JPH01501361A - 新しいｔ細胞サプレッサー因子の生産およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

明細書 新しいＴ細胞サプレッサー因子の生産およびその用途本発明は、Ｔ細胞サプレッ サータンパク質の天然供給源からの精製、組換え手法による生産およびその利用 に関するものである。 １、背景 ＩＩ！胞の増殖および分化を調節するポリペプチド因子類の新規系統群（ファミ リー）が明らかになった。 本発明のポリペプチドに関係する因子群、即ち腫瘍増殖　因子−β（ＴＧＦ−β ）群、軟骨誘導因子（ＣＩＦ）群および神経膠芽腫由来Ｔ細胞サプレッサー因子 （Ｇ−Ｔ　ｓ　Ｆ　）群へ至る研究は重要な３つの流れに大別される０本発明は 主としてＧ−ＴｓＦに関する９本発明の優先日以降に明らかになったように、Ｇ −ＴｓＦはＴＧＦ−β２および／またはＣＩ　Ｆ−Ｂと同一のものであると思わ れる。 １．１．７ＧＦ−β類 ＴＧＦ−β類は、初めヒト血小板から精製されたジスルフィドで連結した２５ｋ ｄのホモ二量体およびヘテロニ量体である。またＴＧＦ−βと機能的および／ま たは精造的に関連するその他の因子類、例えば哺乳動物の新しい形のＴＧＦ−β 、アクチビン、インヒビンおよびミエラー管　抑制物質（ＭＩＳ）およびショウ ジヨウバエの１５遮断遺伝子複合体生成物が発見された。 これらのポリペプチドの幾つかについてその対応するｃＤＮＡの解析から推論さ れるところによる　と、これらは通常もっと大きい分泌前駆物質の一部として合 成される。これらタンパク質相互の相同性は主として全ペプチドのＣ−末端領域 に帰属されるが、その部分は一般に前駆物質から切断され、生物活性を有する成 熟二量体を生成する。分子鎖内および分子鎖間ジスルフィド結合形成に含まれた 複数システィンの保存は特に驚くべきことである。このポリペプチド系統群の幾 つかに共通することは、明らかにそれらが胚形成および組織修復のような分化過 程に関与していることである。 本発明の最先優先日以降、ＴＧＦ−βには３つの形Ｓ、即ちＴＧＦ−β１、ＴＧ Ｆ−β２およびＴＧＦ−β１．２の三種の形態が存在し、ＴＧＦ−β１．２はサ ブユニットβ１およびβ２のホモ２量体およびヘテロ２量体の組合わせから得ら れたものであることが判明した（Ｓ、カイフェッツら、セル、４８巻［１９８７ 年２月１３日］、４０９〜４１５頁）０元来ＴＧＦ−βと記載されていたポリペ １チドは、実際は２個のβ１サブユニットからなる。その遺伝子系統群ノソノ他 周知のどの構成部分よりも、β１およびβ２サブユニツトは相互に密接に関連し 合っており、そのＮ−末端側の半分では約７０％のアミノ酸配列の相似性を示し ている。 ごく最近に判明したことだが、ＴＧＦ−β系統群のもう一つ驚嘆すべき点は高度 の配列保存性を有することであり、例えばヒトおよびマウスのＴＧＦ−β１配列 間の保存性は９９％である。この事実は、ＴＧＦ−βの種をまたがった決定的な 生物学的役割を物語っている。 ＴＧＦ−β類の生物学的機能はまだ完全に解明されていないが、上記のように極 めて多彩である。即ち、インビトロでこれらは正常およびある種の腫瘍由来の上 皮細胞系の増殖を抑制するが、光道したオートクリン（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）マ イトジェンの形質発現に対する恐らく２次反応としである種の間質細胞増殖を誘 発する０分化能を有する細胞による特異表現型形質発現はＴＧＦ−β類によって 、しばしば極端に変えられる。即ちこれらは脂肪形成、筋肉形成、造血を阻止す るが、一方、インビトロにおいて軟骨形成および上皮細胞の分化を促進し、また リンパ球、顆粒膜および副腎皮質細胞における分化機能を調整することができる 。 ＴＧＦ−βのインビボにおける効果はさほど完全に検討されていないが、これら は活性な分化の中心および血小板に比較的高水準に存在していることから、正常 の発生および創傷治癒反応におけるさまざまな組織系の形成に活発に関与してい るものと考えられる。 事実、ＴＧＦ−βによって分化・増殖に影響を受けた多くの開業細胞および上皮 細胞は、これらの因子に反応してフィブロネクチン、種々の型のコラーゲンおよ びその他の細胞接着性タンパク質の形質発現を光道する。インビボでは、皮下投 与により豊富なコラーゲン沈着を誘発する。 したがってＴＧＦ−βは細胞の細胞外マトリックスに対する相互作用に影響し、 もしくは調節し１例えば細胞外マトリックスの過剰およびマトリックスの構造、 およびそれに対応する細胞の反応能を制御し、あるいは他の成長因子に対する受 容体および細胞内標的をＷＪＮすることによって分化および形態発生に影響を与 えているようである。 ＴＧＦ−βｌおよびＴＧＦ−β２の機能は全く同一ではなく、異なった受容体認 識性を有する。’Ｉ”ＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２に対する異なった受容体が 存在し、そのあるものは交差反応性である。この事実はＴＧＦ−β２に関しであ る独特な機能を示唆している。しかし２因子とも、上皮細胞増殖および脂肪形成 阻止能およびフィブロネクチンおよびコラーゲンの形質発現誘発能は同等である ようである。 ＴＧＦ−βの作用は、ことに結合織において強く同化的であって繊維形成および 脈管形成を招来する。 したがって実際の適用は、外傷、火傷、外科手術によって生じる組織損傷の修復 、または高齢者の衰弱、骨粗しよう症、およびＴリンパ球およびＢリンパ球双方 に対する抑制作用に着目して抗炎症剤または免疫抑制剤として使用される。 ＴＧＦ−β群、ことにＴＧＦ−β１は造血調節に関与するかもしれない（Ｍ、オ ークら、ネーチャー、３２９巻［１９８７年１０月１．５３９〜５４０頁）。 ヒトＴＧＦ−β１（鮪初ＴＧＦ−βと命名された）およびその前駆物質のアミノ 酸およびヌクレオチド配列は既知である（例えばＲ。 プリンクら、ネーチャー、３１６巻［１９８５年１．７０１〜７０４頁、Ｒ，プ リンクら、ジャーナル・サブ・セル・バイオケミストリー［１９８６年］、増刊 号１０Ｃ１１０５頁、Ｒ，プリンクら、ジャーナル・サブ・バイオロジカル・ケ ミストリー、２６１巻［１９８６年４月５日］　、４３７７〜４３７９頁および ゲンネンテク、ＥＰ２００３４１号［１９８６年１２月１０日公開］）。 ＴＧＦ−β２はそれ自体、本発明の最先優先日当時、明らかに同定されていなか った。その後１部分的アミノ酸配列が開示され、例えば成熟ブタのＴＧＦ−β２ の最初の２９個のＮ−末端アミノ酸配列がＳ、カイフエツッら（七ル、４８巻［ １９８７年２月１３日］、４０９〜４１５頁）により、成熟ヒトのＴＧＦ−β２ の最初の５１個のＮ−末端アミノ酸配列がＴ、イケダら（バイオケミストリー、 ２６巻［１９８７年５月１．２４０６〜２４１０頁）により開示されている。さ らに成熟ヒトのＴＧＦ−β２の完全なアミノ酸配列がＨ，マークアットら（ジャ ーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー、２６２巻［１９８７年９月５日 １．１２１２７〜１２１３１頁）により、即ち本発明の優先日より後れて開示さ れた。 １．２．　ＣＩ　Ｆ−Ｂ もう一つの研究の流れは、ＣＩＦ類、即ち一般に軟骨誘導因子Ｂ（ＣＩ　Ｆ−Ｂ ）と命名された脱ミネラル化したウシの骨董白質の単離、精製および形質決定で あって、例えばＳ、Ｍ、サイアディンら（プロシーディングズ・オン・ザ・ナシ ョナル・アカデミ−・オプ・サイエンシズ・オン・ザ・ユナイテッド・スティッ ・オン・アメリカ［以下、ＰＮＡＳと略記］、８２巻［１９８５年１．２２６７ 〜２２７１頁）、およびそれまたはその関連因子の種々の抽出法または部分的精 製方法（例えばコラーゲン［ＥＰ１２１９７６号］およびＵＳＰ４６２７９８２ 号）が記載されている。 ＣＩ　Ｆ−Ｅ）−はインビトロで強力な軟骨形成誘導因子であるから、軟骨内の 骨形成に関与する。コラーゲン（ＥＰ１８２４８３号）には、恐ら（ＣＩＦ−Ｂ を含有していると思われる蛋白質量誘導因子からなる骨修復を行う移植用組成物 が記載されている。コラーゲン（ＥＰ２１３７７６号）には一般に炎症の処置ま たは造血またはリンパ生成の機能障害もしくは機能不全の処置にＣＩ　Ｆ−Ｂを 使用する用途が開示されている。 ウシの骨から単離された成熟ＣＩ　Ｆ−Ｂの部分的な、しかし不正確な３０個の Ｎ−末端アミノ酸配列がコラーゲン（ＥＰ１６９０１６号）に、また本発明の優 先期間中にコラーゲン（ＥＰ２１３７７６号［１９８７年３月１１日公開］）に 開示され、本発明の優先期間中に、成熟したウシのＣＩ　Ｆ−Ｂの最初の３０個 のＮ−末端アミノ酸の正確なアミノ酸配列がＳ、Ｍ、サイアディン（ジャーナル ・オン・バイオロジカル・ケミストリー、２６２巻［１９８７年２月１５日］、 １９４６〜１９４９頁）によって開示された。 現在、ＴＧＦ−β２およびＣＩ　Ｆ−Ｂは恐らく同一であるということが分かっ た。 １．３．０−ＴｓＦ 研究の第三の流れは神経膠芽腫由来Ｔ細胞サプレッサー因子（Ｇ−Ｔ　ｓ　Ｆ　 ）に関するものである。 神経膠芽腫患者は抑制された細胞性免疫を有する。この事実は１９７２年頃には 既に明らかにされていた（Ｗ、Ｈ，ブルックスら、ジャーナル・オプ・エクスペ リメンタル・メディシン、１３６巻［１９７２年］、１６３１〜１６４７頁）、 神経膠芽腫患者の末梢血リンパ球および１（瘍浸潤リンパ球はともにインビトロ で増殖反応の抑制を示す、さらにこれらの患者は遍在抗原に対し、インビボの皮 膚試験反応の障害を示す、免疫抑制活性は腫瘍除去前の腫瘍ａ腫液および血清に 存在するが腫瘍除去後には存在しないから、この欠損細胞性免疫は神経膠芽Ｈ１ ｍ胞による免疫抑制ペプチド産生に起因したものである。数種の培養神経膠芽ｌ ！腫瘍細胞系によって生じた粗製の上清が、レクチンによって誘発された胸腺細 胞の増殖およびインターロイキン−２によって誘発されたＴ−細胞クローンの増 殖およびアロ抗原反応性細胞障害性Ｔ細胞の生成を抑制するという観察によって この考えは裏付けられる（Ａ、フォンタナら、ジャーナル・オン・イムノロジー 、１３２巻［１９８４年１．１８３７〜１８４４頁、Ｍ、シュバイツアーおよび Ａ、フォンタナ、ジャーナル・オン・イムノロジー、１３４巻［１９８５年１． １００３〜１００９頁）。 Ｇ−ＴｓＦはさまざまな純度段階で、配列の記載なしにその天然形態、部分的に 精製した形態が文献および特許に記載されており、例えばサンド［ＥＰ１５９２ ８９号］はこの因子の生化学的な形質決定および部分的精製を記載している。そ の他の発表としては１例えばＡ、７オンタナら（ジャーナル・オン・イムノロジ ー、１３２巻［１９８４年１．１８３７〜１８４４頁）、およびＭ、シュバイツ アーおよびＡ、フォンタナ（ジャーナル・オプ・イムノロジー、１３４巻［１９ ８５年］、１００３〜１００９頁）がある。 またこの因子は結合織形成を増大し、強力な同化活性を有し、繊維形成および脈 管形成を誘導する。 本発明の優先権期間中、均一となるまでＧ−ＴｓＦを精製し、成熟タンパク質の 最初の２０個のアミノ酸のアミノ末端配列が開示されたく例えばＭ、ウランら、 ＥＭＢＯジャーナル、６巻［１９８７年６月］り。 ２、発明の要約 以上から、上記の因子群を純粋な形で単離し、その誘導体を生産し得る程度大量 に入手可能とし、さらに各種の治療形態で試験し、使用し得るよう、即ち組換え 体形ｆ３で入手可能とする必要性が存在すると考えられる。 本発明は （ａ）神経膠芽■細胞のような天然供給源から実質上純粋な形でヒトＧ−ＴｓＦ を単離し。 （ｂ）組換え体Ｇ−ＴｓＦおよびその前駆物質ペプチドを生産することからなる 方法によってこれを達成する。 （ａ）に関しては、タンパク質化学の手法を用いてこれを達成する。Ｇ−ＴｓＦ の２つの可能性ある変異型が得られ、その一つに関しては完全に形質決定した。 生産物Ｇ−ＴｓＦは少なくとも９０％の純度を有する。その比活性は胸１１１Ｍ 胞検定により少なくとも５Ｘ１０’単位／ｍｇである。 この検定で、半最大抑制値はｌＸ１０〜”Ｍまたはそれ以下の濃度で得られる。 （ｂ）に関しては、本発明によって成熟Ｇ−ＴｓＦおよびＧ−ＴｓＦ前駆物質の 完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列および対応するｃＤＮＡの入手が初めて 可能となった。 このように本発明は組換え体成ｐｉＧ−ＴｓＦおよび組換えＤＮＡ手法による成 ｖＡＧ−ＴｓＦの生産方法および対応するｃＤＮＡを提供する。 またさらに本発明は組換え体Ｇ−ＴｓＦ前駆物質および組換えＤＮＡ手法による Ｇ−ＴｓＦ前駆物質の生産方法および対応するｃＤＮＡを提供する。 また本発明は組換え体　Ｇ　Ｔ　ｓ　Ｆ　ｉｉＪ駆物質部分および組換えＤＮＡ 手法による組換え体Ｇ−ＴｓＦ前駆物質部分の生産方法およびそれに対応するｃ ＤＮＡを提供する。 組換え体成熟Ｇ−ＴｓＦｔたはＧ−ＴｓＦＷ駆物質はヒトまたはヒト以外の、例 えば哺乳動物形態でありてもよい、好ましいのはヒトの形態のものである。 このようにして本発明は、治療適用、およびさらに多面的なその生物活性を研究 し、それらの配列に関する知識に基づき誘導体の生産を可能とするのに十分量の 成熟Ｇ−Ｔ＠Ｆ、Ｇ−ＴｓＦ前駆物質およびＧ−ＴｓＦ前駆物質部分の生産を初 めて可能とした。 ｃＤＮＡおよびＧ−ＴｓＦに対するアミノ酸配列の好ましい態様を第２ｄ図に示 す、全配列はＧ−ＴｓＦ前駆物質を示したものである。矢印は成熟Ｇ−ＴｓＦ配 列からＧ−ＴｓＦ前駆物質部分を分離したものである。また成熟Ｇ−ＴｓＦの配 列は第２ａ図にも示した。 このように、本明細書で用いる「前駆物質」と「前駆物質部分」との表現は興な った意味を有し、「前駆物質」は成熟ペプチドを含む全ペプチドを包含し、これ に対して「前駆物質部分」とは全ペプチド配列から成熟ペプチド配列を差し引い た配列を意味する。 第２ａおよび２ｄ図のヌクレオチド配列の対立変異型（即ち、ある種の内部に起 こるアミノ酸配列を変化し、あるいは変化しなくてもよい天然に起こる塩基配列 の変化）および対応するペプチド配列および遺伝暗号の縮重から生じたヌクレオ チド配列の変化も、それらがＧ−ＴｓＦ活性を有するポリペプチドを暗号化して いる限り、本発明の用途に包含される。 タンパク質の活性またはその生産を高めるため、点突然変異または一層大きな修 飾によって第２ａおよび２ｂ図の配列に起こす変化は、形質発現に際し、配列が 暗号化している成熟タンパク質または前駆物質タンパク質の主な機能および構造 特性を変えてしまうべきではない。 したがって配列中のそのような変化は本発明に包含される。ＤＮＡ配列について 熟慮し設計されたそのようなヌクレオチド修飾は、この技術に熟練した専門家が 既知技術を用いてなし得ルコトである。そのような修飾としては、Ｇ−ＴｓＦの ペプチドまたはプレペプチド配列のアミノ酸配列中の欠失、挿入または置換が含 まれる０例えば暗号配列中の１またはそれ以上のシスティン残基を置き代えると 、対応するジスルフィド結合が脱離してしまう、また前駆物質配列中のトリペプ チド−アスパラギン結合グリコジル化認識部位の１またはそれ以上のアミノ酸を 置換、挿入または欠失することはその部位における非グリコジル化をもたらして しまう、そのような置換または欠失のための突然変異の手法は周知のことである 。 