DE19813774A1

DE19813774A1 - Parapockenvirus-kodierter vaskulärer Endothelzell Wachstumsfaktor (PPV-VEGF)

Info

Publication number: DE19813774A1
Application number: DE1998113774
Authority: DE
Inventors: Christoph Dehio; Marlene Roettgen; Hanns-Joachim Rziha; Mathias Buettner
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1998-03-27
Filing date: 1998-03-27
Publication date: 1999-09-30
Also published as: WO1999050290A1; WO1999050290A9; AU3147799A

Abstract

Die Erfindung betrifft neue aus Parapockenviren erhältliche Polypeptide mit Homologien zu humanen VEGF-Proteinen, welche in der Lage sind, die Endothelzellproliferation zu stimulieren. Diese VEGF-PPV-Polypeptide sind für pharmazeutische Anwendungen, insbesondere zur Stimulation der Gefäßbildung, Gefäßreparatur, Gewebereparatur und zur Immuntherapie geeignet. Weiterhin werden für die erfindungsgemäßen Polypeptide kodierende Nukleinsäuren, diese Nukleinsäuren enthaltende Vektoren und gegen die Polypeptide gerichtete Antikörper offenbart.

Description

Die Erfindung betrifft neue aus Parapockenviren (PPV) erhältliche Polypep tide mit Homologien zu humanen VEGF-Proteinen, welche in der Lage sind, die Endothelzellproliferation zu stimulieren. Diese PPV-VEGF-Polypeptide sind für pharmazeutische Anwendungen, insbesondere zur Stimulation der Gefäßbildung, Gefäßreparatur, Gewebereparatur und zur Immuntherapie geeignet. Weiterhin werden für die erfindungsgemäßen Polypeptide kodierende Nukleinsäuren, diese Nukleinsäuren enthaltende Vektoren und gegen die Polypeptide gerichtete Antikörper offenbart.

Angiogenese umfaßt den Prozeß der Neubildung von Blutgefäßen aus bereits existierenden Blutgefäßen. Angiogenetische Prozesse sind für eine normale Entwicklung und Differenzierung des Gefäßsystems essentiell. Im postembryonalen Stadium findet sich Angiogenese nur noch bei wenigen physiologischen Prozessen wie dem zyklischen Wachstum vom Corpus Luteum und Endometrium, der Wundheilung, den Reparaturprozessen bei der Gewebe- und Organregeneration, sowie bei dem pathologischen Prozeß des Tumorwachstums (Beck und D'Amore, "Vascular Development: Cellular and Molecular Regulation", FASEB J. 11: 365-373, 1997; Risau, "Mecha nisms of angiogenesis", Nature 386: 671-674, 1997).

Blutkapillaren bestehen aus Endothelzellen und Perizyten. Diese beiden Zelltypen besitzen die genetische Information zur Ausbildung neuer Blutkapillaren durch Kapillarsprossung. Dieser Prozeß wird durch spezifische Angiogenesefaktoren initiiert. Aufgrund der großen physiologischen Bedeutung der Angiogenese wurden in den vergangenen Jahren ver schiedene Angiogenesefaktoren isoliert, gereinigt und charakterisiert, u. a. aFGF, bFGF, EGF, TGF-α, TGF-β, PGE2, Monobutyrin, HGF, TNF-α, PD-ECGF, Angiogenin, Interleukin-8 und VEGF (Klagsbrun et al., "Regulators of Angiogenesis", Ann. Rev. Physiol., 53: 217-239, 1991).

VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) bezeichnet eine Familie mikroheterogener Wachstumsfaktoren mit großer Spezifität und Selektivität hinsichtlich der Wirkung als Mitogen für vaskuläre Endothelzellen (ED₅₀ 2-10 pM) (Ferrara et al., "The Vascular Endothelial Growth Factor Family of Polypeptides", J. Cellular Biochem., 47: 211-218, 1991). VEGF stimuliert die Angiogenese in verschiedenen in vivo Modellen, wie dem "chick chorioallentoic membrane" (CAM)-Assay (Leung et al., "Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen". Science 246: 1306-1309, 1989) und dem "rabbit cornea" Assay (Philipps et al., "Vascular endothelial growth factor is expressed in rat corpus luteum", Endocrinology, 127: 965-968, 1995), sowie in in vitro Modellen durch Bildung von kapillarartigen Strukturen in dreidimensionalen Kollagengelen (Pepper et al., "Potent synergism between vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor in the induction of angiogenesis in vitro", Biochem. Biophys. Res. Commun. 189: 824-831, 1992). VEGF stimuliert in vaskulären Endothelzellen weiterhin die Expression von Tissue-type Plasminogen Activator (tPA), PA Inhibitor-1 (PAI-1) (Pepper et al., "Vascular endothelial growth factor (VEGF) induces plasminogen activators and plasminogen activator inhibitor typ 1 in microvascular endothelial cell", Biochim. Biophys. Res. Commun. 181: 902-908, 1991) und Metallproteinasen (Unemori et al., "Vascular endothelial growth factor induces interstitial collagenase expression in human endothelial cells", J. Cell. Physiol. 153: 557-562, 1992). Eine weitere Funktion von VEGF liegt in der Erhöhung der vaskulären Permeabilität, weshalb das Protein auch als "Vascular Permeability Factor" (VPF) bezeichnet wird (Ferrara et al., "The Vascular Endothelial Growth Factor Family of Polypeptides", J. Cellular Biochem., 47: 211-218 (1991)). Darüber hinaus wird VEGF eine immunmodulatorische Wirkung zugeschrie ben, da VEGF die funktionale Reifung von dendritischen Zellen aus CD34 + Stammzellen inhibiert (Gabrilovich et al., Production of vascular endothelial growth factor by human tumors inhibits the functional maturation of dendritic cells", Nature Med. 2: 1096-1103, 1996).

