JP4025403B2 - 試料中の多数の被検物質を検出するための装置および方法 - Google Patents
試料中の多数の被検物質を検出するための装置および方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は試料中の多被検体を検出するための装置および方法に関する。
【０００２】
本発明はＡｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒａｍプロジェクト番号９５−０８−００１２および商務省により与えられた協力同意番号７０ＮＡＮＢ５Ｈ１１０８の下で一部米国政府により支援され、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより管理されている。該政府は本発明にある種の権利を持つ。
【０００３】
【従来の技術】
試料中に痕跡量で存在する被検体の検出は感度が高くおよび特異的な方法を必要とする。さもなくば、そのような被検体の検出は試料中に高い濃度で見いだされる物質の存在により覆い隠されてしまうであろう。もし被検体が検出を容易にする物理的または化学的特性を持っていない場合、この問題は倍加される。
【０００４】
ゲノセンサーとは試料中の標的核酸の検出を容易にするプローブの群または組を含んでいる装置である。例えば、Ｂｅａｔｔｉｅら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１（５）：７００−７０６，１９９６）は、核酸プローブの３ｘ３マトリックスを含む単層シリコンウェハーを含んでいる通過式ゲノセンサーを記載している。プローブが結合できる標的核酸を含んでいると疑われる試料は、弱い真空または吸引を与えることによりゲノセンサーを通過させる。
【０００５】
試料中の標的分子を検出するために使用される別の装置はディップスティックであり、それは抗体のようなプローブを含む細長いストリップである。ディップスティックはプローブに結合する分子を含んでいると疑われる試料内へ浸される。例えば、Ｕｒｎｏｖｉｔｚ（米国特許第５，４４７，８３７号、１９９５年）は試料中の異なった抗原または抗体存在の検出に使用するために、対応する異なった抗体または抗原を各々含んでいる分離された領域を含むディップスティックを記載している。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は試料中の多被検体を検出するための装置および方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、そこに結合する異なった被検体に特異的である結合因子またはプローブを各々有する結合要素の直線状配列を含む容器またはチャンネル（例えば管）を各々が含むアッセイ装置を提供する。本装置は試料中の多被検体の同時分析のための方法に使用できる。これらの方法を使用した場合、バーコードに似ている信号の直線状配列が装置内で発生する。
【０００８】
従って、一つの態様において、本発明は試料から被検体（例えば、核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂質、代謝物または薬剤）を単離するためのアッセイ装置を特徴としている。アッセイ装置は、対応する特異的成分が結合する異なった結合因子に各々が連結されている結合要素の直線状配列を含んでいる、キャピラリー管のような管から構成されている。アッセイ装置中の結合要素の各々は、結合要素の全周囲に沿って管の内部表面に密閉的に接触するように配置されている。結合要素は別の要素と隣接するように配置されていてもよく、または異なった結合因子を欠く領域により分離されていてもよい。
【０００９】
結合要素の少なくとも一つの異なった結合因子は捕捉プローブから構成されていてもよく、その場合、対応する特異的成分は標的被検体である。もしくは、結合要素の少なくとも一つの異なった結合因子は特異的結合対の一つの構成物から構成されていてもよく、その場合、対応する特異的成分は特異的結合対の他の構成物および被検体に結合する捕捉プローブである。
【００１０】
結合要素の少なくとも一つの異なった結合因子は核酸、例えば、自己触媒的に複製可能な核酸、またはポリペプチドの一部から構成されていてもよい。
【００１１】
第二の態様において、本発明は試料中の被検体（例えば、核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂質、代謝物または薬剤）の存在を検出するための方法を特徴とする。この方法において、被検体は検出可能な標識で標識されており（例えば、検出プローブにより提供される検出可能な標識、それは核酸でもポリペプチドでもよい）、捕捉プローブ（例えば、核酸でもポリペプチドでもよい）と接触して本発明の装置中の特異的結合要素上で被検体−捕捉プローブ複合体を形成する。結合要素上の検出可能標識が試料中の被検体の存在の尺度として検出できるように複合体中の被検体に特異的に結合しない検出可能標識は続いて除去される。好適には、複合体中で被検体に特異的に結合されていない実質的にすべての検出可能標識が装置から除去される。例えば、好適には少なくとも５０％、またはより好適には少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または１００％の非結合標識が除去される。
【００１２】
異なった結合因子は捕捉プローブから構成されることができ、接触工程は被検体を１回またはそれ以上装置を通過させることにより実施できる。被検体は例えば、機械的ポンピングまたは被検体に電界を印加することにより装置内を通過させることができる。標識工程および接触工程は同時に実施してもよく、あるいは標識工程の前に接触工程を実施することもできる。
【００１３】
本発明の方法の一つの例において、被検体は核酸からなり、検出プローブは一つの末端上の自己触媒的複製可能核酸の一部および他の末端上の第一の被検体結合要素からなり、そして捕捉プローブは末端上の自己触媒的複製可能核酸の残りおよび他の末端上の第二の被検体結合要素からなる。第一および第二の被検体結合要素は核酸被検体中の隣接するヌクレオチドセグメントに結合する。この方法は（１）第一および第二の被検体結合要素を互いに結合させて複製鋳型を形成させる、および（２）鋳型を複製して検出可能な信号を発生させる工程を含んでいる。
【００１４】
結合要素の異なった結合因子は、捕捉プローブであるというより、特異的結合対の一員であることができ、別々の捕捉プローブは特異的結合対の他の構成物を含むことができる。接触工程は例えば、装置を通して試料および捕捉プローブを通過させることにより実施できる。
【００１５】
本発明はまた、本発明のアッセイ装置と液体連絡を有する能動液体輸送を提供する手段を含むアッセイシステムも提供する。本発明の装置と液体連絡を有する液体運搬装置を含むアッセイシステムもまた本発明に含まれる。
【００１６】
試料から被検体を単離するためのアッセイ装置もまた本発明に含まれ、本装置は、内部内腔表面を持ち、結合要素の直線状配列を含むチャンネル（例えば、管またはガラス表面のような表面内へエッチングされたチャンネル）を含んでいる。この装置中の各々の結合要素は、対応する特異的成分が結合する別個の結合因子を含んでいる。加えて、この装置中の各々の結合要素はチャンネルの別個の領域の内腔表面を含んでいる。この装置内の別個の結合因子の少なくとも一つは、フォトリソグラフィーまたは化学的カップリングのような方法により結合要素の少なくとも一つに結合されている（下記参照）。
【００１７】
本発明は、試料中の多被検体の高感度、微量での同時分析を可能とするためいくつかの利点を提供する。検出された被検体は装置上で物理的に分離されるので、異なった被検体に特異的である検出プローブ上に別個の標識を使用する必要がない。本発明の方法はまた、少量の試料および試薬容量しか必要とせず（必要に応じ、大容量でも使用できる）、迅速でありかつ自動化に容易に適用できる。本装置のかなめの特色は、希薄な溶液から被検体を本発明の装置内の小さな捕捉ゾーン（すなわち、結合要素）内へ単離および濃縮する能力であり、それは物理的増幅を意味している。このことは感度を上昇させ、いくつかの応用でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用によるような酵素的増幅の必要を回避する。
【００１８】
ある実施態様において、本発明の装置および方法で使用されるプローブは核酸である。一対の核酸分子（または単一核酸分子内の二つの領域）は、それらの間で塩基対相互作用によりデュープレックスを形成する場合、互いに”ハイブリダイズする”と称される。本分野で知られているように、核酸対間のハイブリダイゼーションはハイブリダイズする領域間の完全な相補性は必要とせず、使用される条件下でデュープレックスを維持するために十分なレベルの塩基対生成があればよい。
【００１９】
ハイブリダイゼーション反応は典型的には”ストリンジェント条件”下、例えば、特異的および非特異的相互作用が起こり得る低から中ストリンジェンシー条件下で実施される。ハイブリダイゼーション後、非特異的結合を除去するためにより高いストリンジェンシー条件下で洗浄が行われる。本分野では既知のように、最適な洗浄条件は経験的に決定されるであろう（例えば、ストリンジェンシーを徐々に増加させることにより）。ストリンジェンシーに影響を及ぼすために変化できる条件パラメーターには、例えば、温度および塩濃度が含まれる。一般に、塩濃度をより低くし、および温度をより高くするとストリンジェンシーはより高くなる。例えば、ハイブリダイゼーション溶液と等しいまたはより低い塩濃度を含む溶液を用いて、低温（例えば、室温）から洗浄を開始することができる。続いての洗浄は、同一の塩濃度を持ち、段々に温かい溶液を用いて実施できる。もしくは、洗浄工程では温度は保ちながら塩濃度をより低くするか、または塩濃度をより低くしかつ温度を上昇させることができる。そのような標準的変化は本分野では既知である。ストリンジェンシーに影響するために変更できる他のパラメーターには、例えば、ホルムアミドのような不安定化剤の使用が含まれる。
【００２０】
核酸ハイブリダイゼーション反応において、特定のレベルのストリンジェンシーの達成に使用される条件は、ハイブリダイズする核酸の性質に依存して変化するであろう。例えば、核酸のハイブリダイズする領域の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列組成（例えば、ＧＣ ｖ ＡＴ含量）、および核酸の型（例えば、ＲＮＡ ｖ ＤＮＡ）をハイブリダイゼーション条件を選択する際に考慮することができる。さらに、核酸の一つが固定化される（例えば、フィルター上に）かどうかも考慮される。
【００２１】
以下にさらに詳しく説明されるように（実施例II参照）、本発明の方法で使用できるハイブリダイゼーション条件の一つの例は、３ｘＳＳＣ中、室温でのハイブリダイゼーション、および続いての３ｘＳＳＣでの洗浄を含んでいる。従って、この実施例においてはハイブリダイゼーションから洗浄までストリンジェンシーは変化していない。以下に記載する別の実施例では（実施例II参照）、ハイブリダイゼーションは３ｘＳＳＣ中、室温で実施され、続いての洗浄は３ｘＳＳＣ中、以下の温度で実施される：２５℃、４２℃、５２℃、５８℃および７０℃。
【００２２】
段々にストリンジェンシー条件を高くする別の例は以下のようである：室温で２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（ハイブリダイゼーション条件）；室温で０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（低ストリンジェンシー条件）；４２℃で０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（中ストリンジェンシー条件）；および６８℃で０．１ｘＳＳＣ（高ストリンジェンシー条件）。洗浄はこれらの条件のただ一つ（例えば、高いストリンジェンシー条件）で実施されるか、または各々の条件も使用できる（例えば、上に掲げた順序で各々１０−１５分、上に掲げた段階の任意のものまたはすべてを繰り返して）。しかしながら、上に記載したように、至適の条件は含まれる特定のハイブリダイゼーション反応に依存して変化するであろうので、経験的に決定することができる。
【００２３】
核酸ハイブリダイゼーションと同様に、タンパク質−タンパク質結合反応および非特異的結合を除去するための続いての洗浄は、互いのタンパク質の親和性に依存して種々の条件下で実施できる。例えば、結合反応は生理的塩濃度を持つ緩衝液中で生じさせることができ、洗浄は増加した塩濃度を持つ緩衝液を用いて実施することができる。洗浄条件のストリンジェンシーはまた、洗浄溶液にＴＷＥＥＮ−２０TMおよびＴＲＩＴＯＮ−ＸTMのような界面活性剤を含ませることにより高くすることができる。
【００２４】
分子対の構成物（例えば、検出プローブまたは捕捉プローブおよび標的被検体または特異的結合対の構成物（例えば、抗体−抗原、核酸およびタンパク質−ビタミン結合対））は、それらが他の非特異的分子よりも強い親和性で互いに結合する場合、互いに”特異的に結合する”と称される。例えば、一つの抗原に対して引き起こされた抗体はその抗原に対して非特異的な抗原よりもより有効に結合するのでその抗原に特異的に結合すると記述できる。同様に、核酸プローブは、それが標的と塩基対形成相互作用により特異的デュープレックスを形成する場合、核酸標的に特異的に結合すると記述される。
【００２５】
特に記載しない限り、本明細書で使用されたすべての技術および科学的用語は本発明が属する分野の当業者により共通して理解されるものと同じ意味を持っている。本明細書に記載されたものと類似または均等な方法および材料が本発明の実施または試験に使用できるが、いくつかの好適な方法および材料が以下に記載されている。本明細書で述べられたすべての刊行物、特許出願、特許および他の参照文献は全文のまま本明細書で援用される。矛盾する場合、本明細書が調節するであろう。さらに、記載された材料および方法は例示のためだけのものであり、制限を意図しているものではない。
【００２６】
本発明の他の特色および利点は以下の詳細な説明および請求の範囲から明らかになるであろう。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明は試料中の多標的被検体（例えば、１００までまたはそれ以上の異なった被検体）を検出するための装置および方法を提供する。本発明の方法の中心的特色は標的被検体へのプローブの特異的結合である。これは例えばサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ（例えばＲａｎｋｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ２１：７７−８５，１９８３；米国特許第４，４８６，５３９号（１９８４）を参照されたい）を使用することにより実施できる。サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイは捕捉プローブおよび検出プローブの使用を含んでおり、それらは標的被検体に同時に結合して捕捉プローブ−被検体−検出プローブ複合体を形成するように設計されている。本発明の文脈において、検出プローブは検出可能な標識を含んでおり、捕捉プローブは（１）特異的結合対の第一の構成物を含んでいるか、または（２）本発明の装置の特異的結合要素上に固定化されている（下記参照）。これらの場合のどちらにおいても、捕捉プローブの使用は試料成分から、ならびに非結合検出プローブからの被検体−プローブ複合体の精製を容易にする。
【００２８】
検出可能標識が検出プローブの一部として提供されるサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイに加え、標的それ自身が標識されるアッセイも使用できる。そのようなアッセイにおいては検出プローブは必要とされない。例えば、本発明の装置と接触させる前または後に、標的は標識ヌクレオチド（例えば、蛍光または同位元素標識ヌクレオチド）存在下でＰＣＲにより増幅できる。同様に、標的は標識ヌクレオチドを含むプライマー伸長反応で標識できる。標的はまた、例えば、標的の標識された成分（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）と標的を産生する細胞とを接触させることにより代謝的に標識することもできる。標識化した標的は、上記のような特異的捕捉プローブに結合させることにより、本発明の装置の特異的結合要素上に固定化される。検出プローブはまた、核酸捕捉プローブと被検体との間のデュープレックス形成を測定するために挿入色素（例えば、エチジウムブロミドまたはプロピジウムヨージド）の検出が用いられる場合にも必要とされない。
【００２９】
本発明に含まれる装置の一つの例は、各々が結合要素上の結合因子として固定化された別個の対応する被検体に特異的な捕捉プローブを含む結合要素の直線状配列を含んでいる容器またはチャンネル（例えば、キャピラリー管のような管）から構成される。この装置は結合要素上に捕捉プローブ−被検体−検出プローブ複合体が形成されるいくつかの方法で使用できる。好適には、捕捉プローブと接触する前に被検体および検出プローブが互いに接触して被検体−検出プローブ複合体が形成される。本装置の結合要素は、例えば、機械的または電気泳動的輸送により試料を装置内を通過させることにより被検体−検出プローブ複合体を含む試料と接触させることができる。被検体−検出プローブ複合体がその対応する装置内の結合要素と接触すると捕捉プローブ−被検体−検出プローブ複合体が形成される。
【００３０】
本方法の変法において、捕捉プローブ−被検体複合体が本装置の結合要素上で形成されるように、被検体を検出プローブと接触させる前に被検体を含む試料を本装置に適用する。続いて、被検体に特異的に結合し検出可能な標識を含む検出プローブを結合要素上に形成された捕捉プローブ−被検体複合体と接触させる。この方法の別の変法においては、被検体を含んでいる試料および検出プローブを個々に同時に装置と接触させる。
【００３１】
必要なら、捕捉プローブとその対応する被検体または被検体−検出プローブ複合体との間の特異的結合の見込みを増加させるために、試料およびプローブを装置を多数回通過させることができる。そのような方法が使用される場合、捕捉プローブ、被検体および検出プローブの間の接触の順序はあまり関係がない。試料およびプローブを多数回装置に通すことは、例えば、両方の末端が装置に連結された管の使用により容易にできる。試料およびプローブはペリスタポンプを用いて装置および管を通して、繰り返しポンプで送ることができる。試料およびプローブが装置を１回だけ通過するような場合、検出プローブおよび被検体を装置と接触させる前に検出プローブ−被検体複合体を形成させておくことが好ましい。
【００３２】
非結合検出プローブおよび非特異的結合試料成分は、装置の組成および結合複合体に依存して、例えば、アッセイ装置と液体連絡があるように配置されている機械式ポンプ（例えば、圧電式ポンプ装置）のような能動液体輸送体、電気泳動、真空の適用またはこれらの方法の組み合わせを使用することにより装置から除去できる。特異的捕捉プローブに対応している装置の結合要素上の標識の検出は、試料中の対応する被検体の存在の尺度として使用できる。
【００３３】
本発明に含まれる装置の第二の例は、結合要素の直線状配列を含むチャンネル（例えば、管）から成っており、各々の結合要素は結合因子として特定の特異的結合対の固定化された構成物に連結されている（例えば、共有結合または非共有結合により）。この装置は、例えば機械的または電気泳動的輸送により試料およびプローブを装置内を通過させることにより、装置の結合要素を試料、捕捉プローブ（その各々は特定の結合対の他の構成物を含んでいる）および標識検出プローブと接触させるような方法において使用できる。必要なら、特異的複合体形成の見込みを増加させるために、試料およびプローブを装置を多数回通過させることができる。次に、非結合検出プローブおよび非特異的結合試料成分は、装置の組成および結合複合体に依存して、例えば、機械式ポンプ（例えば、圧電式ポンプ装置）のような液体運搬装置、電気泳動、真空の適用またはこれらの方法の組み合わせを使用することにより装置から洗浄できる。特定の特異的結合対に対応している装置の結合要素上の標識の検出は、試料中の被検体の存在の尺度として使用できる。本発明の方法において、試料、検出プローブ、捕捉プローブおよび装置は互いに任意の順序で接触できる。好適には、捕捉プローブ−被検体−検出プローブ複合体が装置内への試料の導入に先立って形成される。
【００３４】
結合要素の直線状配列を含み、その各々が特定の特異的結合対の構成物の別個の組を含むこの特定の装置の利点は、単一の装置が実質的に無限の数の被検体の検出に使用できることである。このことを達成するために変更することが必要とされるこのシステムのただ一つの要素は、捕捉および検出プローブの被検体−結合領域である。結合要素上の挿入色素のレベルが測定される場合（上記参照）、各々の被検体に対して変更することが必要とされるこのシステムのただ一つの成分は捕捉プローブの被検体−特異的結合領域である。
【００３５】
装置
本発明の装置は、各々がそれに連結された（１）被検体−特異的捕捉プローブ、または（２）特定の特異的結合対の構成物を有する結合要素の直線状配列を含むチャンネル、例えば管から成っている。以下に記載するように、本発明の装置は多くの様式により具体化できる。
【００３６】
例えば、図１は本発明の装置１１を含んでいる自動化アッセイシステム１０を示す。装置１１は管、例えばキャピラリー管１８の内腔中に一次元的積み重ねで層積された結合要素１４の直線状配列１２を含んでいる。この様式の結合要素は任意の標準的カラム充填材料から構成できる。例えば、ガラスマイクロビーズ、フリットガラス、焼結ガラス、シリコン、アガロースビーズ、ガラスウールまたはゲル、例えばポリアクリルアミドゲルが使用できる。従って、結合要素は多くの別個なサブユニット、例えばビーズから作り上げることができ、それらは各々同一の結合因子へ連結されている。それは、それら自身が個々のサブユニットであるというより、各々が同一の結合因子に連結している”結合要素”であるそのような同様のサブユニットの群である。そのような結合要素を含んでいる装置は標準的方法を用いて作製できる。例えば、管の一つの末端にプラグを置くことができ、結合要素が作られる材料は管の他の末端に置くことができる。プラグを含む管の末端に吸引を与えることにより結合要素を位置させることができる。追加の結合要素は、所望の結合要素材料を用いてこの過程を繰り返すことにより装置へ追加することができる。結合要素は互いに先端に直接積み重ねることができるが、捕捉プローブ（または特定の特異的結合対の構成物）を欠く不活性層をそれらの間に置くこともできる。そのように積み重なった結合要素は、各々が管の内部表面と密閉的に接触するように、すなわち各々がその全周囲に沿って管の内部表面に接触するような形状および配置とされなければならない。例えば、管が円形の断面を持っている場合、結合要素は各々円形断面を持ち、管内に加圧適合できるように管の内径よりもわずかに小さな直径を持っているであろう。この形状は、被検体を含んでいる液体が積み重なった結合要素の各々を通って流れる（周囲ではなく）ことを強要する。
【００３７】
