JPH10185922A - 試料中の多数の被検物質を検出するための装置および方法 - Google Patents
試料中の多数の被検物質を検出するための装置および方法Info
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- JPH10185922A JPH10185922A JP9333775A JP33377597A JPH10185922A JP H10185922 A JPH10185922 A JP H10185922A JP 9333775 A JP9333775 A JP 9333775A JP 33377597 A JP33377597 A JP 33377597A JP H10185922 A JPH10185922 A JP H10185922A
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- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 試料中の標的被検体を検出するための方法に
使用しうる装置を提供すること。 【解決手段】 本発明は、各々が標的被検体が連結され
るための特異的な捕捉プローブを持つ特異的結合要素の
直線状配列を含んでいる管から各々が構成される装置を
特徴とする。
使用しうる装置を提供すること。 【解決手段】 本発明は、各々が標的被検体が連結され
るための特異的な捕捉プローブを持つ特異的結合要素の
直線状配列を含んでいる管から各々が構成される装置を
特徴とする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は試料中の多被検体を
検出するための装置および方法に関する。
検出するための装置および方法に関する。
【０００２】本発明はＡｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒａｍプロジェクト番号９５−０８
−００１２および商務省により与えられた協力同意番号
７０ＮＡＮＢ５Ｈ１１０８の下で一部米国政府により支
援され、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ
Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに
より管理されている。該政府は本発明にある種の権利を
持つ。
ｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒａｍプロジェクト番号９５−０８
−００１２および商務省により与えられた協力同意番号
７０ＮＡＮＢ５Ｈ１１０８の下で一部米国政府により支
援され、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ
Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに
より管理されている。該政府は本発明にある種の権利を
持つ。
【０００３】
【従来の技術】試料中に痕跡量で存在する被検体の検出
は感度が高くおよび特異的な方法を必要とする。さもな
くば、そのような被検体の検出は試料中に高い濃度で見
いだされる物質の存在により覆い隠されてしまうであろ
う。もし被検体が検出を容易にする物理的または化学的
特性を持っていない場合、この問題は倍加される。
は感度が高くおよび特異的な方法を必要とする。さもな
くば、そのような被検体の検出は試料中に高い濃度で見
いだされる物質の存在により覆い隠されてしまうであろ
う。もし被検体が検出を容易にする物理的または化学的
特性を持っていない場合、この問題は倍加される。
【０００４】ゲノセンサーとは試料中の標的核酸の検出
を容易にするプローブの群または組を含んでいる装置で
ある。例えば、Ｂｅａｔｔｉｅら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅ
ｍ．４１（５）：７００−７０６，１９９６）は、核酸
プローブの３ｘ３マトリックスを含む単層シリコンウェ
ハーを含んでいる通過式ゲノセンサーを記載している。
プローブが結合できる標的核酸を含んでいると疑われる
試料は、弱い真空または吸引を与えることによりゲノセ
ンサーを通過させる。
を容易にするプローブの群または組を含んでいる装置で
ある。例えば、Ｂｅａｔｔｉｅら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅ
ｍ．４１（５）：７００−７０６，１９９６）は、核酸
プローブの３ｘ３マトリックスを含む単層シリコンウェ
ハーを含んでいる通過式ゲノセンサーを記載している。
プローブが結合できる標的核酸を含んでいると疑われる
試料は、弱い真空または吸引を与えることによりゲノセ
ンサーを通過させる。
【０００５】試料中の標的分子を検出するために使用さ
れる別の装置はディップスティックであり、それは抗体
のようなプローブを含む細長いストリップである。ディ
ップスティックはプローブに結合する分子を含んでいる
と疑われる試料内へ浸される。例えば、Ｕｒｎｏｖｉｔ
ｚ（米国特許第５，４４７，８３７号、１９９５年）は
試料中の異なった抗原または抗体存在の検出に使用する
ために、対応する異なった抗体または抗原を各々含んで
いる分離された領域を含むディップスティックを記載し
ている。
れる別の装置はディップスティックであり、それは抗体
のようなプローブを含む細長いストリップである。ディ
ップスティックはプローブに結合する分子を含んでいる
と疑われる試料内へ浸される。例えば、Ｕｒｎｏｖｉｔ
ｚ（米国特許第５，４４７，８３７号、１９９５年）は
試料中の異なった抗原または抗体存在の検出に使用する
ために、対応する異なった抗体または抗原を各々含んで
いる分離された領域を含むディップスティックを記載し
ている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は試料中の多被
検体を検出するための装置および方法を提供することを
目的とする。
検体を検出するための装置および方法を提供することを
目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、そこに結合す
る異なった被検体に特異的である結合因子またはプロー
ブを各々有する結合要素の直線状配列を含む容器または
チャンネル（例えば管）を各々が含むアッセイ装置を提
供する。本装置は試料中の多被検体の同時分析のための
方法に使用できる。これらの方法を使用した場合、バー
コードに似ている信号の直線状配列が装置内で発生す
る。
る異なった被検体に特異的である結合因子またはプロー
ブを各々有する結合要素の直線状配列を含む容器または
チャンネル（例えば管）を各々が含むアッセイ装置を提
供する。本装置は試料中の多被検体の同時分析のための
方法に使用できる。これらの方法を使用した場合、バー
コードに似ている信号の直線状配列が装置内で発生す
る。
【０００８】従って、一つの態様において、本発明は試
料から被検体（例えば、核酸、ポリペプチド、炭水化
物、脂質、代謝物または薬剤）を単離するためのアッセ
イ装置を特徴としている。アッセイ装置は、対応する特
異的成分が結合する異なった結合因子に各々が連結され
ている結合要素の直線状配列を含んでいる、キャピラリ
ー管のような管から構成されている。アッセイ装置中の
結合要素の各々は、結合要素の全周囲に沿って管の内部
表面に密閉的に接触するように配置されている。結合要
素は別の要素と隣接するように配置されていてもよく、
または異なった結合因子を欠く領域により分離されてい
てもよい。
料から被検体（例えば、核酸、ポリペプチド、炭水化
物、脂質、代謝物または薬剤）を単離するためのアッセ
イ装置を特徴としている。アッセイ装置は、対応する特
異的成分が結合する異なった結合因子に各々が連結され
ている結合要素の直線状配列を含んでいる、キャピラリ
ー管のような管から構成されている。アッセイ装置中の
結合要素の各々は、結合要素の全周囲に沿って管の内部
表面に密閉的に接触するように配置されている。結合要
素は別の要素と隣接するように配置されていてもよく、
または異なった結合因子を欠く領域により分離されてい
てもよい。
【０００９】結合要素の少なくとも一つの異なった結合
因子は捕捉プローブから構成されていてもよく、その場
合、対応する特異的成分は標的被検体である。もしく
は、結合要素の少なくとも一つの異なった結合因子は特
異的結合対の一つの構成物から構成されていてもよく、
その場合、対応する特異的成分は特異的結合対の他の構
成物および被検体に結合する捕捉プローブである。
因子は捕捉プローブから構成されていてもよく、その場
合、対応する特異的成分は標的被検体である。もしく
は、結合要素の少なくとも一つの異なった結合因子は特
異的結合対の一つの構成物から構成されていてもよく、
その場合、対応する特異的成分は特異的結合対の他の構
成物および被検体に結合する捕捉プローブである。
【００１０】結合要素の少なくとも一つの異なった結合
因子は核酸、例えば、自己触媒的に複製可能な核酸、ま
たはポリペプチドの一部から構成されていてもよい。
因子は核酸、例えば、自己触媒的に複製可能な核酸、ま
たはポリペプチドの一部から構成されていてもよい。
【００１１】第二の態様において、本発明は試料中の被
検体（例えば、核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂質、
代謝物または薬剤）の存在を検出するための方法を特徴
とする。この方法において、被検体は検出可能な標識で
標識されており（例えば、検出プローブにより提供され
る検出可能な標識、それは核酸でもポリペプチドでもよ
い）、捕捉プローブ（例えば、核酸でもポリペプチドで
もよい）と接触して本発明の装置中の特異的結合要素上
で被検体−捕捉プローブ複合体を形成する。結合要素上
の検出可能標識が試料中の被検体の存在の尺度として検
出できるように複合体中の被検体に特異的に結合しない
検出可能標識は続いて除去される。好適には、複合体中
で被検体に特異的に結合されていない実質的にすべての
検出可能標識が装置から除去される。例えば、好適には
少なくとも５０％、またはより好適には少なくとも７０
％、８０％、９０％、９５％または１００％の非結合標
識が除去される。
検体（例えば、核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂質、
代謝物または薬剤）の存在を検出するための方法を特徴
とする。この方法において、被検体は検出可能な標識で
標識されており（例えば、検出プローブにより提供され
る検出可能な標識、それは核酸でもポリペプチドでもよ
い）、捕捉プローブ（例えば、核酸でもポリペプチドで
もよい）と接触して本発明の装置中の特異的結合要素上
で被検体−捕捉プローブ複合体を形成する。結合要素上
の検出可能標識が試料中の被検体の存在の尺度として検
出できるように複合体中の被検体に特異的に結合しない
検出可能標識は続いて除去される。好適には、複合体中
で被検体に特異的に結合されていない実質的にすべての
検出可能標識が装置から除去される。例えば、好適には
少なくとも５０％、またはより好適には少なくとも７０
％、８０％、９０％、９５％または１００％の非結合標
識が除去される。
【００１２】異なった結合因子は捕捉プローブから構成
されることができ、接触工程は被検体を１回またはそれ
以上装置を通過させることにより実施できる。被検体は
例えば、機械的ポンピングまたは被検体に電界を印加す
ることにより装置内を通過させることができる。標識工
程および接触工程は同時に実施してもよく、あるいは標
識工程の前に接触工程を実施することもできる。
されることができ、接触工程は被検体を１回またはそれ
以上装置を通過させることにより実施できる。被検体は
例えば、機械的ポンピングまたは被検体に電界を印加す
ることにより装置内を通過させることができる。標識工
程および接触工程は同時に実施してもよく、あるいは標
識工程の前に接触工程を実施することもできる。
【００１３】本発明の方法の一つの例において、被検体
は核酸からなり、検出プローブは一つの末端上の自己触
媒的複製可能核酸の一部および他の末端上の第一の被検
体結合要素からなり、そして捕捉プローブは末端上の自
己触媒的複製可能核酸の残りおよび他の末端上の第二の
被検体結合要素からなる。第一および第二の被検体結合
要素は核酸被検体中の隣接するヌクレオチドセグメント
に結合する。この方法は（１）第一および第二の被検体
結合要素を互いに結合させて複製鋳型を形成させる、お
よび（２）鋳型を複製して検出可能な信号を発生させる
工程を含んでいる。
は核酸からなり、検出プローブは一つの末端上の自己触
媒的複製可能核酸の一部および他の末端上の第一の被検
体結合要素からなり、そして捕捉プローブは末端上の自
己触媒的複製可能核酸の残りおよび他の末端上の第二の
被検体結合要素からなる。第一および第二の被検体結合
要素は核酸被検体中の隣接するヌクレオチドセグメント
に結合する。この方法は（１）第一および第二の被検体
結合要素を互いに結合させて複製鋳型を形成させる、お
よび（２）鋳型を複製して検出可能な信号を発生させる
工程を含んでいる。
【００１４】結合要素の異なった結合因子は、捕捉プロ
ーブであるというより、特異的結合対の一員であること
ができ、別々の捕捉プローブは特異的結合対の他の構成
物を含むことができる。接触工程は例えば、装置を通し
て試料および捕捉プローブを通過させることにより実施
できる。
ーブであるというより、特異的結合対の一員であること
ができ、別々の捕捉プローブは特異的結合対の他の構成
物を含むことができる。接触工程は例えば、装置を通し
て試料および捕捉プローブを通過させることにより実施
できる。
【００１５】本発明はまた、本発明のアッセイ装置と液
体連絡を有する能動液体輸送を提供する手段を含むアッ
セイシステムも提供する。本発明の装置と液体連絡を有
する液体運搬装置を含むアッセイシステムもまた本発明
に含まれる。
体連絡を有する能動液体輸送を提供する手段を含むアッ
セイシステムも提供する。本発明の装置と液体連絡を有
する液体運搬装置を含むアッセイシステムもまた本発明
に含まれる。
【００１６】試料から被検体を単離するためのアッセイ
装置もまた本発明に含まれ、本装置は、内部内腔表面を
持ち、結合要素の直線状配列を含むチャンネル（例え
ば、管またはガラス表面のような表面内へエッチングさ
れたチャンネル）を含んでいる。この装置中の各々の結
合要素は、対応する特異的成分が結合する別個の結合因
子を含んでいる。加えて、この装置中の各々の結合要素
はチャンネルの別個の領域の内腔表面を含んでいる。こ
の装置内の別個の結合因子の少なくとも一つは、フォト
リソグラフィーまたは化学的カップリングのような方法
により結合要素の少なくとも一つに結合されている（下
記参照）。
装置もまた本発明に含まれ、本装置は、内部内腔表面を
持ち、結合要素の直線状配列を含むチャンネル（例え
ば、管またはガラス表面のような表面内へエッチングさ
れたチャンネル）を含んでいる。この装置中の各々の結
合要素は、対応する特異的成分が結合する別個の結合因
子を含んでいる。加えて、この装置中の各々の結合要素
はチャンネルの別個の領域の内腔表面を含んでいる。こ
の装置内の別個の結合因子の少なくとも一つは、フォト
リソグラフィーまたは化学的カップリングのような方法
により結合要素の少なくとも一つに結合されている（下
記参照）。
【００１７】本発明は、試料中の多被検体の高感度、微
量での同時分析を可能とするためいくつかの利点を提供
する。検出された被検体は装置上で物理的に分離される
ので、異なった被検体に特異的である検出プローブ上に
別個の標識を使用する必要がない。本発明の方法はま
た、少量の試料および試薬容量しか必要とせず（必要に
応じ、大容量でも使用できる）、迅速でありかつ自動化
に容易に適用できる。本装置のかなめの特色は、希薄な
溶液から被検体を本発明の装置内の小さな捕捉ゾーン
（すなわち、結合要素）内へ単離および濃縮する能力で
あり、それは物理的増幅を意味している。このことは感
度を上昇させ、いくつかの応用でのポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）の使用によるような酵素的増幅の必要を回
避する。
量での同時分析を可能とするためいくつかの利点を提供
する。検出された被検体は装置上で物理的に分離される
ので、異なった被検体に特異的である検出プローブ上に
別個の標識を使用する必要がない。本発明の方法はま
た、少量の試料および試薬容量しか必要とせず（必要に
応じ、大容量でも使用できる）、迅速でありかつ自動化
に容易に適用できる。本装置のかなめの特色は、希薄な
溶液から被検体を本発明の装置内の小さな捕捉ゾーン
（すなわち、結合要素）内へ単離および濃縮する能力で
あり、それは物理的増幅を意味している。このことは感
度を上昇させ、いくつかの応用でのポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）の使用によるような酵素的増幅の必要を回
避する。
【００１８】ある実施態様において、本発明の装置およ
び方法で使用されるプローブは核酸である。一対の核酸
分子（または単一核酸分子内の二つの領域）は、それら
の間で塩基対相互作用によりデュープレックスを形成す
る場合、互いに”ハイブリダイズする”と称される。本
分野で知られているように、核酸対間のハイブリダイゼ
ーションはハイブリダイズする領域間の完全な相補性は
必要とせず、使用される条件下でデュープレックスを維
持するために十分なレベルの塩基対生成があればよい。
び方法で使用されるプローブは核酸である。一対の核酸
分子（または単一核酸分子内の二つの領域）は、それら