Von den verschiedenen mikroheterogenen humanen VEGF-Formen liegt in normalen menschlichen Geweben vorwiegend VEGF₁₆₅ vor. VEGF₁₆₅ ist ein glycosyliertes, kationisches Dimer von 46-48 kDa, das aus zwei identischen 24 kDa Untereinheiten gebildet wird. VEGF₁₆₅ wird durch Sulfhydryl reduzierende Agentien inaktiviert, es ist jedoch resistent gegenüber saurem pH und Hitze. VEGF₁₆₅ bindet auf Endothelzellen an die Transmembranrezep toren KDR und FIt-1, die beide in der intrazellulären Domäne eine Proteinty rosinkinaseaktivität aufweisen. Während FIt-1 mit höherer Affinität als KDR gebunden wird, scheint das mitogene Signal für Endothelzellen durch KDR vermittelt zu werden (Klagsbrun und D'Amore, "Vascular endothelial growth factor and its receptors"l, Cytokine Growth Factor Rev. 7: 259-270, 1996).

Durch differentielles Spleißen von Transkripten des humanen vegf Gens können neben VEGF₁₆₅auch die VEGF-Polypeptidvarianten VEGF₁₂₁, VEGF₁₈₉ und VEGF₂₀₈ gebildet werden. Während alle humanen VEGF Polypeptide die Eigenschaft zur Stimulation der Endothelzellproliferation haben, unter scheiden sich die verschiedenen mikroheterogenen Formen hinsichtlich der Größe, dem Grad der niedrig-affinen Bindung an Heparin bzw. der hoch affinen Bindung an FIt-1 (Keyt et al., "The Carboxy-Terminal Domain (111-165) of Vascular endothelial Growth Factor 15 Critical for its Mitogenic Potency J. Biol. Chem. 271: 7788-7795, 1996). Beim Menschen wurden inzwischen weitere homologe Gene und deren Genprodukte beschrieben, u. a. VEGF-B, VEGF-C und VEGF-D, die gegenüber den zuvor beschriebenen VEGF-Polypeptiden abweichende biologische Aktivitäten und Expressions muster aufweisen. Homologe der bezeichneten humanen Faktoren wurden auch in verschiedenen Tierarten beschrieben.

Zu den Parapockenviren zählen unter anderem Orf-Viren, die bei Schaf und Ziege den Lippengrind und beim Menschen das Ecthyma contagiosum verursachen, und Melkerknotenviren, die beim Menschen den Melkerknoten verursachen (als Übersichtsartikel s. Mayr, A. und Büttner, M. "Milers's node, Bovine Papular Stomatitis, Ecthyma (Orf) Virus" In: Virus Infections of the Vertebrates, Vol. 3. Dinter, Z., Morein, B. (eds.) Seiten 23-42, Elsevier, Amsterdam, 1990). Diese Viren infizieren Keratinozyten der Haut und bewirken vasoproliferative Prozesse, die in Folge zu Schleimhaut wucherungen führen. Durch DNA-Sequenzierung vergleichbarer Abschnitte des Genoms der Orf-Virus-Isolate NZ2 bzw. NZ7 wurden zwei Varianten eines hypothetischen Gens (DNA-Sequenzen der offenen Leseraster hier bezeichnet als NZ2vegf, s. Abb. 1a, bzw. NZ7vegf, s. Abb. 1b) mit einem offenen Leseraster beschrieben, das eine gewisse Homologie zu mammali schem VEGF aufweist (Lyttle et al., "Homologs of Vascular Endothelial Growth Factor are encoded by the Poxvirus Orf Virus", J. Virol., 68: 84-92, 1994). Die Genprodukte dieser Gene und deren biologische Aktivität sind jedoch nicht bekannt.

Die Verfügbarkeit von Faktoren, die das Wachstum von Blutgefäßen stimulieren können, ist von großer Bedeutung für eine Behandlung pathologischer Zustände, die aus einer insuffizienten Durchblutung von Geweben und Qrganen herrühren (Ischämie). Rekombinanter hVEGF₁₆₅ (US-Patent 5,332,671) wurde bereits erfolgreich im Kaninchen-Tiermodell zur Therapie einer experimentell bewirkten Ischämie einer Extremität (Takeshita et al, "Therapeutic angiogenesis: A single intra-arterial bolus of vascular endothelial growth factor augments collateral vessel formation in a rabbit ischemic hindlimb model", J. Clin. Invest 93: 662-670, 1994) sowie in einem Schweine-Tiermodell zur Therapie einer chronischen myocardialen Ischämie verwendet (Harada et al., "Vascular endothelial growth factor improves coronary flow and myocardial function in chronically ischemic porcine hearts". Am. J. Physiol. 270: 1791-1802). Für ähnliche therapeu tische Anwendungen wurden weitere VEGF Varianten patentiert (US- Patente No. 5,194,596, No. 5,607,918, No. 5,726,152). Die unter schiedlichen physikalischen Eigenschaften (z. B. Bindung an Heparin, Stabilität gegenüber proteolytischer Degradation) und biologischen Aktivitäten (Wirkung auf vaskuläre Endothelzellen als Mitogen bzw. als Permeabilitätsfaktor) der verschiedenen VEGF Varianten lassen erwarten, daß diese Faktoren von unterschiedlichem therapeutischem Nutzen für die Behandlung dieser und anderer Krankheitsbilder sein werden. Da optimierte Therapeutika für den Einsatz beim Menschen bisher nicht entwickelt worden sind, besteht demnach weiterhin Bedarf für eine Bereitstellung von Wachstumsfaktoren mit einer möglichst hohen biologischen Wirksamkeit oder/und selektiven Wirkung auf das Endothel.

