JPH0763761A

JPH0763761A - 生理活性物質固定化磁性微粒子の製造法

Info

Publication number: JPH0763761A
Application number: JP21562693A
Authority: JP
Inventors: Hiromasa Nagao; 洋昌長尾
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1993-08-31
Filing date: 1993-08-31
Publication date: 1995-03-10

Abstract

(57)【要約】【目的】バイオリアクター、免疫学的検査用担体等とし
て有効な微粒子の製造法に関するものであり、特に免疫
活性物質を固定化してなる免疫活性固定化磁性微粒子有
効な生理活性物質固定化磁性微粒子の製造法の提供。【構成】平均粒径 0.3〜1.0 μm よりなる磁性を有する
磁性微粒子を、平均粒径1.0〜10μm の樹脂粒子に対し
て、高速気流中衝撃法を用いて固定化することを特徴と
する生理活性物質固定化磁性微粒子の製造方法等。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、バイオリアクター、免
疫学的検査用担体等として有効な微粒子の製造法に関す
るものであり、特に免疫活性物質を固定化してなる免疫
活性固定化磁性微粒子等の生理活性物質固定化磁性微粒
子の製造法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、酵素、菌体、細胞などの蛋白質か
ら構成された生理活性物質を担体に固定化したものが食
品や医薬品工業における化学反応触媒、生理活性物質の
分離、精製用の吸着体又は生化学及び医学、診断医学の
分野に於いて種々使用されている。

【０００３】特に診断医学に於ける生理活性物質固定化
担体の用途等について、以下免疫活性物質を固定化した
担体について説明する。従来より、生体成分の分析法に
は多数の方法が知られているが、混在する成分よりある
特定の微量成分を分析しようとする場合、特異性の高い
高感度な方法が求められる。このような観点から、生物
学的親和性（抗原―抗体等）を利用した多くの分析法が
実用に供されている。特に、１９５９年にBersonとYalo
w によって報告された放射免疫測定法（ＲＩＡ）は、化
学的測定法やバイオアッセイ法及びそれまで用いられて
いた免疫学的方法に比べて検出感度や特異性に優れた測
定法である（R.S. Yalow et al., Nature, 184,1648 19
59年）。しかし、この方法は標識物質に放射性物質（Ｒ
Ｉ）を使用するため、特殊な施設や測定装置を要すると
いう課題があり、１９７１年にEngvall ら及びWeemenら
により報告された酵素免疫測定法（ＥＩＡ）によって改
善された。

【０００４】ＥＩＡでは、酵素で抗原又は抗体を標識
し、その酵素活性値から検体中の抗原又は抗体濃度を定
量する方法で、それまで組織化学で用いられた酵素抗体
法をＲＩＡの原理に基づき液相系の反応に利用したもの
である（Immunochem.,8,871 1971年;FEBS Lett.,15,232
1971 年）。ＥＩＡは、検出型式及び反応相等により多
数の方法に分類できる。例えば、酵素標識抗原（または
抗体）と抗体（または抗原）との反応に於いては、非標
識抗原（または抗体）を競合させるか否かにより競合法
と非競合法とがある。また、抗原・抗体反応物の測定方
式により、分離法（不均一（ヘテロジニアス）法）と非
分離法（均一（ホモジニアス）法）があるが、前者は抗
原・抗体反応物と未反応物とを分離し標識酵素の測定を
行うものである。

【０００５】また、分離法では抗原・抗体反応を液相で
行う方法（液相法）と液相―固相間で行う方法（固相
法）とがあるが、液相法は遠心分離を必要とするため、
固相法に比べて操作が繁雑である。例えば、固相法では
固相（担体）をあらかじめ抗体でコーティングしてお
き、それに検体中の抗原を反応させた後、酵素標識抗体
を用いて検出する。通常、担体にはビーズ、マイクロプ
レート及びチューブ類などが使用されるが、最近では反
応時間を短縮する目的で微粒子担体（磁性粒子等）が用
いられている。

【０００６】微粒子担体では、一般に有機微粒子が磁性
体を含み比較的沈降しにくい粒径の粒子に抗原或いは抗
体を固定化しておくことで、それぞれ抗体又はは抗原を
効率良く補足でき、後に磁石によって回収することで、
抗体又は抗原の濃度分析が出来る。とくに形状が球状で
ある場合は粒子の分散性がよく、磁石による捕集速度が
速いという利点もある。