の間で塩基対相互作用によりデュープレックスを形成す
る場合、互いに”ハイブリダイズする”と称される。本
分野で知られているように、核酸対間のハイブリダイゼ
ーションはハイブリダイズする領域間の完全な相補性は
必要とせず、使用される条件下でデュープレックスを維
持するために十分なレベルの塩基対生成があればよい。
【００１９】ハイブリダイゼーション反応は典型的に
は”ストリンジェント条件”下、例えば、特異的および
非特異的相互作用が起こり得る低から中ストリンジェン
シー条件下で実施される。ハイブリダイゼーション後、
非特異的結合を除去するためにより高いストリンジェン
シー条件下で洗浄が行われる。本分野では既知のよう
に、最適な洗浄条件は経験的に決定されるであろう（例
えば、ストリンジェンシーを徐々に増加させることによ
り）。ストリンジェンシーに影響を及ぼすために変化で
きる条件パラメーターには、例えば、温度および塩濃度
が含まれる。一般に、塩濃度をより低くし、および温度
をより高くするとストリンジェンシーはより高くなる。
例えば、ハイブリダイゼーション溶液と等しいまたはよ
り低い塩濃度を含む溶液を用いて、低温（例えば、室
温）から洗浄を開始することができる。続いての洗浄
は、同一の塩濃度を持ち、段々に温かい溶液を用いて実
施できる。もしくは、洗浄工程では温度は保ちながら塩
濃度をより低くするか、または塩濃度をより低くしかつ
温度を上昇させることができる。そのような標準的変化
は本分野では既知である。ストリンジェンシーに影響す
るために変更できる他のパラメーターには、例えば、ホ
ルムアミドのような不安定化剤の使用が含まれる。
は”ストリンジェント条件”下、例えば、特異的および
非特異的相互作用が起こり得る低から中ストリンジェン
シー条件下で実施される。ハイブリダイゼーション後、
非特異的結合を除去するためにより高いストリンジェン
シー条件下で洗浄が行われる。本分野では既知のよう
に、最適な洗浄条件は経験的に決定されるであろう（例
えば、ストリンジェンシーを徐々に増加させることによ
り）。ストリンジェンシーに影響を及ぼすために変化で
きる条件パラメーターには、例えば、温度および塩濃度
が含まれる。一般に、塩濃度をより低くし、および温度
をより高くするとストリンジェンシーはより高くなる。
例えば、ハイブリダイゼーション溶液と等しいまたはよ
り低い塩濃度を含む溶液を用いて、低温（例えば、室
温）から洗浄を開始することができる。続いての洗浄
は、同一の塩濃度を持ち、段々に温かい溶液を用いて実
施できる。もしくは、洗浄工程では温度は保ちながら塩
濃度をより低くするか、または塩濃度をより低くしかつ
温度を上昇させることができる。そのような標準的変化
は本分野では既知である。ストリンジェンシーに影響す
るために変更できる他のパラメーターには、例えば、ホ
ルムアミドのような不安定化剤の使用が含まれる。
【００２０】核酸ハイブリダイゼーション反応におい
て、特定のレベルのストリンジェンシーの達成に使用さ
れる条件は、ハイブリダイズする核酸の性質に依存して
変化するであろう。例えば、核酸のハイブリダイズする
領域の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列組成（例
えば、ＧＣ ｖ ＡＴ含量）、および核酸の型（例え
ば、ＲＮＡ ｖ ＤＮＡ）をハイブリダイゼーション条
件を選択する際に考慮することができる。さらに、核酸
の一つが固定化される（例えば、フィルター上に）かど
うかも考慮される。
て、特定のレベルのストリンジェンシーの達成に使用さ
れる条件は、ハイブリダイズする核酸の性質に依存して
変化するであろう。例えば、核酸のハイブリダイズする
領域の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列組成（例
えば、ＧＣ ｖ ＡＴ含量）、および核酸の型（例え
ば、ＲＮＡ ｖ ＤＮＡ）をハイブリダイゼーション条
件を選択する際に考慮することができる。さらに、核酸
の一つが固定化される（例えば、フィルター上に）かど
うかも考慮される。
【００２１】以下にさらに詳しく説明されるように（実
施例II参照）、本発明の方法で使用できるハイブリダイ
ゼーション条件の一つの例は、３ｘＳＳＣ中、室温での
ハイブリダイゼーション、および続いての３ｘＳＳＣで
の洗浄を含んでいる。従って、この実施例においてはハ
イブリダイゼーションから洗浄までストリンジェンシー
は変化していない。以下に記載する別の実施例では（実
施例II参照）、ハイブリダイゼーションは３ｘＳＳＣ
中、室温で実施され、続いての洗浄は３ｘＳＳＣ中、以
下の温度で実施される：２５℃、４２℃、５２℃、５８
℃および７０℃。
施例II参照）、本発明の方法で使用できるハイブリダイ
ゼーション条件の一つの例は、３ｘＳＳＣ中、室温での
ハイブリダイゼーション、および続いての３ｘＳＳＣで
の洗浄を含んでいる。従って、この実施例においてはハ
イブリダイゼーションから洗浄までストリンジェンシー
は変化していない。以下に記載する別の実施例では（実
施例II参照）、ハイブリダイゼーションは３ｘＳＳＣ
中、室温で実施され、続いての洗浄は３ｘＳＳＣ中、以
下の温度で実施される：２５℃、４２℃、５２℃、５８
℃および７０℃。
【００２２】段々にストリンジェンシー条件を高くする
別の例は以下のようである：室温で２ｘＳＳＣ／０．１
％ＳＤＳ（ハイブリダイゼーション条件）；室温で０．
２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（低ストリンジェンシー条
件）；４２℃で０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（中ス
トリンジェンシー条件）；および６８℃で０．１ｘＳＳ
Ｃ（高ストリンジェンシー条件）。洗浄はこれらの条件
のただ一つ（例えば、高いストリンジェンシー条件）で
実施されるか、または各々の条件も使用できる（例え
ば、上に掲げた順序で各々１０−１５分、上に掲げた段
階の任意のものまたはすべてを繰り返して）。しかしな
がら、上に記載したように、至適の条件は含まれる特定
のハイブリダイゼーション反応に依存して変化するであ
ろうので、経験的に決定することができる。
別の例は以下のようである：室温で２ｘＳＳＣ／０．１
％ＳＤＳ（ハイブリダイゼーション条件）；室温で０．
２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（低ストリンジェンシー条
件）；４２℃で０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（中ス
トリンジェンシー条件）；および６８℃で０．１ｘＳＳ
Ｃ（高ストリンジェンシー条件）。洗浄はこれらの条件
のただ一つ（例えば、高いストリンジェンシー条件）で
実施されるか、または各々の条件も使用できる（例え
ば、上に掲げた順序で各々１０−１５分、上に掲げた段
階の任意のものまたはすべてを繰り返して）。しかしな
がら、上に記載したように、至適の条件は含まれる特定
のハイブリダイゼーション反応に依存して変化するであ
ろうので、経験的に決定することができる。
【００２３】核酸ハイブリダイゼーションと同様に、タ
ンパク質−タンパク質結合反応および非特異的結合を除
去するための続いての洗浄は、互いのタンパク質の親和
性に依存して種々の条件下で実施できる。例えば、結合
反応は生理的塩濃度を持つ緩衝液中で生じさせることが
でき、洗浄は増加した塩濃度を持つ緩衝液を用いて実施
することができる。洗浄条件のストリンジェンシーはま
た、洗浄溶液にＴＷＥＥＮ−２０TMおよびＴＲＩＴＯＮ
−ＸTMのような界面活性剤を含ませることにより高くす
ることができる。
ンパク質−タンパク質結合反応および非特異的結合を除
去するための続いての洗浄は、互いのタンパク質の親和
性に依存して種々の条件下で実施できる。例えば、結合
反応は生理的塩濃度を持つ緩衝液中で生じさせることが
でき、洗浄は増加した塩濃度を持つ緩衝液を用いて実施
することができる。洗浄条件のストリンジェンシーはま
た、洗浄溶液にＴＷＥＥＮ−２０TMおよびＴＲＩＴＯＮ
−ＸTMのような界面活性剤を含ませることにより高くす
ることができる。
【００２４】分子対の構成物（例えば、検出プローブま
たは捕捉プローブおよび標的被検体または特異的結合対
の構成物（例えば、抗体−抗原、核酸およびタンパク質
−ビタミン結合対））は、それらが他の非特異的分子よ
りも強い親和性で互いに結合する場合、互いに”特異的
に結合する”と称される。例えば、一つの抗原に対して
引き起こされた抗体はその抗原に対して非特異的な抗原
よりもより有効に結合するのでその抗原に特異的に結合
すると記述できる。同様に、核酸プローブは、それが標
的と塩基対形成相互作用により特異的デュープレックス
を形成する場合、核酸標的に特異的に結合すると記述さ
れる。
たは捕捉プローブおよび標的被検体または特異的結合対
の構成物（例えば、抗体−抗原、核酸およびタンパク質
−ビタミン結合対））は、それらが他の非特異的分子よ
りも強い親和性で互いに結合する場合、互いに”特異的
に結合する”と称される。例えば、一つの抗原に対して
引き起こされた抗体はその抗原に対して非特異的な抗原
よりもより有効に結合するのでその抗原に特異的に結合
すると記述できる。同様に、核酸プローブは、それが標
的と塩基対形成相互作用により特異的デュープレックス
を形成する場合、核酸標的に特異的に結合すると記述さ
れる。
【００２５】特に記載しない限り、本明細書で使用され
たすべての技術および科学的用語は本発明が属する分野
の当業者により共通して理解されるものと同じ意味を持
っている。本明細書に記載されたものと類似または均等
な方法および材料が本発明の実施または試験に使用でき
るが、いくつかの好適な方法および材料が以下に記載さ
れている。本明細書で述べられたすべての刊行物、特許
出願、特許および他の参照文献は全文のまま本明細書で
援用される。矛盾する場合、本明細書が調節するであろ
う。さらに、記載された材料および方法は例示のためだ
けのものであり、制限を意図しているものではない。
たすべての技術および科学的用語は本発明が属する分野
の当業者により共通して理解されるものと同じ意味を持
っている。本明細書に記載されたものと類似または均等
な方法および材料が本発明の実施または試験に使用でき
るが、いくつかの好適な方法および材料が以下に記載さ
れている。本明細書で述べられたすべての刊行物、特許
出願、特許および他の参照文献は全文のまま本明細書で
援用される。矛盾する場合、本明細書が調節するであろ
う。さらに、記載された材料および方法は例示のためだ
けのものであり、制限を意図しているものではない。
【００２６】本発明の他の特色および利点は以下の詳細
な説明および請求の範囲から明らかになるであろう。
な説明および請求の範囲から明らかになるであろう。
【００２７】
【発明の実施の形態】本発明は試料中の多標的被検体
（例えば、１００までまたはそれ以上の異なった被検
体）を検出するための装置および方法を提供する。本発
明の方法の中心的特色は標的被検体へのプローブの特異
的結合である。これは例えばサンドイッチハイブリダイ
ゼーションアッセイ（例えばＲａｎｋｉ ｅｔ．ａ
ｌ．，Ｇｅｎｅ２１：７７−８５，１９８３；米国特許
第４，４８６，５３９号（１９８４）を参照されたい）
を使用することにより実施できる。サンドイッチハイブ
リダイゼーションアッセイは捕捉プローブおよび検出プ
ローブの使用を含んでおり、それらは標的被検体に同時
に結合して捕捉プローブ−被検体−検出プローブ複合体
を形成するように設計されている。本発明の文脈におい
て、検出プローブは検出可能な標識を含んでおり、捕捉
プローブは（１）特異的結合対の第一の構成物を含んで
いるか、または（２）本発明の装置の特異的結合要素上
に固定化されている（下記参照）。これらの場合のどち
らにおいても、捕捉プローブの使用は試料成分から、な
らびに非結合検出プローブからの被検体−プローブ複合
体の精製を容易にする。
（例えば、１００までまたはそれ以上の異なった被検
体）を検出するための装置および方法を提供する。本発
明の方法の中心的特色は標的被検体へのプローブの特異
的結合である。これは例えばサンドイッチハイブリダイ
ゼーションアッセイ（例えばＲａｎｋｉ ｅｔ．ａ
ｌ．，Ｇｅｎｅ２１：７７−８５，１９８３；米国特許
第４，４８６，５３９号（１９８４）を参照されたい）
を使用することにより実施できる。サンドイッチハイブ
リダイゼーションアッセイは捕捉プローブおよび検出プ
ローブの使用を含んでおり、それらは標的被検体に同時
に結合して捕捉プローブ−被検体−検出プローブ複合体
を形成するように設計されている。本発明の文脈におい
て、検出プローブは検出可能な標識を含んでおり、捕捉
プローブは（１）特異的結合対の第一の構成物を含んで
いるか、または（２）本発明の装置の特異的結合要素上
に固定化されている（下記参照）。これらの場合のどち
らにおいても、捕捉プローブの使用は試料成分から、な
らびに非結合検出プローブからの被検体−プローブ複合
体の精製を容易にする。
【００２８】検出可能標識が検出プローブの一部として
提供されるサンドイッチハイブリダイゼーションアッセ
イに加え、標的それ自身が標識されるアッセイも使用で
きる。そのようなアッセイにおいては検出プローブは必
要とされない。例えば、本発明の装置と接触させる前ま
たは後に、標的は標識ヌクレオチド（例えば、蛍光また
は同位元素標識ヌクレオチド）存在下でＰＣＲにより増
幅できる。同様に、標的は標識ヌクレオチドを含むプラ
イマー伸長反応で標識できる。標的はまた、例えば、標
的の標識された成分（例えば、ヌクレオチドまたはアミ
ノ酸）と標的を産生する細胞とを接触させることにより
代謝的に標識することもできる。標識化した標的は、上
記のような特異的捕捉プローブに結合させることによ
り、本発明の装置の特異的結合要素上に固定化される。
検出プローブはまた、核酸捕捉プローブと被検体との間
のデュープレックス形成を測定するために挿入色素（例
えば、エチジウムブロミドまたはプロピジウムヨージ
ド）の検出が用いられる場合にも必要とされない。
提供されるサンドイッチハイブリダイゼーションアッセ
イに加え、標的それ自身が標識されるアッセイも使用で
きる。そのようなアッセイにおいては検出プローブは必
要とされない。例えば、本発明の装置と接触させる前ま
たは後に、標的は標識ヌクレオチド（例えば、蛍光また
は同位元素標識ヌクレオチド）存在下でＰＣＲにより増
幅できる。同様に、標的は標識ヌクレオチドを含むプラ
イマー伸長反応で標識できる。標的はまた、例えば、標
的の標識された成分（例えば、ヌクレオチドまたはアミ
ノ酸）と標的を産生する細胞とを接触させることにより
代謝的に標識することもできる。標識化した標的は、上
記のような特異的捕捉プローブに結合させることによ
り、本発明の装置の特異的結合要素上に固定化される。
検出プローブはまた、核酸捕捉プローブと被検体との間
のデュープレックス形成を測定するために挿入色素（例
えば、エチジウムブロミドまたはプロピジウムヨージ
ド）の検出が用いられる場合にも必要とされない。
【００２９】本発明に含まれる装置の一つの例は、各々
が結合要素上の結合因子として固定化された別個の対応
する被検体に特異的な捕捉プローブを含む結合要素の直
線状配列を含んでいる容器またはチャンネル（例えば、
キャピラリー管のような管）から構成される。この装置
は結合要素上に捕捉プローブ−被検体−検出プローブ複
合体が形成されるいくつかの方法で使用できる。好適に
は、捕捉プローブと接触する前に被検体および検出プロ
ーブが互いに接触して被検体−検出プローブ複合体が形
成される。本装置の結合要素は、例えば、機械的または
電気泳動的輸送により試料を装置内を通過させることに
より被検体−検出プローブ複合体を含む試料と接触させ
ることができる。被検体−検出プローブ複合体がその対
応する装置内の結合要素と接触すると捕捉プローブ−被
検体−検出プローブ複合体が形成される。
が結合要素上の結合因子として固定化された別個の対応
する被検体に特異的な捕捉プローブを含む結合要素の直
線状配列を含んでいる容器またはチャンネル（例えば、
キャピラリー管のような管）から構成される。この装置
は結合要素上に捕捉プローブ−被検体−検出プローブ複
合体が形成されるいくつかの方法で使用できる。好適に
は、捕捉プローブと接触する前に被検体および検出プロ
ーブが互いに接触して被検体−検出プローブ複合体が形
成される。本装置の結合要素は、例えば、機械的または
電気泳動的輸送により試料を装置内を通過させることに
より被検体−検出プローブ複合体を含む試料と接触させ
ることができる。被検体−検出プローブ複合体がその対
応する装置内の結合要素と接触すると捕捉プローブ−被
検体−検出プローブ複合体が形成される。
【００３０】本方法の変法において、捕捉プローブ−被
検体複合体が本装置の結合要素上で形成されるように、
被検体を検出プローブと接触させる前に被検体を含む試
料を本装置に適用する。続いて、被検体に特異的に結合
し検出可能な標識を含む検出プローブを結合要素上に形
成された捕捉プローブ−被検体複合体と接触させる。こ
の方法の別の変法においては、被検体を含んでいる試料
および検出プローブを個々に同時に装置と接触させる。
検体複合体が本装置の結合要素上で形成されるように、
被検体を検出プローブと接触させる前に被検体を含む試
料を本装置に適用する。続いて、被検体に特異的に結合
し検出可能な標識を含む検出プローブを結合要素上に形
成された捕捉プローブ−被検体複合体と接触させる。こ
の方法の別の変法においては、被検体を含んでいる試料
および検出プローブを個々に同時に装置と接触させる。
【００３１】必要なら、捕捉プローブとその対応する被
