとして使用し得る。増幅されたDNAが、M1
3mp19にライゲートされている、拾い上げたファージ
を、pET-19Aと命名しなおした;以下の実施例3に述べ
るように、このファージに挿入されたフラグメントを、
濾胞星状細胞cDNAライブラリーをスクリーニングす
るプローブとして使用した。
たM13mp19プラークの1つ、および4つのM13mp18プラー
クをさらなる分析のために、拾い上げた。次に一本鎖D
NAを、配列決定のために、標準の方法(Messing, J.,
Methods in Enzymology (1983)101:20-78)で調製し
た。5つの単離したクローン中の挿入配列を図1に示
す。4つのM13mp18クローンのシーケンシングゲルの1
つの領域(図1のヌクレオチド32-35)は、明確に解読
し得なかった。M13mp18の配列の解読できない領域を除
いて、5つの配列決定したクローンのうちの4つは、ポ
リメラーゼチェーンリアクションで使用した2つのプラ
イマー配列がハイブリダイズする部位およびその間にあ
るmRNAの領域にコードされる、ウシ血管内皮細胞増殖因
子のその部分に相当する同じアミノ酸配列をコードして
いた。5つ目の配列決定したクローンは、コードするア
ミノ酸の1つが異なり、それは、ウシ血管内皮細胞増殖
因子のアミノ酸27位に相当し、Pro(CCC)ではなくHis(CA
C)をコードする。図1は、5つのクローンの挿入物のD
NA配列および、M13mp19クローン挿入物のコンセンサ
スDNA配列および推定アミノ酸配列を示す。5つの単
離された配列のほとんどの非相同ヌクレオチドは、ポリ
メラーゼチェーンリアクションに使用したプライマー配
列にあり、これは、場合によっては、ヌクレオチドミス
マッチを1つ有するプライマーの縮重オリゴヌクレオチ
ドが、血管内皮細胞mRNA中のタンパク質をコードする配
列にハイブリダイズして、そして増幅されたことを示す
ことがわかる。他の配列の違いは、たぶん、ポリメラー
ゼのエラーか、あるいは血管内皮細胞増殖因子mRNAの多
型性であろう。これらの配列は、天然のDNA配列に正
確には対応しないが、それにもかかわらず、5つのうち
の4つは血管内皮細胞増殖因子の正しいアミノ酸配列
(M13mp18クローンの解読できない領域を除いて)をコ
ードする。さらに、それらは、ウシ血管内皮細胞増殖因
子の全長DNA配列の単離あるいはウシ以外の種のこれ
に相当するタンパク質をコードするDNAの単離のため
のプローブとして使用し得る。増幅されたDNAが、M1
3mp19にライゲートされている、拾い上げたファージ
を、pET-19Aと命名しなおした;以下の実施例3に述べ
るように、このファージに挿入されたフラグメントを、
濾胞星状細胞cDNAライブラリーをスクリーニングす
るプローブとして使用した。
【0125】実施例3 ウシ血管内皮細胞増殖因子(120個のアミノ酸の形態)
をコードするcDNAの回収 Huynhら、DNA Cloning, D.M. Glover編、Vol.I, p.49,
IRL Press, Washington, D.C.(1985)の方法の改変法で
ウシ濾胞星状細胞cDNAライブラリーを、λgt10バク
テリオファージ中に調製した。ライブラリーのcDNA
を作るのに使用するポリ(A)+RNAは、公表されている
方法(Ferraraら、PNAS(1987) 84:5773-5777)によっ
て、Denis Gospodarowicz博士によりウシ下垂体から単
離され、増殖された濾胞星状細胞から得た。λgt10中の
cDNAライブラリー(約1.5×106ファージ)をC600hf
l-細胞に蒔いた(プレート30枚、5×104ファージ/プ
レート)。各々のプレートのプラークリフトを2つ、ニ
トロセルロースフィルターペーパー上に取った。フィル
ターを変性溶液(0.2M NaOH、1.5M NaCl)に3分間浸し
た後、中和溶液(2×SSC、0.4M Tris pH 7.5)に3分
間浸し、そして洗浄溶液(2×SSC)に3分間浸した。
次にフィルターを風乾し、そしてバキュームオーブン中
80℃で2時間焼き付けた。1セットのフィルターを200m
lの40%ホルムアミドバッファー中42℃で、プレハイブ
リダイズさせた。
をコードするcDNAの回収 Huynhら、DNA Cloning, D.M. Glover編、Vol.I, p.49,
IRL Press, Washington, D.C.(1985)の方法の改変法で
ウシ濾胞星状細胞cDNAライブラリーを、λgt10バク
テリオファージ中に調製した。ライブラリーのcDNA
を作るのに使用するポリ(A)+RNAは、公表されている
方法(Ferraraら、PNAS(1987) 84:5773-5777)によっ
て、Denis Gospodarowicz博士によりウシ下垂体から単
離され、増殖された濾胞星状細胞から得た。λgt10中の
cDNAライブラリー(約1.5×106ファージ)をC600hf
l-細胞に蒔いた(プレート30枚、5×104ファージ/プ
レート)。各々のプレートのプラークリフトを2つ、ニ
トロセルロースフィルターペーパー上に取った。フィル
ターを変性溶液(0.2M NaOH、1.5M NaCl)に3分間浸し
た後、中和溶液(2×SSC、0.4M Tris pH 7.5)に3分
間浸し、そして洗浄溶液(2×SSC)に3分間浸した。
次にフィルターを風乾し、そしてバキュームオーブン中
80℃で2時間焼き付けた。1セットのフィルターを200m
lの40%ホルムアミドバッファー中42℃で、プレハイブ
リダイズさせた。
【0126】フィルターのスクリーニング用プローブを
調製するために、一本鎖調製物を、上述の実施例2に記
載のM13mp19由来のファージpET-19Aから、標準法(Mess
ing,J., Methods Enzymol. (1983) 101:20-78)を用い
て作製した。この調製物を、「ユニバーサル」プライマ
ー(Messing, J., Methods Enzymol. (1983) 101:20-7
8)とハイブリダイズさせ、そしてpET-19Aに相補的なス
トランドを、クレノウフラグメントポリメラーゼおよび
α32P-dNTPsを用いてプライマーを伸長させることによ
り、合成した。
調製するために、一本鎖調製物を、上述の実施例2に記
載のM13mp19由来のファージpET-19Aから、標準法(Mess
ing,J., Methods Enzymol. (1983) 101:20-78)を用い
て作製した。この調製物を、「ユニバーサル」プライマ
ー(Messing, J., Methods Enzymol. (1983) 101:20-7
8)とハイブリダイズさせ、そしてpET-19Aに相補的なス
トランドを、クレノウフラグメントポリメラーゼおよび
α32P-dNTPsを用いてプライマーを伸長させることによ
り、合成した。
【0127】プラークリフトの1セットを、この放射標
識したプローブでスクリーニングした。プローブを100
℃で2分間加熱して2本鎖DNAを融解させ、そして氷
上に放置した。次にこのプローブ(1ml;5×108cpm)
を、プレハイブリダイゼーションに使用した40%ホルム
アミドバッファー200mlに加え、完全に混合した。プレ
ハイブリダイズさせたフィルターを加え、そして42℃の
湯浴中揺らしながら一晩インキュベートした。次にフィ
ルターを、0.1% SDSを含む1×SSC(20×SSCは、3M N
aCl、0.3M クエン酸ナトリウムに相当する)で、50℃
で数時間洗浄した。洗浄後、フィルターを-70℃から-80
℃でX線フィルムに一晩露出した。
識したプローブでスクリーニングした。プローブを100
℃で2分間加熱して2本鎖DNAを融解させ、そして氷
上に放置した。次にこのプローブ(1ml;5×108cpm)
を、プレハイブリダイゼーションに使用した40%ホルム
アミドバッファー200mlに加え、完全に混合した。プレ
ハイブリダイズさせたフィルターを加え、そして42℃の
湯浴中揺らしながら一晩インキュベートした。次にフィ
ルターを、0.1% SDSを含む1×SSC(20×SSCは、3M N
aCl、0.3M クエン酸ナトリウムに相当する)で、50℃
で数時間洗浄した。洗浄後、フィルターを-70℃から-80
℃でX線フィルムに一晩露出した。
【0128】約32個のポジティブと推定されるクローン
を、最初のpET-19A由来の、プライマーから伸長させた
プローブとのスクリーニングで同定した。1c-10cと同定
された10個のクローンをさらなるスクリーニングのため
に選んだ。
を、最初のpET-19A由来の、プライマーから伸長させた
プローブとのスクリーニングで同定した。1c-10cと同定
された10個のクローンをさらなるスクリーニングのため
に選んだ。
【0129】プラークリフトの2つ目のセットを、図1
に示すpET-19Aの増幅したDNA挿入物の配列に基づい
てデザインした、合成オリゴヌクレオチド放射標識プロ
ーブでスクリーニングした。プローブ#4340と同定され
たオリゴヌクレオチドは、アンチセンスストランドに相
当し、次のヌクレオチド配列: 5'-CAC CAG GGT CTC GAT GGG ACG GCA GAA GCT GCG CTG
GTA-3' を有する39-merのオリゴヌクレオチドであった。フィル
ターを、100mlのLong Oligoプレハイブリダイゼーショ
ンバッファーで約6時間、43℃でプレハイブリダイズさ
せた。次に、プレハイブリダイゼーションバッファー中
のフィルターを湯浴中65℃で10分間加熱した。γ-32P-
ATPおよびポリヌクレオチドキナーゼを用いて放射標識
したプローブ(5×108cpm)を65℃のバッファーに加
え、水浴の加熱を止めて温度をゆっくりと室温まで下げ
た。翌日、フィルターをハイブリダイゼーションバッフ
ァーから取り出し、45℃で2時間洗浄(3×SSC、0.1%
SDS中で6〜)した。洗浄液は1時間目で交換した。フ
ィルターを乾燥させ、そして-70℃から-80℃でX線フィ
ルムに一晩露出した。
に示すpET-19Aの増幅したDNA挿入物の配列に基づい
てデザインした、合成オリゴヌクレオチド放射標識プロ
ーブでスクリーニングした。プローブ#4340と同定され
たオリゴヌクレオチドは、アンチセンスストランドに相
当し、次のヌクレオチド配列: 5'-CAC CAG GGT CTC GAT GGG ACG GCA GAA GCT GCG CTG
GTA-3' を有する39-merのオリゴヌクレオチドであった。フィル
ターを、100mlのLong Oligoプレハイブリダイゼーショ
ンバッファーで約6時間、43℃でプレハイブリダイズさ
せた。次に、プレハイブリダイゼーションバッファー中
のフィルターを湯浴中65℃で10分間加熱した。γ-32P-
ATPおよびポリヌクレオチドキナーゼを用いて放射標識
したプローブ(5×108cpm)を65℃のバッファーに加
え、水浴の加熱を止めて温度をゆっくりと室温まで下げ
た。翌日、フィルターをハイブリダイゼーションバッフ
ァーから取り出し、45℃で2時間洗浄(3×SSC、0.1%
SDS中で6〜)した。洗浄液は1時間目で交換した。フ
ィルターを乾燥させ、そして-70℃から-80℃でX線フィ
ルムに一晩露出した。
【0130】プローブ#4340にハイブリダイズするクロ
ーンのうち、1つのクローンのみが、pET-19Aにハイブ
リダイズした最初のセットのフィルターからの32クロー
ンのうちの1つに相当するようであった。このクローン
は、さらなる分析のために拾い上げた元の10個のうちの
1つではなかった。従って、このクローンを拾い上げ、
クローン11cと命名した。#4340にプロービングさせたフ
ィルターを、よりストリンジェントな条件(1×SSC、
0.1% SDS、65℃)で再度洗浄した。それにより、ポジ
ティブと推定されるクローンの数は、pET-19Aにハイブ
リダイズしたクローン11cを含めて約6個に減った。
ーンのうち、1つのクローンのみが、pET-19Aにハイブ
リダイズした最初のセットのフィルターからの32クロー
ンのうちの1つに相当するようであった。このクローン
は、さらなる分析のために拾い上げた元の10個のうちの
1つではなかった。従って、このクローンを拾い上げ、
クローン11cと命名した。#4340にプロービングさせたフ
ィルターを、よりストリンジェントな条件(1×SSC、
0.1% SDS、65℃)で再度洗浄した。それにより、ポジ
ティブと推定されるクローンの数は、pET-19Aにハイブ
リダイズしたクローン11cを含めて約6個に減った。
【0131】拾い上げたクローン2c-11cを第二ラウンド
のスクリーニング用に平板培養した。クローンを「捨い
上げる」ために、寒天プレートの適当な部分から各々の
クローン寒天片を取り出した。すなわちファルコンの12
×75mm滅菌チューブの口を、プレートから移されたフィ
ルター上のポジティブシグナルに相当する、プレートの
所望の部分に当てて、寒天をつきぬけるように押し下
げ、切り取られた寒天片を滅菌したへらで拾い上げて取
った。次に各々の寒天片を1mlのSMバッファー(100mM
NaCl;8mM MgSO4; 50mM Tris pH 7.5; 0.01% ゼラチ
ン)中に入れ、ボルテックスで混ぜ、そして約20分間室
温において、ファージを寒天から浸出させた。拾い上げ
たクローンから得られた懸濁液各々の1μlを1mlのSM
バッファー(1:1000希釈)に懸濁させた。次に、ファ
ージの1:1000希釈物各々の10μlを、590-600μlの培
養用細胞(C600hfl-)が入っているファルコンの75×10
0mmチューブに移し、次いで、10μlをこのチューブか
ら、590-600μlの培養用細胞が入っている第二のチュー
ブに移し、さらに第二のチューブから第三のチューブに
移して段階希釈した。ファージを37℃で20分間吸着さ
せ、そして各チューブのファージ/C600hfl-混合物を、
150mmの平板寒天培地に約10mlの上層アガロースととも
に蒔いた。この平板培地を一晩、37℃でインキュベート
した。1平板培地当り約5000個のファージを有する平板
培地を、ニトロセルロースフィルターぺーパー上にプラ
ークリフトを取るのに使用した。次に、フィルター上の
DNAを、上述の最初のcDNAライブラリーの一次ス
クリーニングでのプラークリフトと同じ様式でフィルタ
ーをNaOHで処理することにより、変性させた。焼き付け
た後、フィルターを、42℃の湯浴中で揺らしながら2時
間、密封できるプラスチックバッグ(1つのバッグ当り
3個のフィルター)中の10mlの50%ホルムアミドバッフ
ァーに浸してプレハイブリダイズさせた。
のスクリーニング用に平板培養した。クローンを「捨い
上げる」ために、寒天プレートの適当な部分から各々の
クローン寒天片を取り出した。すなわちファルコンの12
×75mm滅菌チューブの口を、プレートから移されたフィ
ルター上のポジティブシグナルに相当する、プレートの
所望の部分に当てて、寒天をつきぬけるように押し下
げ、切り取られた寒天片を滅菌したへらで拾い上げて取
った。次に各々の寒天片を1mlのSMバッファー(100mM
NaCl;8mM MgSO4; 50mM Tris pH 7.5; 0.01% ゼラチ
ン)中に入れ、ボルテックスで混ぜ、そして約20分間室
温において、ファージを寒天から浸出させた。拾い上げ
たクローンから得られた懸濁液各々の1μlを1mlのSM
バッファー(1:1000希釈)に懸濁させた。次に、ファ
ージの1:1000希釈物各々の10μlを、590-600μlの培
養用細胞(C600hfl-)が入っているファルコンの75×10
0mmチューブに移し、次いで、10μlをこのチューブか
ら、590-600μlの培養用細胞が入っている第二のチュー
ブに移し、さらに第二のチューブから第三のチューブに
移して段階希釈した。ファージを37℃で20分間吸着さ
せ、そして各チューブのファージ/C600hfl-混合物を、
150mmの平板寒天培地に約10mlの上層アガロースととも
に蒔いた。この平板培地を一晩、37℃でインキュベート
した。1平板培地当り約5000個のファージを有する平板
培地を、ニトロセルロースフィルターぺーパー上にプラ
ークリフトを取るのに使用した。次に、フィルター上の
DNAを、上述の最初のcDNAライブラリーの一次ス
クリーニングでのプラークリフトと同じ様式でフィルタ
ーをNaOHで処理することにより、変性させた。焼き付け
た後、フィルターを、42℃の湯浴中で揺らしながら2時
間、密封できるプラスチックバッグ(1つのバッグ当り
3個のフィルター)中の10mlの50%ホルムアミドバッフ
ァーに浸してプレハイブリダイズさせた。
【0132】これらのフィルターをスクリーニングする
ためのプローブを調製するために、二本鎖(複製型)の
調製物をM13mp19由来のファージpET-19Aから作製した。
この調製物をEcoRIおよびHindIIIで消化し、そして増幅
されたDNAセグメントを示す82塩基対の挿入フラグメ
ントをゲル電気泳動により単離し、次いでクレノーフラ
グメントポリメラーゼおよびα32P-dNTPで一本鎖の末
端を満たすことにより標識した。このプローブを2分間
煮沸し、二本鎖DNAを融解し、氷上で冷却し、次いで
フィルターを浸漬するプレハイブリダイゼーションバッ
ファーに加えた。このフィルターを振盪水槽中で42℃で
一晩インキュベートし、そして50℃で1〜1/2時間、0.1
×SSC、0.1% SDS洗浄バッファー中で2回バッファー交
換することにより洗浄した。このフィルターを−70℃か
ら−80℃で一晩、X線フィルムに曝した。
ためのプローブを調製するために、二本鎖(複製型)の
調製物をM13mp19由来のファージpET-19Aから作製した。
この調製物をEcoRIおよびHindIIIで消化し、そして増幅
されたDNAセグメントを示す82塩基対の挿入フラグメ
ントをゲル電気泳動により単離し、次いでクレノーフラ
グメントポリメラーゼおよびα32P-dNTPで一本鎖の末
端を満たすことにより標識した。このプローブを2分間
煮沸し、二本鎖DNAを融解し、氷上で冷却し、次いで
フィルターを浸漬するプレハイブリダイゼーションバッ
ファーに加えた。このフィルターを振盪水槽中で42℃で
一晩インキュベートし、そして50℃で1〜1/2時間、0.1
×SSC、0.1% SDS洗浄バッファー中で2回バッファー交
換することにより洗浄した。このフィルターを−70℃か
ら−80℃で一晩、X線フィルムに曝した。
【0133】クローン11cの再プレートを示すプレート
上の3個のポジティブクローンは、pET-19A由来の82塩
基対の挿入フラグメントにハイブリダイズした。さら
に、クローン7cの再プレートを示すプレート上に1個の
問題となるポジティブクローンがあると考えられた。こ
れら4個のポジティブクローンをパスツールピペットの
広い方の末端部を用いて寒天プレートから切取り、プレ
ートする細胞中に希釈し、そして前記のものと同様の方
法で3回目のスクリーニングのために再びプレートし
た。2回目のスクリーニングにおいてクローン11cを示
すプレート上で3個のポジティブクローンの3回目のス
クリーニングのために製造された3個のプレートを11
A、11Bおよび11Cと名付けた。上記のように、2つのプ
ラークリフトをニトロセルロースフィルターぺーパー上
に各プレートから調製した。このフィルター上のDNA
を、上記と同様の方法を用いて、変性し、そして焼き付
けた。プラークリフトの第一のセットを放射標識された
プローブ#4340(前に記載された)でスクリーニング
し、そしてプラークリフトの第二のセットをpET-19Aの8
2塩基対挿入物から調製された前述のプローブでスクリ
ーニングした。
上の3個のポジティブクローンは、pET-19A由来の82塩
基対の挿入フラグメントにハイブリダイズした。さら
に、クローン7cの再プレートを示すプレート上に1個の
問題となるポジティブクローンがあると考えられた。こ
れら4個のポジティブクローンをパスツールピペットの
広い方の末端部を用いて寒天プレートから切取り、プレ
ートする細胞中に希釈し、そして前記のものと同様の方
法で3回目のスクリーニングのために再びプレートし
た。2回目のスクリーニングにおいてクローン11cを示
すプレート上で3個のポジティブクローンの3回目のス
クリーニングのために製造された3個のプレートを11
A、11Bおよび11Cと名付けた。上記のように、2つのプ
ラークリフトをニトロセルロースフィルターぺーパー上
に各プレートから調製した。このフィルター上のDNA
を、上記と同様の方法を用いて、変性し、そして焼き付
けた。プラークリフトの第一のセットを放射標識された
プローブ#4340(前に記載された)でスクリーニング
