JP3618909B2 - 免疫測定試薬及び免疫測定法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、抗原抗体反応による凝集反応によって抗原物質を測定する免疫測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、病院や検査センター等においては、人手不足、コスト削減、あるいは多量検体処理の要請等の点から、臨床検査などの諸検査の自動化及び測定時間の短縮化が図られている。このような自動化に適した方法として、不溶性担体粒子の凝集反応を利用して抗原性物質を定性ないし定量する方法が汎用されている（例えば、特公昭５８−１１５７５号公報等）。
上記の凝集法とは、被検試料中の抗原性物質を測定する場合、抗原性物質に特異的に結合する抗体もしくはそのフラグメントを担持させた不溶性担体と試料とを反応させ、不溶性担体の凝集の度合いを測定することにより、前記抗原性物質を検出または定量するものである。
【０００３】
上記抗体としては通常ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体が選択される。しかしながら、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を比較すると、抗原に対する特異性はモノクローナル抗体の方がだんぜん優れている。またポリクローナル抗体は動物の固体差や採血の時期により同じ品質のものを常に得ることは難しく、特異抗体に精製する段階での抗体自信の損失や活性の低下が大きいのに対し、モノクローナル抗体はその点では品質の一定した抗体の大量生産に向いている。
一方モノクローナル抗体は、抗原分子上の特定のエピトープのみと反応するため、抗原性物質が多価抗原である場合でも、特定のエピトープに関しては多価であるとは限らない。従って、抗原は、特定のモノクローナル抗体に対するエピトープに関しては一価となる可能性が高くなる。測定の目的とする抗原物質が一価抗原である場合、不溶性担体に担持された１種のモノクローナル抗体と試料中の抗原性物質が反応もしくは結合しても、通常凝集はおこらない。このため、実質的にはポリクローナル抗体が多用されている。
【０００４】
このような問題点に対し、特公平３−４０３４１号公報には、特定の抗原に対して、異なる２種又は３種のモノクローナル抗体を不溶性担体に担持させ、抗原と反応させて不溶性担体の凝集の程度を測定することにより、抗原性物質を検出または定量する方法が開示されている。
しかしながら、上記のような従来のモノクローナル抗体を不溶性担体に担持させる方法では、不溶性担体の立体障害により、抗体と抗原性物質との間の抗原抗体反応とそれに続く凝集が阻害される可能性がある。すなわち抗原性物質が１種類のモノクローナル抗体と、少なくとももう１種類のモノクローナル抗体とに同時に結合することによって、不溶性担体の凝集が生じるわけであるが、全てのモノクローナル抗体が不溶性担体に担持されていると、２種のモノクローナル抗体の認識する抗原のエピトープが構造的に接近した部位にある場合、不溶性担体間の立体構造により、異なる２種または３種のモノクローナル抗体が１つの抗原性物質に対し、同時に結合することが阻害される場合がある。また、この方法では、不溶性担体に担持させうる抗体量に限界があり、不溶性担体への担持が困難なモノクローナル抗体もある。さらにモノクローナル抗体の性状によっては、不溶性担体に担持させた場合、自己凝集が生じて試薬としての性能を発揮できない場合がある。従って、上記の方法では抗原性物質を正確に定量できない可能性がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点を解決するものであり、その目的とするところは、不溶性担体の立体障害による凝集阻害がなく、多量の抗体を用いることができ、その結果、正確な測定値を得ることのできる免疫測定試薬及び免疫測定法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の免疫測定試薬は、特定の抗原物質に対する異なる２種以上のモノクローナル抗体と水不溶性担体とからなり、上記特定の抗原物質に対するモノクローナル抗体の一部が水不溶性担体に担持される。
上記特定のモノクローナル抗体の水不溶性担体に担持されない抗体は、抗原抗体反応に伴う凝集反応において、水不溶性担体と立体障害をおこさない状態とされていればよく、例えば、水可溶性担体に担持されるか又は２以上の多量体とされるのが好ましい。
