JPH10123137A - 高感度免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 不溶性担体の立体的障害による凝集阻害がな
く、非特異凝集を惹起することなく、抗原抗体反応系中
に反応に関与する抗原又は抗体をできるだけ多く存在さ
せることができ、抗原性物質を正確に定量できる免疫測
定法を提供する。 【解決手段】 本発明による高感度免疫測定法は、特定
の抗原に対する異なる２種以上のモノクローナル抗体を
不溶性担体に担持させ、水溶媒中で抗原と反応させ、不
溶性担体と抗原の結合物を選択的に凝集させるに当た
り、不溶性担体として平均粒径の異なる２種以上の担体
を用い、これら不溶性担体に各モノクローナル抗体をそ
れぞれ担持させることを特徴とする。好ましい不溶性担
体はラテックス粒子である。好ましくは、平均粒径が
０．０５〜０．５００μｍの範囲にある２種以上のラテ
ックス粒子を、最小粒子種の平均粒径に対する他の粒子
種の平均粒径の比が３〜６の範囲になるように組み合わ
せて使用する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、特定の抗原に対す
るモノクローナル抗体を不溶性担体に担持させ、水溶媒
中で該抗原と反応させ、不溶性担体と抗原の結合物を選
択的に凝集反応させる高感度免疫測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、病院、検査センター等において
は、省力化、コスト削減、多量検体処理等の要請から、
臨床検査等の諸検査の自動化、および測定時間の短縮化
が図られてきた。このような自動化に適した方法とし
て、不溶性担体粒子の凝集反応を利用して抗原性物質を
定性ないし定量する凝集法が知られている（特公昭５８
−１１５７５号公報参照）。

【０００３】この凝集法は、被検試料中における抗原性
物質を測定するに当たり、該被検試料と、該抗原性物質
に特異的に結合する抗体もしくはそのフラグメントを担
持させた不溶性担体とを反応させ、不溶性担体の凝集の
程度を測定することにより、前記抗原性物質を検出また
は定量するものである。この場合、上記抗体としては、
通常、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が
適宜選択される。モノクローナル抗体は抗原分子上の特
定のエピトープのみと反応するため、該抗原性物質は多
価抗原である場合でも特定のエピトープに関しては多価
であるとは限らない。従って、上記抗体としてモノクロ
ーナル抗体を用いた場合は、その抗原は、特定のモノク
ローナル抗体に対応するエピトープに関しては、一価抗
原となる可能性が高くなる。測定の対象とする抗原物質
が一価抗原である場合、不溶性担体に担持された１種類
のモノクローナル抗体と被検試料中の該抗原性物質とが
反応もしくは結合しても、通常、凝集は起こらない。こ
のため、凝集の起こり易さという観点から、通常、ポリ
クローナル抗体が多用されている。

【０００４】しかしながら、ポリクローナル抗体とモノ
クローナル抗体を比較してみれば、抗原に対する特異性
の点では、モノクローナル抗体の方が断然優れている。
また、ポリクローナル抗体は動物の個体差や採血の時期
により異なるため、常に同じ品質のものを得ることは難
しく、特異抗体に精製する段階での該抗体の量および活
性損失も大きい。これに対し、モノクローナル抗体は品
質の一定した抗体を大量生産するのに向いている。

【０００５】このような点を考慮して、特定の抗原に対
する異なる２種または３種のモノクローナル抗体を不溶
性担体に担持させ、該抗原と反応させて、不溶性担体の
凝集の程度を測定することにより、前記抗原性物質を検
出または定量する方法が提案されている（特公平３−４
０３４１号公報参照）。