Gemäßvorliegender Erfindung wurde ein Gen-Fragment aus dem Genom des Orf-Virus Isolats D1701 isoliert (DNA-Sequenz des offenen Leseraster, hier bezeichnet als D1701vegf, s. Abb. 1(c)), welches homolog zu den zuvor isolierten hypohetischen Genen NZ2vegf (Abb. 1(a)) und NZ7vegf (Abb. 1(b)) aus anderen Orf-Virus Isolaten ist (Lyttle et al., "Homologs of Vascular Endothelial Growth Factor are encoded by the Poxvirus Orf Virus", J. Virol., 68: 84-92, 1994). Abb. 2 zeigt ein Alignment der VEGF-homologen Proteinsequenzen dieser Gene mit den Proteinsequenzen mammalischer Formen von VEGF.

Durch Expression von rekombinantem rPPV-VEGF in E. coli und dessen Reinigung sowie durch die native Expression von PPV-VEGF in eukaryonti schen Zellen konnte ein potenter Wachstumsfaktor für vaskuläre Endothel zellen dargestellt werden, der hinsichtlich seiner mitogenen Wirkung auf Endothelzellen überraschenderweise eine höhere spezifische Aktivität aufweist als vergleichbar hergestellte humane VEGF-homologe Proteine (Birkenjhäger et al. "Synthesis and physiological acitivity of heterodimers comprising different splice forms of vascular endothelial growth factor and placent growth factor", Biochem. J. 31 6: 703-707, 1996).

Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft ein isoliertes Polypeptid mit der Eigenschaft der Stimulierung der Endothelproliferation, enthaltend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus

(a) einer Aminosäuresequenz, die von einer der in Abb. 1(a), (b) und (c) dargestellten Nukleinsäuresequenzen kodiert ist,
(b) einer Aminosäuresequenz, die mindestens 25 aufeinanderfolgende Aminosäurereste einer der Aminosäuresequenzen aus (a) enthält, oder
(c) einer Aminosäuresequenz mit einer Identität von mindestens 50% zu einer der Aminosäuresequenzen aus (a).

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein isoliertes Polypeptid mit der Eigenschaft der Stimulierung der Endothelproliferation, erhältlich aus Parapockenviren, oder eine daraus abgeleitete Variante.

Durch die Erfindung wird ein neuartiger "Vascular Endothelial Growth Factor" bereitgestellt, der durch ein Gen im Genom von Parapockenviren kodiert wird (PPV-VEGF). Dieser PPV ist für diagnostische und insbesondere therapeutische Anwendungen geeignet, z. B. für die Stimulierung der Gefäßbildung und Gefäßreparatur, des weiteren der Gewebereparatur, der Produktion künstlicher Gefäße sowie für die Immuntherapie. Weiterhin werden die Bereitstellung von DNA-Vektoren zur Expression von PPV-VEGF bereitgestellt, insbesondere zur Gentherapie von Defekten der Gefäßbildung, Gefäßreparatur und Gewebereparatur.

Der in dieser Erfindung vorgestellte rekombinante PPV-VEGF (rPPV-VEGF) zeichnet sich durch eine ungewöhnlich hohe Aktivität hinsichtlich der Stimulation der Proliferation von humanen Endothelzellen aus. Während 0,4 ng/ml rPPV-VEGF bereits die Endothelzellproliferation stimulieren, werden für einen vergleichbaren Effekt ca. 1-2 ng/ml eines rekombinant hergestellten humanen VEGF Polypeptids benötigt (Birkenjhäger et al. supra). Ein weiterer Vorteil der Erfindung liegt in dem vorgestellten Verfahren zur Expression von rPPV-VEGF in E. coli, mit dem eine für eine therapeutische Anwendung ausreichende Menge an rPPV-VEGF hergestellt werden kann. Der Nachweis einer funktionellen Expression von PPV-VEGF durch eukaryontische Zellen nach Transfektion eines Expressionsplasmids bzw. nach Infektion mit ganzen PPV-Viren zeigt weiterhin auf, daß die für PPV-VEGF kodierende DNA-Sequenz für gentherapeutische Anwendungen Verwendung finden kann.

Die in den Abb. 1(a), (b) und (c) dargestellten Nukleinsäuresequen zen kodieren für erfindungsgemäße Polypeptide. Daneben erfaßt die Erfindung auch Polypeptide, die eine Aminosäureteilsequenz mit mindestens 25, vorzugsweise mindestens mindestens 50 und besonders bevorzugt mindestens 75 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten einer dieser Aminosäuresequenzen aufweisen oder eine Aminosäuresequenz mit einer Identität von mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 60%, besonders bevorzugt mindestens 75% und am meisten bevorzugt mindestens 90% zu einer dieser Aminosäuresequenzen besitzen.