【０００７】これらの好適条件を満たす磁性微粒子の製
法として、従来、様々な樹脂粒子にフェライトメッキを
してフェライト被覆樹脂粒子を調製する方法が知られて
いるが、多くの場合、先ず重合体材料から成るマトリッ
クスを調製し、このマトリックス内にコロイド状に、且
つ安定に磁性体を分散させることで調製されている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】有機球形微粒子は、従
来エマルジョン重合法またはサスペンジョン重合法で調
製されている。これらの方法では、モノマーとラジカル
反応開始剤を水中に仕込み、乳化剤の存在下または非存
在下でモノマーを粒子状に重合する。エマルジョン重合
法は一般に０．５μｍ以下の球形微粒子の製造にその利
点があり、０．５μｍ以上の粒子では製造所用時間が急
激に増加してしまうという課題がある。またサスペンジ
ョン重合の場合、エマルジョン重合に比べて遥かに大き
な粒子を得るのに有利であるが、一般に粒子形状が必ず
しも球形とはならず、粒径分布も極めて広くなってしま
うという課題がある。

【０００９】また、エマルジョン重合法及びサスペンジ
ョン重合法には、粒子に無機質（磁性体）、特に比重の
重い無機粒子を多く配合出来ないという課題がある。

【００１０】

【解決するための手段】前述の課題に鑑みて、本発明者
は、高速気流中衝撃法を用いることで比重の重い磁性体
を多く配合した生理活性物質固定化磁性微粒子を調製し
得ることを見いだし、本発明を完成するに至った。即ち
本発明は、平均粒径 0.3〜1.0 μm よりなる磁性を有す
る磁性微粒子を、平均粒径 1.0〜10μm の樹脂粒子に対
して、高速気流中衝撃法を用いて固定化することを特徴
とする生理活性物質固定化磁性微粒子の製造方法であ
る。また本発明は、このようにして製造された微粒子の
固定化された磁性微粒子の表面をシランカップリング剤
で処理し、該処理によって生成した官能基に、直接又は
他の官能基を結合させた後、生理活性物質を結合させる
ことを特徴とする生理活性物質固定化磁性微粒子の製造
法である。以下、本発明中、特に免疫活性物質固定化担
体について詳細に説明するが、本発明の微粒子はこれら
の用途に限定されるものでないことは明らかである。

【００１１】粉体工学の分野に於いて、１９７５年Hers
eyは平均粒子径の異なる２種粉体を混合すると大粒子表
面上に小粒子が付着し、均質混合系が形成されることを
明らかにした。その後、Konishi らは更に強固な粒子の
複合化技術、高速気流中衝撃法を開発した（粉体工学会
誌、24,593 1987 年）が、本発明における高速気流中衝
撃法としてはこの方法を採用することができる。この方
法による粒子の複合化過程については、高速で回転する
ローターにより発生される秒速100m程度の気流中に、例
えばフェライトと樹脂粒子の粉体粒子を分散させ、粒子
同士及び粒子とローター上に取り付けられた衝撃用羽根
とを繰り返し衝突させることが例示できる。これによ
り、小粒子（又は子粒子、フェライト等）は大粒子（母
粒子、樹脂粒子）上に付着、埋設され、固定化される
が、この時大粒子と小粒子の粒径比を１０：１以上とし
ておくことで、大粒子上に小粒子の均一な単層コーティ
ングを形成することができ、好ましい。

【００１２】以上の操作により、固体担体としての磁性
微粒子が得られるが、この微粒子に対しては物理吸着法
により免疫活性物質等を固定化することができる。免疫
活性物質等を共有結合で固定化する場合には、引き続き
後に述べるようにして微粒子表面を改質し、官能基を導
入する等すれば良い。

【００１３】本発明で使用する大粒子としては、ポリエ
チレン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポ
リグリシジルメタアクリレート、ナイロンなど平均粒径
１〜１０μm の範囲の任意の粒径を持つ樹脂粒子であれ
ばよく、好ましくは粒径分布の狭い単分散樹脂粒子を使
用する。更に大粒子の材質としては、特にナイロンが好
ましい。本発明で使用する子粒子としては、基本的に、
磁性を有する０．３〜１．０μm の範囲の任意の粒径を
持つ磁性微粒子であれば良い。特に、外部磁場により磁
化され難い、例えばソフトフェライトようなものが好ま
しい。