し、そしてプラークリフトの第二のセットをpET-19Aの8
2塩基対挿入物から調製された前述のプローブでスクリ
ーニングした。
【0134】フィルターの第一のセットを、室温で、シ
ョートオリゴプレハイブリダイゼーションバッファー7
mlを含有するプラスチックバッグ中に浸漬することによ
りプレハイブリダイズした。放射標識されたプローブ#4
340をこれらのフィルターを含有するプレハイブリダイ
ゼーションバッファーに加えた。このバッグを数分間65
℃の振盪水槽セット中に据えることにより温度を65℃に
した。次いで、この水浴の加熱を止め、温度を緩やかに
室温まで戻した。インキュベーションを室温で約2〜1/
2日間続けた。
ョートオリゴプレハイブリダイゼーションバッファー7
mlを含有するプラスチックバッグ中に浸漬することによ
りプレハイブリダイズした。放射標識されたプローブ#4
340をこれらのフィルターを含有するプレハイブリダイ
ゼーションバッファーに加えた。このバッグを数分間65
℃の振盪水槽セット中に据えることにより温度を65℃に
した。次いで、この水浴の加熱を止め、温度を緩やかに
室温まで戻した。インキュベーションを室温で約2〜1/
2日間続けた。
【0135】このフィルターの第二のセットを50%ホル
ムアミドバッファー10mlを含有するプラスチックバッグ
中に浸漬し、そして42℃でインキュベーションして、プ
レハイブリダイズした。pET-19Aの82塩基対挿入物から
調製されたプローブを煮沸し、そしてフィルターの第二
のセットを含有するプレハイブリダイゼーションバッフ
ァーに直接加えた。このハイブリダイゼーション反応液
を約2〜1/2日間42℃で振盪水槽中でインキュベートし
た。
ムアミドバッファー10mlを含有するプラスチックバッグ
中に浸漬し、そして42℃でインキュベーションして、プ
レハイブリダイズした。pET-19Aの82塩基対挿入物から
調製されたプローブを煮沸し、そしてフィルターの第二
のセットを含有するプレハイブリダイゼーションバッフ
ァーに直接加えた。このハイブリダイゼーション反応液
を約2〜1/2日間42℃で振盪水槽中でインキュベートし
た。
【0136】プローブ#4340とハイブリダイズしたフィ
ルターのセットを55℃で1×SSC、0.1% SDS中で洗浄し
た。pET-19A由来のプローブでハイブリダイズされたフ
ィルターのセットを55℃で0.1×SSC、0.1% SDS中で洗
浄した。フィルターの両セットを3〜1/2時間X線フィ
ルムに曝した。プレート11A、11Bおよび11C上の数個の
プラークは、プローブ#4340およびpET-19A由来の塩基対
挿入物の両方に強くハイブリダイズした。いずれかのプ
ローブとハイブリダイズする2回目のスクリーニングの
プレート7cから取り出して希釈したものは、このプレー
ト上でプラークを表さなかった。プレート11Aからの2
個の強くハイブリダイズしたプラークをパスツールピペ
ットの細い方の末端を用いて取り出した。11A'および11
B'と名付けられたこれらのクローンをプレート細胞中で
希釈し、前記のように、4回目のスクリーニングとして
再プレートした。
ルターのセットを55℃で1×SSC、0.1% SDS中で洗浄し
た。pET-19A由来のプローブでハイブリダイズされたフ
ィルターのセットを55℃で0.1×SSC、0.1% SDS中で洗
浄した。フィルターの両セットを3〜1/2時間X線フィ
ルムに曝した。プレート11A、11Bおよび11C上の数個の
プラークは、プローブ#4340およびpET-19A由来の塩基対
挿入物の両方に強くハイブリダイズした。いずれかのプ
ローブとハイブリダイズする2回目のスクリーニングの
プレート7cから取り出して希釈したものは、このプレー
ト上でプラークを表さなかった。プレート11Aからの2
個の強くハイブリダイズしたプラークをパスツールピペ
ットの細い方の末端を用いて取り出した。11A'および11
B'と名付けられたこれらのクローンをプレート細胞中で
希釈し、前記のように、4回目のスクリーニングとして
再プレートした。
【0137】ポジティブクローン11A'および11B'から調
製されたプレートのそれぞれから2個のプラークリフト
をニトロセルロースフィルターぺーパー上に調製した。
このフィルター上のDNAを上記のものと同様の方法を
用いて変性し、そして焼き付けた。フィルターの各セッ
トをショートオリゴプレハイブリダイゼーションバッフ
ァー10mlを含有するプラスチックバッグ中に浸漬するこ
とによりプレハイブリダイズし、そして室温でインキュ
ベートした。プレート11A'および11B'のそれぞれ由来の
第一のプラークリフトを放射標識したプローブ#4340
(前で記載された)でスクリーニングした。このプロー
ブをこのフィルターおよびプレハイブリダイゼーション
バッファーを含有するプラスチックバッグに加え、初め
に65℃でインキュベートし、次いで、上記のように緩や
かに冷却した。プレート11A'および11B'のそれぞれ由来
の第二のプラークリフトを、放射標識が48倍に縮重され
た混合オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングし
た。プローブはプローブ#4255と名付けたが、それはウ
シの血管内皮細胞増殖因子の内因性のトリプシン消化フ
ラグメント由来のアミノ酸に基づいており、そしてそれ
は以下の配列を有する:
製されたプレートのそれぞれから2個のプラークリフト
をニトロセルロースフィルターぺーパー上に調製した。
このフィルター上のDNAを上記のものと同様の方法を
用いて変性し、そして焼き付けた。フィルターの各セッ
トをショートオリゴプレハイブリダイゼーションバッフ
ァー10mlを含有するプラスチックバッグ中に浸漬するこ
とによりプレハイブリダイズし、そして室温でインキュ
ベートした。プレート11A'および11B'のそれぞれ由来の
第一のプラークリフトを放射標識したプローブ#4340
(前で記載された)でスクリーニングした。このプロー
ブをこのフィルターおよびプレハイブリダイゼーション
バッファーを含有するプラスチックバッグに加え、初め
に65℃でインキュベートし、次いで、上記のように緩や
かに冷却した。プレート11A'および11B'のそれぞれ由来
の第二のプラークリフトを、放射標識が48倍に縮重され
た混合オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングし
た。プローブはプローブ#4255と名付けたが、それはウ
シの血管内皮細胞増殖因子の内因性のトリプシン消化フ
ラグメント由来のアミノ酸に基づいており、そしてそれ
は以下の配列を有する:
【0138】
【化3】
【0139】このハイブリダイゼーションの条件は、プ
ローブ#4340に対して記載されたものと同一であった。
プレート11A'および11B'由来のプラークリフトをl×SS
C、0.1% SDSで55℃で(#4340)または3×SSC、0.1%
SDSで30℃で、次いで3Mテトラメチルアンモニウムク
ロライド(TMACl)、0.05M トリス-塩酸、pH8.0、0.1
%SDS、0.002M EDTAで45℃で(#4255)洗浄し、そして
フィルムに曝した。両プレート由来のプラークは、プロ
ーブ#4340およびプローブ#4255の両方にハイブリダイズ
するとともに、それぞれのフィルター上の全てのプラー
クとハイブリダイズすることを見い出した。それによ
り、クローン11A'および11B'が一本鎖の、純粋なクロー
ンを構成するという結論が下された。
ローブ#4340に対して記載されたものと同一であった。
プレート11A'および11B'由来のプラークリフトをl×SS
C、0.1% SDSで55℃で(#4340)または3×SSC、0.1%
SDSで30℃で、次いで3Mテトラメチルアンモニウムク
ロライド(TMACl)、0.05M トリス-塩酸、pH8.0、0.1
%SDS、0.002M EDTAで45℃で(#4255)洗浄し、そして
フィルムに曝した。両プレート由来のプラークは、プロ
ーブ#4340およびプローブ#4255の両方にハイブリダイズ
するとともに、それぞれのフィルター上の全てのプラー
クとハイブリダイズすることを見い出した。それによ
り、クローン11A'および11B'が一本鎖の、純粋なクロー
ンを構成するという結論が下された。
【0140】クローン11B'のDNA挿入物の配列決定
は、まずEcoRIでファージDNAを消化し、6%ポリア
クリルアミドゲル上でその消化物を分画し、約800塩基
対の挿入フラグメントを電気溶出し、そしてEcoRI切断
のM13mp18中にこのフラグメントを連結することによっ
て行い、次いで、標準的な方法を用いて、ジデオシヌク
レオチド法によってこの挿入物の配列を決定した。この
ヌクレオチド配列、およびコードされたアミノ酸配列は
図3aにおいて示されている(この図には、797個のヌ
クレオチド挿入物の配列のうちの7番目から795番目の
ヌクレオチドのみが示されており;各末端のEcoRIリン
カー配列は、省略している)。797個のヌクレオチドか
らなる挿入配列は、ウシ血管内皮細胞増殖因子の既知の
タンパク質配列のアミノ酸番号15から始まる、既知のア
ミノ酸配列をコードする。オープンリーディングフレー
ムはヌクレオチド327位のフレーム内の転写終止コドン
まで伸びる。クローン11B'の挿入配列をプラスミドpUC8
のEcoRI部位に連結した。得られたpST800と呼ばれるプ
ラスミドは、E.coli JM83宿主に入れてAmerican Type
Culture Collection, Rockville, MDに受託番号68060で
寄託されている。
は、まずEcoRIでファージDNAを消化し、6%ポリア
クリルアミドゲル上でその消化物を分画し、約800塩基
対の挿入フラグメントを電気溶出し、そしてEcoRI切断
のM13mp18中にこのフラグメントを連結することによっ
て行い、次いで、標準的な方法を用いて、ジデオシヌク
レオチド法によってこの挿入物の配列を決定した。この
ヌクレオチド配列、およびコードされたアミノ酸配列は
図3aにおいて示されている(この図には、797個のヌ
クレオチド挿入物の配列のうちの7番目から795番目の
ヌクレオチドのみが示されており;各末端のEcoRIリン
カー配列は、省略している)。797個のヌクレオチドか
らなる挿入配列は、ウシ血管内皮細胞増殖因子の既知の
タンパク質配列のアミノ酸番号15から始まる、既知のア
ミノ酸配列をコードする。オープンリーディングフレー
ムはヌクレオチド327位のフレーム内の転写終止コドン
まで伸びる。クローン11B'の挿入配列をプラスミドpUC8
のEcoRI部位に連結した。得られたpST800と呼ばれるプ
ラスミドは、E.coli JM83宿主に入れてAmerican Type
Culture Collection, Rockville, MDに受託番号68060で
寄託されている。
【0141】成熟型のウシ血管内皮細胞増殖因子をコー
ドする全長コード配列を、図3bの配列と共に図3aに
示す。図3bの二本鎖DNA配列は、5’末端近くに転
写開始コドンATGを有し、ヒト細胞の遺伝子発現で好ま
しく選択されるコドンに基づき選ばれる配列を表してお
り、ウシタンパク質のN末端表示部(開始メチオニン残
基で先行される)をコードし、図3aに示されたコード
配列と重複している。成熟型のウシ血管内皮細胞増殖因
子をコードする全長コード配列を作るために、図3bの
DNA配列はオリゴヌクレオチド合成の周知の方法を用
いて合成し得、そしてATCCに寄託されたプラスミドから
好都合に得られる図3aの配列の部分に、酵素的に結合
し得る。図3aおよび3bの配列を結合する前に、図3
aの配列をEcoRIを用いてプラスミドpST800から切り出
し、単離した挿入物をNlaIVで消化する。NlaIVはこの挿
入物を5回、全て3'非翻訳領域内において切断する。
次に、好都合な制限部位、例えばHindIIIをコードする
リンカーを、ブラントエンド連結を介して最も5’末端
側のNlaIV部位に結合させる。得られたライゲーション
反応混合物を、次にAccIおよびリンカー酵素(例えばHi
ndIII)で消化し、3’末端(NlaIV部位に)連結された
リンカーの消化物の付いた、pST800挿入物の325塩基対
フラグメント(AccI-NlaIV)を遊離させる。フラグメン
トを精製し、図3bに示す合成フラグメントに連結す
る。ライゲーション混合物をNcoIおよびリンカー切断制
限酵素(例えばHindIIIリンカーを用いた場合にはHindI
II)で消化すると、5’側には消化されたNcoI部位が隣
接し、また3’側にはフラグメントの発現ベクターへの
挿入に有用な、消化された制限酵素部位が隣接した、成
熟型のウシ血管内皮細胞増殖因子をコードする所望のコ
ード配列が得られる。
ドする全長コード配列を、図3bの配列と共に図3aに
示す。図3bの二本鎖DNA配列は、5’末端近くに転
写開始コドンATGを有し、ヒト細胞の遺伝子発現で好ま
しく選択されるコドンに基づき選ばれる配列を表してお
り、ウシタンパク質のN末端表示部(開始メチオニン残
基で先行される)をコードし、図3aに示されたコード
配列と重複している。成熟型のウシ血管内皮細胞増殖因
子をコードする全長コード配列を作るために、図3bの
DNA配列はオリゴヌクレオチド合成の周知の方法を用
いて合成し得、そしてATCCに寄託されたプラスミドから
好都合に得られる図3aの配列の部分に、酵素的に結合
し得る。図3aおよび3bの配列を結合する前に、図3
aの配列をEcoRIを用いてプラスミドpST800から切り出
し、単離した挿入物をNlaIVで消化する。NlaIVはこの挿
入物を5回、全て3'非翻訳領域内において切断する。
次に、好都合な制限部位、例えばHindIIIをコードする
リンカーを、ブラントエンド連結を介して最も5’末端
側のNlaIV部位に結合させる。得られたライゲーション
反応混合物を、次にAccIおよびリンカー酵素(例えばHi
ndIII)で消化し、3’末端(NlaIV部位に)連結された
リンカーの消化物の付いた、pST800挿入物の325塩基対
フラグメント(AccI-NlaIV)を遊離させる。フラグメン
トを精製し、図3bに示す合成フラグメントに連結す
る。ライゲーション混合物をNcoIおよびリンカー切断制
限酵素(例えばHindIIIリンカーを用いた場合にはHindI
II)で消化すると、5’側には消化されたNcoI部位が隣
接し、また3’側にはフラグメントの発現ベクターへの
挿入に有用な、消化された制限酵素部位が隣接した、成
熟型のウシ血管内皮細胞増殖因子をコードする所望のコ
ード配列が得られる。
【0142】この混成配列は適切な発現ベクターの、原
核または真核宿主内で発現を指示し得る調節エレメント
の制御下に挿入される。E.coliでの発現に好適なベク
ターには、pKK233-2(AmmanおよびBrosius, Gene (198
5) 40:183-190)があり、これはPharmacia, Inc.から市
販されている。このベクターのNcoIとHindIII部位の間
に混成配列を挿入すると、コード配列はtrcプロモータ
ーの制御下に置かれる。次に発現ベクターはE.coliの
ような好適な宿主の形質転換に用いられ、形質転換体は
コードされたDNAが発現される条件下で培養される。
次に、発現されたタンパク質を当該分野に慣例の方法で
回収する。
核または真核宿主内で発現を指示し得る調節エレメント
の制御下に挿入される。E.coliでの発現に好適なベク
ターには、pKK233-2(AmmanおよびBrosius, Gene (198
5) 40:183-190)があり、これはPharmacia, Inc.から市
販されている。このベクターのNcoIとHindIII部位の間
に混成配列を挿入すると、コード配列はtrcプロモータ
ーの制御下に置かれる。次に発現ベクターはE.coliの
ような好適な宿主の形質転換に用いられ、形質転換体は
コードされたDNAが発現される条件下で培養される。
次に、発現されたタンパク質を当該分野に慣例の方法で
回収する。
【0143】もちろん、他の配列が図3aの配列に結合
可能である。例えば、図3bの配列は、5’末端がNcoI
部位ではなくNdeI部位を表すように改変し得る。哺乳動
物での発現に対しては、図3bのコード配列を5’方向
に延ばして、随意に分泌シグナル配列、例えばヒト成長
ホルモンのシグナル配列に結合した、ウシ血管内皮細胞
増殖因子のアミノ末端配列をコードするようにし得る。
可能である。例えば、図3bの配列は、5’末端がNcoI
部位ではなくNdeI部位を表すように改変し得る。哺乳動
物での発現に対しては、図3bのコード配列を5’方向
に延ばして、随意に分泌シグナル配列、例えばヒト成長
ホルモンのシグナル配列に結合した、ウシ血管内皮細胞
増殖因子のアミノ末端配列をコードするようにし得る。
【0144】あるいは、図3aに示されたコード配列
は、DNAハイブリダイゼーションの標準的条件下でプ
ローブとして使用し、ウシ血管内皮細胞増殖因子または
ヒトを含む他の哺乳動物種の相当するタンパク質をコー
ドする、天然の全長DNA配列を回収することができ
る。図3aの配列はcDNAまたはゲノムDNAライブ
ラリーから所望の配列を回収するためのプローブとして
使用し得る。
は、DNAハイブリダイゼーションの標準的条件下でプ
ローブとして使用し、ウシ血管内皮細胞増殖因子または
ヒトを含む他の哺乳動物種の相当するタンパク質をコー
ドする、天然の全長DNA配列を回収することができ
る。図3aの配列はcDNAまたはゲノムDNAライブ
ラリーから所望の配列を回収するためのプローブとして
使用し得る。
【0145】ウシ血管内皮細胞増殖因子mRNAの5’末端
方向に伸長されたクローンは、アンチセンスオリゴヌク
レオチド4338(5'-GCCAAGCTTGCACCAGGGTCTCGATGGGACGGC
AGAA-3')をプライマーとして用いて、実施例1に記載
のように第一鎖cDNA合成をプライムし、次に得られ
た二重鎖の5’末端に、オリゴヌクレオチド4537および
4514(それぞれ5'-GATCGCGG-3'および5'-CCGCGATCAAGCT
TCCCGGGAATTCGGC-3')からなる部分二本鎖リンカー分子
を連結して作製した。最後に、生成物をオリゴヌクレオ
チド4338および4315(5'-GCCGAATTCCCGGGAAGCTTGATCGCG
G;4514に相補的)をプライマーとして用いてポリメラー
ゼ連鎖反応で増幅した。ジデオキシヌクレオチド法で配
列決定したところ、得られたクローンから図5に示す
5’配列を得た。
方向に伸長されたクローンは、アンチセンスオリゴヌク
レオチド4338(5'-GCCAAGCTTGCACCAGGGTCTCGATGGGACGGC
AGAA-3')をプライマーとして用いて、実施例1に記載
のように第一鎖cDNA合成をプライムし、次に得られ
た二重鎖の5’末端に、オリゴヌクレオチド4537および
4514(それぞれ5'-GATCGCGG-3'および5'-CCGCGATCAAGCT
TCCCGGGAATTCGGC-3')からなる部分二本鎖リンカー分子
を連結して作製した。最後に、生成物をオリゴヌクレオ
チド4338および4315(5'-GCCGAATTCCCGGGAAGCTTGATCGCG
G;4514に相補的)をプライマーとして用いてポリメラー
ゼ連鎖反応で増幅した。ジデオキシヌクレオチド法で配
列決定したところ、得られたクローンから図5に示す
5’配列を得た。
【0146】実施例4 ウシ血管内皮細胞増殖因子(bVEGF164)をコードす
るcDNAの回収 bVEGF120(図3a)以外のVEGF型を単離するため
に、卵胞星状体(foliculo stellate)ポリ(A)+RNAを
鋳型として用い、アンチセンスオリゴヌクレオチド4456
(5'-GTAGTTCTGTGTCAGTCTTTCCTGGTGAGACGTCTGGTTCCCGAA
ACCCTGAGGGAGGCT-3')をプライマーとして用いて、第一
鎖cDNA合成を行った。得られた生成物を次に、アン
チセンスオリゴヌクレオチド4456およびセンスオリゴヌ
クレオチド4414(5'-TTCTGCCGTCCCATCGAGACCCTGGTGGACA
TCTTCCAGGAGTACCCAGATGAGATT-3')をプライマーとして
用いてポリメラーゼ連鎖反応で30回増幅した。生成物の
ポリアクリルアミドゲル分析およびDNA配列決定によ
り、図6に示すように2種類の血管内皮細胞増殖因子を
コードするcDNAが明らかになった。図6に示され
た、四角く囲った132bpの挿入を含むオープンリーディ
ングフレームは、bVEGF164をコードする。