結合要素は捕捉プローブ（または特定の特異的結合対の構成物）が固定されているフィルターまたは膜（例えば、ナイロンまたはニトロセルロース膜）の積み重ねで構成することもできる。例えば、ＤＮＡプローブをナイロンフィルターへ共有結合で結合させ、続いて各々のフィルター間に多孔性、不活性、両面付着シートを置くことにより多くの別個のプローブを含んでいる多数のフィルターを積み重ねて装置を作ることができる。
【００３８】
本発明の装置の結合要素は例えば、０．０５から１ｍｍの厚さで、同様のサイズの直径を持っているであろう。そのような寸法を持っている結合要素は、例えば、ポリスチレンまたはガラスビーズの層から構成でき、またはガラス表面のような平面表面内にエッチングされたチャンネルの場合は（下記参照）、結合要素は個々のビーズの直線状配列により構成できる。もしくは、約０．０５ｍｍの直径のエッチングされたチャンネルの内壁、または同様な直径を持つキャピラリー管の内壁は、０．０２ｍｍから１ｍｍの厚さの結合要素を発生させるためにレーザーにより活性化できる（下記参照）。
【００３９】
結合要素は好適には、すべての標的被検体（または特定の特異的結合対の構成物を含んでいる捕捉プローブ）がその対応する捕捉プローブ（または特定の特異的結合対の対応する構成物）のごく近傍で装置を通過することを助力するような表面−容量比を持つように設計される。好ましい表面面積−容量比を持つ結合要素の選択は、当業者には容易に判断されるであろう。例えば、ガラスまたはアガロースビーズのような、試料およびプローブがそのまわりを流れるであろう材料を選択してもよいし、または望ましくは、多孔性ビーズまたはフィルターのような、試料およびプローブがそこを通って流れるであろう材料を選択してもよい。いずれの場合も、本分野で理解されているように、表面面積−容量比に加えて、材料を通過する可能な流量のような因子を、結合要素として使用するための材料の選択において考慮することができる。
【００４０】
積み重ねられた結合要素は、それらが含む捕捉プローブ（または特定の特異的結合対の構成物）、それらが作られた材料および／またはそれらの間の不活性スペーサー（すなわち、捕捉プローブを持たない）の存在により互いに区別できる。適当な陽性および陰性対照もまた装置の結合要素の積み重ね中に含ませることができる。
【００４１】
フィルター、膜または上記のその他のマトリックスへの連結に加え、捕捉プローブ（または特定の特異的結合対の対応する構成物）はチャンネル（例えば、キャピラリー管の様な管）の内腔上の別個の結合要素領域に連結できる。そのような表面への核酸およびポリペプチドプローブのようなプローブの接着は、表面上の反応性基への直接的吸着または化学的結合を含む多くの標準法を用いて実施できる。例えばリンカー、例えば、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランリンカー（例えば、Ｍａｓｋｏｓ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０（７）：１６７９−１６８４，１９９２を参照されたい）のような融通性のある炭素鎖が使用できる。フォトリソグラフィーもまたこの型の装置の作製に使用できる。この方法においては、管の内腔表面は光感受性リンカーで被覆され、特異的捕捉プローブの結合が望まれる管の領域にレーザービームが向けられる。続いてプローブを管に通し、ここでプローブはレーザー活性化領域に結合する。過剰のプローブを流し出した後、管の別の領域をレーザー活性化して異なったプローブを接触させ、このプロセスを所望の数の結合要素が得られるまで繰り返すことができる（例えば、米国特許第５，１４３，８５４号；ＷＯ９２／１００９２；およびＷＯ９０／１５０７０を参照されたい）。同様の方法を用いて、結合要素がガラス板のような平らな表面内へエッチングされたチャンネルの内腔壁の領域に連結された捕捉プローブから構成されている装置を作製することができる。
【００４２】
本新規装置は自動化アッセイシステムに組み込むことができる。例えば、アッセイ装置１１を含んでいる自動化アッセイシステム１０が図１に図解して例示されている。装置１１中の結合要素１４の直線状配列１２（各々は不活性スペーサー１６により分離されている）がキャピラリー管１８内に含まれている。標的被検体を含んでいると疑われる試料は混合室２０に導入され、次にシリンジポンプ２２、二つのバルブ２４および２６、および液体ライン１１ａ、１１ｂ、２２ａ、２８ａ、２８ｂ、３０ａ、３２ａおよび３４ａを含む自動化システム１０により、混合室２０から装置１１内へ移される。本システムはまた、ハイブリダイゼーション緩衝液３０、洗浄緩衝液３２および一つまたはそれ以上の検出プローブ３４を含んでいる貯蔵器も含んでいる。システムの機械的操作（例えば、バルブ２４および２６の開閉）はコンピューター（示されていない）により制御できる。このアッセイシステム１０を用いる試料中の核酸被検体を検出するための工程は以下に簡単に説明されている。
【００４３】
ハイブリダイゼーション緩衝液は液体ライン３０ａ、バルブ２４、液体ライン２２ａを通してハイブリダイゼーション緩衝液貯蔵器３０からシリンジポンプ２２内へ引き出され、次に液体ライン２２ａ、バルブ２４、液体ライン２８ａを通して標的被検体を含んでいると疑われる試料を含む混合室２０内へポンプで送り出される。次に検出プローブが検出プローブ貯蔵器３４から引き出され、液体ライン３４ａ、バルブ２４、液体ライン２８ａおよびバルブ２６を通して混合室２０内へポンプで送り出され、そこでシリンジポンプ２２による急速な脈動により試料と混合される。試料−プローブ混合物は次に混合室２０中で、標的被検体と検出プローブのハイブリダイゼーションを容易にする温度まで、導管３６ａを経て加熱器３６により加熱される。混合物は次にバルブ２６、液体ライン２８ａ、バルブ２４、および液体ライン２２ａを通してシリンジポンプ２２内へ戻され、続いて液体ライン２２ａ、バルブ２４、および液体ライン１１ａを通して、導管３６ａを経て加熱器３６により前もって加熱されている装置１１へ押し出され、次に液体ライン２８ｂを通して混合室２０内へ戻される。この工程の間、混合物は装置１１中の結合要素１２の直線状配列を通過する。
【００４４】
標的被検体配列に配列相補性を持つ結合要素１４の直線状配列１２中の結合要素１４上のプローブと接触した標的−検出プローブ複合体は結合要素１４上に固定化される。この工程は、十分なパーセントの標的被検体が結合要素１４の直線状配列１２中の結合要素１４上に捕捉されるまで数回繰り返すことができる。
【００４５】
混合物は次に、液体ライン２８ｂ、バルブ２６、液体ライン２８ａ、バルブ２４および液体ライン１１ｂを経て廃棄物収集室３８へポンプで送られ、洗浄緩衝液が洗浄緩衝液貯蔵器３２から液体ライン３２ａ、バルブ２４、および液体ライン２２ａを経てシリンジポンプ２２内へ引き出され、次に装置１１から非結合検出プローブのようなすべての非結合物質を除去するために、液体ライン２２ａ、バルブ２４、および液体ライン１１ａを経由して装置１１を通って送り出される。洗浄緩衝液は各々のサイクル後、液体ライン２８ｂ、バルブ２６、液体ライン２８ａ、バルブ２４および液体ライン１１ｂを経て廃棄物収集室３８へポンプで送られ、非特異的結合を減少させるため数回の洗浄サイクルが実施されるであろう。アッセイ装置１１は次に画像化システムにより照射および走査できる（下記参照）。
【００４６】
結合要素が平らな表面内へエッチングされたチャンネルの内腔壁領域に連結された捕捉プローブからなる装置を含むアッセイシステムの例が図２Ａ（上面図）および図２Ｂ（側面、断面図）に図解されている。このシステムにおいて、結合要素４２の直線状配列４０（各々不活性スペーサー４４により分離されている）はガラススライド４６の表面内へエッチングされており、ガラスカバースリップ４８により覆われている。検出プローブおよび標的被検体を含んでいると疑われる試料を含む混合物は試料注入口５０を通しての注入によりアッセイシステム内へ導入される。ポンプ５２は混合物を結合要素４２の直線状配列４０を通して押し出すのに使用される。直線状配列４０中の結合要素４２に結合された標的−検出プローブ複合体の検出は、レーザー５４およびガラスカバースリップ４８上に置かれたチャージ−カップルドデバイス（ＣＣＤ）を用いて実施できる。
【００４７】
標的被検体
本発明の方法を用いて検出できる標的被検体には、広範囲の分子、例えば、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、代謝物、ビタミンおよび薬剤が含まれる。そのような分子の検出は、医学、法医学、農業、工業、食品科学および獣医学の分野で有用であろう。例えば、医学の分野では、本発明の方法は特定のマーカー（例えば、タンパク質または核酸マーカー）の存在または不在、および／または普通に存在するタンパク質（例えば、ホルモン、サイトカイン、リンホカイン、抗体または酵素）または核酸の変化したレベルにより特徴付けられる状態（例えば、癌）の診断に使用できる。本発明の方法はまた、例えば、単一塩基対の変化、小さなまたは大きな欠失、挿入または転位（例えば、染色体転座）により特徴付けられる遺伝子突然変異および遺伝子多形性の検出にも使用できる。加えて、本発明の方法は、試料、例えば患者からの試料中の感染性病原体（例えば、細菌、ウイルス、プロトゾア、寄生虫または真菌）または希な細胞（例えば、母性血中の胎児細胞）の存在を検出するのに使用できる。
【００４８】
別個の被検体の結合に加え、本発明の装置の直線状配列中の異なった結合要素を単一の被検体分子の異なった領域に結合するように設計することもできる。そのような直線状配列を含む装置は、例えば、核酸中の配列変異を検出するために使用できる。例えば、生物体の異なった群間の配列変異はこの型の装置を使用して検出できる。この装置において、結合要素の収集は、結合の一つまたはそれ以上のパターンが生物体の特定の群に観察される配列変異に集合的に対応し、および他のパターンが生物体の他の群に対応するように選択される。例えば、ｒＲＮＡ分子の種々の部分を標的とするプローブを、２，０００以上の既知のサルモネラ株を完全に含むように、組（例えば、６または７組）で使用できる。別の例としては、シゲラ フレクスネリおよび大腸菌ｒＲＮＡは非常に相関しているので、単一プローブの使用ではすべてのシゲラを大腸菌から区別できないようであるが、これらの生物体を区別するために７または８プローブのパネルを集合的に使用できる。
【００４９】
本発明の方法を使用して試験できる試料には、例えば、血液、血清、血漿、尿および唾液のような生物学的液体、ならびに植物抽出液、細胞または組織抽出液、細胞培養培地、環境試料および発酵混合物が含まれる。必要に応じ、本方法を応用する前に、常法を用いて試料からタンパク質および／または核酸調製物を抽出できる。本発明の方法の感度のため、少量の試料しか必要とされない。
【００５０】
プローブ
本発明の方法で使用される特異的プローブの型は、検出されるべき標的被検体の特定の型に依存し、本分野ではよく知られている。例えば、核酸標的（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的）の場合には核酸プローブが使用できる。核酸プローブはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはそれらの組み合わせまたは修飾物を含むことができる。特異的結合を達成するための至適の配列、長さおよび標的被検体との相補性の程度は、当業者により容易に決定されるパラメーターである。例えば、プローブは標的核酸被検体と相補的である少なくとも８、好適には１６−１００、または最も好適には１８−４０の連続したヌクレオチドを含むことができる。そのようなプローブの設計は標準プロトコールマニュアルおよび公的に入手可能なコンピュータープログラム（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照されたい）を参照することにより容易にできる。核酸プローブの合成は標準的な化学または組換え法により実施できる。もしくは、核酸プローブは商業的供給元から購入できる。核酸プローブに加え、核酸標的被検体は、ポリペプチドプローブ（例えば、ヌクレオチド配列特異的核酸結合ドメインを含むポリペプチドプローブ）のような他のプローブを用いて検出することもできる。
【００５１】
タンパク質標的（例えば、抗体、ホルモン、酵素、病原性タンパク質、サイトカインおよびリンホカイン）の場合には、被検体に特異的に結合するモノクローナル抗体のような抗体を本発明の方法で使用できる。抗体を産生する技術は本分野ではよく知られている（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８を参照されたい）。特に有用な抗体分子には、免疫グロブリンのＦａｂ断片、ならびに組換え的に作製された一本鎖抗体（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ．ａｌ．，米国特許第５，０９１，５１３号（１９９２）および５，１３２，４０５号（１９９２）；およびＬａｄｎｅｒｅｔ．ａｌ．，米国特許第４，７０４，６９２号（１９８７）および４，９４６，７７８号（１９９０）を参照されたい）が含まれる。抗体に加え、標的タンパク質被検体に特異的に結合する非抗体タンパク質、核酸およびその他の分子が使用できる。
【００５２】
検出プローブは例えば、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミンまたはテキサスレッド）、酵素標識（例えば、アルカリ性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼまたはガラクトシダーズ）、発色団、リン光試薬、発光試薬、放射活性標識、着色標識またはそれらの組み合わせで標識できる。本発明の利点は、装置上での異なった特異的検出プローブの物理的分離のため、単一の標識が同一のアッセイにおいて多くの別個の検出プローブに対して使用できることである。
【００５３】
検出プローブの使用はアッセイの特異性を増加させるが、上記のように、本発明に含まれるすべての方法について検出プローブが必要なわけではない。例えば、捕捉プローブと接触する前または後のどちらかで標的自身が標識される場合（例えば、ＰＣＲ、プライマー伸長または代謝的標識により）、検出プローブは必要とされない。検出プローブはまた、捕捉プローブ−被検体結合が、エチジウムブロミドまたはプロピジウムヨージドのような挿入色素（核酸捕捉プローブと被検体との間のデュープレックス形成により結合要素に捕捉される）のレベルの検出によりモニターされる場合も必要とされない。同様に、核酸検出プローブと被検体との間のデュープレックス形成により結合要素上に捕捉された挿入色素のレベルの検出により検出プローブ−被検体結合がモニターされる場合、標識を含まない検出プローブが使用できる。
【００５４】
上記のように、本発明の方法で使用される捕捉プローブは、例えば、（１）特異的結合対の構成物を含むことができ、または（２）本発明の装置の特異的結合要素上に固定化することができる。結合対は、結合要素への捕捉プローブの直接付着よりもむしろ、特異的標的被検体を正しい、前もって決められた結合要素に向けるために使用できる。例えば、特異的標的被検体のための捕捉プローブは特定の特異的結合対の一つの構成物を含むことができ、結合対の他の構成物は直線状配列中の特定の結合要素に結合できる。試料を直線状配列と接触させる際、標的被検体は結合対の二つの構成物の互いの共同の認識により特定の結合要素へ特異的に局在化される。捕捉プローブとともに使用できる結合対には、例えば、ビタミン−ビタミン結合タンパク質（例えば、アビジン−ビオチンおよびストレプトアビジン−ビオチン）、ならびに抗体−ハプテン（例えば、ジゴキシゲニン−抗ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ（フルオレセイン−イソチオシアネート）−抗ＦＩＴＣ、および任意の他のハプテン−抗ハプテン抗体、その多くは商業的に入手可能である）、酵素−基質、酵素−酵素結合タンパク質（例えば、β−ガラクトシダーゼおよびＡＰＴＧ（パラ−アミノ−フェニル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）、受容体−リガンド（またはアンタゴニスト）（例えば、ホルモン受容体へ結合するホルモン、例えば、ｈＩＬ−１ｒａはヒトインターロイキン受容体様インターロイキン−１へ結合する）、核酸−核酸結合タンパク質、核酸−核酸結合対およびその他の本分野で既知の特異的結合対が含まれる。特異的結合対の他の構成物（または捕捉プローブそれ自身）は、常法を用いて本装置の結合要素上に固定化できる。例えば、プローブはリンカー（例えば、エポキシシランリンカー、例えば３−グリシドキシプロピルトリ−メトキシシランリンカー（例えば、Ｍａｓｋｏｓ ｅｔ．ａｌ．，上記文献；Ｂｅａｔｔｉｅ ｅｔ．ａｌ．，上記文献を参照されたい）を使用することにより、表面（例えば、ガラス、プラスチック（例えば、ポリプロピレン）、シリコン、金または白金で作製された平滑または多孔性表面）へ結合させることができる。フォトリソグラフィーもまた使用される（上記参照）。
【００５５】
本発明で使用できる特異的結合対の例は相補的オリゴヌクレオチドの対である。特異的結合対として使用するためのオリゴヌクレオチドの至適の長さ、配列および相補性の程度は当業者により容易に決定され、配列組成、試料の複雑さおよびアッセイ条件（例えば、イオン強度、使用される塩の型、有機溶剤の存在および／またはハイブリダイゼーション温度）を含む因子に依存して変わり得るであろう。例えば、（ＡＧＴＣ）n（式中、ｎ＝反復の数）のような交互反復を含んでいる核酸は特異的結合対の一つの構成物として使用でき、（ＧＡＣＴ）nの交互反復を含んでいるその相補物は結合対の他の構成物として使用できる。反復配列を含んでいる核酸に加え、相補的ランダム配列を含んでいる核酸の対が本発明において結合対として使用できる。例えば、各々が例えば少なくとも１６のヌクレオチド（例えば、少なくとも２０のヌクレオチド）を含んでいる核酸の対が使用できる。そのようなランダム配列（統計的にはヒトゲノム中ではユニークであろう）はより高い特異性を提供する。より短い配列が高度の複雑さを持つ被検体混合物中で相補的非標的配列を見いだす可能性がある。ホモポリマーオリゴヌクレオチド（例えば、ポリ−Ａ／ポリ−Ｔおよびポリ−Ｇ／ポリ−Ｃ）もまた本発明の結合対として使用できる。
【００５６】
検出プローブの酵素的増幅
上記のプローブのような結合された検出可能標識を持つ検出プローブに加え、本発明の方法は、酵素的に増幅できて検出可能な信号を発生する核酸のすべてまたは一部を含む検出プローブを使用することができる。例えば、Ｑβレプリカーゼのような酵素の存在下で自己触媒的に複製可能なミディ変異体−１（ＭＤＶ−１）ＲＮＡのような核酸のすべてまたは一部を含んでいる検出プローブが使用できる。
【００５７】
自己触媒的に複製可能な核酸およびそれらを複製する対応する酵素は本分野ではよく知られており、本発明の方法に容易に適用することができる。例えば、ＭＤＶ−１ ＲＮＡ、ナノ変異体ＲＮＡ、ミニ変異体ＲＮＡおよびマイクロ変異体ＲＮＡ（これらはすべてＱβレプリカーゼにより複製可能である）が使用できる（例えば、Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，７８６，６００号；Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ １０：２５７−２７１，１９９６；Ｍｕｎｉｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２１：４６３−４７２，１９９１；Ｍｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７２（１１）：４２５２−４２５６，１９７５；Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１７：８７７−９０７，１９７７；Ｚａｍｏｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１２６１−１２６６，１９９５を参照されたい）。
【００５８】
Ｑ−ベータレプリカーゼにより複製可能な核酸に加え、他のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより複製可能であるバクテリオファージＲＮＡゲノム由来の核酸のような他の核酸が本発明で使用できる。例えば、ＳＰファージ（Ｆｕｋａｍｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６９：１７３−１８１，１９７９）から誘導された核酸、ＭＳ２、Ｒ１７およびＦ２（Ｉｎｏｋｕｃｈｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９６：３２３−３２６，１９７９，Ｉｎｏｋｕｃｈｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：７１１−７３０，１９８２）。ブロムモザイクウイルスＲＮＡから誘導された核酸もまた使用できる（Ｑｕａｄｔ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１４９８−１５０２，１９９３）。
【００５９】
複製可能配列のどちらかの末端に置かれているまたはその中に埋め込まれている被検体特異的プローブセグメントを持つＭＤＶ−１のような自己触媒的複製可能核酸の全配列を含む検出プローブは本発明の方法に使用できる。非特異的に結合したプローブは特異的に結合したプローブと同じように容易に増幅されて信号を発生するので、結合要素から非特異的に結合したプローブを除去することは、この型のプローブを用いる方法においては特に重要である。従って、この型のプローブの使用はバックグラウンド信号の発生をもたらし、または受容可能なレベルまでバックグラウンドを減少させるために追加の測定（アッセイ工程）を必要とする。
【００６０】
一緒になって酵素的に複製可能な核酸の全配列を含む二つの核酸分子から構成される二成分プローブ対が、上記の複製可能プローブに付随する潜在的バックグラウンド問題を避けるために使用できる（例えば、Ｔｙａｇｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５３９５−５４００，１９９６；Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ ｅｔ．ａｌ．，米国特許第５，４０７，７９８号を参照されたい）。二成分プローブ対の使用は図３に略図で示されている。この例において、検出プローブ６８はその３’末端に自己触媒的複製可能核酸の３’部分７０を、およびその５’末端に被検体特異的プローブ７２を含んでいる。この例では結合要素５８に連結されている捕捉プローブ６０（捕捉プローブはまた特定の特異的結合対の一つの構成物を含むことができる、上記参照）は自己触媒的複製可能核酸の５’部分６２を含み、その３’末端に被検体特異的プローブ６４を含んでいる。本プローブは、被検体６６へ結合した場合、５’プローブ６８の３’末端が３’プローブ６０の５’末端に隣接されるように設計できる。結合した５’プローブ６８および３’プローブ６０は一緒に結合して（すなわち、共有結合により継ぎ合わせ）、自己触媒的複製のための鋳型を発生させることができる。そのような二成分プローブの使用は、自己触媒的複製可能鋳型を発生するために捕捉プローブと検出プローブとの共有結合による継ぎ合わせを必要とするので、捕捉プローブ、被検体および検出プローブ間の特異的結合が存在しないときの信号発生の可能性を減少させる。