【０００６】また、近年、免疫診断では尿、血清、血漿
等に含まれる微量物質、たとえば癌マーカーであるα−
フェトプロテイン（ＡＦＰ）や、カルテイノエンブリオ
イックアンテイジエン（ＣＥＡ）などは１ｎｇ／ｍｌと
いった低濃度まで定量することが望まれている。このよ
うな物質を測定するために、平均粒径の異なる２種以上
のラテックス粒子を混合することによって低濃度から高
濃度までの広範囲濃度の抗原又は抗体の測定を可能にす
る方法も提案されている（特開昭６３−６５３６９号公
報参照）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、すべて
のモノクローナル抗体を同一平均粒径の不溶性担体に担
持させる方法では、不溶性担体による立体的障害のため
に、抗体と測定しようとする抗原物質との間の抗原抗体
反応およびそれに続く凝集反応が阻害される可能性があ
る。すなわち、抗原性物質が、１種類のモノクローナル
抗体と、少なくとももう１種類のモノクローナル抗体と
に同時に結合することによって、不溶性担体の凝集が生
じるわけであるが、すべてのモノクローナル抗体が不溶
性担体に担持されていると、２種のモノクローナル抗体
の認識する抗原のエピトープが構造的に互いに近接した
部位にある場合、不溶性担体間の立体的障害によって、
異なる２種または３種のモノクローナル抗体が１つの抗
原物質に対し同時に結合することが阻害される場合があ
る。また、この２種あるいは３種のモノクローナル抗体
の間で抗原と抗原との親和定数が大きく乖離している場
合も上記と同様に該親和定数の高いモノクローナル抗体
が優先的に抗原と結合し、他のモノクローナル抗体との
結合およびそれに続く凝集を阻害する場合がある。これ
らの理由により、モノクローナル抗体を同一平均粒径の
不溶性担体に担持させる方法では、抗原性物質を正確に
定量できない可能性がある。

【０００８】特開昭６３−６５３６９号公報は、上述し
たように、低濃度の抗原物質の検出を実現するために、
平均粒径の異なる２種以上のラテックス粒子を混合する
方法を開示しているが、この方法で用いられている抗体
はポリクローナル抗体であり、かつこの公報記載の発明
は抗原抗体反応系中に反応に関与する抗原または抗体を
できるだけ多く存在させることを企図したものである。
従って低濃度での反応量は増大するが、同時にバックグ
ラウンドおよび抗原物質以外の物質に由来する非特異凝
集が多いという欠点がある。

【０００９】本発明の目的は、上記のごとき実情に鑑
み、不溶性担体の立体的障害による凝集阻害がなく、非
特異凝集を惹起することなく、抗原抗体反応系中に反応
に関与する抗原または抗体をできるだけ多く存在させる
ことができ、その結果、抗原性物質を正確に定量できる
高感度免疫測定法を提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明による高感度免疫
測定法は、特定の抗原に対する異なる２種以上のモノク
ローナル抗体を不溶性担体に担持させ、水溶媒中で抗原
と反応させ、不溶性担体と抗原の結合物を選択的に凝集
させるに当たり、不溶性担体として平均粒径の異なる２
種以上の担体を用い、これら不溶性担体に各モノクロー
ナル抗体をそれぞれ担持させることを特徴とする方法で
ある。

【００１１】本発明により検出するのに適した抗原性物
質は、生体試料中に含まれる生理活性物質で、かつ該抗
原性物質に対応するモノクローナル抗体の作成ないし入
手が可能である限り特に限定されないが、一価の抗原で
かつ１種類のモノクローナル抗体では検出不可能なもの
が特に望ましい。また、抗原性物質を検出する試験項目
としては、臨床検査上重要な項目であり、かつ従来の凝
集法では検出感度が不足であるとされていた項目が特に
有用である。

【００１２】例えば、癌検診のスクリーニングにおいて
測定される、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９などの１ｎｇ／ｍｌ
まで検出感度が要求される項目などである。

【００１３】本発明で使用するモノクローナル抗体は特
定の抗原に対する異なる２種以上（例えば２種または３
種、好ましくは２種）のモノクローナル抗体である。モ
ノクローナル抗体は、細胞融合技術分野において、それ
自体公知の手法を適宜に選択し、またそれらを組み合わ
せてモノクローナル抗体産生融合細胞株を形成し、該細
胞株を利用して産生、取得することができる（「単クロ
ーン抗体・ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ」岩崎辰夫ら
著、講談社）。

【００１４】細胞融合の一態様によれば、ある特定の完
全抗原を用いて、これを適当な動物、例えばマウス、ラ
ット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシなどの動物
に、例えば、アジュバントとともに皮下注射するといっ
た手法を用いて投与し、該動物を免疫した後、この免疫
動物、例えば免疫マウスの該抗原に対する抗体産生細
胞、例えば脾細胞、胸腺細胞、リンパ節細胞および／ま
たは末梢血細胞などの細胞を採取し、該細胞と自己増殖
性を有するが抗体産生能を実質的に有しない適当な株化
細胞、例えばマウス骨髄腫（ミエローマ）株化細胞と
を、それ自体公知の手法により細胞融合処理する。

【００１５】モノクローナル抗体を得るためのミエロー
マ細胞と抗体産生細胞との組み合わせは、各細胞が融合
して増殖しつつ抗体を産生することが可能であれば、そ
れぞれの細胞の由来する動物の種類は限定されず、任意
の組み合わせでよい。