検体または被検体−検出プローブ複合体との間の特異的
結合の見込みを増加させるために、試料およびプローブ
を装置を多数回通過させることができる。そのような方
法が使用される場合、捕捉プローブ、被検体および検出
プローブの間の接触の順序はあまり関係がない。試料お
よびプローブを多数回装置に通すことは、例えば、両方
の末端が装置に連結された管の使用により容易にでき
る。試料およびプローブはペリスタポンプを用いて装置
および管を通して、繰り返しポンプで送ることができ
る。試料およびプローブが装置を１回だけ通過するよう
な場合、検出プローブおよび被検体を装置と接触させる
前に検出プローブ−被検体複合体を形成させておくこと
が好ましい。
検体または被検体−検出プローブ複合体との間の特異的
結合の見込みを増加させるために、試料およびプローブ
を装置を多数回通過させることができる。そのような方
法が使用される場合、捕捉プローブ、被検体および検出
プローブの間の接触の順序はあまり関係がない。試料お
よびプローブを多数回装置に通すことは、例えば、両方
の末端が装置に連結された管の使用により容易にでき
る。試料およびプローブはペリスタポンプを用いて装置
および管を通して、繰り返しポンプで送ることができ
る。試料およびプローブが装置を１回だけ通過するよう
な場合、検出プローブおよび被検体を装置と接触させる
前に検出プローブ−被検体複合体を形成させておくこと
が好ましい。
【００３２】非結合検出プローブおよび非特異的結合試
料成分は、装置の組成および結合複合体に依存して、例
えば、アッセイ装置と液体連絡があるように配置されて
いる機械式ポンプ（例えば、圧電式ポンプ装置）のよう
な能動液体輸送体、電気泳動、真空の適用またはこれら
の方法の組み合わせを使用することにより装置から除去
できる。特異的捕捉プローブに対応している装置の結合
要素上の標識の検出は、試料中の対応する被検体の存在
の尺度として使用できる。
料成分は、装置の組成および結合複合体に依存して、例
えば、アッセイ装置と液体連絡があるように配置されて
いる機械式ポンプ（例えば、圧電式ポンプ装置）のよう
な能動液体輸送体、電気泳動、真空の適用またはこれら
の方法の組み合わせを使用することにより装置から除去
できる。特異的捕捉プローブに対応している装置の結合
要素上の標識の検出は、試料中の対応する被検体の存在
の尺度として使用できる。
【００３３】本発明に含まれる装置の第二の例は、結合
要素の直線状配列を含むチャンネル（例えば、管）から
成っており、各々の結合要素は結合因子として特定の特
異的結合対の固定化された構成物に連結されている（例
えば、共有結合または非共有結合により）。この装置
は、例えば機械的または電気泳動的輸送により試料およ
びプローブを装置内を通過させることにより、装置の結
合要素を試料、捕捉プローブ（その各々は特定の結合対
の他の構成物を含んでいる）および標識検出プローブと
接触させるような方法において使用できる。必要なら、
特異的複合体形成の見込みを増加させるために、試料お
よびプローブを装置を多数回通過させることができる。
次に、非結合検出プローブおよび非特異的結合試料成分
は、装置の組成および結合複合体に依存して、例えば、
機械式ポンプ（例えば、圧電式ポンプ装置）のような液
体運搬装置、電気泳動、真空の適用またはこれらの方法
の組み合わせを使用することにより装置から洗浄でき
る。特定の特異的結合対に対応している装置の結合要素
上の標識の検出は、試料中の被検体の存在の尺度として
使用できる。本発明の方法において、試料、検出プロー
ブ、捕捉プローブおよび装置は互いに任意の順序で接触
できる。好適には、捕捉プローブ−被検体−検出プロー
ブ複合体が装置内への試料の導入に先立って形成され
る。
要素の直線状配列を含むチャンネル（例えば、管）から
成っており、各々の結合要素は結合因子として特定の特
異的結合対の固定化された構成物に連結されている（例
えば、共有結合または非共有結合により）。この装置
は、例えば機械的または電気泳動的輸送により試料およ
びプローブを装置内を通過させることにより、装置の結
合要素を試料、捕捉プローブ（その各々は特定の結合対
の他の構成物を含んでいる）および標識検出プローブと
接触させるような方法において使用できる。必要なら、
特異的複合体形成の見込みを増加させるために、試料お
よびプローブを装置を多数回通過させることができる。
次に、非結合検出プローブおよび非特異的結合試料成分
は、装置の組成および結合複合体に依存して、例えば、
機械式ポンプ（例えば、圧電式ポンプ装置）のような液
体運搬装置、電気泳動、真空の適用またはこれらの方法
の組み合わせを使用することにより装置から洗浄でき
る。特定の特異的結合対に対応している装置の結合要素
上の標識の検出は、試料中の被検体の存在の尺度として
使用できる。本発明の方法において、試料、検出プロー
ブ、捕捉プローブおよび装置は互いに任意の順序で接触
できる。好適には、捕捉プローブ−被検体−検出プロー
ブ複合体が装置内への試料の導入に先立って形成され
る。
【００３４】結合要素の直線状配列を含み、その各々が
特定の特異的結合対の構成物の別個の組を含むこの特定
の装置の利点は、単一の装置が実質的に無限の数の被検
体の検出に使用できることである。このことを達成する
ために変更することが必要とされるこのシステムのただ
一つの要素は、捕捉および検出プローブの被検体−結合
領域である。結合要素上の挿入色素のレベルが測定され
る場合（上記参照）、各々の被検体に対して変更するこ
とが必要とされるこのシステムのただ一つの成分は捕捉
プローブの被検体−特異的結合領域である。
特定の特異的結合対の構成物の別個の組を含むこの特定
の装置の利点は、単一の装置が実質的に無限の数の被検
体の検出に使用できることである。このことを達成する
ために変更することが必要とされるこのシステムのただ
一つの要素は、捕捉および検出プローブの被検体−結合
領域である。結合要素上の挿入色素のレベルが測定され
る場合（上記参照）、各々の被検体に対して変更するこ
とが必要とされるこのシステムのただ一つの成分は捕捉
プローブの被検体−特異的結合領域である。
【００３５】装置 本発明の装置は、各々がそれに連結された（１）被検体
−特異的捕捉プローブ、または（２）特定の特異的結合
対の構成物を有する結合要素の直線状配列を含むチャン
ネル、例えば管から成っている。以下に記載するよう
に、本発明の装置は多くの様式により具体化できる。
−特異的捕捉プローブ、または（２）特定の特異的結合
対の構成物を有する結合要素の直線状配列を含むチャン
ネル、例えば管から成っている。以下に記載するよう
に、本発明の装置は多くの様式により具体化できる。
【００３６】例えば、図１は本発明の装置１１を含んで
いる自動化アッセイシステム１０を示す。装置１１は
管、例えばキャピラリー管１８の内腔中に一次元的積み
重ねで層積された結合要素１４の直線状配列１２を含ん
でいる。この様式の結合要素は任意の標準的カラム充填
材料から構成できる。例えば、ガラスマイクロビーズ、
フリットガラス、焼結ガラス、シリコン、アガロースビ
ーズ、ガラスウールまたはゲル、例えばポリアクリルア
ミドゲルが使用できる。従って、結合要素は多くの別個
なサブユニット、例えばビーズから作り上げることがで
き、それらは各々同一の結合因子へ連結されている。そ
れは、それら自身が個々のサブユニットであるというよ
り、各々が同一の結合因子に連結している”結合要素”
であるそのような同様のサブユニットの群である。その
ような結合要素を含んでいる装置は標準的方法を用いて
作製できる。例えば、管の一つの末端にプラグを置くこ
とができ、結合要素が作られる材料は管の他の末端に置
くことができる。プラグを含む管の末端に吸引を与える
ことにより結合要素を位置させることができる。追加の
結合要素は、所望の結合要素材料を用いてこの過程を繰
り返すことにより装置へ追加することができる。結合要
素は互いに先端に直接積み重ねることができるが、捕捉
プローブ（または特定の特異的結合対の構成物）を欠く
不活性層をそれらの間に置くこともできる。そのように
積み重なった結合要素は、各々が管の内部表面と密閉的
に接触するように、すなわち各々がその全周囲に沿って
管の内部表面に接触するような形状および配置とされな
ければならない。例えば、管が円形の断面を持っている
場合、結合要素は各々円形断面を持ち、管内に加圧適合
できるように管の内径よりもわずかに小さな直径を持っ
ているであろう。この形状は、被検体を含んでいる液体
が積み重なった結合要素の各々を通って流れる（周囲で
はなく）ことを強要する。
いる自動化アッセイシステム１０を示す。装置１１は
管、例えばキャピラリー管１８の内腔中に一次元的積み
重ねで層積された結合要素１４の直線状配列１２を含ん
でいる。この様式の結合要素は任意の標準的カラム充填
材料から構成できる。例えば、ガラスマイクロビーズ、
フリットガラス、焼結ガラス、シリコン、アガロースビ
ーズ、ガラスウールまたはゲル、例えばポリアクリルア
ミドゲルが使用できる。従って、結合要素は多くの別個
なサブユニット、例えばビーズから作り上げることがで
き、それらは各々同一の結合因子へ連結されている。そ
れは、それら自身が個々のサブユニットであるというよ
り、各々が同一の結合因子に連結している”結合要素”
であるそのような同様のサブユニットの群である。その
ような結合要素を含んでいる装置は標準的方法を用いて
作製できる。例えば、管の一つの末端にプラグを置くこ
とができ、結合要素が作られる材料は管の他の末端に置
くことができる。プラグを含む管の末端に吸引を与える
ことにより結合要素を位置させることができる。追加の
結合要素は、所望の結合要素材料を用いてこの過程を繰
り返すことにより装置へ追加することができる。結合要
素は互いに先端に直接積み重ねることができるが、捕捉
プローブ（または特定の特異的結合対の構成物）を欠く
不活性層をそれらの間に置くこともできる。そのように
積み重なった結合要素は、各々が管の内部表面と密閉的
に接触するように、すなわち各々がその全周囲に沿って
管の内部表面に接触するような形状および配置とされな
ければならない。例えば、管が円形の断面を持っている
場合、結合要素は各々円形断面を持ち、管内に加圧適合
できるように管の内径よりもわずかに小さな直径を持っ
ているであろう。この形状は、被検体を含んでいる液体
が積み重なった結合要素の各々を通って流れる（周囲で
はなく）ことを強要する。
【００３７】結合要素は捕捉プローブ（または特定の特
異的結合対の構成物）が固定されているフィルターまた
は膜（例えば、ナイロンまたはニトロセルロース膜）の
積み重ねで構成することもできる。例えば、ＤＮＡプロ
ーブをナイロンフィルターへ共有結合で結合させ、続い
て各々のフィルター間に多孔性、不活性、両面付着シー
トを置くことにより多くの別個のプローブを含んでいる
多数のフィルターを積み重ねて装置を作ることができ
る。
異的結合対の構成物）が固定されているフィルターまた
は膜（例えば、ナイロンまたはニトロセルロース膜）の
積み重ねで構成することもできる。例えば、ＤＮＡプロ
ーブをナイロンフィルターへ共有結合で結合させ、続い
て各々のフィルター間に多孔性、不活性、両面付着シー
トを置くことにより多くの別個のプローブを含んでいる
多数のフィルターを積み重ねて装置を作ることができ
る。
【００３８】本発明の装置の結合要素は例えば、０．０
５から１ｍｍの厚さで、同様のサイズの直径を持ってい
るであろう。そのような寸法を持っている結合要素は、
例えば、ポリスチレンまたはガラスビーズの層から構成
でき、またはガラス表面のような平面表面内にエッチン
グされたチャンネルの場合は（下記参照）、結合要素は
個々のビーズの直線状配列により構成できる。もしく
は、約０．０５ｍｍの直径のエッチングされたチャンネ
ルの内壁、または同様な直径を持つキャピラリー管の内
壁は、０．０２ｍｍから１ｍｍの厚さの結合要素を発生
させるためにレーザーにより活性化できる（下記参
照）。
５から１ｍｍの厚さで、同様のサイズの直径を持ってい
るであろう。そのような寸法を持っている結合要素は、
例えば、ポリスチレンまたはガラスビーズの層から構成
でき、またはガラス表面のような平面表面内にエッチン
グされたチャンネルの場合は（下記参照）、結合要素は
個々のビーズの直線状配列により構成できる。もしく
は、約０．０５ｍｍの直径のエッチングされたチャンネ
ルの内壁、または同様な直径を持つキャピラリー管の内
壁は、０．０２ｍｍから１ｍｍの厚さの結合要素を発生
させるためにレーザーにより活性化できる（下記参
照）。
【００３９】結合要素は好適には、すべての標的被検体
（または特定の特異的結合対の構成物を含んでいる捕捉
プローブ）がその対応する捕捉プローブ（または特定の
特異的結合対の対応する構成物）のごく近傍で装置を通
過することを助力するような表面−容量比を持つように
設計される。好ましい表面面積−容量比を持つ結合要素
の選択は、当業者には容易に判断されるであろう。例え
ば、ガラスまたはアガロースビーズのような、試料およ
びプローブがそのまわりを流れるであろう材料を選択し
てもよいし、または望ましくは、多孔性ビーズまたはフ
ィルターのような、試料およびプローブがそこを通って
流れるであろう材料を選択してもよい。いずれの場合
も、本分野で理解されているように、表面面積−容量比
に加えて、材料を通過する可能な流量のような因子を、
結合要素として使用するための材料の選択において考慮
することができる。
（または特定の特異的結合対の構成物を含んでいる捕捉
プローブ）がその対応する捕捉プローブ（または特定の
特異的結合対の対応する構成物）のごく近傍で装置を通
過することを助力するような表面−容量比を持つように
設計される。好ましい表面面積−容量比を持つ結合要素
の選択は、当業者には容易に判断されるであろう。例え
ば、ガラスまたはアガロースビーズのような、試料およ
びプローブがそのまわりを流れるであろう材料を選択し
てもよいし、または望ましくは、多孔性ビーズまたはフ
ィルターのような、試料およびプローブがそこを通って
流れるであろう材料を選択してもよい。いずれの場合
も、本分野で理解されているように、表面面積−容量比
に加えて、材料を通過する可能な流量のような因子を、
結合要素として使用するための材料の選択において考慮
することができる。
【００４０】積み重ねられた結合要素は、それらが含む
捕捉プローブ（または特定の特異的結合対の構成物）、
それらが作られた材料および／またはそれらの間の不活
性スペーサー（すなわち、捕捉プローブを持たない）の
存在により互いに区別できる。適当な陽性および陰性対
照もまた装置の結合要素の積み重ね中に含ませることが
できる。
捕捉プローブ（または特定の特異的結合対の構成物）、
それらが作られた材料および／またはそれらの間の不活
性スペーサー（すなわち、捕捉プローブを持たない）の
存在により互いに区別できる。適当な陽性および陰性対
照もまた装置の結合要素の積み重ね中に含ませることが
できる。
【００４１】フィルター、膜または上記のその他のマト
リックスへの連結に加え、捕捉プローブ（または特定の
特異的結合対の対応する構成物）はチャンネル（例え
ば、キャピラリー管の様な管）の内腔上の別個の結合要
素領域に連結できる。そのような表面への核酸およびポ
リペプチドプローブのようなプローブの接着は、表面上
の反応性基への直接的吸着または化学的結合を含む多く
の標準法を用いて実施できる。例えばリンカー、例え
ば、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランリン
カー（例えば、Ｍａｓｋｏｓ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０（７）：１６７９−１６
８４，１９９２を参照されたい）のような融通性のある
炭素鎖が使用できる。フォトリソグラフィーもまたこの
型の装置の作製に使用できる。この方法においては、管
の内腔表面は光感受性リンカーで被覆され、特異的捕捉
プローブの結合が望まれる管の領域にレーザービームが
向けられる。続いてプローブを管に通し、ここでプロー
ブはレーザー活性化領域に結合する。過剰のプローブを
流し出した後、管の別の領域をレーザー活性化して異な
ったプローブを接触させ、このプロセスを所望の数の結
合要素が得られるまで繰り返すことができる（例えば、
米国特許第５，１４３，８５４号；ＷＯ９２／１００９
２；およびＷＯ９０／１５０７０を参照されたい）。同
様の方法を用いて、結合要素がガラス板のような平らな
表面内へエッチングされたチャンネルの内腔壁の領域に
連結された捕捉プローブから構成されている装置を作製
することができる。
リックスへの連結に加え、捕捉プローブ（または特定の
特異的結合対の対応する構成物）はチャンネル（例え
ば、キャピラリー管の様な管）の内腔上の別個の結合要
素領域に連結できる。そのような表面への核酸およびポ
リペプチドプローブのようなプローブの接着は、表面上
の反応性基への直接的吸着または化学的結合を含む多く
の標準法を用いて実施できる。例えばリンカー、例え
ば、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランリン
カー（例えば、Ｍａｓｋｏｓ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０（７）：１６７９−１６
８４，１９９２を参照されたい）のような融通性のある
炭素鎖が使用できる。フォトリソグラフィーもまたこの
型の装置の作製に使用できる。この方法においては、管
の内腔表面は光感受性リンカーで被覆され、特異的捕捉
プローブの結合が望まれる管の領域にレーザービームが
向けられる。続いてプローブを管に通し、ここでプロー