【００６１】
そのような二成分プローブ対で使用される検出および捕捉プローブは両方ともＤＮＡ、両方ともＲＮＡで作製でき、または一つのプローブがＤＮＡで作製できて他方のプローブがＲＮＡで作製できる。さらに、プローブの片方または両方が混合ＤＮＡ／ＲＮＡ組成であってもよい。プローブは例えば標準分子法を用いて、または標準ホスホロアミダイト化学により作製できる。両方ともＲＮＡで作製された５’および３’部分プローブの使用では、そのようなプローブがＱβレプリカーゼ存在下でＲＮＡ組換え反応を促進でき、被検体依存性結合不在下で複製可能ＲＮＡ鋳型の産生を生じるので、バックグラウンド信号の発生が生じる。そのような二成分プローブ系において、ＤＮＡで作製された５’部分プローブおよびＲＮＡで作製された３’部分プローブの使用は、上記のＲＮＡ組換え反応を抑制するので多くの利点を提供する。その結果、はるかに高いレベルの結合されていない遊離プローブがＱβ増幅反応の間に存在でき、ハイブリダイズされていないプローブの除去のためのアッセイの必要性を実質的に減少させる。さらに、ＤＮＡ５’断片とＲＮＡ３’断片の使用は、全ＤＮＡ鋳型よりも著しく効率的に複製される全ＲＮＡ鋳型と同様の効率でキメラ結合生成物が複製することを可能にしている。そのようなキメラの二成分プローブの一般例が以下に記載されている。
【００６２】
５’プローブはＭＤＶ−１（または別の自己触媒的複製可能鋳型）のＤＮＡ版の一部から構成することができ、その３’末端は被検体核酸の一部と相補的なプローブ要素と連結されている。３’プローブはその５’末端の５’プローブにより結合される領域に隣接する被検体領域に相補的であるプローブ配列を含有するＲＮＡ、およびその３’末端の複製可能ＲＮＡ配列の残りから構成できる。各々のプローブのプローブ配列要素は、連結されたＤＮＡ：ＲＮＡキメラ生成物の複製度を改良するために一つまたはそれ以上のスペーサー要素により複製可能配列から分離されていてもよい。
【００６３】
二つのプローブは標的核酸にハイブリダイズし、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼまたは多くの化学試薬の任意の試薬（例えば、ブロモシアン、シアノイミダゾール、１−メチルシアノイミダゾール、カルボニル ジイミダゾールまたは水溶性カルボジイミド）を用いて結合される。結合生成物は、Ｑβレプリカーゼのような酵素およびヌクレオチド三リン酸と接触させて、複製を促進して検出可能な量の複製生成物を発生させる。複製生成物は例えば、複製生成物内へインターカレートする色素（例えば、エチジウムブロミドまたはプロジウムヨージド）による染色、または複製生成物に特異的に結合するプローブとのハイブリダイゼーションにより検出される。
【００６４】
キャピラリー電気泳動
上記のように、被検体およびプローブの装置の結合要素への結合は、試料およびプローブを装置を通して、例えば電気泳動的および／または機械的に注入することにより容易にすることができる。
【００６５】
電気泳動的移送の場合、本装置の結合要素の直線状配列は、ガラス、プラスチックまたはその他の材料で作製され、例えば、約１−２ミリメートル未満、例えば、５００ミクロン未満の内径を持つキャピラリー管のような長く伸ばされたチャンネル内に含ませることができる。例えば、１００ミクロンの内径および５０ミリメートルの長さを持つキャピラリー管が使用できる。より高い表面積−容量比はより細いキャピラリーを使用することにより達成され、それにより、より迅速なハイブリダイゼーション反応速度論を容易にする。高い表面積−容量比従って発散する熱に対して高い熱容量を持つキャピラリー管の使用は、高い電圧の使用を可能にし、従ってアッセイの加速を容易にする。さらに、キャピラリー管の高表面積−容量比では、キャピラリーを通過する標的分子はプローブにきわめて近接するので、プローブへの標的被検体のハイブリダイゼーションが容易になる。
【００６６】
本発明に関連したキャピラリー管の高表面積−容量比の別の結果は、非常に少量の試薬および被検体しか必要としないことであり、被検体は少量または多量の試料容量中に存在している。例えば、レーザーによる蛍光誘導後、ＣＣＤ装置による検出は数百の発蛍光団のみしか必要としないので（例えば、Ｍａｃｋａｙ ｅｔ．ａｌ．，米国特許第４，８７４，４９２号（１９８９）を参照されたい）、約１０6−１０7個の白血球細胞を含む１ミリリットルの血液は本発明の方法を使用する検出のためには十分な量の標的を提供するであろう。細菌ｒＲＮＡが標的被検体である場合、１ミリリットルの試料中の一つの細菌が本発明の方法を用いて検出可能であろう。
【００６７】
キャピラリー電気泳動を実施するための方法は本分野ではよく知られており、例えば、Ｎｏｖｏｔｎｙら（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１１：７３５−７４９，１９９０）により記載されている。いくつかの標準的キャピラリー電気泳動システムの何れもが本発明の方法を実施するために使用できる。例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｐ／ＡＣＥ システム２０５０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）が使用できる。加えて、いくつかのキャピラリー管の同時処理を容易にするシステムが使用できる（例えば、Ｙｅｕｎｇｅｔ．ａｌ．，米国特許第５，３２４，４０１号（１９９４）を参照されたい）。
【００６８】
キャピラリー電気泳動に加え、他の電気泳動法が本発明の方法に使用できる。例えば、ガラスまたはプラスチックプレートのようなプレート内にエッチングされ、結合要素の直線状配列を含むチャンネル中で電気泳動が実施できる。この方法において、チャンネルの各々の末端はウェルと接触しており、その一つに試料（およびプローブ）が加えられる。この型のシステムはより多い試料容量の分析を可能にする。
【００６９】
結合要素に結合した標識の検出
本発明の装置の特異的結合要素に結合した標識の発光、吸光またはその他の検出可能な信号は、標識の性質に依存していくつかの標準法の何れかを用いて検出できる。例えば、発色団標識は分光光度計により特定の波長での光の吸収を測定することにより検出でき、一方、化学発光標識により発生された光はルミノメーターまたはＣＣＤ装置を用いて検出できる。ＣＣＤ装置はまた、より高い周波数の電磁放射線（例えば放射性同位元素標識からの放射線）または標準的水銀光源またはレーザー光線で適当な波長で励起された発蛍光団から発生された蛍光を検出するためにも使用できる。多標的ゾーンを検出するため、キャピラリーは光ファイバー装置で走査でき、またはＣＣＤの配列をキャピラリーに隣接させ、励起光線に垂直に置くこともできる。励起光線は走査装置の一部であってもよく、例えば、内部ファイバーはレーザー光線を運ぶことができ、周囲のファイバーは蛍光光を画像化システムに運び返す。異なった様式においては、レーザー光線はキャピラリー管の一つの末端を通して、内腔を通すように（それによりキャピラリーの内部が光トンネルとして働く）、または壁を通すように（波誘導装置として働く）向けられる。後者の場合、内部壁に非常に近い蛍光標識のみが、表面プラスモン共鳴と称されるよく知られた過程により励起されるであろう。当業者には明らかであろうように、散乱または反射光を除去するためにＣＣＤ装置または光電子増倍管のような検出装置に適当なフィルターを使用できる。
【００７０】
検出器は特定の結合要素に対応する装置中の正確な位置を特異的にモニターするよう配置することができ、必要に応じ、異なった特異的結合要素が検出器で読めるように結合対の直線状配列を移動させることができる。もしくは、検出器は装置に沿って移動させることができる。キャピラリー管の使用を含む別の例においては、結合要素の直線状配列を含んでいるキャピラリーおよび検出器のどちらも移動しない。むしろ、結合要素上で複合体が形成されたら、検出器を通過するようにキャピラリー管内を輸送される。そのような輸送は例えば、液体をキャピラリーを通してポンプで送って直線状配列を還流的に移動させることにより誘導できる。全直線状配列が移動される装置においては、キャピラリーに含まれているにしろまたはいないにしろ、検出器は決定された時間が標識の通過と一致するように流動の開始後の前もって決められた時間にのみ読み取りを行うようにプログラムできる。また、装置の長さに広げられた直線状ＣＣＤ装置も使用できる。信号誘導（例えば、レーザー）および検出装置（例えば、ＣＣＤ装置）を一体化した適当なシステムは本分野ではよく知られている（例えば、Ｆｕｊｉｍｉｙａｅｔ．ａｌ．，米国特許第５，０６９，７６９号（１９９１）；Ｐｅｎｔｏｎｅｙ，米国特許第５，２０８，４６６号（１９９３）を参照されたい。
【００７１】
標的被検体の定量分析を実行するには、標準法を用いて最初に標準曲線を作ることができる。例えば、本発明の方法を用いて検出される標識の量は、既知の量の被検体を含むいくつかの試料について決定できる。これらの読み取りにより作られた標準曲線は、次に検出された信号のレベルを標準曲線と比較することにより、未知の被検体濃度を持つ試料中の被検体濃度の決定に使用できる。
【００７２】
【実施例】
実施例Ｉ−生物的試料中のサルモネラの検出
新規の方法および装置（例えば、図１に例示されている装置）が試料中の病原性生物体の存在の検出、例えば、食品試料中のサルモネラの検出に使用できる。このアッセイを実施するために適応可能な試薬および方法はＧＥＮＥ−ＴＲＡＫサルモネラアッセイキット（ＧＥＮＥ−ＴＲＡＫ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）に提供されている。簡単に記すと、本発明の装置はポリ−Ａプローブが連結された結合要素を含むように作製される。次に、試料、サルモネラ核酸に特異的でありかつポリ−Ｔテイルを含む捕捉プローブ、および同一のサルモネラ核酸に特異的である検出プローブをこの装置の開口部に加える。
【００７３】
必要に応じ、プローブおよび試料は例えば、電気泳動により、または機械的ポンプのような液体運搬装置を使用することにより装置を通して多数回輸送できる。非結合検出プローブのような非特異的結合物質を除いた後、ポリ−Ａプローブを含んでいる装置の結合要素を、標識の型について適当な方法（例えば、上記参照）を用いて検出プローブ標識の存在についてモニターする。
【００７４】
サルモネラに加え、装置が各々の追加の病原体について、（１）他の病原体に特異的なプローブ、または（２）結合対の一つの構成物を含むプローブ、その他方の構成物は他の病原体に特異的なプローブの成分である（同一アッセイにおいてサルモネラ検出に使用されたポリ−Ａ／ポリ−Ｔ結合対は他の病原体の検出には使用できないことに注意されたい）、を含んでいる結合要素を含むならば、試料中の他の病原体の存在が同一の装置を用いて同時にモニターできる。上記の記載と一致して、他の病原体のためのプローブは直接的に結合要素に結合されるか、または病原体特異的被検体への結合に加えて、（１）結合要素に結合されている、および（２）上記のポリ−Ａプローブとは別個であるプローブへ結合する捕捉プローブであってもよい。
【００７５】
実施例 II −染色体転座の検出
本発明は染色体転座を検出するためにも使用できる。特定の例として、本発明は、その存在がしばしば急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）および慢性骨髄発生性白血病（ＣＭＬ）の潜在的原因であるいわゆる”フィラデルフィア”染色体を検出するために使用できる。フィラデルフィア染色体は染色体９の終端領域の染色体２２の終端領域への均衡転座を持つことにより特徴付けられる。このことにより、染色体９上のａｂｌ癌遺伝子と染色体２２上のｂｃｒ遺伝子との間で遺伝子融合が生じる。この遺伝子融合は両方の遺伝子に対応する領域を含むメッセージに転写される。
【００７６】
本発明を用いてそのような転座を以下のように検出することができる。捕捉プローブは融合のｂｃｒ領域（遺伝子それ自身またはそのＲＮＡ（前ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ）転写体）にハイブリダイズするように設計でき、一方、検出プローブはａｂｌ領域にハイブリダイズするように設計できる。本発明の装置は、捕捉プローブが特異的結合要素へ連結されているように作製できる。もしくは、装置の結合要素は特異的結合対の一つの構成物（例えば、アビジン）を含むことができ、かつ捕捉プローブは特異的結合対の他の構成物（例えばビオチン）を含むことができる。両方の場合とも、試料、捕捉プローブおよび検出プローブを結合要素と接触させ、例えば、電気泳動または機械的なポンプによる送り出しにより非結合成分（例えば、非結合検出プローブ）を除去し、ｂｃｒ結合要素上のａｂｌ検出プローブの存在をモニターする。ｂｃｒ捕捉プローブによるａｂｌ検出プローブの捕捉は試料中のフィラデルフィア転座の存在を示している。
【００７７】
本発明の方法を使用したＣＭＬおよびＡＬＬの診断は、ｂｃｒ遺伝子中の異なった配列を認識する多重捕捉プローブを用いても実施できる。これらのプローブを用いて、染色体２２上の異なった***点を含む転座を区別することができる。この方法は以下に例示されている。
【００７８】
モデル標的、捕捉プローブおよび検出プローブとしての合成オリゴヌクレオチドモデル標的
ＡＬＬおよびＣＭＬキメラｍＲＮＡを模倣するように二つの標的が設計された。ＡＬＬモデル標的（４０ｍｅｒ）はｂｃｒ配列の２０ヌクレオチド（ヌクレオチド１５９４−１６１３）およびａｂｌ配列の２０ヌクレオチド（ヌクレオチド４６３−４８２）を含んでいる。
【００７９】
ＡＬＬモデル標的：
ＣＭＬモデル標的（４０ｍｅｒ）は２０ヌクレオチドのＣＭＬ特異的ｂｃｒ配列（ヌクレオチド３３４９−３３６８）および２０ヌクレオチドのＡＬＬモデル標的と同一のａｂｌ配列（ヌクレオチド４６３−４８２）を含んでいる。
【００８０】
ＣＭＬモデル標的：
捕捉プローブ
１８ｍｅｒであり、５’がカルボキシル化され、かつＡＬＬ標的のｂｃｒ領域と相補的なＡＬＬ捕捉プローブは以下の配列を持っている。
【００８１】
ＡＬＬ捕捉プローブ：
１８ｍｅｒであり、５’がカルボキシル化され、かつＣＭＬ標的プローブのｂｃｒ領域と相補的なＣＭＬ捕捉プローブは以下の配列を持っている。
【００８２】
ＣＭＬ捕捉プローブ：
二つの不完全な相補性（２つおよび４つのミスマッチ）ＣＭＬ捕捉プローブがハイブリダイゼーションの特異性を試験するために作製された。２つのミスマッチ（下線）を含むプローブ２ＭＳは以下の配列を持っている。
【００８３】
プローブ２ＭＳ：
４つのミスマッチを含むプローブ４ＭＳは以下の配列を持っている。
【００８４】
プローブ４ＭＳ：
検出プローブ
ＦＩＴＣで標識された検出プローブ（ＤＰ，２０ｍｅｒ）はＡＬＬおよびＣＭＬ両方のモデル標的に共通のａｂｌ配列に相補的である。検出プローブは以下の配列を持っている。
【００８５】
検出プローブ（ＤＰ）：
フィラデルフィア転座を検出および区別するための装置の製造
以下のように結合要素として使用するためのＡｆｆｉ−Ｇｅｌ １０２ビーズに捕捉プローブを結合させるために１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いるカップリング反応が使用された。
【００８６】
１．５ｍｌの水中でＡｆｆｉ−Ｇｅｌ１０２ゲルスラリー（０．５ｍｌ）を５００ｎｍｏｌｅのＤＮＡオリゴマー（ＡＬＬまたはＣＭＬ特異的捕捉プローブ）を混合し、５０μｌの０．２Ｎ ＨＣｌでｐＨを４．８−５．０に調整した。０．５ｍｇのＥＤＡＣを添加後、３０μｌの０．２Ｎ ＨＣｌでｐＨを再び５．０に調整し、混合物を室温で３時間振とうした。カップリング効率は７０％に達しており、３５０ｎｍｏｌｅのＤＮＡが４００μｌの湿ったゲルビーズに結合した。約２．５ｍｍの内径を持つガラスキャピラリーの一つの末端にガラスウールを詰め、結合された捕捉プローブを持つかまたは持たないゲルビーズを交互の層で充填した。
【００８７】
装置上での多標的捕捉の実証
すべてのプローブが１μＭの濃度になるように、３ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）中で合成モデル標的（ＡＬＬまたはＣＭＬ）を検出プローブと混合した。７０℃で５分間加熱した後、モデル標的および検出プローブを室温で１時間ハイブリダイズさせた。この混合物の一部を３ｘＳＳＣで希釈して全容量３００μｌ中、２５ｐｍｏｌｅハイブリッドの最終濃度とした。ＡＬＬ標的−検出プローブハイブリッドは、ＡＬＬまたはＣＭＬ捕捉プローブを含むかまたは捕捉プローブを含まないビーズの交互の層を含むキャピラリー（上記参照）を７５μｌ／分の流量で通過させた。次にキャピラリーを１ｍｌの３ｘＳＣＣで２回洗浄した。ＦＩＴＣ発蛍光団の励起およびＦＩＴＣ特異的蛍光光を捕捉するための適当なシステムを用いてゲル−ベッドを含んでいるキャピラリーの領域をＣＣＤ装置で画像化した。
【００８８】
図４ＡはＡＬＬ特異性捕捉プローブを含む３つすべての領域がモデル標的−検出プローブ複合体のいくつかを捕捉したことを示している。次にＣＭＬ特異性標的−検出プローブ複合体を同一条件下でキャピラリーに加え、非結合物質を含まないようにキャピラリーを洗浄した後、キャピラリーを再び画像化した。図４ＢはＣＭＬ特異性捕捉プローブを含むゲルゾーンにおけるＣＭＬ特異性標的複合体の捕捉を示している。ＣＭＬとＡＬＬ特異的ゲルベッドとの間のゲルの領域は捕捉プローブを含まず、従って非蛍光性のまま残っている。ガラスウールはいくらかの非特異的自己蛍光を示している。
【００８９】
標的特異性の実証
ガラスキャピラリーを、ＣＭＬ特異性捕捉プローブの単一層、および何の捕捉プローブも含まないゲル層により分離された、２つのミスマッチ（２ＭＳ）または４つのミスマッチ（４ＭＳ）を含んでいるゲルの各々１つの層で充填した。ＣＭＬ特異性モデル標的−検出プローブハイブリッド（１００μｌ中に５ｐｍｏｌｅ）をキャピラリーに０．０１３ｍｌ／分の流量で加えた。次にキャピラリーを各々１ｍｌの３ｘＳＳＣで２５℃、４２℃、５２℃、５８℃および７０℃で洗浄した。標的−検出プローブ複合体を加える前および各々の洗浄後にキャピラリーを画像化した。重要な領域の露光過多または不足を避けるために各々の画像に対して異なった露光時間が選択された。図５はＣＭＬ標的を加える前のガラスウールのみによる自己蛍光（長時間暴露後）を示している。室温（約２３℃）でＣＭＬモデル標的を加えると、２ＭＳミスマッチおよびＣＭＬ特異的捕捉ゾーンへの結合が起こったが、４ＭＳミスマッチゾーンでは起こらなかった。温度を４２℃に上昇させると、モデル標的は２ＭＳミスマッチから放出されたが、ＣＭＬモデル標的ゾーンからは放出されず、本装置の特異的ゾーン中の標的特異的捕捉が適当な温度で成し遂げられることを示している。
【００９０】
他の態様
本発明をその詳細な説明に関連して説明してきたが、前述の記載は例示を意図しているものであり、本発明の範囲を制限するものではないことを理解しなければならない。本発明の他の態様、利点および変形は特許請求の範囲内に含まれている。
【００９１】
【配列表】
【００９２】
【００９３】
【００９４】
【００９５】
【００９６】
【００９７】
【００９８】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は本発明の装置を使用するための自動化アッセイシステムの概略図である。
【図２】 図２は、本発明の別の装置を使用するためのアッセイシステムの概略図である。Ａは上面図であり、ＢはＡの線２Ｂ−２Ｂに沿った側面断面図である。
【図３】 図３は、それに連結された捕捉プローブを有する結合要素の概略図である。
【図４】 図４は本発明の装置中に捕捉された標識−検出プローブ複合体の蛍光信号を示している電気イメージである。Ａは本発明の装置中に捕捉された急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）特異的標識−検出プローブ複合体の蛍光信号を示している電気イメージである。Ｂは本発明の装置中に捕捉された急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）特異的および慢性骨髄発生性白血病（ＣＭＬ）特異的標識−検出プローブ複合体の蛍光信号を示している電気イメージである。
【図５】 図５は本発明の装置上のＣＭＬ標的捕捉の特異性を示している一連のコンピューター作製イメージである。
【発明の属する技術分野】
本発明は試料中の多被検体を検出するための装置および方法に関する。
【０００２】
本発明はＡｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒａｍプロジェクト番号９５−０８−００１２および商務省により与えられた協力同意番号７０ＮＡＮＢ５Ｈ１１０８の下で一部米国政府により支援され、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより管理されている。該政府は本発明にある種の権利を持つ。
【０００３】
【従来の技術】
試料中に痕跡量で存在する被検体の検出は感度が高くおよび特異的な方法を必要とする。さもなくば、そのような被検体の検出は試料中に高い濃度で見いだされる物質の存在により覆い隠されてしまうであろう。もし被検体が検出を容易にする物理的または化学的特性を持っていない場合、この問題は倍加される。
【０００４】
ゲノセンサーとは試料中の標的核酸の検出を容易にするプローブの群または組を含んでいる装置である。例えば、Ｂｅａｔｔｉｅら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１（５）：７００−７０６，１９９６）は、核酸プローブの３ｘ３マトリックスを含む単層シリコンウェハーを含んでいる通過式ゲノセンサーを記載している。プローブが結合できる標的核酸を含んでいると疑われる試料は、弱い真空または吸引を与えることによりゲノセンサーを通過させる。
【０００５】
試料中の標的分子を検出するために使用される別の装置はディップスティックであり、それは抗体のようなプローブを含む細長いストリップである。ディップスティックはプローブに結合する分子を含んでいると疑われる試料内へ浸される。例えば、Ｕｒｎｏｖｉｔｚ（米国特許第５，４４７，８３７号、１９９５年）は試料中の異なった抗原または抗体存在の検出に使用するために、対応する異なった抗体または抗原を各々含んでいる分離された領域を含むディップスティックを記載している。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は試料中の多被検体を検出するための装置および方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、そこに結合する異なった被検体に特異的である結合因子またはプローブを各々有する結合要素の直線状配列を含む容器またはチャンネル（例えば管）を各々が含むアッセイ装置を提供する。本装置は試料中の多被検体の同時分析のための方法に使用できる。これらの方法を使用した場合、バーコードに似ている信号の直線状配列が装置内で発生する。
【０００８】