るcDNAの回収 bVEGF120(図3a)以外のVEGF型を単離するため
に、卵胞星状体(foliculo stellate)ポリ(A)+RNAを
鋳型として用い、アンチセンスオリゴヌクレオチド4456
(5'-GTAGTTCTGTGTCAGTCTTTCCTGGTGAGACGTCTGGTTCCCGAA
ACCCTGAGGGAGGCT-3')をプライマーとして用いて、第一
鎖cDNA合成を行った。得られた生成物を次に、アン
チセンスオリゴヌクレオチド4456およびセンスオリゴヌ
クレオチド4414(5'-TTCTGCCGTCCCATCGAGACCCTGGTGGACA
TCTTCCAGGAGTACCCAGATGAGATT-3')をプライマーとして
用いてポリメラーゼ連鎖反応で30回増幅した。生成物の
ポリアクリルアミドゲル分析およびDNA配列決定によ
り、図6に示すように2種類の血管内皮細胞増殖因子を
コードするcDNAが明らかになった。図6に示され
た、四角く囲った132bpの挿入を含むオープンリーディ
ングフレームは、bVEGF164をコードする。
【0147】実施例5 ヒト血管内皮細胞増殖因子をコードするゲノムDNAの
回収 血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸配列をコードするDN
Aを含有する、ヒトゲノムのクローンは、市販のヒト肺
線維芽細胞ゲノムライブラリー(Stratagene Inc., La
Jolla, CA)から単離した。1μlのストックファージ
(約3×1010ファージ/ml)を1ml SMバッファーに希
釈し、20μlのCHCl3を加えた。LE392細胞(hsdR514(r-,
m-)、supE44、supF58、lacY1またはΔ(lacIZY)6、galK
2、galT22、metB1、trpR55、λ-)はNZYM培地でO.D.600
が0.5になるまで増殖させ、細胞を回収し、10mM MgSO4
に再懸濁した。30個の試験管の各々の中で、2μlの希
釈したファージストックを0.6mlの細胞に混合し、37℃
で15分間インキュベートした。10mlのNZYMトップアガー
を各試験管に加え、各試験管の内容物を150mm NZXYMプ
レートに撒き、37℃で16時間インキュベートした後温度
を4℃に下げた。30個のプレートの各々から、ニトロセ
ルロースフィルター上に2枚のプラークリフトを移し
た。フィルター上のDNAを変性させ、実施例3に記載
のように焼き付けた。次にフィルターを、37℃で6時
間、40%ホルムアミド緩衝液中でプレハイブリダイズさ
せた。
回収 血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸配列をコードするDN
Aを含有する、ヒトゲノムのクローンは、市販のヒト肺
線維芽細胞ゲノムライブラリー(Stratagene Inc., La
Jolla, CA)から単離した。1μlのストックファージ
(約3×1010ファージ/ml)を1ml SMバッファーに希
釈し、20μlのCHCl3を加えた。LE392細胞(hsdR514(r-,
m-)、supE44、supF58、lacY1またはΔ(lacIZY)6、galK
2、galT22、metB1、trpR55、λ-)はNZYM培地でO.D.600
が0.5になるまで増殖させ、細胞を回収し、10mM MgSO4
に再懸濁した。30個の試験管の各々の中で、2μlの希
釈したファージストックを0.6mlの細胞に混合し、37℃
で15分間インキュベートした。10mlのNZYMトップアガー
を各試験管に加え、各試験管の内容物を150mm NZXYMプ
レートに撒き、37℃で16時間インキュベートした後温度
を4℃に下げた。30個のプレートの各々から、ニトロセ
ルロースフィルター上に2枚のプラークリフトを移し
た。フィルター上のDNAを変性させ、実施例3に記載
のように焼き付けた。次にフィルターを、37℃で6時
間、40%ホルムアミド緩衝液中でプレハイブリダイズさ
せた。
【0148】フィルターは、前述の実施例3で作製した
プラスミドであるプラスミドpST800からのゲル精製され
たEcoRI挿入フラグメントをニックトランスレーション
して調製した、放射標識プローブでプロービングした。
pST800の797塩基対のEcoRI挿入は、ウシ血管内皮細胞増
殖因子の一部分をコードするcDNAフラグメントを含
有する。プローブは100℃で2分間煮沸して二本鎖DN
Aを融解した後、氷冷した。プローブはフィルターを含
むプレハイブリダイゼーション用バッファーに直接、10
6cpm/mlとなるように加え、フィルターを37℃で一晩、
ハイブリダイズさせた。フィルターを50℃にて1×SS
C、0.1% SDSで、洗浄バッファーを3回替えて洗浄し、
次に吸い取りにより乾燥させ、X線フィルムに−70℃か
ら−80℃で一晩さらした。曝されたフィルムはプレート
当り約200個の陽性クローンを示し、そのうち19個のク
ローンは強い陽性であることを特徴とした。
プラスミドであるプラスミドpST800からのゲル精製され
たEcoRI挿入フラグメントをニックトランスレーション
して調製した、放射標識プローブでプロービングした。
pST800の797塩基対のEcoRI挿入は、ウシ血管内皮細胞増
殖因子の一部分をコードするcDNAフラグメントを含
有する。プローブは100℃で2分間煮沸して二本鎖DN
Aを融解した後、氷冷した。プローブはフィルターを含
むプレハイブリダイゼーション用バッファーに直接、10
6cpm/mlとなるように加え、フィルターを37℃で一晩、
ハイブリダイズさせた。フィルターを50℃にて1×SS
C、0.1% SDSで、洗浄バッファーを3回替えて洗浄し、
次に吸い取りにより乾燥させ、X線フィルムに−70℃か
ら−80℃で一晩さらした。曝されたフィルムはプレート
当り約200個の陽性クローンを示し、そのうち19個のク
ローンは強い陽性であることを特徴とした。
【0149】19個の強い陽性クローンのうち、12個を釣
り上げ、前述の実施例3に記載のように希釈し、再度プ
レートに撒いて第二回目のスクリーニングを行った。再
プレートしたファージから、前述のように各々2枚のプ
ラークリフトを調製した。フィルターを37℃で6時間、
40%ホルムアミドバッファーでプレハイブリダイズさせ
た。このフィルターの1枚を第一回目のスクリーニング
に用いたのと同じプローブを用いて37℃で一晩、ハイブ
リダイズさせた。もう一枚のフィルターは、第一回目の
釣り上げた陽性クローンがプローブ配列のサブクローニ
ングに用いたベクター由来の配列とはハイブリダイズし
ないことを確実にするために、ニックトランスレーショ
ン放射標識pUC8とハイブリダイズさせた。フィルターを
50℃にて1×SSC、0.1% SDSで洗浄し、フィルムにさら
した。この第二回目のスクリーニングで、12個の再プレ
ートしたクローンのうち6個が、pST800由来のプローブ
に対してまだ陽性であり、pUC8プローブに対しては陽性
ではなかった。
り上げ、前述の実施例3に記載のように希釈し、再度プ
レートに撒いて第二回目のスクリーニングを行った。再
プレートしたファージから、前述のように各々2枚のプ
ラークリフトを調製した。フィルターを37℃で6時間、
40%ホルムアミドバッファーでプレハイブリダイズさせ
た。このフィルターの1枚を第一回目のスクリーニング
に用いたのと同じプローブを用いて37℃で一晩、ハイブ
リダイズさせた。もう一枚のフィルターは、第一回目の
釣り上げた陽性クローンがプローブ配列のサブクローニ
ングに用いたベクター由来の配列とはハイブリダイズし
ないことを確実にするために、ニックトランスレーショ
ン放射標識pUC8とハイブリダイズさせた。フィルターを
50℃にて1×SSC、0.1% SDSで洗浄し、フィルムにさら
した。この第二回目のスクリーニングで、12個の再プレ
ートしたクローンのうち6個が、pST800由来のプローブ
に対してまだ陽性であり、pUC8プローブに対しては陽性
ではなかった。
【0150】第二回目のスクリーニングで陽性の6個の
クローンの各々から、陽性プラークを釣り上げた。6個
の釣り上げたプラークを前述のように希釈し、再プレー
トして第三回目のスクリーニングを行った。さらに、第
一回目のスクリーニングで強い陽性であったが再スクリ
ーニングしなかった、7個のクローンを釣り上げ、再プ
レートして第二回目のスクリーニングを行った。再プレ
ートしたクローンの各々から、前述のように2枚のプラ
ークリフトを調製した。これらのフィルターを40%ホル
ムアミドバッファー中で、37℃にて5時間、プレハイブ
リダイズさせた。
クローンの各々から、陽性プラークを釣り上げた。6個
の釣り上げたプラークを前述のように希釈し、再プレー
トして第三回目のスクリーニングを行った。さらに、第
一回目のスクリーニングで強い陽性であったが再スクリ
ーニングしなかった、7個のクローンを釣り上げ、再プ
レートして第二回目のスクリーニングを行った。再プレ
ートしたクローンの各々から、前述のように2枚のプラ
ークリフトを調製した。これらのフィルターを40%ホル
ムアミドバッファー中で、37℃にて5時間、プレハイブ
リダイズさせた。
【0151】第二回目のスクリーニングからの6個の陽
性クローンのうちの一枚のプラークリフトには、前述の
pST800由来の797塩基対挿入をニックトランスレーショ
ンした106cpm/mlを加えた。フィルターおよびプローブ
はプレハイブリダイゼーション用バッファー中で37℃で
一晩、ハイブリダイズさせた。この6個の陽性クローン
のうちのもう1枚のプラークリフトには、前述のpST800
の797塩基対挿入のEcoRI-HpaII断片をニックトランスレ
ーション法で調製したプローブを加えた。EcoRI-HpaII
断片は797塩基対の挿入の5’末端の331塩基対からなっ
ており、従ってAおよびTのヌクレオチドに富んだ挿入
の3’末端を失っていて、これが初期の回のスクリーニ
ングでの間違ったハイブリダイズ陽性の原因であったか
もしれない。
性クローンのうちの一枚のプラークリフトには、前述の
pST800由来の797塩基対挿入をニックトランスレーショ
ンした106cpm/mlを加えた。フィルターおよびプローブ
はプレハイブリダイゼーション用バッファー中で37℃で
一晩、ハイブリダイズさせた。この6個の陽性クローン
のうちのもう1枚のプラークリフトには、前述のpST800
の797塩基対挿入のEcoRI-HpaII断片をニックトランスレ
ーション法で調製したプローブを加えた。EcoRI-HpaII
断片は797塩基対の挿入の5’末端の331塩基対からなっ
ており、従ってAおよびTのヌクレオチドに富んだ挿入
の3’末端を失っていて、これが初期の回のスクリーニ
ングでの間違ったハイブリダイズ陽性の原因であったか
もしれない。
【0152】第一回目の陽性クローンからの7個の再プ
レートされたプラークリフトの2枚には、797塩基対の
プローブをニックトランスレーションした106cpm/mlを
加えた。プローブはプレハイブリダイゼーション用バッ
ファー中で37℃で一晩ハイブリダイズさせた。
レートされたプラークリフトの2枚には、797塩基対の
プローブをニックトランスレーションした106cpm/mlを
加えた。プローブはプレハイブリダイゼーション用バッ
ファー中で37℃で一晩ハイブリダイズさせた。
【0153】全てのフィルターは50℃にて2時間、1×
SSC、0.1% SDSで、バッファーを2回替えて洗浄した。
フィルターを乾燥させ、X線フィルムに−70℃から−80
℃で3時間さらした。第一回目の7個の陽性クローンの
うち、第二回目のスクリーニングで797塩基対プローブ
を用いて、4個の陽性シグナルを得た。第二回目の6個
の陽性クローンのうち、第三回目のスクリーニングで79
7塩基対プローブおよび331塩基対プローブを用いて、4
個の陽性シグナルを得た。
SSC、0.1% SDSで、バッファーを2回替えて洗浄した。
フィルターを乾燥させ、X線フィルムに−70℃から−80
℃で3時間さらした。第一回目の7個の陽性クローンの
うち、第二回目のスクリーニングで797塩基対プローブ
を用いて、4個の陽性シグナルを得た。第二回目の6個
の陽性クローンのうち、第三回目のスクリーニングで79
7塩基対プローブおよび331塩基対プローブを用いて、4
個の陽性シグナルを得た。
【0154】4個の第二回目の陽性クローンを釣り上げ
て、第三回目のスクリーニングを行った。プラークリフ
トの一つは放射標識した797塩基対のプローブでスクリ
ーニングし、もう一つのプラークリフトは前述のように
放射標識された331塩基対のプローブにハイブリダイズ
させた。4個の全てが両方のプローブにハイブリダイズ
することが見出された。
て、第三回目のスクリーニングを行った。プラークリフ
トの一つは放射標識した797塩基対のプローブでスクリ
ーニングし、もう一つのプラークリフトは前述のように
放射標識された331塩基対のプローブにハイブリダイズ
させた。4個の全てが両方のプローブにハイブリダイズ
することが見出された。
【0155】第三回目のスクリーニングで797塩基対お
よび331塩基対のプローブの両方にハイブリダイズした
8個のクローンを全て、単一のプラークとして釣り上げ
た。ファージDNA沈澱を標準法に従い調製した。次
に、ファージのゲノムDNAの挿入フラグメントを、配
列決定のためにM13mp18およびM13mp19ファージに移入
し、これらがヒト血管内皮細胞増殖因子をコードしてい
ることを確かめた。ヒト血管内皮細胞増殖因子をコード
しているゲノムクローンを含有する、バクテリオファー
ジの一つは、American Type Culture CollectionにATCC
番号40636で寄託されている。
よび331塩基対のプローブの両方にハイブリダイズした
8個のクローンを全て、単一のプラークとして釣り上げ
た。ファージDNA沈澱を標準法に従い調製した。次
に、ファージのゲノムDNAの挿入フラグメントを、配
列決定のためにM13mp18およびM13mp19ファージに移入
し、これらがヒト血管内皮細胞増殖因子をコードしてい
ることを確かめた。ヒト血管内皮細胞増殖因子をコード
しているゲノムクローンを含有する、バクテリオファー
ジの一つは、American Type Culture CollectionにATCC
番号40636で寄託されている。
【0156】このクローンの配列解析から、成熟型のヒ
ト血管内皮細胞増殖因子をコードする配列、および成熟
型タンパク質の最初のアミノ酸からすぐ上流のシグナル
配列のうち4個のアミノ酸をコードする配列が判明し
た。このクローンに5’末端で重複する第二のゲノムク
ローンは、ヒト血管内皮細胞増殖因子の残りの26個のア
ミノ酸のシグナル配列をコードする、さらに上流の配列
を与えた。シグナル配列および5’非翻訳領域を含有す
る、第二のゲノムクローンを得るために、オリゴヌクレ
オチド5'-CTCTCTTGGGTACATTGGAGCCTTGCCTTGCTGCTCTACCT
TCACCATGCCAAGを用いてゲノムライブラリー(前述に同
じ)をスクリーニングした。このオリゴヌクレオチド配
列は、PCRにより生じたウシcDNAに由来する。約1.2
×106個のファージをスクリーニングした。各2枚のニ
トロセルロースフィルター上のプラークリフトをNaOH、
中和、および6×SSCバッファーでそれぞれ4分間処理
した。空気乾燥の後、バキュームオーブンで2時間、80
℃で焼き付けた。プレハイブリダイゼーションは短いオ
リゴのプレハイブリダイゼーション用バッファーを用い
て、室温で6時間行った。[32P]-標識したオリゴヌク
レオチドの2×106cpm/mlをフィルターに添加し、同じ
バッファー中で一晩、室温でハイブリダイズさせた。フ
ィルターを1×SSC、0.1% SDSで、バッファーを2回替
えて、50℃で2時間、洗浄した。第一回目のスクリーニ
ングで陽性クローンについて、プラーク精製および再ス
クリーニングを行った。1つの陽性クローンが得られ
た。
ト血管内皮細胞増殖因子をコードする配列、および成熟
型タンパク質の最初のアミノ酸からすぐ上流のシグナル
配列のうち4個のアミノ酸をコードする配列が判明し
た。このクローンに5’末端で重複する第二のゲノムク
ローンは、ヒト血管内皮細胞増殖因子の残りの26個のア
ミノ酸のシグナル配列をコードする、さらに上流の配列
を与えた。シグナル配列および5’非翻訳領域を含有す
る、第二のゲノムクローンを得るために、オリゴヌクレ
オチド5'-CTCTCTTGGGTACATTGGAGCCTTGCCTTGCTGCTCTACCT
TCACCATGCCAAGを用いてゲノムライブラリー(前述に同
じ)をスクリーニングした。このオリゴヌクレオチド配
列は、PCRにより生じたウシcDNAに由来する。約1.2
×106個のファージをスクリーニングした。各2枚のニ
トロセルロースフィルター上のプラークリフトをNaOH、
中和、および6×SSCバッファーでそれぞれ4分間処理
した。空気乾燥の後、バキュームオーブンで2時間、80
℃で焼き付けた。プレハイブリダイゼーションは短いオ
リゴのプレハイブリダイゼーション用バッファーを用い
て、室温で6時間行った。[32P]-標識したオリゴヌク
レオチドの2×106cpm/mlをフィルターに添加し、同じ
バッファー中で一晩、室温でハイブリダイズさせた。フ
ィルターを1×SSC、0.1% SDSで、バッファーを2回替
えて、50℃で2時間、洗浄した。第一回目のスクリーニ
ングで陽性クローンについて、プラーク精製および再ス
クリーニングを行った。1つの陽性クローンが得られ
た。
【0157】これらの2個のクローンから得られた混成
ゲノム配列を図8に示す。図は8個のエキソン(ローマ
数字で示す)を表し、これらは本来のシグナル配列と、
異なるメッセージのスプライシングの結果生じ得るヒト
血管内皮細胞増殖因子の全ての型とをコードする。完全
なイントロン配列は示されておらず、各々のエキソンに
隣接する「結合部の」配列のみが呈示されている。エキ
ソンが図8に描かれているように、成熟型hVEGF
121はエキソンII-VおよびVIIIにコードされ;成熟型h
VEGF165はエキソンI-V、VIIおよびVIIIにコードさ
れ;成熟型hVEGF189はエキソンII-VIIIにコードさ
れている。
ゲノム配列を図8に示す。図は8個のエキソン(ローマ
数字で示す)を表し、これらは本来のシグナル配列と、
異なるメッセージのスプライシングの結果生じ得るヒト
血管内皮細胞増殖因子の全ての型とをコードする。完全
なイントロン配列は示されておらず、各々のエキソンに
隣接する「結合部の」配列のみが呈示されている。エキ
ソンが図8に描かれているように、成熟型hVEGF
121はエキソンII-VおよびVIIIにコードされ;成熟型h
VEGF165はエキソンI-V、VIIおよびVIIIにコードさ
れ;成熟型hVEGF189はエキソンII-VIIIにコードさ
れている。
【0158】実施例6 ヒト血管内皮細胞増殖因子をコードするcDNAの回収 血管内皮細胞増殖因子mRNAの細胞源 血管平滑筋細胞は、血管内皮細胞増殖因子タンパク質を
コードするmRNAを高レベルで産生し、そのために、血管
内皮細胞増殖因子配列に富んだcDNAライブラリー用
のmRNAの良い調製源である。ヒト胎児血管平滑筋(fhVS
M)細胞を、10%(v/v)ウシ胎児血清(HYCLONE)、2m
MのL-グルタミン、ml当り各100Uのペニシリンおよびス
トレプトマイシン、および組換え血管内皮細胞増殖因子
(1ng/mlの濃度で48時間毎に加える)、を補った、低グ
ルコースのダルベッコ改変イーグルス培地(DMEM-16、G
IBCO)中で培養した。細胞をコンフルエンスまで継代
し、典型的には25%コンフルエンスで蒔き、再培養し
た。
コードするmRNAを高レベルで産生し、そのために、血管
内皮細胞増殖因子配列に富んだcDNAライブラリー用
のmRNAの良い調製源である。ヒト胎児血管平滑筋(fhVS
M)細胞を、10%(v/v)ウシ胎児血清(HYCLONE)、2m
MのL-グルタミン、ml当り各100Uのペニシリンおよびス
トレプトマイシン、および組換え血管内皮細胞増殖因子
(1ng/mlの濃度で48時間毎に加える)、を補った、低グ
ルコースのダルベッコ改変イーグルス培地(DMEM-16、G
IBCO)中で培養した。細胞をコンフルエンスまで継代
し、典型的には25%コンフルエンスで蒔き、再培養し
た。
【0159】ポリ(A)+RNAの単離 血管平滑筋細胞mRNAを単離するために、典型的には、細
胞をコンフルエンスまで生育させ、次いで血管内皮細胞
増殖因子mRNAの合成をさらに刺激するための、フォルボ
ールミリステートアセテート(PMA)処理を、行う、あ
るいは行わなかった。細胞のモノレイヤーを、5から20
mlのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS)で2
回洗浄し、残存する培地を除去し、次いで、RNAをChirg
winらの、Biochemistry (1979) 18:5294-5299の方法で
単離した。この方法では、溶解バッファー(4.0Mのグ
アニジンチオシアネート、0.1%のアンチフォームA、2
5mMのクエン酸ナトリウム、0.5%のN-ラウロイルサル
コシン、および100mMのβ-メルカプトエタノール)の直
接添加により、モノレイヤー中の細胞を溶解する。注射
針を通過させDNAを切断した後、酢酸およびエタノー
ルの添加により、RNAを直接沈澱させる。沈澱したRNA
を、次にジエチルピロカーボネート(DEP)-処理した脱
イオン水(D-H2O、典型的には約400μl)に再懸濁し、
2.6mlのグアニジン-HClバッファー(7.5Mのグアニジ
ン、25mMのクエン酸ナトリウム、5mMのジチオスレイト
ール)を添加し、そして酢酸およびエタノールの添加に
より、RNAを沈澱させる。沈澱させたRNAを、再び400μl
のDEP-処理したd-H2Oに再懸濁し、そして酢酸ナトリウ
ムおよびエタノールの添加によりRNAを沈澱させた。
胞をコンフルエンスまで生育させ、次いで血管内皮細胞
増殖因子mRNAの合成をさらに刺激するための、フォルボ
ールミリステートアセテート(PMA)処理を、行う、あ
るいは行わなかった。細胞のモノレイヤーを、5から20
mlのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS)で2
回洗浄し、残存する培地を除去し、次いで、RNAをChirg
winらの、Biochemistry (1979) 18:5294-5299の方法で
単離した。この方法では、溶解バッファー(4.0Mのグ
アニジンチオシアネート、0.1%のアンチフォームA、2
5mMのクエン酸ナトリウム、0.5%のN-ラウロイルサル
コシン、および100mMのβ-メルカプトエタノール)の直
接添加により、モノレイヤー中の細胞を溶解する。注射
針を通過させDNAを切断した後、酢酸およびエタノー
ルの添加により、RNAを直接沈澱させる。沈澱したRNA
を、次にジエチルピロカーボネート(DEP)-処理した脱
イオン水(D-H2O、典型的には約400μl)に再懸濁し、
2.6mlのグアニジン-HClバッファー(7.5Mのグアニジ
ン、25mMのクエン酸ナトリウム、5mMのジチオスレイト
ール)を添加し、そして酢酸およびエタノールの添加に
より、RNAを沈澱させる。沈澱させたRNAを、再び400μl
のDEP-処理したd-H2Oに再懸濁し、そして酢酸ナトリウ
ムおよびエタノールの添加によりRNAを沈澱させた。
【0160】グアニジン-チオシアネート法(上述)で
単離した全細胞RNAを、さらに、確立した方法(Edmond
s, M. らの、PNAS(1971)68:1336、Aviv, H.およびLe
der, P.のPNAS(1972)69:1408)によりオリゴd(T)
-セルロースクロマトグラフィーで分画し、ポリ(A)+
RNAを単離した。
単離した全細胞RNAを、さらに、確立した方法(Edmond
s, M. らの、PNAS(1971)68:1336、Aviv, H.およびLe
der, P.のPNAS(1972)69:1408)によりオリゴd(T)
-セルロースクロマトグラフィーで分画し、ポリ(A)+
RNAを単離した。
【0161】cDNA合成、および血管内皮細胞増殖因
子cDNAのλZAPIIへのクローニング cDNA合成を、GublerおよびHoffmannの、方法(Gen
e, 25:263-269)に従い、Boehringer-Mannheim Biochem
icalsから購入したcDNA合成キットを用い行った。
この方法を簡単に記載すると以下のようになる:第一鎖
cDNA合成を先ず、オリゴd(T)15をプライマーと
して、5から20μgのfhVSMポリ(A)+RNAの3’末端
から逆転写酵素による合成を開始した。得られたRNA-DN
AハイブリッドをRNase Hで制限消化し、E.coli DNA
ポリメラーゼIを用いた第二鎖DNAの合成用の3’-OH
プライマーを得た。次にT4 DNAポリメラーゼを用い
て、残っている全ての突出3'-末端を除去し、平滑末端
cDNA生成物を得た。
子cDNAのλZAPIIへのクローニング cDNA合成を、GublerおよびHoffmannの、方法(Gen
e, 25:263-269)に従い、Boehringer-Mannheim Biochem
icalsから購入したcDNA合成キットを用い行った。
この方法を簡単に記載すると以下のようになる:第一鎖
cDNA合成を先ず、オリゴd(T)15をプライマーと
して、5から20μgのfhVSMポリ(A)+RNAの3’末端
から逆転写酵素による合成を開始した。得られたRNA-DN
AハイブリッドをRNase Hで制限消化し、E.coli DNA
ポリメラーゼIを用いた第二鎖DNAの合成用の3’-OH
プライマーを得た。次にT4 DNAポリメラーゼを用い
て、残っている全ての突出3'-末端を除去し、平滑末端
cDNA生成物を得た。
【0162】λZAPII(Stratagene, Inc., La Jolla, C
A)のような、λクローニングベクターに挿入する前
に、標準的な方法で平滑末端化したcDNAをメチル化
し(例えば、EcoRIメチラーゼで)、cDNA中に存在
する特定のサブセットの制限酵素部位の開裂をブロック
する(即ち、EcoRIメチラーゼでメチル化するとEcoRIに
よるcDNAの開裂がブロックされる)。次にこのcD
NAをオリゴヌクレオチドリンカーにライゲーションし
(例えば、EcoRIリンカーGGAATTCC)、リンカーを適切
な制限エンドヌクレアーゼで開裂し(例えば、EcoR
I)、そして過剰のリンカーを除去した後に、cDNA
をλベクターの適切なクローニング部位に最終的にライ
ゲーションする(例えば、λZAPIIのEcoRI部位)。cD
NAをベクターの腕にライゲーションした後に、クロー
ニングしたcDNAをGigapack II Gold(Stratagene,
Inc., La Jolla, CA)のような、λパッケージング抽出
物と「パッケージング」する。
A)のような、λクローニングベクターに挿入する前
に、標準的な方法で平滑末端化したcDNAをメチル化
し(例えば、EcoRIメチラーゼで)、cDNA中に存在
する特定のサブセットの制限酵素部位の開裂をブロック
する(即ち、EcoRIメチラーゼでメチル化するとEcoRIに
よるcDNAの開裂がブロックされる)。次にこのcD
NAをオリゴヌクレオチドリンカーにライゲーションし
(例えば、EcoRIリンカーGGAATTCC)、リンカーを適切
な制限エンドヌクレアーゼで開裂し(例えば、EcoR
I)、そして過剰のリンカーを除去した後に、cDNA
をλベクターの適切なクローニング部位に最終的にライ
ゲーションする(例えば、λZAPIIのEcoRI部位)。cD
NAをベクターの腕にライゲーションした後に、クロー
ニングしたcDNAをGigapack II Gold(Stratagene,
Inc., La Jolla, CA)のような、λパッケージング抽出
物と「パッケージング」する。
【0163】パッケージングの後、λファージを適切な
宿主株(例えばλZAPIIベクターに対してはXL1-Blue、S
tratagene, Inc., La Jolla, CA)にタイターした後、1
0,000と50,000pfu/プレートの間のタイターで、NZYMア
ガーの150mmプレートに撒いた。37℃で6-8時間生育さ
せた後、プレートを4℃まで冷やし、ニトロセルロース
膜(BA85, SCHLEICHER AND SCHUELL)またはハイボンド
-N膜(AMERSHAM)上にプラークリフトを、標準法(Ben
ton, W.D.およびDavis, R.W., Science(1977) 196:18
0)に従い調製した。血管内皮細胞増殖因子の配列に相
同であるか、または一部相同な配列を含むクローンは、
pST800(前述の実施例3)のcDNA挿入に由来するウ
シ血管内皮細胞増殖因子の、32P-標識体、または図3
aの配列に基づいた、血管内皮細胞増殖因子の配列に特
異的なオリゴヌクレオチドに対して、ハイブリダイゼー
ションを行って検出する。ハイブリダイゼーションは、
20%と50%との間のホルムアミドおよび0%と10%との
間の硫酸デキストランを含有する標準的なハイブリダイ
ゼーション用バッファー中で、37℃と42℃との間で行
う。血管内皮細胞増殖因子プローブにハイブリダイズす
るクローンについて、続いて単一プラークに精製し、D
NA配列解析のために、関連の配列をバクテリオファー
ジM13ベクター、例えばM13mp18およびM13mp19にサブク
ローンした。
宿主株(例えばλZAPIIベクターに対してはXL1-Blue、S
tratagene, Inc., La Jolla, CA)にタイターした後、1
0,000と50,000pfu/プレートの間のタイターで、NZYMア
ガーの150mmプレートに撒いた。37℃で6-8時間生育さ
せた後、プレートを4℃まで冷やし、ニトロセルロース
膜(BA85, SCHLEICHER AND SCHUELL)またはハイボンド
-N膜(AMERSHAM)上にプラークリフトを、標準法(Ben
ton, W.D.およびDavis, R.W., Science(1977) 196:18
0)に従い調製した。血管内皮細胞増殖因子の配列に相
同であるか、または一部相同な配列を含むクローンは、
pST800(前述の実施例3)のcDNA挿入に由来するウ
シ血管内皮細胞増殖因子の、32P-標識体、または図3
aの配列に基づいた、血管内皮細胞増殖因子の配列に特
異的なオリゴヌクレオチドに対して、ハイブリダイゼー
ションを行って検出する。ハイブリダイゼーションは、
20%と50%との間のホルムアミドおよび0%と10%との
間の硫酸デキストランを含有する標準的なハイブリダイ
ゼーション用バッファー中で、37℃と42℃との間で行
う。血管内皮細胞増殖因子プローブにハイブリダイズす
るクローンについて、続いて単一プラークに精製し、D
NA配列解析のために、関連の配列をバクテリオファー
ジM13ベクター、例えばM13mp18およびM13mp19にサブク
ローンした。
【0164】血管内皮細胞増殖因子のヒトのcDNA配
列は、ヒト血管内皮細胞増殖因子の遺伝子産物の、対応
するアミノ酸配列の予測に用い得る。cDNAはまた、
E.coliのような細菌、またはイーストまたは哺乳類細
胞でヒト血管内皮細胞増殖因子のタンパク質産物を発現
するように設計された構築物の、転写制御エレメントに
連結し得る。
列は、ヒト血管内皮細胞増殖因子の遺伝子産物の、対応
するアミノ酸配列の予測に用い得る。cDNAはまた、
E.coliのような細菌、またはイーストまたは哺乳類細
胞でヒト血管内皮細胞増殖因子のタンパク質産物を発現
するように設計された構築物の、転写制御エレメントに
連結し得る。
【0165】実施例7 ヒト血管内皮細胞増殖因子(hVEGF121およびhV
EGF165)のDNA配列およびアミノ酸配列 実施例6に記載した方法に従い、ヒト血管内皮細胞増殖
因子をコードするcDNAクローンを調製および単離し
た。多数のクローンの配列決定により、多様性情報スプ
ライシングがウシの場合と同様に起こることが確認され
た。従って、bVEGF120およびbVEGF164に相当
するヒトタンパク質の発現型が存在する(しかし、ヒト
タンパク質にはウシ型の血管内皮細胞増殖因子にない付
加されたアミノ酸を7位に含有するため、ヒト型の血管
内皮細胞増殖因子は各々、121および165残基を含有す
る)。λH3と命名した、hVEGF121のコード領域の
一部を含有するcDNAクローンは、寄託番号40728と
してAmerican Type CultureCollectionに寄託されてい
る。λH2と命名した、hVEGF165のコード領域の一
部を含有するcDNAクローンも、寄託番号40727とし
て寄託されている。さらに、hVEGF121およびhV
EGF165の一次翻訳物全体をコードする別のクローン
も、類似の方法によって得られ得る。
EGF165)のDNA配列およびアミノ酸配列 実施例6に記載した方法に従い、ヒト血管内皮細胞増殖
因子をコードするcDNAクローンを調製および単離し
た。多数のクローンの配列決定により、多様性情報スプ
ライシングがウシの場合と同様に起こることが確認され
た。従って、bVEGF120およびbVEGF164に相当
するヒトタンパク質の発現型が存在する(しかし、ヒト
タンパク質にはウシ型の血管内皮細胞増殖因子にない付
加されたアミノ酸を7位に含有するため、ヒト型の血管
内皮細胞増殖因子は各々、121および165残基を含有す
る)。λH3と命名した、hVEGF121のコード領域の
一部を含有するcDNAクローンは、寄託番号40728と
してAmerican Type CultureCollectionに寄託されてい
る。λH2と命名した、hVEGF165のコード領域の一
部を含有するcDNAクローンも、寄託番号40727とし
て寄託されている。さらに、hVEGF121およびhV
EGF165の一次翻訳物全体をコードする別のクローン
も、類似の方法によって得られ得る。
【0166】実施例5の寄託ヒトゲノムクローンから、
および実施例6に記載の方法によって得られた多数のc
DNAクローンの配列情報に基づき、hVEGF121お
よびhVEGF165をコードする天然DNA配列を決定
した。そのDNA配列を図7に示す。囲まれた132ヌク
レオチド配列は、情報により多様性にスプライシングさ
れる部分に相当するDNA配列を包含する。翻訳された
情報の中にこの配列が存在している時、コードされたタ
ンパク貿はhVEGF165であり、そのアミノ酸配列は
図7のオリゴヌクレオチド配列の上に直接示されてい
る。この配列が翻訳された情報に存在しない時、コード
されたタンパク質はhVEGF121である。この型のタ
ンパク質は、114位のアミノ酸までhVEGF165と同じ
アミノ酸配列を有する。112位から始まるhVEGF121
のカルボキシル末端配列は、図7のヌクレオチド配列の
下にイタリック体で表されている。hVEGF121およ
びhVEGF165をコードする連続のcDNA配列は、
合成オリゴヌクレオチドから、あるいは実施例4に記載
の方法に類似した方法を用い、ヒト胎児血管平滑筋のpo
ly(A)+RNAからポリメラーゼチェーンリアクションを
用いて、作製し得る。
および実施例6に記載の方法によって得られた多数のc
DNAクローンの配列情報に基づき、hVEGF121お
よびhVEGF165をコードする天然DNA配列を決定
した。そのDNA配列を図7に示す。囲まれた132ヌク
レオチド配列は、情報により多様性にスプライシングさ
れる部分に相当するDNA配列を包含する。翻訳された
情報の中にこの配列が存在している時、コードされたタ
ンパク貿はhVEGF165であり、そのアミノ酸配列は
図7のオリゴヌクレオチド配列の上に直接示されてい
る。この配列が翻訳された情報に存在しない時、コード
されたタンパク質はhVEGF121である。この型のタ
ンパク質は、114位のアミノ酸までhVEGF165と同じ
アミノ酸配列を有する。112位から始まるhVEGF121
のカルボキシル末端配列は、図7のヌクレオチド配列の
下にイタリック体で表されている。hVEGF121およ
びhVEGF165をコードする連続のcDNA配列は、
合成オリゴヌクレオチドから、あるいは実施例4に記載
の方法に類似した方法を用い、ヒト胎児血管平滑筋のpo
ly(A)+RNAからポリメラーゼチェーンリアクションを
用いて、作製し得る。
【0167】実施例8 ヒト型の血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドの発現 上記の標準的な方法に従って、ヒト血管内皮細胞増殖因
子(hVEGF121あるいはhVEGF165)の一次翻訳
物をコードする全領域を含有するcDNAクローンは、
完全型あるいは切断(改変)型が最も便利に、種々の宿
主内で組換えタンパク質を生産するのに使用される。し
かし、哺乳類系での発現が好ましい。なぜなら、宿主が
天然で作られるタンパク質に見られるような翻訳後のプ
ロセッシングが可能であり、そして宿主がイントロンの
プロセッシングも可能であるために、cDNAあるいは
ゲノム配列のいずれかを使用し得るためである。
ポリペプチドの発現 上記の標準的な方法に従って、ヒト血管内皮細胞増殖因
子(hVEGF121あるいはhVEGF165)の一次翻訳
物をコードする全領域を含有するcDNAクローンは、
完全型あるいは切断(改変)型が最も便利に、種々の宿
主内で組換えタンパク質を生産するのに使用される。し
かし、哺乳類系での発現が好ましい。なぜなら、宿主が
天然で作られるタンパク質に見られるような翻訳後のプ
ロセッシングが可能であり、そして宿主がイントロンの
プロセッシングも可能であるために、cDNAあるいは
ゲノム配列のいずれかを使用し得るためである。
【0168】従って、宿主ベクターへの挿入のために、
ヒト血管内皮細胞増殖因子のいずれかの型をコードする
全領域を含有するcDNAあるいはゲノムクローンは、
以下に説明される通り調製される、しかしこれに限定さ
れない。
ヒト血管内皮細胞増殖因子のいずれかの型をコードする
全領域を含有するcDNAあるいはゲノムクローンは、
以下に説明される通り調製される、しかしこれに限定さ
れない。
【0169】ベクターを構築するために、クローン化さ
れたcDNAあるいはゲノム挿入物を、それが単離され
るクローニングベクターから切り出す。この挿入物を、
NcoI、BamHI、EcoRIあるいは必要ならば他の適切なリン
カーにより得られ、そして次にpHS1あるいはその誘導体
のような適切な宿主ベクター中に、以下の通りに挿入す
る。あるいは、挿入物の切断および適切なベクターへの
挿入の前に、都合のよい制限酵素部位あるいは別のコー
ド配列をクローン化される挿入部に導入するために、イ
ンビトロ変異誘発を用い得る。
れたcDNAあるいはゲノム挿入物を、それが単離され
るクローニングベクターから切り出す。この挿入物を、
NcoI、BamHI、EcoRIあるいは必要ならば他の適切なリン
カーにより得られ、そして次にpHS1あるいはその誘導体
のような適切な宿主ベクター中に、以下の通りに挿入す
る。あるいは、挿入物の切断および適切なベクターへの
挿入の前に、都合のよい制限酵素部位あるいは別のコー
ド配列をクローン化される挿入部に導入するために、イ
ンビトロ変異誘発を用い得る。
【0170】宿主ベクターの構築 pHS1 プラスミドpHS1は、哺乳類宿主中で挿入DNAを発現さ
せるのに適する。このプラスミドは、p84H(Karin, M.
ら、Nature(1982) 299:797-802)由来のヒトメタロチオ
ネイン-IIA(hMT-IIA)配列の、hMT-IIA遺伝子の-765位
のHindIII部位から+70位塩基のBamHI開裂部位に至る約8
40塩基対を含有する。pHS1を構築するために、プラスミ
ドp84HをBamHIで完全消化し、エキソヌクレアーゼBAL-3
1で処理して末端ヌクレオチドを除去し、そして次にHin
dIIIで消化した。所望の約840塩基対のフラグメントをH
indIIIおよびHindII消化で開環したpUC8(Vieira, J.
ら、Gene(1982) 19:259-268)に連結した。このライゲー
ション反応混合物をE.coli HB101をAmpRとするように
形質転換するために用いて、そしてpHS1と命名した、一
つの候補プラスミドを単離し、そしてジデオキシシーケ
ンシングにより配列決定した。pHS1はhMT-IIA制御配列
を、都合のよい制限部位(BamHI、SmaI、およびEcoRI)
を含有するポリリンカーの上流に含有する。
せるのに適する。このプラスミドは、p84H(Karin, M.
ら、Nature(1982) 299:797-802)由来のヒトメタロチオ
ネイン-IIA(hMT-IIA)配列の、hMT-IIA遺伝子の-765位
のHindIII部位から+70位塩基のBamHI開裂部位に至る約8
40塩基対を含有する。pHS1を構築するために、プラスミ
ドp84HをBamHIで完全消化し、エキソヌクレアーゼBAL-3
1で処理して末端ヌクレオチドを除去し、そして次にHin
dIIIで消化した。所望の約840塩基対のフラグメントをH
indIIIおよびHindII消化で開環したpUC8(Vieira, J.