好適な宿主細胞の選択および形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび生産 物の生産および精製方法は当業界で周知のものである。 Ｇ−ＴｓＦの生産のための宿主細胞としては哺乳動物の細胞を使用できる。こと に好適な哺乳動物細胞系はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系である 。もう一つの好適な哺乳動物細胞系はサルＣＯ５−１細胞系またはＣＶ−１細胞 系である。 また酵母を使用してもよい、そのほか昆虫細胞も昆虫ベクター、例えばウィルス ベクターと組合わせて本発明方法の宿主細胞として使用してもよい、また組換え 体ワクチニアウィルスをさまざまな哺乳動物細胞５例えばヒトの細胞にＧ−Ｔｓ Ｆを生産するのに使用してもよい。 本発明のもう一つのａｍは、上述と同一のヌクレオチド配列または実質上同一の ヌクレオチド配列を含んだＧ−ＴｓＦの形質発現方法に使用するベクターを提供 する。またこのベクターはＧ−ＴｓＦ　ＤＮＡ配列を形質発現し得る好適なコン トロール配列を含んでいる。別法として、修飾した、もしくは天然の対立遺伝子 配列を挿入するベクターもまた本発明の実施態様である。このベクターは、選ば れた宿主細胞に、その複製および形質発現を指令し得る上記のＧ−ＴｓＦ　ＤＮ Ａ暗号配列を操作的に随伴し得る選ばれた調節配列を含むことができる０通常、 そのようなベクターの有用な調節配列は当業界で既知であり、選ばれた宿主細胞 に応じてこれを選べばよい。 組換え体Ｇ−ＴｓＦを生産する方法は、Ｇ−ＴｓＦを暗号化した遺伝子で形質転 換した宿主細胞から形質発現したＧ−ＴｓＦを回収することを含む。 特にこの方法は （ａ）Ｇ−ＴｓＦを暗号化した核酸を含んだベクターの組立て、（ｂ）該ベクタ ーによる異種宿主細胞の形質転換。 （ｃ）形質転換した宿主細胞の培養、 （ｄ）形質発現したＧ−ＴｓＦの培養からの回収からなる。 本発明は成熟Ｇ−ＴｓＦまたはＧ−ＴｓＦ前駆物質を暗号化した核酸を提供する 。これは上記のベクターを組立てるのに有用である。 またこの核酸またはそれとハイブリッド化が可能な核酸を標識化し、Ｇ−ＴｓＦ を暗号化しているＤＮＡまたはｍＲＮＡまたはその前駆物質またはそれに関連す るタンパク質の診断的検定に使用できる。 ここに開示したＧ−ＴｓＦＢ＆号化配列法化配列−ＴｓＦおよびその前駆物質を 暗号化した配列を知ることによって、組換え方法によるＧ−ＴｓＦ誘導体の生産 が実施可能となる。これらの誘導体は核酸中に成熟Ｇ−ＴｓＦを暗号化し、また はＧ−ＴｓＦＭ駆物質金物質化したサイレント変異体および形質発現変異体を含 む。 サイレント変異体には、いずれもが同一アミノ酸を暗号化している二つのコドン の一方の縮重コドンを他のコドンと置換し、ただしそれによって、例えばｍＲＮ Ａの２次楕遣の修飾により組換え培養物中のＧ−ＴｓＦ収量に有益な効果を発揮 し得る置換を含む、そのような歓迎すべき置換は、形質転換体からＧ−ＴｓＦ収 量をスクリ一二〉・グすることによって同定できる。 形質発現したＧ−ＴｓＦ変異体は欠失、置換または挿入の三つのいずれかの１ま たはそれ以上に該当する。欠失は、それに替わる残基の挿入なしにアミノ酸残基 を脱離することからなる。欠失−突然変異Ｇ−ＴｓＦ　ＤＮＡは断片調製の際に 、例えば免疫エピトープを欠失することが所望される場合に有用である。 ｆ換突然変異は−アミノ酸残基を他の残基と置き代える変異である。そのような 突然変異は組換え合成以外の方法によって実施することは極めて難しく、ことに −次アミノ酸配列の内部を標的とする置換の場合難しい、置換はＧ−ＴｓＦの生 物学的活性を修飾するのに有用である。 挿入突然変異体は、１またはそれ以上の残基をＧ−ＴｓＦ核酸内またはその末端 に配置した突然変異体である。融合の代表例は挿入が卜ＴｓＦのカルボキシルま たはアミノ末端残基の位置に起こった挿入突然変異種である。 ４、

【図面の簡単な説明】

第１図はｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用するオリゴヌクレオチド を示す、２つのプローブはアミノ酸配列に基づいて示した。２２の位置はのちに イソロイシンであることが判明した。 プローブＡは二つの重複したオリゴヌクレオチドからなり、それらはその３−末 端に１２個の相補的ヌクレオチドを有する３９量体と４２量体である。アニール し、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片を充填することによって、暗号鎖また は非暗号鎖に対応する２個の６９量体が得られた。決定したｃＤＮＡに対応して 予測したヌクレオチド配列の位置を星印で示す、プローブＢは１６個の２９量体 の混合物であった。図示したよう（ど塩基を決定できない位置にデオキシイノシ ンまたはデオキシシチジンおよびデオキシチミジン残基が挿入された。 第２ａ図は成熟しトＧ−ＴｓＦの完全なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す 、ＴＧＦ−β１とのアミノ酸相似部分は下線で示した。矢印は１０テア一ゼ切断 部位および成熟蛋白質の開始位置を示す。 第２ｂＳは成熟Ｇ−ＴｓＦ領域内のｃＤＮＡ配列に到達するのに用いた配列決定 ストラテジーを図示したものである。ＰＢＳにおけるラムダー５ＵＰ２５のＥｃ ｏＲＩ挿入体をサブクローンした後、１０−ブＢ（第１図４＃照）をプライマー として使用するサンガー・ジデオキシチェインターミネータ−法によって配列の Ｍ１３部分を確定した。さらに得られた配列部分に対応する２個のオリゴヌクレ オチドを合成し、図示した主Ｇ−ＴｓＦペプチドを暗号化した配列を得るのに使 用した。 第２ｃ図はＧ−ＴｓＦｃＤＮＡの略図およびその部分制限エンドヌクレアーゼ地 図である。暗号配列は四角で囲み、成熟ペプチドは３−末端に斜線部分として示 した。配列決定したラムダ５ＵＰ２５、ラムダ５ＵＰ４０、ラムダ５ＵＰ４２挿 入体を略図上に並べて示す。 第２ｄ図はヒトＧ−ＴｓＦ前駆物質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す、 他の独立した２個のクローン（１−１６９５の位置）によって確認されたラムダ ５ＵＰ２５領域のヌクレオチド配列を示す、恐ら（Ｇ−ＴｓＦ前駆物質部分の導 入部分を精成すると思われる１５個のアミノ酸からなる疎水性範囲およびカルボ キシ末端の成熟Ｇ−ＴｓＦペプチドを太い下線で示す、Ｇ−ＴｓＦペプチドの一 方の末端の位置に推定される１０テア一ゼ切断部位を矢印で示す、切断部位に先 行する塩基性アミノ酸の範囲を点線で示す、前駆物質配列内の可能性あるグリコ ジル化部位を細い下線で示す。 第２ｅ図はインテリジェネティックスの標準的な「アライン」プログラムにした がって分析したＧ−ＴｓＦおよびＴＧＦ−β１前駆物質のアミノ酸配列の比較で ある。２つのタンパク質問の配列相似性を最大にするためにギャップを挿入する 。同一アミノ酸を星印で示す、１１２個のアミノｌ！２鎖長の成熟ペプチド形態 を四角い囲いで示す。 第３ａ図はＣＨＯ−およびＣＯ３−細胞のための完全な鎖長の５ＵＰ２５ｃＤＮ Ａを含んだＰ９１０２３（ｂ）−３ＵＰ２−５−１と名付けた形質発現ベクター を示す、ＡｄＭＬＰ−アデノウィルス主後期プロモーター、Ｄ　ＨＰ　Ｒ−ジヒ ドロ葉酸還元酵素ｃＤＮＡ。 第３ｂ図はＣＨＯ−およびＣＯ３−細胞に５ＵＰ４０ｃＤＮＡで発現するｐＸＭ Ｔ３．ｎｅｏ７／５ＵＰ４０−１と名付けた形質発現プラスミドを図示する。Ａ ｄＭＬＰ−アデノウィルス主後期プロモーター、ＴＫＰ−ヘルペスシンルックス ウィルスのチミジンキナーゼプロモーター、Ｄ）（ＦＲ−ジヒドロ葉酸還元酵素 ｃＤＮＡ。 第４図はＰｒｏ−ＲＰＣ（商標）で神経膠芽腫上清１１からトリフルオロ酢酸ｌ イソプロパツールを用いて得た３０８神経膠芽腫細胞からのＧ−ＴｓＦを精製す る最終精製段階を示す。Ｐｒｏ−ＰＲＣ（商標）で実施した逆層ＦＰＬＣの各分 画についてＣｏｎＡ誘発胸ｌｌｌ細胞の増殖抑制を最終希釈濃度１　：　５００ ０で試験した。さらに各分画の１．００μｌアリコートをマンニット１ｍｇの存 在で凍結乾燥し、減圧条件下に１０〜１５％ポリアクリルアミドゲル上で５ＤＳ −ＰＡＧＥおよび銀染色により分析した。バンド２９．３０および３１はＧ−Ｔ ｓＦ活性を有する３つの分画に存在するタンパク質を示す０分子量マーカータン パク質（ＢＲ）の移動を示す。 第５図は二つの検定法による純粋なヒトＧ−ＴｓＦの活性を示す。 Ａ、ＣｏｎＡ誘発による胸腺細胞増殖に対するＧ−ＴｓＦ（・）およびＴＧＦ− β１（ム）の用量に依存した抑制効果、最終Ｐｒｏ−ＲＰＣ（商標）カラムから Ｇ−ＴｓＦ溶出に使用した溶媒（０，１％トリフルオロ酢酸の２−プロパツール 溶液（２５％ｖ／ｖ　））をＧ−ＴｓＦの対照に使用した。 Ｂ、Ｇ−ＴｓＦおよびＴＧＦ−β１によるＩＬ−２−依存Ｔ細胞増殖の抑制、オ ボアルブミン特異性Ｔヘルパー細胞を、Ｇ−ＴｓＦ（１，６ＸＩＯ−”Ｍ濃度） （・）またはＴＧＦ−β１（１０−１０Ｍ濃度）（ム）と−緒に種々の濃度の組 換え体ＩＬ−２の存在で培養した。対照は溶ｊＸ（上記）またはＧ−ＴｓＦを希 釈した培地（０／Δ）からなる。 第６図はＰｒｏ−ＲＰＣ（商標）を用い、トリフルオロ酢Ｍ／イソプロパツール で実施した神経膠芽腫上清１０１からのＧ−ＴｓＦの最終精製を示す、Ｐｒｏ− ＲＰＣ（商標）で実施した逆層ＦＰＬＣからの各分画を胸腺細胞増殖検定で試験 した。挿入図は第４図に記載した分画２８〜３４からの１００μｌアリコートの ５ＤＳ−ＰＡＧＥを示す。 第７ａ図はラムダプロモーターに基づきエシエ盲ルア・コリにＧ−ＴｓＦを形質 発現するＰＰＬ　５ｌ−ＳＵＰ２５−１と名付けたプラスミドの地図である。Ｐ Ｌ＝ラムダプロモーター。 第７ｂ図は形質発現プラスミドＰＰＬ　５ｌ−ＳＵＰ２５−１の組立てを示す、 Ｇ−ＴｓＦ　ｃＤＮＡの部分Ｈａｅｌ−Ｘｂａｌ断片はラムダＳυＰ２５　ｃＤ ＮＡの２１４１位のＨａｅ１部位を、まずＸｂａｌリンカ−でＸｂａ１部位へ変 換することにより誘導した。ついでＨａｅ璽およびＸｂａｌでｅＤＮＡの部分切 断を実施した。 第８図はエシェリヒア・コリからの組換え体Ｇ−ＴｓＦの形質発現および精製を 示す。 Ａ、ラムダプロモーターＰＬを４２℃で誘導後、回収した全エシエ１Ｊｔ７・コ リタンパク質の免疫プロット、バンドＯ〜６は種々のインキュベート時間のもの を示す。 Ｂ、Ｐｒｏ−ＲＰＣ（商標）を使用した逆層ＦＰＬＣによる３０および３１分画 の５ＤＳ−ＰＡＧＥ、本質的に純粋なＧ−ＴｓＦがＰｒｏ−ＲＰＣ（商標）から 回収されたことを示している。 第９図はイー・コリからの組換え体Ｇ−ＴｓＦによる胸ＩＩ！細胞増殖抑制を示 す。 第１０図はＣＨＯ細胞から得られた細胞上清の免疫プロットにおける組換え体Ｇ −ＴｓＦの形質発現を示したものである。 バンド１はｃＤＮＡを欠くベクター（ｐＸＭＴ３．ｎｅｏ？）でトランスフェク トした対照ＣＨＯ細胞の上清。 バンド２はＧ−ＴｓＦ　ｃＤＮＡを含むベクター（ｐＸＭＴ３．ｎｅｏ７／５Ｕ Ｐ４０−１）でトランスフェクトし、１ｎＭメソトレキセートで選んだＣＨＯ細 胞からの上清。 バンド３はバンド２と同様であるが、１０ｎＭメソトレキセートで選んだ上清。 第１１図はＣＨＯ細胞からの組換え体Ｇ−ＴｓＦの胸腺細胞増殖抑制を示す、希 釈は胸腺細胞検定におけるＣＨＯ上清の最終希釈度。 口＝酸活性化をせずにＰＸＭＴ３．ｎｅｏ７でトランスフェクトした対照ＣＨＯ 細胞からの上清。 Ｏ＝口と同様であるが、１Ｍ酢酸で一夜室温で活性化したもの。 ■＝　ｐＸＭＴ３．ｎｅｏ７／５ＵＰ４０−１でトランスフェクトし、酸活性化 をせずに１０ｎＭメソトレキセートで選んだＣＨＯ細胞からの上清。 ・；■と同様であるが、Ｏの場合と同様に酸活性化を行ったもの。 酸活性化したＣＨＯ！ｉ胞によりある種の内因性の抑制が見られるが、これはＣ ＨＯ細胞によって産生されたＧ−ＴｓＦまたはＴＧＦ−β１のような何か他の因 子によって起こるものであろう、しかし組換え体物質の生産物は少なくとも二桁 の強度で抑制活性の増加を生じる。 ４１発明の詳細な説明 ４．１６第一の態様としてＧ−ＴｓＦを精製して均質とし、成熟ヒトタンパク質 の最初の２０個のアミノ酸配列を決定した。 Ｇ−ＴｓＦは神経膠芽ｌｌ細胞由来の上清を濃縮およびダイアフィルトレージョ ンした後、これをヒドロキシルアパタイトおよびＰｒｏ−ＲＰＣ（商標）による クロマトグラフィー、Ｍｏｎｏ−Ｓ（商標）による陽イオン交換クロマトグラフ ィーおよびＰｒｏ−ＲＰＣ（商標）による最後の逆層ＦＰＬＣからなる方法で精 製した。精製工程の決定的段階はＭｏｎｏ−３（商標）による陽イオン交換クロ マトグラフィーであって、１６倍の精製度が得られ、５ＤＳ−ＰＡＧＥによる１ ２．５ｋｄタンパク質バンドに生物学的活性相関を認めた。５ＤＳ−ＰＡＧＥお よび銀染色した後、単一の１２．５　ｋ　ｄバンドに３つの分画を検出したので 、最終逆層クロマトグラフィ一段階によりこの点を確認した（第４ＵＡｅ照）、 これらのバンド強度は胸腺細胞検定におけるＧ−ＴｓＦ活性と相関した。そのう え１２．５ｋｄバンドについて計算した５Ｘ１０’単位／ｍｇの比活性は他のサ イトカイン類に匹敵する。 この物質から成熟Ｇ−ＴｓＦの最初の２０個のアミン末端アミノ酸をピーク分画 の気層配列決定により得た（第２ａ図参照）。 第２ｅ図に示したようにヒトＧ−ＴｓＦおよびブタ血小板由来のＴＧＦ−β１　 （Ｒ＆Ｄシステムズ）の双方ともコンカナバリンＡで誘発した胸腺細胞増殖反応 を抑制する。胸腺細胞活性化の半最大抑制に要する濃度はＴＧＦ−β１で１０− ”Ｍであった。ＴＧＦ−β１の代わりに、精製したＧ−ＴｓＦを使用することに よってほぼ同等の投与−反応曲線が観察され、その半最大抑制は８Ｘ１０−”　 Ｍで起こった０元来、３０８神経膠芽■細胞の粗製上清はＩＬ−２効果で妨害す ることによるＴ細胞活性化を抑制することが分かったので精製したＧ−ＴｓＦお よびＴＧＦ−β１はＣ５７Ｂ　Ｌ／６マウスから株化したオボアルブミン特異性 Ｔヘルパー細胞系（ＯＶＡ−７７）で分析した。各試験濃度（Ｇ−ＴｓＦ　：　 １．６Ｘ１０−”　Ｍ、ＴＧＦ−β１：１０−＠Ｍ）７両因子ともＯＶ　Ａ−７ ７細胞のＩＬ−２依存性増殖をほぼ完全に抑制した（第５図、Ｂ部参照）、その 抑制の程度はＩＬ−２の１〜２５６単位／ｍｌの範囲で濃度に無関係であった。 その生物学的活性形でヒトＧ−ＴｓＦはジスルフイツド結合を介する分子鎖間架 橋結合で連結された２個の同一サブユニットからなる二量体である。二量化はタ ンパク質加水分解プロセスによって生じるのかも知れない、ＴＧＦ−β１とのへ テロニ量体も生物学的活性を示す。 したがって生物学的活性を有するＧ−ＴｓＦは、コンカナバリンＡ誘発による胸 腺細胞増殖およびＩ　Ｌ−２誘導によるＴ細胞クローン成長を抑制し得るＧ−Ｔ ｓＦと定義する。これらの検定は、以下に示す実施例および各種文献に記載する 。このことはまたｒＧ−ＴｓＦ様活性」という表現の意味をも規定する。 