Besonders bevorzugt ist ein Polypeptid enthaltend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus

(a) einer Aminosäuresequenz, die von der in Abb. 1(c) dargestellten Nukleinsäuresequenz kodiert ist,
(b) einer Aminosäuresequenz, die mindestens 25 aufeinanderfolgende Aminosäurereste einer der Aminosäuresequenzen aus (a) enthält, oder
(c) einer Aminosäuresequenz mit einer Identität von mindestens 50% zu einer der Aminosäuresequenzen aus (a).

Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Polypeptid durch rekombinante Expression einer exogenen Nukleinsäuresequenz in einer geeigneten Wirtszelle, z. B. einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle, hergestellt. Bei Expression in prokaryontischen Wirtszellen wie etwa E. coli wird das Polypeptid in unglykosilierter Form erhalten.

Die für das Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz wird vorzugsweise ausgewählt aus:

(a) den in Abb. 1(a), (b) und (c) dargestellten Nukleinsäuresequenzen,
(b) Nukleinsäuresequenzen, die im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes einer Nukleinsäure gemäß (a) entsprechen, und
(c) Nukleinsäuren, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nu kleinsäure gemäß (a) oder/und (b) hybridisieren.

Der Begriff "stringente Hybridisierung" gemäß vorliegender Erfindung wird wie bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CoId Spring Harbour Laboratory Press, 1.101-1.104, 1989) verwendet. Vorzugsweise spricht man von einer stringenten Hybridisierung, wenn nach Waschen für eine Stunde mit 1 × SSC und 0,1% SDS bei 55°C, vorzugs weise bei 62°C und besonders bevorzugt bei 68°C, insbesondere für 1 h mit 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 62°C und besonders bevorzugt bei 68°C noch ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Weiterhin ist, bevorzugt, wenn die Nukleinsäuresequenz zu einer der in den Abb. 1(a), (b) und (c) dargestellten Nukleinsäure sequenzen eine Identität von mindestens 70%, besonders bevorzugt von mindestens 80% und am meisten bevorzugt von mindestens 90% aufweist.

Erfindungsgemäße Polypeptide mit der Eigenschaft der Stimulierung der Endothezellproliferation sind aus Parapockenviren, insbesondere Orf-Viren, erhältlich. Daneben werden von der vorliegenden Erfindung auch Varianten solcher Polypeptide umfaßt, die sich durch Substitutionen, Deletionen oder/und Additionen einzelner Aminosäuren oder/und Aminosäuren abschnitte sich von den aus Parapockenviren erhältlichen Polypeptiden unterscheiden. Vorzugsweise enthalten diese Varianten mindestens 25, besonders bevorzugt mindestens 50 und am meisten bevorzugt mindestens 75 aufeinanderfolgende Aminosäurereste der natürlichen viralen Polypepti de. Darüber hinaus ist es bevorzugt, wenn die Aminosäuresequenz der Varianten eine Identität von mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 60%, besonders bevorzugt mindestens 75% und am meisten bevorzugt mindestens 90% mit der Aminosäuresequenz der natürlichen viralen Polypeptide aufweist.

Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine isolierte Nukleinsäure, die für ein Polypeptid wie zuvor angegeben, oder einen Abschnitt einer solchen Nukleinsäure von vorzugsweise mindestens 20, besonders bevorzugt mindestens 50 und am meisten bevorzugt mindestens 100 Nukleotiden kodiert. Die Nukleinsäure kann eine DNA, RNA oder auch ein Nukleinsäureanalogon sein. Erfindungsgemäße Nukleinsäuren umfassen aus Parapockenviren erhältliche Nukleinsäuren, daraus durch rekombinante DNA-Techniken erhältliche Nukleinsäuren und durch chemische Synthese hergestellte Nukleinsäuren. Vorzugsweise ist die Nukleinsäure eine rekombinante Nukleinsäure, d. h. sie liegt in Verknüpfung mit weiteren Nukleinsäuresequenzen vor, mit denen sie natürlicherweise nicht assoziiert ist. Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure frei von weiteren polypeptidkodierenden Sequenzen aus Parapockenviren.

Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinanter Vektor, der mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure wie zuvor angegeben enthält. Dieser Vektor kann ein beliebiger prokaryontischer oder eukaryonti scher Vektor sein, auf dem sich die erfindungsgemäße Nukleinsäure vorzugsweise unter Kontrolle eines Expressionssignals (Promotor, Operator, Enhancer etc.) befindet. Bevorzugte Beispiele für erfindungsgemäße Vektoren sind Plasmide oder virale Vektoren. Geeignete prokaryontische Vektoren sind beispielsweise bei Sambrook et al., supra, Kapitel 1-4 beschrieben. Beispiele für eukaryontische Vektoren finden sich bei Sambrook et al., supra, Kapitel 16.

Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine rekombinante Wirtszelle, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder mit einem erfindungsgemäßen Vektor transfiziert ist. Die Angabe "Transformation" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist dabei in ihrer breiten Bedeutung zu verstehen und umfaßt auch Prozesse wie Transfektion oder Infektion.

Die erfindungsgemäße Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle, ins besondere eine gram-negative prokaryontische Zelle, z. B. eine E.coli Zelle sein. Andererseits kann die Zelle jedoch auch eine eukaryontische Zelle sein, wie etwa eine Pilzzelle (z. B. Hefe), eine tierische, menschliche oder eine pflanzliche Zelle. Verfahren zur Transformation prokaryontischer oder eukaryontischer Zellen mit exogenen Nukleinsäuren sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie geläufig.