ら、Gene(1982) 19:259-268)に連結した。このライゲー
ション反応混合物をE.coli HB101をAmpRとするように
形質転換するために用いて、そしてpHS1と命名した、一
つの候補プラスミドを単離し、そしてジデオキシシーケ
ンシングにより配列決定した。pHS1はhMT-IIA制御配列
を、都合のよい制限部位(BamHI、SmaI、およびEcoRI)
を含有するポリリンカーの上流に含有する。
【0171】機能する宿主プラスミドpHS1を、メタロチ
オネインプロモーター以外の別の制御因子を含有させる
ように、さらに改変し得る。特に、SV40のようなウイル
ス系のエンハンサーエレメント、およびヒト成長ホルモ
ン(hGH)のような他のタンパク質の3’非翻訳領域に
関連する終止シグナルを加え得る。
オネインプロモーター以外の別の制御因子を含有させる
ように、さらに改変し得る。特に、SV40のようなウイル
ス系のエンハンサーエレメント、およびヒト成長ホルモ
ン(hGH)のような他のタンパク質の3’非翻訳領域に
関連する終止シグナルを加え得る。
【0172】ウイルスのエンハンサー 1118塩基対のSV40のDNAフラグメントをpHS1のMT-IIA
プロモーター配列の前のHindIII部位に挿入して、MT-II
Aプロモーターに作動可能に連結させたSV40エンハンサ
ーを含有する、一対の宿主発現ベクターを構築した。SV
40のDNAフラグメントは、SV40の複製起点を含み、ヌ
クレオチド5172位からヌクレオチド5243位(起点の部
位)に至る配列、ヌクレオチド107-250由来の重複した7
2塩基対の反復を含有し、後期ウイルス遺伝子の5’末
端を含有する起点の横のヌクレオチド1046位を含めて続
く。このHindIIIの1118塩基対フラグメントは、SV40 DN
A(Buchman, A.R.ら、DNA Tumor Viruses, 2nd ed (J. T
ooze編), Cold Spring Harbor Laboratory, New York
(1981), pp. 799-841)のHindIII消化によって得られ、
そして増幅のためにpBR322にクローン化される。このSV
40フラグメントを含有するpBR322べクターをHindIIIで
切断して、そして1118塩基対のSV40 DNAフラグメントを
ゲル電気泳動により単離して、そしてHindIII消化し、C
IP処理したpHS1に連結した。pHS1-SV(9)およびpHS1-SV
(10)と命名した、得られたベクターは、MT-IIAプロモー
ターの前にSV40フラグメントを逆方向で含有する。pHS1
-SV(9)において、エンハンサーは、MT-IIAプロモーター
の5’mRNA開始部位からの約1600塩基対であり、逆方向
ではこれは5’mRNA開始部位からの約980塩基対であ
る。両方の方向が作動可能であるが、エンハンサー配列
が開始部位に近い方の方向がより高い発現レベルを与え
る。転写開始部位の250から400塩基対上流にエンハンサ
ーを位置させるような削除が最適であると考えられてい
る。
プロモーター配列の前のHindIII部位に挿入して、MT-II
Aプロモーターに作動可能に連結させたSV40エンハンサ
ーを含有する、一対の宿主発現ベクターを構築した。SV
40のDNAフラグメントは、SV40の複製起点を含み、ヌ
クレオチド5172位からヌクレオチド5243位(起点の部
位)に至る配列、ヌクレオチド107-250由来の重複した7
2塩基対の反復を含有し、後期ウイルス遺伝子の5’末
端を含有する起点の横のヌクレオチド1046位を含めて続
く。このHindIIIの1118塩基対フラグメントは、SV40 DN
A(Buchman, A.R.ら、DNA Tumor Viruses, 2nd ed (J. T
ooze編), Cold Spring Harbor Laboratory, New York
(1981), pp. 799-841)のHindIII消化によって得られ、
そして増幅のためにpBR322にクローン化される。このSV
40フラグメントを含有するpBR322べクターをHindIIIで
切断して、そして1118塩基対のSV40 DNAフラグメントを
ゲル電気泳動により単離して、そしてHindIII消化し、C
IP処理したpHS1に連結した。pHS1-SV(9)およびpHS1-SV
(10)と命名した、得られたベクターは、MT-IIAプロモー
ターの前にSV40フラグメントを逆方向で含有する。pHS1
-SV(9)において、エンハンサーは、MT-IIAプロモーター
の5’mRNA開始部位からの約1600塩基対であり、逆方向
ではこれは5’mRNA開始部位からの約980塩基対であ
る。両方の方向が作動可能であるが、エンハンサー配列
が開始部位に近い方の方向がより高い発現レベルを与え
る。転写開始部位の250から400塩基対上流にエンハンサ
ーを位置させるような削除が最適であると考えられてい
る。
【0173】SV40エンハンサーの3’末端の190塩基
対、250塩基対、および360塩基対のそれぞれをMT-IIAプ
ロモーターTATAボックスの5’末端の上流に位置させた
ベクターをさらに構築した。これらの構築物は、Karin,
M.ら、Nature (1984) 308:513-519に記載されているヒ
トMT-IIAプロモーターの上流調節領域のマッピングに基
づいている。全ての構築物は、重金属による調節のため
の重複部位を含有する配列を保持しているが、190塩基
対および250塩基対分離物からの構築物は、これらの重
金属調節部位のさらに上流にあるグルココルチコイド調
節配列を保持していない。
対、250塩基対、および360塩基対のそれぞれをMT-IIAプ
ロモーターTATAボックスの5’末端の上流に位置させた
ベクターをさらに構築した。これらの構築物は、Karin,
M.ら、Nature (1984) 308:513-519に記載されているヒ
トMT-IIAプロモーターの上流調節領域のマッピングに基
づいている。全ての構築物は、重金属による調節のため
の重複部位を含有する配列を保持しているが、190塩基
対および250塩基対分離物からの構築物は、これらの重
金属調節部位のさらに上流にあるグルココルチコイド調
節配列を保持していない。
【0174】pHS'-SV190、pHS'-SV250、およびpHS'-SV3
60と命名した、これらのベクターは以下の概略に従って
調製した。メタロチオネインプロモーターを含有する配
列の長さおよびpHS1から切り出されたフラグメントとし
て供給される上流領域の長さ以外は、全ての構築物は同
じである。
60と命名した、これらのベクターは以下の概略に従って
調製した。メタロチオネインプロモーターを含有する配
列の長さおよびpHS1から切り出されたフラグメントとし
て供給される上流領域の長さ以外は、全ての構築物は同
じである。
【0175】pHS'-SV190の場合、pHS1をSacIIで消化し
て、末端を平滑化し、そしてKpnIリンカーに連結する。
次に、このDNAをEcoRIおよびKpnIで消化し、MT-IIA
制御配列の適切な部分を切り出す。同様に、pHS'-SV250
の場合、pHS1をHgaIで消化して、末端を平滑化し、KpnI
リンカーに連結し、そしてEcoRIおよびKpnIで消化す
る;pHS'-SV360では、最初の消化にDdeIを用いる。
て、末端を平滑化し、そしてKpnIリンカーに連結する。
次に、このDNAをEcoRIおよびKpnIで消化し、MT-IIA
制御配列の適切な部分を切り出す。同様に、pHS'-SV250
の場合、pHS1をHgaIで消化して、末端を平滑化し、KpnI
リンカーに連結し、そしてEcoRIおよびKpnIで消化す
る;pHS'-SV360では、最初の消化にDdeIを用いる。
【0176】SV40エンハンサーを含有する中間体ベクタ
ーを以下のように調製する。SV40のHindIII/KpnIフラグ
メント(5172位から298位までに伸長し、KpnI部位から5
0塩基対のところにエンハンサーエレメントを含有す
る)を、KpnI/HindIIIで消化したpUC19に挿入してpUC-S
Vを得る(pUC19はポリリンカー領域に3つの都合のよい
制限部位を、HindIII、KpnIおよびEcoRIの順で含有す
る)。上記の記載通りに調製したKpnI/EcoRIフラグメン
トを、KnpI/EcoRIで消化したpUC-SVに挿入して、完成ベ
クターを得る。
ーを以下のように調製する。SV40のHindIII/KpnIフラグ
メント(5172位から298位までに伸長し、KpnI部位から5
0塩基対のところにエンハンサーエレメントを含有す
る)を、KpnI/HindIIIで消化したpUC19に挿入してpUC-S
Vを得る(pUC19はポリリンカー領域に3つの都合のよい
制限部位を、HindIII、KpnIおよびEcoRIの順で含有す
る)。上記の記載通りに調製したKpnI/EcoRIフラグメン
トを、KnpI/EcoRIで消化したpUC-SVに挿入して、完成ベ
クターを得る。
【0177】従って、全ての前述の改変ベクターは、SV
40エンハンサーエレメントの利点を有する。他のウイル
スのエンハンサーも、当然類似の方法で用いられ得る。
40エンハンサーエレメントの利点を有する。他のウイル
スのエンハンサーも、当然類似の方法で用いられ得る。
【0178】転写終止配列 転写終止制御配列を得るために、コード配列を有するD
NAおよびヒト増殖ホルモンの3’非翻訳領域を、pHS1
につないだ。hGHコード領域の換わりに、hGH3’非翻訳
領域からコード配列までを順にベクター中につないだ中
間的なベクターを得た。
NAおよびヒト増殖ホルモンの3’非翻訳領域を、pHS1
につないだ。hGHコード領域の換わりに、hGH3’非翻訳
領域からコード配列までを順にベクター中につないだ中
間的なベクターを得た。
【0179】hGHをコードするゲノム配列は、p2.6-3(D
eNotoら、Nucleic Acids Res.(1981)19:3719)から、
最初のエキソンの5’末端で切断するBamHI、および機
能遺伝子の3’を切断するEcoRIで消化し、次いでポリ
アクリルアミドゲル精製を行い、単離した。単離したフ
ラグメントをBamHI/EcoRI消化したpHS1にライゲーショ
ンし、そしてこのライゲーション反応混合物をE.coli
MC1061中に形質転換し、AmpRとした。成功した形質転換
体を制限酵素分析でスクリーニングし、目的のプラスミ
ドを含んだ株pMT-hGHgを、大量のプラスミドDNAを調
製するためにさらに増殖した。
eNotoら、Nucleic Acids Res.(1981)19:3719)から、
最初のエキソンの5’末端で切断するBamHI、および機
能遺伝子の3’を切断するEcoRIで消化し、次いでポリ
アクリルアミドゲル精製を行い、単離した。単離したフ
ラグメントをBamHI/EcoRI消化したpHS1にライゲーショ
ンし、そしてこのライゲーション反応混合物をE.coli
MC1061中に形質転換し、AmpRとした。成功した形質転換
体を制限酵素分析でスクリーニングし、目的のプラスミ
ドを含んだ株pMT-hGHgを、大量のプラスミドDNAを調
製するためにさらに増殖した。
【0180】上述のpHS1-SV(9)あるいはpHS1-SV(1
0)の構築で記載した方法と類似の、ただしpHS1をpMT-h
GHgに変えた方法で、MT-IIAプロモーターの制御下に、
そしてSV40エンハンサーに機能するように結合されたhG
H遺伝子を有する、各々phGHg-SV(9)およびphGHg-SV
(10)と名付けた、2つのベクターを得た。このライゲ
ーション反応混合物をE.coli MC1061をAmpRに形質転換
するのに用い、そして正しい構築物であることを確認し
た。
0)の構築で記載した方法と類似の、ただしpHS1をpMT-h
GHgに変えた方法で、MT-IIAプロモーターの制御下に、
そしてSV40エンハンサーに機能するように結合されたhG
H遺伝子を有する、各々phGHg-SV(9)およびphGHg-SV
(10)と名付けた、2つのベクターを得た。このライゲ
ーション反応混合物をE.coli MC1061をAmpRに形質転換
するのに用い、そして正しい構築物であることを確認し
た。
【0181】発現ベクターの構築 phGHg-SV(10)を、ヒト血管内皮細胞増殖因子の宿主ベク
ターとして用いた。phGHg-SV(10)を、BamHIおよびSmaI
で消化し、クレノウ断片で平滑末端とし、そしてCIPで
処理してhGHコード配列を切り出した。この開環したベ
クターを、血管内皮細胞増殖因子の全長をコードした、
cDNAあるいはゲノムクローンからのフラグメントに
ライゲーションし、発現ベクターpVEGF-SV(10)を得
た。
ターとして用いた。phGHg-SV(10)を、BamHIおよびSmaI
で消化し、クレノウ断片で平滑末端とし、そしてCIPで
処理してhGHコード配列を切り出した。この開環したベ
クターを、血管内皮細胞増殖因子の全長をコードした、
cDNAあるいはゲノムクローンからのフラグメントに
ライゲーションし、発現ベクターpVEGF-SV(10)を得
た。
【0182】図8に示すように、血管内皮細胞増殖因子
遺伝子の最初の全長翻訳産物は、26アミノ酸の分泌シグ
ナル配列を有している。この配列は、成熟血管内皮細胞
増殖因子の哺乳類細胞培養培地への分泌に効果を示し得
る。望むならば、合成オリゴヌクレオチドを、成熟血管
内皮細胞増殖因子のコード配列に加え得、(例えば、hG
Hからの)外来の分泌シグナル配列を、最初の全長翻訳
産物中に作製された血管内皮細胞増殖因子遺伝子に機能
するように結合させ得る。どちらの場合にも、産生物の
分泌が起こらねばならない。
遺伝子の最初の全長翻訳産物は、26アミノ酸の分泌シグ
ナル配列を有している。この配列は、成熟血管内皮細胞
増殖因子の哺乳類細胞培養培地への分泌に効果を示し得
る。望むならば、合成オリゴヌクレオチドを、成熟血管
内皮細胞増殖因子のコード配列に加え得、(例えば、hG
Hからの)外来の分泌シグナル配列を、最初の全長翻訳
産物中に作製された血管内皮細胞増殖因子遺伝子に機能
するように結合させ得る。どちらの場合にも、産生物の
分泌が起こらねばならない。
【0183】加えて、血管内皮細胞増殖因子遺伝子ある
いはcDNA配列を発現させるために、他の宿主ベクタ
ーも使用し得る。例えば、上述のようにSV40エンハンサ
ーの種々の立体構造を含むように改変した、pHS1および
pHS1が使用し得る。最後に、宿主ベクターは、血管内皮
細胞増殖因子遺伝子のみならず、ネオマイシン耐性遺伝
子(pSV2:NEOから得られる)および/あるいはヒトメタ
ロチオネイン-IIAタンパク質までも(pMT-VEGF-NEOある
いはpMT-VEGF-NEO-MTと呼ばれる)、コードするよう
に、さらに改変し得る。
いはcDNA配列を発現させるために、他の宿主ベクタ
ーも使用し得る。例えば、上述のようにSV40エンハンサ
ーの種々の立体構造を含むように改変した、pHS1および
pHS1が使用し得る。最後に、宿主ベクターは、血管内皮
細胞増殖因子遺伝子のみならず、ネオマイシン耐性遺伝
子(pSV2:NEOから得られる)および/あるいはヒトメタ
ロチオネイン-IIAタンパク質までも(pMT-VEGF-NEOある
いはpMT-VEGF-NEO-MTと呼ばれる)、コードするよう
に、さらに改変し得る。
【0184】これらのベクターは、以下の検討を目的に
pMT-VEGFと総称的に命名した。
pMT-VEGFと総称的に命名した。
【0185】哺乳類組換え体による血管内皮細胞増殖因
子の産生 チャイニーズハムスター卵巣(CHO)-K1細胞を、F12培
地および12%の仔ウシ胎児血清を加えたDMEの1:1の
混合培地中で生育した。構成細胞をpMT-VEGFおよびpSV
2:NEOと同時形質転換(Southern, P.らの、J. Mol. App
l. Genet.(1982)1:327-341)した;pSV2:NEOは、ネオマ
イシン類似体G418に対する耐性を付与する機能の遺伝子
を含んでいる。形質転換は、1μgのpSV2:NEOおよび1
0μgのpMT-VEGFを、リン酸カルシウム-DNA共沈澱物
中の細胞へ、Wigler, W.らの、Cell(1979)16:777-785
のプロトコールに従って加え、4時間DNAに曝した後
に、2分間15%のグリセリン”ショック”を与えた。あ
るいは細胞を、10μgのpMT-VEGF-NEOあるいはpMT-VEGF
-NEO-MTと、同じリン酸カルシウムプロトコールを用い
て形質転換した。1日後、1mg/mlのG418に細胞を曝
し、G418-耐性コロニーのプールを得た。耐性コロニー
のプールが充分生育した後、このプールを、細胞付着型
あるいは分泌型の血管内皮細胞増殖因子の産生に関して
アッセイした。
子の産生 チャイニーズハムスター卵巣(CHO)-K1細胞を、F12培
地および12%の仔ウシ胎児血清を加えたDMEの1:1の
混合培地中で生育した。構成細胞をpMT-VEGFおよびpSV
2:NEOと同時形質転換(Southern, P.らの、J. Mol. App
l. Genet.(1982)1:327-341)した;pSV2:NEOは、ネオマ
イシン類似体G418に対する耐性を付与する機能の遺伝子
を含んでいる。形質転換は、1μgのpSV2:NEOおよび1
0μgのpMT-VEGFを、リン酸カルシウム-DNA共沈澱物
中の細胞へ、Wigler, W.らの、Cell(1979)16:777-785
のプロトコールに従って加え、4時間DNAに曝した後
に、2分間15%のグリセリン”ショック”を与えた。あ
るいは細胞を、10μgのpMT-VEGF-NEOあるいはpMT-VEGF
-NEO-MTと、同じリン酸カルシウムプロトコールを用い
て形質転換した。1日後、1mg/mlのG418に細胞を曝
し、G418-耐性コロニーのプールを得た。耐性コロニー
のプールが充分生育した後、このプールを、細胞付着型
あるいは分泌型の血管内皮細胞増殖因子の産生に関して
アッセイした。
【0186】安定なpMT-VEGFの形質も有する、成功した
G418-耐性形質転換体、あるいは他の血管内皮細胞増殖
因子発現プラスミドを、低密度で蒔き、株化単離体を精
製した。少量のこれらの単離体を、2×10-4Mの塩化亜
鉛に曝した後に、マルチウェルプレートに蒔き、血管内
皮細胞増殖因子の簡易アッセイとした。血管内皮細胞増
殖因子は、内皮細胞のマイトジェン活性を、細胞中で、
および/あるいは調整培地中で調べるマイトジェンアッ
セイで、あるいは標準的な方法を用いて、標準的なELIS
A、あるいは適切な血管内皮細胞増殖因子タンパク質あ
るいはペプチドに対して調製した抗血清に対してのラジ
オイムノアッセイ、を用いて確認した。大量の、好まし
くは分泌型の、目的の血管内皮細胞増殖因子を産生して
いる株化単離体を選択した。
G418-耐性形質転換体、あるいは他の血管内皮細胞増殖
因子発現プラスミドを、低密度で蒔き、株化単離体を精
製した。少量のこれらの単離体を、2×10-4Mの塩化亜
鉛に曝した後に、マルチウェルプレートに蒔き、血管内
皮細胞増殖因子の簡易アッセイとした。血管内皮細胞増
殖因子は、内皮細胞のマイトジェン活性を、細胞中で、
および/あるいは調整培地中で調べるマイトジェンアッ
セイで、あるいは標準的な方法を用いて、標準的なELIS
A、あるいは適切な血管内皮細胞増殖因子タンパク質あ
るいはペプチドに対して調製した抗血清に対してのラジ
オイムノアッセイ、を用いて確認した。大量の、好まし
くは分泌型の、目的の血管内皮細胞増殖因子を産生して
いる株化単離体を選択した。
【0187】この細胞を1/10コンフルエンシーで10%の
ウシ胎児血清を補った基本培地(F12およびDMEの1:1
混合物)中に蒔き、一晩インキュベートし、そして次
に、1×10-4Mから3×10-4Mの濃度範囲の塩化亜鉛の
添加により血管内皮細胞増殖因子の産生を誘起した。
ウシ胎児血清を補った基本培地(F12およびDMEの1:1
混合物)中に蒔き、一晩インキュベートし、そして次
に、1×10-4Mから3×10-4Mの濃度範囲の塩化亜鉛の
添加により血管内皮細胞増殖因子の産生を誘起した。
【0188】血管内皮細胞増殖因子産生細胞を確立する
別の方法では、CHO細胞をpMT-VEGF、pSV:NEO、およびヒ
トMT-IIA挿入物を含んだpHS1(pHS1-MT)、あるいはpMT-V
EGF-NEO-MTと同時形質転換した。G418選択の後、プール
した耐性コロニーを100μMのZnCl2をインデューサーと
し、10μMのCdCl2の存在下で、カドミウム耐性に関して
選択した(MT-IIAタンパク質の発現に基づく)。次に耐
性コロニーのプールを、上述のようにアッセイし、血管
内皮細胞増殖因子の産生レベルを測定した。
別の方法では、CHO細胞をpMT-VEGF、pSV:NEO、およびヒ
トMT-IIA挿入物を含んだpHS1(pHS1-MT)、あるいはpMT-V
EGF-NEO-MTと同時形質転換した。G418選択の後、プール
した耐性コロニーを100μMのZnCl2をインデューサーと
し、10μMのCdCl2の存在下で、カドミウム耐性に関して
選択した(MT-IIAタンパク質の発現に基づく)。次に耐
性コロニーのプールを、上述のようにアッセイし、血管
内皮細胞増殖因子の産生レベルを測定した。
【0189】天然の血管内皮細胞増殖因子シグナルある
いはhGH由来のシグナルの様な、血管内皮細胞増殖因子
用の機能する分泌シグナル配列を、発現ベクターの構築
に含めることにより、CHOあるいは他の哺乳類細胞宿主
を用いた正常な本質的経路を用いた分泌に効果がある。
分泌を変化させると、タンパク質精製工程がより単純に
なり、そしてタンパク質の折畳み構造がより自然の立体
構造に近づき、再折畳み工程の必要をなくすため、当然
いくつかの利点が生じる。次に、分泌された血管内皮細
胞増殖因子の精製を、実施例9に記載の方法に従い、あ
るいは、イオン交換クロマトグラフィー、分子量排除型
クロマトグラフィー、および、例えば、逆相HPLCおよび
既知の方法に従い製造した抗血管内皮細胞増殖因子抗体
を用いた抗体親和性クロマトグラフィーのような、疎水
性による分離のような工程を含み得る、当分野で既知の
標準的な他の方法に従って、行う。
いはhGH由来のシグナルの様な、血管内皮細胞増殖因子
用の機能する分泌シグナル配列を、発現ベクターの構築
に含めることにより、CHOあるいは他の哺乳類細胞宿主
を用いた正常な本質的経路を用いた分泌に効果がある。
分泌を変化させると、タンパク質精製工程がより単純に
なり、そしてタンパク質の折畳み構造がより自然の立体
構造に近づき、再折畳み工程の必要をなくすため、当然
いくつかの利点が生じる。次に、分泌された血管内皮細
胞増殖因子の精製を、実施例9に記載の方法に従い、あ
るいは、イオン交換クロマトグラフィー、分子量排除型
クロマトグラフィー、および、例えば、逆相HPLCおよび
既知の方法に従い製造した抗血管内皮細胞増殖因子抗体
を用いた抗体親和性クロマトグラフィーのような、疎水
性による分離のような工程を含み得る、当分野で既知の
標準的な他の方法に従って、行う。
【0190】実施例9 ポリペプチドの回収および血管内皮細胞増殖因子ダイマ
ーの形成 上述のように哺乳類発現ベクター中で発現させ、産生さ
れた増殖因子の分泌型を得たならば、この増殖因子hV
EGF165は、Gospodarowiczらの、PNAS(1989)86(19):7
311-7315の方法で精製し得る。増殖因子を発現している
宿主細胞で調整された培地を、10000gで15分から30分
間遠心分離する。1N HClで上清溶液をpH5から6に調
整し、1Lに付き少なくとも500gの硫酸アンモニウム
を加える。この溶液を4℃で2時間から6時間攪拌し、
そして次に30分から60分間10000gで遠心分離した。こ
の上清を捨て、そしてペレットをさらに精製するために
残した。
ーの形成 上述のように哺乳類発現ベクター中で発現させ、産生さ
れた増殖因子の分泌型を得たならば、この増殖因子hV
EGF165は、Gospodarowiczらの、PNAS(1989)86(19):7
311-7315の方法で精製し得る。増殖因子を発現している
宿主細胞で調整された培地を、10000gで15分から30分
間遠心分離する。1N HClで上清溶液をpH5から6に調
整し、1Lに付き少なくとも500gの硫酸アンモニウム
を加える。この溶液を4℃で2時間から6時間攪拌し、
そして次に30分から60分間10000gで遠心分離した。こ
の上清を捨て、そしてペレットをさらに精製するために
残した。
【0191】このペレットを、25から100mMのNaClを含
んだ5から25mMのTris、pH6.5から8.0に再溶解した。こ
の溶液を、同じバッファーで一晩透析した。沈澱した物
質全てを遠心分離で溶液から析出させ、そして捨てた
(10000gで、30分から60分間)。この溶液を、透析に
用いたのと同じバッファーで平衡化しておいたヘパリン
-セファロースのカラムにかけた。タンパク質溶液の全
てをかけた後、カラムを、溶出物の吸光度がべースライ
ンレベルに戻るまで平衡化バッファーで洗浄した。タン
パク質を、0.1Mから2.5Mの間のNaClを含んだ平衡化バ
ッファーでカラムから段階溶出した。活性フラクション
を集め、Amicon stirred cell中で10,000MWのカットオ
フメンブレンで濃縮した。
んだ5から25mMのTris、pH6.5から8.0に再溶解した。こ
の溶液を、同じバッファーで一晩透析した。沈澱した物
質全てを遠心分離で溶液から析出させ、そして捨てた
(10000gで、30分から60分間)。この溶液を、透析に
用いたのと同じバッファーで平衡化しておいたヘパリン
-セファロースのカラムにかけた。タンパク質溶液の全
てをかけた後、カラムを、溶出物の吸光度がべースライ
ンレベルに戻るまで平衡化バッファーで洗浄した。タン
パク質を、0.1Mから2.5Mの間のNaClを含んだ平衡化バ
ッファーでカラムから段階溶出した。活性フラクション
を集め、Amicon stirred cell中で10,000MWのカットオ
フメンブレンで濃縮した。
【0192】ヘパリン-セファロースのカラムから集め
られたこの濃縮した生理活性物質を、リン酸緩衝食塩水
で平衡化したBio-Gel P-60カラムにかけた。カラムを同
じバッファーで溶出し、そして生理活性のあるフラクシ
ョンを集めた。この物質を3倍容量の20mMのHEPES、pH
8.3で希釈し、Mono-Sカラムにかけた。このカラムを、
同じバッファー中の0.0Mから1.0MのNaCl濃度勾配で溶
出した。構造調査用には、最終の精製を、0.1%のトリ
フルオロ酢酸を含んだ水中の10%から60%へのアセトニ
トリルの濃度勾配を用い、Vydac C4逆相カラム(RP-HPL
C)で行った。
られたこの濃縮した生理活性物質を、リン酸緩衝食塩水
で平衡化したBio-Gel P-60カラムにかけた。カラムを同
じバッファーで溶出し、そして生理活性のあるフラクシ
ョンを集めた。この物質を3倍容量の20mMのHEPES、pH
8.3で希釈し、Mono-Sカラムにかけた。このカラムを、
同じバッファー中の0.0Mから1.0MのNaCl濃度勾配で溶
出した。構造調査用には、最終の精製を、0.1%のトリ
フルオロ酢酸を含んだ水中の10%から60%へのアセトニ
トリルの濃度勾配を用い、Vydac C4逆相カラム(RP-HPL
C)で行った。
【0193】封入体中にタンパク質を産生させるために
細菌発現システムを用いた場合、Hoppeらの、Biochemis
try (1989) 28:2956-2960に類似の方法で産生物を精製
し得る。細胞を、5から25mMのTris、pH 6.5から8.0、
1mMのEDTAに懸濁し、microfluidizerを通して破砕し
た。この溶液を10000gで15分から30分間、遠心分離
し、そしてペレットを5から25mMのTris、pH 6.5から8.