従って、一つの態様において、本発明は試料から被検体（例えば、核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂質、代謝物または薬剤）を単離するためのアッセイ装置を特徴としている。アッセイ装置は、対応する特異的成分が結合する異なった結合因子に各々が連結されている結合要素の直線状配列を含んでいる、キャピラリー管のような管から構成されている。アッセイ装置中の結合要素の各々は、結合要素の全周囲に沿って管の内部表面に密閉的に接触するように配置されている。結合要素は別の要素と隣接するように配置されていてもよく、または異なった結合因子を欠く領域により分離されていてもよい。
【０００９】
結合要素の少なくとも一つの異なった結合因子は捕捉プローブから構成されていてもよく、その場合、対応する特異的成分は標的被検体である。もしくは、結合要素の少なくとも一つの異なった結合因子は特異的結合対の一つの構成物から構成されていてもよく、その場合、対応する特異的成分は特異的結合対の他の構成物および被検体に結合する捕捉プローブである。
【００１０】
結合要素の少なくとも一つの異なった結合因子は核酸、例えば、自己触媒的に複製可能な核酸、またはポリペプチドの一部から構成されていてもよい。
【００１１】
第二の態様において、本発明は試料中の被検体（例えば、核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂質、代謝物または薬剤）の存在を検出するための方法を特徴とする。この方法において、被検体は検出可能な標識で標識されており（例えば、検出プローブにより提供される検出可能な標識、それは核酸でもポリペプチドでもよい）、捕捉プローブ（例えば、核酸でもポリペプチドでもよい）と接触して本発明の装置中の特異的結合要素上で被検体−捕捉プローブ複合体を形成する。結合要素上の検出可能標識が試料中の被検体の存在の尺度として検出できるように複合体中の被検体に特異的に結合しない検出可能標識は続いて除去される。好適には、複合体中で被検体に特異的に結合されていない実質的にすべての検出可能標識が装置から除去される。例えば、好適には少なくとも５０％、またはより好適には少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または１００％の非結合標識が除去される。
【００１２】
異なった結合因子は捕捉プローブから構成されることができ、接触工程は被検体を１回またはそれ以上装置を通過させることにより実施できる。被検体は例えば、機械的ポンピングまたは被検体に電界を印加することにより装置内を通過させることができる。標識工程および接触工程は同時に実施してもよく、あるいは標識工程の前に接触工程を実施することもできる。
【００１３】
本発明の方法の一つの例において、被検体は核酸からなり、検出プローブは一つの末端上の自己触媒的複製可能核酸の一部および他の末端上の第一の被検体結合要素からなり、そして捕捉プローブは末端上の自己触媒的複製可能核酸の残りおよび他の末端上の第二の被検体結合要素からなる。第一および第二の被検体結合要素は核酸被検体中の隣接するヌクレオチドセグメントに結合する。この方法は（１）第一および第二の被検体結合要素を互いに結合させて複製鋳型を形成させる、および（２）鋳型を複製して検出可能な信号を発生させる工程を含んでいる。
【００１４】
結合要素の異なった結合因子は、捕捉プローブであるというより、特異的結合対の一員であることができ、別々の捕捉プローブは特異的結合対の他の構成物を含むことができる。接触工程は例えば、装置を通して試料および捕捉プローブを通過させることにより実施できる。
【００１５】
本発明はまた、本発明のアッセイ装置と液体連絡を有する能動液体輸送を提供する手段を含むアッセイシステムも提供する。本発明の装置と液体連絡を有する液体運搬装置を含むアッセイシステムもまた本発明に含まれる。
【００１６】
試料から被検体を単離するためのアッセイ装置もまた本発明に含まれ、本装置は、内部内腔表面を持ち、結合要素の直線状配列を含むチャンネル（例えば、管またはガラス表面のような表面内へエッチングされたチャンネル）を含んでいる。この装置中の各々の結合要素は、対応する特異的成分が結合する別個の結合因子を含んでいる。加えて、この装置中の各々の結合要素はチャンネルの別個の領域の内腔表面を含んでいる。この装置内の別個の結合因子の少なくとも一つは、フォトリソグラフィーまたは化学的カップリングのような方法により結合要素の少なくとも一つに結合されている（下記参照）。
【００１７】
本発明は、試料中の多被検体の高感度、微量での同時分析を可能とするためいくつかの利点を提供する。検出された被検体は装置上で物理的に分離されるので、異なった被検体に特異的である検出プローブ上に別個の標識を使用する必要がない。本発明の方法はまた、少量の試料および試薬容量しか必要とせず（必要に応じ、大容量でも使用できる）、迅速でありかつ自動化に容易に適用できる。本装置のかなめの特色は、希薄な溶液から被検体を本発明の装置内の小さな捕捉ゾーン（すなわち、結合要素）内へ単離および濃縮する能力であり、それは物理的増幅を意味している。このことは感度を上昇させ、いくつかの応用でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用によるような酵素的増幅の必要を回避する。
【００１８】
ある実施態様において、本発明の装置および方法で使用されるプローブは核酸である。一対の核酸分子（または単一核酸分子内の二つの領域）は、それらの間で塩基対相互作用によりデュープレックスを形成する場合、互いに”ハイブリダイズする”と称される。本分野で知られているように、核酸対間のハイブリダイゼーションはハイブリダイズする領域間の完全な相補性は必要とせず、使用される条件下でデュープレックスを維持するために十分なレベルの塩基対生成があればよい。
【００１９】
ハイブリダイゼーション反応は典型的には”ストリンジェント条件”下、例えば、特異的および非特異的相互作用が起こり得る低から中ストリンジェンシー条件下で実施される。ハイブリダイゼーション後、非特異的結合を除去するためにより高いストリンジェンシー条件下で洗浄が行われる。本分野では既知のように、最適な洗浄条件は経験的に決定されるであろう（例えば、ストリンジェンシーを徐々に増加させることにより）。ストリンジェンシーに影響を及ぼすために変化できる条件パラメーターには、例えば、温度および塩濃度が含まれる。一般に、塩濃度をより低くし、および温度をより高くするとストリンジェンシーはより高くなる。例えば、ハイブリダイゼーション溶液と等しいまたはより低い塩濃度を含む溶液を用いて、低温（例えば、室温）から洗浄を開始することができる。続いての洗浄は、同一の塩濃度を持ち、段々に温かい溶液を用いて実施できる。もしくは、洗浄工程では温度は保ちながら塩濃度をより低くするか、または塩濃度をより低くしかつ温度を上昇させることができる。そのような標準的変化は本分野では既知である。ストリンジェンシーに影響するために変更できる他のパラメーターには、例えば、ホルムアミドのような不安定化剤の使用が含まれる。
【００２０】
核酸ハイブリダイゼーション反応において、特定のレベルのストリンジェンシーの達成に使用される条件は、ハイブリダイズする核酸の性質に依存して変化するであろう。例えば、核酸のハイブリダイズする領域の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列組成（例えば、ＧＣ ｖ ＡＴ含量）、および核酸の型（例えば、ＲＮＡ ｖ ＤＮＡ）をハイブリダイゼーション条件を選択する際に考慮することができる。さらに、核酸の一つが固定化される（例えば、フィルター上に）かどうかも考慮される。
【００２１】
以下にさらに詳しく説明されるように（実施例II参照）、本発明の方法で使用できるハイブリダイゼーション条件の一つの例は、３ｘＳＳＣ中、室温でのハイブリダイゼーション、および続いての３ｘＳＳＣでの洗浄を含んでいる。従って、この実施例においてはハイブリダイゼーションから洗浄までストリンジェンシーは変化していない。以下に記載する別の実施例では（実施例II参照）、ハイブリダイゼーションは３ｘＳＳＣ中、室温で実施され、続いての洗浄は３ｘＳＳＣ中、以下の温度で実施される：２５℃、４２℃、５２℃、５８℃および７０℃。
【００２２】
段々にストリンジェンシー条件を高くする別の例は以下のようである：室温で２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（ハイブリダイゼーション条件）；室温で０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（低ストリンジェンシー条件）；４２℃で０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（中ストリンジェンシー条件）；および６８℃で０．１ｘＳＳＣ（高ストリンジェンシー条件）。洗浄はこれらの条件のただ一つ（例えば、高いストリンジェンシー条件）で実施されるか、または各々の条件も使用できる（例えば、上に掲げた順序で各々１０−１５分、上に掲げた段階の任意のものまたはすべてを繰り返して）。しかしながら、上に記載したように、至適の条件は含まれる特定のハイブリダイゼーション反応に依存して変化するであろうので、経験的に決定することができる。
【００２３】
核酸ハイブリダイゼーションと同様に、タンパク質−タンパク質結合反応および非特異的結合を除去するための続いての洗浄は、互いのタンパク質の親和性に依存して種々の条件下で実施できる。例えば、結合反応は生理的塩濃度を持つ緩衝液中で生じさせることができ、洗浄は増加した塩濃度を持つ緩衝液を用いて実施することができる。洗浄条件のストリンジェンシーはまた、洗浄溶液にＴＷＥＥＮ−２０TMおよびＴＲＩＴＯＮ−ＸTMのような界面活性剤を含ませることにより高くすることができる。
【００２４】
分子対の構成物（例えば、検出プローブまたは捕捉プローブおよび標的被検体または特異的結合対の構成物（例えば、抗体−抗原、核酸およびタンパク質−ビタミン結合対））は、それらが他の非特異的分子よりも強い親和性で互いに結合する場合、互いに”特異的に結合する”と称される。例えば、一つの抗原に対して引き起こされた抗体はその抗原に対して非特異的な抗原よりもより有効に結合するのでその抗原に特異的に結合すると記述できる。同様に、核酸プローブは、それが標的と塩基対形成相互作用により特異的デュープレックスを形成する場合、核酸標的に特異的に結合すると記述される。
【００２５】
特に記載しない限り、本明細書で使用されたすべての技術および科学的用語は本発明が属する分野の当業者により共通して理解されるものと同じ意味を持っている。本明細書に記載されたものと類似または均等な方法および材料が本発明の実施または試験に使用できるが、いくつかの好適な方法および材料が以下に記載されている。本明細書で述べられたすべての刊行物、特許出願、特許および他の参照文献は全文のまま本明細書で援用される。矛盾する場合、本明細書が調節するであろう。さらに、記載された材料および方法は例示のためだけのものであり、制限を意図しているものではない。
【００２６】
本発明の他の特色および利点は以下の詳細な説明および請求の範囲から明らかになるであろう。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明は試料中の多標的被検体（例えば、１００までまたはそれ以上の異なった被検体）を検出するための装置および方法を提供する。本発明の方法の中心的特色は標的被検体へのプローブの特異的結合である。これは例えばサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ（例えばＲａｎｋｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ２１：７７−８５，１９８３；米国特許第４，４８６，５３９号（１９８４）を参照されたい）を使用することにより実施できる。サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイは捕捉プローブおよび検出プローブの使用を含んでおり、それらは標的被検体に同時に結合して捕捉プローブ−被検体−検出プローブ複合体を形成するように設計されている。本発明の文脈において、検出プローブは検出可能な標識を含んでおり、捕捉プローブは（１）特異的結合対の第一の構成物を含んでいるか、または（２）本発明の装置の特異的結合要素上に固定化されている（下記参照）。これらの場合のどちらにおいても、捕捉プローブの使用は試料成分から、ならびに非結合検出プローブからの被検体−プローブ複合体の精製を容易にする。
【００２８】
検出可能標識が検出プローブの一部として提供されるサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイに加え、標的それ自身が標識されるアッセイも使用できる。そのようなアッセイにおいては検出プローブは必要とされない。例えば、本発明の装置と接触させる前または後に、標的は標識ヌクレオチド（例えば、蛍光または同位元素標識ヌクレオチド）存在下でＰＣＲにより増幅できる。同様に、標的は標識ヌクレオチドを含むプライマー伸長反応で標識できる。標的はまた、例えば、標的の標識された成分（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）と標的を産生する細胞とを接触させることにより代謝的に標識することもできる。標識化した標的は、上記のような特異的捕捉プローブに結合させることにより、本発明の装置の特異的結合要素上に固定化される。検出プローブはまた、核酸捕捉プローブと被検体との間のデュープレックス形成を測定するために挿入色素（例えば、エチジウムブロミドまたはプロピジウムヨージド）の検出が用いられる場合にも必要とされない。
【００２９】
本発明に含まれる装置の一つの例は、各々が結合要素上の結合因子として固定化された別個の対応する被検体に特異的な捕捉プローブを含む結合要素の直線状配列を含んでいる容器またはチャンネル（例えば、キャピラリー管のような管）から構成される。この装置は結合要素上に捕捉プローブ−被検体−検出プローブ複合体が形成されるいくつかの方法で使用できる。好適には、捕捉プローブと接触する前に被検体および検出プローブが互いに接触して被検体−検出プローブ複合体が形成される。本装置の結合要素は、例えば、機械的または電気泳動的輸送により試料を装置内を通過させることにより被検体−検出プローブ複合体を含む試料と接触させることができる。被検体−検出プローブ複合体がその対応する装置内の結合要素と接触すると捕捉プローブ−被検体−検出プローブ複合体が形成される。
【００３０】
本方法の変法において、捕捉プローブ−被検体複合体が本装置の結合要素上で形成されるように、被検体を検出プローブと接触させる前に被検体を含む試料を本装置に適用する。続いて、被検体に特異的に結合し検出可能な標識を含む検出プローブを結合要素上に形成された捕捉プローブ−被検体複合体と接触させる。この方法の別の変法においては、被検体を含んでいる試料および検出プローブを個々に同時に装置と接触させる。
【００３１】
必要なら、捕捉プローブとその対応する被検体または被検体−検出プローブ複合体との間の特異的結合の見込みを増加させるために、試料およびプローブを装置を多数回通過させることができる。そのような方法が使用される場合、捕捉プローブ、被検体および検出プローブの間の接触の順序はあまり関係がない。試料およびプローブを多数回装置に通すことは、例えば、両方の末端が装置に連結された管の使用により容易にできる。試料およびプローブはペリスタポンプを用いて装置および管を通して、繰り返しポンプで送ることができる。試料およびプローブが装置を１回だけ通過するような場合、検出プローブおよび被検体を装置と接触させる前に検出プローブ−被検体複合体を形成させておくことが好ましい。
【００３２】
非結合検出プローブおよび非特異的結合試料成分は、装置の組成および結合複合体に依存して、例えば、アッセイ装置と液体連絡があるように配置されている機械式ポンプ（例えば、圧電式ポンプ装置）のような能動液体輸送体、電気泳動、真空の適用またはこれらの方法の組み合わせを使用することにより装置から除去できる。特異的捕捉プローブに対応している装置の結合要素上の標識の検出は、試料中の対応する被検体の存在の尺度として使用できる。
【００３３】
本発明に含まれる装置の第二の例は、結合要素の直線状配列を含むチャンネル（例えば、管）から成っており、各々の結合要素は結合因子として特定の特異的結合対の固定化された構成物に連結されている（例えば、共有結合または非共有結合により）。この装置は、例えば機械的または電気泳動的輸送により試料およびプローブを装置内を通過させることにより、装置の結合要素を試料、捕捉プローブ（その各々は特定の結合対の他の構成物を含んでいる）および標識検出プローブと接触させるような方法において使用できる。必要なら、特異的複合体形成の見込みを増加させるために、試料およびプローブを装置を多数回通過させることができる。次に、非結合検出プローブおよび非特異的結合試料成分は、装置の組成および結合複合体に依存して、例えば、機械式ポンプ（例えば、圧電式ポンプ装置）のような液体運搬装置、電気泳動、真空の適用またはこれらの方法の組み合わせを使用することにより装置から洗浄できる。特定の特異的結合対に対応している装置の結合要素上の標識の検出は、試料中の被検体の存在の尺度として使用できる。本発明の方法において、試料、検出プローブ、捕捉プローブおよび装置は互いに任意の順序で接触できる。好適には、捕捉プローブ−被検体−検出プローブ複合体が装置内への試料の導入に先立って形成される。
【００３４】
結合要素の直線状配列を含み、その各々が特定の特異的結合対の構成物の別個の組を含むこの特定の装置の利点は、単一の装置が実質的に無限の数の被検体の検出に使用できることである。このことを達成するために変更することが必要とされるこのシステムのただ一つの要素は、捕捉および検出プローブの被検体−結合領域である。結合要素上の挿入色素のレベルが測定される場合（上記参照）、各々の被検体に対して変更することが必要とされるこのシステムのただ一つの成分は捕捉プローブの被検体−特異的結合領域である。
【００３５】
装置
本発明の装置は、各々がそれに連結された（１）被検体−特異的捕捉プローブ、または（２）特定の特異的結合対の構成物を有する結合要素の直線状配列を含むチャンネル、例えば管から成っている。以下に記載するように、本発明の装置は多くの様式により具体化できる。
【００３６】
例えば、図１は本発明の装置１１を含んでいる自動化アッセイシステム１０を示す。装置１１は管、例えばキャピラリー管１８の内腔中に一次元的積み重ねで層積された結合要素１４の直線状配列１２を含んでいる。この様式の結合要素は任意の標準的カラム充填材料から構成できる。例えば、ガラスマイクロビーズ、フリットガラス、焼結ガラス、シリコン、アガロースビーズ、ガラスウールまたはゲル、例えばポリアクリルアミドゲルが使用できる。従って、結合要素は多くの別個なサブユニット、例えばビーズから作り上げることができ、それらは各々同一の結合因子へ連結されている。それは、それら自身が個々のサブユニットであるというより、各々が同一の結合因子に連結している”結合要素”であるそのような同様のサブユニットの群である。そのような結合要素を含んでいる装置は標準的方法を用いて作製できる。例えば、管の一つの末端にプラグを置くことができ、結合要素が作られる材料は管の他の末端に置くことができる。プラグを含む管の末端に吸引を与えることにより結合要素を位置させることができる。追加の結合要素は、所望の結合要素材料を用いてこの過程を繰り返すことにより装置へ追加することができる。結合要素は互いに先端に直接積み重ねることができるが、捕捉プローブ（または特定の特異的結合対の構成物）を欠く不活性層をそれらの間に置くこともできる。そのように積み重なった結合要素は、各々が管の内部表面と密閉的に接触するように、すなわち各々がその全周囲に沿って管の内部表面に接触するような形状および配置とされなければならない。例えば、管が円形の断面を持っている場合、結合要素は各々円形断面を持ち、管内に加圧適合できるように管の内径よりもわずかに小さな直径を持っているであろう。この形状は、被検体を含んでいる液体が積み重なった結合要素の各々を通って流れる（周囲ではなく）ことを強要する。
【００３７】
結合要素は捕捉プローブ（または特定の特異的結合対の構成物）が固定されているフィルターまたは膜（例えば、ナイロンまたはニトロセルロース膜）の積み重ねで構成することもできる。例えば、ＤＮＡプローブをナイロンフィルターへ共有結合で結合させ、続いて各々のフィルター間に多孔性、不活性、両面付着シートを置くことにより多くの別個のプローブを含んでいる多数のフィルターを積み重ねて装置を作ることができる。
【００３８】
本発明の装置の結合要素は例えば、０．０５から１ｍｍの厚さで、同様のサイズの直径を持っているであろう。そのような寸法を持っている結合要素は、例えば、ポリスチレンまたはガラスビーズの層から構成でき、またはガラス表面のような平面表面内にエッチングされたチャンネルの場合は（下記参照）、結合要素は個々のビーズの直線状配列により構成できる。もしくは、約０．０５ｍｍの直径のエッチングされたチャンネルの内壁、または同様な直径を持つキャピラリー管の内壁は、０．０２ｍｍから１ｍｍの厚さの結合要素を発生させるためにレーザーにより活性化できる（下記参照）。
【００３９】
結合要素は好適には、すべての標的被検体（または特定の特異的結合対の構成物を含んでいる捕捉プローブ）がその対応する捕捉プローブ（または特定の特異的結合対の対応する構成物）のごく近傍で装置を通過することを助力するような表面−容量比を持つように設計される。好ましい表面面積−容量比を持つ結合要素の選択は、当業者には容易に判断されるであろう。例えば、ガラスまたはアガロースビーズのような、試料およびプローブがそのまわりを流れるであろう材料を選択してもよいし、または望ましくは、多孔性ビーズまたはフィルターのような、試料およびプローブがそこを通って流れるであろう材料を選択してもよい。いずれの場合も、本分野で理解されているように、表面面積−容量比に加えて、材料を通過する可能な流量のような因子を、結合要素として使用するための材料の選択において考慮することができる。
【００４０】
積み重ねられた結合要素は、それらが含む捕捉プローブ（または特定の特異的結合対の構成物）、それらが作られた材料および／またはそれらの間の不活性スペーサー（すなわち、捕捉プローブを持たない）の存在により互いに区別できる。適当な陽性および陰性対照もまた装置の結合要素の積み重ね中に含ませることができる。
【００４１】
フィルター、膜または上記のその他のマトリックスへの連結に加え、捕捉プローブ（または特定の特異的結合対の対応する構成物）はチャンネル（例えば、キャピラリー管の様な管）の内腔上の別個の結合要素領域に連結できる。そのような表面への核酸およびポリペプチドプローブのようなプローブの接着は、表面上の反応性基への直接的吸着または化学的結合を含む多くの標準法を用いて実施できる。例えばリンカー、例えば、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランリンカー（例えば、Ｍａｓｋｏｓ ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０（７）：１６７９−１６８４，１９９２を参照されたい）のような融通性のある炭素鎖が使用できる。フォトリソグラフィーもまたこの型の装置の作製に使用できる。この方法においては、管の内腔表面は光感受性リンカーで被覆され、特異的捕捉プローブの結合が望まれる管の領域にレーザービームが向けられる。続いてプローブを管に通し、ここでプローブはレーザー活性化領域に結合する。過剰のプローブを流し出した後、管の別の領域をレーザー活性化して異なったプローブを接触させ、このプロセスを所望の数の結合要素が得られるまで繰り返すことができる（例えば、米国特許第５，１４３，８５４号；ＷＯ９２／１００９２；およびＷＯ９０／１５０７０を参照されたい）。同様の方法を用いて、結合要素がガラス板のような平らな表面内へエッチングされたチャンネルの内腔壁の領域に連結された捕捉プローブから構成されている装置を作製することができる。