Darüber hinaus betrifft die Erfindung auch Antikörper, die gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid gerichtet sind. Vorzugsweise besitzen diese Antikörper keine Kreuzreaktivität mit humanen VEGF-Polypeptiden. Die erfindungsgemäßen Antikörper sind erhältlich durch Immunisierung von Versuchstieren, z. B. Mäusen, Ratten oder Kaninchen, mit erfindungs gemäßen Polypeptiden oder Abschnitten davon. Vorzugsweise werden zur Immunisierung Peptidabschnitte verwendet, die keine signifikante Homologie zu humanen VEGF-Polypeptiden aufweisen. Aus den immunisierten Versuchstieren können dann auf bekannte Weise polyklonale Antiseren bzw. Hybridomzellen, die zur Produktion monoklonaler Antikörper in der Lage sind, gewonnen werden. Neben polyklonalen und monoklonalen Antikörpern werden von der vorliegenden Erfindung auch Fragmente und Derivate solcher Antikörper erfaßt.

Das erfindungsgemäße Polypeptid wird vorzugsweise durch ein Verfahren hergestellt, bei dem man eine Wirtszelle, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist, bereitstellt, die Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert, bei denen eine Expression des Polypeptids stattfindet, und das Polypeptid aus der Wirtszelle oder/und dem Kulturmedium gewinnt. Verfahren zur Gewinnung erfindungsgemäßer Polypeptide aus prokaryontischen und eukaryontischen Zellen sind in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung ausführlich dargestellt.

Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder einen Abschnitt davon, vorzugsweise einen mindestens 25 Aminosäuren, besonders bevorzugt mindestens 50 und am meisten bevorzugt mindestens 75 Aminosäure langen Abschnitt davon, eine erfindungsgemäße Nu kleinsäure oder einen Abschnitt davon oder einen erfindungsgemäßen Vektor oder einen erfindungsgemäßen Antikörper gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch üblichen Träger-, Hilfs- und Zusatzstoffen enthält. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann für diagnostische Anwendungen und insbesondere für therapeutische Anwendungen eingesetzt werden.

Diagnostische Anwendungen umfassen Verfahren zum Nachweis des erfindungsgemäßen Polypeptids, dafür kodierender Nukleinsäuren bzw. gegen das Polypeptid gerichteten Antikörpern in biologischen Proben. Solche Nachweisverfahren werden üblicherweise in Form von Immunoas says oder Nukleinsäurehybridisierungsassays durchgeführt. Derartige Verfahren sind dem Fachmann geläufig.

Therapeutische Anwendungen für die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung umfassen die Stimulierung der Angiogenese, die Stimulierung der Gewebereparatur oder die Modulation der Immunantwort, z. B. die Stimulierung der Endothelzellproliferation oder die Inhibition der funktionellen Differenzierung dendritischer Zellen. Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann nach Protokollen erfolgen, wie sie beispielsweise für humane VEGF Polypeptide bekannt sind, z. B. durch parenterale Verabreichung des Polypeptids. Weiterhin von Bedeutung ist die Anwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung für die DNA-Vakzinierung oder für die Gentherapie. Hierzu kann auf bekannte Vektorsysteme zurückgegriffen werden, deren Einsatz für solche Zwecke bekannt ist. Darüber hinaus können auch als Vektorsysteme infektiöse Parapockenviren, insbesondere nichtpathogene Varianten davon eingesetzt werden.

Neben den erfindungsgemäßen Polypeptiden, Nukleinsäuren oder Antikör pern kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung noch einen oder mehrere Wirkstoffe enthalten. Beispiele solcher Wirkstoffe sind bekannte Angiogenesefaktoren wie sie zuvor genannt wurden.

Die vorliegende Erfindung wird darüber hinaus durch die nachfolgenden Beispiele und die Abb. 1 bis 10 erläutert.

Beispiele 1. Klonierung des Gens D1701vegf aus dem Genom des Orf Virus D1701

Das Gen D1701vegf wurde aus genomischer DNA des Orf Virus D1701 mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert (Standardtechnik nach Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Edition) Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989). Hierfür wurden die Oligonukleo tidprimer 5'-GGG TGA GAA TTC ATG AAG TTT CTC GTC GGC-3' und 5'- AAA GTT GGA TCC CTA GCG GCG TCT TCT GGG-3', die unmittelbar vor das ATG-Startkodon eine EcoRI-Schnittstelle und unmittelbar nach dem TAG-Stopkodon eine BamHI-Schnittstelle einführen, verwendet. Durch Standardtechniken wurde das ca. 420 bp große Amplifikat über die eingeführten EcoRI- und BamHI-Schnittstellen in den Vektor pSPT18 (Boehringer Mannheim) kloniert, wodurch das Plamid pVEGF gebildet wurde. Das in pVEGF klonierte 1701vegf Gen wurde über die EcoRI- und BamHI- Schnittstellen weiterhin in den Vektor pSK⁻(Stragene, Heidelberg) kloniert, wodurch das Plasmid pCD325 gebildet wurde.