【０００７】
この時、水不溶性担体に担持されるモノクローナル抗体と、水可溶性担体に担持されるあるいは多量体とされるモノクローナル抗体は、特定の抗原物質に対する異なるモノクローナル抗体である。少なくとも１種の異なるモノクローナル抗体が担持あるいは多量体とされていれば、例えば、水不溶性担体に２種、水可溶性担体に別の１種が担持されていてもよい。
また、特定の抗原物質に対する異なる２種以上のモノクローナル抗体の混合物の、一部が水不溶性担体に担持され、一部が水可溶性担体に担持されるかあるいは２以上の多量体とされていてもよく、１種のモノクローナル抗体が水不溶性担体に担持され、異なる２種以上のモノクローナル抗体の混合物が水可溶性担体に担持されるかあるいは２以上の多量体とされていてもよい。
【０００８】
上記モノクローナル抗体の水不溶性担体に担持される量は、少なくなると凝集はしても凝集の程度を測定するのが困難となり、多くなると立体障害による凝集反応阻害が起こりやすくなるので、モノクローナル抗体全体の３０〜８０％が好ましい。
【０００９】
上記モノクローナル抗体としては、細胞融合技術分野において、公知の手法を適宜選択し、またはそれらを組み合わせることによりモノクローナル抗体産生融合細胞株を形成し、この細胞株を利用して産生、取得したものを用いることができる（「単クローン抗体・ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ」，岩崎辰夫ら著；講談社）。
【００１０】
その一態様としては、ある特定の完全抗原を用いて、これを適当な動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の動物に、例えば、アジュバントとともに皮下注射するなどの手法により投与し、動物を免疫した後、この免疫動物、例えば免疫マウスの上記抗原に対する抗体産生細胞、例えば脾細胞、胸腺細胞、リンパ節細胞及び／又は末梢血細胞等の細胞を採取し、これらの細胞と自己増殖能を有するが実質的に抗体産生能を有しない適当な株化細胞（ミエローマ細胞）、例えばマウス骨髄腫株化細胞とを、公知の手法により細胞融合処理する。
モノクローナル抗体を得るための抗体産生細胞とミエローマ細胞との組み合わせは、各細胞が融合して増殖しつつ抗体を産生することが可能であれば、それぞれの細胞の由来する動物の種類は限定されず、任意に組み合わせることができる。
【００１１】
上記ミエローマ細胞としては、特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト等の種々の動物の細胞体を用いることができる。好ましくは、株化細胞は薬剤抵抗性のものであり、かつ未融合のミエローマ細胞が選択培地で生存せず、融合細胞のみが生存するようなものである。
一般には、８−アザグアニジン抵抗性の株化細胞が用いられ、これはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン・アミンプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地に生育できない性質を有する。
さらに、株化細胞としては非分泌型のものが好ましく、例えば、マウスミエローマＭＯＰＣ−２１株由来のＰ３ ／Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３ Ｕ１）、Ｐ３ ／Ｘ６３−Ａｇ８・６・５・３、Ｐ３ ／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４、ラットミエローマ２１０・ＲＣＹ３・Ａｇ１・２・３等が挙げられる。
【００１２】
上記細胞融合処理は、例えば、イーグル最小基本（ＭＥＭ）培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地等の培地中で、上記免疫マウスの脾細胞１〜５×１０８ 個と、上記マウス骨髄腫株化細胞１〜５×１０７ 個とを混合して行うことができる。融合促進剤としては、平均分子量１０００〜６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、ウイルス等が挙げられ、特にＰＥＧが好ましく、ＰＥＧは約３０〜５０重量％で用いられる。