ブはレーザー活性化領域に結合する。過剰のプローブを
流し出した後、管の別の領域をレーザー活性化して異な
ったプローブを接触させ、このプロセスを所望の数の結
合要素が得られるまで繰り返すことができる（例えば、
米国特許第５，１４３，８５４号；ＷＯ９２／１００９
２；およびＷＯ９０／１５０７０を参照されたい）。同
様の方法を用いて、結合要素がガラス板のような平らな
表面内へエッチングされたチャンネルの内腔壁の領域に
連結された捕捉プローブから構成されている装置を作製
することができる。
【００４２】本新規装置は自動化アッセイシステムに組
み込むことができる。例えば、アッセイ装置１１を含ん
でいる自動化アッセイシステム１０が図１に図解して例
示されている。装置１１中の結合要素１４の直線状配列
１２（各々は不活性スペーサー１６により分離されてい
る）がキャピラリー管１８内に含まれている。標的被検
体を含んでいると疑われる試料は混合室２０に導入さ
れ、次にシリンジポンプ２２、二つのバルブ２４および
２６、および液体ライン１１ａ、１１ｂ、２２ａ、２８
ａ、２８ｂ、３０ａ、３２ａおよび３４ａを含む自動化
システム１０により、混合室２０から装置１１内へ移さ
れる。本システムはまた、ハイブリダイゼーション緩衝
液３０、洗浄緩衝液３２および一つまたはそれ以上の検
出プローブ３４を含んでいる貯蔵器も含んでいる。シス
テムの機械的操作（例えば、バルブ２４および２６の開
閉）はコンピューター（示されていない）により制御で
きる。このアッセイシステム１０を用いる試料中の核酸
被検体を検出するための工程は以下に簡単に説明されて
いる。
み込むことができる。例えば、アッセイ装置１１を含ん
でいる自動化アッセイシステム１０が図１に図解して例
示されている。装置１１中の結合要素１４の直線状配列
１２（各々は不活性スペーサー１６により分離されてい
る）がキャピラリー管１８内に含まれている。標的被検
体を含んでいると疑われる試料は混合室２０に導入さ
れ、次にシリンジポンプ２２、二つのバルブ２４および
２６、および液体ライン１１ａ、１１ｂ、２２ａ、２８
ａ、２８ｂ、３０ａ、３２ａおよび３４ａを含む自動化
システム１０により、混合室２０から装置１１内へ移さ
れる。本システムはまた、ハイブリダイゼーション緩衝
液３０、洗浄緩衝液３２および一つまたはそれ以上の検
出プローブ３４を含んでいる貯蔵器も含んでいる。シス
テムの機械的操作（例えば、バルブ２４および２６の開
閉）はコンピューター（示されていない）により制御で
きる。このアッセイシステム１０を用いる試料中の核酸
被検体を検出するための工程は以下に簡単に説明されて
いる。
【００４３】ハイブリダイゼーション緩衝液は液体ライ
ン３０ａ、バルブ２４、液体ライン２２ａを通してハイ
ブリダイゼーション緩衝液貯蔵器３０からシリンジポン
プ２２内へ引き出され、次に液体ライン２２ａ、バルブ
２４、液体ライン２８ａを通して標的被検体を含んでい
ると疑われる試料を含む混合室２０内へポンプで送り出
される。次に検出プローブが検出プローブ貯蔵器３４か
ら引き出され、液体ライン３４ａ、バルブ２４、液体ラ
イン２８ａおよびバルブ２６を通して混合室２０内へポ
ンプで送り出され、そこでシリンジポンプ２２による急
速な脈動により試料と混合される。試料−プローブ混合
物は次に混合室２０中で、標的被検体と検出プローブの
ハイブリダイゼーションを容易にする温度まで、導管３
６ａを経て加熱器３６により加熱される。混合物は次に
バルブ２６、液体ライン２８ａ、バルブ２４、および液
体ライン２２ａを通してシリンジポンプ２２内へ戻さ
れ、続いて液体ライン２２ａ、バルブ２４、および液体
ライン１１ａを通して、導管３６ａを経て加熱器３６に
より前もって加熱されている装置１１へ押し出され、次
に液体ライン２８ｂを通して混合室２０内へ戻される。
この工程の間、混合物は装置１１中の結合要素１２の直
線状配列を通過する。
ン３０ａ、バルブ２４、液体ライン２２ａを通してハイ
ブリダイゼーション緩衝液貯蔵器３０からシリンジポン
プ２２内へ引き出され、次に液体ライン２２ａ、バルブ
２４、液体ライン２８ａを通して標的被検体を含んでい
ると疑われる試料を含む混合室２０内へポンプで送り出
される。次に検出プローブが検出プローブ貯蔵器３４か
ら引き出され、液体ライン３４ａ、バルブ２４、液体ラ
イン２８ａおよびバルブ２６を通して混合室２０内へポ
ンプで送り出され、そこでシリンジポンプ２２による急
速な脈動により試料と混合される。試料−プローブ混合
物は次に混合室２０中で、標的被検体と検出プローブの
ハイブリダイゼーションを容易にする温度まで、導管３
６ａを経て加熱器３６により加熱される。混合物は次に
バルブ２６、液体ライン２８ａ、バルブ２４、および液
体ライン２２ａを通してシリンジポンプ２２内へ戻さ
れ、続いて液体ライン２２ａ、バルブ２４、および液体
ライン１１ａを通して、導管３６ａを経て加熱器３６に
より前もって加熱されている装置１１へ押し出され、次
に液体ライン２８ｂを通して混合室２０内へ戻される。
この工程の間、混合物は装置１１中の結合要素１２の直
線状配列を通過する。
【００４４】標的被検体配列に配列相補性を持つ結合要
素１４の直線状配列１２中の結合要素１４上のプローブ
と接触した標的−検出プローブ複合体は結合要素１４上
に固定化される。この工程は、十分なパーセントの標的
被検体が結合要素１４の直線状配列１２中の結合要素１
４上に捕捉されるまで数回繰り返すことができる。
素１４の直線状配列１２中の結合要素１４上のプローブ
と接触した標的−検出プローブ複合体は結合要素１４上
に固定化される。この工程は、十分なパーセントの標的
被検体が結合要素１４の直線状配列１２中の結合要素１
４上に捕捉されるまで数回繰り返すことができる。
【００４５】混合物は次に、液体ライン２８ｂ、バルブ
２６、液体ライン２８ａ、バルブ２４および液体ライン
１１ｂを経て廃棄物収集室３８へポンプで送られ、洗浄
緩衝液が洗浄緩衝液貯蔵器３２から液体ライン３２ａ、
バルブ２４、および液体ライン２２ａを経てシリンジポ
ンプ２２内へ引き出され、次に装置１１から非結合検出
プローブのようなすべての非結合物質を除去するため
に、液体ライン２２ａ、バルブ２４、および液体ライン
１１ａを経由して装置１１を通って送り出される。洗浄
緩衝液は各々のサイクル後、液体ライン２８ｂ、バルブ
２６、液体ライン２８ａ、バルブ２４および液体ライン
１１ｂを経て廃棄物収集室３８へポンプで送られ、非特
異的結合を減少させるため数回の洗浄サイクルが実施さ
れるであろう。アッセイ装置１１は次に画像化システム
により照射および走査できる（下記参照）。
２６、液体ライン２８ａ、バルブ２４および液体ライン
１１ｂを経て廃棄物収集室３８へポンプで送られ、洗浄
緩衝液が洗浄緩衝液貯蔵器３２から液体ライン３２ａ、
バルブ２４、および液体ライン２２ａを経てシリンジポ
ンプ２２内へ引き出され、次に装置１１から非結合検出
プローブのようなすべての非結合物質を除去するため
に、液体ライン２２ａ、バルブ２４、および液体ライン
１１ａを経由して装置１１を通って送り出される。洗浄
緩衝液は各々のサイクル後、液体ライン２８ｂ、バルブ
２６、液体ライン２８ａ、バルブ２４および液体ライン
１１ｂを経て廃棄物収集室３８へポンプで送られ、非特
異的結合を減少させるため数回の洗浄サイクルが実施さ
れるであろう。アッセイ装置１１は次に画像化システム
により照射および走査できる（下記参照）。
【００４６】結合要素が平らな表面内へエッチングされ
たチャンネルの内腔壁領域に連結された捕捉プローブか
らなる装置を含むアッセイシステムの例が図２Ａ（上面
図）および図２Ｂ（側面、断面図）に図解されている。
このシステムにおいて、結合要素４２の直線状配列４０
（各々不活性スペーサー４４により分離されている）は
ガラススライド４６の表面内へエッチングされており、
ガラスカバースリップ４８により覆われている。検出プ
ローブおよび標的被検体を含んでいると疑われる試料を
含む混合物は試料注入口５０を通しての注入によりアッ
セイシステム内へ導入される。ポンプ５２は混合物を結
合要素４２の直線状配列４０を通して押し出すのに使用
される。直線状配列４０中の結合要素４２に結合された
標的−検出プローブ複合体の検出は、レーザー５４およ
びガラスカバースリップ４８上に置かれたチャージ−カ
ップルドデバイス（ＣＣＤ）を用いて実施できる。
たチャンネルの内腔壁領域に連結された捕捉プローブか
らなる装置を含むアッセイシステムの例が図２Ａ（上面
図）および図２Ｂ（側面、断面図）に図解されている。
このシステムにおいて、結合要素４２の直線状配列４０
（各々不活性スペーサー４４により分離されている）は
ガラススライド４６の表面内へエッチングされており、
ガラスカバースリップ４８により覆われている。検出プ
ローブおよび標的被検体を含んでいると疑われる試料を
含む混合物は試料注入口５０を通しての注入によりアッ
セイシステム内へ導入される。ポンプ５２は混合物を結
合要素４２の直線状配列４０を通して押し出すのに使用
される。直線状配列４０中の結合要素４２に結合された
標的−検出プローブ複合体の検出は、レーザー５４およ
びガラスカバースリップ４８上に置かれたチャージ−カ
ップルドデバイス（ＣＣＤ）を用いて実施できる。
【００４７】標的被検体 本発明の方法を用いて検出できる標的被検体には、広範
囲の分子、例えば、核酸、タンパク質、炭水化物、脂
質、代謝物、ビタミンおよび薬剤が含まれる。そのよう
な分子の検出は、医学、法医学、農業、工業、食品科学
および獣医学の分野で有用であろう。例えば、医学の分
野では、本発明の方法は特定のマーカー（例えば、タン
パク質または核酸マーカー）の存在または不在、および
／または普通に存在するタンパク質（例えば、ホルモ
ン、サイトカイン、リンホカイン、抗体または酵素）ま
たは核酸の変化したレベルにより特徴付けられる状態
（例えば、癌）の診断に使用できる。本発明の方法はま
た、例えば、単一塩基対の変化、小さなまたは大きな欠
失、挿入または転位（例えば、染色体転座）により特徴
付けられる遺伝子突然変異および遺伝子多形性の検出に
も使用できる。加えて、本発明の方法は、試料、例えば
患者からの試料中の感染性病原体（例えば、細菌、ウイ
ルス、プロトゾア、寄生虫または真菌）または希な細胞
（例えば、母性血中の胎児細胞）の存在を検出するのに
使用できる。
囲の分子、例えば、核酸、タンパク質、炭水化物、脂
質、代謝物、ビタミンおよび薬剤が含まれる。そのよう
な分子の検出は、医学、法医学、農業、工業、食品科学
および獣医学の分野で有用であろう。例えば、医学の分
野では、本発明の方法は特定のマーカー（例えば、タン
パク質または核酸マーカー）の存在または不在、および
／または普通に存在するタンパク質（例えば、ホルモ
ン、サイトカイン、リンホカイン、抗体または酵素）ま
たは核酸の変化したレベルにより特徴付けられる状態
（例えば、癌）の診断に使用できる。本発明の方法はま
た、例えば、単一塩基対の変化、小さなまたは大きな欠
失、挿入または転位（例えば、染色体転座）により特徴
付けられる遺伝子突然変異および遺伝子多形性の検出に
も使用できる。加えて、本発明の方法は、試料、例えば
患者からの試料中の感染性病原体（例えば、細菌、ウイ
ルス、プロトゾア、寄生虫または真菌）または希な細胞
（例えば、母性血中の胎児細胞）の存在を検出するのに
使用できる。
【００４８】別個の被検体の結合に加え、本発明の装置
の直線状配列中の異なった結合要素を単一の被検体分子
の異なった領域に結合するように設計することもでき
る。そのような直線状配列を含む装置は、例えば、核酸
中の配列変異を検出するために使用できる。例えば、生
物体の異なった群間の配列変異はこの型の装置を使用し
て検出できる。この装置において、結合要素の収集は、
結合の一つまたはそれ以上のパターンが生物体の特定の
群に観察される配列変異に集合的に対応し、および他の
パターンが生物体の他の群に対応するように選択され
る。例えば、ｒＲＮＡ分子の種々の部分を標的とするプ
ローブを、２，０００以上の既知のサルモネラ株を完全
に含むように、組（例えば、６または７組）で使用でき
る。別の例としては、シゲラ フレクスネリおよび大腸
菌ｒＲＮＡは非常に相関しているので、単一プローブの
使用ではすべてのシゲラを大腸菌から区別できないよう
であるが、これらの生物体を区別するために７または８
プローブのパネルを集合的に使用できる。
の直線状配列中の異なった結合要素を単一の被検体分子
の異なった領域に結合するように設計することもでき
る。そのような直線状配列を含む装置は、例えば、核酸
中の配列変異を検出するために使用できる。例えば、生
物体の異なった群間の配列変異はこの型の装置を使用し
て検出できる。この装置において、結合要素の収集は、
結合の一つまたはそれ以上のパターンが生物体の特定の
群に観察される配列変異に集合的に対応し、および他の
パターンが生物体の他の群に対応するように選択され
る。例えば、ｒＲＮＡ分子の種々の部分を標的とするプ
ローブを、２，０００以上の既知のサルモネラ株を完全
に含むように、組（例えば、６または７組）で使用でき
る。別の例としては、シゲラ フレクスネリおよび大腸
菌ｒＲＮＡは非常に相関しているので、単一プローブの
使用ではすべてのシゲラを大腸菌から区別できないよう
であるが、これらの生物体を区別するために７または８
プローブのパネルを集合的に使用できる。
【００４９】本発明の方法を使用して試験できる試料に
は、例えば、血液、血清、血漿、尿および唾液のような
生物学的液体、ならびに植物抽出液、細胞または組織抽
出液、細胞培養培地、環境試料および発酵混合物が含ま
れる。必要に応じ、本方法を応用する前に、常法を用い
て試料からタンパク質および／または核酸調製物を抽出
できる。本発明の方法の感度のため、少量の試料しか必
要とされない。
は、例えば、血液、血清、血漿、尿および唾液のような
生物学的液体、ならびに植物抽出液、細胞または組織抽
出液、細胞培養培地、環境試料および発酵混合物が含ま
れる。必要に応じ、本方法を応用する前に、常法を用い
て試料からタンパク質および／または核酸調製物を抽出
できる。本発明の方法の感度のため、少量の試料しか必
要とされない。
【００５０】プローブ 本発明の方法で使用される特異的プローブの型は、検出
されるべき標的被検体の特定の型に依存し、本分野では
よく知られている。例えば、核酸標的（例えば、ＤＮＡ
またはＲＮＡ標的）の場合には核酸プローブが使用でき
る。核酸プローブはデオキシリボヌクレオチド、リボヌ
クレオチドまたはそれらの組み合わせまたは修飾物を含
むことができる。特異的結合を達成するための至適の配
列、長さおよび標的被検体との相補性の程度は、当業者
により容易に決定されるパラメーターである。例えば、
プローブは標的核酸被検体と相補的である少なくとも
８、好適には１６−１００、または最も好適には１８−
４０の連続したヌクレオチドを含むことができる。その
ようなプローブの設計は標準プロトコールマニュアルお
よび公的に入手可能なコンピュータープログラム（例え
ば、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔ ａｌ．編，Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，１９８９を参照されたい）を参照することにより
容易にできる。核酸プローブの合成は標準的な化学また
は組換え法により実施できる。もしくは、核酸プローブ
は商業的供給元から購入できる。核酸プローブに加え、
核酸標的被検体は、ポリペプチドプローブ（例えば、ヌ
クレオチド配列特異的核酸結合ドメインを含むポリペプ
チドプローブ）のような他のプローブを用いて検出する
こともできる。
されるべき標的被検体の特定の型に依存し、本分野では
よく知られている。例えば、核酸標的（例えば、ＤＮＡ
またはＲＮＡ標的）の場合には核酸プローブが使用でき
る。核酸プローブはデオキシリボヌクレオチド、リボヌ
クレオチドまたはそれらの組み合わせまたは修飾物を含
むことができる。特異的結合を達成するための至適の配
列、長さおよび標的被検体との相補性の程度は、当業者
により容易に決定されるパラメーターである。例えば、
プローブは標的核酸被検体と相補的である少なくとも
８、好適には１６−１００、または最も好適には１８−
４０の連続したヌクレオチドを含むことができる。その
ようなプローブの設計は標準プロトコールマニュアルお
よび公的に入手可能なコンピュータープログラム（例え
ば、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔ ａｌ．編，Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，１９８９を参照されたい）を参照することにより
容易にできる。核酸プローブの合成は標準的な化学また
は組換え法により実施できる。もしくは、核酸プローブ
は商業的供給元から購入できる。核酸プローブに加え、
核酸標的被検体は、ポリペプチドプローブ（例えば、ヌ
クレオチド配列特異的核酸結合ドメインを含むポリペプ
チドプローブ）のような他のプローブを用いて検出する
こともできる。
【００５１】タンパク質標的（例えば、抗体、ホルモ
ン、酵素、病原性タンパク質、サイトカインおよびリン
ホカイン）の場合には、被検体に特異的に結合するモノ
クローナル抗体のような抗体を本発明の方法で使用でき
る。抗体を産生する技術は本分野ではよく知られている
（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、
Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８を参照されたい）。
特に有用な抗体分子には、免疫グロブリンのＦａｂ断
片、ならびに組換え的に作製された一本鎖抗体（例え