2. Klonierung des Gens D1701vegf in Vektoren zur rekombinanten Expression eines Fusionsproteins in E. coli

Die rekombinante Expression von rPPV-VEGF erfolgte in Derivaten des Vektors pET-15b (Novagen, Madison, Wisconsin). Dieser auf T7-Polymerase basierende, IPTG-induzierbare Expressionsvektor ermöglicht die Expression von Fusionsproteinen, die N-terminal ein proteolytisch abspaltbares Peptid mit einer Hexa-Histidin-Sequenz für die Affinitätsreinigung des rekom binanten Proteins an Nickel-Chelat-Säulen tragen. Der fusionierte Teil des D1701vegf Gens wurde N-terminal um 20-Aminsäuren verkürzt, da dies etwa der Prozessierung des nativen Proteins bei der Abspaltung des Signalpeptids während der co-translationalen Translokation in eukaryonti schen Zellen entspricht (Abb. 4). Für die Klonierung des Expressions plasmids pCD369 wurde der Vektor pET-1 Sb mit Ndel geöffnet, die überhängenden Enden wurden durch Klenow-Poiymerase aufgefüllt und dann die an einem Ende gelegene BamHI Schnittstelle mit BamHI ge schnitten. Ein ca. 345 bp langes Genfragment von D1701vegf wurde durch Mvnl/BamHI Verdau des Plasmids pCD325 isoliert und direktionell in den im vorigen Schritt vorbereiteten Vektor pET-15b kloniert, wodurch das Plasmid pCD369 rekonstituiert wurde (Abb. 3a).

Die alleinige Einführung von pCD369 in den E. coli Expressionsstamm BL21 (DE-3) (Novagen, Madison, Wisconsin) ermöglichte jedoch noch keine Expression des rekombinanten Fusionsproteins. Hierfür mußte zusätzlich das Plasmid pSB161 (Schenk et al., "Improved high-level expression system for eukaryotic genes in Escherichia coli using" T7 RNA polymerase and rare ^ArgtRNAs) eingeführt werden, welches die Überexpression einer seltenen ^ArgtRNA (argU) bewirkt. Hierdurch können in E. coli Gene überexprimiert werden die, wie viele eukaryontische Gene, eine kritische Anzahl der in E. coli seltener Argininkodons (AGG/AGA) enthalten (Brinkmann et al., "High-level expression of recombinant genes in Escherichia coli is dependent on the availabilitiy of the dnaY gene product", Gene 85: 109-114, 1989). Um die Expression des rekombinanten pPPV-VEGF Protein zu verbessern und die Stabilität des Expressionsplasmids zu verbessern, wurde aus den Plasmiden pCD369 und pSB161 das chimäre Plasmid pCD371 konstruiert, welches die positiven Merkmale der beiden Plasmide vereint und deren Nachteile weitgehend ausschließt: (1) Ein Lac^q reprimiertes, IPTG-induzier bares T7-Polymerase abhängiges Expressionssytem für die Überexpression des Fusionsproteins nach Abb. 4, (2) Expression der seltenen ^ArgtRNA (argU) als Voraussetzung für die Überexpression des letzteren Fusionsproteins und (3) einen Kanamycinresistenz als geeigneteren Resistenzmarker im Vergleich zur Ampicillinresistenz in pCD369.

Für die Konstruktion des Expressionplasmids pCD371 (Abb. 3b) wurde pSB161 mit Nhel linearisiert und die überhängenden Enden mit Klenow- Polymerase aufgefüllt. pCD369 wurde mit Nrul/Sspl verdaut und ein 2844 bp großes Fragment mit dem lac^q Gen und dem D1701vegf Gen in den im vorigen Schritt linearisierten Vektor pSB161 kloniert. pCD371 wurde dann in den Expressionsstamm BL21 (DE-3) transformiert. Dieser Expressions stamm erwies sich als stabil und geeignet für die Expression großer Mengen des rPPV-VEGF Fusionsproteins in E. coli.

3. Rekombinante Expression des rPPV-VEGF Fusionsproteins in E. coli und dessen Reinigung

Für die Expression des rPPV-VEGF Fusionsproteins in E.coli wurde der Stamm BL21 (DE-3, pCD371) aus einem Glycerolstock in LB-Medium mit 30 µg/ml Kanamycin für 16 h in Schüttelkultur bei 37°C angezüchtet. Dann wurden 2 Liter desselben Mediums 1 : 100 mit der Kultur angeimpft und bis zu einer optischen Dichte (OD 550 nm) von 0,3 unter gleichen Bedingungen inkubiert. Nach Zugabe von IPTG (1 mM Endkonzentration) wurde für weitere 2 h inkubiert. Die Bakterien wurden dann durch Zentrifugation pelletiert und in Aufschluß-Puffer (5 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,9) resuspendiert und bei 4°C durch Ultraschall aufge schlossen. Nach Zentrifugation für 30 min bei 17 000 rpm, 4°C wurde löslicher rPPV-VEGF aus dem Überstand anhand des Hexa-Histidin-Tags durch Affinitätschromatographie an einer Ni-Chelat Säule entsprechend den Angaben des Herstellers (Novagen, Madison, Wisconsin, Protokoll für native Reinigung) gebunden und durch Waschen mit mindestens 10 Säulenvolu mina von kontaminierenden Substanzen abgetrennt.