上記のようにして得られる融合細胞含有系から、融合細胞を、公知の手法により、選別処理、抗体活性スクリーニング処理及びクローニング処理して、免疫マウスの形成に用いた完全抗原に対するモノクローナル抗体産生能を有し、かつ自己増殖能をもつ融合細胞株を得ることができる。
【００１３】
上記融合細胞の選別処理は、例えば、２０重量％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地等で細胞融合を終えた細胞を適当に希釈し、９６穴マイクロプレートに１０５ 〜１０６ 個／ウェル程度に分注し、各ウェルに選択培地（ＨＡＴ培地等）を加え、以後選択培地の交換を行いながら、５％ＣＯ２ 培養器（３７℃）で培養を続けることにより行うことができる。ミエローマ細胞として８−アザグアニン抵抗性株を用いれば、未融合のミエローマ細胞はＨＡＴ培地で死滅し、また抗体産生細胞は正常細胞なので、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養では長期間生育できない。従って、培養後１０〜１４日ぐらいから生育してくる細胞を融合細胞として選別できる。
【００１４】
上記のようにして得られる融合細胞株の抗体活性スクリーニング処理及びクローニング処理は、公知の方法により行うことができる。
例えば、融合細胞の生育したウェルの培養上清の一部を採取し、一定量の標識抗原とインキュベーションし、標識抗原との結合能を測定することにより目的とする抗体を分泌しているウェルを検索する方法が挙げられる。すなわち １２５Ｉ、 １３１Ｉ等のラジオアイソトープ又は酵素等で標識した抗原と培養上清を反応させた後、各反応液について抗原−抗体結合物を分離し、標識量を測定することにより、目的とする抗体の存在及び結合能を検索することができる。
目的とする抗体活性の認められる各ウェル中には、２種以上の融合細胞が生育している可能性があるので、限界希釈法や軟寒天によるコロニー形成法によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生融合細胞株を得ることができる。
【００１５】
上記のようにして得られるモノクローナル抗体産生融合細胞株を用いて、前記免疫動物の形成に用いた完全抗原に対するモノクローナル抗体を取得する方法としては、例えば、上記モノクローナル抗体産生融合細胞株を適当な培地に培養し、培地からモノクローナル抗体を採取する方法、ミエローマ細胞由来動物と同系の動物に上記細胞株を移植し、腹水中のモノクローナル抗体を採取する方法等の公知の手法が挙げられる。
上記前者の態様としては、例えば、モノクローナル抗体産生融合細胞株を１０重量％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地等の培養液で培養し、その培養上清を硫安分画、抗原を結合させたセファロース４Ｂ等のアフィニティークロマトグラフィーなどによって精製することにより目的とするモノクローナル抗体を得ることができる。
【００１６】
また、上記後者の態様としては、例えば、同系動物にプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）等の鉱物油を腹腔内投与することによりｉｎ ｖｉｖｏで融合細胞を大量に増殖させ、高濃度のモノクローナル抗体が含まれた腹水を得る。この腹水から硫安分画及び必要に応じて前記アフィニティークロマトグラフィー等により、目的とするモノクローナル抗体を得ることができる。
本発明のモノクローナル抗体として、上述のようにして取得できるもの以外に市販のものを用いることも可能である。
【００１７】
前記水不溶性担体としては、従来より免疫化学的凝集反応及び凝集阻止反応において、一般的に用いられている微粒子の担体を用いることができるが、工業的に大量生産が可能な有機系微粒子が好ましい。
上記有機系微粒子としては、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体及び／又は共重合体；スチレン−ブタジエン共重合体、メタクリル酸メチル−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体；並びに官能基としてカルボキシル基、第１級アミノ基、カルボアミノ基（−ＣＯＮＨ２）、水酸基、アルデヒド基等を有し、かつ基体が前記有機系微粒子からなる反応性有機系微粒子などが挙げられ、抗体の吸着性に優れ、生物学的活性を長期間安定に保持できる等の理由から、特にスチレンを主成分とするポリスチレン系のラテックス粒子が好ましい。
【００１８】