【００４２】
本新規装置は自動化アッセイシステムに組み込むことができる。例えば、アッセイ装置１１を含んでいる自動化アッセイシステム１０が図１に図解して例示されている。装置１１中の結合要素１４の直線状配列１２（各々は不活性スペーサー１６により分離されている）がキャピラリー管１８内に含まれている。標的被検体を含んでいると疑われる試料は混合室２０に導入され、次にシリンジポンプ２２、二つのバルブ２４および２６、および液体ライン１１ａ、１１ｂ、２２ａ、２８ａ、２８ｂ、３０ａ、３２ａおよび３４ａを含む自動化システム１０により、混合室２０から装置１１内へ移される。本システムはまた、ハイブリダイゼーション緩衝液３０、洗浄緩衝液３２および一つまたはそれ以上の検出プローブ３４を含んでいる貯蔵器も含んでいる。システムの機械的操作（例えば、バルブ２４および２６の開閉）はコンピューター（示されていない）により制御できる。このアッセイシステム１０を用いる試料中の核酸被検体を検出するための工程は以下に簡単に説明されている。
【００４３】
ハイブリダイゼーション緩衝液は液体ライン３０ａ、バルブ２４、液体ライン２２ａを通してハイブリダイゼーション緩衝液貯蔵器３０からシリンジポンプ２２内へ引き出され、次に液体ライン２２ａ、バルブ２４、液体ライン２８ａを通して標的被検体を含んでいると疑われる試料を含む混合室２０内へポンプで送り出される。次に検出プローブが検出プローブ貯蔵器３４から引き出され、液体ライン３４ａ、バルブ２４、液体ライン２８ａおよびバルブ２６を通して混合室２０内へポンプで送り出され、そこでシリンジポンプ２２による急速な脈動により試料と混合される。試料−プローブ混合物は次に混合室２０中で、標的被検体と検出プローブのハイブリダイゼーションを容易にする温度まで、導管３６ａを経て加熱器３６により加熱される。混合物は次にバルブ２６、液体ライン２８ａ、バルブ２４、および液体ライン２２ａを通してシリンジポンプ２２内へ戻され、続いて液体ライン２２ａ、バルブ２４、および液体ライン１１ａを通して、導管３６ａを経て加熱器３６により前もって加熱されている装置１１へ押し出され、次に液体ライン２８ｂを通して混合室２０内へ戻される。この工程の間、混合物は装置１１中の結合要素１２の直線状配列を通過する。
【００４４】
標的被検体配列に配列相補性を持つ結合要素１４の直線状配列１２中の結合要素１４上のプローブと接触した標的−検出プローブ複合体は結合要素１４上に固定化される。この工程は、十分なパーセントの標的被検体が結合要素１４の直線状配列１２中の結合要素１４上に捕捉されるまで数回繰り返すことができる。
【００４５】
混合物は次に、液体ライン２８ｂ、バルブ２６、液体ライン２８ａ、バルブ２４および液体ライン１１ｂを経て廃棄物収集室３８へポンプで送られ、洗浄緩衝液が洗浄緩衝液貯蔵器３２から液体ライン３２ａ、バルブ２４、および液体ライン２２ａを経てシリンジポンプ２２内へ引き出され、次に装置１１から非結合検出プローブのようなすべての非結合物質を除去するために、液体ライン２２ａ、バルブ２４、および液体ライン１１ａを経由して装置１１を通って送り出される。洗浄緩衝液は各々のサイクル後、液体ライン２８ｂ、バルブ２６、液体ライン２８ａ、バルブ２４および液体ライン１１ｂを経て廃棄物収集室３８へポンプで送られ、非特異的結合を減少させるため数回の洗浄サイクルが実施されるであろう。アッセイ装置１１は次に画像化システムにより照射および走査できる（下記参照）。
【００４６】
結合要素が平らな表面内へエッチングされたチャンネルの内腔壁領域に連結された捕捉プローブからなる装置を含むアッセイシステムの例が図２Ａ（上面図）および図２Ｂ（側面、断面図）に図解されている。このシステムにおいて、結合要素４２の直線状配列４０（各々不活性スペーサー４４により分離されている）はガラススライド４６の表面内へエッチングされており、ガラスカバースリップ４８により覆われている。検出プローブおよび標的被検体を含んでいると疑われる試料を含む混合物は試料注入口５０を通しての注入によりアッセイシステム内へ導入される。ポンプ５２は混合物を結合要素４２の直線状配列４０を通して押し出すのに使用される。直線状配列４０中の結合要素４２に結合された標的−検出プローブ複合体の検出は、レーザー５４およびガラスカバースリップ４８上に置かれたチャージ−カップルドデバイス（ＣＣＤ）を用いて実施できる。
【００４７】
標的被検体
本発明の方法を用いて検出できる標的被検体には、広範囲の分子、例えば、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、代謝物、ビタミンおよび薬剤が含まれる。そのような分子の検出は、医学、法医学、農業、工業、食品科学および獣医学の分野で有用であろう。例えば、医学の分野では、本発明の方法は特定のマーカー（例えば、タンパク質または核酸マーカー）の存在または不在、および／または普通に存在するタンパク質（例えば、ホルモン、サイトカイン、リンホカイン、抗体または酵素）または核酸の変化したレベルにより特徴付けられる状態（例えば、癌）の診断に使用できる。本発明の方法はまた、例えば、単一塩基対の変化、小さなまたは大きな欠失、挿入または転位（例えば、染色体転座）により特徴付けられる遺伝子突然変異および遺伝子多形性の検出にも使用できる。加えて、本発明の方法は、試料、例えば患者からの試料中の感染性病原体（例えば、細菌、ウイルス、プロトゾア、寄生虫または真菌）または希な細胞（例えば、母性血中の胎児細胞）の存在を検出するのに使用できる。
【００４８】
別個の被検体の結合に加え、本発明の装置の直線状配列中の異なった結合要素を単一の被検体分子の異なった領域に結合するように設計することもできる。そのような直線状配列を含む装置は、例えば、核酸中の配列変異を検出するために使用できる。例えば、生物体の異なった群間の配列変異はこの型の装置を使用して検出できる。この装置において、結合要素の収集は、結合の一つまたはそれ以上のパターンが生物体の特定の群に観察される配列変異に集合的に対応し、および他のパターンが生物体の他の群に対応するように選択される。例えば、ｒＲＮＡ分子の種々の部分を標的とするプローブを、２，０００以上の既知のサルモネラ株を完全に含むように、組（例えば、６または７組）で使用できる。別の例としては、シゲラ フレクスネリおよび大腸菌ｒＲＮＡは非常に相関しているので、単一プローブの使用ではすべてのシゲラを大腸菌から区別できないようであるが、これらの生物体を区別するために７または８プローブのパネルを集合的に使用できる。
【００４９】
本発明の方法を使用して試験できる試料には、例えば、血液、血清、血漿、尿および唾液のような生物学的液体、ならびに植物抽出液、細胞または組織抽出液、細胞培養培地、環境試料および発酵混合物が含まれる。必要に応じ、本方法を応用する前に、常法を用いて試料からタンパク質および／または核酸調製物を抽出できる。本発明の方法の感度のため、少量の試料しか必要とされない。
【００５０】
プローブ
本発明の方法で使用される特異的プローブの型は、検出されるべき標的被検体の特定の型に依存し、本分野ではよく知られている。例えば、核酸標的（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的）の場合には核酸プローブが使用できる。核酸プローブはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはそれらの組み合わせまたは修飾物を含むことができる。特異的結合を達成するための至適の配列、長さおよび標的被検体との相補性の程度は、当業者により容易に決定されるパラメーターである。例えば、プローブは標的核酸被検体と相補的である少なくとも８、好適には１６−１００、または最も好適には１８−４０の連続したヌクレオチドを含むことができる。そのようなプローブの設計は標準プロトコールマニュアルおよび公的に入手可能なコンピュータープログラム（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照されたい）を参照することにより容易にできる。核酸プローブの合成は標準的な化学または組換え法により実施できる。もしくは、核酸プローブは商業的供給元から購入できる。核酸プローブに加え、核酸標的被検体は、ポリペプチドプローブ（例えば、ヌクレオチド配列特異的核酸結合ドメインを含むポリペプチドプローブ）のような他のプローブを用いて検出することもできる。
【００５１】
タンパク質標的（例えば、抗体、ホルモン、酵素、病原性タンパク質、サイトカインおよびリンホカイン）の場合には、被検体に特異的に結合するモノクローナル抗体のような抗体を本発明の方法で使用できる。抗体を産生する技術は本分野ではよく知られている（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８を参照されたい）。特に有用な抗体分子には、免疫グロブリンのＦａｂ断片、ならびに組換え的に作製された一本鎖抗体（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ．ａｌ．，米国特許第５，０９１，５１３号（１９９２）および５，１３２，４０５号（１９９２）；およびＬａｄｎｅｒｅｔ．ａｌ．，米国特許第４，７０４，６９２号（１９８７）および４，９４６，７７８号（１９９０）を参照されたい）が含まれる。抗体に加え、標的タンパク質被検体に特異的に結合する非抗体タンパク質、核酸およびその他の分子が使用できる。
【００５２】
検出プローブは例えば、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミンまたはテキサスレッド）、酵素標識（例えば、アルカリ性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼまたはガラクトシダーズ）、発色団、リン光試薬、発光試薬、放射活性標識、着色標識またはそれらの組み合わせで標識できる。本発明の利点は、装置上での異なった特異的検出プローブの物理的分離のため、単一の標識が同一のアッセイにおいて多くの別個の検出プローブに対して使用できることである。
【００５３】
検出プローブの使用はアッセイの特異性を増加させるが、上記のように、本発明に含まれるすべての方法について検出プローブが必要なわけではない。例えば、捕捉プローブと接触する前または後のどちらかで標的自身が標識される場合（例えば、ＰＣＲ、プライマー伸長または代謝的標識により）、検出プローブは必要とされない。検出プローブはまた、捕捉プローブ−被検体結合が、エチジウムブロミドまたはプロピジウムヨージドのような挿入色素（核酸捕捉プローブと被検体との間のデュープレックス形成により結合要素に捕捉される）のレベルの検出によりモニターされる場合も必要とされない。同様に、核酸検出プローブと被検体との間のデュープレックス形成により結合要素上に捕捉された挿入色素のレベルの検出により検出プローブ−被検体結合がモニターされる場合、標識を含まない検出プローブが使用できる。
【００５４】
上記のように、本発明の方法で使用される捕捉プローブは、例えば、（１）特異的結合対の構成物を含むことができ、または（２）本発明の装置の特異的結合要素上に固定化することができる。結合対は、結合要素への捕捉プローブの直接付着よりもむしろ、特異的標的被検体を正しい、前もって決められた結合要素に向けるために使用できる。例えば、特異的標的被検体のための捕捉プローブは特定の特異的結合対の一つの構成物を含むことができ、結合対の他の構成物は直線状配列中の特定の結合要素に結合できる。試料を直線状配列と接触させる際、標的被検体は結合対の二つの構成物の互いの共同の認識により特定の結合要素へ特異的に局在化される。捕捉プローブとともに使用できる結合対には、例えば、ビタミン−ビタミン結合タンパク質（例えば、アビジン−ビオチンおよびストレプトアビジン−ビオチン）、ならびに抗体−ハプテン（例えば、ジゴキシゲニン−抗ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ（フルオレセイン−イソチオシアネート）−抗ＦＩＴＣ、および任意の他のハプテン−抗ハプテン抗体、その多くは商業的に入手可能である）、酵素−基質、酵素−酵素結合タンパク質（例えば、β−ガラクトシダーゼおよびＡＰＴＧ（パラ−アミノ−フェニル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）、受容体−リガンド（またはアンタゴニスト）（例えば、ホルモン受容体へ結合するホルモン、例えば、ｈＩＬ−１ｒａはヒトインターロイキン受容体様インターロイキン−１へ結合する）、核酸−核酸結合タンパク質、核酸−核酸結合対およびその他の本分野で既知の特異的結合対が含まれる。特異的結合対の他の構成物（または捕捉プローブそれ自身）は、常法を用いて本装置の結合要素上に固定化できる。例えば、プローブはリンカー（例えば、エポキシシランリンカー、例えば３−グリシドキシプロピルトリ−メトキシシランリンカー（例えば、Ｍａｓｋｏｓ ｅｔ．ａｌ．，上記文献；Ｂｅａｔｔｉｅ ｅｔ．ａｌ．，上記文献を参照されたい）を使用することにより、表面（例えば、ガラス、プラスチック（例えば、ポリプロピレン）、シリコン、金または白金で作製された平滑または多孔性表面）へ結合させることができる。フォトリソグラフィーもまた使用される（上記参照）。
【００５５】
本発明で使用できる特異的結合対の例は相補的オリゴヌクレオチドの対である。特異的結合対として使用するためのオリゴヌクレオチドの至適の長さ、配列および相補性の程度は当業者により容易に決定され、配列組成、試料の複雑さおよびアッセイ条件（例えば、イオン強度、使用される塩の型、有機溶剤の存在および／またはハイブリダイゼーション温度）を含む因子に依存して変わり得るであろう。例えば、（ＡＧＴＣ）n（式中、ｎ＝反復の数）のような交互反復を含んでいる核酸は特異的結合対の一つの構成物として使用でき、（ＧＡＣＴ）nの交互反復を含んでいるその相補物は結合対の他の構成物として使用できる。反復配列を含んでいる核酸に加え、相補的ランダム配列を含んでいる核酸の対が本発明において結合対として使用できる。例えば、各々が例えば少なくとも１６のヌクレオチド（例えば、少なくとも２０のヌクレオチド）を含んでいる核酸の対が使用できる。そのようなランダム配列（統計的にはヒトゲノム中ではユニークであろう）はより高い特異性を提供する。より短い配列が高度の複雑さを持つ被検体混合物中で相補的非標的配列を見いだす可能性がある。ホモポリマーオリゴヌクレオチド（例えば、ポリ−Ａ／ポリ−Ｔおよびポリ−Ｇ／ポリ−Ｃ）もまた本発明の結合対として使用できる。
【００５６】
検出プローブの酵素的増幅
上記のプローブのような結合された検出可能標識を持つ検出プローブに加え、本発明の方法は、酵素的に増幅できて検出可能な信号を発生する核酸のすべてまたは一部を含む検出プローブを使用することができる。例えば、Ｑβレプリカーゼのような酵素の存在下で自己触媒的に複製可能なミディ変異体−１（ＭＤＶ−１）ＲＮＡのような核酸のすべてまたは一部を含んでいる検出プローブが使用できる。
【００５７】
自己触媒的に複製可能な核酸およびそれらを複製する対応する酵素は本分野ではよく知られており、本発明の方法に容易に適用することができる。例えば、ＭＤＶ−１ ＲＮＡ、ナノ変異体ＲＮＡ、ミニ変異体ＲＮＡおよびマイクロ変異体ＲＮＡ（これらはすべてＱβレプリカーゼにより複製可能である）が使用できる（例えば、Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，７８６，６００号；Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ １０：２５７−２７１，１９９６；Ｍｕｎｉｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２１：４６３−４７２，１９９１；Ｍｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７２（１１）：４２５２−４２５６，１９７５；Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１７：８７７−９０７，１９７７；Ｚａｍｏｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１２６１−１２６６，１９９５を参照されたい）。
【００５８】
Ｑ−ベータレプリカーゼにより複製可能な核酸に加え、他のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより複製可能であるバクテリオファージＲＮＡゲノム由来の核酸のような他の核酸が本発明で使用できる。例えば、ＳＰファージ（Ｆｕｋａｍｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６９：１７３−１８１，１９７９）から誘導された核酸、ＭＳ２、Ｒ１７およびＦ２（Ｉｎｏｋｕｃｈｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９６：３２３−３２６，１９７９，Ｉｎｏｋｕｃｈｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：７１１−７３０，１９８２）。ブロムモザイクウイルスＲＮＡから誘導された核酸もまた使用できる（Ｑｕａｄｔ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１４９８−１５０２，１９９３）。
【００５９】
複製可能配列のどちらかの末端に置かれているまたはその中に埋め込まれている被検体特異的プローブセグメントを持つＭＤＶ−１のような自己触媒的複製可能核酸の全配列を含む検出プローブは本発明の方法に使用できる。非特異的に結合したプローブは特異的に結合したプローブと同じように容易に増幅されて信号を発生するので、結合要素から非特異的に結合したプローブを除去することは、この型のプローブを用いる方法においては特に重要である。従って、この型のプローブの使用はバックグラウンド信号の発生をもたらし、または受容可能なレベルまでバックグラウンドを減少させるために追加の測定（アッセイ工程）を必要とする。
【００６０】
一緒になって酵素的に複製可能な核酸の全配列を含む二つの核酸分子から構成される二成分プローブ対が、上記の複製可能プローブに付随する潜在的バックグラウンド問題を避けるために使用できる（例えば、Ｔｙａｇｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５３９５−５４００，１９９６；Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ ｅｔ．ａｌ．，米国特許第５，４０７，７９８号を参照されたい）。二成分プローブ対の使用は図３に略図で示されている。この例において、検出プローブ６８はその３’末端に自己触媒的複製可能核酸の３’部分７０を、およびその５’末端に被検体特異的プローブ７２を含んでいる。この例では結合要素５８に連結されている捕捉プローブ６０（捕捉プローブはまた特定の特異的結合対の一つの構成物を含むことができる、上記参照）は自己触媒的複製可能核酸の５’部分６２を含み、その３’末端に被検体特異的プローブ６４を含んでいる。本プローブは、被検体６６へ結合した場合、５’プローブ６８の３’末端が３’プローブ６０の５’末端に隣接されるように設計できる。結合した５’プローブ６８および３’プローブ６０は一緒に結合して（すなわち、共有結合により継ぎ合わせ）、自己触媒的複製のための鋳型を発生させることができる。そのような二成分プローブの使用は、自己触媒的複製可能鋳型を発生するために捕捉プローブと検出プローブとの共有結合による継ぎ合わせを必要とするので、捕捉プローブ、被検体および検出プローブ間の特異的結合が存在しないときの信号発生の可能性を減少させる。
【００６１】
そのような二成分プローブ対で使用される検出および捕捉プローブは両方ともＤＮＡ、両方ともＲＮＡで作製でき、または一つのプローブがＤＮＡで作製できて他方のプローブがＲＮＡで作製できる。さらに、プローブの片方または両方が混合ＤＮＡ／ＲＮＡ組成であってもよい。プローブは例えば標準分子法を用いて、または標準ホスホロアミダイト化学により作製できる。両方ともＲＮＡで作製された５’および３’部分プローブの使用では、そのようなプローブがＱβレプリカーゼ存在下でＲＮＡ組換え反応を促進でき、被検体依存性結合不在下で複製可能ＲＮＡ鋳型の産生を生じるので、バックグラウンド信号の発生が生じる。そのような二成分プローブ系において、ＤＮＡで作製された５’部分プローブおよびＲＮＡで作製された３’部分プローブの使用は、上記のＲＮＡ組換え反応を抑制するので多くの利点を提供する。その結果、はるかに高いレベルの結合されていない遊離プローブがＱβ増幅反応の間に存在でき、ハイブリダイズされていないプローブの除去のためのアッセイの必要性を実質的に減少させる。さらに、ＤＮＡ５’断片とＲＮＡ３’断片の使用は、全ＤＮＡ鋳型よりも著しく効率的に複製される全ＲＮＡ鋳型と同様の効率でキメラ結合生成物が複製することを可能にしている。そのようなキメラの二成分プローブの一般例が以下に記載されている。
【００６２】
５’プローブはＭＤＶ−１（または別の自己触媒的複製可能鋳型）のＤＮＡ版の一部から構成することができ、その３’末端は被検体核酸の一部と相補的なプローブ要素と連結されている。３’プローブはその５’末端の５’プローブにより結合される領域に隣接する被検体領域に相補的であるプローブ配列を含有するＲＮＡ、およびその３’末端の複製可能ＲＮＡ配列の残りから構成できる。各々のプローブのプローブ配列要素は、連結されたＤＮＡ：ＲＮＡキメラ生成物の複製度を改良するために一つまたはそれ以上のスペーサー要素により複製可能配列から分離されていてもよい。
【００６３】
二つのプローブは標的核酸にハイブリダイズし、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼまたは多くの化学試薬の任意の試薬（例えば、ブロモシアン、シアノイミダゾール、１−メチルシアノイミダゾール、カルボニル ジイミダゾールまたは水溶性カルボジイミド）を用いて結合される。結合生成物は、Ｑβレプリカーゼのような酵素およびヌクレオチド三リン酸と接触させて、複製を促進して検出可能な量の複製生成物を発生させる。複製生成物は例えば、複製生成物内へインターカレートする色素（例えば、エチジウムブロミドまたはプロジウムヨージド）による染色、または複製生成物に特異的に結合するプローブとのハイブリダイゼーションにより検出される。
【００６４】
キャピラリー電気泳動
上記のように、被検体およびプローブの装置の結合要素への結合は、試料およびプローブを装置を通して、例えば電気泳動的および／または機械的に注入することにより容易にすることができる。
【００６５】
