JP4626350B2 - ハイブリダイゼーション検出に適する反応部などを有する流路系、該流路系を用いるハイブリダイゼーション検出装置 - Google Patents
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Description
まず、流路系を構成する細管として、内径0.53mm、外径0.68mm、長さ6cmのフューズド・シリカ・キャピラリー・チューブ(ジーエルサイエンス社製)を用意した。
パフュージョンクロマトグラフィー粒子として、POROS 20 R1(アプライド・バイオシステムズ社製)を用いた。これを10%エタノール溶液に分散させて、粒子分散溶液(以下、「POROS溶液」)を調製した。
次に、Streptavidin Coated Microsphere plain(Polysciences)の水溶液に、5'末端にビオチンを修飾したデオキシチミジンのオリゴヌクレオチド(21mer)を加えて、アビジン−ビオチン結合によりオリゴdTが固定されたビーズ(以下、「オリゴdTビーズ」)を調製した。
流路系デバイスの排出部のルアー・ロック・ニードルにシリンジを取り付けた。POROS溶液を吸い込んだレオダイン型シリンジを、導入部のフィルポートに取り付け、ルアー・ロック・ニードルに取り付けた前記シリンジを吸引し、前記チューブ内に、パフュージョンクロマトグラフィー粒子である「POROS粒子」を注入した。
まず、ターゲット核酸として、5'末端に蛍光色素Cy3を標識した21mer デオキシグアノシンに21merデオキシアデノシンを連結した計42merのオリゴヌクレオチド(以下「Cy3-oligo dG+oligo-dA」と表す)用意した(表1参照)。
本実験は、上記の通りの方法で作製した流路系デバイスを用いて行った。この流路系デバイスの温度制御は、ヒートプレートを用いて行った。流路系へ送り込まれる各オリゴヌクレオチド溶液の送液量は、200μLで送液速度は50μ/minとした。ハイブリダイゼーション確認のためのCy3の蛍光観察は、蛍光顕微鏡に接続された顕微分光システム(大塚電子社製)で行った。
2 ビーズ
3 検出部
11 細管
111 反応部
112 送液促進部
L リンカー
X ターゲット核酸
Y プローブ核酸
Claims (11)
- サンプル液の流路となる細管と、
該細管内に設けられ、マイクロビーズが充填された反応部と、
該反応部よりも下流側の細管内に設けられ、パフュージョンクロマトグラフィー粒子が充填された送液促進部と、を有し、
前記ビーズの表面には、ターゲット核酸に相補的な配列からなる同種塩基配列を有するリンカーが化学的に結合している流路系。 - 前記ビーズには、前記リンカーを介して、プローブ核酸との間で相補鎖形成をするターゲット核酸が保持されている請求項1に記載の流路系。
- 前記リンカーの同種塩基配列はポリTであり、前記ターゲット核酸はポリAテール部分を有するmRNAである請求項1又は2に記載の流路系。
- 前記mRNAは、流路系へ注入された細胞を、該流路系の所定箇所で溶解することにより得られるmRNAである請求項3に記載の流路系。
- 前記反応部において、前記ターゲット核酸の一本鎖部分と前記反応部に送り込まれてくるプローブ核酸との間のハイブリダイゼーションを進行させる請求項1乃至4のいずれか1項に記載の流路系。
- ハイブリダイゼーションに関与しなかったプローブ核酸を、前記送液促進部でトラップする請求項5記載の流路系。
- 前記プローブ核酸は、蛍光物質で標識されている請求項5又は6に記載の流路系。
- 請求項1に記載の流路系が、複数経路設けられているマルチ流路系。
- 各流路系の反応部に相互に異なる種類のターゲット核酸が保持される請求項8に記載のマルチ流路系。
- 請求項1乃至9のいずれか1項に記載の流路系と、
該流路系に設けられた反応部に充填されたビーズにリンカーを介して保持されるターゲット核酸と、前記反応部を通流する溶液中に存在するプローブ核酸との間のハイブリダイゼーションを検出する検出部と、
を備えるハイブリダイゼーション検出装置。 - 前記検出部は、前記プローブ核酸にラベルされた蛍光物質を励起させるための励起光照射部と、前記反応部から得られる励起蛍光を捕捉する光ディテクタ部と、を少なくとも備える請求項10に記載のハイブリダイゼーション検出装置。
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