その他、動物の赤血球、細菌の細胞等の生物学的粒子；ベントナイト、コロジオン、コレステロール結晶、シリカ、カオリン、炭素末等の非生物学的粒子なども用いることができる。
上記水不溶性担体の平均粒径は、測定方法、測定機器によって異なるが、０．０５〜１．０μｍのものが通常用いられる。
【００１９】
上記水不溶性担体にモノクローナル抗体を担持させる方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、水不溶性担体に物理的に吸着させる方法、官能基を有する水不溶性担体表面に、公知の化学結合法や共有結合法により担持させる方法等が挙げられる。
【００２０】
前記水可溶性担体としては、モノクローナル抗体を２以上担持でき、かつ水可溶性であれば特に限定されない。例えば、二塩酸スベリミジン酸ジメチル、アルキルジイミデート等のビスイミドエステル類；アシルアジド類；イソシアネート類；グルタルアルデヒド等のジアルデヒド類；メルカプトアルキルイミデート類；イミノチオ等のチオール化試薬；ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）；ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）；ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド）；ＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−マレイミドヘキサノイルオキシ）スクシンイミド）；ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）；ニトレン類；アリールハライド類；スルホニルハライド類；ブロモシアン；過ヨウ素酸塩等の低分子化合物などのタンパク質の架橋剤が挙げられ、なかでも二塩酸スベリミジン酸ジメチルが好ましい。
その他、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース等のセルロース誘導体；ポリビニルアルコール等の水溶性高分子化合物などが挙げられる。
【００２１】
上記水可溶性担体にモノクローナル抗体を担持させる方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、公知の化学結合法や共有結合法により担持させる方法、水可溶性担体に物理的に吸着させる方法、アビジン−ビオチン等の親和性をもつ物質を用いて担持させる方法等が挙げられる。
【００２２】
前記モノクローナル抗体を２以上の多量体にする方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、抗体濃度５〜３０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７〜１０の抗体希釈液を加熱し、熱変性により抗原認識部位に関与しないＦｃ部位で抗体どうしを結合させる方法等が挙げられる。
上記加熱処理は、温度が高かったり時間が長くなると抗体が変性するため、４０〜８０℃で６０分以内が好ましく、より好ましくは５０〜７５℃で３０分以内である。
【００２３】
本発明の免疫測定法は、上記本発明の免疫測定試薬と、上記特定の抗原物質とを反応させ、凝集の度合いにより上記特定の抗原物質を測定する方法である。
【００２４】
上記抗体が担持された水不溶性担体、及び抗体が担持された水可溶性担体又は少なくとも２以上の抗体の多量体と、特定の抗原物質との反応は、抗原抗体反応及びそれに伴う凝集反応である。反応条件は、上記反応が起こりうるものであれば特に限定されないが、反応温度は恒温で２５〜３７℃の範囲内で行うのが好ましい。反応時間は５秒〜１５分が好ましい。
上記反応を行う際の反応液としては、抗原抗体反応が起こりうる生理的条件を満たす水溶液であれば特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。反応液のｐＨは、５．５〜８．５が好ましく、さらに好ましくは６．５〜８．０である。
【００２５】
上記反応液には、更に必要に応じて、牛血清アルブミン、ショ糖等の安定化剤、感度を高める効果が期待されるポリエチレングリコール、デキストラン等の水溶性多糖類、アジ化ナトリウム等の防腐剤、塩化ナトリウム等の塩濃度調整剤などを添加してもよい。
【００２６】