【００１６】使用されるミエローマ細胞は特に限定はな
く、多くのマウス、ラット、ウサギ、ヒトなどの動物の
細胞体を使用することができる。好ましい株化細胞は薬
剤抵抗性のものであり、かつ未融合のミエローマ細胞が
選択培地で生存せず、一方融合細胞のみが生存するよう
なものである。通常用いられるものは、８−アザグアニ
ジン抵抗性の株化細胞で、これはヒポキサンチン・グア
ニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒ
ポキサンチン・アミンプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培
地に生育できない性質を有している。さらに使用する株
化細胞は「非分泌型」のものであることが好ましい。例
えばマウスミエローマＭＯＰＣ−２１株由来のＰ₃ ／Ｘ
６３−Ａｇ８Ｕ₁ （Ｐ₃ Ｕ₁ ）、Ｐ₃ ／Ｘ６３−Ａｇ８
・６・５・３、Ｐ₃ ／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１、Ｓｐ２
／Ｏ−Ａｇ１４、ラットミエローマ２１０・ＲＣＹ３・
Ａｇ１・２・３などが好適に用いられる。

【００１７】該細胞融合処理は、例えば、通常イーグル
最小基本（ＭＥＭ）培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地など
の培地中で上記免疫マウスの脾細胞１×１０⁸ 〜５×１
０⁸個と、上記マウス骨髄腫株化細胞１×１０⁷ 〜５×
１０⁷ 個とを、混合して行うことができる。融合促進剤
としては、平均分子量１，０００〜６，０００のポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）が好ましく、他の融合促進
剤、例えば、ポリビニルアルコール、ウイルスなども使
用することができる。ＰＥＧの使用濃度は好ましくは約
３０〜５０％である。

【００１８】上述のようにして得ることのできる融合細
胞含有系から融合細胞を、それ自体公知の手法を利用し
て、選別処理、抗体活性スクリーニング処理およびクロ
ーニング処理して、免疫マウスの形成に用いた完全抗原
に対するモノクローナル抗体産生能を有し、かつ自己増
殖能を持つ融合細胞株を取得することができる。

【００１９】上記融合細胞の選別処理は、例えば、２０
％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで細胞
融合を終えた細胞を適当に希釈し、９６穴マイクロプレ
ートに１０⁵ 〜１０⁶ 個／ウェル程度に分注し、各ウェ
ルに選択培地（例えばＨＡＴ培地）を加え、以後選択培
地交換を行いながら、５％ＣＯ₂ 培養器（３７℃）で培
養を続けることにより行うことができる。ミエローマ細
胞として８−アザグアニン抵抗性株を用いれば、未融合
のミエローマ細胞はＨＡＴ培地で死滅し、また抗体産生
細胞は正常細胞なので試験管内（in vitro）培養では長
期間生育できない。したがって培養後１０〜１４日ぐら
いから生育してくる細胞はすべて融合細胞である。

【００２０】上述のようにして得ることのできる融合細
胞株の抗体活性スクリーニング処理およびクローニング
処理は、例えば以下のようにして常法により行うことが
できる。

【００２１】融合細胞の生育したウェルの培養上清の一
部を採取し、一定量の標識抗原とインキュベーション
し、標識抗原との結合能を測定することにより目的とす
る抗体を分泌しているウェルを検索することができる。
すなわち、 ¹²⁵Ｉ、 ¹³¹Ｉなどのラジオアイソトープあ
るいは酵素などで標識した抗原と培養上清を反応させた
後、各反応液について抗原−抗体結合物を分離し、標識
量を測定することにより、目的とする抗体の存在および
結合能を検索することができる。

【００２２】目的とする抗体活性の認められる各ウェル
中には２種以上の融合細胞が生育している可能性がある
ので、限界希釈法や軟寒天によるコロニー形成法により
クローニングを行い、モノクローナル抗体産生融合細胞
株を得ることができる。

【００２３】上述のようにして得ることのできるモノク
ローナル抗体産生細胞株を用いて、前記免疫動物の形成
に用いた完全抗原に対するモノクローナル抗体を取得す
るには、該モノクローナル抗体産生細胞株を、例えば適
当な培地に培養し、培地からモノクローナル抗体を採取
する方法、ミエローマ細胞由来動物と同系の動物に該細
胞株を移植し腹水中のモノクローナル抗体を採取する方
法など、それ自体公知の手法を利用することができる。