ば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ．ａｌ．，米国特許第５，０９
１，５１３号（１９９２）および５，１３２，４０５号
（１９９２）；およびＬａｄｎｅｒｅｔ．ａｌ．，米国
特許第４，７０４，６９２号（１９８７）および４，９
４６，７７８号（１９９０）を参照されたい）が含まれ
る。抗体に加え、標的タンパク質被検体に特異的に結合
する非抗体タンパク質、核酸およびその他の分子が使用
できる。
ン、酵素、病原性タンパク質、サイトカインおよびリン
ホカイン）の場合には、被検体に特異的に結合するモノ
クローナル抗体のような抗体を本発明の方法で使用でき
る。抗体を産生する技術は本分野ではよく知られている
（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、
Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８を参照されたい）。
特に有用な抗体分子には、免疫グロブリンのＦａｂ断
片、ならびに組換え的に作製された一本鎖抗体（例え
ば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ．ａｌ．，米国特許第５，０９
１，５１３号（１９９２）および５，１３２，４０５号
（１９９２）；およびＬａｄｎｅｒｅｔ．ａｌ．，米国
特許第４，７０４，６９２号（１９８７）および４，９
４６，７７８号（１９９０）を参照されたい）が含まれ
る。抗体に加え、標的タンパク質被検体に特異的に結合
する非抗体タンパク質、核酸およびその他の分子が使用
できる。
【００５２】検出プローブは例えば、蛍光標識（例え
ば、フルオレセイン、ローダミンまたはテキサスレッ
ド）、酵素標識（例えば、アルカリ性ホスファターゼ、
グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダー
ゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼまたはガラクトシダー
ズ）、発色団、リン光試薬、発光試薬、放射活性標識、
着色標識またはそれらの組み合わせで標識できる。本発
明の利点は、装置上での異なった特異的検出プローブの
物理的分離のため、単一の標識が同一のアッセイにおい
て多くの別個の検出プローブに対して使用できることで
ある。
ば、フルオレセイン、ローダミンまたはテキサスレッ
ド）、酵素標識（例えば、アルカリ性ホスファターゼ、
グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダー
ゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼまたはガラクトシダー
ズ）、発色団、リン光試薬、発光試薬、放射活性標識、
着色標識またはそれらの組み合わせで標識できる。本発
明の利点は、装置上での異なった特異的検出プローブの
物理的分離のため、単一の標識が同一のアッセイにおい
て多くの別個の検出プローブに対して使用できることで
ある。
【００５３】検出プローブの使用はアッセイの特異性を
増加させるが、上記のように、本発明に含まれるすべて
の方法について検出プローブが必要なわけではない。例
えば、捕捉プローブと接触する前または後のどちらかで
標的自身が標識される場合（例えば、ＰＣＲ、プライマ
ー伸長または代謝的標識により）、検出プローブは必要
とされない。検出プローブはまた、捕捉プローブ−被検
体結合が、エチジウムブロミドまたはプロピジウムヨー
ジドのような挿入色素（核酸捕捉プローブと被検体との
間のデュープレックス形成により結合要素に捕捉され
る）のレベルの検出によりモニターされる場合も必要と
されない。同様に、核酸検出プローブと被検体との間の
デュープレックス形成により結合要素上に捕捉された挿
入色素のレベルの検出により検出プローブ−被検体結合
がモニターされる場合、標識を含まない検出プローブが
使用できる。
増加させるが、上記のように、本発明に含まれるすべて
の方法について検出プローブが必要なわけではない。例
えば、捕捉プローブと接触する前または後のどちらかで
標的自身が標識される場合（例えば、ＰＣＲ、プライマ
ー伸長または代謝的標識により）、検出プローブは必要
とされない。検出プローブはまた、捕捉プローブ−被検
体結合が、エチジウムブロミドまたはプロピジウムヨー
ジドのような挿入色素（核酸捕捉プローブと被検体との
間のデュープレックス形成により結合要素に捕捉され
る）のレベルの検出によりモニターされる場合も必要と
されない。同様に、核酸検出プローブと被検体との間の
デュープレックス形成により結合要素上に捕捉された挿
入色素のレベルの検出により検出プローブ−被検体結合
がモニターされる場合、標識を含まない検出プローブが
使用できる。
【００５４】上記のように、本発明の方法で使用される
捕捉プローブは、例えば、（１）特異的結合対の構成物
を含むことができ、または（２）本発明の装置の特異的
結合要素上に固定化することができる。結合対は、結合
要素への捕捉プローブの直接付着よりもむしろ、特異的
標的被検体を正しい、前もって決められた結合要素に向
けるために使用できる。例えば、特異的標的被検体のた
めの捕捉プローブは特定の特異的結合対の一つの構成物
を含むことができ、結合対の他の構成物は直線状配列中
の特定の結合要素に結合できる。試料を直線状配列と接
触させる際、標的被検体は結合対の二つの構成物の互い
の共同の認識により特定の結合要素へ特異的に局在化さ
れる。捕捉プローブとともに使用できる結合対には、例
えば、ビタミン−ビタミン結合タンパク質（例えば、ア
ビジン−ビオチンおよびストレプトアビジン−ビオチ
ン）、ならびに抗体−ハプテン（例えば、ジゴキシゲニ
ン−抗ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ（フルオレセイン−イ
ソチオシアネート）−抗ＦＩＴＣ、および任意の他のハ
プテン−抗ハプテン抗体、その多くは商業的に入手可能
である）、酵素−基質、酵素−酵素結合タンパク質（例
えば、β−ガラクトシダーゼおよびＡＰＴＧ（パラ−ア
ミノ−フェニル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）、
受容体−リガンド（またはアンタゴニスト）（例えば、
ホルモン受容体へ結合するホルモン、例えば、ｈＩＬ−
１ｒａはヒトインターロイキン受容体様インターロイキ
ン−１へ結合する）、核酸−核酸結合タンパク質、核酸
−核酸結合対およびその他の本分野で既知の特異的結合
対が含まれる。特異的結合対の他の構成物（または捕捉
プローブそれ自身）は、常法を用いて本装置の結合要素
上に固定化できる。例えば、プローブはリンカー（例え
ば、エポキシシランリンカー、例えば３−グリシドキシ
プロピルトリ−メトキシシランリンカー（例えば、Ｍａ
ｓｋｏｓ ｅｔ．ａｌ．，上記文献；Ｂｅａｔｔｉｅ
ｅｔ．ａｌ．，上記文献を参照されたい）を使用するこ
とにより、表面（例えば、ガラス、プラスチック（例え
ば、ポリプロピレン）、シリコン、金または白金で作製
された平滑または多孔性表面）へ結合させることができ
る。フォトリソグラフィーもまた使用される（上記参
照）。
捕捉プローブは、例えば、（１）特異的結合対の構成物
を含むことができ、または（２）本発明の装置の特異的
結合要素上に固定化することができる。結合対は、結合
要素への捕捉プローブの直接付着よりもむしろ、特異的
標的被検体を正しい、前もって決められた結合要素に向
けるために使用できる。例えば、特異的標的被検体のた
めの捕捉プローブは特定の特異的結合対の一つの構成物
を含むことができ、結合対の他の構成物は直線状配列中
の特定の結合要素に結合できる。試料を直線状配列と接
触させる際、標的被検体は結合対の二つの構成物の互い
の共同の認識により特定の結合要素へ特異的に局在化さ
れる。捕捉プローブとともに使用できる結合対には、例
えば、ビタミン−ビタミン結合タンパク質（例えば、ア
ビジン−ビオチンおよびストレプトアビジン−ビオチ
ン）、ならびに抗体−ハプテン（例えば、ジゴキシゲニ
ン−抗ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ（フルオレセイン−イ
ソチオシアネート）−抗ＦＩＴＣ、および任意の他のハ
プテン−抗ハプテン抗体、その多くは商業的に入手可能
である）、酵素−基質、酵素−酵素結合タンパク質（例
えば、β−ガラクトシダーゼおよびＡＰＴＧ（パラ−ア
ミノ−フェニル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）、
受容体−リガンド（またはアンタゴニスト）（例えば、
ホルモン受容体へ結合するホルモン、例えば、ｈＩＬ−
１ｒａはヒトインターロイキン受容体様インターロイキ
ン−１へ結合する）、核酸−核酸結合タンパク質、核酸
−核酸結合対およびその他の本分野で既知の特異的結合
対が含まれる。特異的結合対の他の構成物（または捕捉
プローブそれ自身）は、常法を用いて本装置の結合要素
上に固定化できる。例えば、プローブはリンカー（例え
ば、エポキシシランリンカー、例えば３−グリシドキシ
プロピルトリ−メトキシシランリンカー（例えば、Ｍａ
ｓｋｏｓ ｅｔ．ａｌ．，上記文献；Ｂｅａｔｔｉｅ
ｅｔ．ａｌ．，上記文献を参照されたい）を使用するこ
とにより、表面（例えば、ガラス、プラスチック（例え
ば、ポリプロピレン）、シリコン、金または白金で作製
された平滑または多孔性表面）へ結合させることができ
る。フォトリソグラフィーもまた使用される（上記参
照）。
【００５５】本発明で使用できる特異的結合対の例は相
補的オリゴヌクレオチドの対である。特異的結合対とし
て使用するためのオリゴヌクレオチドの至適の長さ、配
列および相補性の程度は当業者により容易に決定され、
配列組成、試料の複雑さおよびアッセイ条件（例えば、
イオン強度、使用される塩の型、有機溶剤の存在および
／またはハイブリダイゼーション温度）を含む因子に依
存して変わり得るであろう。例えば、（ＡＧＴＣ）
n（式中、ｎ＝反復の数）のような交互反復を含んでい
る核酸は特異的結合対の一つの構成物として使用でき、
（ＧＡＣＴ）nの交互反復を含んでいるその相補物は結
合対の他の構成物として使用できる。反復配列を含んで
いる核酸に加え、相補的ランダム配列を含んでいる核酸
の対が本発明において結合対として使用できる。例え
ば、各々が例えば少なくとも１６のヌクレオチド（例え
ば、少なくとも２０のヌクレオチド）を含んでいる核酸
の対が使用できる。そのようなランダム配列（統計的に
はヒトゲノム中ではユニークであろう）はより高い特異
性を提供する。より短い配列が高度の複雑さを持つ被検
体混合物中で相補的非標的配列を見いだす可能性があ
る。ホモポリマーオリゴヌクレオチド（例えば、ポリ−
Ａ／ポリ−Ｔおよびポリ−Ｇ／ポリ−Ｃ）もまた本発明
の結合対として使用できる。
補的オリゴヌクレオチドの対である。特異的結合対とし
て使用するためのオリゴヌクレオチドの至適の長さ、配
列および相補性の程度は当業者により容易に決定され、
配列組成、試料の複雑さおよびアッセイ条件（例えば、
イオン強度、使用される塩の型、有機溶剤の存在および
／またはハイブリダイゼーション温度）を含む因子に依
存して変わり得るであろう。例えば、（ＡＧＴＣ）
n（式中、ｎ＝反復の数）のような交互反復を含んでい
る核酸は特異的結合対の一つの構成物として使用でき、
（ＧＡＣＴ）nの交互反復を含んでいるその相補物は結
合対の他の構成物として使用できる。反復配列を含んで
いる核酸に加え、相補的ランダム配列を含んでいる核酸
の対が本発明において結合対として使用できる。例え
ば、各々が例えば少なくとも１６のヌクレオチド（例え
ば、少なくとも２０のヌクレオチド）を含んでいる核酸
の対が使用できる。そのようなランダム配列（統計的に
はヒトゲノム中ではユニークであろう）はより高い特異
性を提供する。より短い配列が高度の複雑さを持つ被検
体混合物中で相補的非標的配列を見いだす可能性があ
る。ホモポリマーオリゴヌクレオチド（例えば、ポリ−
Ａ／ポリ−Ｔおよびポリ−Ｇ／ポリ−Ｃ）もまた本発明
の結合対として使用できる。
【００５６】検出プローブの酵素的増幅 上記のプローブのような結合された検出可能標識を持つ
検出プローブに加え、本発明の方法は、酵素的に増幅で
きて検出可能な信号を発生する核酸のすべてまたは一部
を含む検出プローブを使用することができる。例えば、
Ｑβレプリカーゼのような酵素の存在下で自己触媒的に
複製可能なミディ変異体−１（ＭＤＶ−１）ＲＮＡのよ
うな核酸のすべてまたは一部を含んでいる検出プローブ
が使用できる。
検出プローブに加え、本発明の方法は、酵素的に増幅で
きて検出可能な信号を発生する核酸のすべてまたは一部
を含む検出プローブを使用することができる。例えば、
Ｑβレプリカーゼのような酵素の存在下で自己触媒的に
複製可能なミディ変異体−１（ＭＤＶ−１）ＲＮＡのよ
うな核酸のすべてまたは一部を含んでいる検出プローブ
が使用できる。
【００５７】自己触媒的に複製可能な核酸およびそれら
を複製する対応する酵素は本分野ではよく知られてお
り、本発明の方法に容易に適用することができる。例え
ば、ＭＤＶ−１ ＲＮＡ、ナノ変異体ＲＮＡ、ミニ変異
体ＲＮＡおよびマイクロ変異体ＲＮＡ（これらはすべて
Ｑβレプリカーゼにより複製可能である）が使用できる
（例えば、Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第
４，７８６，６００号；Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂ
ｅｓ １０：２５７−２７１，１９９６；Ｍｕｎｉｓｈ
ｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ２２１：４６３−４７２，１９９１；Ｍｉ
ｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７２（１１）：４２５２−４２５
６，１９７５；Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１７：８７７−９０７，１９
７７；Ｚａｍｏｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ３４：１２６１−１２６６，１９９５を参照
されたい）。
を複製する対応する酵素は本分野ではよく知られてお
り、本発明の方法に容易に適用することができる。例え
ば、ＭＤＶ−１ ＲＮＡ、ナノ変異体ＲＮＡ、ミニ変異
体ＲＮＡおよびマイクロ変異体ＲＮＡ（これらはすべて
Ｑβレプリカーゼにより複製可能である）が使用できる
（例えば、Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第
４，７８６，６００号；Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂ
ｅｓ １０：２５７−２７１，１９９６；Ｍｕｎｉｓｈ
ｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ２２１：４６３−４７２，１９９１；Ｍｉ
ｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７２（１１）：４２５２−４２５
６，１９７５；Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１７：８７７−９０７，１９
７７；Ｚａｍｏｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ３４：１２６１−１２６６，１９９５を参照
されたい）。
【００５８】Ｑ−ベータレプリカーゼにより複製可能な
核酸に加え、他のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによ
り複製可能であるバクテリオファージＲＮＡゲノム由来
の核酸のような他の核酸が本発明で使用できる。例え
ば、ＳＰファージ（Ｆｕｋａｍｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏ
ｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６９：１７３−１８
１，１９７９）から誘導された核酸、ＭＳ２、Ｒ１７お
よびＦ２（Ｉｎｏｋｕｃｈｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ ９６：３２３−３２６，１９７９，Ｉｎｏｋ
ｕｃｈｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５
８：７１１−７３０，１９８２）。ブロムモザイクウイ
ルスＲＮＡから誘導された核酸もまた使用できる（Ｑｕ
ａｄｔ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１４９８−１５０２，１９
９３）。
核酸に加え、他のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによ
り複製可能であるバクテリオファージＲＮＡゲノム由来
の核酸のような他の核酸が本発明で使用できる。例え
ば、ＳＰファージ（Ｆｕｋａｍｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏ
ｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６９：１７３−１８
１，１９７９）から誘導された核酸、ＭＳ２、Ｒ１７お