本発明の方法において、測定対象となる試料としては、抗原、抗体等の免疫学的に活性な抗原物質を含有する試料、特に生体試料である。生体試料としては、例えば、血液、胸水、腹水、リンパ液等の体液、尿、便、汗等の***物、及び組織の抽出物などが挙げられる。
【００２７】
上記特定の抗原物質としては、抗原抗体反応しうる抗原、抗体等の免疫学的に活性なあらゆる物質、すなわち従来測定されていた物質のいずれもが包含され、例えばタンパク質、ポリペプチド、多糖類、脂質、ステロイド等が挙げられる。上記タンパク質としては、例えば、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、フィブリノーゲン分解産物（ＦＤＰ）、Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）等の血液中タンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）等の感染症に対する抗原及びその抗体、レセプター、酵素などが挙げられる。
【００２８】
前記凝集の度合いを測定する方法としては、特に限定されないが、例えば、凝集を定性的又は半定量的に測定する場合には、既知の試料の濁度の程度との比較から、測定すべき試料の濁度の程度を目視により観察する方法を用いることができ、定量的に測定する場合には、簡便性及び精度の点から、上記濁度の程度を光学的に測定する方法が好ましい。
【００２９】
上記目視により観察する方法としては、、試料と抗体が担持された水不溶性担体及び抗体が担持された水可溶性担体（又は多量体）を含む溶液を判定板上で混合し、揺り動かした後、凝集の有無を判定する。判定には、単に肉眼で判定する以外に、ビデオカメラで撮影し画像処理を施すことによって判定することもできる。
【００３０】
上記光学的に測定する方法としては、公知の方法が用いられ、例えば、凝集塊の形成を濁度の増加としてとらえる比濁法、凝集塊の形成を粒度分布又は平均粒径の変化としてとらえる方法、凝集塊の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し透過光強度との比を比較する積分球濁度法等が挙げられる。
上記の測定法において、異なる時点で少なくとも２つの測定値を得、これらの時点間における測定値の増加分（すなわち増加速度）に基づき凝集の程度を求める速度試験（レートアッセイ）、及びある時点（通常は反応の終点と考えられる時点）で１つの測定値を得、この測定値に基づき凝集の程度を求める終点試験（エンドポイントアッセイ）を利用でき、測定の簡便性、迅速性の点から比濁法による速度試験を行うことが好ましい。
【００３１】
【作用】
上述のように、本発明によれば、特定の抗原物質に対する２種以上のモノクローナル抗体の一部が水不溶性担体に担持され、例えば、残りの一部が水可溶性担体に担持されるか又は２以上の多量体とされていることにより、凝集反応の際に水不溶性担体の立体障害による凝集反応阻害が抑えられるので、特定の抗原物質との結合物を選択的に凝集させることができ、高感度に抗原物質量を測定することができる。
【００３２】
【実施例】
本発明を実施例につき説明する。実施例及び比較例に用いた試薬は以下のとおりである。
〔抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体〕
マウスの培養細胞上清からプロテインＡにより精製した、エピトープの異なる２種のマウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体、クローンＮｏ．ＡＦＰ４−Ｆ１１（ＩｇＧ−１、以下抗体Ｉとする）、及びクローンＮｏ．ＡＦＰ４−Ｆ６７（ＩｇＧ−１、以下抗体ＩＩとする）を用いた（共にＤＡＣＯ社製）。
〔抗体架橋反応用緩衝液〕
２００ｍＭ Ｎａ２ ＨＰＯ４ と２００ｍＭ ＮａＨ２ ＰＯ４ をｐＨ８となるように混合して用いた。
〔ラテックス希釈用緩衝液、抗体希釈用緩衝液〕
５０ｍＭ Ｎａ２ ＨＰＯ４ と５０ｍＭ ＮａＨ２ ＰＯ４ をｐＨ７．５となるように混合して用いた。
〔ブロッキング用緩衝液〕
１００ｍＭ Ｎａ２ ＨＰＯ４ と１００ｍＭ ＮａＨ２ ＰＯ４ をｐＨ７．４となるように混合し、さらにウシ血清アルブミン（フラクションＶ、Ｒｅａｇｅｎｔ Ｇｒａｄｅ 、Ｍｉｌｅｓ Ｃｏｒｐ．社製）を１％（Ｗ／Ｖ）になるように、またＮａＮ３ （試薬特級、ナカライテスク社製）を０．１％（Ｗ／Ｖ）になるように添加し溶解させたものを用いた。
〔検体希釈液〕