【００２４】上記前者の方法によれば、例えば、モノク
ローナル抗体産生融合細胞株を１０％ウシ胎児血清含有
ＲＰＭＩ−１６４０培地などの培養液で培養し、その培
養上清液を硫安分画や、抗原を結合させたセファロース
４Ｂなどのアフィニティークロマトグラフィーなどによ
って精製することにより目的とするモノクローナル抗体
を採取することができる。

【００２５】また、上記後者の方法によれば、例えば、
同系動物にプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメ
チルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与した後、
融合細胞を腹腔内投与することにより生体内（in vivo
）で融合細胞を大量に増殖させる。その結果、形成さ
れる腹水には高濃度のモノクローナル抗体が含まれてい
る。この腹水から硫安分画および必要に応じて前記アフ
ィニティークロマトグラフィーなどにより、目的とする
モノクローナル抗体を取得することができる。

【００２６】上述のようにして取得できるようなモノク
ローナル抗体は市販品として入手することも可能であ
り、本発明方法に利用できる。

【００２７】本発明で使用する不溶性担体としては、従
来より免疫化学的凝集反応および凝集阻止反応において
一般的に用いられている微粒子の担体を使用することが
できる。

【００２８】このような不溶性担体としては、工業的に
大量生産可能な有機系微粒子が好ましいが、これに限定
されるものではない。工業的に大量生産可能な有機系微
粒子としては、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリ
ロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタク
リル酸エステルなどのビニル系モノマーの単独重合体お
よび／または共重合体、スチレン−ブタジエン共重合
体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体などの
ブタジエン系共重合体などの微粒子、および官能基とし
てカルボキシル基、第１級アミノ基、またはカルボアミ
ノ基（−ＣＯＮＨ ₂ ）、水酸基、アルデヒド基などを有
し、かつ基体が前記有機系微粒子からなる反応性有機系
微粒子などが挙げられる。抗体の吸着性に優れており、
かつ生物学的活性を長期間安定に保持できるなどの理由
から、特にポリスチレン系のラテックス粒子が好まし
い。

【００２９】そのほか、動物の赤血球や細菌の細胞など
の生物学的粒子、ベントナイト、コロジオン、コレステ
ロール結晶、シリカ、カオリン、炭素末など非生物学的
粒子が挙げられる。

【００３０】本発明で使用する不溶性担体の平均粒径
は、不溶性担体上の抗体と、測定対象となる抗原物質の
抗原抗体反応により惹起される凝集反応の結果生じた凝
集塊が肉眼または光学的に検出できるに充分な大きさを
呈するものであればよい。特に、平均粒径が０．０５〜
０．５００μｍの範囲にある２種以上の不溶性担体（好
ましくはラテックス粒子）を、最小粒子種（２種以上の
不溶性担体のうち最も平均粒径の小さいもの）の平均粒
径に対する他の粒子種（２種以上の不溶性担体のうち上
記最小粒子種以外の１または２以上のもの）の平均粒径
の比が３〜６の範囲になるように組み合わせて使用する
ことが好ましい。

【００３１】２種の不溶性担体を混合する際、その容量
の比は１：１０〜１０：１の範囲で、測定対象物質の必
要な検出下限に合わせて適宜選択される。３種以上の不
溶性担体を混合する際にも上記と同様に混合比を決定す
ればよい。

【００３２】上記不溶性担体の表面にモノクローナル抗
体を感作させる手法は種々知られており、本発明におい
て適宜利用できる。例えば、このような感作手法として
不溶性担体表面にモノクローナル抗体を物理的に吸着さ
せる手法や、官能基を有する不溶性担体表面に、既知の
方法である化学結合法や共有結合法により、モノクロー
ナル抗体を効率的に感作する手法が挙げられる。

【００３３】抗体を担持させた不溶性担体と、抗原との
反応は、抗原抗体反応及びそれに伴う凝集反応であり、
該反応が起こりうる条件であれば、その反応条件は特に
限定されないが、反応温度は恒温、特に２５℃〜３７℃
の範囲内の恒温であることが好ましい。反応時間につい
ても特に限定されないが、５秒〜１５分が好ましい。