Nach der Elution wurde die Proteinlösung durch Ultrafiltration mit Centricon- Säulen entsprechend den Angaben des Herstellers (Amicon, Beverly, MA) eingeengt. Ein weiterer Reinigungsschritt von rPPV-VEGF erfolgte durch Gelfiltration über Superose 12 h in PBS-Puffer, wodurch Dimere größtenteils von verbliebenen Monomeren abgetrennt werden konnten. Dann wurde der Histidin-Tag durch Verdau mit 1 U biotinyliertem Thrombin/mg Fusions protein für 6,5 h bei Raumtemperatur entsprechend den Angaben des Herstellers (Novagen, Madison, Wisconsin) abgespalten und das biotinylierte Thrombin an Streptavidin-Sepharose adsorbiert. Der abgespaltene Histidin- Tag wurde an einer Ni-Chelat Säule entsprechend den Angaben des Herstellers (Novagen, Madison, Wisconsin) adsorbiert. Nach erneutem Einengen des Säulendurchflusses durch Ultrafiltration wurde ein letzter Gelfiltrationsschritt über eine Sephacryl S-200 Säule in PBS Puffer durch geführt. Die Homogenität des eluierten rPPV-VEGF wurde durch SDS-PAGE und nachfolgende Silberfärbung nach Standardtechniken nachgewiesen. Proteinbestimmung mit dem Bradford-Reagenz (Biorad) wurden ent sprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt. Endotoxinbestimmun gen wurden mit dem Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Coattest (Chromoge nix, Mölndal, Schweden) entsprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt.

4. Test der Endothelzellproliferation durch rPPV-VEGF und PPV-VEGF

Die Stimulierung der Proliferation von primären Endothelzellen aus der Vene der menschlichen Nabelschnur ("Human umbilical vein endothelial cells" im folgenden als HUVECs bezeichnet) stellt das übliche Verfahren zum Nachweis der mitogenen Wirkung von VEGF Wachstumsfaktoren auf Endothelzellen dar. HUVECs wurden entsprechend Dehio et al., ("Interaction of Bartonella henselae with endothelial cells results in bacterial aggregation on the cell surface and the subsequent engulfment and internalisation of the bacterial aggregate by a unique structure, the invasome", J. Cell Science 110: 2141-2154, 1997) präpariert und kultiviert und von Passage 4 bis 9 für Proliferationsassays eingesetzt. Hierfür wurden HUVECs mit einer Dichte von 50000 Zellen/ml in Gelatine-beschichteten Beschichtung mit (0,2%iger Lösung bei 37°C für 30 min) 24 Well-Platten im Medium 199 mit 10% dekomplementiertem FCS eingesät und für 16 h bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. Dann wurde das Medium gegen gleiches Medium mit der Testsubstanz ausgetauscht und nach weiteren 72 h Inkubation der Zellen bei 37°C/5% CO₂ wurde die Zellzahl durch Auszählen eines definierten mikroskopischen Feldes bestimmt. Für die Bestimmung des Proliferations faktors wurde als Referenzprobe Medium ohne weitere Zusätze verwendet, der Proliferationsfaktor einer Probe ergibt sich aus dem Quotienten der Zellzahlen bezogen auf diese Referenzprobe.

5. Klonierung des Gens D1701vegf in einen eukaryontischen Ex pressionsvektor

Für die Expression von PPV-VEGF in eukaryontischen Zellen wurde das Gen D1701vegf in den Expressionsvektor pCB6-Bam (Abb. 8a) kloniert. pCB6-Bam ist ein Plasmid von 6189 bp Länge, welches über folgende funktionell en Sequenzelemente verfügt: Den Replikationsursprung ColE1 und das Ampicillinresistenz-kodierende Gen bla, welches Klonierung und Plasmid präparation in E. coli ermöglicht, eine Expressionskassette für das neo Gen, welches in transfizierten eukaryontischen Zellen Resistenz gegen Geniticin verleiht; einen Cytomegalovirus (CMV)-Promotor, gefolgt von einem Polylinker und einer hGll-Polyadenylierungsstelle für die Expression eines beliebigen Gens in eukaryontischen Zellen durch Insertion der kodierenden Sequenzen in den Polylinker. Das Leseraster des in pVEGF bzw. pCD325 klonierten D1701vegf Gens wird direkt durch die zuvor rekombinant eingeführten EcoRI- bzw. BamHI-Schnittstellen eingerahmt. Für die effiziente Expression von D1701vegf in eukaryontischen Zellen scheinen jedoch wenige Nukleotide der viralen Sequenz stromaufwärts vom Translations startpunkt von Bedeutung zu sein. Deshalb wurden durch geeignete Primer 22 Nukleotide der ursprünglichen viralen Sequenz vor dem ATG-Startkodon wieder eingeführt, gleichzeitig davor eine HindIII Schnittstelle für die direktionale Klonierung des Amplifikats. Für die Polymerasekettenreaktion nach Standardtechniken wurde das Plasmid pCD325 als Template und die Oligonukleotide 5'-GGG GAA GCT TAC TTT TAA GGG TGA GGC GCC ATG AAG TTT CTC GTC GGC ATA CTG-3' und 5'-CGC GGA TCC CTA GCG GCG TCT TCT G-3' als Amplifikationsprimer eingesetzt. Das Amplifikat wurde durch Standardtechniken über die Schnittstellen HindIII und BamHI in den Vektor pCB6-Bam kloniert, was in der Bildung des Plasmids pCD379 (Abb. 8b) resultierte.