「成熟Ｇ−ＴＳＦＪの話は、それ以上の条件を付けずに使用する場合、第２ｄ図 の矢印以下に示したアミノ酸配列と７１％以上のアミノ酸配列相似性（例えば９ ０％以上）を有するタンパク質を意味する。ｒＧ−ＴｓＦ前駆物質」の話は、そ れ以上の条件を付けずに使用する場合、第２ｄ図に示した全アミノ酸配列と３０ ％以上（例えば６０％以上）のアミノ酸配列相似性を有するタンパク質を意味す る。 したがって本発明の一態様では、実質上純粋なヒトＧ−ＴｓＦ、および陽イオン 換クロマトグラフィーＦｕｌｌＪ、好ましくはＭｏｎ。 −Ｓ（商標）による陽イオン交換クロマトグラフィ一段階を含む実質上純粋なヒ トＧ−ＴｓＦの生産方法を提供する。特にこの方法は（ａ）神経膠芽［１１胞の ようなＧ−ＴｓＦの天然供給源に由来する細胞からの上滑の濃縮およびダイアフ ィルトレージョン、（ｂ）ヒドロキシルアパタイトを用いるクロマトグラフィー 、（ｃ）トリフルオロ酢酸／アセトニトリル（２×）を溶出液として使用するＰ ｒｏ−ＲＰＣ（商標）による逆層クロマトグラフィー、（ｄ）好ましくはＭｏｎ ｏ−３（商標）による陽イオン交換クロマ１−グラフィー、および （ｅ）トリフルオロ酢酸／２−７０パノールを溶出液として使用するＰｒｏ−Ｒ ＰＣ（商標）による逆層クロマトグラフィーからなる。 さらに神経膠芽腫上清１０リツトルからＧ−ＴｓＦの精製によって、Ｐｒｏ−Ｒ ＰＣ（商標）による最後の逆層ＦＰＬＣ中、１２．５ｋｂｌｌＪ質の幅広い二重 ピークが得られ、このことは僅かに分離した二つのペプチドの重なり合った２つ のピークの存在を示している。 二重ピークのある全領域から得た物質は、胸腺細胞増殖検定で類似した生物活性 を示した（第６図参照）、シたがって第１および第２ピークの物質を気層配列決 定に掛けた。第１ピークからの物質（フラクション３０）からは第２ａ図に示し たものと同一のアミノ末端配列が得られた。しかし第２ピークから回収した物質 （フラクション３２）からは下記のアミン末端配列が得られた。 この部分配列は、１６位のＣｙｓの代わりにＩＩｅ、２５位のＬｙｓの代わりに Ｖａｌを有する点で対応する第２ａ図の配列と異なっている（フラクション３０ から回収した物質の２３位のＡｓｐに対応するアミノ酸は確実性をもって決定す ることができなかった）。 この新たな配列はよくヒトＧ−ＴｓＦの変異体のＮ−末端部分の配列に相当して いる０本発明はこの変異体および、さらにそｈ以外の変異体をも包含する。 ４．２．ついで第２の態様として、上記の配列情報を組換え体ＤＮＡ手法による Ｇ−ＴｓＦの生産に使用した。 ４．２．１．この生産はＴ、マニアティスらの記載による一般周知方法にしたが って実施した（Ｔ、マニアティスら、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラ トリ−・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニュー ヨーク（１９８２年］）。 しかしながらＴＧＦ−β１と同様、Ｇ−ＴｓＦ組換え体は、その活性を保持した まま合成するのが困難であるとされている。第２ａ図から分かるように成熟アミ ノ酸配列は非常に多数のシスティン残基を含んでおり、少なくともそれらのある ものは明らかに天然供給源から回収されたホモニＩ体Ｇ−ＴｓＦを形成する分子 鋼量架橋結合を含んでいる。しかもＧ−ＴｓＦは、その後のＧ−ＴｓＦの運命、 即ち小胞体膜を通過し、分子間または分子内ジスルフィッド結合の生成を含む前 駆物質ポリペプチドを適切に折りたたみ、これを分泌する小胞に貯蔵し、生物活 性ペプチドとして分泌するためのタンパク質分解切断を調節するＧ−ＴｓＦの運 命を指令することに恐らく関与していると考えられる巨大アミノ末端領域を有す る前駆物質分子として形質発現される。しかし真核細胞を形質転換して異種Ｇ− ＴｓＦを発現することは、組換え体培養中で一次翻訳生産物を適切に加工するこ とが困難であったなけれども可能であった。またエシェ９Ｌ７−コリ中における 成熟Ｇ−ＴｓｔＦペプチドの生産も達成された。 本発明は組換え体成熟Ｇ−ＴｓＦおよびその前駆物質部分、それらの組換え体合 成および前駆物質を経由する生物活性Ｇ−ＴｓＦの産生、ことに前駆物質Ｇ−Ｔ ｓＦ、成ｖ！、Ｇ−ＴＳＦおよびＧ−ＴｓＦ前駆物質部分を含む第２ｄ図の配列 を有する生物活性Ｇ−ＴｓＦ、およびそのポリペプチド断片、その挿入、置換お よび／または欠失突然変異体を包含する０例えばＧ−ＴｓＦ前駆物質または折り たたみ、およびタンパク質加水分解加工に不可欠なＧ−ＴｓＦ前駆物質部分をあ らかじめ合成し、これを経由して生物活性を有する二量体Ｇ−ＴｓＦを生産する ことを包含する。 第１図に示したオリゴヌクレオチドプローブをＧ−ＴｓＦ部分部分タンパク列配 列推定し、ヒト神経膠芽腫細胞系３０８由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリー ニングするのに使用した。ラムダｇｔ１０に株化したこのライブラリーは、１６ ００ｂｐより大きい挿入体をあらかじめサイズ選別した０合計１０００００個の 組換え体ファージをスクリーニングすることによって、双方のプローブにあるシ グナルを与える単一のクローンを検出した。プローブＢを配列決定プライマーと して使用することにより、これがＴＧＦ−β１と相同な配列を含んでいることが 判明した。その後、ラムダＳυＰ２５と呼ばれるこのクローンを使用して、さら に追加的にＧ−ＴｓＦに対するｃＤＮＡクローン類（ラムダ５ＵＰ４０およびラ ムダ５ＵＰ４２）を単離した。 成熟ペプチドを暗号化した領域のヌクレオチド配列確定に用いた配列決定ストラ テジイーを第２ｂ図に示す。 Ｇ−ＴｓＦ　ｃＤＮＡの部分制限酵素地図を第２Ｃ図に示す、ラムダ５ＵＰ２５ クローンの１位から１６９５位までに挿入された挿入体およびそれから推定され る前駆タンパク質配列を含んだアミノ酸配列の双方の鎖を配列決定することによ って決定したヌクレオチド配列を第２ｄ図に示す、特異的な内部オリゴヌクレオ チドプライマーによって、３００個のヌクレオチドの両末端および成熟Ｇ−Ｔｓ Ｆペプチドを暗号化した全領域についてラムダ５ＵＰ４０およびラムダ５ＵＰ４ ２クローンの挿入体の配列決定を実施した。これらのｃＤＮＡは数個のヌクレオ チド内のラムダ５ＵＰ２５の５°−末端から出発してそれぞれ１５３４および１ ６９５の位置で終わる。そのほかそれらの配列はラムダ５ＵＰ２５挿入体の配列 と同一であることが判明したが、ただしこちらの３゛−末端の方が一層長い。 Ｇ−ＴｓＦ　ｃＤＮＡの５°−の翻訳されない領域はＡＴが豊富であり（ＡＴＴ １％）、ＡＴＧ翻訳開始コドンは１８２−１８４の位置にある。このコドンは、 ３０３〜３２３のアミノ酸位置にＧ−ＴｓＦペプチドのアミノ末端配列を含んだ 長いタンパク質−４１４アミノ酸−を暗号化したオープンリーディングフレーム の最初のＡＴＧであるから、このコドンは最も翻訳開始に使用されるものであり そうである。またそれは同じリーディングフレーム内の直ぐ前に先行する数個の 停止コドンを有し、また予測されたタンパク質の最初の２０個のアミノ酸はシグ ナルペプチドの強い疎水性特性を示す、予測されたＴＧＦ−β１前駆物質と有意 な相同性を示す最初のクラスターは２１〜２４のアミノ酸がら起こる。その他の ｍＲＮＡの翻訳開始部位付近に見られる共通配列に対する相同性は、３−位のプ リンを除いて認められないことが判明した。しがし２６２．２７８および５０３ 位のＡＴＧコドンはそのあとに疎水性アミノ酸の有意な流れを暗号化した配列が 続かない。 前駆物質の翻訳後切断によって成熟Ｇ−ＴｓＦが生じる。前駆物質部分がどうな るかは分がっていないが、他の生物学的活性を有するペプチドを生じるがもしれ ない、Ｇ−ＴｓＦ前駆物質はさらに翻訳後切断を受け、離断されたポリペプチド 部分を生じることができる数対の塩基性残基対を含んでいる。 ４．２．２．ｃＤＮＡライブラリーの組立て尿素−ＬｉＣ１法を用いてＲＮＡを 単離し、ポリアテデニル化したＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラ フィーで選別した。ついで最初のｃＤＮＡ鎖を逆転写酵素で合成し、ＲＮＡ／Ｄ ＮＡハイブリッドを２本ｊｉ［ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａに変換した。このｃＤＮＡを５１ ヌクレアーゼおよびＴ４　ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化して、ＥｃｏＲＩメ チラーゼでメチル化し、リン酸化したＥｃｏＲＩリンカ−でライゲーシミンし、 その生産物をＥｃｏＲＩの過剰量で消化した。ＣＤＮＡをサイズ選別し、１６０ ０ｂＰ以上の断片をフェノール抽出およびエタノール沈殿により回収した。ラム ダｇｔｌＯアームをライゲーシッンした後、組換え体ＤＮＡをインビトロパッケ ージ抽出物とインキュベートし、ＢＢＬ寒天平板上に接種することによりニジエ リＥＴ・コリＣ６００ｈｆｌを感染させ、寒天層設上部から溶出することにより 、ライブラリーを作成した。 ４．２．３．ライブラリーのスクリーニング約１０００００個の組換え体ファー ジをエシエ１７１．７．コリｃ６００に培養し、プラークをナイロンフィルター 上に複製した。ついでＧ−ＴＳＦのアミノ末端配列と推定されるアミノ酸から誘 導した２個の１０−ブ（第１図）を使用してフィルターを処理し　スクリーニン グした。オリゴヌクレオチド１０−ブはＤＮＡシンセサイザーで合成した。一つ は１０個のアミノ酸に対応する１６個の２９量体の混合物（長い部分）であった 、これをＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼおよび［ガンマ−”＊ｐ）Ａ’ｒｐで 標識化した。第２のプローブは３′−末端に１２個の相補的塩基を有する３９量 体および４２量体（第１図）からなり、したがって［α−３”Ｐ］ｄＧＴＰおよ びＤＮＡポリメラーゼ！クレノウ断片を使用してアニールすることにより充填す ることができた。フィルターを４〜６時間プレハイブリッド化し、ついでプロー ブとともに１６時間４２℃でハイブリッド化した。フィルターを４２℃で５ｘＮ ＥＴ、０．２％ＳＤＳで洗浄し、ついで徐々に温度を５５℃に再上昇した０両方 のプローブでシグナルが得られたプラーク領域を再び平板培養し、４７℃で再ス クリーニングした０両方のプローブで再現性のあるシグナルが得られる単一のプ ラークが見出され、これから回収したｃＤＮＡを、以後ライブラリーの再スクリ ーニングに使用した。 、１．２．４．サブクローニングおよび配列決定陽性を示したクローン類からｍ ａｉｍ製法によりラムダＤＮＡを抽出した。ＥｃｏＦｉｌｔＪ］断後、ｃＤＮＡ 挿入体を回収し、これをｐＢＳ、Ｍ　ｌ　３配列決定ベクター（ス１〜ラタジー ン）にサブクローンした。サンガー・ジデオキシチェインターミネータ−法を用 いてＤＮＡ配列決定を実施した０両方向に重複している一組の配列を得るため、 挿入体をまずＨｉｎｄｕで消化した。ついでエキソヌクレアーゼおよびミドリ豆 ヌクレアーゼ消化か、または部分配列データに現れた制限部位切断のいずれかに より１ｌｉｎｄｌ断片からサブクローン体を得た０合成オリゴヌクレオチドブラ イマーを用いて成熟Ｇ−ＴＳＦペプチド領域で追加的な配列情報を得た。フレノ ウＤＮＡポリメラーゼ断片で全領域を両方向に配列決定した後、逆転写酵素を鎖 長伸長反応に使用して残された不明瞭な領域を解明した。 配列決定の結果（第２ｄｌｌ）、Ｇ−ＴＳＦはタンパク質加水分解切断によって 成熟タンパク質を遊離しなければならない前駆物質タンパク質として翻訳されて いることが判明した。この活性タンパク質は２個の成熟ペプチド部分の二量体で ある。成熟Ｇ−ＴＳＦペプチドのアミノ酸配列は前駆物質の３０３位のアミノ酸 から始まる。Ｇ−ＴＳＦ前駆物質は３個の強力なＮ−グリコジル化部位を含んで いる。 第２ｄ図の成熟Ｇ−ＴＳＦについて計算した分子量は１２３２０ダルトンである 。前駆物質部分および成熟部分の両方を含んだ全体の分子は４５５４０ダルトン の計算分子量を有する（考えられるグリコジル化を無視して）。 成熟Ｇ−ＴＳＦはＯ−グリコジル化されてもよく、またＧ−ＴＳＦ前駆物質は０ −および／またはＮ−グリコジル化されてもよい、そのようなグリコジル形もま た本発明の一部である。 また対立遺伝子および／または変異体形態も本発明の一部である。 本発明の優先権期間中、公開された関連因子の配列、即ちブタのＴＧＦ−β２の 最初の２９個のＮ−末端アミノ酸（Ｓ、カイフェッッら、セル、４８巻［１９８ ７年２月１３日１，４０９〜４１５頁）またはヒトＴＧＦ−β２の最初の５１個 のＮ−末端アミノ酸（Ｔ、イケダら、バイオケミストリー、２６巻［１９８７年 ５月５日］、２４０６〜２４１０頁）、またはウシＣＩ　Ｆ−Ｈの最初の３０個 のＮ−末端アミノｆｌ（Ｓ、Ｍ、サイアディン、ジャーナル・オン・バイオロジ カル・ケミストリー、２６２巻［１９８７年２月１５日］、１９４６〜１９４９ 頁）と成熟Ｇ−ＴＳＦの配列を比較すると完全な同一性を示す、したがってＧ− ＴＳＦは上記各因子のヒト類縁体であり、そのかなりの構造相似性から、ＴＧＦ −β１の場合にも観察された極めて強力な種間配列保存性が確認される。 第１項で既に述べたように、成熟しトＴＧＦ−β２の完全なアミノ酸配列が本発 明の優先権期間中に独立して発表された（Ｈ，マークアットら、ジャーナル・オ ン・バイオロジカル・ケミストリー。 ２６２巻［１９８７年９月５０］、１２１２７〜１２１３１頁）。 その配列は成熟Ｇ−ＴＳＦに対するアミノ酸配列（第２ｄ図）と同一である。 さらにＧ−ＴＳＦはＴＧＦ−β１と７１％のアミノ酸配列相似性を示す、相似性 は３２９から３４６までのアミノ酸および１４個のＣ−末端アミノ酸で極めて高 い（第２Ｃ図）、またこの相似性は一層離れた関係にある二つのペプチド、イン ヒビンおよびミュラー抑制物質でも見られ、対応する領域はこれらのペプチドで 最も保存性の高い分子部分である。構造相似性はＧ−ＴＳＦの９個のすべてのシ スティン残基の保存によってさらに強められる。Ｇ−ＴＳＦ前駆物質のＴＧＦ− β１前駆物質とのアミノ酸配列相似性は３０％である。 またＴＧＦ−β１およびＧ−ＴＳＦ両前駆物質部分にもある種の構造パターンが 保存されている。成熟ペプチドは明らかにＬｙｓ−Ａｒｇ残基におけるタンパク 質加水分解切断によって遊離される。Ｇ−ＴＳＦおよびＴＧＦ−β１両前駆物質 間の構造相同性は、成熟タンパク質同志問よりはるかに顕著ではないが、前駆物 質部分に散在している一定の配列相同クラスターが存在する。この事実は長い進 化の分岐、恐らくは因子産生における異なった調節、および恐らく修飾された生 物学的な役割を示している。保存されている配列クラスタ−は、分子の輸送およ び加工、およびＧ−ＴＳＦペプチドの遊離を制御することに関与する前駆物質分 子の機能的ドメインを構成しているのかもしれない。 神経膠芽腫細胞から得られた第２ｄ図の天然型即ち野生型成熟Ｇ−ＴＳＦに対す る分子量等のような形質は、Ｇ−ＴＳＦ天然天然間してのみ記載したものである ０本明細書で予期する突然変異体は天然Ｇ−ＴＳＦの形質とかなり相違してもよ く、事実、このことは突然変異の目的でもある０本明細書で規定したＧ−ＴＳＦ は天然のＧ−ＴＳＦを含むが、そのほか関連する生物学的活性ポリペプチドもこ の定義に包含される。