【００３４】反応液としては、抗原抗体反応が起こりう
る生理的条件を満たす水溶液であればどのようなもので
もよいが、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸
緩衝液、グッド緩衝液等が好ましい。反応液のｐＨは、
好ましくは５．５〜８．５、特に好ましくは６．５〜
８．０である。上記反応液に、安定剤として牛血清アル
ブミン、ショ糖、または感度を高める効果が期待される
ポリエチレングリコール、デキストランなどの水溶性多
糖類、防腐剤としてアジ化ナトリウム、および塩濃度調
整のために塩化ナトリウム等の添加剤を適宜溶解させて
もよい。

【００３５】不溶性担体の凝集の程度を測定する方法
は、特に限定されない。例えば、凝集を定性的ないし半
定量的に測定する場合には、既知の試料の濁度の程度と
の比較から、上記結合物の凝集の程度を目視によって判
定することも可能である。該凝集を定量的に測定する場
合、簡便性及び精度の点からは、例えば光学的に測定す
ることが望ましい。

【００３６】凝集の光学的測定法としては、公知の方法
が利用可能である。より具体的には、例えば、いわゆる
比濁法（凝集塊の形成を濁度の増加としてとらえる）、
粒度分布による測定法（凝集塊の形成を粒度分布ないし
平均粒径の変化としてとらえる）、積分球濁度法（凝集
塊の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定
し、透過光強度との比を比較する）などの種々の方式が
利用可能である。

【００３７】これらのそれぞれの測定法について、速度
試験（レートアッセイ；異なる時点で少なくとも２つの
測定値を得て、これらの時点間における該測定値の増加
分（すなわち増加速度）に基づき凝集の程度を求める）
と、終点試験（エンドポイントアッセイ；ある時点（通
常は、反応の終点と考えられる時点）で１つの測定値を
得て、この測定値に基づき凝集の程度を求める）が利用
可能である。測定の簡便さ、迅速性の点からは、比濁法
を用いた速度試験を行うことが望ましい。

【００３８】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施例を説明す
る。

【００３９】実施例および比較例で用いた試薬および材
料は、下記の通りである。

【００４０】１）試薬および材料 下記の試薬および材料を用意ないしは調製した。

【００４１】抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体：抗ＣＥ
Ａモノクローナル抗体（Clone No. ＣＥＡ４−Ｇ６７、
ＩｇＧ−１、ＤＡＫＯ社製、およびClone No. ＣＥＡ４
−Ｇ１１、ＩｇＧ−１、ＤＡＫＯ社製）を用いた。

【００４２】ラテックス：平均粒径０．０８７μｍ、
０．１２０μｍ、、０．２１０μｍ０．４００μｍ、
０．４６４μｍのポリスチレン粒子をそれぞれ含む５種
のラテックス（いずれも固形分１０％（Ｗ／Ｖ）、積水
化学社製）を用いた。

【００４３】ラテックス希釈用緩衝液：５０ｍＭ Ｎａ
₂ ＨＰＯ₄ と５０ｍＭ ＮａＨ₂ ＰＯ₄ をｐＨ７．５０
になるように混合し、得られた混合物をラテックス希釈
用緩衝液として用いた。

【００４４】抗体希釈用緩衝液：上記ラテックス希釈用
緩衝液を抗体希釈用緩衝液としても用いた。

【００４５】ブロッキング用緩衝液：１００ｍＭ Ｎａ
₂ ＨＰＯ₄ と１００ｍＭ ＮａＨ₂ ＰＯ₄ をｐＨ７．４
０になるように混合し、得られた混合物にウシ血清アル
ブミン（Bovine serum albumin、Fraction V、Reagent
Grade 、Miles Corp. 社製）を１％（Ｗ／Ｖ）になるよ
うに、またＮａＮ₃ （試薬特級、ナカライテスク社製）
を０．１％（Ｗ／Ｖ）になるように添加したものを、ブ
ロッキング用緩衝液として用いた。

【００４６】ＣＥＡ標準品：ＣＥＡ標準品（ダイナボッ
ト社製、ＣＥＡ・リアビーズキット添付品）の０、５、
２０、１００、５００ｎｇ／ｍｌをそのまま用いた。

【００４７】検体希釈用希釈液（Ｒ１液）：ブロッキン
グ用緩衝液に、ポリエチレングリコール６，０００（平
均分子量７，５００、和光純薬社製）を３％（Ｗ／Ｖ）
になるように添加したものを検体希釈用希釈液（Ｒ１
液）として用いた。