【００１４】固体担体表面の改質法の一つとして、シラ
ンカップラー法が例示できる。シランカップリング剤
は、一般に(RO)₃Si-Xであらわされるが、RO基は湿気な
どで加水分解してシラノール基を生成し、無機物質など
と何等かの形で強い相互作用を成す。一方、Ｘ基はビニ
ル、メタクリル、エポキシ、アミノ、メルカプト基など
が代表例である。このシランカップリング剤を用いて前
記の如くして製造された微粒子の表面に固定化された磁
性微粒子（例えばフェライト等）の表面を処理すると、
シラン系カップリング剤のシラノール基との間に化学結
合が形成され、新たにＸ基をその表面に導入できる。こ
の処理より、担体として製造した前記微粒子に、新たな
界面化学的特性を付与できる。より具体的に、３−（２
−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン、
３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、３−メ
タクリルオキシプロピルトリメトキシシラン、フェニル
トリメトキシシラン等の試薬を例示することができる。

【００１５】免疫活性物質等を共有結合で固定化する場
合、前記したようにして導入したＸ基を、更に反応性に
富んだ官能基へ変える必要がある。このため、Ｘの官能
基の種類によっても異なるが、アミノ基の場合にはａ〜
ｄに示す様な二価性試薬を反応させ、マレイミド化す
る。または無水マレイン酸を作用させることで、マレイ
ル基を導入する事も出来る。ａからｄの市販されている
試薬は、一方に活性エステル基と他方にマレイミド基を
有し、その間を異なるスペイサーが結んでいるものであ
り、アミノ基と反応させた場合は、活性エステル基が反
応し、新たにペプチド結合を形成し繋がり、マレイミド
基の導入を完結できる。ａ）Succinimidyl-4-(N-maleimidimethyl)cyclohexane-
1-carboxylate ｂ）N-( ε-maleimidocaproyloxy)succinimide ｃ）Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butylate ｄ）m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester なお、物理吸着により生理活性物質固定化する方法は、
微粒子と抗体（抗原）等の間に働く疎水性相互作用によ
り固定化する方法である。殆どのプラスチックはタンパ
ク質溶液に浸漬するだけでタンパク質を吸着することが
できる。物理吸着法を採用した場合には、より良い結果
を得るために固定化する表面を清浄にしておくことが好
ましい。しかし、微粒子との疎水性相互作用の小さい生
理活性物質等で固定化できなっかたり、また固定化後に
遊離してしまう可能性のある生理活性物質に対しては、
共有結合による固定化を採用することが好ましい。

【００１６】共有結合法は、微粒子にアミノ基やカルボ
キシル基のような官能基を導入した後、グルタルアルデ
ヒドなどの架橋剤や水溶性カルボジイミドのような活性
化剤により抗体等を共有結合させる。またアミノ基に前
記ａ〜ｄのような試薬を反応させてマレイミド化し、抗
体、モノクローナル抗体又はこれらのＦ（ａｂ’）フラ
グメント等を共有結合させることもできる。なおＦ（ａ
ｂ’）は、インタクトなモノクローナル抗体ＩｇＧ分子
をペプシン（酵素）によって限定加水分解し、その後Ｆ
（ａｂ’）2 フラグメントを還元剤にて処理した、ヒン
ジ部にチオール基を持った抗体断片である。

【００１７】

【発明の効果】本発明に於ける免疫活性物質固定化磁性
微粒子は、その微粒子自身を、簡便かつ短時間で調製で
きる。また得られた微粒子は、フェライト粒子等と比較
して、樹脂にコーティングされているため比重が小さ
い。その結果、粒子の浮遊時間が長くなり、反応が促進
される可能性が高くなる。また、ヘテロジニアス反応系
に於ける磁気によるＢ／Ｆ分離操作により、容易に分離
し得る。

【００１８】以上、本発明によれば、重合等により磁性
物質を取り込ませること無しに、生理活性物質固定化用
磁性微粒子が容易に調製でき、例えば抗体の固定化に関
しても物理吸着及び共有結合ともに良好な結果を得、磁
気による捕集も短時間で行える。

【００１９】

【実施例】以下、本発明を更に詳細に説明するために実
施例を記載するが、これらの実施例は一例であって本発
明を限定するものではない。

【００２０】実施例１表１に示した大粒子と小粒子を用いて、以下のようにし
て微粒子を製造した（大粒子の表面上に子粒子がひとな
らび最密に充填した際の量を１層として、子粒子の平均
径を用いて計算量が１. ５〜４層となるようにした）。