電気泳動的移送の場合、本装置の結合要素の直線状配列は、ガラス、プラスチックまたはその他の材料で作製され、例えば、約１−２ミリメートル未満、例えば、５００ミクロン未満の内径を持つキャピラリー管のような長く伸ばされたチャンネル内に含ませることができる。例えば、１００ミクロンの内径および５０ミリメートルの長さを持つキャピラリー管が使用できる。より高い表面積−容量比はより細いキャピラリーを使用することにより達成され、それにより、より迅速なハイブリダイゼーション反応速度論を容易にする。高い表面積−容量比従って発散する熱に対して高い熱容量を持つキャピラリー管の使用は、高い電圧の使用を可能にし、従ってアッセイの加速を容易にする。さらに、キャピラリー管の高表面積−容量比では、キャピラリーを通過する標的分子はプローブにきわめて近接するので、プローブへの標的被検体のハイブリダイゼーションが容易になる。
【００６６】
本発明に関連したキャピラリー管の高表面積−容量比の別の結果は、非常に少量の試薬および被検体しか必要としないことであり、被検体は少量または多量の試料容量中に存在している。例えば、レーザーによる蛍光誘導後、ＣＣＤ装置による検出は数百の発蛍光団のみしか必要としないので（例えば、Ｍａｃｋａｙ ｅｔ．ａｌ．，米国特許第４，８７４，４９２号（１９８９）を参照されたい）、約１０6−１０7個の白血球細胞を含む１ミリリットルの血液は本発明の方法を使用する検出のためには十分な量の標的を提供するであろう。細菌ｒＲＮＡが標的被検体である場合、１ミリリットルの試料中の一つの細菌が本発明の方法を用いて検出可能であろう。
【００６７】
キャピラリー電気泳動を実施するための方法は本分野ではよく知られており、例えば、Ｎｏｖｏｔｎｙら（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１１：７３５−７４９，１９９０）により記載されている。いくつかの標準的キャピラリー電気泳動システムの何れもが本発明の方法を実施するために使用できる。例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｐ／ＡＣＥ システム２０５０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）が使用できる。加えて、いくつかのキャピラリー管の同時処理を容易にするシステムが使用できる（例えば、Ｙｅｕｎｇｅｔ．ａｌ．，米国特許第５，３２４，４０１号（１９９４）を参照されたい）。
【００６８】
キャピラリー電気泳動に加え、他の電気泳動法が本発明の方法に使用できる。例えば、ガラスまたはプラスチックプレートのようなプレート内にエッチングされ、結合要素の直線状配列を含むチャンネル中で電気泳動が実施できる。この方法において、チャンネルの各々の末端はウェルと接触しており、その一つに試料（およびプローブ）が加えられる。この型のシステムはより多い試料容量の分析を可能にする。
【００６９】
結合要素に結合した標識の検出
本発明の装置の特異的結合要素に結合した標識の発光、吸光またはその他の検出可能な信号は、標識の性質に依存していくつかの標準法の何れかを用いて検出できる。例えば、発色団標識は分光光度計により特定の波長での光の吸収を測定することにより検出でき、一方、化学発光標識により発生された光はルミノメーターまたはＣＣＤ装置を用いて検出できる。ＣＣＤ装置はまた、より高い周波数の電磁放射線（例えば放射性同位元素標識からの放射線）または標準的水銀光源またはレーザー光線で適当な波長で励起された発蛍光団から発生された蛍光を検出するためにも使用できる。多標的ゾーンを検出するため、キャピラリーは光ファイバー装置で走査でき、またはＣＣＤの配列をキャピラリーに隣接させ、励起光線に垂直に置くこともできる。励起光線は走査装置の一部であってもよく、例えば、内部ファイバーはレーザー光線を運ぶことができ、周囲のファイバーは蛍光光を画像化システムに運び返す。異なった様式においては、レーザー光線はキャピラリー管の一つの末端を通して、内腔を通すように（それによりキャピラリーの内部が光トンネルとして働く）、または壁を通すように（波誘導装置として働く）向けられる。後者の場合、内部壁に非常に近い蛍光標識のみが、表面プラスモン共鳴と称されるよく知られた過程により励起されるであろう。当業者には明らかであろうように、散乱または反射光を除去するためにＣＣＤ装置または光電子増倍管のような検出装置に適当なフィルターを使用できる。
【００７０】
検出器は特定の結合要素に対応する装置中の正確な位置を特異的にモニターするよう配置することができ、必要に応じ、異なった特異的結合要素が検出器で読めるように結合対の直線状配列を移動させることができる。もしくは、検出器は装置に沿って移動させることができる。キャピラリー管の使用を含む別の例においては、結合要素の直線状配列を含んでいるキャピラリーおよび検出器のどちらも移動しない。むしろ、結合要素上で複合体が形成されたら、検出器を通過するようにキャピラリー管内を輸送される。そのような輸送は例えば、液体をキャピラリーを通してポンプで送って直線状配列を還流的に移動させることにより誘導できる。全直線状配列が移動される装置においては、キャピラリーに含まれているにしろまたはいないにしろ、検出器は決定された時間が標識の通過と一致するように流動の開始後の前もって決められた時間にのみ読み取りを行うようにプログラムできる。また、装置の長さに広げられた直線状ＣＣＤ装置も使用できる。信号誘導（例えば、レーザー）および検出装置（例えば、ＣＣＤ装置）を一体化した適当なシステムは本分野ではよく知られている（例えば、Ｆｕｊｉｍｉｙａｅｔ．ａｌ．，米国特許第５，０６９，７６９号（１９９１）；Ｐｅｎｔｏｎｅｙ，米国特許第５，２０８，４６６号（１９９３）を参照されたい。
【００７１】
標的被検体の定量分析を実行するには、標準法を用いて最初に標準曲線を作ることができる。例えば、本発明の方法を用いて検出される標識の量は、既知の量の被検体を含むいくつかの試料について決定できる。これらの読み取りにより作られた標準曲線は、次に検出された信号のレベルを標準曲線と比較することにより、未知の被検体濃度を持つ試料中の被検体濃度の決定に使用できる。
【００７２】
【実施例】
実施例Ｉ−生物的試料中のサルモネラの検出
新規の方法および装置（例えば、図１に例示されている装置）が試料中の病原性生物体の存在の検出、例えば、食品試料中のサルモネラの検出に使用できる。このアッセイを実施するために適応可能な試薬および方法はＧＥＮＥ−ＴＲＡＫサルモネラアッセイキット（ＧＥＮＥ−ＴＲＡＫ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）に提供されている。簡単に記すと、本発明の装置はポリ−Ａプローブが連結された結合要素を含むように作製される。次に、試料、サルモネラ核酸に特異的でありかつポリ−Ｔテイルを含む捕捉プローブ、および同一のサルモネラ核酸に特異的である検出プローブをこの装置の開口部に加える。
【００７３】
必要に応じ、プローブおよび試料は例えば、電気泳動により、または機械的ポンプのような液体運搬装置を使用することにより装置を通して多数回輸送できる。非結合検出プローブのような非特異的結合物質を除いた後、ポリ−Ａプローブを含んでいる装置の結合要素を、標識の型について適当な方法（例えば、上記参照）を用いて検出プローブ標識の存在についてモニターする。
【００７４】
サルモネラに加え、装置が各々の追加の病原体について、（１）他の病原体に特異的なプローブ、または（２）結合対の一つの構成物を含むプローブ、その他方の構成物は他の病原体に特異的なプローブの成分である（同一アッセイにおいてサルモネラ検出に使用されたポリ−Ａ／ポリ−Ｔ結合対は他の病原体の検出には使用できないことに注意されたい）、を含んでいる結合要素を含むならば、試料中の他の病原体の存在が同一の装置を用いて同時にモニターできる。上記の記載と一致して、他の病原体のためのプローブは直接的に結合要素に結合されるか、または病原体特異的被検体への結合に加えて、（１）結合要素に結合されている、および（２）上記のポリ−Ａプローブとは別個であるプローブへ結合する捕捉プローブであってもよい。
【００７５】
実施例 II −染色体転座の検出
本発明は染色体転座を検出するためにも使用できる。特定の例として、本発明は、その存在がしばしば急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）および慢性骨髄発生性白血病（ＣＭＬ）の潜在的原因であるいわゆる”フィラデルフィア”染色体を検出するために使用できる。フィラデルフィア染色体は染色体９の終端領域の染色体２２の終端領域への均衡転座を持つことにより特徴付けられる。このことにより、染色体９上のａｂｌ癌遺伝子と染色体２２上のｂｃｒ遺伝子との間で遺伝子融合が生じる。この遺伝子融合は両方の遺伝子に対応する領域を含むメッセージに転写される。
【００７６】
本発明を用いてそのような転座を以下のように検出することができる。捕捉プローブは融合のｂｃｒ領域（遺伝子それ自身またはそのＲＮＡ（前ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ）転写体）にハイブリダイズするように設計でき、一方、検出プローブはａｂｌ領域にハイブリダイズするように設計できる。本発明の装置は、捕捉プローブが特異的結合要素へ連結されているように作製できる。もしくは、装置の結合要素は特異的結合対の一つの構成物（例えば、アビジン）を含むことができ、かつ捕捉プローブは特異的結合対の他の構成物（例えばビオチン）を含むことができる。両方の場合とも、試料、捕捉プローブおよび検出プローブを結合要素と接触させ、例えば、電気泳動または機械的なポンプによる送り出しにより非結合成分（例えば、非結合検出プローブ）を除去し、ｂｃｒ結合要素上のａｂｌ検出プローブの存在をモニターする。ｂｃｒ捕捉プローブによるａｂｌ検出プローブの捕捉は試料中のフィラデルフィア転座の存在を示している。
【００７７】
本発明の方法を使用したＣＭＬおよびＡＬＬの診断は、ｂｃｒ遺伝子中の異なった配列を認識する多重捕捉プローブを用いても実施できる。これらのプローブを用いて、染色体２２上の異なった***点を含む転座を区別することができる。この方法は以下に例示されている。
【００７８】
モデル標的、捕捉プローブおよび検出プローブとしての合成オリゴヌクレオチドモデル標的
ＡＬＬおよびＣＭＬキメラｍＲＮＡを模倣するように二つの標的が設計された。ＡＬＬモデル標的（４０ｍｅｒ）はｂｃｒ配列の２０ヌクレオチド（ヌクレオチド１５９４−１６１３）およびａｂｌ配列の２０ヌクレオチド（ヌクレオチド４６３−４８２）を含んでいる。
【００７９】
ＡＬＬモデル標的：
【００８０】
ＣＭＬモデル標的：
１８ｍｅｒであり、５’がカルボキシル化され、かつＡＬＬ標的のｂｃｒ領域と相補的なＡＬＬ捕捉プローブは以下の配列を持っている。
【００８１】
ＡＬＬ捕捉プローブ：
【００８２】
ＣＭＬ捕捉プローブ：
【００８３】
プローブ２ＭＳ：
【００８４】
プローブ４ＭＳ：
ＦＩＴＣで標識された検出プローブ（ＤＰ，２０ｍｅｒ）はＡＬＬおよびＣＭＬ両方のモデル標的に共通のａｂｌ配列に相補的である。検出プローブは以下の配列を持っている。
【００８５】
検出プローブ（ＤＰ）：
以下のように結合要素として使用するためのＡｆｆｉ−Ｇｅｌ １０２ビーズに捕捉プローブを結合させるために１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いるカップリング反応が使用された。
【００８６】
１．５ｍｌの水中でＡｆｆｉ−Ｇｅｌ１０２ゲルスラリー（０．５ｍｌ）を５００ｎｍｏｌｅのＤＮＡオリゴマー（ＡＬＬまたはＣＭＬ特異的捕捉プローブ）を混合し、５０μｌの０．２Ｎ ＨＣｌでｐＨを４．８−５．０に調整した。０．５ｍｇのＥＤＡＣを添加後、３０μｌの０．２Ｎ ＨＣｌでｐＨを再び５．０に調整し、混合物を室温で３時間振とうした。カップリング効率は７０％に達しており、３５０ｎｍｏｌｅのＤＮＡが４００μｌの湿ったゲルビーズに結合した。約２．５ｍｍの内径を持つガラスキャピラリーの一つの末端にガラスウールを詰め、結合された捕捉プローブを持つかまたは持たないゲルビーズを交互の層で充填した。
【００８７】
装置上での多標的捕捉の実証
すべてのプローブが１μＭの濃度になるように、３ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）中で合成モデル標的（ＡＬＬまたはＣＭＬ）を検出プローブと混合した。７０℃で５分間加熱した後、モデル標的および検出プローブを室温で１時間ハイブリダイズさせた。この混合物の一部を３ｘＳＳＣで希釈して全容量３００μｌ中、２５ｐｍｏｌｅハイブリッドの最終濃度とした。ＡＬＬ標的−検出プローブハイブリッドは、ＡＬＬまたはＣＭＬ捕捉プローブを含むかまたは捕捉プローブを含まないビーズの交互の層を含むキャピラリー（上記参照）を７５μｌ／分の流量で通過させた。次にキャピラリーを１ｍｌの３ｘＳＣＣで２回洗浄した。ＦＩＴＣ発蛍光団の励起およびＦＩＴＣ特異的蛍光光を捕捉するための適当なシステムを用いてゲル−ベッドを含んでいるキャピラリーの領域をＣＣＤ装置で画像化した。
【００８８】
図４ＡはＡＬＬ特異性捕捉プローブを含む３つすべての領域がモデル標的−検出プローブ複合体のいくつかを捕捉したことを示している。次にＣＭＬ特異性標的−検出プローブ複合体を同一条件下でキャピラリーに加え、非結合物質を含まないようにキャピラリーを洗浄した後、キャピラリーを再び画像化した。図４ＢはＣＭＬ特異性捕捉プローブを含むゲルゾーンにおけるＣＭＬ特異性標的複合体の捕捉を示している。ＣＭＬとＡＬＬ特異的ゲルベッドとの間のゲルの領域は捕捉プローブを含まず、従って非蛍光性のまま残っている。ガラスウールはいくらかの非特異的自己蛍光を示している。
【００８９】
標的特異性の実証
ガラスキャピラリーを、ＣＭＬ特異性捕捉プローブの単一層、および何の捕捉プローブも含まないゲル層により分離された、２つのミスマッチ（２ＭＳ）または４つのミスマッチ（４ＭＳ）を含んでいるゲルの各々１つの層で充填した。ＣＭＬ特異性モデル標的−検出プローブハイブリッド（１００μｌ中に５ｐｍｏｌｅ）をキャピラリーに０．０１３ｍｌ／分の流量で加えた。次にキャピラリーを各々１ｍｌの３ｘＳＳＣで２５℃、４２℃、５２℃、５８℃および７０℃で洗浄した。標的−検出プローブ複合体を加える前および各々の洗浄後にキャピラリーを画像化した。重要な領域の露光過多または不足を避けるために各々の画像に対して異なった露光時間が選択された。図５はＣＭＬ標的を加える前のガラスウールのみによる自己蛍光（長時間暴露後）を示している。室温（約２３℃）でＣＭＬモデル標的を加えると、２ＭＳミスマッチおよびＣＭＬ特異的捕捉ゾーンへの結合が起こったが、４ＭＳミスマッチゾーンでは起こらなかった。温度を４２℃に上昇させると、モデル標的は２ＭＳミスマッチから放出されたが、ＣＭＬモデル標的ゾーンからは放出されず、本装置の特異的ゾーン中の標的特異的捕捉が適当な温度で成し遂げられることを示している。
【００９０】
他の態様
本発明をその詳細な説明に関連して説明してきたが、前述の記載は例示を意図しているものであり、本発明の範囲を制限するものではないことを理解しなければならない。本発明の他の態様、利点および変形は特許請求の範囲内に含まれている。
【００９１】
【配列表】
【００９２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は本発明の装置を使用するための自動化アッセイシステムの概略図である。
【図２】 図２は、本発明の別の装置を使用するためのアッセイシステムの概略図である。Ａは上面図であり、ＢはＡの線２Ｂ−２Ｂに沿った側面断面図である。
【図３】 図３は、それに連結された捕捉プローブを有する結合要素の概略図である。
【図４】 図４は本発明の装置中に捕捉された標識−検出プローブ複合体の蛍光信号を示している電気イメージである。Ａは本発明の装置中に捕捉された急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）特異的標識−検出プローブ複合体の蛍光信号を示している電気イメージである。Ｂは本発明の装置中に捕捉された急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）特異的および慢性骨髄発生性白血病（ＣＭＬ）特異的標識−検出プローブ複合体の蛍光信号を示している電気イメージである。
【図５】 図５は本発明の装置上のＣＭＬ標的捕捉の特異性を示している一連のコンピューター作製イメージである。
Claims (29)
- 試料から被検体を単離するためのアッセイ装置であって、前記装置は結合要素の直線状配列を含んでいる管を含み、前記結合要素の各々が別個の結合因子に連結され、その結合因子に対して対応する特異的成分が結合するものであり、ここで前記結合要素の各々は結合要素の全周囲に沿って前記管の内部表面と密閉的に接触するように配置されていることを特徴とする装置。
- 少なくとも一つの前記結合要素の前記別個の結合因子が捕捉プローブを含み、および前記対応する特異的成分が標的被検体を含む請求項第１項に記載の装置。
- 少なくとも一つの前記結合要素の前記別個の結合因子が特異的結合対の一つの構成物を含み、および前記対応する特異的成分が前記特異的結合対の他の構成物および捕捉プローブを含む請求項第１項に記載の装置。
- 前記管がキャピラリー管である請求項第１項に記載の装置。
- 少なくとも一つの前記結合要素の前記別個の結合因子が核酸を含む請求項第１項に記載の装置。
- 前記核酸が自己触媒的複製可能核酸を含む請求項第５項に記載の装置。
- 少なくとも一つの前記結合要素の前記別個の結合因子がポリペプチドを含む請求項第１項に記載の装置。
- 前記結合要素の少なくとも二つが、別個の結合因子を欠く領域により互いに分離されている請求項第１項に記載の装置。
- 試料中の被検体の存在を検出するための方法であって：前記被検体を検出可能標識で標識し；前記被検体と捕捉プローブを接触させて請求項第１項の装置中の特異的結合要素上に被検体−捕捉プローブ複合体を形成させ；前記複合体から前記複合体中の前記被検体に特異的に結合されていない前記検出可能標識を除去し；そして前記結合要素中の前記検出可能標識を前記試料中の前記被検体の存在の尺度として検出するの各工程を含む方法。
- 前記検出可能標識が検出プローブの成分である請求項第９項に記載の方法。
- 前記別個の結合因子が前記捕捉プローブを含み、および前記接触工程が前記装置を通して前記被検体を通過させることにより実施される、請求項第９項に記載の方法。
- 前記被検体が前記装置を多数回通過する請求項第１１項に記載の方法。
- 前記被検体が前記装置を通過するよう機械的にポンプにより送られる請求項第１１項に記載の方法。
- 前記被検体に電界を印加することにより前記被検体が前記装置を通過する請求項第１１項に記載の方法。
- 前記被検体が核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂質、代謝物または薬剤を含む請求項第９項に記載の方法。
- 前記検出プローブが核酸またはポリペプチドを含む請求項第９項に記載の方法。
- 前記捕捉プローブが核酸またはポリペプチドを含む請求項第９項に記載の方法。
- 前記被検体が核酸を含み；前記検出プローブが一つの末端上に自己触媒的複製可能核酸の一部を、かつ他の末端上に第一の被検体結合要素を含み；前記捕捉プローブが一つの末端上の前記自己触媒的複製可能核酸の残りおよび他の末端上の第二の被検体結合要素を含み；かつ前記第一および第二の被検体結合要素は前記核酸被検体中の隣接するヌクレオチドセグメントに結合し；前記方法はさらに、前記第一および第二の被検体結合要素を互いに結合させて複製鋳型を形成させ、そして前記鋳型を複製して前記検出可能信号を発生させる工程を含む、請求項第９項に記載の方法。
- 前記結合要素の前記結合因子が特異的結合対の一つの構成物を含み、前記捕捉プローブが前記特異的結合対の他の構成物を含み；および前記接触工程が前記試料および前記捕捉プローブを前記装置を通して通過させることにより実施される、請求項第９項に記載の方法。
- 前記試料および前記捕捉プローブが前記装置を多数回通過する請求項第１９項に記載の方法。
- 前記試料および前記捕捉プローブが前記装置を通過するよう機械的にポンプにより送られる請求項第１９項に記載の方法。
- 前記試料および前記捕捉プローブに電界を印加することにより前記試料および前記捕捉プローブが前記装置を通過する請求項第１９項に記載の方法。
- 前記標識工程および前記接触工程が同時に実施される請求項第１９項に記載の方法。
- 前記接触工程が前記標識工程の前に実施される請求項第１９項に記載の方法。
- 請求項第１項の管と液体連絡を有する能動液体輸送を提供する手段を含むアッセイシステム。
- 請求項第１項の管と液体連絡を有する液体運搬装置を含むアッセイシステム。
- 試料から被検体を単離するためのアッセイ装置であって、前記装置は内部内腔表面を有し、不活性スペーサーにより分離された結合要素の直線状配列を含むチャンネルを含み、前記結合要素の各々が別個の結合因子に連結され、その結合因子に対して対応する特異的成分が結合するものであり、ここで前記結合要素の各々は前記チャンネルの別個の領域の内腔表面を含むことを特徴とする装置。
- 前記チャンネルが管である請求項第２７項に記載の装置。
- 少なくとも一つの前記別個の結合因子がフォトリソグラフィーにより少なくとも一つの前記結合要素に結合されている請求項第２７項に記載の装置。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| USRE43097E1 (en) | 1994-10-13 | 2012-01-10 | Illumina, Inc. | Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors |
| US6406848B1 (en) * | 1997-05-23 | 2002-06-18 | Lynx Therapeutics, Inc. | Planar arrays of microparticle-bound polynucleotides |
| SE9404166D0 (sv) * | 1994-11-30 | 1994-11-30 | Pharmacia Biotech Ab | Multifunctional surfaces |
| SE504798C2 (sv) * | 1995-06-16 | 1997-04-28 | Ulf Landegren | Immunanalys och testkit med två reagens som kan tvärbindas om de adsorberats till analyten |
| US6556299B1 (en) * | 1996-07-10 | 2003-04-29 | Packard Instrument Company, Inc. | Imaging system for fluorescence assays |
| EP0990142A4 (en) | 1996-12-31 | 2000-09-27 | Genometrix Genomics Inc | MULTIPLEXED MOLECULAR ANALYSIS METHOD AND DEVICE |
| US20020042048A1 (en) * | 1997-01-16 | 2002-04-11 | Radoje Drmanac | Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species |