【００４８】実施例１ (1) ＣＥＡ測定用試薬の調製 平均粒径０．０８７μｍのポリスチレンラテックス（固
形分１０％（Ｗ／Ｖ））１容に、ラテックス希釈用緩衝
液９容を添加してラテックスを希釈し、１．０％ラテッ
クス液とした。抗ＣＥＡ抗体（Clone No. ＣＥＡ４−Ｇ
６７）は、タンパク濃度が６６．７μｇ／ｍｌになるよ
うに抗体希釈用緩衝液で希釈し、感作用の抗体液とし
た。１．０％（Ｗ／Ｖ）ラテックス液６００μｌを２５
℃のインキュベーター中でマグネチックスターラーで攪
拌しながら、これに抗体液１２００μｌを素早く添加
し、２５℃にて１時間攪拌した。その後、ブロッキング
用緩衝液を３．０ｍｌ添加し、２５℃にて続けて２時間
攪拌した。その後、１５℃、１５，０００ｒｐｍにて１
５分間遠心分離した。得られた沈殿にブロッキング用緩
衝液を４．０ｍｌ添加し、同様に遠心分離することによ
り、沈殿を洗浄した。洗浄操作は３回行った。この沈殿
にブロッキング用緩衝液を１．８ｍｌ添加し、よく攪拌
した後、超音波破砕機にて分散処理を行った。これにさ
らにブロッキング用緩衝液を１．８ｍｌ添加し、固形分
０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬［１］とし
た。このようにして調製したＣＥＡ測定用試薬［１］は
４℃にて保存した。

【００４９】また、不溶性担体液として、平均粒径０．
４６４μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０％
（Ｗ／Ｖ））を用い、感作用の抗体液として、抵ＣＥＡ
抗体（Clone No. ＣＥＡ４−Ｇ１１、ＩｇＧ−１）をタ
ンパク濃度が１２．５μｇ／ｍｌになるように抗体希釈
用緩衝液で希釈したものを用い、その他の点ではＣＥＡ
測定用試薬［１］の場合と同様の操作を行って固形分
０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬［２］を得、
４℃にて保存した。

【００５０】(2) ＣＥＡ量の測定 ＣＥＡ量の測定は、生化学用自動分析装置７１５０形
（日立製作所社製）を用いて行った。上記(1) で得られ
た固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬
［１］および［２］を等量混合し、得られた混合液を試
薬（Ｒ２液）（固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ））とした。
測定条件は以下の通りである。

【００５１】 検体容量 ２０μｌ 検体希釈用希釈液（Ｒ１液） ２１０μｌ 試薬（Ｒ２液） ３０μｌ 測定波長 ５７０ｎｍ 測定温度 ３７℃

【００５２】測定系に試薬（Ｒ２液）を添加してから約
８０秒後の吸光度と約３２０秒後の吸光度の差（ΔＯＤ
５７０）を測定し、この吸光度の差を１０，０００倍し
たものを吸光度変化量とした。検体として既知濃度のＣ
ＥＡ標準品を用いて測定を行い、検量線を作成した。

【００５３】比較例１（同一平均粒径のラテックス凝集
免疫試薬を用いたＣＥＡ量の測定） 実施例１で得られたＣＥＡ測定用試薬［１］（ラテック
ス凝集免疫試薬（固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ））をその
まま試薬（Ｒ２液）として用いた点を除いて、実施例１
と同じ操作を行った。

【００５４】比較例２（同一平均粒径のラテックス凝集
免疫試薬を用いたＣＥＡ量の測定） 実施例１で得られたＣＥＡ測定用試薬［２］（ラテック
ス凝集免疫試薬（固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ））をその
まま試薬（Ｒ２液）として用いた点を除いて、実施例１
と同じ操作を行った。

【００５５】試験結果 実施例１および比較例１、２で測定した吸光度変化量お
よび作成した検量線を表１および図１に示す。

【００５６】

【表１】

【００５７】表１および図１から明らかなように、本発
明の方法による実施例１の測定値から作成された検量線
は、ＣＥＡ低濃度域から高濃度域まで、良好な直線性を
示した。これに対し、同一平均粒径のラテックス凝集免
疫試薬による比較例１、２の検量線は、ＣＥＡ低濃度域
および高濃度域において、本発明による方法よりも反応
性が低いため、良好な直線性を示さなかった。

【００５８】これは、実施例１では、２種のモノクロー
ナル抗原を異なる平均粒径の不溶性担体に担持させてな
るラテックス試薬を用いたため、比較例で用いた同一平
均粒径のものよりもラテックス粒子間の立体障害が解消
され、抗原抗体反応およびそれに続く凝集反応が促進さ
れたためと推察される。