【００２１】原材料の混合は、適当な大粒子／子粒子の
比に於いて手法で行い、２０〜３０ｇのミクスチャーを
調製した。その後、ミクスチャ−を、ハイブリダイザー
ＮＨＳー０型（奈良機械製作所（株）製）を用いて回転
数８０００〜１６２００ｒｐｍ、処理時間２〜１０分で
複合処理し、磁性微粒子を作成した。作成した磁性微粒
子の表面を走査型電子顕微鏡により観察した結果、磁性
層は均一性を有していた。

【００２２】

【表１】

【００２３】実施例２実施例１中、大粒子にナイロン又は単分散ポリメタアク
リレ−トを、小粒子にMn-Zn フェライトを使用して製造
した磁性微粒子の１ｇを、アミノプロピルトリエトキシ
シラン（信越化学（株）製）１０％のメタノール溶液中
で撹拌下、１６時間還流した。反応終了後、磁性微粒子
をエタノール、水で良く洗浄し減圧乾燥した。本処理に
よって導入されたアミノ基をN-Succinimidyl-3-(2-pyri
dyldithio)propionateと反応させた後、過剰の試薬を除
去、洗浄し、次いでチオール基を有する化合物（２ーメ
ルカプトエタノール）よって２ーチオピリドンを遊離さ
せた。ここで、３４３ｎｍの吸光度を測定し、アミノ基
の定量を行ったところ、４〜８( μmole/g) のアミノ基
が導入されていた。

【００２４】実施例３実施例２で作成したアミノ基を導入した微粒子１ｇを、
酢酸ｎーブチル３０ｍｌに懸濁し、そこへ酢酸ｎーブチ
ルに溶解したSuccinimidyl-4-(N-maleimidimethyl)cycl
ohexane-1-carboxylate （５ｍｇ／３ｍｌ）を加え、撹
拌下、３時間還流してマレイミド基を導入した。導入さ
れたマレイミド基に、EDTA存在下に2-mercaptoethylami
neを作用させ、次に4,4'-Dithiopyridine を反応させ、
上清の３２４ｎｍの吸光度を測定した。その結果２〜５
( μmole/g) のマレイミド基が導入されていた。

【００２５】実施例４実施例３のようにして製造した微粒子に、Ｆ（ａｂ´）
化したモノクローナル抗体を反応させ、抗体側のＳＨ基
と担体側のマレイミド基を共有結合させて固定化した。
固定化する前の溶液中の抗体量及び固定化後の溶液の残
存抗体量を高速液体ゲルロ過クロマトグラフ法にて算出
し、両者の差を固定化量として見積もった（表２）。

【００２６】高速液体クロマトグラフの条件は、カラム
G3000sw-XL（東ソー社製）、溶離液0.2M NaCl, 2mM EDT
A を含む20mMリン酸緩衝液(pH 6.8)で、流速 1.0 ml/mi
n 、検出280nm である。

【００２７】一方、実施例１で製造した磁性微粒子中、
大粒子にナイロン、ポリメタアクリレ−ト又は単分散ポ
リスチレンを、小粒子にMn-Zn フェライトを使用したも
のについて、実施例２と同様にしてアミノプロピルトリ
エトキシシランを反応させてアミノ基を付与し、その後
マレイミド化試薬や無水マレイン酸によりマレイル化し
てＦ（ａｂ´）化モノクロ−ナル抗体を固定化した抗体
固定化微粒子についてその比重及び磁気による捕集具合
を試験した（表３）。捕集具合は、試験管（10X75mm ）
中にリン酸緩衝液を分散媒として分散した粒子（1mg/m
l）を、1400ガウスの外部磁場により捕集した結果であ
る。

【００２８】

【表２】

【００２９】

【表３】

【００３０】実施例５実施例１で製造した微粒子中、Mn-Zn フェライトをコー
ティングしたナイロン微粒子の表面をメタノール洗浄に
より浄化し、Ｆ（ａｂ´）2 化した抗体溶液加え、室温
で３時間、回転撹拌(90rpm) インキュベーションした。
物理吸着した抗体量は、実施例４と同様にして抗体量を
算出した。結果は表２に合わせて示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】平均粒径 0.3〜1.0 μm よりなる磁性を有
する磁性微粒子を、平均粒径 1.0〜10μm の樹脂粒子に
対して、高速気流中衝撃法を用いて固定化することを特
徴とする生理活性物質固定化磁性微粒子の製造方法。
【請求項２】請求項１項記載のようにして製造された微
粒子に固定化された磁性微粒子の表面をシランカップリ
ング剤で処理し、該処理によって生成した官能基に、直
接または他の官能基を結合させた後、生理活性物質を結
合させることを特徴とする生理活性物質固定化磁性微粒
子の製造法。