上記ブロッキング用緩衝液に、ポリエチレングリコール６０００（平均分子量７５００、和光純薬社製）を３％（Ｗ／Ｖ）となるように溶解して用いた。
【００３３】
（実施例１）
１）水可溶性担体試薬▲１▼の調製
抗体Ｉを、抗体架橋反応用緩衝液１５００ｍｌで透析した後、タンパク濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように抗体架橋反応用緩衝液で希釈し、抗体液とした。
また、二塩化スベリミジン酸ジメチル（東京化成社製）１１．４ｍｇを上記抗体架橋反応用緩衝液５ｍｌに溶解し、抗体架橋剤を調製した。
上記抗体液１ｍｌを２５℃のインキュベーター中でマグネチックスターラーで攪拌しながら、上記抗体架橋剤１μｌを２分おきに計５回添加し、その後さらに１０分間攪拌した。
次いで、酢酸アンモニウム（試薬特級、和光純薬社製）７．７ｍｇを上記抗体架橋反応用緩衝液５００μｌに溶解して調製した抗体架橋反応停止剤５μｌを添加し、この粗生成物を０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ ＨＲ１０／３０（ゲル濾過カラム、ファルマシア社製）に供し、同緩衝液で０．５ｍｌ／分で溶出させ、分子量２５００００〜５０００００の画分を分取した。最終タンパク濃度が４０μｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希釈し、水可溶性担体試薬▲１▼を調製した。
【００３４】
２）ＡＦＰ測定試薬▲１▼の調製
平均粒径０．３０４μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０％（ｗ／ｖ）、積水化学工業社製）１容に、上記ラテックス希釈用緩衝液９容を添加希釈し、ラテックス液とした。
抗体ＩＩは、タンパク濃度が６６．７μｇ／ｍｌとなるように上記抗体希釈用緩衝液で希釈し、感作抗体液とした。
上記ラテックス液６００μｌを２５℃のインキュベーター中で、マグネチックスターラーで攪拌しながら、上記感作抗体液１２００μｌを素早く添加し、さらに１時間攪拌した。次いでブロッキング用緩衝液３ｍｌを添加し、２５℃で続けて２時間攪拌した。その後１５℃、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し沈殿を得た。この沈殿にブロッキング用緩衝液４ｍｌを添加し、同様に遠心分離して沈殿を洗浄した。この洗浄操作をさらに２回行った後、ブロッキング用緩衝液１．８ｍｌを添加し、よく攪拌し、超音波破砕機で分散処理を行った。
この分散液に上記水可溶性担体試薬▲１▼１．８ｍｌを添加し、固形分０．１７％（ｗ／ｖ）のＡＦＰ測定試薬▲１▼を調製した。この試薬は４℃で保存した。
【００３５】
３）ＡＦＰ量の測定
ヒトプール血清から精製されたＡＦＰ標準品（ＷＨＯ標準品、９０８９０Ｉ．Ｕ．／ｍｌ、１１０μｇ／ｍｌ、ＤＡＣＯ社製）を用い、生理食塩水で２０００、５００、１００、２０、１０、５ｎｇ／ｍｌにそれぞれ希釈し、各濃度のＡＦＰ標準品を調製した。また、ＡＦＰ標準品を含まない生理食塩水のみのものを０ｎｇ／ｍｌとした。
測定は、各ＡＦＰ標準品２０μｌを分注後、直ちに上記検体希釈液２１０μｌを添加混合し、次いで上記ＡＦＰ測定試薬▲１▼３０μｌの添加混合を行った。
生化学用自動分析装置（日立７１５０型、日立製作所社製）を使用し、測定条件は温度３７℃、波長５７０ｎｍとした。
反応量は、ＡＦＰ測定試薬添加後８０秒後の吸光度と３２０秒後の吸光度を測定し、その差を１００００倍したものを吸光度変化量とし、各ＡＦＰ標準品の抗体濃度と吸光度変化量の検量線を作成した。結果を表２及び図１に示す。
【００３６】
（比較例１）
１）ＡＦＰ測定試薬▲２▼の調製
上記実施例１のＡＦＰ測定試薬▲１▼の調製において、分散液に水可溶性担体試薬▲１▼を添加するかわりに、ブロッキング用緩衝液１．８ｍｌを添加したこと以外は同様にして、ＡＦＰ測定試薬▲２▼を調製した。
２）ＡＦＰ測定試薬▲３▼の調製
上記ＡＦＰ測定試薬▲２▼の調製において、抗体として抗体Ｉを用いて感作抗体液としたこと以外は同様にして、ＡＦＰ測定試薬▲３▼を調製した。
３）ラテックス凝集免疫試薬の調製
上記ＡＦＰ測定試薬▲２▼とＡＦＰ測定試薬▲３▼を等量混合し、固形分０．１７％（ｗ／ｖ）のラテックス凝集免疫試薬を調製した。この試薬は４℃で保存した。
４）ＡＦＰ量の測定