よびＦ２（Ｉｎｏｋｕｃｈｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ ９６：３２３−３２６，１９７９，Ｉｎｏｋ
ｕｃｈｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５
８：７１１−７３０，１９８２）。ブロムモザイクウイ
ルスＲＮＡから誘導された核酸もまた使用できる（Ｑｕ
ａｄｔ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１４９８−１５０２，１９
９３）。
【００５９】複製可能配列のどちらかの末端に置かれて
いるまたはその中に埋め込まれている被検体特異的プロ
ーブセグメントを持つＭＤＶ−１のような自己触媒的複
製可能核酸の全配列を含む検出プローブは本発明の方法
に使用できる。非特異的に結合したプローブは特異的に
結合したプローブと同じように容易に増幅されて信号を
発生するので、結合要素から非特異的に結合したプロー
ブを除去することは、この型のプローブを用いる方法に
おいては特に重要である。従って、この型のプローブの
使用はバックグラウンド信号の発生をもたらし、または
受容可能なレベルまでバックグラウンドを減少させるた
めに追加の測定（アッセイ工程）を必要とする。
いるまたはその中に埋め込まれている被検体特異的プロ
ーブセグメントを持つＭＤＶ−１のような自己触媒的複
製可能核酸の全配列を含む検出プローブは本発明の方法
に使用できる。非特異的に結合したプローブは特異的に
結合したプローブと同じように容易に増幅されて信号を
発生するので、結合要素から非特異的に結合したプロー
ブを除去することは、この型のプローブを用いる方法に
おいては特に重要である。従って、この型のプローブの
使用はバックグラウンド信号の発生をもたらし、または
受容可能なレベルまでバックグラウンドを減少させるた
めに追加の測定（アッセイ工程）を必要とする。
【００６０】一緒になって酵素的に複製可能な核酸の全
配列を含む二つの核酸分子から構成される二成分プロー
ブ対が、上記の複製可能プローブに付随する潜在的バッ
クグラウンド問題を避けるために使用できる（例えば、
Ｔｙａｇｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５３９５−５４００，１
９９６；Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ ｅｔ．ａｌ．，米国特
許第５，４０７，７９８号を参照されたい）。二成分プ
ローブ対の使用は図３に略図で示されている。この例に
おいて、検出プローブ６８はその３’末端に自己触媒的
複製可能核酸の３’部分７０を、およびその５’末端に
被検体特異的プローブ７２を含んでいる。この例では結
合要素５８に連結されている捕捉プローブ６０（捕捉プ
ローブはまた特定の特異的結合対の一つの構成物を含む
ことができる、上記参照）は自己触媒的複製可能核酸の
５’部分６２を含み、その３’末端に被検体特異的プロ
ーブ６４を含んでいる。本プローブは、被検体６６へ結
合した場合、５’プローブ６８の３’末端が３’プロー
ブ６０の５’末端に隣接されるように設計できる。結合
した５’プローブ６８および３’プローブ６０は一緒に
結合して（すなわち、共有結合により継ぎ合わせ）、自
己触媒的複製のための鋳型を発生させることができる。
そのような二成分プローブの使用は、自己触媒的複製可
能鋳型を発生するために捕捉プローブと検出プローブと
の共有結合による継ぎ合わせを必要とするので、捕捉プ
ローブ、被検体および検出プローブ間の特異的結合が存
在しないときの信号発生の可能性を減少させる。
配列を含む二つの核酸分子から構成される二成分プロー
ブ対が、上記の複製可能プローブに付随する潜在的バッ
クグラウンド問題を避けるために使用できる（例えば、
Ｔｙａｇｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５３９５−５４００，１
９９６；Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ ｅｔ．ａｌ．，米国特
許第５，４０７，７９８号を参照されたい）。二成分プ
ローブ対の使用は図３に略図で示されている。この例に
おいて、検出プローブ６８はその３’末端に自己触媒的
複製可能核酸の３’部分７０を、およびその５’末端に
被検体特異的プローブ７２を含んでいる。この例では結
合要素５８に連結されている捕捉プローブ６０（捕捉プ
ローブはまた特定の特異的結合対の一つの構成物を含む
ことができる、上記参照）は自己触媒的複製可能核酸の
５’部分６２を含み、その３’末端に被検体特異的プロ
ーブ６４を含んでいる。本プローブは、被検体６６へ結
合した場合、５’プローブ６８の３’末端が３’プロー
ブ６０の５’末端に隣接されるように設計できる。結合
した５’プローブ６８および３’プローブ６０は一緒に
結合して（すなわち、共有結合により継ぎ合わせ）、自
己触媒的複製のための鋳型を発生させることができる。
そのような二成分プローブの使用は、自己触媒的複製可
能鋳型を発生するために捕捉プローブと検出プローブと
の共有結合による継ぎ合わせを必要とするので、捕捉プ
ローブ、被検体および検出プローブ間の特異的結合が存
在しないときの信号発生の可能性を減少させる。
【００６１】そのような二成分プローブ対で使用される
検出および捕捉プローブは両方ともＤＮＡ、両方ともＲ
ＮＡで作製でき、または一つのプローブがＤＮＡで作製
できて他方のプローブがＲＮＡで作製できる。さらに、
プローブの片方または両方が混合ＤＮＡ／ＲＮＡ組成で
あってもよい。プローブは例えば標準分子法を用いて、
または標準ホスホロアミダイト化学により作製できる。
両方ともＲＮＡで作製された５’および３’部分プロー
ブの使用では、そのようなプローブがＱβレプリカーゼ
存在下でＲＮＡ組換え反応を促進でき、被検体依存性結
合不在下で複製可能ＲＮＡ鋳型の産生を生じるので、バ
ックグラウンド信号の発生が生じる。そのような二成分
プローブ系において、ＤＮＡで作製された５’部分プロ
ーブおよびＲＮＡで作製された３’部分プローブの使用
は、上記のＲＮＡ組換え反応を抑制するので多くの利点
を提供する。その結果、はるかに高いレベルの結合され
ていない遊離プローブがＱβ増幅反応の間に存在でき、
ハイブリダイズされていないプローブの除去のためのア
ッセイの必要性を実質的に減少させる。さらに、ＤＮＡ
５’断片とＲＮＡ３’断片の使用は、全ＤＮＡ鋳型より
も著しく効率的に複製される全ＲＮＡ鋳型と同様の効率
でキメラ結合生成物が複製することを可能にしている。
そのようなキメラの二成分プローブの一般例が以下に記
載されている。
検出および捕捉プローブは両方ともＤＮＡ、両方ともＲ
ＮＡで作製でき、または一つのプローブがＤＮＡで作製
できて他方のプローブがＲＮＡで作製できる。さらに、
プローブの片方または両方が混合ＤＮＡ／ＲＮＡ組成で
あってもよい。プローブは例えば標準分子法を用いて、
または標準ホスホロアミダイト化学により作製できる。
両方ともＲＮＡで作製された５’および３’部分プロー
ブの使用では、そのようなプローブがＱβレプリカーゼ
存在下でＲＮＡ組換え反応を促進でき、被検体依存性結
合不在下で複製可能ＲＮＡ鋳型の産生を生じるので、バ
ックグラウンド信号の発生が生じる。そのような二成分
プローブ系において、ＤＮＡで作製された５’部分プロ
ーブおよびＲＮＡで作製された３’部分プローブの使用
は、上記のＲＮＡ組換え反応を抑制するので多くの利点
を提供する。その結果、はるかに高いレベルの結合され
ていない遊離プローブがＱβ増幅反応の間に存在でき、
ハイブリダイズされていないプローブの除去のためのア
ッセイの必要性を実質的に減少させる。さらに、ＤＮＡ
５’断片とＲＮＡ３’断片の使用は、全ＤＮＡ鋳型より
も著しく効率的に複製される全ＲＮＡ鋳型と同様の効率
でキメラ結合生成物が複製することを可能にしている。
そのようなキメラの二成分プローブの一般例が以下に記
載されている。
【００６２】５’プローブはＭＤＶ−１（または別の自
己触媒的複製可能鋳型）のＤＮＡ版の一部から構成する
ことができ、その３’末端は被検体核酸の一部と相補的
なプローブ要素と連結されている。３’プローブはその
５’末端の５’プローブにより結合される領域に隣接す
る被検体領域に相補的であるプローブ配列を含有するＲ
ＮＡ、およびその３’末端の複製可能ＲＮＡ配列の残り
から構成できる。各々のプローブのプローブ配列要素
は、連結されたＤＮＡ：ＲＮＡキメラ生成物の複製度を
改良するために一つまたはそれ以上のスペーサー要素に
より複製可能配列から分離されていてもよい。
己触媒的複製可能鋳型）のＤＮＡ版の一部から構成する
ことができ、その３’末端は被検体核酸の一部と相補的
なプローブ要素と連結されている。３’プローブはその
５’末端の５’プローブにより結合される領域に隣接す
る被検体領域に相補的であるプローブ配列を含有するＲ
ＮＡ、およびその３’末端の複製可能ＲＮＡ配列の残り
から構成できる。各々のプローブのプローブ配列要素
は、連結されたＤＮＡ：ＲＮＡキメラ生成物の複製度を
改良するために一つまたはそれ以上のスペーサー要素に
より複製可能配列から分離されていてもよい。
【００６３】二つのプローブは標的核酸にハイブリダイ
ズし、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼまたは多くの化学
試薬の任意の試薬（例えば、ブロモシアン、シアノイミ
ダゾール、１−メチルシアノイミダゾール、カルボニル
ジイミダゾールまたは水溶性カルボジイミド）を用い
て結合される。結合生成物は、Ｑβレプリカーゼのよう
な酵素およびヌクレオチド三リン酸と接触させて、複製
を促進して検出可能な量の複製生成物を発生させる。複
製生成物は例えば、複製生成物内へインターカレートす
る色素（例えば、エチジウムブロミドまたはプロジウム
ヨージド）による染色、または複製生成物に特異的に結
合するプローブとのハイブリダイゼーションにより検出
される。
ズし、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼまたは多くの化学
試薬の任意の試薬（例えば、ブロモシアン、シアノイミ
ダゾール、１−メチルシアノイミダゾール、カルボニル
ジイミダゾールまたは水溶性カルボジイミド）を用い
て結合される。結合生成物は、Ｑβレプリカーゼのよう
な酵素およびヌクレオチド三リン酸と接触させて、複製
を促進して検出可能な量の複製生成物を発生させる。複
製生成物は例えば、複製生成物内へインターカレートす
る色素（例えば、エチジウムブロミドまたはプロジウム
ヨージド）による染色、または複製生成物に特異的に結
合するプローブとのハイブリダイゼーションにより検出
される。
【００６４】キャピラリー電気泳動 上記のように、被検体およびプローブの装置の結合要素
への結合は、試料およびプローブを装置を通して、例え
ば電気泳動的および／または機械的に注入することによ
り容易にすることができる。
への結合は、試料およびプローブを装置を通して、例え
ば電気泳動的および／または機械的に注入することによ
り容易にすることができる。
【００６５】電気泳動的移送の場合、本装置の結合要素
の直線状配列は、ガラス、プラスチックまたはその他の
材料で作製され、例えば、約１−２ミリメートル未満、
例えば、５００ミクロン未満の内径を持つキャピラリー
管のような長く伸ばされたチャンネル内に含ませること
ができる。例えば、１００ミクロンの内径および５０ミ
リメートルの長さを持つキャピラリー管が使用できる。
より高い表面積−容量比はより細いキャピラリーを使用
することにより達成され、それにより、より迅速なハイ
ブリダイゼーション反応速度論を容易にする。高い表面
積−容量比従って発散する熱に対して高い熱容量を持つ
キャピラリー管の使用は、高い電圧の使用を可能にし、
従ってアッセイの加速を容易にする。さらに、キャピラ
リー管の高表面積−容量比では、キャピラリーを通過す
る標的分子はプローブにきわめて近接するので、プロー
ブへの標的被検体のハイブリダイゼーションが容易にな
る。
の直線状配列は、ガラス、プラスチックまたはその他の
材料で作製され、例えば、約１−２ミリメートル未満、
例えば、５００ミクロン未満の内径を持つキャピラリー
管のような長く伸ばされたチャンネル内に含ませること
ができる。例えば、１００ミクロンの内径および５０ミ
リメートルの長さを持つキャピラリー管が使用できる。
より高い表面積−容量比はより細いキャピラリーを使用
することにより達成され、それにより、より迅速なハイ
ブリダイゼーション反応速度論を容易にする。高い表面
積−容量比従って発散する熱に対して高い熱容量を持つ
キャピラリー管の使用は、高い電圧の使用を可能にし、
従ってアッセイの加速を容易にする。さらに、キャピラ
リー管の高表面積−容量比では、キャピラリーを通過す
る標的分子はプローブにきわめて近接するので、プロー
ブへの標的被検体のハイブリダイゼーションが容易にな
る。
【００６６】本発明に関連したキャピラリー管の高表面
積−容量比の別の結果は、非常に少量の試薬および被検
体しか必要としないことであり、被検体は少量または多
量の試料容量中に存在している。例えば、レーザーによ
る蛍光誘導後、ＣＣＤ装置による検出は数百の発蛍光団
のみしか必要としないので（例えば、Ｍａｃｋａｙｅ
ｔ．ａｌ．，米国特許第４，８７４，４９２号（１９８
９）を参照されたい）、約１０6−１０7個の白血球細胞
を含む１ミリリットルの血液は本発明の方法を使用する
検出のためには十分な量の標的を提供するであろう。細
菌ｒＲＮＡが標的被検体である場合、１ミリリットルの
試料中の一つの細菌が本発明の方法を用いて検出可能で
あろう。
積−容量比の別の結果は、非常に少量の試薬および被検
体しか必要としないことであり、被検体は少量または多
量の試料容量中に存在している。例えば、レーザーによ
る蛍光誘導後、ＣＣＤ装置による検出は数百の発蛍光団
のみしか必要としないので（例えば、Ｍａｃｋａｙｅ
ｔ．ａｌ．，米国特許第４，８７４，４９２号（１９８
９）を参照されたい）、約１０6−１０7個の白血球細胞
を含む１ミリリットルの血液は本発明の方法を使用する
検出のためには十分な量の標的を提供するであろう。細
菌ｒＲＮＡが標的被検体である場合、１ミリリットルの
試料中の一つの細菌が本発明の方法を用いて検出可能で
あろう。
【００６７】キャピラリー電気泳動を実施するための方
法は本分野ではよく知られており、例えば、Ｎｏｖｏｔ
ｎｙら（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１１：７３
５−７４９，１９９０）により記載されている。いくつ
かの標準的キャピラリー電気泳動システムの何れもが本
発明の方法を実施するために使用できる。例えば、Ｂｅ
ｃｋｍａｎ Ｐ／ＡＣＥ システム２０５０（Ｂｅｃｋ
ｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，
ＭＤ）が使用できる。加えて、いくつかのキャピラリー
管の同時処理を容易にするシステムが使用できる（例え
ば、Ｙｅｕｎｇｅｔ．ａｌ．，米国特許第５，３２４，
４０１号（１９９４）を参照されたい）。
法は本分野ではよく知られており、例えば、Ｎｏｖｏｔ
ｎｙら（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１１：７３
５−７４９，１９９０）により記載されている。いくつ
かの標準的キャピラリー電気泳動システムの何れもが本
発明の方法を実施するために使用できる。例えば、Ｂｅ
ｃｋｍａｎ Ｐ／ＡＣＥ システム２０５０（Ｂｅｃｋ
ｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，
ＭＤ）が使用できる。加えて、いくつかのキャピラリー
管の同時処理を容易にするシステムが使用できる（例え
ば、Ｙｅｕｎｇｅｔ．ａｌ．，米国特許第５，３２４，
４０１号（１９９４）を参照されたい）。
【００６８】キャピラリー電気泳動に加え、他の電気泳
動法が本発明の方法に使用できる。例えば、ガラスまた
はプラスチックプレートのようなプレート内にエッチン
グされ、結合要素の直線状配列を含むチャンネル中で電
気泳動が実施できる。この方法において、チャンネルの
各々の末端はウェルと接触しており、その一つに試料
（およびプローブ）が加えられる。この型のシステムは
より多い試料容量の分析を可能にする。
動法が本発明の方法に使用できる。例えば、ガラスまた
はプラスチックプレートのようなプレート内にエッチン
グされ、結合要素の直線状配列を含むチャンネル中で電
気泳動が実施できる。この方法において、チャンネルの
各々の末端はウェルと接触しており、その一つに試料
（およびプローブ）が加えられる。この型のシステムは
より多い試料容量の分析を可能にする。
【００６９】結合要素に結合した標識の検出 本発明の装置の特異的結合要素に結合した標識の発光、
吸光またはその他の検出可能な信号は、標識の性質に依
存していくつかの標準法の何れかを用いて検出できる。
例えば、発色団標識は分光光度計により特定の波長での
光の吸収を測定することにより検出でき、一方、化学発
光標識により発生された光はルミノメーターまたはＣＣ
Ｄ装置を用いて検出できる。ＣＣＤ装置はまた、より高
い周波数の電磁放射線（例えば放射性同位元素標識から
の放射線）または標準的水銀光源またはレーザー光線で
適当な波長で励起された発蛍光団から発生された蛍光を
検出するためにも使用できる。多標的ゾーンを検出する
ため、キャピラリーは光ファイバー装置で走査でき、ま
たはＣＣＤの配列をキャピラリーに隣接させ、励起光線
に垂直に置くこともできる。励起光線は走査装置の一部
であってもよく、例えば、内部ファイバーはレーザー光
線を運ぶことができ、周囲のファイバーは蛍光光を画像