0、1mMのEDTAおよび1%から2%のTriton X-100で洗
浄した。
細菌発現システムを用いた場合、Hoppeらの、Biochemis
try (1989) 28:2956-2960に類似の方法で産生物を精製
し得る。細胞を、5から25mMのTris、pH 6.5から8.0、
1mMのEDTAに懸濁し、microfluidizerを通して破砕し
た。この溶液を10000gで15分から30分間、遠心分離
し、そしてペレットを5から25mMのTris、pH 6.5から8.
0、1mMのEDTAおよび1%から2%のTriton X-100で洗
浄した。
【0194】ペレットを、20mMのTris、pH7.5、1mMのE
DTA、6Mのグアニジン-HCl、0.1MのNa2SO3、および0.
01mMのNa2S4O6中に再懸濁し、そしてこの溶液を室温で
4時間から12時間放置した。この工程で、分子がモノマ
ー型に変換される。不溶性の物質は遠心分離で除去し
た。
DTA、6Mのグアニジン-HCl、0.1MのNa2SO3、および0.
01mMのNa2S4O6中に再懸濁し、そしてこの溶液を室温で
4時間から12時間放置した。この工程で、分子がモノマ
ー型に変換される。不溶性の物質は遠心分離で除去し
た。
【0195】得られたS-スルフォン酸化タンパク質
を、10から50mMのTris、pH6.5から8.0、1mMのEDTA、3
から6Mのグアニジン-HCl、で平衡化したセファクリル
S-200のクロマトグラフィーにかけた。タンパク質を含
んだ画分をプールし、水で透析した。S-スルフォン酸
化タンパク質の最終精製は、RP-HPLC C4クロマトグラフ
ィーで行った。タンパク質を、アセトニトリルの0%か
ら100%の直線的な濃度勾配で溶出した(濃度勾配を作
るためのチャンバーAは、0.1%のトリフルオロ酢酸を
含んだ水で、そしてチャンバーBは、0.1%のトリフル
オロ酢酸を含んだアセトニトリルである)。
を、10から50mMのTris、pH6.5から8.0、1mMのEDTA、3
から6Mのグアニジン-HCl、で平衡化したセファクリル
S-200のクロマトグラフィーにかけた。タンパク質を含
んだ画分をプールし、水で透析した。S-スルフォン酸
化タンパク質の最終精製は、RP-HPLC C4クロマトグラフ
ィーで行った。タンパク質を、アセトニトリルの0%か
ら100%の直線的な濃度勾配で溶出した(濃度勾配を作
るためのチャンバーAは、0.1%のトリフルオロ酢酸を
含んだ水で、そしてチャンバーBは、0.1%のトリフル
オロ酢酸を含んだアセトニトリルである)。
【0196】このタンパク質を最終濃度が0.1から0.5mg
/mlとなるように、50mMのTris、pH8.0、1mMのEDTA、5
mMのグルタチオン、およびタンパク質の溶解性を保つの
に充分な尿素を含んだ0.5mMのグルタチオンジスルフィ
ド中に溶解した。この工程で、タンパク質は天然のホモ
ダイマー構造の血管内皮細胞増殖因子の型に折畳まれ
る。2日後、このタンパク質を、上述の同じRP-HPLCシ
ステムで、あるいは、ヘパリン-セファロースあるいはM
ono-Sのようなアフィニティークロマトグラフィー工程
で精製した。モノマーのダイマーからの分離は、20mMの
Tris-HCl、pH7.5中でS-セファロースのクロマトグラフ
ィーで行った;ダイマーは、0.7MのNaClを含んだ20mM
のTris、pH7.5でカラムから溶出した。hVEGF
121(bVEGF120に相当する)は、hVEGF165お
よびhVPF189のヘパリン結合特性を欠いていること
を見いだしたので、hVEGF121およびbVEGF120
の精製は、ヘパリン-セファロースクロマトグラフィー
以外の方法で行った。
/mlとなるように、50mMのTris、pH8.0、1mMのEDTA、5
mMのグルタチオン、およびタンパク質の溶解性を保つの
に充分な尿素を含んだ0.5mMのグルタチオンジスルフィ
ド中に溶解した。この工程で、タンパク質は天然のホモ
ダイマー構造の血管内皮細胞増殖因子の型に折畳まれ
る。2日後、このタンパク質を、上述の同じRP-HPLCシ
ステムで、あるいは、ヘパリン-セファロースあるいはM
ono-Sのようなアフィニティークロマトグラフィー工程
で精製した。モノマーのダイマーからの分離は、20mMの
Tris-HCl、pH7.5中でS-セファロースのクロマトグラフ
ィーで行った;ダイマーは、0.7MのNaClを含んだ20mM
のTris、pH7.5でカラムから溶出した。hVEGF
121(bVEGF120に相当する)は、hVEGF165お
よびhVPF189のヘパリン結合特性を欠いていること
を見いだしたので、hVEGF121およびbVEGF120
の精製は、ヘパリン-セファロースクロマトグラフィー
以外の方法で行った。
【0197】実施例10 血管内皮細胞増殖因子を含んだ創傷治癒調合物 カテーテル経由で創傷部位に静脈投与するのに適した非
経口的溶液は、血管内皮細胞増殖因子(例えば、bVE
GF120、bVEGF164、hVEGF121、あるいはh
VEGF165)を、5.0から7.0の範囲の安定なpHに保つ
ための適切な量のバッファー、および等張の浸透圧にす
るための適切な量の塩化ナトリウムと共に注射用の水に
溶解することで調製し得る。典型的な組成を以下に示
す:
経口的溶液は、血管内皮細胞増殖因子(例えば、bVE
GF120、bVEGF164、hVEGF121、あるいはh
VEGF165)を、5.0から7.0の範囲の安定なpHに保つ
ための適切な量のバッファー、および等張の浸透圧にす
るための適切な量の塩化ナトリウムと共に注射用の水に
溶解することで調製し得る。典型的な組成を以下に示
す:
【0198】
【表2】
【0199】上記の溶液は、機械的なスプレーポンプの
補助で、創傷部位に局所的に塗布もし得る。
補助で、創傷部位に局所的に塗布もし得る。
【0200】創傷部位に局所的に塗布するために好適な
水性のゲルは、肥厚剤ヒドロキシエチルセルロース(25
0Hグレード)を、バッファー、防腐剤、浸透圧調節剤を
含んだ水性溶液に懸濁させることで調製できる。肥厚剤
が完全に溶解したら、血管内皮細胞増殖因子の濃厚溶液
を加え、そして生成物が均一になるまで混合する。以下
の薬学的組成物は、このようなゲルの典型例である:
水性のゲルは、肥厚剤ヒドロキシエチルセルロース(25
0Hグレード)を、バッファー、防腐剤、浸透圧調節剤を
含んだ水性溶液に懸濁させることで調製できる。肥厚剤
が完全に溶解したら、血管内皮細胞増殖因子の濃厚溶液
を加え、そして生成物が均一になるまで混合する。以下
の薬学的組成物は、このようなゲルの典型例である:
【0201】
【表3】
【0202】創傷部位に振りかけるのに適した乾燥粉末
は、血管内皮細胞増殖因子を水溶性のキャリアーと共に
凍結乾燥し、そして凍結乾燥物を細かく砕き、均一な大
きさの粉末を得ることで調製し得る。この粉末は創傷部
位に、直接あるいはエアロゾル発生用ガスを用いて塗布
し得る。典型的な粉末組成物は以下のように調製され
る:
は、血管内皮細胞増殖因子を水溶性のキャリアーと共に
凍結乾燥し、そして凍結乾燥物を細かく砕き、均一な大
きさの粉末を得ることで調製し得る。この粉末は創傷部
位に、直接あるいはエアロゾル発生用ガスを用いて塗布
し得る。典型的な粉末組成物は以下のように調製され
る:
【0203】
【表4】
【0204】この溶液は凍結乾燥し、そして得られる乾
燥物をボールミルで約75μmの中程度の粒子径に砕く。
この粉末はシェイカーにより塗布し得る。大きな表面面
積を被覆する必要がある場合には、フルオロカーボン
(Freon(登録商標))、炭化水素(イソブタン)、ある
いは圧縮ガス(二酸化炭素)を発生用ガスとして含んだ
エアロゾル発生容器により、この粉末を塗布し得る。
燥物をボールミルで約75μmの中程度の粒子径に砕く。
この粉末はシェイカーにより塗布し得る。大きな表面面
積を被覆する必要がある場合には、フルオロカーボン
(Freon(登録商標))、炭化水素(イソブタン)、ある
いは圧縮ガス(二酸化炭素)を発生用ガスとして含んだ
エアロゾル発生容器により、この粉末を塗布し得る。
【0205】実施例11 キメラ増殖因子の調製 血管内皮細胞増殖因子の鎖を一本と血小板由来の増殖因
子のA鎖を一本とを含むキメラ分子は、まずこれら2分
子の組換え発現用ベクターを構築することにより調製さ
れる。ヒト血管内皮細胞増殖因子を哺乳動物で合成させ
る発現ベクターは実施例8に記載している。好ましいベ
クターは、合成血管内皮細胞増殖因子が宿主細胞から分
泌されるように構築されているものである(たとえば、
天然の血管内皮細胞増殖因子の分泌シグナルを含む、血
管内皮細胞増殖因子の全長の一次翻訳産物をコードする
領域が、親のベクターのBamHI部位とSmaI部位との間に
作動可能なように挿入されるように変更されているphGH
g-SV(10))。同様のベクターが血小板由来増殖因子の発
現用に構成され、それは図4a(A鎖の一次翻訳産物の
全長をコードする)に示される配列を有する合成または
部分的に合成された配列をとり、BamHIおよびEcoRVで消
化し、得られたコード領域フラグメントphGHg-SV(10)の
BamHI部位とSmaI部位との間に挿入して構築される。
子のA鎖を一本とを含むキメラ分子は、まずこれら2分
子の組換え発現用ベクターを構築することにより調製さ
れる。ヒト血管内皮細胞増殖因子を哺乳動物で合成させ
る発現ベクターは実施例8に記載している。好ましいベ
クターは、合成血管内皮細胞増殖因子が宿主細胞から分
泌されるように構築されているものである(たとえば、
天然の血管内皮細胞増殖因子の分泌シグナルを含む、血
管内皮細胞増殖因子の全長の一次翻訳産物をコードする
領域が、親のベクターのBamHI部位とSmaI部位との間に
作動可能なように挿入されるように変更されているphGH
g-SV(10))。同様のベクターが血小板由来増殖因子の発
現用に構成され、それは図4a(A鎖の一次翻訳産物の
全長をコードする)に示される配列を有する合成または
部分的に合成された配列をとり、BamHIおよびEcoRVで消
化し、得られたコード領域フラグメントphGHg-SV(10)の
BamHI部位とSmaI部位との間に挿入して構築される。
【0206】増殖因子鎖の産生には発現プラスミドを哺
乳動物宿主細胞、たとえばCHO細胞に、実施例8で記載
したリン酸カルシウム沈澱法で導入する。CHO細胞へは
2つの異なった方法が使用される。一つの形質転換は、
細胞に導入されるDNAは同時形質転換で行われ、血管
内皮細胞増殖因子発現プラスミドとpSV2:NEOとを10:1
重量比で行う;他の形質転換は血小板由来増殖因子A鎖
の発現ベクターとpSV2:NEOとを10:1重量比で行う。それ
ぞれの形質転換体から形質転換体のG418耐性プールを選
択し、個々の増殖因子産生クローンは、高レベルの増殖
因子産生についてスクリーニングされ、アッセイは馴化
培地の(血管内皮細胞増殖因子産生細胞の場合は)血管
内皮細胞に対する、あるいは(血小板由来増殖因子A鎖
産生細胞の場合は)ATCCから入手可能なマウスNIH 3T3
細胞(#ATCC CRL 1658)に対する***誘起活性、あるい
は当該分野に標準的な方法で作製された、この2つの増
殖因子のELISAまたはラジオイムノアッセイで行った。
乳動物宿主細胞、たとえばCHO細胞に、実施例8で記載
したリン酸カルシウム沈澱法で導入する。CHO細胞へは
2つの異なった方法が使用される。一つの形質転換は、
細胞に導入されるDNAは同時形質転換で行われ、血管
内皮細胞増殖因子発現プラスミドとpSV2:NEOとを10:1
重量比で行う;他の形質転換は血小板由来増殖因子A鎖
の発現ベクターとpSV2:NEOとを10:1重量比で行う。それ
ぞれの形質転換体から形質転換体のG418耐性プールを選
択し、個々の増殖因子産生クローンは、高レベルの増殖
因子産生についてスクリーニングされ、アッセイは馴化
培地の(血管内皮細胞増殖因子産生細胞の場合は)血管
内皮細胞に対する、あるいは(血小板由来増殖因子A鎖
産生細胞の場合は)ATCCから入手可能なマウスNIH 3T3
細胞(#ATCC CRL 1658)に対する***誘起活性、あるい
は当該分野に標準的な方法で作製された、この2つの増
殖因子のELISAまたはラジオイムノアッセイで行った。
【0207】別のアプローチとして、形質転換は3つの
プラスミドを細胞上にリン酸カルシウムで共沈澱させる
方法である;血管内皮細胞増殖因子発現ベクター、血小
板由来増殖因子A鎖発現ベクターおよびpSV2:NEOで(重
量比で10:10:1)行う。クローンのG418耐性プールは
形質転換細胞から選択され、次にそれぞれのクローンに
ついて両方の増殖因子鎖を同時に分泌するクローンをEL
ISAあるいは他の抗体を基本とするアッセイで選択す
る。
プラスミドを細胞上にリン酸カルシウムで共沈澱させる
方法である;血管内皮細胞増殖因子発現ベクター、血小
板由来増殖因子A鎖発現ベクターおよびpSV2:NEOで(重
量比で10:10:1)行う。クローンのG418耐性プールは
形質転換細胞から選択され、次にそれぞれのクローンに
ついて両方の増殖因子鎖を同時に分泌するクローンをEL
ISAあるいは他の抗体を基本とするアッセイで選択す
る。
【0208】馴化培地からの血管内皮細胞増殖因子鎖の
精製は実施例9に記載された方法で行う。血小板由来増
殖因子A鎖の精製は以下の当該分野に公知のプロトコー
ル、たとえば、ヘルディン(Heldin)らのプロトコー
ル、Nature(1986) 319:511-514に従って行われる。
精製は実施例9に記載された方法で行う。血小板由来増
殖因子A鎖の精製は以下の当該分野に公知のプロトコー
ル、たとえば、ヘルディン(Heldin)らのプロトコー
ル、Nature(1986) 319:511-514に従って行われる。
【0209】この後者のプロトコールでは、分泌された
増殖因子を含有する馴化培地はスルファデックス(Sulp
hadex)ビーズヘの吸着により分画され、次に血小板由
来増殖因子A鎖物質は1.5M NaClを含有する0.01Mリン
酸バッファー、pH7.4で溶出する。硫酸アンモニウム沈
澱法で溶出した蛋白を濃縮した後、サンプルは1M NaC
l、0.01Mリン酸バッファー、pH7.4に再懸濁し、このバ
ッファーに対して透析した。サンプルは、次に、セファ
クリルS-200カラムで分画(1M NaCl、0.01Mリン酸バッ
ファー、pH7.4で溶出)し、1M酢酸で透析し、凍結乾
燥して、1M酢酸に溶解後、バイオゲル(BioGel)P-1
50カラムにかけた(lM酢酸で溶出)。A鎖物質を含有
する画分を凍結乾燥した後、サンプルは1M酢酸に再溶
解し、逆相HPLCで分画した(1M酢酸、2Mグアニジン
-塩酸中、0-50%プロパノールの濃度勾配で溶出)。
増殖因子を含有する馴化培地はスルファデックス(Sulp
hadex)ビーズヘの吸着により分画され、次に血小板由
来増殖因子A鎖物質は1.5M NaClを含有する0.01Mリン
酸バッファー、pH7.4で溶出する。硫酸アンモニウム沈
澱法で溶出した蛋白を濃縮した後、サンプルは1M NaC
l、0.01Mリン酸バッファー、pH7.4に再懸濁し、このバ
ッファーに対して透析した。サンプルは、次に、セファ
クリルS-200カラムで分画(1M NaCl、0.01Mリン酸バッ
ファー、pH7.4で溶出)し、1M酢酸で透析し、凍結乾
燥して、1M酢酸に溶解後、バイオゲル(BioGel)P-1
50カラムにかけた(lM酢酸で溶出)。A鎖物質を含有
する画分を凍結乾燥した後、サンプルは1M酢酸に再溶
解し、逆相HPLCで分画した(1M酢酸、2Mグアニジン
-塩酸中、0-50%プロパノールの濃度勾配で溶出)。
【0210】血管内皮細胞増殖因子鎖の一本と血小板由
来の増殖因子A鎖の一本とを含むキメラダイマーは、上
述のように調製したこれらのタンパク質の2つの精製サ
ンプルを混合することにより製造される。混合物は次
に、実施例9記載のように変性し再構成した。簡単に述
べると、まず、混合物は変性され、20mMトリス、pH7.5、
1mM EDTA、6Mグアニジン-塩酸、0.1M Na2SO3、0.01m
M Na2S4O6で4から12時間室温で処理してS-スルホン化
した。セファクリルS-200で分画し、逆相HPLCで精製し
た後(実施例9参照)、S-スルホン化された鎖を凍結
乾燥し、次にタンパク質鎖が溶解性を維持できるように
充分な量の尿素を含む50mMトリス-塩酸、pH8.0、1mM E
DTA、5mMグルタチオン、0.5mMグルタチオンジサルファ
イドの溶液に最終濃度0.1から0.5mg/mlとなるように溶
解した。モノマーはS-セファロースのクロマトグラフ
ィーを用いてダイマーから20mMトリス-塩酸、pH 7.5中
で、NaClの濃度を増加させながら分離した。キメラダイ
マーは、次に、個々のホモダイマーを精製するステップ
を組み合わせてホモダイマーから分離した後、変性と再
度折り畳みとを行った。さらに、キメラ分子は抗血管内
皮細胞増殖因子抗体カラムを通過させ、次に抗血小板由
来増殖因子A鎖抗体カラムを通過させ、精製され得、後
の手順は公知である。
来の増殖因子A鎖の一本とを含むキメラダイマーは、上
述のように調製したこれらのタンパク質の2つの精製サ
ンプルを混合することにより製造される。混合物は次
に、実施例9記載のように変性し再構成した。簡単に述
べると、まず、混合物は変性され、20mMトリス、pH7.5、
1mM EDTA、6Mグアニジン-塩酸、0.1M Na2SO3、0.01m
M Na2S4O6で4から12時間室温で処理してS-スルホン化
した。セファクリルS-200で分画し、逆相HPLCで精製し
た後(実施例9参照)、S-スルホン化された鎖を凍結
乾燥し、次にタンパク質鎖が溶解性を維持できるように
充分な量の尿素を含む50mMトリス-塩酸、pH8.0、1mM E
DTA、5mMグルタチオン、0.5mMグルタチオンジサルファ
イドの溶液に最終濃度0.1から0.5mg/mlとなるように溶
解した。モノマーはS-セファロースのクロマトグラフ
ィーを用いてダイマーから20mMトリス-塩酸、pH 7.5中
で、NaClの濃度を増加させながら分離した。キメラダイ
マーは、次に、個々のホモダイマーを精製するステップ
を組み合わせてホモダイマーから分離した後、変性と再
度折り畳みとを行った。さらに、キメラ分子は抗血管内
皮細胞増殖因子抗体カラムを通過させ、次に抗血小板由
来増殖因子A鎖抗体カラムを通過させ、精製され得、後
の手順は公知である。
【0211】実施例12 ヒト血管内皮細胞増殖因子(hVEGF121)をコード
する全長cDNA配列の回収 血管内皮細胞増殖因子mRNAの細胞源 ヒトU937前単球白血病細胞は血管内皮細胞増殖因子タン
パク質をコードするmRNAを高レベルで生産する。それ
故、ヒト血管内皮細胞増殖因子cDNAの調製に良好な
mRNAの供給源である。American Type Culture Collecti
onから入手したU937細胞はRPMI-1640培地(GIBCO)に10
%ウシ胎児血清(FBS)、1%L-グルタミン酸、それぞ
れ100ユニット/mlのペニシリンとストレプトマイシンと
を加えた培地で維持した。細胞は典型的には3から4日
ごとに継代培養し、典型的には培地1mlあたり5×105
細胞の濃度で移植した。
する全長cDNA配列の回収 血管内皮細胞増殖因子mRNAの細胞源 ヒトU937前単球白血病細胞は血管内皮細胞増殖因子タン
パク質をコードするmRNAを高レベルで生産する。それ
故、ヒト血管内皮細胞増殖因子cDNAの調製に良好な
mRNAの供給源である。American Type Culture Collecti
onから入手したU937細胞はRPMI-1640培地(GIBCO)に10
%ウシ胎児血清(FBS)、1%L-グルタミン酸、それぞ
れ100ユニット/mlのペニシリンとストレプトマイシンと
を加えた培地で維持した。細胞は典型的には3から4日
ごとに継代培養し、典型的には培地1mlあたり5×105
細胞の濃度で移植した。
【0212】ポリ(A)+RNAの単離 U937細胞のmRNAの単離のために、細胞を1mlあたり約5
×106細胞の濃度まで増殖した。細胞は500×gで5分の
緩やかな遠心分離を行いペレットを集めた。細胞ペレッ
トは、チャーグイン(Chirgwin)の方法、Biochemistry
(1979)18:5294-5299、に従って、mRNA単離の前に50ml
の氷冷したダルベッコのリン酸緩衝化した生理食塩水
(D-PBS)で一回洗浄し、残余の培地を洗浄した。この
方法で、洗浄した細胞ペレットは溶解バッファー(4.0
M グアニジンチオシアネート、0.1%アンチフォーム
A、25mMクエン酸ナトリウム、0.5% N-ラウロイルサ
ルコシン、100mM β-メルカプトエタノール)を直接加
えて溶解した。DNAを注射針で通して切断した後、RN
Aは酢酸とエタノールの添加により直接沈澱させた。沈
澱したRNAは、次に、ジエチルピロカーボネート(DEP)
処理した脱イオン水(D-H2O、典型的には約400μl)に
溶解し、2.6mlのグアニジン-塩酸バッファー(7.5Mグ
アニジン塩酸、25mMクエン酸ナトリウム、5mMジチオス
レイトール)を加えた。酢酸とエタノールを添加してRN
Aを沈澱させた。沈澱したRNAは再びDEP-H2Oに溶解し、
酢酸ナトリウムとエタノールで沈澱させた。
×106細胞の濃度まで増殖した。細胞は500×gで5分の
緩やかな遠心分離を行いペレットを集めた。細胞ペレッ
トは、チャーグイン(Chirgwin)の方法、Biochemistry
(1979)18:5294-5299、に従って、mRNA単離の前に50ml
の氷冷したダルベッコのリン酸緩衝化した生理食塩水
(D-PBS)で一回洗浄し、残余の培地を洗浄した。この
方法で、洗浄した細胞ペレットは溶解バッファー(4.0
M グアニジンチオシアネート、0.1%アンチフォーム
A、25mMクエン酸ナトリウム、0.5% N-ラウロイルサ
ルコシン、100mM β-メルカプトエタノール)を直接加
えて溶解した。DNAを注射針で通して切断した後、RN
Aは酢酸とエタノールの添加により直接沈澱させた。沈
澱したRNAは、次に、ジエチルピロカーボネート(DEP)
処理した脱イオン水(D-H2O、典型的には約400μl)に
溶解し、2.6mlのグアニジン-塩酸バッファー(7.5Mグ
アニジン塩酸、25mMクエン酸ナトリウム、5mMジチオス
レイトール)を加えた。酢酸とエタノールを添加してRN
Aを沈澱させた。沈澱したRNAは再びDEP-H2Oに溶解し、
酢酸ナトリウムとエタノールで沈澱させた。
【0213】グアニジンチオシアネート法(上記)で単
離した全細胞のRNAは、以下の確立された方法によって
(Edmonds, M., et al., PNAS (1971)68:1336;Aviv. H.