【００５９】以上の結果から、本発明によるＣＥＡ定量
法は、従来のラテックス凝集免疫試薬よりも高感度で優
れた定量法であることが確認された。

【００６０】実施例２ (1) ＣＥＡ測定用試薬の調製 不溶性担体液として、平均粒径０．１２０μｍおよび
０．４００μｍの２種のポリスチレンラテックスを用
い、感作用の抗体液として、抵ＣＥＡ抗体Clone No. Ｃ
ＥＡ４−Ｇ６７をタンパク濃度が４８．３μｇ／ｍｌに
なるように抗体希釈用緩衝液で希釈したもの、および、
抵ＣＥＡ抗体Clone No. ＣＥＡ４−Ｇ１１をタンパク濃
度が１４．５μｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液
で希釈したものをそれぞれ用い、その他の点ではＣＥＡ
測定用試薬［１］の場合と同様の操作を行って固形分
０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬［３］および
［４］を得、４℃にて保存した。

【００６１】(2) ＣＥＡ量の測定 上記(1) で得られた固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥ
Ａ測定用試薬［３］および［４］を等量混合し、得られ
た混合液を試薬（Ｒ２液）とした点を除いて、実施例１
と同じ操作を行ってＣＥＡ量を測定した。

【００６２】比較例３（同一平均粒径のラテックス凝集
免疫試薬を用いたＣＥＡ量の測定） 実施例２で得られたＣＥＡ測定用試薬［３］（ラテック
ス凝集免疫試薬（固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ））をその
まま試薬（Ｒ２液）として用いた点を除いて、実施例２
と同じ操作を行った。

【００６３】比較例４（同一平均粒径のラテックス凝集
免疫試薬を用いたＣＥＡ量の測定） 実施例２で得られたＣＥＡ測定用試薬［４］（ラテック
ス凝集免疫試薬（固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ））をその
まま試薬（Ｒ２液）として用いた点を除いて、実施例２
と同じ操作を行った。

【００６４】試験結果 実施例２および比較例３、４で測定した吸光度変化量お
よび作成した検量線を表２および図２に示す。

【００６５】

【表２】

【００６６】表２および図２から明らかなように、本発
明の方法による実施例２の測定値から作成された検量線
は、実施例１と同様にＣＥＡ低濃度域から高濃度域ま
で、良好な直線性を示した。これに対し、同一平均粒径
のラテックス凝集免疫試薬による比較例３、４の検量線
は、ＣＥＡ低濃度域および高濃度域において、本発明に
よる方法よりも反応性が低いため、良好な直線性を示さ
なかった。

【００６７】実施例３ 実施例１で得られたＣＥＡ測定用試薬［１］と、実施例
２で得られたＣＥＡ測定用試薬［４］とを等量混合し、
得られた混合液を試薬（Ｒ２液）とした点を除いて、実
施例１と同じ操作を行ってＣＥＡ量を測定した。

【００６８】実施例４ 実施例１で得られたＣＥＡ測定用試薬［２］と、実施例
２で得られたＣＥＡ測定用試薬［３］とを等量混合し、
得られた混合液を試薬（Ｒ２液）とした点を除いて、実
施例１と同じ操作を行ってＣＥＡ量を測定した。

【００６９】試験結果 実施例３、４で測定した吸光度変化量および作成した検
量線を表３および図３に示す。

【００７０】

【表３】

【００７１】表３および図３から明らかなように、本発
明の方法による実施例３、４の測定値から作成された検
量線は、実施例１と同様にＣＥＡ低濃度域から高濃度域
まで良好な直線性を示した。

【００７２】実施例５ (1) ＣＥＡ測定用試薬の調製 不溶性担体液として、平均粒径０．２１０μｍのポリス
チレンラテックスを用い、感作用の抗体液として、抵Ｃ
ＥＡ抗体Clone No. ＣＥＡ４−Ｇ６７をタンパク濃度が
２７．６μｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希
釈したものを用い、その他の点では実施例１のＣＥＡ測
定用試薬［１］の場合と同様の操作を行って固形分０．
１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬［５］を得、４℃
にて保存した。

【００７３】(2) ＣＥＡ量の測定 上記(1) で得られた固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥ
Ａ測定用試薬［５］と、実施例１で得られたＣＥＡ測定
用試薬［２］とを等量混合し、得られた混合液を試薬
（Ｒ２液）とした点を除いて、実施例１と同じ操作を行
ってＣＥＡ量を測定した。