化システムに運び返す。異なった様式においては、レー
ザー光線はキャピラリー管の一つの末端を通して、内腔
を通すように（それによりキャピラリーの内部が光トン
ネルとして働く）、または壁を通すように（波誘導装置
として働く）向けられる。後者の場合、内部壁に非常に
近い蛍光標識のみが、表面プラスモン共鳴と称されるよ
く知られた過程により励起されるであろう。当業者には
明らかであろうように、散乱または反射光を除去するた
めにＣＣＤ装置または光電子増倍管のような検出装置に
適当なフィルターを使用できる。
吸光またはその他の検出可能な信号は、標識の性質に依
存していくつかの標準法の何れかを用いて検出できる。
例えば、発色団標識は分光光度計により特定の波長での
光の吸収を測定することにより検出でき、一方、化学発
光標識により発生された光はルミノメーターまたはＣＣ
Ｄ装置を用いて検出できる。ＣＣＤ装置はまた、より高
い周波数の電磁放射線（例えば放射性同位元素標識から
の放射線）または標準的水銀光源またはレーザー光線で
適当な波長で励起された発蛍光団から発生された蛍光を
検出するためにも使用できる。多標的ゾーンを検出する
ため、キャピラリーは光ファイバー装置で走査でき、ま
たはＣＣＤの配列をキャピラリーに隣接させ、励起光線
に垂直に置くこともできる。励起光線は走査装置の一部
であってもよく、例えば、内部ファイバーはレーザー光
線を運ぶことができ、周囲のファイバーは蛍光光を画像
化システムに運び返す。異なった様式においては、レー
ザー光線はキャピラリー管の一つの末端を通して、内腔
を通すように（それによりキャピラリーの内部が光トン
ネルとして働く）、または壁を通すように（波誘導装置
として働く）向けられる。後者の場合、内部壁に非常に
近い蛍光標識のみが、表面プラスモン共鳴と称されるよ
く知られた過程により励起されるであろう。当業者には
明らかであろうように、散乱または反射光を除去するた
めにＣＣＤ装置または光電子増倍管のような検出装置に
適当なフィルターを使用できる。
【００７０】検出器は特定の結合要素に対応する装置中
の正確な位置を特異的にモニターするよう配置すること
ができ、必要に応じ、異なった特異的結合要素が検出器
で読めるように結合対の直線状配列を移動させることが
できる。もしくは、検出器は装置に沿って移動させるこ
とができる。キャピラリー管の使用を含む別の例におい
ては、結合要素の直線状配列を含んでいるキャピラリー
および検出器のどちらも移動しない。むしろ、結合要素
上で複合体が形成されたら、検出器を通過するようにキ
ャピラリー管内を輸送される。そのような輸送は例え
ば、液体をキャピラリーを通してポンプで送って直線状
配列を還流的に移動させることにより誘導できる。全直
線状配列が移動される装置においては、キャピラリーに
含まれているにしろまたはいないにしろ、検出器は決定
された時間が標識の通過と一致するように流動の開始後
の前もって決められた時間にのみ読み取りを行うように
プログラムできる。また、装置の長さに広げられた直線
状ＣＣＤ装置も使用できる。信号誘導（例えば、レーザ
ー）および検出装置（例えば、ＣＣＤ装置）を一体化し
た適当なシステムは本分野ではよく知られている（例え
ば、Ｆｕｊｉｍｉｙａｅｔ．ａｌ．，米国特許第５，０
６９，７６９号（１９９１）；Ｐｅｎｔｏｎｅｙ，米国
特許第５，２０８，４６６号（１９９３）を参照された
い。
の正確な位置を特異的にモニターするよう配置すること
ができ、必要に応じ、異なった特異的結合要素が検出器
で読めるように結合対の直線状配列を移動させることが
できる。もしくは、検出器は装置に沿って移動させるこ
とができる。キャピラリー管の使用を含む別の例におい
ては、結合要素の直線状配列を含んでいるキャピラリー
および検出器のどちらも移動しない。むしろ、結合要素
上で複合体が形成されたら、検出器を通過するようにキ
ャピラリー管内を輸送される。そのような輸送は例え
ば、液体をキャピラリーを通してポンプで送って直線状
配列を還流的に移動させることにより誘導できる。全直
線状配列が移動される装置においては、キャピラリーに
含まれているにしろまたはいないにしろ、検出器は決定
された時間が標識の通過と一致するように流動の開始後
の前もって決められた時間にのみ読み取りを行うように
プログラムできる。また、装置の長さに広げられた直線
状ＣＣＤ装置も使用できる。信号誘導（例えば、レーザ
ー）および検出装置（例えば、ＣＣＤ装置）を一体化し
た適当なシステムは本分野ではよく知られている（例え
ば、Ｆｕｊｉｍｉｙａｅｔ．ａｌ．，米国特許第５，０
６９，７６９号（１９９１）；Ｐｅｎｔｏｎｅｙ，米国
特許第５，２０８，４６６号（１９９３）を参照された
い。
【００７１】標的被検体の定量分析を実行するには、標
準法を用いて最初に標準曲線を作ることができる。例え
ば、本発明の方法を用いて検出される標識の量は、既知
の量の被検体を含むいくつかの試料について決定でき
る。これらの読み取りにより作られた標準曲線は、次に
検出された信号のレベルを標準曲線と比較することによ
り、未知の被検体濃度を持つ試料中の被検体濃度の決定
に使用できる。
準法を用いて最初に標準曲線を作ることができる。例え
ば、本発明の方法を用いて検出される標識の量は、既知
の量の被検体を含むいくつかの試料について決定でき
る。これらの読み取りにより作られた標準曲線は、次に
検出された信号のレベルを標準曲線と比較することによ
り、未知の被検体濃度を持つ試料中の被検体濃度の決定
に使用できる。
【００７２】
【実施例】実施例Ｉ−生物的試料中のサルモネラの検出 新規の方法および装置（例えば、図１に例示されている
装置）が試料中の病原性生物体の存在の検出、例えば、
食品試料中のサルモネラの検出に使用できる。このアッ
セイを実施するために適応可能な試薬および方法はＧＥ
ＮＥ−ＴＲＡＫサルモネラアッセイキット（ＧＥＮＥ−
ＴＲＡＫ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ
ｃｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）に提供されている。
簡単に記すと、本発明の装置はポリ−Ａプローブが連結
された結合要素を含むように作製される。次に、試料、
サルモネラ核酸に特異的でありかつポリ−Ｔテイルを含
む捕捉プローブ、および同一のサルモネラ核酸に特異的
である検出プローブをこの装置の開口部に加える。
装置）が試料中の病原性生物体の存在の検出、例えば、
食品試料中のサルモネラの検出に使用できる。このアッ
セイを実施するために適応可能な試薬および方法はＧＥ
ＮＥ−ＴＲＡＫサルモネラアッセイキット（ＧＥＮＥ−
ＴＲＡＫ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ
ｃｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）に提供されている。
簡単に記すと、本発明の装置はポリ−Ａプローブが連結
された結合要素を含むように作製される。次に、試料、
サルモネラ核酸に特異的でありかつポリ−Ｔテイルを含
む捕捉プローブ、および同一のサルモネラ核酸に特異的
である検出プローブをこの装置の開口部に加える。
【００７３】必要に応じ、プローブおよび試料は例え
ば、電気泳動により、または機械的ポンプのような液体
運搬装置を使用することにより装置を通して多数回輸送
できる。非結合検出プローブのような非特異的結合物質
を除いた後、ポリ−Ａプローブを含んでいる装置の結合
要素を、標識の型について適当な方法（例えば、上記参
照）を用いて検出プローブ標識の存在についてモニター
する。
ば、電気泳動により、または機械的ポンプのような液体
運搬装置を使用することにより装置を通して多数回輸送
できる。非結合検出プローブのような非特異的結合物質
を除いた後、ポリ−Ａプローブを含んでいる装置の結合
要素を、標識の型について適当な方法（例えば、上記参
照）を用いて検出プローブ標識の存在についてモニター
する。
【００７４】サルモネラに加え、装置が各々の追加の病
原体について、（１）他の病原体に特異的なプローブ、
または（２）結合対の一つの構成物を含むプローブ、そ
の他方の構成物は他の病原体に特異的なプローブの成分
である（同一アッセイにおいてサルモネラ検出に使用さ
れたポリ−Ａ／ポリ−Ｔ結合対は他の病原体の検出には
使用できないことに注意されたい）、を含んでいる結合
要素を含むならば、試料中の他の病原体の存在が同一の
装置を用いて同時にモニターできる。上記の記載と一致
して、他の病原体のためのプローブは直接的に結合要素
に結合されるか、または病原体特異的被検体への結合に
加えて、（１）結合要素に結合されている、および
（２）上記のポリ−Ａプローブとは別個であるプローブ
へ結合する捕捉プローブであってもよい。
原体について、（１）他の病原体に特異的なプローブ、
または（２）結合対の一つの構成物を含むプローブ、そ
の他方の構成物は他の病原体に特異的なプローブの成分
である（同一アッセイにおいてサルモネラ検出に使用さ
れたポリ−Ａ／ポリ−Ｔ結合対は他の病原体の検出には
使用できないことに注意されたい）、を含んでいる結合
要素を含むならば、試料中の他の病原体の存在が同一の
装置を用いて同時にモニターできる。上記の記載と一致
して、他の病原体のためのプローブは直接的に結合要素
に結合されるか、または病原体特異的被検体への結合に
加えて、（１）結合要素に結合されている、および
（２）上記のポリ−Ａプローブとは別個であるプローブ
へ結合する捕捉プローブであってもよい。
【００７５】実施例II−染色体転座の検出 本発明は染色体転座を検出するためにも使用できる。特
定の例として、本発明は、その存在がしばしば急性リン
パ球性白血病（ＡＬＬ）および慢性骨髄発生性白血病
（ＣＭＬ）の潜在的原因であるいわゆる”フィラデルフ
ィア”染色体を検出するために使用できる。フィラデル
フィア染色体は染色体９の終端領域の染色体２２の終端
領域への均衡転座を持つことにより特徴付けられる。こ
のことにより、染色体９上のａｂｌ癌遺伝子と染色体２
２上のｂｃｒ遺伝子との間で遺伝子融合が生じる。この
遺伝子融合は両方の遺伝子に対応する領域を含むメッセ
ージに転写される。
定の例として、本発明は、その存在がしばしば急性リン
パ球性白血病（ＡＬＬ）および慢性骨髄発生性白血病
（ＣＭＬ）の潜在的原因であるいわゆる”フィラデルフ
ィア”染色体を検出するために使用できる。フィラデル
フィア染色体は染色体９の終端領域の染色体２２の終端
領域への均衡転座を持つことにより特徴付けられる。こ
のことにより、染色体９上のａｂｌ癌遺伝子と染色体２
２上のｂｃｒ遺伝子との間で遺伝子融合が生じる。この
遺伝子融合は両方の遺伝子に対応する領域を含むメッセ
ージに転写される。
【００７６】本発明を用いてそのような転座を以下のよ
うに検出することができる。捕捉プローブは融合のｂｃ
ｒ領域（遺伝子それ自身またはそのＲＮＡ（前ｍＲＮＡ
またはｍＲＮＡ）転写体）にハイブリダイズするように
設計でき、一方、検出プローブはａｂｌ領域にハイブリ
ダイズするように設計できる。本発明の装置は、捕捉プ
ローブが特異的結合要素へ連結されているように作製で
きる。もしくは、装置の結合要素は特異的結合対の一つ
の構成物（例えば、アビジン）を含むことができ、かつ
捕捉プローブは特異的結合対の他の構成物（例えばビオ
チン）を含むことができる。両方の場合とも、試料、捕
捉プローブおよび検出プローブを結合要素と接触させ、
例えば、電気泳動または機械的なポンプによる送り出し
により非結合成分（例えば、非結合検出プローブ）を除
去し、ｂｃｒ結合要素上のａｂｌ検出プローブの存在を
モニターする。ｂｃｒ捕捉プローブによるａｂｌ検出プ
ローブの捕捉は試料中のフィラデルフィア転座の存在を
示している。
うに検出することができる。捕捉プローブは融合のｂｃ
ｒ領域（遺伝子それ自身またはそのＲＮＡ（前ｍＲＮＡ
またはｍＲＮＡ）転写体）にハイブリダイズするように
設計でき、一方、検出プローブはａｂｌ領域にハイブリ
ダイズするように設計できる。本発明の装置は、捕捉プ
ローブが特異的結合要素へ連結されているように作製で
きる。もしくは、装置の結合要素は特異的結合対の一つ
の構成物（例えば、アビジン）を含むことができ、かつ
捕捉プローブは特異的結合対の他の構成物（例えばビオ
チン）を含むことができる。両方の場合とも、試料、捕
捉プローブおよび検出プローブを結合要素と接触させ、
例えば、電気泳動または機械的なポンプによる送り出し
により非結合成分（例えば、非結合検出プローブ）を除
去し、ｂｃｒ結合要素上のａｂｌ検出プローブの存在を
モニターする。ｂｃｒ捕捉プローブによるａｂｌ検出プ
ローブの捕捉は試料中のフィラデルフィア転座の存在を
示している。
【００７７】本発明の方法を使用したＣＭＬおよびＡＬ
Ｌの診断は、ｂｃｒ遺伝子中の異なった配列を認識する
多重捕捉プローブを用いても実施できる。これらのプロ
ーブを用いて、染色体２２上の異なった***点を含む転
座を区別することができる。この方法は以下に例示され
ている。
Ｌの診断は、ｂｃｒ遺伝子中の異なった配列を認識する
多重捕捉プローブを用いても実施できる。これらのプロ
ーブを用いて、染色体２２上の異なった***点を含む転
座を区別することができる。この方法は以下に例示され
ている。
【００７８】モデル標的、捕捉プローブおよび検出プロ
ーブとしての合成オリゴヌクレオチドモデル標的 ＡＬＬおよびＣＭＬキメラｍＲＮＡを模倣するように二
つの標的が設計された。ＡＬＬモデル標的（４０ｍｅ
ｒ）はｂｃｒ配列の２０ヌクレオチド（ヌクレオチド１
５９４−１６１３）およびａｂｌ配列の２０ヌクレオチ
ド（ヌクレオチド４６３−４８２）を含んでいる。
ーブとしての合成オリゴヌクレオチドモデル標的 ＡＬＬおよびＣＭＬキメラｍＲＮＡを模倣するように二
つの標的が設計された。ＡＬＬモデル標的（４０ｍｅ
ｒ）はｂｃｒ配列の２０ヌクレオチド（ヌクレオチド１
５９４−１６１３）およびａｂｌ配列の２０ヌクレオチ
ド（ヌクレオチド４６３−４８２）を含んでいる。
【００７９】ＡＬＬモデル標的：ｂｃｒ 領域 ‖ ａｂｌ領域 5' gctccaatgagaacctcaccTAGCATCTGACTTTGAGCCT 3'（配
列ＩＤ番号：１） ＣＭＬモデル標的（４０ｍｅｒ）は２０ヌクレオチドの
ＣＭＬ特異的ｂｃｒ配列（ヌクレオチド３３４９−３３
６８）および２０ヌクレオチドのＡＬＬモデル標的と同
一のａｂｌ配列（ヌクレオチド４６３−４８２）を含ん
でいる。
列ＩＤ番号：１） ＣＭＬモデル標的（４０ｍｅｒ）は２０ヌクレオチドの
ＣＭＬ特異的ｂｃｒ配列（ヌクレオチド３３４９−３３
６８）および２０ヌクレオチドのＡＬＬモデル標的と同
一のａｂｌ配列（ヌクレオチド４６３−４８２）を含ん
でいる。
【００８０】ＣＭＬモデル標的：ｂｃｒ 領域 ‖ ａｂｌ領域 5' actcagccactggatttaagTAGCATCTGACTTTGAGCCT 3'（配
列ＩＤ番号：２）捕捉プローブ １８ｍｅｒであり、５’がカルボキシル化され、かつＡ
ＬＬ標的のｂｃｒ領域と相補的なＡＬＬ捕捉プローブは
以下の配列を持っている。
列ＩＤ番号：２）捕捉プローブ １８ｍｅｒであり、５’がカルボキシル化され、かつＡ
ＬＬ標的のｂｃｒ領域と相補的なＡＬＬ捕捉プローブは
以下の配列を持っている。
【００８１】ＡＬＬ捕捉プローブ： 5' HOOC-tgaggttctcattggagc 3' （配列ＩＤ番号：
３） １８ｍｅｒであり、５’がカルボキシル化され、かつＣ
ＭＬ標的プローブのｂｃｒ領域と相補的なＣＭＬ捕捉プ
ローブは以下の配列を持っている。
３） １８ｍｅｒであり、５’がカルボキシル化され、かつＣ
ＭＬ標的プローブのｂｃｒ領域と相補的なＣＭＬ捕捉プ
ローブは以下の配列を持っている。
【００８２】ＣＭＬ捕捉プローブ： 5' HOOC-taaatccagtggctgagt 3' （配列ＩＤ番号：
４） 二つの不完全な相補性（２つおよび４つのミスマッチ）
ＣＭＬ捕捉プローブがハイブリダイゼーションの特異性
を試験するために作製された。２つのミスマッチ（下
線）を含むプローブ２ＭＳは以下の配列を持っている。
４） 二つの不完全な相補性（２つおよび４つのミスマッチ）
ＣＭＬ捕捉プローブがハイブリダイゼーションの特異性
を試験するために作製された。２つのミスマッチ（下
線）を含むプローブ２ＭＳは以下の配列を持っている。
【００８３】プローブ２ＭＳ： 5' HOOC-taaatGcagtgCctgagt 3' （配列ＩＤ番号：
５） ４つのミスマッチを含むプローブ４ＭＳは以下の配列を
持っている。
５） ４つのミスマッチを含むプローブ４ＭＳは以下の配列を
持っている。
【００８４】プローブ４ＭＳ： 5' HOOC-taTatGcagtgCctCagt 3' （配列ＩＤ番号：
６）検出プローブ ＦＩＴＣで標識された検出プローブ（ＤＰ，２０ｍｅ
ｒ）はＡＬＬおよびＣＭＬ両方のモデル標的に共通のａ
ｂｌ配列に相補的である。検出プローブは以下の配列を
持っている。
６）検出プローブ ＦＩＴＣで標識された検出プローブ（ＤＰ，２０ｍｅ
ｒ）はＡＬＬおよびＣＭＬ両方のモデル標的に共通のａ
ｂｌ配列に相補的である。検出プローブは以下の配列を
持っている。
【００８５】検出プローブ（ＤＰ）： 5' FITC-AGGCTCAAAGTCAGATGCTA-FITC 3' （配列ＩＤ番
号：７）フィラデルフィア転座を検出および区別するための装置
の製造 以下のように結合要素として使用するためのＡｆｆｉ−
Ｇｅｌ １０２ビーズに捕捉プローブを結合させるため
に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いるカップリング反応が
使用された。
号：７）フィラデルフィア転座を検出および区別するための装置