挿入変異体、欠失変異体または溶融タンパク質のようなＧ −ＴＳＦ種では、突然変異体が天然Ｇ−ＴＳＦで確立した分子量の範囲を超えて しまう０例えば成熟Ｇ−ＴＳＦまたはＧ−ＴＳＦ前駆物質との溶融タンパク質は 天然の成熟Ｇ−ＴＳＦまたはＧ−ＴＳＦ前駆物質より大きい分子量を有するはず であり、一方成熟Ｇ−ＴＳＦまたはＧ’−ＴＳＦ前駆物質の欠失変異体はそれよ り低い分子量を有するはずである。同様にＧ−ＴＳＦまたはＧ−ＴＳＦ前駆物質 にグリコジル化部位を導入するため、または生物学的活性に対し臨界的でない部 位でセリンをシスティ°ンに置換するため、これらを操作することもできる。ま たヒトの前駆体Ｇ−ＴＳＦの翻訳後形質転換処理によって、例えば霊長類でない 哺乳動物由来の細胞系で、アラニンがもはやアミノ末端アミノ酸でなくなるよう に成熟Ｇ−ＴＳＦのアミノ末端領域に微量異質性を生じることができる。 また前駆物質は成熟Ｇ−ＴＳＦが、そのカルボキシル末端にペプチド結合によっ て不溶性またはゼラチン様部分と結合する溶融タンパク質であってもよい、この ペプチド結合領域に、またはその領域の範囲内で、配列はタンパク質加水分解を 受けることによってＧ−ＴＳＦを遊離し、あるいは生体内でそのままＧ−ＴＳＦ を生じ、または生体外で生産１０トコールの一部として選ばれる。 通常、組換え体Ｇ−ＴＳＦは哺乳動物の、好ましくはヒトの組換え体Ｇ−ＴＳＦ を意味する。ただしネズミ、ブタ、ウマまたはウシのような供給源でも、そのこ と以外、上記の標準的な生物学的活性に適応する限り組換え体Ｇ−ＴＳＦの定義 に包含される。Ｇ−ＴＳＦは種特異的ではない、したがっである種から由来した Ｇ−ＴＳＦを別の種の治療に使用することができる。 Ｇ−ＴＳＦを暗号化しているＤＮＡは、化学合成により、あるいは神経膠芽腫ま たはその他の細胞からのｍＲＮＡ逆転写物をスクリーニングすることにより、ま たは真核細胞からのゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって入手 できる。使用したコドンを宿主細胞が認識する限り、このＤＮＡは第２ｄ図に示 したコドンを使用する必要はなく、事実、採用した形質発現方式にしたがってコ ドン最適化をすることにより生産を改善に導くことができる。 ４．３．形質発現は、例えばノ゛エネンテクＥＰ　［２００３４１号］に記載の 周知方法を使用する好適な任意の原核細胞または真核細胞形質発現方式によって 得ることができる。 ４．３．１．好適な形質発現ベクターは、Ｇ−ＴＳＦを暗号化し、Ｇ−ＴＳＦを 宿主に形質発現し得る好適な調節配列を操作的に結合したＤＮＡ配列である。そ のような調節配列は転写プロモーター。 転写を調節し得る任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボンーム結合部位 を暗号化している配列および転写および翻訳の終結を調節する配列を含んでいる 。また真核細胞にＧ−ＴＳＦを形質発現するため、ベクターも選択遺伝子を暗号 化したＤＮＡを含むべきである０Ｍ択遺伝子は同時形質転換によって非結合性プ ラスミドにより供給することができる。 ベクターはプラスミド、ウィルス（ファージを含む）、および組み込み可能なり ＮＡ断片、即ち組換えによって宿主ゲノムへ組み込むことが可能な断片等からな る。 ＤＮＡ領域は、それらが相互に機能的に係わり合うとき作動可能に結合される０ 例えばポリペプチド分泌に関与する前駆体タンパク質として形質発現される前駆 配列または分泌リーダーに対するＤＮＡであるなら、ポリペプチドに対するＤＮ Ａへ作動可能に結合される。 配列の逆転写を調節する１０モーターなら、暗号配列へ作動可能に結合される。 翻訳し得るように配置されるリポソーム結合部位なら、暗号配列へ作動可能に結 合される。全般に作動可能な結合とは隣接を意味し、分泌リーダーの場合は隣接 して読み取り層の中にある。 好ましい宿主細胞は多細胞生物由来の細胞である。を椎動物由来の細胞培養であ っても、あるいはそれが無を椎動物由来の細胞培養であっても、原則的に任意の 高級真核細胞培養が操作可能である。 有用な宿主細胞系を例示すれば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系 またはＣＯ３−７細胞系が挙げられる。 Ｇ−ＴＳＦは、溶解し形質転換した細胞、および遠心によって分離した可溶性細 胞残滓から回収する。別法としてＧ−ＴＳＦを分泌した形質転換細胞からの培貢 上清を、単に遠心によって細胞から分離する。ついで当該技術一般周知の方法に より、Ｇ−ＴＳＦを例えば酸の存在下にゲルー過を使用し、ついでＨＰＬＣおよ びアセトニトリル濃度勾配による溶出によって精製する。 それに追加し、またはそれに置き代わる精製段階として、細胞溶解物または上清 に混在するＧ−ＴＳＦ以外のタンパク質をある時間加熱して変性し、これらが沈 殿するのに十分な温度で加熱する。ＴＧＦ−β１と同様に、恐らく膨大なジスル フィド結合形成の結果、Ｇ−ＴＳＦは極めて温度に安定なタンパク質である。し たがって、加熱はジチオトレイトールのような少址のジスルフィド試薬を含有す る培地中で実施すべきである。Ｇ−ＴＳＦは１Ｍ酢酸に安定であるから、加熱と 酸性化を組合わせてもよい。 成熟Ｇ−ＴＳＦはグリコジル化されない、したがってこれは、レンチルレクチン 結合セファロースのようなレクチンカラムで糖タンパク質を吸着させることによ り、残留する任意の熱安定性および酸安定性の糖タンパク質混在物から分離され る。 高純度の生産物を所望するのなら、粗製または部分精製した混合物をさらにその 後、クロマトグラフィーに掛ける。 同様の方法を前駆物質ペプチドの精製に使用してもよい。 ４．３．２．ＣＨＯ細胞における形質発現−！υ様として、ＣＨＯ細胞に二つの 変異体で形質発現を実施した。 ４．３．２．１．ｐ９］０２３（Ｂ）−ＳＵＰ２５−１を有する第１変異体 ５ＵＰ２５　ｃＤＮＡの全鎖長をＣＨＯ−およびＣＯ５−細胞形質発現ベクター ｐ９１０２３Ｂ　（Ｇ、Ｇ、ウォングら、サイエンス、２２８巻［１９８５年］ 、８１０〜８１５頁）にクローンし、制限酵素分析により正しい方向を有するク ローンを選別した（第３ａ図参照）、ついで電気泳動注入により、得られたプラ スミドＤＮＡをジヒドロ葉酸還元酵素欠損ＣＨＯ細胞系ＤＵＫＸ−Ｂにトランス フェクトした。ついでジヒドロ葉酸還元酵素を産生ずる細胞だけが生存し得る条 件付けをしたα（−）培地中で、ｐ９１０２３（Ｂ）−３ＵＰ２５−Ｉ　ＤＮＡ を挿入したすべてのクローンを選別した。ベクターｐ９１０２３（Ｂ）はジしド ロ葉６３１元酵素をトランスフェクトしたマウス細胞遺伝子を提供するから、ク ローンを選別することができる。さらにメントレキセートを使用し、１ｎＭから 出発して濃度を増大させる選別法により、トランスフェクトした遺伝子を増幅で きる。クローンは１０ｎＭメソトレキセート以上まで選別でき、実施例に記載の 免疫プロッティングおよび胸腺細胞増殖検定により生物活性を有する成熟Ｇ−Ｔ ＳＦを産生することを立証することができる。 ４．３．２．２．ＰＸＭＴ３．ｎｅｏ７／５ＵＰ４０−１を有する第２変異体 さらにもう一つの組立てとして、５ＵＰ４０　ｃＤＮＡの全鎖長（第２ｃ図参照 ）をＣｏ５−およびＣＨＯ−細胞形質発現ベクターｐＸＭＴ３．ｎｅｏ７へ挿入 した０本ベクターはｐＸＭ　（Ｙ、ヨング、セル、４７巻［１９８６年］、３〜 １０）の修飾体であって、異なった方法で組立てられたがｐ９１０２３（Ｂ）と してこれと同一の塩基要素を含んでいる。したがってｐＸＭは、ｐ９１０２３（ Ｂ）として原核細胞および真核細胞宿主に結合したＤＮＡを複製するのに必要な 要素、およびさらにプロモーターおよびその結合要素に近接した部位ヘクローン したｃＤＮＡの形質発現のため強いアデノウィルス主後期プロモーターを細胞に 提供する。ｐＸＭＴ３゜ｎｅｏ７は、多重クローニング部位およびトランスフェ クトした細胞を抗生物質Ｇ４１８で都合よく選別するための細菌性ｎｅｏ遺伝子 を挿入することによりｐＸＭから誘導した。 ｐＸＭＴ３．ｎｅｏ７に５ＵＰ４０−ｃＤＮＡの全鎖長を正転写方向に含有する 組立てをｐＸＭＴ３．ｎｅｏ７／５ＵＰ４０−１と命名しく第３ｂ図９照）、こ れをイー・コリＨＢＩＯＩヘトランスフエクトした組立てをＤＳＭ４２２６の受 付は番号のもとにドイツチェ・ザンムルンク・フィン・ミクロオルガニスメン（ ＤＳＭ）（グリゼバッハシュトラッセ、８．Ｄ−３４００、ゲッチンゲン、ドイ ツ連邦共和国）へ１９８７年８月２７日に寄託し、ジ・インターナショナル・レ コグニション・オプ・ザ・デポジット・オン・マイクロオルガニスムス・フォア ・ザ・バーバシズ・オン・パテント・プロシデュア・ブダペスト条約（１９７７ 年）のらとに１９８７年１１月６日に同一番号で変換寄託された。 この１ラスミドをジヒドロ葉酸　欠損ＣＨＯ細胞系ＤＵＫＸヘトランスフェクト し、このプラスミドを含有するクローンをまずＧ４１８０．５ｍｇ／ｍｌで選別 した。さらにα（−）培地を使用し、上記ならびに実施例記載のようにメントレ キセート濃度を増大して、増幅したジヒドロ葉Ｈ遍元酵素配列に対する選別を実 施した。ｌｏｎＭメソトレキセートで選別した細胞クローンは、細胞によって分 泌されたタンパク質の５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティングにより組換え 体成熟ヒトＧ−ＴＳＦを産生することを明らかに証明することができた（第１′ ｏ図）、またこの物質は、胸腺細胞増殖試験でヒト神経膠芽ＭａＩ胞から単離し た物質の活性に近い算定比活性で生物活性を示したく第１１図）、１０ｎＭメン トレキ七−トで選別したＣＨＯ／５ＵＰ４０−１／１０ＭＴＸと呼ばれるこの細 胞は、ブダペスト条約のもとにＥＣＡＣＣ８７１１１１Ｑ１の受付番号でジ・ヨ ーロピアン・コレクシシン・オプ・アニマル・セル・カルチャーズ、ポートン・ ダウン、サリスブリー、ウィルラシャ−，ＳＰ４、ＯＪＧ　（英国）へ１９８７ 年１１月１１日寄託された。 ４・３・　３．エシェリヒア・コリにおける形質発現ニジエリＬ７・）＋７にお ける形質発現に使用したプラスミドはラムダプロモーターから作成する。オリゴ ヌクレオチドを合成し、Ｇ−ＴＳＦ配列の５°−末端をこのベクターのＮｄｅ　 Ｘ部位と結合した。 エシェリヒア・コリＨＢＩＯＩヘトランスフエクトして得られたプラスミドをＰ ＰＬＳＩ−３ＵＰ２５−１と名付け（第７ａおよび７ｂ図、参照）、ドイツチェ ・ザンムルンク・フィン・ミクロオルガニスメン（ＤＳＭ）へｄＳＭ４２２５の 受付は番号のもとに１９８７年８月２７日寄託され、ブダペスト条約のちとに同 じ受付番号で１．９８７１１月６日変換寄託された。 この組立て体を、温度感受性ラムダレセプターを産生するコリＷ３１１０ラムダ Ｙ１３９株をトランスフェクトするのに使用した。形質発現生産物の性質を広範 囲に検討した。第８図に見られるようにエシエリヒＴ・コリからの組換え体Ｇ− ＴＳＦを均質となるまで精製し、５ＤＳ−ＰＡＧＥで単一のバンドを得た。その うえ物質中のタンパク質配列は正しいアミノ末端アミノ酸を示し、したがってＧ −ＴＳＦが原核細胞系へ効率的に形質発現したことが明白に証明された。 第９図は、エシエ１Ｊｔ７・コ１７からの組換え体物質の場合、低水準ながら若 干の生物学的活性が得られることを示している。変性した単量体Ｇ−ＴＳＦから 低い比活性はＧ−ＴＳＦの生物活性二量体の形が自然発生的に生成できないこと を示唆している。 エシエＩｉ７・コリに形質発現するには、成熟Ｇ−ＴＳＦ　ｃＤＮＡの前方にメ チオニン残基を挿入しなければならない、Ｍｅｔ−Ｇ−ＴＳＦもまた本発明の一 部である。メチオニン残基の挿入は周知の方法により実施する。 ４．３．４．その他の系における形質発現さらにその他の系における形質発現も 通常の手法を使用して当然可能であり、例えば上記のクローンから出発し、メソ トレキセート濃度を増大することによる選別を経由する遺伝子増幅手法を用いて 効果と収量を改善することが可能である。 産生されるタンパク質が可溶化しなければならない不溶性形態、または既知方法 により巻戻しを必要とする何らか他の形態となることがあり得ることを銘記すべ きである（例えばＴ、Ｅ、フライトン、プログレス・イン・バイオフィジックス ・アンド・モレキュラー・バイオロジー、３３巻、［１９７８年１．２３１〜２ ９７頁、９照）。 Ｇ−ＴＳＦは恐らく若干のその前駆物質部分および結合タンパク質を随伴した潜 伏タンパク質として分泌され、したがって十分な生物活性を得るため、非共有結 合の開裂のようなさらに若干の加工を必要とすることがある。この加工は、例え ば酢酸または重炭酸アンモニウムに対する透析によって例えば細胞を生産した上 清をあらがじめ酸性化する形をとってもよい、別法として、アルカリまたは乳化 剤もまた活性化剤として考應される。好ましいのは例えば酢酸で酸性化すること である。 ４．３．５．この態様はまだ完全には解明されていないが、前駆物質ペプチドは 生物学的活性物質の有効な形質発現を成功させるのに特に重要であるように思わ れる０分子の折りたたみ、ジスルフィド架橋の生成およびタンパク質加水分解に よる切断は有用もしくは必須でさえある。タンパク質加水分解によって成熟Ｇ− ＴＳＦを遊離した後も前駆物質部分のペプチドはなお重要な役割を演じ、例えば 恐らく細胞付着に関連したＧ−ＴＳＦの生物学的機能を強化するがまたはタンパ ク質加水分解による切１ｌＪｉｆ＆、先に言及したように（４゜３．４．）、前 駆物質部分ペプチドが恐らく前駆物質の切断に関与したタンパク質加水分解酵素 のようなさらにもう一つの成分と一緒に成熟Ｇ−ＴＳＦの２個のサブユニットの 二量体と非共有結合的な複合体を形成するのかもしれない、この流れに沿って考 察を進めれば。 無秩序な上皮細胞の増殖はオートクリンＧ−ＴＳＦの潜伏形を活性化し損じた結 果であるのかもしれない。 上記の不確実さがどうあろうと、生体内での活性化がＧ−ＴＳＦ作用の標的特異 性の決定的な調節段階であり、また前駆物質は明らかにこの活性化プロセスにお いて最重要なものであるから、本発明の重要性は成熟Ｇ−ＴＳＦに対する配列よ りも前駆物質部分ペプチドに対する配列の提供の方に存在しているとさえ言えよ う。 また全前駆物質タンパク質をそのままエシェ１ルア・コリで合成し、折りたたみ 、二重化し、そのあとのタンパク質加水分解による切断によって成熟へプチドを 回収することができた。切断してない天然形態または突然変異前駆物質形態のど ちらでも同様によいが、例えば対応するｃＤＮＡでＣＨＯｊｌｌｉ胞をトランス フェクトし、前駆物質を精製した後、切断することによってこれらの形態を細胞 がち得ることができる０例えばインターロイキン−２またはＧＭ−ＣＳＦ由来の 無関係な先行断片を前駆物質の内側位置に加えることによって前駆物質のハイブ リッド形態を形質発現することがきる。これらのハイブリッドタンパク質は一層 効率的に分泌され、細胞内で正しく切断され、または切断されないこともある。 