| US6056859A (en) * | 1997-02-12 | 2000-05-02 | Lockheed Martin Energy Research Corporation | Method and apparatus for staining immobilized nucleic acids |
| US6143496A (en) * | 1997-04-17 | 2000-11-07 | Cytonix Corporation | Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly |
| WO1998049344A1 (en) | 1997-04-28 | 1998-11-05 | Lockheed Martin Energy Research Corporation | Method and apparatus for analyzing nucleic acids |
| US6558901B1 (en) * | 1997-05-02 | 2003-05-06 | Biomerieux Vitek | Nucleic acid assays |
| IL124275A (en) * | 1997-05-02 | 2002-03-10 | Bio Merieux Vitek Inc | A method to produce sequences of nucleic acids |
| EP0878552A1 (en) | 1997-05-13 | 1998-11-18 | Erasmus Universiteit Rotterdam | Molecular detection of chromosome aberrations |
| US6337214B1 (en) | 1997-06-09 | 2002-01-08 | Acgt Medico, Inc. | Detection of DNA, RNA and proteins using a test column with two snares |
| GB9711941D0 (en) | 1997-06-09 | 1997-08-06 | Acgt Medico Inc | Detection of pathogens |
| US6849400B1 (en) | 1997-07-23 | 2005-02-01 | Gen-Probe Incorporated | Methods for detecting and measuring spliced nucleic acids |
| US20030096232A1 (en) | 1997-12-19 | 2003-05-22 | Kris Richard M. | High throughput assay system |
| US6238869B1 (en) * | 1997-12-19 | 2001-05-29 | High Throughput Genomics, Inc. | High throughput assay system |
| US6458533B1 (en) | 1997-12-19 | 2002-10-01 | High Throughput Genomics, Inc. | High throughput assay system for monitoring ESTs |
| JP3944996B2 (ja) | 1998-03-05 | 2007-07-18 | 株式会社日立製作所 | Ｄｎａプローブアレー |
| JP2002513587A (ja) | 1998-05-04 | 2002-05-14 | ダコ エー エス | 染色体異常を検出するための方法およびプローブ |
| US7195867B2 (en) * | 1998-06-08 | 2007-03-27 | Acgt Medico Inc. | Method for detection of multiple test materials in a sample |
| DE69927812D1 (de) * | 1998-06-08 | 2005-11-24 | Acgt Medico Inc | Erkennung von dns, rns und proteinen |
| AU754952B2 (en) | 1998-06-24 | 2002-11-28 | Illumina, Inc. | Decoding of array sensors with microspheres |
| AU4700699A (en) * | 1998-06-24 | 2000-01-10 | Glaxo Group Limited | Nucleotide detection method |
| ATE269417T1 (de) * | 1998-07-23 | 2004-07-15 | Gen Probe Inc | Verfahren zur erkennung und messung von gespleisten nukleinsäuren |
| WO2000009650A1 (en) * | 1998-08-10 | 2000-02-24 | Genomic Solutions, Inc. | A thermal/fluidic cycling device for the purpose of nucleic acid hybridization |
| US6107038A (en) * | 1998-08-14 | 2000-08-22 | Agilent Technologies Inc. | Method of binding a plurality of chemicals on a substrate by electrophoretic self-assembly |
| US6203989B1 (en) | 1998-09-30 | 2001-03-20 | Affymetrix, Inc. | Methods and compositions for amplifying detectable signals in specific binding assays |
| US6277628B1 (en) | 1998-10-02 | 2001-08-21 | Incyte Genomics, Inc. | Linear microarrays |
| US6413780B1 (en) | 1998-10-14 | 2002-07-02 | Abbott Laboratories | Structure and method for performing a determination of an item of interest in a sample |
| US6268147B1 (en) * | 1998-11-02 | 2001-07-31 | Kenneth Loren Beattie | Nucleic acid analysis using sequence-targeted tandem hybridization |
| WO2000026412A1 (en) * | 1998-11-02 | 2000-05-11 | Kenneth Loren Beattie | Nucleic acid analysis using sequence-targeted tandem hybridization |
| US6638760B1 (en) | 1998-11-25 | 2003-10-28 | Pe Corporation (Ny) | Method and apparatus for flow-through hybridization |
| US7116407B2 (en) * | 1998-12-15 | 2006-10-03 | Union Biometrica, Inc. | System for axial pattern analysis of multicellular organisms |
| US20030032029A1 (en) * | 1998-12-21 | 2003-02-13 | Nanogen, Inc. | Three dimensional apparatus and method for integrating sample preparation and multiplex assays |
| US7612020B2 (en) * | 1998-12-28 | 2009-11-03 | Illumina, Inc. | Composite arrays utilizing microspheres with a hybridization chamber |
| EP1157264B1 (en) * | 1999-02-26 | 2004-04-21 | EXACT Sciences Corporation | Biochemical purification devices with immobilized capture probes and their uses |
| US6410231B1 (en) * | 1999-02-26 | 2002-06-25 | Incyte Genomics, Inc. | SNP detection |
| AU3883200A (en) * | 1999-03-11 | 2000-09-28 | Combimatrix Corporation | Self assembling arrays |
| WO2000061806A2 (en) * | 1999-04-09 | 2000-10-19 | Arcturus Engineering, Inc. | GENERIC cDNA OR PROTEIN ARRAY FOR CUSTOMIZED ASSAYS |
| US20050100943A1 (en) * | 2000-04-11 | 2005-05-12 | Hideki Kambara | Method of producing probe arrays for biological materials using fine particles |
| WO2000068689A1 (en) * | 1999-05-10 | 2000-11-16 | Prolinx Inc. | Cell separation device and methods for use |
| JP3911909B2 (ja) | 1999-06-09 | 2007-05-09 | 株式会社日立製作所 | Ｄｎａ試料調製方法及びｄｎａ試料調製装置 |
| US7045287B2 (en) * | 1999-07-20 | 2006-05-16 | Agilent Technologies, Inc. | Method for contacting fluid components with moieties on a surface |
| US6294392B1 (en) * | 1999-07-21 | 2001-09-25 | The Regents Of The University Of California | Spatially-encoded analyte detection |
| AU771499B2 (en) * | 1999-07-26 | 2004-03-25 | Government of The United States of America, as represented by The Secretary Department of Health & Human Services, The National Institutes of Health, The | Layered device with capture regions for cellular analysis |
| US6613581B1 (en) * | 1999-08-26 | 2003-09-02 | Caliper Technologies Corp. | Microfluidic analytic detection assays, devices, and integrated systems |
| US6613561B1 (en) | 1999-11-26 | 2003-09-02 | Olympus Optical Co., Ltd. | High-density capillary array for reaction and detection of fluid |
| DE10000629C5 (de) * | 2000-01-10 | 2010-06-02 | november Aktiengesellschaft, Gesellschaft für Molekulare Medizin | Verfahren zur Identifizierung einer auf einen festen Körper aufgebrachten Markierung |
| WO2001098525A2 (en) | 2000-06-22 | 2001-12-27 | Clinomics Laboratories, Inc. | Frozen tissue microarrays and methods for using the same |
| US6610499B1 (en) | 2000-08-31 | 2003-08-26 | The Regents Of The University Of California | Capillary array and related methods |
| US6716619B1 (en) | 2001-02-08 | 2004-04-06 | Clinomics Biosciences, Inc. | Stylet for use with tissue microarrayer and molds |
| US6534307B1 (en) | 2001-02-08 | 2003-03-18 | Clinomics Biosciences, Inc. | Frozen tissue microarrayer |
| US7157047B2 (en) * | 2001-02-09 | 2007-01-02 | Pss Bio Instruments, Inc. | Device for containing, reacting and measuring, and method of containing, reacting and measuring |
| US20020150966A1 (en) * | 2001-02-09 | 2002-10-17 | Muraca Patrick J. | Specimen-linked database |
| US20020146745A1 (en) * | 2001-04-03 | 2002-10-10 | Surromed, Inc. | Methods and reagents for multiplexed analyte capture, surface array self-assembly, and analysis of complex biological samples |
| US6960437B2 (en) | 2001-04-06 | 2005-11-01 | California Institute Of Technology | Nucleic acid amplification utilizing microfluidic devices |
| WO2002089973A2 (en) * | 2001-05-09 | 2002-11-14 | Ebara Corporation | Affinity reaction probe detection/analysis chips and detection system and apparatus using the same |
| US7723123B1 (en) | 2001-06-05 | 2010-05-25 | Caliper Life Sciences, Inc. | Western blot by incorporating an affinity purification zone |
| US9777312B2 (en) | 2001-06-30 | 2017-10-03 | Enzo Life Sciences, Inc. | Dual polarity analysis of nucleic acids |
| US9261460B2 (en) | 2002-03-12 | 2016-02-16 | Enzo Life Sciences, Inc. | Real-time nucleic acid detection processes and compositions |
| US20040161741A1 (en) | 2001-06-30 | 2004-08-19 | Elazar Rabani | Novel compositions and processes for analyte detection, quantification and amplification |
| US6767731B2 (en) * | 2001-08-27 | 2004-07-27 | Intel Corporation | Electron induced fluorescent method for nucleic acid sequencing |
| DE10149947A1 (de) * | 2001-10-10 | 2003-04-17 | Febit Ferrarius Biotech Gmbh | Mikrofluidisches Extraktionsverfahren |
| US7636636B2 (en) * | 2001-10-12 | 2009-12-22 | Abbott Laboratories | Imaging microarrays |
| DE10153963A1 (de) * | 2001-11-06 | 2003-05-22 | Aventis Behring Gmbh Intellect | Testsystem zur Untersuchung einer biologischen Flüssigkeit |
| US7413859B2 (en) * | 2001-11-14 | 2008-08-19 | Siemens Aktiengesellschaft | Method and biosensors for detecting macromolecular biopolymers |
| US10022078B2 (en) | 2004-07-13 | 2018-07-17 | Dexcom, Inc. | Analyte sensor |
| US20060057576A1 (en) * | 2002-03-12 | 2006-03-16 | Jerzy Paszkowski | Microcapillary hybridization chamber |
| US9353405B2 (en) | 2002-03-12 | 2016-05-31 | Enzo Life Sciences, Inc. | Optimized real time nucleic acid detection processes |
| EP2666849A3 (en) | 2002-04-01 | 2014-05-28 | Fluidigm Corporation | Microfluidic particle-analysis systems |
| EP1507145B1 (en) * | 2002-05-08 | 2009-02-18 | Panasonic Corporation | Biomolecular substrate and test device |
| US8168139B2 (en) | 2002-06-24 | 2012-05-01 | Fluidigm Corporation | Recirculating fluidic network and methods for using the same |
| US7508608B2 (en) | 2004-11-17 | 2009-03-24 | Illumina, Inc. | Lithographically fabricated holographic optical identification element |
| US7872804B2 (en) | 2002-08-20 | 2011-01-18 | Illumina, Inc. | Encoded particle having a grating with variations in the refractive index |
| US7901630B2 (en) | 2002-08-20 | 2011-03-08 | Illumina, Inc. | Diffraction grating-based encoded microparticle assay stick |
| US7900836B2 (en) | 2002-08-20 | 2011-03-08 | Illumina, Inc. | Optical reader system for substrates having an optically readable code |
| US7164533B2 (en) | 2003-01-22 | 2007-01-16 | Cyvera Corporation | Hybrid random bead/chip based microarray |
| US7923260B2 (en) | 2002-08-20 | 2011-04-12 | Illumina, Inc. | Method of reading encoded particles |
| AU2003265583C1 (en) | 2002-08-20 | 2009-05-21 | Cyvera Corporation | Diffraction grating-based optical identification element |
| US7092160B2 (en) | 2002-09-12 | 2006-08-15 | Illumina, Inc. | Method of manufacturing of diffraction grating-based optical identification element |
| US20100255603A9 (en) | 2002-09-12 | 2010-10-07 | Putnam Martin A | Method and apparatus for aligning microbeads in order to interrogate the same |
| CA2498916A1 (en) | 2002-09-12 | 2004-03-25 | Cyvera Corporation | Chemical synthesis using diffraction grating-based encoded optical elements |
| CA2499037A1 (en) | 2002-09-12 | 2004-03-25 | Cyvera Corporation | Method and apparatus for labelling using diffraction grating-based encoded optical identification elements |
| EP2298448A3 (en) | 2002-09-25 | 2012-05-30 | California Institute of Technology | Microfluidic large scale integration |