の製造 以下のように結合要素として使用するためのＡｆｆｉ−
Ｇｅｌ １０２ビーズに捕捉プローブを結合させるため
に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いるカップリング反応が
使用された。
【００８６】１．５ｍｌの水中でＡｆｆｉ−Ｇｅｌ１０
２ゲルスラリー（０．５ｍｌ）を５００ｎｍｏｌｅのＤ
ＮＡオリゴマー（ＡＬＬまたはＣＭＬ特異的捕捉プロー
ブ）を混合し、５０μｌの０．２Ｎ ＨＣｌでｐＨを
４．８−５．０に調整した。０．５ｍｇのＥＤＡＣを添
加後、３０μｌの０．２Ｎ ＨＣｌでｐＨを再び５．０
に調整し、混合物を室温で３時間振とうした。カップリ
ング効率は７０％に達しており、３５０ｎｍｏｌｅのＤ
ＮＡが４００μｌの湿ったゲルビーズに結合した。約
２．５ｍｍの内径を持つガラスキャピラリーの一つの末
端にガラスウールを詰め、結合された捕捉プローブを持
つかまたは持たないゲルビーズを交互の層で充填した。
２ゲルスラリー（０．５ｍｌ）を５００ｎｍｏｌｅのＤ
ＮＡオリゴマー（ＡＬＬまたはＣＭＬ特異的捕捉プロー
ブ）を混合し、５０μｌの０．２Ｎ ＨＣｌでｐＨを
４．８−５．０に調整した。０．５ｍｇのＥＤＡＣを添
加後、３０μｌの０．２Ｎ ＨＣｌでｐＨを再び５．０
に調整し、混合物を室温で３時間振とうした。カップリ
ング効率は７０％に達しており、３５０ｎｍｏｌｅのＤ
ＮＡが４００μｌの湿ったゲルビーズに結合した。約
２．５ｍｍの内径を持つガラスキャピラリーの一つの末
端にガラスウールを詰め、結合された捕捉プローブを持
つかまたは持たないゲルビーズを交互の層で充填した。
【００８７】装置上での多標的捕捉の実証 すべてのプローブが１μＭの濃度になるように、３ｘＳ
ＳＣ（１ｘＳＳＣ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭク
エン酸ナトリウム）中で合成モデル標的（ＡＬＬまたは
ＣＭＬ）を検出プローブと混合した。７０℃で５分間加
熱した後、モデル標的および検出プローブを室温で１時
間ハイブリダイズさせた。この混合物の一部を３ｘＳＳ
Ｃで希釈して全容量３００μｌ中、２５ｐｍｏｌｅハイ
ブリッドの最終濃度とした。ＡＬＬ標的−検出プローブ
ハイブリッドは、ＡＬＬまたはＣＭＬ捕捉プローブを含
むかまたは捕捉プローブを含まないビーズの交互の層を
含むキャピラリー（上記参照）を７５μｌ／分の流量で
通過させた。次にキャピラリーを１ｍｌの３ｘＳＣＣで
２回洗浄した。ＦＩＴＣ発蛍光団の励起およびＦＩＴＣ
特異的蛍光光を捕捉するための適当なシステムを用いて
ゲル−ベッドを含んでいるキャピラリーの領域をＣＣＤ
装置で画像化した。
ＳＣ（１ｘＳＳＣ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭク
エン酸ナトリウム）中で合成モデル標的（ＡＬＬまたは
ＣＭＬ）を検出プローブと混合した。７０℃で５分間加
熱した後、モデル標的および検出プローブを室温で１時
間ハイブリダイズさせた。この混合物の一部を３ｘＳＳ
Ｃで希釈して全容量３００μｌ中、２５ｐｍｏｌｅハイ
ブリッドの最終濃度とした。ＡＬＬ標的−検出プローブ
ハイブリッドは、ＡＬＬまたはＣＭＬ捕捉プローブを含
むかまたは捕捉プローブを含まないビーズの交互の層を
含むキャピラリー（上記参照）を７５μｌ／分の流量で
通過させた。次にキャピラリーを１ｍｌの３ｘＳＣＣで
２回洗浄した。ＦＩＴＣ発蛍光団の励起およびＦＩＴＣ
特異的蛍光光を捕捉するための適当なシステムを用いて
ゲル−ベッドを含んでいるキャピラリーの領域をＣＣＤ
装置で画像化した。
【００８８】図４ＡはＡＬＬ特異性捕捉プローブを含む
３つすべての領域がモデル標的−検出プローブ複合体の
いくつかを捕捉したことを示している。次にＣＭＬ特異
性標的−検出プローブ複合体を同一条件下でキャピラリ
ーに加え、非結合物質を含まないようにキャピラリーを
洗浄した後、キャピラリーを再び画像化した。図４Ｂは
ＣＭＬ特異性捕捉プローブを含むゲルゾーンにおけるＣ
ＭＬ特異性標的複合体の捕捉を示している。ＣＭＬとＡ
ＬＬ特異的ゲルベッドとの間のゲルの領域は捕捉プロー
ブを含まず、従って非蛍光性のまま残っている。ガラス
ウールはいくらかの非特異的自己蛍光を示している。
３つすべての領域がモデル標的−検出プローブ複合体の
いくつかを捕捉したことを示している。次にＣＭＬ特異
性標的−検出プローブ複合体を同一条件下でキャピラリ
ーに加え、非結合物質を含まないようにキャピラリーを
洗浄した後、キャピラリーを再び画像化した。図４Ｂは
ＣＭＬ特異性捕捉プローブを含むゲルゾーンにおけるＣ
ＭＬ特異性標的複合体の捕捉を示している。ＣＭＬとＡ
ＬＬ特異的ゲルベッドとの間のゲルの領域は捕捉プロー
ブを含まず、従って非蛍光性のまま残っている。ガラス
ウールはいくらかの非特異的自己蛍光を示している。
【００８９】標的特異性の実証 ガラスキャピラリーを、ＣＭＬ特異性捕捉プローブの単
一層、および何の捕捉プローブも含まないゲル層により
分離された、２つのミスマッチ（２ＭＳ）または４つの
ミスマッチ（４ＭＳ）を含んでいるゲルの各々１つの層
で充填した。ＣＭＬ特異性モデル標的−検出プローブハ
イブリッド（１００μｌ中に５ｐｍｏｌｅ）をキャピラ
リーに０．０１３ｍｌ／分の流量で加えた。次にキャピ
ラリーを各々１ｍｌの３ｘＳＳＣで２５℃、４２℃、５
２℃、５８℃および７０℃で洗浄した。標的−検出プロ
ーブ複合体を加える前および各々の洗浄後にキャピラリ
ーを画像化した。重要な領域の露光過多または不足を避
けるために各々の画像に対して異なった露光時間が選択
された。図５はＣＭＬ標的を加える前のガラスウールの
みによる自己蛍光（長時間暴露後）を示している。室温
（約２３℃）でＣＭＬモデル標的を加えると、２ＭＳミ
スマッチおよびＣＭＬ特異的捕捉ゾーンへの結合が起こ
ったが、４ＭＳミスマッチゾーンでは起こらなかった。
温度を４２℃に上昇させると、モデル標的は２ＭＳミス
マッチから放出されたが、ＣＭＬモデル標的ゾーンから
は放出されず、本装置の特異的ゾーン中の標的特異的捕
捉が適当な温度で成し遂げられることを示している。
一層、および何の捕捉プローブも含まないゲル層により
分離された、２つのミスマッチ（２ＭＳ）または４つの
ミスマッチ（４ＭＳ）を含んでいるゲルの各々１つの層
で充填した。ＣＭＬ特異性モデル標的−検出プローブハ
イブリッド（１００μｌ中に５ｐｍｏｌｅ）をキャピラ
リーに０．０１３ｍｌ／分の流量で加えた。次にキャピ
ラリーを各々１ｍｌの３ｘＳＳＣで２５℃、４２℃、５
２℃、５８℃および７０℃で洗浄した。標的−検出プロ
ーブ複合体を加える前および各々の洗浄後にキャピラリ
ーを画像化した。重要な領域の露光過多または不足を避
けるために各々の画像に対して異なった露光時間が選択
された。図５はＣＭＬ標的を加える前のガラスウールの
みによる自己蛍光（長時間暴露後）を示している。室温
（約２３℃）でＣＭＬモデル標的を加えると、２ＭＳミ
スマッチおよびＣＭＬ特異的捕捉ゾーンへの結合が起こ
ったが、４ＭＳミスマッチゾーンでは起こらなかった。
温度を４２℃に上昇させると、モデル標的は２ＭＳミス
マッチから放出されたが、ＣＭＬモデル標的ゾーンから
は放出されず、本装置の特異的ゾーン中の標的特異的捕
捉が適当な温度で成し遂げられることを示している。
【００９０】他の態様 本発明をその詳細な説明に関連して説明してきたが、前
述の記載は例示を意図しているものであり、本発明の範
囲を制限するものではないことを理解しなければならな
い。本発明の他の態様、利点および変形は特許請求の範
囲内に含まれている。
述の記載は例示を意図しているものであり、本発明の範
囲を制限するものではないことを理解しなければならな
い。本発明の他の態様、利点および変形は特許請求の範
囲内に含まれている。
【００９１】
【００９２】配列番号１ （ｉ）配列特性： （Ａ）配列の長さ：４０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：１： GCTCCAATGA GAACCTCACC TAGCATCTGA CTTTGAGCCT
【００９３】配列番号２ （ｉ）配列特性： （Ａ）配列の長さ：４０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：２： ACTCAGCCAC TGGATTTAAG TAGCATCTGA CTTTGAGCCT
【００９４】配列番号３ （ｉ）配列特性： （Ａ）配列の長さ：１８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：３： TGAGGTTCTC ATTGGAGC
【００９５】配列番号４ （ｉ）配列特性： （Ａ）配列の長さ：１８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：４： TAAATCCAGT GGCTGAGT
【００９６】配列番号５ （ｉ）配列特性： （Ａ）配列の長さ：１８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：５： TAAATGCAGT GCCTGAGT
【００９７】配列番号６ （ｉ）配列特性： （Ａ）配列の長さ：１８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：６： TATATGCAGT GCCTCAGT
【００９８】配列番号７ （ｉ）配列特性： （Ａ）配列の長さ：２０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ （ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号：７： AGGCTCAAAG TCAGATGCTA
【図１】 図１は本発明の装置を使用するための自動化
アッセイシステムの概略図である。
アッセイシステムの概略図である。
【図２】 図２は、本発明の別の装置を使用するための
アッセイシステムの概略図である。Ａは上面図であり、
ＢはＡの線２Ｂ−２Ｂに沿った側面断面図である。
アッセイシステムの概略図である。Ａは上面図であり、
ＢはＡの線２Ｂ−２Ｂに沿った側面断面図である。
【図３】 図３は、それに連結された捕捉プローブを有
する結合要素の概略図である。
する結合要素の概略図である。
【図４】 図４は本発明の装置中に捕捉された標識−検
出プローブ複合体の蛍光信号を示している電気イメージ
である。Ａは本発明の装置中に捕捉された急性リンパ球
性白血病（ＡＬＬ）特異的標識−検出プローブ複合体の
蛍光信号を示している電気イメージである。Ｂは本発明
の装置中に捕捉された急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）
特異的および慢性骨髄発生性白血病（ＣＭＬ）特異的標
識−検出プローブ複合体の蛍光信号を示している電気イ
メージである。
出プローブ複合体の蛍光信号を示している電気イメージ
である。Ａは本発明の装置中に捕捉された急性リンパ球
性白血病（ＡＬＬ）特異的標識−検出プローブ複合体の
蛍光信号を示している電気イメージである。Ｂは本発明
の装置中に捕捉された急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）
特異的および慢性骨髄発生性白血病（ＣＭＬ）特異的標
識−検出プローブ複合体の蛍光信号を示している電気イ
メージである。
【図５】 図５は本発明の装置上のＣＭＬ標的捕捉の特
異性を示している一連のコンピューター作製イメージで
ある。
異性を示している一連のコンピューター作製イメージで
ある。
フロントページの続き (71)出願人 597060357 3100 Ｗｏｏｄｃｒｅｅｋ Ｄｒｉｖｅ, Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ，Ｉｌｌｉｎ ｏｉｓ 60515−5400，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓ ｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
Claims (29)
- 【請求項１】 試料から被検体を単離するためのアッセ
イ装置であって、対応する特異的成分が結合する別個の
結合因子に各々連結された結合要素の直線状配列を含ん
でいる管を含み、ここで前記結合要素の各々は結合要素
の全周囲に沿って前記管の内部表面と密閉的に接触する
ように配置されていることを特徴とする装置。 - 【請求項２】 少なくとも一つの前記結合要素の前記別
個の結合因子が捕捉プローブを含み、および前記対応す
る特異的成分が標的被検体を含む請求項第１項に記載の
装置。 - 【請求項３】 少なくとも一つの前記結合要素の前記別
個の結合因子が特異的結合対の一つの構成物を含み、お
よび前記対応する特異的成分が前記特異的結合対の他の
構成物および捕捉プローブを含む請求項第１項に記載の
装置。 - 【請求項４】 前記管がキャピラリー管である請求項第
１項に記載の装置。 - 【請求項５】 少なくとも一つの前記結合要素の前記別
個の結合因子が核酸を含む請求項第１項に記載の装置。 - 【請求項６】 前記核酸が自己触媒的複製可能核酸を含
む請求項第５項に記載の装置。 - 【請求項７】 少なくとも一つの前記結合要素の前記別
個の結合因子がポリペプチドを含む請求項第１項に記載
の装置。 - 【請求項８】 前記結合要素の少なくとも二つが、別個
の結合因子を欠く領域により互いに分離されている請求
項第１項に記載の装置。 - 【請求項９】 試料中の被検体の存在を検出するための
方法であって：前記被検体を検出可能標識で標識し；前
記被検体と捕捉プローブを接触させて請求項第１項の装
置中の特異的結合要素上に被検体−捕捉プローブ複合体
を形成させ；前記複合体から前記複合体中の前記被検体
に特異的に結合されていない前記検出可能標識を除去
し；そして前記結合要素中の前記検出可能標識を前記試
料中の前記被検体の存在の尺度として検出するの各工程
を含む方法。 - 【請求項１０】 前記検出可能標識が検出プローブの成
分である請求項第９項に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記別個の結合因子が前記捕捉プロー
ブを含み、および前記接触工程が前記装置を通して前記
被検体を通過させることにより実施される、請求項第９
項に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記被検体が前記装置を多数回通過す
る請求項第１１項に記載の方法。 - 【請求項１３】 前記被検体が前記装置を通過するよう
機械的にポンプにより送られる請求項第１１項に記載の
方法。 - 【請求項１４】 前記被検体に電界を印加することによ
り前記被検体が前記装置を通過する請求項第１１項に記
載の方法。 - 【請求項１５】 前記被検体が核酸、ポリペプチド、炭
水化物、脂質、代謝物または薬剤を含む請求項第９項に
記載の方法。 - 【請求項１６】 前記検出プローブが核酸またはポリペ
プチドを含む請求項第９項に記載の方法。 - 【請求項１７】 前記捕捉プローブが核酸またはポリペ
プチドを含む請求項第９項に記載の方法。 - 【請求項１８】 前記被検体が核酸を含み；前記検出プ
ローブが一つの末端上に自己触媒的複製可能核酸の一部
を、かつ他の末端上に第一の被検体結合要素を含み；前
記捕捉プローブが一つの末端上の前記自己触媒的複製可
能核酸の残りおよび他の末端上の第二の被検体結合要素
を含み；かつ前記第一および第二の被検体結合要素は前
記核酸被検体中の隣接するヌクレオチドセグメントに結
合し；前記方法はさらに、前記第一および第二の被検体
結合要素を互いに結合させて複製鋳型を形成させ、そし
て前記鋳型を複製して前記検出可能信号を発生させる工
程を含む、請求項第９項に記載の方法。 - 【請求項１９】 前記結合要素の前記結合因子が特異的
結合対の一つの構成物を含み、前記捕捉プローブが前記
特異的結合対の他の構成物を含み；および前記接触工程
が前記試料および前記捕捉プローブを前記装置を通して
通過させることにより実施される、請求項第９項に記載
の方法。 - 【請求項２０】 前記試料および前記捕捉プローブが前
記装置を多数回通過する請求項第１９項に記載の方法。 - 【請求項２１】 前記試料および前記捕捉プローブが前
記装置を通過するよう機械的にポンプにより送られる請
求項第１９項に記載の方法。 - 【請求項２２】 前記試料および前記捕捉プローブに電
界を印加することにより前記試料および前記捕捉プロー
ブが前記装置を通過する請求項第１９項に記載の方法。 - 【請求項２３】 前記標識工程および前記接触工程が同
時に実施される請求項第１９項に記載の方法。 - 【請求項２４】 前記接触工程が前記標識工程の前に実
施される請求項第１９項に記載の方法。 - 【請求項２５】 請求項第１項の管と液体連絡を有する
能動液体輸送を提供する手段を含むアッセイシステム。 - 【請求項２６】 請求項第１項の管と液体連絡を有する
液体運搬装置を含むアッセイシステム。 - 【請求項２７】 試料から被検体を単離するためのアッ
セイ装置であって、前記装置は内部内腔表面を有し、か
つ対応する特異的成分が結合する別個の結合因子に各々
連結された結合要素の直線状配列を含むチャンネルを含
み、ここで前記結合要素の各々は前記チャンネルの別個
の領域の内腔表面を含むことを特徴とする装置。 - 【請求項２８】 前記チャンネルが管である請求項第２
７項に記載の装置。 - 【請求項２９】 少なくとも一つの前記別個の結合因子
がフォトリソグラフィーにより少なくとも一つの前記結
合要素に結合されている請求項第２７項に記載の装置。
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