また切断されない形態を細胞系から単離し、インビトロで切断してもよい、タン パク質加水分解による切断部位を突然変異させ、各種のタンパク質加水分解酵素 によって認識される配列を得ることができる。これらの修飾された切断部位を含 んだ切断されていない前駆物質を、もう一度単離して対応する酵素によって切断 してもよい。 以下に実施例を挙げて本発明を説明する。実施例は単に発明を説明するためのも のであって、発明の範囲を限定するものではない。 ５、実施例 ５．１．０−ＴｓＰの精製 ５．１．１．膠芽腫瘍細胞類５Ｎ３０８（エイ・フォンタナら著、ジャーナル・ オン・イムノロジー（Ｊ、ｌ５ｓｕｎｏ１．）’１３２巻、［１９８４年］、１ ８３７〜１８４４頁）を組織培養フラスコ内またはマルチトレイ（Ｎｕ　ｎ　ｃ 　）で生育させる。培地は、ｌｏ％胎児仔牛血清および３００マイクログラム／ ｍｌのＬ−グルタミンを加えたダルベツコの修飾イーグル培地である。全面生長 後、細胞をハングの溶液を用いて洗浄し、トリプシン／ベルセン（ジブコ社）を 用いて処理した後、８Ｘ１０＠個／１７５ｃｇ＋”フラスコまたは４ＸＩＯ”個 ／マルチトレイの濃度で接種する。全面生長が達成された後、細胞を３日間、１ マイクログラム／ｍｌのインドメタシンを含む非血清培地中でインキュベートす る。その後、上清を採取し、段階５．１．２．に記述したようにＧ−ＴｓＦの精 製のために使用する。別法として、全面生長後細胞を１８目に回収し、段階５． ２゜１、で記述したように■ＲＮＡ単離のために使用する。 ５．１．２．１リツトルの非血清上清（胸腺リンパ球分析で、全体で１．１ｘｌ Ｏ’単位）をベリコン（商標）カセットシステムおよびＰＴＧＣ（商標）膜（ミ リバー社）中で１３９＋ａｌに濃縮し、その後５倍量の１０ｍＭトリス・ＭＣＩ 　（ｐＨ７，５）でダイアフィルトレートする。 ５．１．３．その後ヒドロキシアパタイトカラムで標本をクロマトグラフィーに 付す。 容積：　１．６ｘ２４ｃｍ、４９ｍ１ 緩衝液Ａ：１０ｍＭ）すＸ−ＨＣｌ　（ｐ　Ｈ７，５）＋１０？イクロＭ−Ｃａ Ｃ１゜ 緩衝液Ｂ：　ｏ、５Ｍりん酸ナトリウム（ｐＨ７，５）流速比：２１１／分 生物活性物質が１００〜２５０ｍＭりん酸（緩衝液Ｂ）で溶出する。 ５．１．４　逆相クロマトグラフィーにより、トリフルオロ酢酸／アセトニトリ ルを溶出剤として用いてＰｒ　ｏ−ＲＰＣ（商標）（ファルマシア社）でクロマ トグラフィーに付す。 容積：　ＨＲ５／１０．２ｍｌ’ 緩衝液緩衝液中：水中０．１フルオロ酢酸緩衝液Ｂニアセトニトリル中０．１％ トリフルオロ酢酸０．１％トリフルオロ酢酸を生物活性物質（２９ｍｌ）のプー ルに加え、溶液を凍結し、上清（１１，４ｍｇのタンパク）をカラムに加える。 生物活性物質が１〜２５％の緩衝液Ｂで溶出する（過剰プロティンの条件下）。 ５、ｉ　５．Ｐｒｏ−ＲＰＣ（商標）上での再クロマトグラフィ生物活性物質の プールを４１衝液Ａを用いてｌ：５に希釈し、カラムに加える。生物活性物質が ３０〜３２％の溶出剤Ｂで溶出する。 ５．１．６．モノ−８（商標）上での陽イオン交換クロマトグラフィー 容積：　ＨＲＩ　Ｏ／ｌ　０１８ａ＋１緩衝液Ａ：２５５Ｍ蟻酸アンモニウム、 ５０％の２−プロパツール（ｐＨ４，０） 緩衝液Ｂ：緩緩衝液中中５００ｍＭ−ＮａＣ１生物活性物質のプールを緩衝液Ａ を用いて１：　ｌＯに希釈する。 活性物質は６８〜６９％緩衝液Ｂで溶出する。 ５．１．７．）リフルオロ酢酸／２−プロパツールを用いたＰｒｏ−ＲＰＣ（商 Ｉ）上での逆相クロマトグラフィー容積：　ＨＲ５／２．０．４＠１ 緩衝液Ａ：　ｏ、１％トリフルオロ酢酸／水緩衝液Ｂ：　ｏ、１％トリフルオロ 酢酸／２−プロパツール緩衝液Ａを用いて、生物活性物質のプールをｌ：５に希 釈した後カラムに加える。生物活性物質の溶出は２４〜２６％の緩衝液Ｂで起る 。緩衝液Ａ中の試料を加えることによってクロマトグラフィーを開始し、緩衝液 Ｂの濃度を増加させながら、こう配溶出する。 結果を第４図に示す。このカラムクロマトグラフィーのピーク画分は、以下に示 す特徴を持っている。 刺激した胸腺リンパ球の増殖は２００マイクロリツトルの試験試料中１：５００ ０の希釈で半最大に阻害された。これは約２５０００単位／＋＋＋１の活性と等 しい。 試験法は、以下のようである。 ５０マイクロリツトルの上滑を種々の希釈度で、３００マイクログラム／ｍｌの し一グルタミン、ｌＸｌ０−’Ｍの２−メルカプトエタノールおよび５％仔牛血 清を補足した１５０マイクロリツトルのＲＰＭＩ培地に懸濁したＣ３Ｈ／Ｈｅｊ ｖウス由来の５ｘｉｏ’胸腺リンパ球に加える。平底マイクロタイタープレート で７２時間、コンカナバリン−Ａ（０，５マイクログラム／ウエル）の存在下で 細胞をインキュベートする。回収の１６時間前に０．５マイクロＣｉのピＨ］− チミジン（０，５Ｃｉ／ｍａ＋ｏｌ）をウェルごとに加える。結果は、培地対照 によって処理した胸腺リンパ球のコンカナバリン−Ａ応答と比較した抑制率で表 す。標準化の目的で、抑制率をプロットして標準曲線を得、これからＧ−ＴｓＦ 活性の単位への変換をすることができ得る。Ｇ−ＴｓＦのｌ単位は、分析におい て半最大の阻害を起すｌｓｌの最終分析培養培地中のＧ−ＴｓＦの量として定義 されている。 抗原特異的Ｔヘルパー細胞のインターロイキン−２依存増殖も、Ｇ−ＴｓＦの１ ０−　”Ｍの濃度で９０％以上阻害される（第５図参照、部分Ｂ）。 試験法を以下に示す。 ２Ｘ１０’Ｔヘルパー細胞０ＶＡ−７Ｔをマイクロタイタープレートで、種々の 濃度のＩＬ−２および試験画分の存在下で培養する（アメルシャム、ＡＲＮ　１ ０１０．バッチ１０）。培地は、イスコブの完全培地（ベルリングベルケカタロ グ番号７８５２号）、５×１０−’Ｍ・２−メルカプトエタノールおよび３００ マイクログラム／ｍｌのし一グルタミンである。３Ｈ−Ｔｄｒのとり込み（１マ イクロＣｉ／ウエル）を１６時間以上測定する。結果を３Ｈ−Ｔｄｒ−摂取のＣ ｐＨｌ値で測定し、阻害率として表す。 担体存在下での凍結乾燥後に行った５ＤＳ−ＰＡＧＥ（ゲルこう配５〜１５％） および銀染色は分子量１２．５ｋｄの可視バンドを示す（９３，６７，４５，３ １，２１および１４ｋｂの標準から推定される）（第４図参照）。タンパクの濃 度を計算すると、使用した標準の塩基の量に基づき０．５マイクログラム／ｌｌ であり、ｌＯ″″”Ｍの濃度での胸腺リンパ球増殖分析および分析の半最大の阻 害において５８１０’単位／ｎｇのタンパクの特異的生物活性に対応する（第５ 図参照、部分Ａ）。 精製タンパクの特異的活性におけるこれらのデータを５ＤＳ−ＰＡＧＥでの単一 バンドの表示とともに考慮すると、生物学的に活性なＧ−ＴｓＦが均−物に精製 されたことを明白に示している。 ５．２．ｃＤＮＡのクローニングおよび配列５．２．１．ｍＲＮＡの単離 ５．１．１．段階の記載に従い培養された５０枚のプレート中の細胞をプレート からこすり取り、遠心分離に掛け、沈澱物を４０ｗ（ｌの溶菌液（６Ｍ尿素、３ Ｍ−ＬｉＣＬ　５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５。 ０．２００μ９７ＩＱヘパリン、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム）に懸濁し、 ３０秒間ソーバール・オムニミックス中で３回ホモジネートし、４℃で一夜貯蔵 する。１００００　ｒｐｍおよび４℃で遠心分離後、沈澱物を８Ｍ尿素、４Ｍ− ＬｉＣρにより１回洗浄し、次いで５０酎の酢酸緩衝液（２００ｍＭ酢酸ナトリ ウム、ｐＨ５，０，０，２％ドデシル硫酸ナトリウム、１ｍＭ−ＥＤＴＡ）に溶 解し、水−飽和フェノールで抽出する。遠心分離後水相を分離し、フェノールお よびクロロホルムの１：１混合物で再抽出する。−夜−２０℃で２倍容量のエタ ノールによりＲＮＡが沈澱する。１１００００ｒｐで１０分間遠心分離後、沈澱 物を１（１２のＴＢＳに溶かす。この溶液を７．５ＭＮａＣＱにし、５００ｍ９ オリゴ（ｄＴ）−セルロース（ＰＬ、タイプ７）を用いたカラムに通す。０．５ Ｍ−ＮａＣＱＳ　１０ｍＭ−トリス、ＨＣ１２、ｐＨ７，６，１ｍＭ−ＥＤＴＡ により激しく洗浄後、滅菌水を溶離剤として結合したポリ（Ａ）含有ＲＮＡを溶 離する。０．３Ｍの酢酸ナトリウムｐＨ７，０および２．５倍容量のエタノール を加え、−２０℃で一夜ｍＲＮＡを沈澱させ、溶液を１１０００Ｏｒｐの遠心分 離に掛ける。沈澱物を水に溶かし、約ｌμｇ／μｇの濃度にする。約４０−６０ μ９のｍＲＮＡを５０枚の１４−ｃｍプレートから回収する。 ５．２，２．ｃＤＮＡの合成 ５０ｍＭのトリス、ＨＣｌ２．、ｐＨ８，３，５０ｍＭのＫＣＱ１８＋＊ＭのＭ ｇＣ（ｌｔ、１ｍＭ（７）ジチオトレイトール、３０　ｕ９／ｗＱｃＤオリゴ（ ｄＴ）、０．１μｖ／ｚ（ｌのアクチノマイシンＤ、各々１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄ ＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１単位／μｇのりボヌクレアーゼ阻害剤ＲＮ リボヌクレアーゼ阻害剤（商標、プロメガ）並びに１．５単位／μＣのとり骨髄 芽球症ウィルス逆転写酵素（ライフ・サイエンシーズ）を含有する溶液２００μ Ｑ中２０μ９のｎＲＮＡから第−ＣＤＮＡ鎖を合成する。４２℃で４時間インキ ュベーシツンを行う。ｌ／１０容量の０．５Ｍ−ＥＤＴＡにより反応を停止し、 セファデックスＧ１５０を充填したパスツール・ピペットに通すことにより、取 り込まれていない三りん酸類、アクチノマイシンＤおよび塩類を除去する。０． ３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ７，０を溶離されたｃＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッドに 加え、混合物を一２０℃で一夜２．５容量のエタノールにより沈澱させる。沈澱 を遠心分離により回収し、８０％エタノールで１回洗浄し、２０μＱのＴＥＮに 溶かす。 ２０ｍＭのトリス、ＨＣＱ％ｐＨ８，０，５ｍＭのＭｇＣ１２ｔ％ｌ　ＯｍＭの （ＮＨ，）、Ｓｏｏ　１００ｍ〜１のＫＯｆｆ、各々０．０５＋＋＋ＭのｄＡＴ Ｐ％ｄＣＴＰ％ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．１Ｍのジチオトレイトール、２０ マイクロキユリーのα［″”Ｐ］ｄＣＴＰ（アマ−ジャム、３０００キユリ一／ ｍＭ）、２０μＱのりボヌクレアーゼＨ（ベゼスダ・リサーチ・ラボラトリーズ 、３単位／μｍ２）、１０μＱのＤＮＡポリメラーゼＩにューイングランド・バ イオラブズ、ｌＯ単位／μの並びに上記で得られたハイブリッドｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ 　／　ｍ　ＲＮ　Ａから成る反応混合物４００μｇ中、下記修正を加えたグプラ ーおよびホフマンの方法「「ジーン」、２５巻（１９８３年）２６３−２６９頁 ］により第２鎖を合成する。インキュベーションを１２℃で９０分間および２２ ℃で３時間続ける。ｌ／２０容量の０．５Ｍ−ＥＤＴＡにより反応を停止し、低 分子量成分をセファデックスＧ１５０カラムで分離する。次いで二本鎖ｃＤＮＡ をエタノールにより沈澱させ、２０μＱのＴＥＮに溶かす。 次いで３７℃で１時間、５０ｏＭのトリス、ＨＣ（２，ｐＨ８，０，０゜１ｍＭ のＥＤＴＡ、８０ＭＭのアデノシルメチオニン（シグマ）および５μｆ２ｃ）Ｅ ｅｏＲＩメチラーゼにューイングランド・バイオラブズ、２０単位／μｍ２）か ら成る混合物５０μＱ中で処理することにより、ＣＤＮＡのＥｅｏＲ１部位をメ チル化する。 さらに、２２℃で３０分間２５０ｍＭのＮａＣ１！、３０ｍＭの酢酸ナトリウム ｐＨ４，５，１ｍＭのＺ　ｎ　Ｓ　Ｏ４および１０単位の６１ヌクレアーゼ（Ｐ Ｌ）から成る混合物４００μＱ中で処理することにより、形成されたヘアピンル ープを全てヌクレアーゼＳ１で切断する。フェノール／クロロホルム（１：１） により抽出後、ｃＤＮＡをエタノールにより沈澱させ、ｌＯＯμＱＯ）　Ｔ　Ｅ 　Ｎに溶かし、Ｇｌ　５０カラムに通すことにより、小ＤＮＡフラグメントを捨 てる。エタノール沈澱後、ｃＤＮＡを小量（１０−２０ｕＱ）ｔ））ＴＥＮ（： 溶かす。 次いで、トリス−酢酸（ｐＨ７，９）３３ｍＭ、酢酸カリウム６６ｍＭ。 酢酸マグネシウム１０　ＩＩＩＭｓジチオトレイトール２．５ｍＭ、ｄＡＴＰ。 ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ各々０　、１　ｍＭから成る混合物４０μＱ およびＴ４ＤＮＡポリメラーゼ１にューイングランド・バイオラブズ、１０単位 ／μｌ２）４μｇ中３７℃で３０分間Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼとインキュベーシ ョンすることにより、ｃＤＮＡの末端をリンカ−結合用に調製する。７０℃で１ ０分間処理することにより酵素を不活化する。 次いで合成ＥｃｏＲＩリンカ−にューイングランド・バイオラブズ）の５°−末 端を次の要領でキナーゼ化する。２０μ９のリンカ−ＤＮＡを３７℃で４０分間 ７０＋ａＭのトリス、ＨＣｆｆ（＋）Ｈ７、５）、１０ｍＭのＭｇＣ２，，５ｍ Ｍのジチオトレイトール、２ｍＭのＡＴＰおよび、１０Ｍｇのポリヌクレオチド キナーゼから成る混合物２００μＱ中でインキュベーションする。 次に、５°−りん酸化リンカ−をｃＤＮＡに結合させる。加熱不活化ｃＤＮＡ反 応混合物を１００μｇにし、３５ｍＭ）リス、ＨＣ１２ｐＨ７。 ５．７＋ｎＭのＭ　ｇ　ＣＱ　＊、ｌＩＩＩＭのＡＴＰおよび５ｍＭのジチオト レイトールの濃度にする。１．６μ９のキナーゼ化ＥｃｏＲＩリンカ−を加え、 １５℃で一夜１０μＱのＴ４ＤＮＡリガーゼにューイングランド・バイオラブズ ）によりライゲーション（結合）を行う。次いでリガーゼを１０分間７０℃で不 活化し、３７℃で４時間、かなり過剰のＥｃｏＲＩ　にューイングランド・バイ オラブズ、１０００単位）で処理することにより、ＥｃｏＲＩリンカ−を完全に 開裂する。酵素を１容量のフェノールにより抽出し、ｃＤＮＡをエタノールによ り沈澱させる。セファロース４Ｂカラムにおいて七ツマ−・リンカ−・フラグメ ントがＣＤ　Ｎ　Ａから分離され得る。３００ｂｐを越えるｃＤＮＡが排除容量 中に溶離し、これをエタノールにより沈澱させ、少量のＴＥＮに溶かす。次にｃ ＤＮＡを５０Ｖの電気泳動緩衝液（４ｈＭ）リス・酢酸ｐＨ７、８，１ｍＭのＥ ＤＴＡ）中１％ゼアープラーク・アガロースゲルによりサイズ−分画化し、臭化 エチジウムで染色し、１６００ｂｐより大きいＤＮＡフラグメントをゲルから切 断する。サイズ・マーカーとしてｐＢＲ３２２のＨｉｎｆｌフラグメントを使用 する（サツトクリフ、「ニュークリック・アシッズ・リサーチ」５巻、［１９７ ８年］２７２１−２７２８頁）。等量のＴＥおよび３Ｍの酢酸ナトリウムｐＨ７ 、０を加え、アガロースを７０℃で５分間溶かし、５分間３７℃に冷却する。ア ガロースを等量のフェノールで２回抽出し、エタノールを用いた沈澱によりｃＤ ＮＡを水相から回収する。 ５．２．３．