| TW590982B (en) * | 2002-09-27 | 2004-06-11 | Agnitio Science & Technology I | Micro-fluid driving device |
| JP5695287B2 (ja) * | 2002-10-02 | 2015-04-01 | カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー | 微小流体の核酸解析 |
| US20060211055A1 (en) * | 2002-11-12 | 2006-09-21 | Caliper Life Sciences, Inc. | Capture and release assay system and method |
| US20040101861A1 (en) * | 2002-11-27 | 2004-05-27 | Little Roger G. | Resonant cavity photodiode array for rapid DNA microarray readout |
| EP1616169B1 (en) * | 2003-03-27 | 2009-06-24 | Corning Incorporated | Label-free evanescent-field detection of biological and chemical agents |
| JP2004344036A (ja) * | 2003-05-21 | 2004-12-09 | Fujitsu Ltd | 物質導入装置及び物質導入システム |
| US20050016552A1 (en) * | 2003-06-10 | 2005-01-27 | Rubbermaid Commercial Products Llc | Smoking-waste receptacle with disposable container |
| US20040253141A1 (en) * | 2003-06-16 | 2004-12-16 | Schembri Carol T. | Apparatus and method for nucleic acid spatial ordering |
| US20050026304A1 (en) * | 2003-07-30 | 2005-02-03 | Laurakay Bruhn | Microarray based affinity purification and analysis device coupled with secondary analysis technologies |
| US20050037424A1 (en) * | 2003-08-13 | 2005-02-17 | Schembri Carol T. | Selectable length linear microarrays |
| US7920906B2 (en) | 2005-03-10 | 2011-04-05 | Dexcom, Inc. | System and methods for processing analyte sensor data for sensor calibration |
| US7147362B2 (en) * | 2003-10-15 | 2006-12-12 | Agilent Technologies, Inc. | Method of mixing by intermittent centrifugal force |
| US20050084867A1 (en) * | 2003-10-15 | 2005-04-21 | Caren Michael P. | Hybridization and scanning apparatus |
| US20050084866A1 (en) * | 2003-10-15 | 2005-04-21 | Caren Michael P. | Methods and apparatus for sample mixing |
| US9247900B2 (en) | 2004-07-13 | 2016-02-02 | Dexcom, Inc. | Analyte sensor |
| US20050112588A1 (en) * | 2003-11-25 | 2005-05-26 | Caren Michael P. | Methods and apparatus for analyzing arrays |
| US7433123B2 (en) | 2004-02-19 | 2008-10-07 | Illumina, Inc. | Optical identification element having non-waveguide photosensitive substrate with diffraction grating therein |
| WO2005086703A2 (en) * | 2004-03-05 | 2005-09-22 | Creatv Microtech, Inc. | Flow-through chemical and biological sensor |
| WO2006025866A2 (en) * | 2004-03-05 | 2006-03-09 | Creatv Microtech, Inc. | Integrated multistep biosensor |
| US20050221418A1 (en) * | 2004-04-06 | 2005-10-06 | U.S. Army Research Laboratory | Enhanced bacterial endospore detection method and system |
| US7654956B2 (en) | 2004-07-13 | 2010-02-02 | Dexcom, Inc. | Transcutaneous analyte sensor |
| US7846676B2 (en) * | 2004-07-19 | 2010-12-07 | Cell Biosciences, Inc. | Methods and devices for analyte detection |
| US7935479B2 (en) * | 2004-07-19 | 2011-05-03 | Cell Biosciences, Inc. | Methods and devices for analyte detection |
| WO2006014680A1 (en) * | 2004-07-19 | 2006-02-09 | Cell Biosciences, Inc. | Methods and devices for analyte detection |
| WO2006020363A2 (en) | 2004-07-21 | 2006-02-23 | Illumina, Inc. | Method and apparatus for drug product tracking using encoded optical identification elements |
| EP1627926A1 (en) * | 2004-08-19 | 2006-02-22 | Roche Diagnostics GmbH | A method to reduce false positive results |
| CN101048515B (zh) * | 2004-08-31 | 2013-06-12 | 荣研化学株式会社 | 核酸分析方法 |
| JP4839051B2 (ja) * | 2004-10-08 | 2011-12-14 | シスメックス株式会社 | 核酸プローブを用いる被検物質の検出方法 |
| EP2194485B1 (en) | 2004-11-16 | 2012-10-17 | Illumina, Inc. | Method and apparatus for reading coded microbeads |
| US7545969B2 (en) * | 2004-12-16 | 2009-06-09 | Alliant Techsystems Inc. | Method and system for wide-area ultraviolet detection of forensic evidence |
| JP4626350B2 (ja) * | 2005-03-22 | 2011-02-09 | ソニー株式会社 | ハイブリダイゼーション検出に適する反応部などを有する流路系、該流路系を用いるハイブリダイゼーション検出装置 |
| US7618809B2 (en) | 2005-03-23 | 2009-11-17 | Gebing Ronald A | Microarrayer with coaxial multiple punches |
| US20060246576A1 (en) | 2005-04-06 | 2006-11-02 | Affymetrix, Inc. | Fluidic system and method for processing biological microarrays in personal instrumentation |
| EP1872139A2 (en) * | 2005-04-09 | 2008-01-02 | Cell Biosciences, Inc. | Automated micro-volume assay system |
| US20060292576A1 (en) * | 2005-06-23 | 2006-12-28 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Non-in situ hybridization method for detecting chromosomal abnormalities |
| WO2007035864A2 (en) | 2005-09-20 | 2007-03-29 | Cell Biosciences, Inc. | Electrophoresis standards, methods and kits |
| US7830575B2 (en) | 2006-04-10 | 2010-11-09 | Illumina, Inc. | Optical scanner with improved scan time |
| EP2010657A2 (en) * | 2006-04-24 | 2009-01-07 | Nimblegen Systems, Inc. | Use of microarrays for genomic representation selection |
| US20080194414A1 (en) * | 2006-04-24 | 2008-08-14 | Albert Thomas J | Enrichment and sequence analysis of genomic regions |
| US8383338B2 (en) | 2006-04-24 | 2013-02-26 | Roche Nimblegen, Inc. | Methods and systems for uniform enrichment of genomic regions |
| JP4940756B2 (ja) * | 2006-05-22 | 2012-05-30 | ソニー株式会社 | マイクロ流路系 |
| US20080017512A1 (en) * | 2006-07-24 | 2008-01-24 | Bordunov Andrei V | Coatings for capillaries capable of capturing analytes |
| JP5034438B2 (ja) * | 2006-10-20 | 2012-09-26 | ソニー株式会社 | 流路系、及びハイブリダイゼーション検出装置 |
| US20080108804A1 (en) * | 2006-11-02 | 2008-05-08 | Kabushiki Kaisha Dnaform | Method for modifying RNAS and preparing DNAS from RNAS |
| US7955810B2 (en) * | 2006-12-01 | 2011-06-07 | Cedars-Sinai Medical Center | Positive selection of serum proteins for proteomic analysis |
| US8080372B2 (en) * | 2007-04-11 | 2011-12-20 | Canon Kabushiki Kaisha | Method for detecting nucleic acid in sample, method for designing probes, system for designing probes therefor |
| US20090023156A1 (en) * | 2007-07-20 | 2009-01-22 | Voss Karl O | Methods and reagents for quantifying analytes |
| BRPI0819739A2 (pt) * | 2007-11-21 | 2017-05-09 | Univ Erasmus Med Ct Rotterdam | sondas de fret otimizadas e usos das mesmas |
| US8093063B2 (en) * | 2007-11-29 | 2012-01-10 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Assay for detecting genetic abnormalities in genomic nucleic acids |
| WO2009082242A2 (en) * | 2007-12-21 | 2009-07-02 | University Of Otago | Optical analyte detection incorporating a micromirror device |
| US10107782B2 (en) | 2008-01-25 | 2018-10-23 | ProteinSimple | Method to perform limited two dimensional separation of proteins and other biologicals |
| US8519115B2 (en) * | 2008-08-14 | 2013-08-27 | Nanostring Technologies, Inc. | Stable nanoreporters |
| DE102008052223A1 (de) * | 2008-10-17 | 2010-04-22 | Albert-Ludwigs-Universität Freiburg | Lumineszenzscanner sowie Verfahren zur Detektion von Lumineszenz in Halbleiterbauteilen |
| JP2012018039A (ja) * | 2010-07-07 | 2012-01-26 | Sony Corp | マイクロ流路と核酸ハイブリダイゼーションのためのマイクロチップとカラム及び装置並びに方法 |
| MX2012012250A (es) | 2010-10-18 | 2013-03-05 | Originoil Inc | Sistemas, aparatos, y metodos para extraer lipidos no polares de una lechada acuosa de algas y lipidos producidos de la misma. |
| KR20120062327A (ko) * | 2010-12-06 | 2012-06-14 | 한국전자통신연구원 | 바이오센서 장치 및 이의 제조방법 |
| US20120295338A1 (en) * | 2011-05-20 | 2012-11-22 | Paul Reep | Monitoring systems for biomass processing systems |
| US20120322064A1 (en) * | 2011-05-23 | 2012-12-20 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Hybridization probes and methods of their use |
| EP2839276B1 (en) | 2012-04-19 | 2018-06-27 | ProteinSimple | Dual wavelength isoelectric focusing for determining drug load in antibody drug conjugates |
| JP6095058B2 (ja) * | 2013-03-14 | 2017-03-15 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | メチルシトシン検出法 |
| US9766206B2 (en) | 2013-09-27 | 2017-09-19 | ProteinSimple | Apparatus, systems, and methods for capillary electrophoresis |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4603114A (en) * | 1980-09-23 | 1986-07-29 | California Institute Of Technology | Method for the sequential performance of chemical processes |
| EP0063810B1 (en) * | 1981-04-29 | 1986-03-05 | Ciba-Geigy Ag | New devices and kits for immunological analysis |
| US4786600A (en) * | 1984-05-25 | 1988-11-22 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Autocatalytic replication of recombinant RNA |
| US4960691A (en) * | 1986-09-29 | 1990-10-02 | Abbott Laboratories | Chromatographic test strip for determining ligands or receptors |
| US5447837A (en) * | 1987-08-05 | 1995-09-05 | Calypte, Inc. | Multi-immunoassay diagnostic system for antigens or antibodies or both |
| US5045172A (en) * | 1987-11-25 | 1991-09-03 | Princeton Biochemicals, Inc. | Capillary electrophoresis apparatus |
| US5202010A (en) * | 1987-11-25 | 1993-04-13 | Princeton Biochemicals, Inc. | Automated capillary electrophoresis apparatus |
| JP2539528B2 (ja) * | 1990-03-02 | 1996-10-02 | 株式会社日立製作所 | 毛細管を用いた分析方法および分析装置 |
| CA2046713A1 (en) * | 1990-10-16 | 1992-04-17 | Richard M. Martinelli | Amplification of midivariant dna templates |
| US5846708A (en) * | 1991-11-19 | 1998-12-08 | Massachusetts Institiute Of Technology | Optical and electrical methods and apparatus for molecule detection |
| US5587128A (en) * | 1992-05-01 | 1996-12-24 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Mesoscale polynucleotide amplification devices |
| US5324483B1 (en) * | 1992-10-08 | 1996-09-24 | Warner Lambert Co | Apparatus for multiple simultaneous synthesis |
| US5795714A (en) * | 1992-11-06 | 1998-08-18 | Trustees Of Boston University | Method for replicating an array of nucleic acid probes |
| US5439578A (en) * | 1993-06-03 | 1995-08-08 | The Governors Of The University Of Alberta | Multiple capillary biochemical analyzer |
| DE69418450T2 (de) * | 1993-10-07 | 1999-09-16 | Beckman Coulter Inc | Verwendung von kapillarer elektroforese zur quantitativen bestimmung von proteinkomponenten und des gesamten proteingehaltes in flussigkeiten |
| US5589136A (en) * | 1995-06-20 | 1996-12-31 | Regents Of The University Of California | Silicon-based sleeve devices for chemical reactions |
| US5534123A (en) * | 1995-07-10 | 1996-07-09 | Molecular Dynamics | Denaturing separation matrix having hydroxyethyl cellulose for nucleic acid electrophoresis |
| US5763263A (en) * | 1995-11-27 | 1998-06-09 | Dehlinger; Peter J. | Method and apparatus for producing position addressable combinatorial libraries |
-
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