上記実施例１のＡＦＰ量の測定において、ＡＦＰ測定試薬▲１▼のかわりに、上記ラテックス凝集免疫試薬を用いたこと以外は同様にして、ＡＦＰ量を測定し、検量線を作成した。結果を表２及び図１に示す。
【００３７】
（実施例２）
１）抗体多量体▲１▼の調製
抗体Ｉの１ｍｌを、抗体架橋反応用緩衝液１５００ｍｌで透析した後、タンパク濃度が５ｍｇ／ｍｌになるように抗体架橋反応用緩衝液で希釈した。この抗体液１ｍｌを５６℃のインキュベーター中で３０分間加熱した後、氷冷した。この後タンパク濃度が４０μｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希釈し、抗体多量体▲１▼を調製した。
【００３８】
２）ＡＦＰ測定試薬▲４▼の調製
上記実施例１のＡＦＰ測定試薬▲１▼の調製において、分散液に水可溶性担体試薬▲１▼を添加するかわりに、上記抗体多量体▲１▼１．８ｍｌを添加したこと以外は同様にして、ＡＦＰ測定試薬▲４▼を調製した。この試薬は４℃で保存した。
３）ＡＦＰ量の測定
上記実施例１のＡＦＰ量の測定において、ＡＦＰ測定試薬▲１▼のかわりに、上記ＡＦＰ測定試薬▲４▼を用いたこと以外は同様にして、ＡＦＰ量を測定し、検量線を作成した。結果を表２及び図２に示す。
【００３９】
（実施例３）
１）水可溶性担体試薬▲２▼の調製
抗体Ｉ及びＩＩを、同じ濃度で等量混合し、抗ＡＦＰ抗体混合液とした。
上記実施例１の水可溶性担体試薬▲１▼の調製において、抗体Ｉのかわりに、上記抗ＡＦＰ抗体混合液を用いたこと以外は同様にして、水可溶性担体試薬▲２▼を調製した。
２）ＡＦＰ測定試薬▲５▼の調製
上記実施例１のＡＦＰ測定試薬▲１▼の調製において、抗体ＩＩのかわりに上記抗ＡＦＰ抗体混合液を用い、分散液に水可溶性担体試薬▲１▼を添加するかわりに上記水可溶性担体試薬▲２▼１．８ｍｌを添加したこと以外は同様にして、ＡＦＰ測定試薬▲５▼を調製した。この試薬は４℃で保存した。
３）ＡＦＰ量の測定
上記実施例１のＡＦＰ量の測定において、ＡＦＰ測定試薬▲１▼のかわりに、上記ＡＦＰ測定試薬▲５▼を用いたこと以外は同様にして、ＡＦＰ量を測定し、検量線を作成した。結果を表２及び図３に示す。
【００４０】
（実施例４）
１）抗体多量体▲２▼の調製
上記実施例２の抗体多量体▲１▼の調製において、抗体Ｉのかわりに、上記実施例３で調製した抗ＡＦＰ抗体混合液を用いたこと以外は同様にして、抗体多量体▲２▼を調製した。
２）ＡＦＰ測定試薬▲６▼の調製
上記実施例１のＡＦＰ測定試薬▲１▼の調製において、抗体ＩＩのかわりに上記抗ＡＦＰ抗体混合液を用い、分散液に水可溶性担体試薬▲１▼を添加するかわりに上記抗体多量体▲２▼１．８ｍｌを添加したこと以外は同様にして、ＡＦＰ測定試薬▲６▼を調製した。この試薬は４℃で保存した。
３）ＡＦＰ量の測定
上記実施例１のＡＦＰ量の測定において、ＡＦＰ測定試薬▲１▼のかわりに、上記ＡＦＰ測定試薬▲６▼を用いたこと以外は同様にして、ＡＦＰ量を測定し、検量線を作成した。結果を表２及び図４に示す。
【００４１】
なお、各実施例及び比較例で用いたＡＦＰ測定試薬の、担体と抗体の種類の構成を表１に示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】
【表２】
【００４４】
表２及び図１〜４より、実施例の本発明の試薬によって作成された検量線は、ＡＦＰ低濃度域から高濃度域まで良好な直線性を示したが、比較例１の従来法によるラテックス凝集免疫試薬による検量線は、低濃度域及び高濃度域において良好な直線性を示さなかった。
これは、本発明の特定の抗原物質に対する異なる２種のモノクローナル抗体を、１種は水不溶性担体に、もう１種は水可溶性担体に担持させるか又は多量体として反応させたため、２種のモノクローナル抗体をそれぞれ水不溶性担体に担持させて反応させた場合（比較例１）と比べて、水不溶性担体の立体障害がないためと考えられる。また、低濃度域での感度も高く、モノクローナル抗体の生理活性もより高く保持されていると考えられる。
【００４５】
【発明の効果】
本発明の免疫測定試薬及び免疫測定方法は上述のとおりであるので、従来のラテックス凝集免疫試薬でみられたような水不溶性担体の立体障害による凝集阻害がなく、かつより多くの抗体を用いることができ、その結果、低濃度域でも高い検出感度を示す。
従って、被検試料中の抗原物質を正確に定量することが可能となり、疾患の発見、病態の把握、治療方法の決定等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の免疫測定試薬と比較例１の従来法のラテックス凝集免疫試薬で、既知濃度のＡＦＰ標準品を測定したときのＡＦＰ量と吸光度変化量の相関を示すグラフである。