ラムダｇｔｌｏへのクローニングサイズ−分画化されたｃＤＮＡを ファージラムダｇｔｉｏにクローニングする（ヒュイン等、ｒＤＮＡクローニン グ」、グローバー編、アイアールエル・プレス、第１巻［１９８５年］４９−７ ８頁）。ホスファターゼにより脱りん酸化されたラムダｇｔｌＯアームは、スト レイタジーン・クローニング・システムズから入手され得る。】、６μＣのＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて２０ａｇのｍＲＮＡから得られた全ｃＤＮＡを含む、５ ．２，２．項記載の全容量８μρ中で、１μ９のラムダｇｔｌＯアームをライゲ ーションさせる。次いでファージを、製造者の使用説明書に従いパッケージ化抽 出物（ギガバック、ストレイタジーン・クローニング・システムズ）とインキュ ベーションし、Ｅ、ｃｏｌｉ細胞Ｃ６００ｈｆｌ（ストレイタジーン）に感染さ せる。ファージのパッケージ化は、２０μｅの凍結融解物および３０ａｇの音波 抽出物を用いて２時間２２℃で行なわれる。次にファージを１ｘ（ｌの希釈緩衝 剤（５，８９のＮａＣ（！、２９Ｃ））ＭｇＳＯ，・７Ｈ＊０，５０ａＭのトリ ス・ＨＣ（２、ｐＨ７，５）で希釈し、４０ａｇのクロロホルムにより安定化す る。次に、Ｃ６００ｈｆｌの新鮮な一夜培養を遠心分離し、２分の１容量（ＤＩ 　０ｍＭ−Ｍｇ５Ｏ，に＠濁する。コノ細菌懸濁液１ｚ１２を３７℃で２０分間 、３分の１のファージ懸濁液により感染させ、２４５ｘ２４５龍生物試験皿（ヌ ンク）に入れた１、５％の寒天上、ＢＢＬ（商標）培地中３０ｚＱトップーアガ ー（０，８％バクトアガー・ディフコ、！　ｏｆ）リブチカーゼ、５９ＮａＣ（ １、ＰＨ７，２）においてＥ、ｃｏｌｉ細胞を培養し、５−６時間３７℃でイン キュベーションする。プラークを伴うトップ−アガーをこすり取り、４℃で２０ ｍ（ｌのファージ緩衝液中−夜振り混ぜる。寒天を６００Ｏｒｐｍで遠心分離し 、溶離ファージ懸濁液を８００μｇのクロロホルムにより安定化する。この方法 では５０００００個の組換えファージが３培養皿から得られ、長さ１６００ｐｂ を越えるｃＤＮＡ挿入体が含まれている。 ５．２．４．放射性オリゴヌクレオチド・プローブの合成５．２．４．１．製造 者の使用説明書に従い、アプライド・バイオシステムズ・ＤＮＡ・シンセサイザ ーを用いて第１図に示すプローブＡおよびプローブＢのオリゴヌクレオチドを製 造す之（プローブＡの場合、仮定した２２位のアミノ酸、Ａｌａの誤っているこ とが後に判明したが、これは実験に影響を与えなかった）。 ５．２．４．２．次に下記の要領でそれらに放射性標識を行う。 ａ）プローブＡ ２つのプローブＡオリゴヌクレオチド各々ｌＯＯμ９を１８μｅの水中７０℃で １０分間加熱し、次に１Ｍ−ＮａＣ（２％１００ｍＭのトリス・ＨＣｌ２（ｐＨ ７，５）の溶液２μＱを加え、プローブを３７℃で１時間および室温で２時間互 いにハイブリダイゼーションさせる。次に混合物を５０ｕＱにし、５０ｍＭのト リス−ＭＣＩ２（ｐＨ８，０）、６ｘＭのＮａＣム、５ｍＭのジチオトレイトー ル、各々０．０５５ＭのｄＡＴＰ％ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、　並びに１００　 μＣ１７）ａ［”Ｐ］ｄＣＴＰ（アマ−ジャム、３０００　Ｃｉ／ｍＭ）といっ た濃度を確立する。２μＱのＤＮＡポリメラーゼＩ・フレノウ断片を加えた後、 混合物を室温で４５分間インキユベーシヲンし、セファデックスＧ２Ｓカラムを 用いて取り込まれていないヌクレオチドを合成２本鎖ＤＮＡフラグメントから分 離する。Ｉ　Ｘ　１０”　〜２　Ｘ　Ｉ　Ｏ”ｅｐｍ／　１００ｎ９のプローブ Ａが得られる。 ｂ）プローブＢ これには、５．２．２．記載の条件下、２０ａ（ｌのキナーゼ化混合物ＣｔＮ　 ００μＣｉα［”Ｐ］ＡＴＰ（７７−’ｉヤム、３００　Ｃｉ／ｍＭ）オよび２ μｅのポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー、１１単位／μｇ）を用いて放 射性標識を施す。０．５ＸｌＯ’〜ｌＸｌ０’単位／１００ｎ９が得られる。 ５．２．５．Ｇ−ＴｓＦクローンのスクリーニングおよび選択０．７％トップ− アガロース中Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００の感染後、１．５％の寒天を含む１０１０ Ｘ１４のベトリ皿上ＢＢＬ（商標）培地において約１ｏｏｏｏｏ個の組換えファ ージ（５，２，３，参照）を培養する。 ３７℃で６〜９時間インキュベーション後、生成したプラークを製造者の使用説 明書に従いナイロン・フィルター（ボール）において複製する。２つの複製が製 造される。まずフィルター上のＤＮＡを５分間０．５Ｎ−ＮａＯＨ，１，５Ｍの ＮａＣｌ２溶液により変性させ、次いで５分間３ＭのＮａ−酢酸ｐＨ５，５によ り中和する。最後に、フィルターを風乾し、３０秒間クロロホルム中に浸し、風 乾し、８０℃で１時間焼き固める。 次いでフィルターを１％ＳＤＳ含有ＮＥＴ溶液中６５℃で２時間洗浄し、４２℃ で４時間０．２％のＳＤＳ、０．１％のフィニル、０゜１％のポリビニルピロリ ドン、０．１％の子牛血清アルブミンおよびｌＯＯμ９／ＩＩＱの変性サーモン ***ＤＮＡを含むＮＥＴ溶液中でプレハイブリダイゼーションする。 ４２℃で一夜０．２％ＳＤＳ、０．１％フイコル、０．１％ポリビニルピロリド ン、０．１％子牛血清アルブミン、１００μ９／籾酵母ｔＲＮＡおよび０．０５ ％ピロりん酸ナトリウムを含むＮＥＴの溶液中でハイブリダイゼーションを行う 。 第一複製を２ｘｌＯ“ｃｐｍ／ｍｅのプローブＡと、第二複製を０．５Ｘ　１０ 　”ｃｐｍ／ｘ（２のプローブＢとハイブリダイゼーションする。）＼イブリダ イゼーションを行った後、ペトリ皿を室温で３０分間多量の０．２％ＳＤＳ含有 ＮＥＴにより２回洗浄する。次に温度を４２℃、４７℃、５２℃および５７℃と 累進的に高め、１５分間同溶液で２回洗浄を行う。各洗浄段階後、フィルターを １６〜４８時間増強スクリーンによりコダックＸＡＲ−５Ｘ線フィルムで感光さ せる。 ５２℃で洗浄後、両プローブとハイブリダイゼーションしているクローンがフィ ルター上に同定され得る。これらのクローンに対応する領域をベトリ皿から選択 し、ファージをファージ緩衝液に溶離させる。選択された領域はまだ幾つかの異 なる組換えファージを含むため、溶離されたファージをＥ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００ の更新感染に使用し、ファージを低密度で培養する。上記と同様に再びナイロン ・フィルター上で複製を製造し、フィルターを対応するプローブによりハイブリ ダイゼーションする。ここで単一プラークがペトリ皿から選択され得る。それを ｌＭｇのファージ緩衝液に溶離し、生成したファージ懸濁液を４℃に保つ。 ｐＢｓ、Ｍ２Ｓ（下記参照）へのこのクローン（合成ラムダ５ＵＰ２５）のｃＤ ＮＡ挿入をサブクローニング後、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼでｐＳＵＰ２５サブク ローンを転写することにより、標識されたＲＮＡプローブが得られた。 これは、４０ｍＭのトリス−ＨＣＣ（＋））Ｉ８．０）、８ＩＩＩＭのＭ　ｇ　 ＣＱ　ｔ、２ｍＭのスペルミジン、５０ｍＭのＮａＣｌ２，７５ｍＭのジチオト レイトール、各々１ｃＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＵＴＰ、２５単位のＲＮ アシン（商標）、５０μＣｉのα”’−ｄＣＴＰ（４００−８００Ｃ１／ミリモ ル）、１ｕ９の線状プラスミドＤＮＡ並び（こｌＯ単位のＴ３ＲＮＡポリメラー ゼを含有する１０μｇアッセイ中で行なわれる。 インキュベーション時間は３７℃で３０分間である。 ＬｘＱのハイブリダイゼーション溶液当たり約Ｉ　Ｘ　１０”ｃｐｍのプローブ を用いて、上記ｃＤＮＡライブラリーの追加培養後ｊこさら１こ製造された複製 のスクリーニングを行った。このスフ１ノーンカ＼らさらに２種のクローンが単 離される（ラムダ５ＵＰ４０およびラムダ５ＵＰ４２、第２Ｃ図参照）。 ５．２．６．Ｇ−ＴｓＦクローンの同一性の確認５．２．６．１．ベクターｐＢ ｓ、Ｍ１３配列への再クローニング５．２．５．で得られたｃＤＮＡ断片が完全 な長さのＧ−ＴｓＦをコードするｃＤＮＡを含むことを確認するため、それの配 夕１１分析をしなければならない。５．２．５．で得られたファージ懸濁液５０ μｇを用いて３７℃で１５分間１０ｍＭのＭｇ５Ｏ，中Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００ 細胞の１００μＱ懸濁液を感染させる。生成した混合物に０．２％マルトースお よび１０ｍＭのＭｇ５Ｏ，含有ＢＢＬ（商標）培地２０ｘ（ｌを加え、３７℃で ４〜７時間振り混ぜる。部分的に溶解した培養に３０分間２１１２のクロロホル ムを加え、次に５００Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を３７℃で６０分間 ３０μｇのデオキシリボヌクレアーゼＩ　（１１９／夏１２）および４０μＱの リボヌクレアーゼ（５ｏ／村）とインキュベージジンする。４℃で一夜等量の２ ０％ポリエチレングリ：１−Ｊｌ、６０００．２　Ｍ（Ｄ　ＮａＣＱ−２９／　 ＱＣ）　ＭｇＳ　Ｏ４・７　ＨｔＯ１５０ｍＭのトリス・ＨＣＱｐＨ７，５を加 えることによりファージを沈澱させる。５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離後に 得られた沈澱物を５００μＱのファージ緩衝液に吸収させ、５００μｇのクロロ ホルムで１回抽出する。次いで水相中のファージＤＮＡを６８℃で１５分間３． ８μＱの２０％ＳＤＳおよび７．５μＱの／、５ＭのＥＤＴＡで処理し、溶液中 の蛋白質をフェノールにより抽出し、ＤＮＡをエタノールにより沈澱させる。 次いでＤＮＡを少量のＴＥに溶かす。生成したファージＤＮＡの半分をｌθμρ の反応混合物中ＥｃｏＲＩにより開裂し、５．２．２．の記載と同様にゼア−プ ラーク・アガロース・ゲルにおいて挿入されたｃＤＮＡ断片をラムダ・アームか ら分離する。バンドを切断し、フェノール抽出およびエタノール沈澱により、５ ．２．２．の記載と同！アガロースからＤＮＡを回収する。約５Ｏｒ＋９のｃＤ ＮＡ断片を５．２．２．記載（７）１０ｕＱ（１）５イ’ｆ−シａン混合物中５ ０　ｎ９（ＤｐＢＳ　。 Ｍ１３ベクター（ストレイタジーン・クローニング・システム）とライゲーショ ンする。このため、ｐＢｓ、Ｍ１３ベクターをまずＥｃｏＲ■により開裂し、製 造者の使用説明書に従い、子牛の腸から得られたアルカリ性ホスファターゼ（ベ ーリンガー）により５°末端を脱りん酸化しなければならない。次いで１〜２μ ｇのライゲーション混合物を感応性Ｅ、ｃｏｌｆ　Ｊ　Ｍ　１０９の１００μｇ 懸濁液にトランスフェクシヨンする。感応ＪＭ１０９細胞は、標準方法、例えば マニアチス等、「モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル 」、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク（１９８２ 年）に記載された方法により製造され得る。１００μｇの細胞懸濁液を水上で解 凍し、２μｇのライゲーション混合物を加える。氷上で２０分間インキュベーシ ョンを行い、次いで細胞を３７℃で４５秒間インキュベーションし、３７℃で１ 時間１ｘＱのｓ。 Ｃ培地（２％バクトートリプトン、０．５％酵母抽出物、ｌＯａＭのＮａＣＱ、 ２．５ｍＭのＫＣ（！、１０ｍＭのＭ　ｇ　Ｃ（！　ｔ、１０＋ＭのＭｇ５ｏ、 、２０ｍＭのグルコース）中で振り混ぜる。遠心分離により沈澱した細菌を１０ ０μｅのＳＯＢ培地（グルコース不含有ＳＯＣ培地）に懸濁し、５０μ９ＩＲＱ のアンピシリンを含むＳＯＢ培地中１．５％の寒天培養基上に広げる。ジメチル ホルムアミド１ｙ１２当たり４ηの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル− β−Ｄ−ガラクトピラノシドおよび５０ｍｇのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラ クトピラノシドを含有する溶液１００μｇにより培養基を前処理すると、ベクタ ーに含まれるβ−ガラクトシダーゼによりＥ、ｃｏｌｉコロニーの青色が生ずる 。挿入をもつコロニーは無色である。これらのコロニーを６ｚＱの培養に接種し 、−夜成長させる。成長培地は、５０μ９７ＩＩＱのアンピシリンを含むＳＯＣ 培地であり得る。マニアチス記載の「ボイリング方法Ｊ（１９８２年、前出）に よりプラスミドＤＮＡを単離する。 ５．２．６．２．　ｃＤＮＡ断片の配列分析６蛙の培養培地から得られたプラス ミドＤＮＡの３分の１を、５分間１／１０容量の２Ｎ−ＮａＯＨ，２ｍＭのＥＤ ＴＡで処理することにより変性させる。１１５容量の５Ｍ酢酸アンモニウムを加 え、２容量のエタノールによりＤＮＡを沈澱させる。沈澱物を８μｇの水に溶か し、１．５μｆｆの反応緩衝液（０，５ＭのＮａＣＱ、０．１Ｍのトリス・ＨＣ ｌ２ｐＨ７，５，０，１ＭのＭｇＣＱ＊、１ｍＭのＥＤＴＡ）を加え、適当なオ リゴヌクレオチド・プライマーをｃＤＮＡとハイブリダイゼーションする。デオ キシヌクレオチド−およびジデオキシヌクレオチド−トリホスフェートの様々な 混合物を加えた後、フレノウＤＮＡポリメラーゼ■を用いるサンガー等の方法［ ｒＰＮＡＳＪ、７４＠Ｃ１９７７年）５４６３−５４７７頁］に従い、ＤＮＡの 配列を分析する。 ５ＵＰ２５　ＣＤＮＡの同定を確認する配列決定ストラテジーを第２ｂ図に示す 。第一プライマーとしてプローブＢ（５，２，４−２，参照）が使用され得る。 それにより約２００のヌクレオチドの領域を読み取ることが可能である。これは 、２種のさらに別のプライマー配列の合成に十分な配列情報を提供する。 −プライマーｌ：５°−ＣＣＧ　ＴＡＴ　ＴＴＡ　ＴＧＧ　ＡＧＴ　ＴＣＡ　Ｇ ４゜−プライマー２　：　５’　−ＧＧＡ　ＧＡＡ　ＧＣＡ　ＧＡＴ　ＧＣＴ　 ＴＣＴ　ＧＧＡ　Ｔ−３’これらの２種のプライマーにより、成熟蛋白質の１１ ２個のアミノ酸を包含する完全な領域を読み取ることが可能である（第２ａ図参 照）。前駆物質の蛋白質内の成熟ペプチドの正確な位置は、決定されたアミノ末 端ペプチド配列から導き出され、またＴＣＰ−βｌについて公表された配列（プ リンク等、「ネイチャーＪ、３１６巻［１９８５年］７０１−７０４頁）と比較 することによっても推定され得る。 様々な制限酵素で５ＵＰ２５−ｃＤＮＡを開裂するか、またはヘニコフの方法［ 「ジーンＪ（１９８４年）３５１−３５９頁コに従い、ヤエナリ・ヌクレアーゼ およびエキソヌークレアーゼ■でサブクローンを処理することにより得られた一 連の重複ｃＤＮＡ断片のサブクローニングおよび塩基配列決定後、１位ないし１ ６９５位間のｃＤＮＡの完全な配列が誘導された。 さらに、５ＵＰ４０および５ＵＰ４２　ｃＤＮＡに関し、上記内部配列決定プラ イマーを用いて、成熟ペプチドをコードする領域および両端から３００個のヌク レオチドについての配列を分析をした。 