andLeder, P., PNAS(1972)69:1408)、オリゴd(T)
セルロースクロマトグラフィーでさらに分画し、ポリ
(A)+RNAを単離した。
離した全細胞のRNAは、以下の確立された方法によって
(Edmonds, M., et al., PNAS (1971)68:1336;Aviv. H.
andLeder, P., PNAS(1972)69:1408)、オリゴd(T)
セルロースクロマトグラフィーでさらに分画し、ポリ
(A)+RNAを単離した。
【0214】逆転写酵素とポリメラーゼチェーン反応
(PCR)増幅とによる血管内皮細胞増殖 因子cDNAの合成と増幅 hVEGF121発現カセットを作製するため、U937ポリ
(A)+RNA(上記参照)から得られたオリゴヌクレオチ
ドプライマー(図9)がPCRの開始に用いられ、それぞ
れの末端にBamHIのクローニング部位を有し、3’末端
のすべてのリーディングフレームに終止コドンを有する
血管内皮細胞増殖因子フラグメントが生じた。第一鎖の
cDNAの合成は1μgのアンチセンスオリゴヌクレオ
チド(プライマー4738、図9)を5μgのU937ポリ
(A)+RNAとアニールさせた後、cDNA合成キット
(ベーリンガーマンハイム)を用いてAMV逆転写酵素で4
2℃、2時間反応させて行った。第一鎖のcDNAの合
成の後、反応液をフェノールとクロロホルムで処理して
エタノールで沈澱させた。次に、1/10のcDNAをパ
ーキンエルマーシータスDNAサーマルサイクラーを用
いて、アンチセンスオリゴヌクレオチド4738とセンス鎖
オリゴヌクレオチド(プライマー4741、図9)をプライ
マーとして、30ラウンドのPCR(Saiki, P.K.et al., Sc
ience(1988)239:487-491)で増幅した。PCR反応の生成
物は、次に5%のポリアクリルアミドゲルで分画し、h
VEGF121発現カセットに対応するバンドが溶出さ
れ、BamHIで消化し、M13mp18につなぎ入れた。配列はサ
ンガーらの方法、J. Mol. Biol.(1980)143:161-178で確
認した。
(PCR)増幅とによる血管内皮細胞増殖 因子cDNAの合成と増幅 hVEGF121発現カセットを作製するため、U937ポリ
(A)+RNA(上記参照)から得られたオリゴヌクレオチ
ドプライマー(図9)がPCRの開始に用いられ、それぞ
れの末端にBamHIのクローニング部位を有し、3’末端
のすべてのリーディングフレームに終止コドンを有する
血管内皮細胞増殖因子フラグメントが生じた。第一鎖の
cDNAの合成は1μgのアンチセンスオリゴヌクレオ
チド(プライマー4738、図9)を5μgのU937ポリ
(A)+RNAとアニールさせた後、cDNA合成キット
(ベーリンガーマンハイム)を用いてAMV逆転写酵素で4
2℃、2時間反応させて行った。第一鎖のcDNAの合
成の後、反応液をフェノールとクロロホルムで処理して
エタノールで沈澱させた。次に、1/10のcDNAをパ
ーキンエルマーシータスDNAサーマルサイクラーを用
いて、アンチセンスオリゴヌクレオチド4738とセンス鎖
オリゴヌクレオチド(プライマー4741、図9)をプライ
マーとして、30ラウンドのPCR(Saiki, P.K.et al., Sc
ience(1988)239:487-491)で増幅した。PCR反応の生成
物は、次に5%のポリアクリルアミドゲルで分画し、h
VEGF121発現カセットに対応するバンドが溶出さ
れ、BamHIで消化し、M13mp18につなぎ入れた。配列はサ
ンガーらの方法、J. Mol. Biol.(1980)143:161-178で確
認した。
【0215】実施例13 CHO細胞でのhVEGF121の発現と分泌 配列確認の後、血管内皮細胞増殖因子発現カセットを含
有するBamHIフラグメントは、哺乳動物の発現プラスミ
ドpLENのBamHI部位にセンスおよびアンチセンスの両方
向に連結した(図10a)。同様に、pMTNベクターにセ
ンス方向に連結した(図10b)。ベクターpLENの構築
のために、上記phGHg-SV(10)をSmaIで消化し、BamHI
リンカーをSmaI部位に連結した。ベクターは次にBamHI
で消化し(これは成長ホルモン遺伝子を除去する)、再
結合して、pLENを生じた。pLENはSV40エンハンサー、MT
-IIプロモーターおよびポリアデニル化部位を含む約600
bpの成長ホルモンの3’非翻訳領域を包含する。このベ
クターの構築とヒトエストロゲン受容体をコードするc
DNAの発現への使用はグリーン(Greene)ら、Scienc
e(1986)231:1150に詳しく記載されている。
有するBamHIフラグメントは、哺乳動物の発現プラスミ
ドpLENのBamHI部位にセンスおよびアンチセンスの両方
向に連結した(図10a)。同様に、pMTNベクターにセ
ンス方向に連結した(図10b)。ベクターpLENの構築
のために、上記phGHg-SV(10)をSmaIで消化し、BamHI
リンカーをSmaI部位に連結した。ベクターは次にBamHI
で消化し(これは成長ホルモン遺伝子を除去する)、再
結合して、pLENを生じた。pLENはSV40エンハンサー、MT
-IIプロモーターおよびポリアデニル化部位を含む約600
bpの成長ホルモンの3’非翻訳領域を包含する。このベ
クターの構築とヒトエストロゲン受容体をコードするc
DNAの発現への使用はグリーン(Greene)ら、Scienc
e(1986)231:1150に詳しく記載されている。
【0216】pMTNはpLENプラスミド(pMTNSV40 polyA B
am)の誘導体であり、ネオマイシン耐性マーカーとSV40
初期プロモーター配列をプラスミドpSV2neoから取り込
んだものである。ネオマイシン耐性マーカーはアミノグ
リコシドホスホトランスフェラーゼをコードし、この酵
素はそのマーカーを有する細胞にG418耐性を賦与する。
pMTNを構築するために、ネオマイシン耐性マーカー(図
10bでneoR)はpSV2neoをBamHIとHindIIIで消化してp
SV2neoから切り離された。pSV2neoのSV40初期プロモー
ター配列は、pSV2neoをpvuIIとHindIIIで消化して切り
離され、neoRマーカーを有するHindIII-BamHIフラグメ
ントにつないだ。このカセットは、neoRマーカーに接続
したSV40初期プロモーターを包含し、SV40エンハンサー
とpLENのpUC8配列の間にあるHindIII部位に挿入した。
am)の誘導体であり、ネオマイシン耐性マーカーとSV40
初期プロモーター配列をプラスミドpSV2neoから取り込
んだものである。ネオマイシン耐性マーカーはアミノグ
リコシドホスホトランスフェラーゼをコードし、この酵
素はそのマーカーを有する細胞にG418耐性を賦与する。
pMTNを構築するために、ネオマイシン耐性マーカー(図
10bでneoR)はpSV2neoをBamHIとHindIIIで消化してp
SV2neoから切り離された。pSV2neoのSV40初期プロモー
ター配列は、pSV2neoをpvuIIとHindIIIで消化して切り
離され、neoRマーカーを有するHindIII-BamHIフラグメ
ントにつないだ。このカセットは、neoRマーカーに接続
したSV40初期プロモーターを包含し、SV40エンハンサー
とpLENのpUC8配列の間にあるHindIII部位に挿入した。
【0217】pLEN121とpMTN121の構築では、hVEGF
121発現カセットをプラスミドベクターpLENおよびpMTN
の、ヒトメタロチオネインプロモーターとヒト成長ホル
モンの3’非翻訳配列との間にあるBamHI部位に挿入し
た。
121発現カセットをプラスミドベクターpLENおよびpMTN
の、ヒトメタロチオネインプロモーターとヒト成長ホル
モンの3’非翻訳配列との間にあるBamHI部位に挿入し
た。
【0218】pLEN121とpMTN121発現プラスミドのCHO細
胞への形質転換 CHO-K1細胞はATCCから入手し(ロックビル、MD)、10%
FBS、1%L-グルタミン酸、それぞれ100ユニット/mlの
ペニシリンおよびストレプトマイシンを追加したダルベ
ッコの変法イーグル培地(DMEM)21:クーンのF-12培地
の1:1混合物(vol/vol)で維持した。
胞への形質転換 CHO-K1細胞はATCCから入手し(ロックビル、MD)、10%
FBS、1%L-グルタミン酸、それぞれ100ユニット/mlの
ペニシリンおよびストレプトマイシンを追加したダルベ
ッコの変法イーグル培地(DMEM)21:クーンのF-12培地
の1:1混合物(vol/vol)で維持した。
【0219】CHO-K1細胞はリン酸カルシウム沈澱法(Gr
aham and van der Eb, Virology(1973)52:456およびWig
ler et al., Cell(1979)16:777)によりプラスミドDN
Aで形質転換した。血管内皮細胞増殖因子-pLEN121プラ
スミドは、選択マーカーを有する2つのプラスミド;完
全なメタロチオネインを有するpUC9MT18およびネオマイ
シン耐性の主な選択マーカーを有するpSVneo、と同時形
質転換した。3つのプラスミドは、重量比でそれぞれ1
0:5:1で混合した。pMTNプラスミドはアミノグリコ
シドホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子(ネ
オマイシンとG418の耐性マーカー)を包含する。従っ
て、pMTNプラスミドは単独で直接CHO-K1細胞を形質転換
した。形質転換から24時間経過後、pSV2neo(pLENで同
時形質転換した場合)あるいはpMTNが有するG418耐性マ
ーカーを発現する細胞は、ネオマイシンアナログである
ゲネテシン(Geneticin)(G418)を培地中に600μg/ml
の濃度で含む培地での生育で選択した。G418選択で生存
したpLEN構築物で形質転換された細胞のコロニーは継代
培養され、5μMのCdCl2を含む培地でさらに選択を行っ
た。生存していたコロニーは増殖させて細胞のプールと
して、血管内皮細胞増殖因子の発現と解析に使用した。
aham and van der Eb, Virology(1973)52:456およびWig
ler et al., Cell(1979)16:777)によりプラスミドDN
Aで形質転換した。血管内皮細胞増殖因子-pLEN121プラ
スミドは、選択マーカーを有する2つのプラスミド;完
全なメタロチオネインを有するpUC9MT18およびネオマイ
シン耐性の主な選択マーカーを有するpSVneo、と同時形
質転換した。3つのプラスミドは、重量比でそれぞれ1
0:5:1で混合した。pMTNプラスミドはアミノグリコ
シドホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子(ネ
オマイシンとG418の耐性マーカー)を包含する。従っ
て、pMTNプラスミドは単独で直接CHO-K1細胞を形質転換
した。形質転換から24時間経過後、pSV2neo(pLENで同
時形質転換した場合)あるいはpMTNが有するG418耐性マ
ーカーを発現する細胞は、ネオマイシンアナログである
ゲネテシン(Geneticin)(G418)を培地中に600μg/ml
の濃度で含む培地での生育で選択した。G418選択で生存
したpLEN構築物で形質転換された細胞のコロニーは継代
培養され、5μMのCdCl2を含む培地でさらに選択を行っ
た。生存していたコロニーは増殖させて細胞のプールと
して、血管内皮細胞増殖因子の発現と解析に使用した。
【0220】CHO細胞からのhVEGF121の発現および
分泌を確認するための放射能ラベルとパルスチェイス pLEN121で形質転換したCHO-K1細胞によるhVEGF121
の発現と培地への分泌は、細胞タンパク質を代謝的にラ
ベルし、次に細胞溶解物あるいは馴化培地からの血管内
皮細胞増殖因子を免疫沈降で確認した。細胞溶解物ある
いは馴化培地サンプルは形質転換したCHO細胞を、放射
能ラベル期間が始まる前に、50μM ZnSO4を含む無血清
のDMEM-21/クーンのF12培地(誘導培地)で24時間培養
してメタロチオネインプロモーターの誘導を行って調製
した。[35S]-L-メチオニンの添加前に、細胞を洗浄
し、メチオニンを含まないDMEM-21/クーンのF12培地で3
0分間、37℃で前培養した。ラベル期間を始めるため
に、コンフルエントになった6cmの組織培養ディッシュ
に最終濃度100μCi/mlとなるように[35S]-L-メチオニ
ンを添加した。パルスチェイス解析においては、”チェ
イス”期間は30分のラベル期間の後に開始した。まず、
ラベル用培地を取り除き、細胞を一度、L-メチオニン
を含む無血清のDMEM-21/クーンのF12培地(”チェイス
培地”)で洗浄し、チェイス期間の間チェイス培地を再
度供給した。
分泌を確認するための放射能ラベルとパルスチェイス pLEN121で形質転換したCHO-K1細胞によるhVEGF121
の発現と培地への分泌は、細胞タンパク質を代謝的にラ
ベルし、次に細胞溶解物あるいは馴化培地からの血管内
皮細胞増殖因子を免疫沈降で確認した。細胞溶解物ある
いは馴化培地サンプルは形質転換したCHO細胞を、放射
能ラベル期間が始まる前に、50μM ZnSO4を含む無血清
のDMEM-21/クーンのF12培地(誘導培地)で24時間培養
してメタロチオネインプロモーターの誘導を行って調製
した。[35S]-L-メチオニンの添加前に、細胞を洗浄
し、メチオニンを含まないDMEM-21/クーンのF12培地で3
0分間、37℃で前培養した。ラベル期間を始めるため
に、コンフルエントになった6cmの組織培養ディッシュ
に最終濃度100μCi/mlとなるように[35S]-L-メチオニ
ンを添加した。パルスチェイス解析においては、”チェ
イス”期間は30分のラベル期間の後に開始した。まず、
ラベル用培地を取り除き、細胞を一度、L-メチオニン
を含む無血清のDMEM-21/クーンのF12培地(”チェイス
培地”)で洗浄し、チェイス期間の間チェイス培地を再
度供給した。
【0221】細胞溶解物および馴化培地からの[35S]-
L-メチオニン-ラベルされたhVEGF121の免疫沈降
法による検出 すべての免疫沈降操作は、特にことわらない限り、4℃
で行い、1mlの培地を有する6cmの組織培養ディッシュ
でコンフルエントになるまで培養した細胞を用いた。培
地を集め、PMSFを1mMとし、細胞溶解物サンプルを調製
する間中、氷冷しておいた。細胞溶解物を調製するた
め、細胞を氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で
一回洗い、次に、0.4mlの、100mMトリス-塩酸(pH8.
0)、100mM NaCl、0.5% NP-40、1mM PMSF(細胞溶解
バッファー)で溶解した。馴化培地と細胞溶解物は4
℃、13,000×gで30分間の遠心分離で清澄にした。清澄
にした後、血管内皮細胞増殖因子に対する抗血清あるい
は免疫前のウサギ血清(ギブコ)を細胞溶解物あるいは
馴化培地に最終濃度2%(vol/vol)となるように加
え、4℃で一夜インキュベートした後、プロテインAセ
ファロースCL-4Bのスラリー(100mg/ml)50μlを加え
た。4℃で1時間インキュベートした後、サンプルを1
mlの50mMトリス-塩酸(pH8.0)、0.5M NaCl、5mM EDT
A、0.5% NP-40、1mg/ml卵白アルブミン(シグマ)で
順次4回;50mMトリス-塩酸(pH 7.5)、150mM NaCl、
5mM EDTA、0.5% NP-40で2回;および10mM トリス-塩
酸(pH7.5)で1回洗浄した。サンプルは、次に、50μl
のサンプルバッファーに懸濁し、3分間沸騰して、13,0
00×gで1分間遠心分離した後、12.5%のSDS-ポリアク
リルアミドゲルに溶解した。放射能ラベルされたタンパ
ク質を可視化するために、電気泳動したゲルをEN 3HANC
E(NEN)に30分間、次にd-H2Oに30分間浸した後、乾燥
し、フルオログラフィーにかけた。
L-メチオニン-ラベルされたhVEGF121の免疫沈降
法による検出 すべての免疫沈降操作は、特にことわらない限り、4℃
で行い、1mlの培地を有する6cmの組織培養ディッシュ
でコンフルエントになるまで培養した細胞を用いた。培
地を集め、PMSFを1mMとし、細胞溶解物サンプルを調製
する間中、氷冷しておいた。細胞溶解物を調製するた
め、細胞を氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で
一回洗い、次に、0.4mlの、100mMトリス-塩酸(pH8.