6. Expression von PPV-VEGF in eukaryontischen Zellen

Plasmid-DNA des eukaryontischen Expressionsvektors pCD371 für Transfektionsexperimente wurde mit dem Qiagen Midi Kit (Qiagen, Hilden) entsprechend den Angaben des Herstellers präpariert. COS-7 Zellen wurden entsprechend der Ca-Phosphat-Kopräzipitationstechnik (Standardtechnik nach Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Edition) Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989) mit dem PPV-VEGF Ex pressionsplasmid pCD379 bzw. dem leeren Expressionsvektor pCB6-Bam transfiziert. Von 24 h bis 72 h nach der Transfektion wurde Medium (M199/10% dekomplementiertes FCS) auf den transfizierten Zellen konditioniert. Nach dem Abernten der Kulturüberstände wurden diese für 15 min zentrifugiert und anschließend durch 0,22 µm Filter filtriert. Dann wurden Verdünnungen hiervon in einem HUVEC Proliferationsassay ent sprechend Beispiel 4 getestet.

7. Expression von PPV-VEGF durch PPV infizierte Zellen

BKKL3A Zellen, oder andere Zellkulturen aus der Kälberniere oder -lunge, bzw. aus der Haut von Schaf, Rind oder Mensch wurden durch Standard techniken mit Orf-Viren und einer Multiplizität der Infektion von 0,1-10 für 4-48 h infiziert. Zellkulturüberstände werden dann durch 0,1 µm Filter abfiltriert, die selbst die Viruspartikel zurückhalten, und in einem HUVEC Proliferationsassay entsprechend Beispiel 4 getestet.

Claims

1. Isoliertes Polypeptid mit der Eigenschaft der Stimulierung der Endothelproliferation, enthaltend eine Aminosäuresequenz ausge wählt aus

(a) einer Aminosäuresequenz, die von einer der in Abb. 1(a), (b) und (c) dargestellten Nukleinsäuresequenzen kodiert ist,
(b) einer Aminosäuresequenz, die mindestens 25 aufeinand erfolgende Aminosäurereste einer der Aminosäuresequenzen aus (a) enthält, oder
(c) einer Aminosäuresequenz mit einer Identität von mindestens 50% zu einer der Aminosäuresequenzen aus (a).

2. Polypeptid nach Anspruch 1, enthaltend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus

(a) einer Aminosäuresequenz, die von der in Abb. 1(c) dargestell ten Nukleinsäuresequenz kodiert ist,
(b) einer Aminosäuresequenz, die mindestens 25 aufeinand erfolgende Aminosäurereste einer der Aminosäuresequenzen aus (a) enthält, oder
(c) einer Aminosäuresequenz mit einer Identität von mindestens 50% zu einer der Aminosäuresequenzen aus (a).

3. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es unglykosyliert ist.

4. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es durch rekombinante Expression einer exogenen Nukleinsäure sequenz in einer geeigneten Wirtszelle hergestellt ist.

5. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus:

(a) den in Abb. 1(a), (b) und (c) dargestellten Nukleinsäurese quenzen,
(b) Nukleinsäuresequenzen, die im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes einer Nukleinsäure gemäß (a) entsprechen, und
(c) Nukleinsäuren, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäure gemäß (a) oder/und (b) hybridisieren.

6. Isoliertes Polypeptid mit der Eigenschaft der Stimulierung der Endothelzellproliferation, erhältlich aus Parapockenviren, oder eine daraus abgeleitete Variante.

7. Polypeptid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Orf-Viren erhältlich ist.

8. Isolierte Nukleinsäure, die für ein Polypeptid nach einem der An sprüche 1 bis 7 kodiert oder ein Abschnitt davon.

9. Rekombinanter Vektor, der mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure nach Anspruch 8 enthält.

10. Vektor nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure in operativer Verknüpfung mit einem Ex pressionssignal ist.

11. Vektor nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Plasmid ist.

12. Vektor nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß er ein viraler Vektor ist.

13. Vektor nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß er frei von weiteren Polypeptid-kodierenden Sequenzen aus Parapockenviren ist.

14. Rekombinante Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer Nukleinsäure nach Anspruch 8 oder einem Vektor nach einem der Ansprüche 9 bis 13 transformiert ist.

15. Antikörper gegen ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7.

16. Antikörper nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß er keine Kreuzreaktivität mit humanen VEGF-Polypeptiden besitzt.

17. Verfahren zur Gewinnung eines Polypeptids nach einem der An sprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Wirtszelle, die mit einer Nukleinsäure nach Anspruch 8 oder einem Vektor nach einem der Ansprüche 9 bis 13 trans formiert ist, bereitstellt, die Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert, bei denen eine Expression des Polypeptids stattfindet, und das Polypeptid aus der Wirtszelle oder/und dem Kulturmedium gewinnt.

18. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder einen Abschnitt davon, eine Nukleinsäure nach Anspruch 8 oder einen Abschnitt davon, einen Vektor nach einem der Ansprüche 9 bis 13 oder einen Antikörper nach Anspruch 15 oder 16 gegebenenfalls zusammen mit pharmazeu tisch üblichen Träger-, Hilfs- und Zusatzstoffen enthält.

19. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18 für diagno stische Anwendungen.

20. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18 für therapeu tische Anwendungen.

21. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20 zur Modula tion der Immunantwort, zur Stimulierung der Angiogenese oder zur Stimulierung der Gewebereparatur.

22. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20 oder 21 zur Stimulierung der Endothelzellproliferation oder zur Inhibition der funktionellen Differenzierung dendritischer Zellen.

23. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 20 bis 22 für die DNA-Vakzinierung und Gentherapie.

24. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen oder mehrere weitere Wirkstoffe enthält.

25. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen oder mehrere weitere Angiogenesefaktoren oder dafür kodierende Nukleinsäuren enthält.