塩基配列決定領域は、５ＵＰ２５　ｃＤＮＡと同一であることが判った（第２Ｃ 図および第２ｄ図参照）。 成熟蛋白質の完全な配列はＴＧＦ−βｌと７１％の相似性を有し、蛋白質配列は 、ＴＧＦ−β１の場合、前駆物質の蛋白質のカルボキシ末端に位置する（第２ｂ 図参照）。これは、３゛−末端の終止コドンおよび成熟蛋白質の第一アミノ酸の 前の可能なプロテアーゼ切断部位の一部としてのアルギニン残基の存在から続く ものである。 ５．３０組換えＧ−ＴｓＦの発現 ５．３．１．ＣＨＯ細胞における形質発現５Ｊ、１．１．発現ベクターの組立 ラムダ５ＵＰ２５およびラムダ５ＵＰ４０　ｃＤＮＡ（第２Ｃ図参照）をＣＯ５ −およびＣＨＯ−細胞発現ベクターｐ９ｔ０２３ＢおよびｐＸＭＴ３．ｎｅｏ７ 中に再クローニングする。 ９９１０２３Ｂは、ウオング等、「サイエンシーズ」２２８巻（１９８５年）８ １０−８１５頁に記載されている。 ｐＸＭＴ３．ｎｅｏ７はｐｘＭベクターから誘導されたもので、９９１０２３Ｂ と同じ主成分を含み、ヤング等、「セル」、４７巻（１９８６年）３−１０頁に 記載されている。 即ち、これらのベクターは共に、Ｅ、ｃｏｌｉおよび真核生物細胞での成長を可 能にする成分を含む。さらに挿入されたｃＤＮＡはＣ）（０およびＣＯ６細胞に おいて発現され得る。それらは、原核生物および真核生物における複製開始部位 、ＳＶ４０からのエンハンサ−成分、アデノウィルスの主後期プロモーター、続 いてアデノウィルスの後期転写の３リーダー配列の一部分、免疫グロブリン遺伝 子からのイントロン、ＳＶ４０からのポリアデニル化部位およびアデノウィルス のＶＡ遺伝子（翻訳制御において５′−非翻訳リーダー配列と一緒になって機能 する）を含む。 さらにこれらのベクターは、免疫グロブリン・イントロンの後に位置するクロー ニング部位およびＳＶ４０からのポリアデニル化配列間に挿入されたマウス・ジ ヒドロ葉酸還元酵素ＣＤ　Ｎ　Ａを含む（第３ａ図参照）。従って、これらのベ クターはまた、ＣＨＯ細胞中にトランスフェクションされ得、高濃度のメトトレ キセートに耐性のあるサブクローンの選択により、転移遺伝子はジヒドロ葉酸還 元酵素ｃＤＮＡと一緒になって増幅され得る（ハインズ等、「ニュークリック・ アシッズ・リサーチ４１１巻（１９８３年）６８７−７０６頁に従う）。 ｐＸＭＴ３．ｎｅｏ７の構造は、ｐＸＭベクターに由来し、多種のクローニング 部位を挿入することによりクローニング手順を簡略化させたものである。さらに 、ヘルペス・シンプレックス・ウィルスのチミジンキナーゼ・プロモーターの制 御下の細菌性新生（ネオ）遺伝子を複製のＳＶ４０起点およびＶＡ遺伝子間に挿 入する。これにより、コルベ−ルーガラパン等、「ジャーナル・オン・モレキュ ラー・バイオロジー」、１５０巻［１９８１年コ、１−１４頁に従い、０４１Ｂ スルフエート（ギブコ）を用いるＣＨＯ細胞のトランスフエフシラン後の第一選 択段階が行なわれる。詳しくは、ｐＵｃ１８からのポリリンカーのＰｓｔ　Ｉ　 −ＥｃｏＲＩ領域（ヤニツヒーベロン等、「ジーン」３３巻［１９８５年］、１ ０３頁）を、ＰｓｔｌおよびＥｃｏＲＩによる開裂後、ｐＸＭＸラプラスミド中 入し、ｐＸＭから３６ｂｐフラグメントを除いた。こうしてクローンｐＸＭＴ３ が得られた。新生遺伝子を挿入するために、ネオ遺伝子と結合したチミジンキナ ーゼ・プロモーターを含むｐＡＧ６０の部分的Ｐｖｕｌｌ開裂（コルベ−ルーガ ラパン等、「ジャーナル・オン・モレキュラー・バイオロジー」、１５０巻［１ ９８１年］、１−１４頁）から得られた１８８２ｂｐフラグメントを５ｔｕｌ− 開裂ｐＸＭＴ３中に挿入し、同じ転写方向においてネオ遺伝子およびアデノウィ ルス主後期プロモーターを含むプラスミド、ｐＸＭＴ３．ｎｅｏ７を選択した。 ５．２．６．１．の記載と同様に、ベクターのＥｃｏＲＩ部位への再クロ−ニン グを行う（第３ａ図および第３ｂ図参照）。 ５．３．１．２．　ＣＨＯ細胞のトランスフェクションおよびＧ−ＴｓＦｃＤＮ Ａの増幅 ジヒドロ葉酸還元酵素−欠失ＣＨＯセルラインＤＵＫＸ−Ｂ（ウルラウブおよび シャサン、ｒＰＮＡｓＪ７７巻［１９８０年コ４２１６−４２２０頁）のトラン スフェクションを、ノイマン等、「エンボ・ジャーナル」１巻、［１９８２年コ ８４１−８４５頁に従いエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔ　 ｔｏｎ）により行った。細胞をα十培地中（イブコ）でほぼ全面成長させ、Ｃａ ＋＋およびＭ　ｇ　＋十を含まないＰＢＳで１回洗浄し、０　、５　ｍＭのＥＤ ＴＡおよび０　、５　ｍＭのＥＧＴＡを含むＰＢＳ中で約５分間インキュベージ コンすることにより培養皿から遊離させた。細胞を遠心分離し、ＴＢＳ（２５ｍ Ｍのトリス−ＨＣｆｆｐＨ７，５，１３７＋ａＭのＮａＣＱ、５ｍＭのＫＣｌ２ ，０．７ｍＭのＣａ　Ｃ１２ｔ、０　、５　ｍＭのＭ　ｇ　ＣＱ　！および０　 、６　ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４）に再懸濁した。追加の遠心分離後、細胞を冷ＴＢ Ｓに懸濁し、１０７細胞／１１Ｉ２に調節した。ｌ５ＣＯモデル４９４電源およ びハエフリガー・エレクトロポレーション・ユニットを用いてこの懸濁液の１０ ０μｇアリコートによりエレクトロポレーションを行った。パルスを行う前に３ ０分間およびその後さらに３０分間、細胞を５μ９の線状プラスミドＤＮＡと一 緒にインキュベーションした。５パルスが５秒間隔で発された。使用電源の調節 値は、２０００Ｖ、　５Ｗ、　３ｍＡ、３０００〜９０００Ｖ／ｃｘの電界強度 を与える６００〜１８００ｖの電位差限界であった。コンデンサーを選択して１ ６９μＦに荷電させた。エレクトロポレーション後、細胞をα十培地中７５Ｃｊ １１の培養フラスコに接種した。２４時間後Ｇ４１８を０　、５　ｚ９／ｚＱの 濃度で加え、ネオ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを取り込んだ細胞クローンを選 択した。０　、５　ｍＭのＥＤＴＡおよび０　、５　ｍＭｃ）Ｅ　ＧＴＡを含有 するＰＢＳ中でインキュベーションすることにより、成長している細胞クローン の混合物を培養皿から分離し、α（−）−培地（ギブコ）に再接種して細胞中の ジヒドロ葉酸還元酵素の存在に関して選択した。次いで、１ａＭから出発して３ および１０ｎＭにメトトレキセート濃度を増加させて培養物を再接種後選択する ことにより、トランスフェクションされた遺伝子をさらに増幅させた。 ５．３．１．３．　ＣＨＯ細胞による生物活性組換えひとＧ−ＴｓＦの産生の確 認 １ａＭおよび１０ｎＭのメトトレキセート中で選ばれた細胞クローン並びにｃＤ ＮＡ挿入体を含まないベクターによりトランスフェクションされ、同様に選択さ れた対照細胞を、２〜４Ｘ１０”細胞／７５ＣＩ”フラスコの細胞密度で接種し 、９０％の割合に全面成長させた。次いで細胞をＰＢＳにより３回洗浄してメト トレキセートを除去し、６１１Ｑの血清不含有α−培地または１０％うし胎児血 清含有α−培地と４８時間インキユベーシゴンした。トリクロロ酢酸による血清 不含有培養上清からの蛋白質の沈澱後、トウビン等、ｒＰＮＡＳＪ７６巻［１９ ７９年コ４３５０−４３５４頁に記載された標準プロトコルに従い、５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥおよび免疫プロッティングを行った。使用したうさぎ抗血清は、うさぎを Ｇ−ＴｓＦのアミノ末端部分に対応する合成ペプチドで免疫化することにより得 られた。 製造会社のプロトコルに従ってバイオシステム・ペプチド・シンセサイザーによ りペプチドＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ −Ａｒた。 免疫プロッティング実験は、１０ｎＭメトトレキセートで選ばれた細胞クローン におけるひと組換え成熟Ｇ−ＴｓＦの産生を明白に確認するものである。対照細 胞および！ｎＭメトトレキセートで選ばれた細胞においてこれらの条件下で検出 可能なＧ−ＴｓＰ材料は無かった（第１θ図参照）。 メトトレキセートを含まない１０％血清培地で得られた上清を、５．１．７．段 階に記載された胸腺細胞増殖検定において試験した。 対照細胞および１ａＭメトトレキセートで選択された細胞から得られた上清は殆 ど阻害活性を示さなかったが、１０ｎＭメトトレキセートで選ばれた細胞クロー ンから得られた上清は胸腺細胞増殖の阻害を示した。細胞クローンにより産生さ れたＧ−ＴｓＰ複合体の酸活性化後、１０ｎＭのメトトレキセートにより選択さ れたクローンは、１　：５０００を越える希釈率で検定における半最大阻害を起 こした（第１１図参照）。この実験は、Ｇ−ＴｓＦ　ｃＤＮＡによりトランスフ ェクションされたＣＨＯ細胞による生物活性組換えひとＧ−ＴｓＰの産生を明確 に立証している。免疫プロットに存在するものと評価されたＧ−ＴｓＦの量から 計算された比活性は（第１１図参照）（約１００　ｎ９／Ｒ１）、神経こう芽腫 細胞から単離された材料に関して計算された５Ｘ１０’単位／Ｊ！９と少なくと も同じ高さである（５．１Ｊ。 参照）。 さらに、２４μ９／ＩＬＱのポリクローナル抗ＴＧＦ〜βｌ抗体（アール・アン ド・ディー・シスラムダ）により１：１０に希釈したメトトレキセート不含有上 清のインキュベーション後、ｐｘＭＴ３．ｎｅｏ７／５ＵＰ４０−１によりトラ ンスフェクションされ、１０ｎＭメトトレキセートで選択されたＣＨＯ細胞から 得られた上清の阻害活性は胸腺細胞アッセイにおいて完全に中和されたが、これ は通常抗体の非存在下で８７％阻害をもたらす。これらの抗体はＴＧＦ−βｌお よびＧ−ＴｓＦに関して交差反応性であることが示された。 ５．３．２．エシェリヒア・コリにお（プる形質発現成熟Ｇ−ＴｓＦペプチドコ ード領域およびＨｉｎｄｌ１１部位までの３゜−非翻訳化配列（第２ｃ図参照） を含むラムダＳ　Ｕ　Ｐ　２５　ｃＤ　Ｎ　Ａの一部をｐＰｓｌにクローニング する。このベクターは、ラムダ・ブし ロモーターの制御下でｃＤＮＡを発現させる。組立てる際、まず、ＡＴＧ翻訳開 始コドンが生成される形でベクターのＮｄｅ１部位とＧ−ＴｓＰ　ｃＤＮＡノ１ ０９９−１１０２位のＨａｅｌ［１部位をつなぐオリゴヌクレオチドを合成する 。これに直接長さ１１２個のアミノ酸を有する成熟Ｇ−ＴｓＦコード配列を続け る（第７ａ図および第７ｂ図参照）。この構造（ｐＰ　５ｌ−ＳＵＰ２５−１） を、温度感受性うし ムダ・リプレッサーを産生ずるエシェリヒア・コリ株Ｗ３１１０ラムダＹ１３９ にトランスフェクションする。次いで細菌を３０℃で成長させる。ｏ、ｅｏｐｅ 。。の密度を達成後、温度を４２℃に上昇させることによりＰプロモーターを誘 導する（これはラムダ・リプレッサーを不活化する）。５４時間のインキュベー ション後、全エシェリヒア・コリ蛋白質を単離し、５．３．１！、に記載された Ｇ−ＴｓＦに対するポリクローナルうさぎ抗体を用いて、ポリアクリルアミド・ ゲルに上り分離後、組換えＧ−ＴｓＦをチェックする。すなわち、Ｇ−ＴｓＦの 産生は、４２℃でのラムダ・リプレッサーの不活化後初めの１時間で立証され得 る（第８図）。 下記の要領で、組換えプラスミドを用いて６ｇのエシェリヒア・コリ含有培養培 地をＯＤｏ。。＝０．６の密度に成長させ、４２℃で５時間誘導し、Ｇ−ＴｓＦ を単離することにより、エシェリヒア・コリ、において発現されたＧ−ＴｓＦの 同定をさらにチェックした。 １）抽出：得られた８９の細胞を２８１１Ｉ２の緩衝液（１０ｍＭのトリス−Ｈ ＣＱ　ｐＨ７，５、ｍＭのＥＤＴＡ、１．５％ＳＤＳ、および０．５％２−メル カプトエタノール）に懸濁し、５０℃で２０分間加熱し、次いで４８０００ｇで １５分間遠心分離した。上清を捨て、同じ緩衝液（ただし、５％ＳＤＳを含有） により沈澱物を再抽出した。両上滑を混合し、強い振動により粘ちょう性を低下 させた。 ２）バイオゲル・クロマトグラフィー：抽出された蛋白質をバイオゲル・カラム （バイオゲルＰ１００．１６０−２００メツシユ、Ｋ１００／１００）により分 画し、緩衝液［１）と同じ組成コにより溶離した（１２０ｍｇ、流速２６Ｍ！／ 時）。フラクションのアリコートをＰＡＧＥにより分離し、免疫プロッティング を行った。溶は込んだフラクション２３および２４を凍結乾燥し、４０ｘＱの蒸 留水に溶かし、蒸留水に対して６日間透析した。次に、透析された材料（８５ｚ Ｑ）のｐＨをトリフルオロ酢酸により２．１５にした。 ３）Ｐｒｏ−ＲＰＣ（ファルマシアＨＲ１６／１０）による逆相ＦＰＬＣ：透析 されたフラクションを４８０００ｇで１０分間遠心分離し、透明な上清（９ｊＩ ｇ蛋白質）をカラムに移した。 緩衝液Ａ：０゜１％トリフルオロ酢酸、水中、緩衝液Ｂ：０．１％トリフルオロ 酢酸、アセトニトリル中、フラクション・サイズ：　２　＊（１，流速２舷／分 、勾配：４５分で５−６０％。 Ｇ−ＴｓＦを含むフラクション（フラクション４３および４４）を免疫プロッテ ィングによりチェックし、マージし、担体として５肩２のマンニトールを与え、 凍結乾燥した。 ４）モノＳ（ファルマシアＨＲ１０／１０）によるカチオン交換ＦＰＬＣ：凍結 乾燥生成物を２＋１７の緩衝液Ａ（２５＋ａＭの蟻酸アンモニウムｐＨ４，０， ５０％２−プロパツール）に溶がし、カラムに移した。 緩衝液Ｂ：５００ｍＭのＮ　ａ　Ｃ１２ｓ緩衝液Ａ中、フラクション・サイズ： 　１　ｍＱ、流速：１１１２／分、勾配−６０分で０−１００％。 銀染色後、Ｇ−ＴｓＦ含有フラクションを５ＤＳ−ＰＡＧＥで測定した（第９図 ）。フラクション３１および３２（１７５ｍＭのにＮａＣｌ２より溶離、約８μ ９の蛋白質）を１＋９のマンニットを用いて凍結乾燥した。 ５）Ｐｒｏ−ＲＰＣ（ファルマシアＨＲ５／２）による逆相ＦＰＬＣ：凍結乾燥 生成物を１ｘＱの緩衝液Ａ（０，１％トリフルオロ酢酸、水中）に溶かし、カラ ムに移した。 緩衝液Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸、アセトニトリル中、フラクション・サイ ズ＋　１　ｙＱｓ流速：　１　ｘ（１量分、勾配＝４５分で５−６０％緩衝液Ｂ ０ ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびアリコートの銀染色によりフラクションの特徴を明らか にする。３６％緩衝液Ｂにおいて溶離するフラクションから得られた材料（約１ μこの蛋白質）をアミノ末端配列決定に使用する。 ６）アミノ末端配列決定＝５）段階のフラクション２６から得られた８００μＱ を、アプライド・バイオシステムズ・ガスーフェーズーシークエネータ−（ラン １５５．８７　０５　１５）ガラスフィルター上に直接移した。製造会社の使用 説明書に従い、減成およびアミノ酸同定を行つた。結果（Ａｌａ−Ｌｅｕ−ブラ ンク−Ａｌａ−＾１ａ−Ｔｙｒ−ブランクーＰｈｅ−ブランク−Ａｓｎ）は、エ シェリヒア・コリにおいて発現された組換えＧ−ＴｓＦの同定および正確なアミ ノ末端配列を立証する。 ７）４）段階のフラクション３１および３２のアリコートを胸腺細胞増殖検定（ ５，１，７，参照）において試験すると、約１０−’Ｍの濃度でしか半最大阻害 が観察されなかったが、阻害活性を存することが示された（第１０図参照）。こ れは、小フラクシジンのモノマーＧ−ＴｓＦのみが自発的に生物活性２量体（ダ イマー）を形成し得ることを示している。 ６゜ すなわち本発明は、さらに進んだ研究および治療適用に用いる組換えＧ−ＴｓＦ の大量生産を可能にするものである。 明らかにＧ−ＴｓＦは、その免疫抑制作用に加えて、多くのタイプの細胞におい て増殖、分化および他の機能を制御する多機能性ペプチドである。 Ｇ−ＴｓＦは、主として例えば腫よう、移植、自己免疫、オステオポローシス、 組織損傷および炎症状態における免疫抑制剤、創傷治癒剤、骨形成剤および抗炎 症剤としてＴＧＰ−β２、Ｃ！　Ｆ−ＢおよびＧ−ＴｓＦに関して「１．従来の 技術」の部分で挙げた適応症において有用である。 因子は主に約２５ｋｄの２量体として生物活性である。 免疫抑制活性は、例えばインビトロで胸腺細胞のレクチン刺激性増殖の抑制およ びネズミ抗原特異的Ｔヘルパー細胞のインターロイキン−２−依存性増殖の抑制 により測定され得る。インビボ検定は、例えばアロ反応性細胞溶解Ｔ−細胞モデ ルおよび脳を髄炎モデル［ヘフェナイダー等、［ジャーナル・オン・イミュノロ ジーＪ、１３０巻（１９８３年）２２２−２２７頁およびベンーヌン等、「ジャ ーナル・オン・イミュノロジー」、１２９巻（１９８２年）９１８−９１９頁に 記載］において実施され得る。別の試験モデルとしては、サンドのＥＰ１５９２ ８９に記載されたものがある。Ｇ−ＴｓＦはＩＬ−２−依存段階を含む、Ｔ−細 胞における早期活性化機構を阻害する。 この活性は、臓器移植から自己免疫疾患（例、慢性多発関節炎および免疫依存性 脳炎）まで多くの適応症におけるひと免疫系の制御に有用である。 すなわち、１０−１１Ｍの濃度（モノマーに基づく）により、コンカナバリン− Ａ−誘発性胸腺細胞増殖およびインターロイキン−２−誘発性Ｔ−ヘルパー細胞 増殖の半最大阻害が起こる（実施例参照）。 さらに、Ｇ−ＴｓＦは結合組織形成を促進し、繊維形成および血管形成に導く。 すなわち、それは、外傷、火傷、手術または老化が原因の皮膚病変の処置におい て有用である。Ｇ−ＴｓＦはまた、そのコラーゲン形成促進能力により、骨マト リックスのコラーゲンおよび他の成分の不十分な形成が病因となる、例えばオス テオポローシスの処置にも有用である。 上記組織形成活性は、公知試験モデル、例えばラット創傷治癒検定（スポーフ等 、「サイエンス」２１９巻［１９８３年コ１３２９−１３３０頁）およびラット 筋肉細胞誘発検定（セイエジン等、ｒＰＮＡＳ」、８２巻［１９８５年コ２２６ ７−２２７１頁）において示され得る。 さらに興味深い適用例としては、皮膚移植ドナ一部位、角膜損傷、床ずれおよび 糖尿病性潰瘍の処置におけるＧ−ＴｓＦの使用がある。 癌の治療における使用可能性までも予想され得る。 さらに、成熟および前駆物質Ｇ−ＴｓＦの全配列の知識により、修飾された、例 えば成熟生成物の特性を凌ぐ改善された特性を育する組換えＧ−ＴｓＦ誘導体の 製造が可能となる。 前駆物質部分自体がそれ自体の有益な薬理活性を有することば全く可能である。 上記適応症の場合、適当な用量は、勿論例えば使用されるＧ−ＴｓＦ、宿主、投 与方法並びに処置される状態の性質および重さにより異なる。しかしながら、一 般には、動物体重１にｇ当たり約０，３μ９〜約１５μ９の一日用量で動物にお ける満足すべき結果が得られるものとされている。大型は乳類、例えばひとの場 合、指示−日用看は、約２０μ９〜約１０００μ２、例えば５０μ９〜５００μ ２の範囲の成熟形態Ｇ−ＴｓＦであり、好適には例えば１日４回以下の分割用量 で投与される。 Ｇ−ＴｓＦはペプチドにおける任意の常用経路により、特に例えば軟膏もしくは 懸濁液の形で局所的、または非経口的注射もしくは注入の形で全身的に投与され 得る。 また本発明は、少なくとも１種の医薬用担体または希釈剤と共にＧ−ＴｓＦを含 有する医薬組成物を提供する。かかる組成物は常法で製造され得る。単位用量形 態は、例えば約５μ９〜約５００μ？のＧ−ＴｓＦを含む。 Ｇ−ＴｓＦにとって特に好ましい適応症は、創傷治癒、内部損傷の両表面、オス テオポローシス、臓器移植および自己免疫疾患である。 Ｇ−ＴｓＦは、活性剤、例えばＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ（表皮成長因子 ）または他の成長および分化因子と組合わされ得る。存在する活性剤の量は、受 容者に投与される活性化組成物中に存在するＧ−ＴｓＦの量に直接的に左右され る。 ７、略語 ＣＨＯチャイニーズハムスター卵巣 ＣＩ　Ｆ−Ｂ　軟骨誘導因子 ＤＭＥＭ　ダルベツコ修飾イーグル培地ＥＤＴＡ　エチレンジアミン四酢酸 ＥＧＴＡ　エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ、Ｎ 、Ｎ’、Ｎ’−四酢酸 ＦＰＬＣ（商標）高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ファルマシア） Ｇ−ＴｓＦ　神経膠芽腫由来Ｔ細胞サプレッサー因子’Ｈ−Ｔｄｒ　）リチウム 化チミジン Ｉ　Ｌ−２インターロイキン−２ Ｍｌ５　ミュ　ラー抑制物質 ＮＥＴ　７５０ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０ｍ１　）リスＨＣ）（ ｐＨ７，５） ＰＡＧＥ　ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＰＢＳ　リンｆｌｉＭ衝液生理食塩 液：　８ｇ／Ｉ　ＮａＣ！。 ０．２ｇ／Ｉ　ＫＣＩ、１．１５ｇ／Ｉ　Ｎａ１ＨＰＯｔ、０．２ｇ／Ｉ　ＫＨ ２ＰＯ４ ５ＤＳ　ドデシル硫酸ナトリウム ＴＢ３　１０ｍＭ　）リスＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、１４０ｍＭａＣＩ ＴＥ　１０ｍＭ　）リスＭＣＩ　（ｐＨ７，５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡＴＥＮ　１ ００ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ）リスＨＣＩ（ｐＨ７，５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ ＴＥＳ　１０ｍＭ　トリスＨＣＩ　（ＰＨ７，５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ。 ０．２％５ＤＳ ＴＧＦ−β　腫瘍増殖　因子β（ＴＧＦ−β１）ＴＧＦ−β１　腫瘍増殖　因子 βＩ ＴＧＦ−β２　腫瘍増殖　因子β２ 第２ｂ図：　配列決定ストラテジー プロテアーゼ開裂部位 配列決定領域 第２ｃ図：　広二工５ＦｃＤＮへ９９居に４び部分制限エンドヌクレアーゼ地内 第３ａ図：　ＣＨＯ−およびＣＯ３−細胞形質発現ベクターＳＶ４０　Ｐｏ１ｙ （Ａ） 第３ｂ図：　ＣＨＯ−およびＣＯ５−細胞における５ＵＰ４０ｃ　ＮＡによる診 鼠良民ズｉ玉ｌ上 開始点　Ｔｉｃ　ＰＯＩＹ（Ａ） Ｐｏｌｙ（Ａ） トコ 第７ａ図：　ラムダ・プロモータに基づくエシェリヒア・コリにおけるＧ−Ｔｓ ＦＰ。 第７ｂ図：　形質発現プラスミドｐｐ、Ｓｌ二」Ｕ月−ししニしユ延免匙８［１ ｆｆｌ：　エシェリヒア・コリからＯ４ｌ濃込体Ｇ−ＴｓＦの形質発現および積 弊時間　分画番号 第９図：　エシェリヒア・コリからの組換え体Ｇ−ＴｓＦによる胸腺細胞増殖抑 制゛ 第１０図：　ＣＨＯ細胞による卵換え体Ｇ−ＴｓＦの形質発現の立証−←　１２ ．５　ｋｄ −ＴｓＦ ３Ｈ−丁ｄｒ取り込み（対照の％） 国際調査報告 −ｍａｅｌａ帥−叢中ｕ軸　ＰＣＴ／ＥＰ　８フ１００７１６−１−中−＾ｍＣ −ｍ、　ＰＣＴ／ＥＰ　８フ１００フ１６国際調査報告 ＥＰ　８７００７１６ Ｓ＾　２０１２５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ひとＧ−ＴｓＦ様活性を有する実質的に純粋形態の蛋白質。 （２）実質的に純粋なひとＧ−ＴｓＰ。 （３）常に組換えＤＮＡ技術により製造されるＧ−ＴｓＦ様活性を有する蛋白質 。 （４）組換えＧ−ＴｓＦ。 （５）組換えほ乳類Ｇ−ＴｓＦ。 （６）ひと粗換えＣ−ＴｓＦ。 （７）組換えＧ−ＴｓＦ前駆物質。 （８）組換えＧ−ＴｓＦ前駆物質部分。 （９）組換え成熟Ｇ−ＴｓＦ。 （１０）第２ｄ図に示された全アミノ酸配列を有する蛋白質。 （１１）第２ｄ図において矢印の前に示されたアミノ酸配列を有する蛋白質。 （１２）第２ｄ図において矢印の後に示されたアミノ酸配列を有する蛋白質。 （１３）請求項１〜１２のいずれか１項に記載された蛋白質の、対立遺伝子また は変異体形態。 （１４）請求項１〜１２のいずれか１項に記載された蛋白質の、対立遺伝子変異 体、または主たる機能および構造特性を変えること無く活性もしくは生塵性を高 めるための点突然変異もしくは一層大きな修飾により得られた変異体。 （１５）請求項１〜１２のいずれか１項記載の蛋白質の欠失、挿入または置換突 然変異体。 （１６）グリコシル化形態である、請求項１〜１５のいずれか１項記載の蛋白質 。 （１７）非グリコシル化形熊である、請求項１〜１５のいずれか１項記載の蛋白 質。 （１８）２量体形である、請求項１〜１７のいずれか１項記載の蛋白質。 （１９）アミノ酸における成熟配列の開始点から１６位にＣｙｓの代わりにＩｌ ｅおよび／または２５位にＬｙｓの代わりにＶａｌを有する請求項１０または１ ２記載の蛋白質。 （２０）常にＣ−ＴｓＦ前駆物質部分を用いて製造される組換え成熟Ｇ−ＴｓＦ 。 （２１）メチオニン残基が先行する成熟Ｇ−ＴｓＦ蛋白質。 （２２）あり得るグリコシル化を無視して、１２３２０ダルトンの成熟モノマー 単位分子量を有する請求項１〜２１のいずれか１項記載の蛋白質。 （２３）あり得るグリコシル化を無視して、４５５４０のモノマー前駆物質分子 量を有する請求項１〜２１のいずれか１項記載の蛋白質。 （２４）少なくとも５×１０７単位／ｍｇの胸腺細胞増殖検定における比活性を 有する、請求項１〜２３のいずれか１項記載の蛋白質。 （２５）第２ｄ図において矢印の後に示されたアミノ酸配列と７１％を越えるア ミノ酸配列相似性を有する、請求項１〜２４のいずれか１項記載の成熟蛋白質。 （２６）第２ｄ図に示された全アミノ酸配列と３０％を越えるアミノ酸配列相似 性を有する、請求項１〜２４のいずれか１項記載の前駆体蛋白質。 （２７）治療用途を存する請求項１〜２６のいずれか１項記載の蛋白質。 （２８）Ｇ−ＴｓＦ様活性を有する蛋白質の組換えＤＮＡ技術による製造方法で あって、前記蛋白質をコードする遺伝子により形質転換した宿主細胞から発現し た蛋白質を回収することを含む方法。 （２９）ａ）Ｇ−ＴｓＦをコード化する核酸を含むベクターの組立、ｂ）前記ベ クターによる異種宿主細胞の形質転換、ｃ）形質転換した宿主細胞の培養、およ びｄ）形質発現した蛋白質の培養からの回収から成る、Ｇ−ＴｓＦ様活性を有す る蛋白質の製造に関する請求項２８記載の方法。 （３０）折りたたみおよび蛋白質加水分解工程において不可欠であるＧ−ＴｓＦ 前駆物質またはＧ−ＴｓＦ前駆物質部分の前合成を介する生物活性２量体Ｇ−Ｔ ｓＦの製造方法。 （３１）好ましくはモノ−Ｓ（商標）によるカチオン交換クロマトグラフィー段 階を含む、請求項１または２記載の蛋白質の製造方法。 （３２）ヒドロキシルアパタイトおよびＰｒｏ−ＲＰＣ（商標）によるクロマト グラフィー、モノ−Ｓ（商標）によるカチオン交換クロマトグラフィー並びにＰ ｒｏ−ＲＰＣ（商標）による逆相クロマトグラフィーを含む、請求項３１記載の 方法。 （３３）ａ）神経こう芽腫細胞のようなＧ−ＴｓＦの天然供給源から得られた細 胞の上清の濃縮およびダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ）、 ｂ）ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィー、ｃ）溶離剤としてトリフル オロ酢酸／アセトニトリル（２×）を用いたＰｒｏ−ＲＰＣ（商標）逆相クロマ トグラフィー、ｄ）好ましくはモノ−Ｓ（商標）によるカチオン交換クロマトグ ラフィー、お上び ｅ）溶離剤としてトリフルオロ詐酸／２−プロパノールを用いたＰｒｏ−ＲＰＣ （商標）逆相クロマトグラフィーから成る、請求項３２記載の方法。 （３４）請求項１〜２７のいずれか１項記記載の蛋白質をコードするｃＤＮＡ。 （３５）第２ｄ図に示されたヌクレオチド配列を有する請求項３４記載のｃＤＮ Ａ。 （３６）第２ｄ図において矢印の前に示されたヌクレオチド配列を有する請求項 ３５記載のｃＤＮＡ。 （３７）第２ｄ図において矢印の後に示されたヌクレオチド配列を有する請求項 ３５記載のｃＤＮＡ。 （３８）請求項３４〜３７のいずれか１項記載の核酸とハイブリダイゼーション し得、Ｇ−ＴｓＦ様活性を有する蛋白質をコードし得るｃＤＮＡ、または前記核 酸に相補的な鎖とハイブリダイゼーションし得るｃＤＮＡ。 （３９）蛋白質をコード化する核酸を含む請求項３〜２７のいずれか１項記載の 組換え蛋白質の形質発現に用いられるベクター。 （４０）真核生物の発現に用いられる請求項３９記載のベクター。 （４１）ＣＨＯ細胞における発現に用いられる請求項３９記載のベクタ（４２） ｐ９１０２３（Ｂ）−ＳＵＰ２５−１である、請求項３９記載のベクター。 （４３）ｐＸＭＴ３．ｎｅｏ７／ＳＵＰ４０−１である、請求項３９記載のベク ター。 （４４）原核生物の形質発現に用いられる請求項３９記載のベクター。 （４５）エシエリヒア・コリにおける形質発現に用いられる請求項３９記載のベ クター。 （４６）ｐＰＬＳ１−ＳＵＰ２５−１である、請求項３９記載のベクター。 （４７）請求項３〜２７のいずれか１項記載の蛋白質をコードする核酸により形 質転換されたセルライン。 （４８）ＣＨＯセルラインである、請求項４７記載のセルライン。 （４９）ＣＨＯ／ＳＵＰ４０−１／１０ＭＴＸである、請求項４７記載のセルラ イン。 （５０）請求項１〜２７のいずれか１項記載の蛋白質を医薬的に許容し得る担体 または希釈剤と共に含有する医薬組成物。 （５１）処置を必要とする対象に、請求項１〜２７のいずれか１項記載の蛋白質 の治原有効量を投与することを含む処置方法。 （５２）治療における請求項１〜２７のいずれか１項記載の蛋白質の用途。 （５３）免疫抑制、創傷治癒、骨形成または炎症における請求項５２記載の用途 。 （５４）臓器移植または自己免疫症状における請求項５２記載の用途。 （５５）オステオポローシスまたは組織損傷症状における請求項５２記載の用途 。 （５６）外傷、火傷、外科手術または老化が原因の皮膚病変の処置こおける請求 項５２記載の用途。 （５７）癌治療における請求項５２記載の用途。 （５８）Ｇ−ＴｓＦ誘導体の製造における、請求項１〜２６のいずれか１項記載 の蛋白質の用途、または請求項３４〜３８のいずれか１項記載のｃＤＮＡの用途 、または請求項３９〜４６のいずれか１項記載のベクターの用途、または請求項 ４７〜４９のいずれか１項記載の細胞の用途。