0)、100mM NaCl、0.5% NP-40、1mM PMSF(細胞溶解
バッファー)で溶解した。馴化培地と細胞溶解物は4
℃、13,000×gで30分間の遠心分離で清澄にした。清澄
にした後、血管内皮細胞増殖因子に対する抗血清あるい
は免疫前のウサギ血清(ギブコ)を細胞溶解物あるいは
馴化培地に最終濃度2%(vol/vol)となるように加
え、4℃で一夜インキュベートした後、プロテインAセ
ファロースCL-4Bのスラリー(100mg/ml)50μlを加え
た。4℃で1時間インキュベートした後、サンプルを1
mlの50mMトリス-塩酸(pH8.0)、0.5M NaCl、5mM EDT
A、0.5% NP-40、1mg/ml卵白アルブミン(シグマ)で
順次4回;50mMトリス-塩酸(pH 7.5)、150mM NaCl、
5mM EDTA、0.5% NP-40で2回;および10mM トリス-塩
酸(pH7.5)で1回洗浄した。サンプルは、次に、50μl
のサンプルバッファーに懸濁し、3分間沸騰して、13,0
00×gで1分間遠心分離した後、12.5%のSDS-ポリアク
リルアミドゲルに溶解した。放射能ラベルされたタンパ
ク質を可視化するために、電気泳動したゲルをEN 3HANC
E(NEN)に30分間、次にd-H2Oに30分間浸した後、乾燥
し、フルオログラフィーにかけた。
【0222】pLEN121で形質転換されたCHO細胞により合
成されたhVEGF121の免疫沈降とパルスチェイスの
解析結果は、免疫沈降法では、CHO細胞により合成され
たhVEGF121は、2-メルカプトエタノールでタンパ
ク質を還元すると、約15kDと約20kDの2つのサイズクラ
スとして検出された。未修飾の還元したhVEGF121
のサイズは約15kDと予測されている。グリコシル化で修
飾された場合、モノマータンパク質は分子量が18kD以上
に移動することが推定される。パルスチェイス解析は、
両方の形態とも60分よりも少ない分泌のハーフタイムで
分泌されることを示す。
成されたhVEGF121の免疫沈降とパルスチェイスの
解析結果は、免疫沈降法では、CHO細胞により合成され
たhVEGF121は、2-メルカプトエタノールでタンパ
ク質を還元すると、約15kDと約20kDの2つのサイズクラ
スとして検出された。未修飾の還元したhVEGF121
のサイズは約15kDと予測されている。グリコシル化で修
飾された場合、モノマータンパク質は分子量が18kD以上
に移動することが推定される。パルスチェイス解析は、
両方の形態とも60分よりも少ない分泌のハーフタイムで
分泌されることを示す。
【0223】CHO細胞により発現される血管内皮細胞増
殖因子のグリコシル化とダイマー化の程度の決定 血管内皮細胞増殖因子の20kD型がN-結合したグリコシ
ル化の結果によることを確認するために、pLEN21で形質
転換されたCHO細胞を、抗生物質ツニカマイシン(典型
的には1から10μg/ml)の非存在または存在下、無血
清培地で4時間生育した。ツニカマイシンを含有する培
地で4時間生育した後、メチオニンを含まないがツニカ
マイシンを前の4時間の培養に存在したと同量含むDMEM
-21/クーンのF12培地で、30分間細胞をメチオニン飢餓
の状態にした。次に形質転換されたCHO細胞はツニカマ
イシンを含有しないか含有するラベル用培地で4時間、
(上述のように)[35S]-L-メチオニンでラベルした。
ツニカマイシン存在下の生育ではhVEGF121の20kD
の還元型の合成が阻害され、血管内皮細胞増殖因子の20
kDのモノマー型はN-結合グリコシル化の修飾によること
を示した。
殖因子のグリコシル化とダイマー化の程度の決定 血管内皮細胞増殖因子の20kD型がN-結合したグリコシ
ル化の結果によることを確認するために、pLEN21で形質
転換されたCHO細胞を、抗生物質ツニカマイシン(典型
的には1から10μg/ml)の非存在または存在下、無血
清培地で4時間生育した。ツニカマイシンを含有する培
地で4時間生育した後、メチオニンを含まないがツニカ
マイシンを前の4時間の培養に存在したと同量含むDMEM
-21/クーンのF12培地で、30分間細胞をメチオニン飢餓
の状態にした。次に形質転換されたCHO細胞はツニカマ
イシンを含有しないか含有するラベル用培地で4時間、
(上述のように)[35S]-L-メチオニンでラベルした。
ツニカマイシン存在下の生育ではhVEGF121の20kD
の還元型の合成が阻害され、血管内皮細胞増殖因子の20
kDのモノマー型はN-結合グリコシル化の修飾によること
を示した。
【0224】グリコシル化された、またはグリコシル化
されていないhVEGF121がダイマー形成できるかど
うかを決定するために、ツニカマイシン非存在あるいは
存在下生育したpLEN121-形質転換CHO細胞により馴化さ
れた培地から免疫沈降物を調製した。免疫沈降後、サン
プルは100mMのβ-メルカプトエタノールを含有するか含
有しないSDSサンプルバッファー中で沸騰することによ
りプロテインAセファロースビーズから溶出した。ツニ
カマイシンが存在しない培地で生育した細胞から調製し
たサンプルは通常の型(15kDと20kD)の血管内皮細胞増
殖因子を有していたが、これはβ-メルカプトエタノー
ル存在下に沸騰してジスルフィド結合を還元した後、SD
S-PAGEにより分画したときである。しかし、サンプルを
β-メルカプトエタノール非存在下で調製したときは、S
DS-ポリアクリルアミドゲル上で、約15kD、20kD、28k
D、32kDおよび36kDの血管内皮細胞増殖因子種を含む5
本のバンドが検出され、hVEGF121がジスルフィド
結合のダイマーを形成できることが示された。ツニカマ
イシンの存在下に生育した細胞から調製され、β-メル
カプトエタノール中で予め還元したあるいは還元してい
ないサンプルの解析の結果、hVEGF121の32kDおよ
び36kD型は一方のサブユニットがグリコシル化されてお
り他方がそうでない(32kD型)ヘテロダイマーを形成す
るか、あるいは、両方のサブユニットがグリコシル化さ
れた(36kD型)ホモダイマーであることが明らかになっ
た。28kD型はhVEGF121の2つのグリコシル化され
ていないサブユニット間のホモダイマーの形成による。
上述の条件下、CHO細胞で生産されたhVEGF121の約
50%はN-結合グリコシル化されている。
されていないhVEGF121がダイマー形成できるかど
うかを決定するために、ツニカマイシン非存在あるいは
存在下生育したpLEN121-形質転換CHO細胞により馴化さ
れた培地から免疫沈降物を調製した。免疫沈降後、サン
プルは100mMのβ-メルカプトエタノールを含有するか含
有しないSDSサンプルバッファー中で沸騰することによ
りプロテインAセファロースビーズから溶出した。ツニ
カマイシンが存在しない培地で生育した細胞から調製し
たサンプルは通常の型(15kDと20kD)の血管内皮細胞増
殖因子を有していたが、これはβ-メルカプトエタノー
ル存在下に沸騰してジスルフィド結合を還元した後、SD
S-PAGEにより分画したときである。しかし、サンプルを
β-メルカプトエタノール非存在下で調製したときは、S
DS-ポリアクリルアミドゲル上で、約15kD、20kD、28k
D、32kDおよび36kDの血管内皮細胞増殖因子種を含む5
本のバンドが検出され、hVEGF121がジスルフィド
結合のダイマーを形成できることが示された。ツニカマ
イシンの存在下に生育した細胞から調製され、β-メル
カプトエタノール中で予め還元したあるいは還元してい
ないサンプルの解析の結果、hVEGF121の32kDおよ
び36kD型は一方のサブユニットがグリコシル化されてお
り他方がそうでない(32kD型)ヘテロダイマーを形成す
るか、あるいは、両方のサブユニットがグリコシル化さ
れた(36kD型)ホモダイマーであることが明らかになっ
た。28kD型はhVEGF121の2つのグリコシル化され
ていないサブユニット間のホモダイマーの形成による。
上述の条件下、CHO細胞で生産されたhVEGF121の約
50%はN-結合グリコシル化されている。
【0225】hVEGF121はヘパリン-セファロースに
結合しない hVEGF121のヘパリン-セファロースに対する結合親
和力を決定するために、ヘパリン-セファロースの1ml
(ベッドボリューム)カラムを調製し、10mMトリス-塩
酸、pH 7.5、50mM NaCl(HS平衡バッファー)で、4℃
にて、0.4ml/分の流速で平衡化した。pLEN121-形質転
換CHO細胞により馴化された培地200mlを集め、硫酸アン
モニウム(最終濃度80% w/v)で10倍に濃縮し、大量の
HS平衡バッファーに対して透析した。10倍に濃縮し、透
析した培地の20mlを(上述の)ラベル用培地で4時間生
育させた細胞から調製した2mlの培地と混合し、1mlの
ヘパリン-セファロースカラムに負荷した。結合せずに
通過した液を集め、SDS-PAGE解析にかけた。次にカラム
をカラム体積の7倍の平衡バッファーで洗浄し、順次、
カラム体積の14倍の10mM トリス-塩酸、pH 7.5、150mM
NaClで洗浄し、ついでカラム体積の6倍の10mM トリ
ス、pH7.5、2M NaClで洗浄しながら画分を集めた。カ
ラム画分をSDS-PAGEおよびフルオログラフィーで解析し
たところ、hVEGF121はヘパリン-セファロースに結
合しないことが明らかになった。
結合しない hVEGF121のヘパリン-セファロースに対する結合親
和力を決定するために、ヘパリン-セファロースの1ml
(ベッドボリューム)カラムを調製し、10mMトリス-塩
酸、pH 7.5、50mM NaCl(HS平衡バッファー)で、4℃
にて、0.4ml/分の流速で平衡化した。pLEN121-形質転
換CHO細胞により馴化された培地200mlを集め、硫酸アン
モニウム(最終濃度80% w/v)で10倍に濃縮し、大量の
HS平衡バッファーに対して透析した。10倍に濃縮し、透
析した培地の20mlを(上述の)ラベル用培地で4時間生
育させた細胞から調製した2mlの培地と混合し、1mlの
ヘパリン-セファロースカラムに負荷した。結合せずに
通過した液を集め、SDS-PAGE解析にかけた。次にカラム
をカラム体積の7倍の平衡バッファーで洗浄し、順次、
カラム体積の14倍の10mM トリス-塩酸、pH 7.5、150mM
NaClで洗浄し、ついでカラム体積の6倍の10mM トリ
ス、pH7.5、2M NaClで洗浄しながら画分を集めた。カ
ラム画分をSDS-PAGEおよびフルオログラフィーで解析し
たところ、hVEGF121はヘパリン-セファロースに結
合しないことが明らかになった。
【0226】hVEGF121、hVEGF165およびhV
PF189の比較から、血管内皮細胞増殖因子の121アミノ
酸型のものはヘパリン結合能を欠くという独特なもので
あることが示された。
PF189の比較から、血管内皮細胞増殖因子の121アミノ
酸型のものはヘパリン結合能を欠くという独特なもので
あることが示された。
【0227】亜鉛-セファロースによるhVEGF121の
精製 亜鉛-セファロースクロマトグラフィーによってhVE
GF121が更に精製される。金属キレートセファロース
(ファルマシア)の2ml(ベッドボリューム)カラムを
調製し、脱イオン水で洗浄してから、24mlの塩化亜鉛
(ZnCl2)溶液(1mg/ml水溶液)を”チャージ”した。
カラムを再度脱イオン水で洗浄し、10mlの50mM NaH2P
O4、pH 7.0、0.5M NaCl、10mM イミダゾールで”活性
化”した。次にカラムを50mM NaH2PO4、pH 7.0、0.5M N
aCl、0.5mMイミダゾール(亜鉛平衡用バッファー)で再
び平衡化した。10mM トリス-塩酸、pH7.5、50mM NaCl中
にhVEGF121を含むサンプル(ヘパリン-セファロー
スクロマトグラフィーからの非結合物質)の24mlを亜鉛
-セファロースカラムにチャージした。カラムは次に亜
鉛平衡用バッファーで洗浄し、そして最終濃度が5mM、
10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、60mMおよび100mMとな
るようにイミダゾールを添加した亜鉛平衡用バッファー
で分画した。この分画の結果、hVEGF121は亜鉛平
衡用バッファー中で亜鉛-セファロースに結合し、カラ
ムから最終濃度が15から25mMとなるようにイミダゾール
を添加した亜鉛平行用バッファーで溶出することを示
す。
精製 亜鉛-セファロースクロマトグラフィーによってhVE
GF121が更に精製される。金属キレートセファロース
(ファルマシア)の2ml(ベッドボリューム)カラムを
調製し、脱イオン水で洗浄してから、24mlの塩化亜鉛
(ZnCl2)溶液(1mg/ml水溶液)を”チャージ”した。
カラムを再度脱イオン水で洗浄し、10mlの50mM NaH2P
O4、pH 7.0、0.5M NaCl、10mM イミダゾールで”活性
化”した。次にカラムを50mM NaH2PO4、pH 7.0、0.5M N
aCl、0.5mMイミダゾール(亜鉛平衡用バッファー)で再
び平衡化した。10mM トリス-塩酸、pH7.5、50mM NaCl中
にhVEGF121を含むサンプル(ヘパリン-セファロー
スクロマトグラフィーからの非結合物質)の24mlを亜鉛
-セファロースカラムにチャージした。カラムは次に亜
鉛平衡用バッファーで洗浄し、そして最終濃度が5mM、
10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、60mMおよび100mMとな
るようにイミダゾールを添加した亜鉛平衡用バッファー
で分画した。この分画の結果、hVEGF121は亜鉛平
衡用バッファー中で亜鉛-セファロースに結合し、カラ
ムから最終濃度が15から25mMとなるようにイミダゾール
を添加した亜鉛平行用バッファーで溶出することを示
す。
【0228】分泌されたhVEGF121はシグナルペプ
チダーゼ開裂部位で正確に開裂される 亜鉛-セファロース(上述)によるクロマトグラフィー
で精製されたhVEGF121は100mMのβ-メルカプトエ
タノールを含む負荷用バッファーで還元し、SDS-ポリア
クリルアミドゲル電気泳動で分画し、ポリビニリデンジ
フルオライド(PVDF)膜に移し、自動気相蛋白質配列決
定機(アプライドバイオシステムズ)で連続エドマン分
解してN末端配列解析を行った。血管内皮細胞増殖因子
の15kDおよび20kD型の両方とも、それぞれの型の90%が
APMAEGGGQNHHEVの配列から始まったが、
これに対し、それぞれの型の10%が1-3位欠損型でA
EGGGQNHHEVであった。これらの結果はCHO細
胞で発現し、分泌されたhVEGF121の15kDと20kD型
の大部分は、天然に単離された型の血管内皮細胞増殖因
子のN末端に一致した、正確なN末端アミノ酸配列を有
することを確かにした。
チダーゼ開裂部位で正確に開裂される 亜鉛-セファロース(上述)によるクロマトグラフィー
で精製されたhVEGF121は100mMのβ-メルカプトエ
タノールを含む負荷用バッファーで還元し、SDS-ポリア
クリルアミドゲル電気泳動で分画し、ポリビニリデンジ
フルオライド(PVDF)膜に移し、自動気相蛋白質配列決
定機(アプライドバイオシステムズ)で連続エドマン分
解してN末端配列解析を行った。血管内皮細胞増殖因子
の15kDおよび20kD型の両方とも、それぞれの型の90%が
APMAEGGGQNHHEVの配列から始まったが、
これに対し、それぞれの型の10%が1-3位欠損型でA
EGGGQNHHEVであった。これらの結果はCHO細
胞で発現し、分泌されたhVEGF121の15kDと20kD型
の大部分は、天然に単離された型の血管内皮細胞増殖因
子のN末端に一致した、正確なN末端アミノ酸配列を有
することを確かにした。
【0229】モノ-QクロマトグラフィーによるhVE
GF121の精製 15から25mMのイミダゾールを含むバッファーで亜鉛-セ
ファロースから溶出したhVEGF121を脱塩し、平衡
用バッファー(10mMトリス-塩酸、pH7.5)中でモノ-Q
(ファルマシア)カラムにかけた。結合したタンパク質
は、0mMから300mMの範囲のNaClを含む平衡用バッファ
ーで濃度勾配(カラム体積の30倍)にかけて溶出し、約
80mMから140mMの間のNaClで血管内皮細胞増殖因子が溶
出した。
GF121の精製 15から25mMのイミダゾールを含むバッファーで亜鉛-セ
ファロースから溶出したhVEGF121を脱塩し、平衡
用バッファー(10mMトリス-塩酸、pH7.5)中でモノ-Q
(ファルマシア)カラムにかけた。結合したタンパク質
は、0mMから300mMの範囲のNaClを含む平衡用バッファ
ーで濃度勾配(カラム体積の30倍)にかけて溶出し、約
80mMから140mMの間のNaClで血管内皮細胞増殖因子が溶
出した。
【0230】
【発明の効果】本発明により、血管内皮細胞に対して分
裂促進性があり、従って新たな血管新生(脈管形成)お
よび血管内表面の内皮新生を促進するのに有用な創傷治
癒剤の製造方法が提供される。また、本発明により、組
換えDNA技術によって血管内皮細胞増殖因子を製造す
る方法および手段が提供される。
裂促進性があり、従って新たな血管新生(脈管形成)お
よび血管内表面の内皮新生を促進するのに有用な創傷治
癒剤の製造方法が提供される。また、本発明により、組
換えDNA技術によって血管内皮細胞増殖因子を製造す
る方法および手段が提供される。
【図1】 図1は、ポリメラーゼチェーンリアクション
のプロセスの改変によって作製した5つのDNA配列を
示している。5つの内の1つ(pET-19A;クローン番号
5)は、ウシ血管内皮細胞増殖因子の配列決定された成
熟型の第15位から第38位のアミノ酸をコードする。この
図にはまた、5つのDNA配列由来のDNAコンセンサ
ス配列およびpET-19Aの翻訳が含まれている。それぞれ
の配列は、EcoRI制限部位およびHindIII制限部位を示す
DNAリンカーをどちらかの端に含む。
のプロセスの改変によって作製した5つのDNA配列を
示している。5つの内の1つ(pET-19A;クローン番号
5)は、ウシ血管内皮細胞増殖因子の配列決定された成
熟型の第15位から第38位のアミノ酸をコードする。この
図にはまた、5つのDNA配列由来のDNAコンセンサ
ス配列およびpET-19Aの翻訳が含まれている。それぞれ
の配列は、EcoRI制限部位およびHindIII制限部位を示す
DNAリンカーをどちらかの端に含む。
【図2】 図2は、ウシ濾胞星状細胞mRNAから、図1の
5つのDNAが作製され、そして増殖される方法を示す
概略図である。
5つのDNAが作製され、そして増殖される方法を示す
概略図である。
【図3a】 図3aは、11B'と命名されたクローン由来
のDNA配列およびその推定アミノ酸配列を示してい
る。示された配列は、ウシ血管内皮細胞増殖因子(bV
EGF120)の15位から120位までのアミノ酸をコードす
る。
のDNA配列およびその推定アミノ酸配列を示してい
る。示された配列は、ウシ血管内皮細胞増殖因子(bV
EGF120)の15位から120位までのアミノ酸をコードす
る。
【図3b】 図3bは、ヒト細胞での好ましいコドンを
使用した場合に基づいた合成DNA配列を表しており、
これはbVEGF120の1位から19位までのアミノ酸を
コードし、そして図3aのDNA配列の5’末端と重複
する。この合成DNAは、図3aのDNA配列を制限酵
素AccIで消化した後に図3aの単離されたDNA配列と
酵素によって連結され、全長の成熟bVEGF120タン
パク質をコードするDNA配列が製造される。
使用した場合に基づいた合成DNA配列を表しており、
これはbVEGF120の1位から19位までのアミノ酸を
コードし、そして図3aのDNA配列の5’末端と重複
する。この合成DNAは、図3aのDNA配列を制限酵
素AccIで消化した後に図3aの単離されたDNA配列と
酵素によって連結され、全長の成熟bVEGF120タン
パク質をコードするDNA配列が製造される。
【図4】 図4は、ヒト血小板由来増殖因子のA鎖サブ
ユニットおよびB鎖サブユニットをコードする単離され
たDNA配列、およびDNA配列から推定されるこれら
2つのタンパク質の前駆体のアミノ酸配列を示す。
ユニットおよびB鎖サブユニットをコードする単離され
たDNA配列、およびDNA配列から推定されるこれら
2つのタンパク質の前駆体のアミノ酸配列を示す。
【図5】 図5は、ウシ血管内皮細胞増殖因子をコード
するmRNAの一部を増幅させて作ったDNAを含む、臭化
エチジウムで染色したポリアクリルアミドゲルの写真で
ある。
するmRNAの一部を増幅させて作ったDNAを含む、臭化
エチジウムで染色したポリアクリルアミドゲルの写真で
ある。
【図6】 図6は、bVEGF120およびbVEGF164
をコードする単離されたcDNA配列を示す。四角で囲
んだ、塩基342位からのDNA配列は、bVEGF164を
コードする、もう一方の様式でスプライスされたcDN
A中に存在する挿入配列を示している。ヌクレオチド配
列のすぐ下に示すアミノ酸配列は、bVEGF164の推
定アミノ酸を示している。bVEGF120の推定アミノ
酸は、113位(Glu)までbVEGF164と一致してい
る。図6では、111位(Arg)から始まるbVEGF120
のカルボキシル末端の配列をイタリックでbVEGF
164の配列の下に示している。
をコードする単離されたcDNA配列を示す。四角で囲
んだ、塩基342位からのDNA配列は、bVEGF164を
コードする、もう一方の様式でスプライスされたcDN
A中に存在する挿入配列を示している。ヌクレオチド配
列のすぐ下に示すアミノ酸配列は、bVEGF164の推
定アミノ酸を示している。bVEGF120の推定アミノ
酸は、113位(Glu)までbVEGF164と一致してい
る。図6では、111位(Arg)から始まるbVEGF120
のカルボキシル末端の配列をイタリックでbVEGF
164の配列の下に示している。
【図7】 図7は、ヒト血管内皮細胞増殖因子の成熟し
た型(hVEGF121およびhVEGF165)をコードす
る天然のヒトDNA配列を示している。この示されてい
るDNA配列は、ヒトゲノムおよびヒトcDNAクロー
ンから得られた配列の構成を示している。コドン7にコ
ードされる括弧内のアミノ酸(Gly)は、bVEGF120
およびbVEGF164の配列と比較したときの挿入アミ
ノ酸を示す。
た型(hVEGF121およびhVEGF165)をコードす
る天然のヒトDNA配列を示している。この示されてい
るDNA配列は、ヒトゲノムおよびヒトcDNAクロー
ンから得られた配列の構成を示している。コドン7にコ
ードされる括弧内のアミノ酸(Gly)は、bVEGF120
およびbVEGF164の配列と比較したときの挿入アミ
ノ酸を示す。
【図8】 図8は、2つのバクテリオファージのオーバ
ーラップしたゲノム挿入物のDNA配列の一部を示す。
これらは共に、hVEGFの様々な型をコードする8つ
のエクソンおよび隣接するスプライスジャンクションを
含む。
ーラップしたゲノム挿入物のDNA配列の一部を示す。
これらは共に、hVEGFの様々な型をコードする8つ
のエクソンおよび隣接するスプライスジャンクションを
含む。
【図9】 図9は、U937細胞のmRNAからのhVEGF
121の全長のcDNA配列を増幅するために用いる2つ
のオリゴヌクレオチドプライマーを示している。
121の全長のcDNA配列を増幅するために用いる2つ
のオリゴヌクレオチドプライマーを示している。
【図10a】 図10aは、チャイニーズハムスター卵
巣細胞培養物中でhVEGF121を発現するのに用いら
れる発現ベクター、pLENの概略を示している。
巣細胞培養物中でhVEGF121を発現するのに用いら
れる発現ベクター、pLENの概略を示している。
【図10b】 図10bは、チャイニーズハムスター卵
巣細胞培養物中でhVEGF121を発現するのに用いら
れる他の発現ベクター、pMTNの概略を示している。
巣細胞培養物中でhVEGF121を発現するのに用いら
れる他の発現ベクター、pMTNの概略を示している。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成10年5月19日
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI C12P 21/02 C12N 5/00 B (C12P 21/02 C12R 1:91) (71)出願人 593215117 2450 BAYSHORE PARKWA Y,MOUNTAIN VIEW,CAL IFORNIA 94043,U.S.A. (72)発明者 ジュディス エイ. アブラハム アメリカ合衆国 カリフォルニア 94086 サニーベイル, #アイ−207, エス. フェアオークスアベニュー 655 (72)発明者 ジョン シー. フィデス アメリカ合衆国 カリフォルニア 94301 パロ アルト, ブライアント ストリ ート 2320 (72)発明者 リチャード エル. ミッチェル アメリカ合衆国 カリフォルニア 94086 サニーベイル, ユリーカ コート 283
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- 【請求項1】 哺乳動物の血管内皮細胞増殖因子をコー
ドする単離されたDNA配列。
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