【００７４】比較例５（同一平均粒径のラテックス凝集
免疫試薬を用いたＣＥＡ量の測定） (1) ＣＥＡ測定用試薬の調製 不溶性担体液として、平均粒径０．４６４μｍのポリス
チレンラテックスを用い、感作用の抗体液として、抵Ｃ
ＥＡ抗体Clone No. ＣＥＡ４−Ｇ６７をタンパク濃度が
１２．５μｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希
釈したものを用い、その他の点ではＣＥＡ測定用試薬
［１］の場合と同様の操作を行って固形分０．１７％
（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬［６］を得、４℃にて保
存した。

【００７５】(2) ＣＥＡ量の測定 上記(1) で得られた固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥ
Ａ測定用試薬［６］と、実施例１で得られたＣＥＡ測定
用試薬［２］とを等量混合し、得られた混合液を試薬
（Ｒ２液）とした点を除いて、実施例１と同じ操作を行
ってＣＥＡ量を測定した。

【００７６】試験結果 実施例５および比較例５で測定した吸光度変化量および
作成した検量線を表４および図３に示す。

【００７７】

【表４】

【００７８】表４および図３から明らかなように、本発
明の方法による実施例５の測定値から作成された検量線
は、実施例１と同様にＣＥＡ低濃度域から高濃度域ま
で、良好な直線性を示した。これに対し、同一平均粒径
のラテックス凝集免疫試薬による比較例５の検量線は、
ＣＥＡ低濃度域および高濃度域において、本発明による
方法よりも反応性が低いため、良好な直線性を示さなか
った。

【００７９】

【発明の効果】本発明による免疫測定法は以上の如く構
成されているので、従来のラテックス凝集免疫試薬で見
られたような不溶性担体の立体的障害による凝集阻害が
なく、かつ非特異凝集を惹起することがなく、抗原抗体
反応系中に反応に関与する抗原または抗体をできるだけ
多く存在させることができる。その結果、抗原性物質を
正確に定量することができ、低濃度域でも高い検出感度
を示すことができる。特に、２種以上のモノクローナル
抗体の認識する抗原のエピトープが構造的に互いに近接
していたり、または抗原物質の分子量が小さく、同一平
均粒径の不溶性担体では凝集反応が生じ難い場合に、よ
り一層その効果が発揮される。したがって、本発明によ
る測定法は、被検試料中の抗原性物質を正確に定量する
ことを可能にし、疾患の発見、病態の把握、治療方法の
決定などに有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１に使用された既知濃度のＣＥＡ標準品
中のＣＥＡ量と、本発明のＣＥＡ測定方法による吸光度
変化量の相関、および比較例１、２に使用された既知濃
度のＣＥＡ標準品中のＣＥＡ量と、従来法によるラテッ
クス凝集免疫試薬による吸光度変化量の相関を示すグラ
フである。

【図２】実施例２に使用された既知濃度のＣＥＡ標準品
中のＣＥＡ量と、本発明のＣＥＡ測定方法による吸光度
変化量の相関、および比較例３、４に使用された既知濃
度のＣＥＡ標準品中のＣＥＡ量と、従来法によるラテッ
クス凝集免疫試薬による吸光度変化量の相関を示すグラ
フである。

【図３】実施例３、４および５に使用された既知濃度の
ＣＥＡ標準品中のＣＥＡ量と、本発明のＣＥＡ測定方法
による吸光度変化量の相関、および比較例５に使用され
た既知濃度のＣＥＡ標準品中のＣＥＡ量と、従来法によ
るラテックス凝集免疫試薬による吸光度変化量の相関を
示すグラフである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 特定の抗原に対する異なる２種以上のモ
   ノクローナル抗体を不溶性担体に担持させ、水溶媒中で
   抗原と反応させ、不溶性担体と抗原の結合物を選択的に
   凝集させるに当たり、不溶性担体として平均粒径の異な
   る２種以上の担体を用い、これら不溶性担体に各モノク
   ローナル抗体をそれぞれ担持させることを特徴とする高
   感度免疫測定法。
2. 【請求項２】 不溶性担体がラテックス粒子であること
   を特徴とする請求項１記載の測定法。
3. 【請求項３】 平均粒径が０．０５〜０．５００μｍの
   範囲にある２種以上の不溶性担体を、最小粒子種の平均
   粒径に対する他の粒子種の平均粒径の比が３〜６の範囲
   になるように組み合わせて使用することを特徴とする請
   求項１又は２記載の測定法。