【図２】実施例２の免疫測定試薬と比較例１の従来法のラテックス凝集免疫試薬で、既知濃度のＡＦＰ標準品を測定したときのＡＦＰ量と吸光度変化量の相関を示すグラフである。
【図３】実施例３の免疫測定試薬と比較例１の従来法のラテックス凝集免疫試薬で、既知濃度のＡＦＰ標準品を測定したときのＡＦＰ量と吸光度変化量の相関を示すグラフである。
【図４】実施例４の免疫測定試薬と比較例１の従来法のラテックス凝集免疫試薬で、既知濃度のＡＦＰ標準品を測定したときのＡＦＰ量と吸光度変化量の相関を示すグラフである。
【産業上の利用分野】
本発明は、抗原抗体反応による凝集反応によって抗原物質を測定する免疫測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、病院や検査センター等においては、人手不足、コスト削減、あるいは多量検体処理の要請等の点から、臨床検査などの諸検査の自動化及び測定時間の短縮化が図られている。このような自動化に適した方法として、不溶性担体粒子の凝集反応を利用して抗原性物質を定性ないし定量する方法が汎用されている（例えば、特公昭５８−１１５７５号公報等）。
上記の凝集法とは、被検試料中の抗原性物質を測定する場合、抗原性物質に特異的に結合する抗体もしくはそのフラグメントを担持させた不溶性担体と試料とを反応させ、不溶性担体の凝集の度合いを測定することにより、前記抗原性物質を検出または定量するものである。
【０００３】
上記抗体としては通常ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体が選択される。しかしながら、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を比較すると、抗原に対する特異性はモノクローナル抗体の方がだんぜん優れている。またポリクローナル抗体は動物の固体差や採血の時期により同じ品質のものを常に得ることは難しく、特異抗体に精製する段階での抗体自信の損失や活性の低下が大きいのに対し、モノクローナル抗体はその点では品質の一定した抗体の大量生産に向いている。
一方モノクローナル抗体は、抗原分子上の特定のエピトープのみと反応するため、抗原性物質が多価抗原である場合でも、特定のエピトープに関しては多価であるとは限らない。従って、抗原は、特定のモノクローナル抗体に対するエピトープに関しては一価となる可能性が高くなる。測定の目的とする抗原物質が一価抗原である場合、不溶性担体に担持された１種のモノクローナル抗体と試料中の抗原性物質が反応もしくは結合しても、通常凝集はおこらない。このため、実質的にはポリクローナル抗体が多用されている。
【０００４】
このような問題点に対し、特公平３−４０３４１号公報には、特定の抗原に対して、異なる２種又は３種のモノクローナル抗体を不溶性担体に担持させ、抗原と反応させて不溶性担体の凝集の程度を測定することにより、抗原性物質を検出または定量する方法が開示されている。
しかしながら、上記のような従来のモノクローナル抗体を不溶性担体に担持させる方法では、不溶性担体の立体障害により、抗体と抗原性物質との間の抗原抗体反応とそれに続く凝集が阻害される可能性がある。すなわち抗原性物質が１種類のモノクローナル抗体と、少なくとももう１種類のモノクローナル抗体とに同時に結合することによって、不溶性担体の凝集が生じるわけであるが、全てのモノクローナル抗体が不溶性担体に担持されていると、２種のモノクローナル抗体の認識する抗原のエピトープが構造的に接近した部位にある場合、不溶性担体間の立体構造により、異なる２種または３種のモノクローナル抗体が１つの抗原性物質に対し、同時に結合することが阻害される場合がある。また、この方法では、不溶性担体に担持させうる抗体量に限界があり、不溶性担体への担持が困難なモノクローナル抗体もある。さらにモノクローナル抗体の性状によっては、不溶性担体に担持させた場合、自己凝集が生じて試薬としての性能を発揮できない場合がある。従って、上記の方法では抗原性物質を正確に定量できない可能性がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点を解決するものであり、その目的とするところは、不溶性担体の立体障害による凝集阻害がなく、多量の抗体を用いることができ、その結果、正確な測定値を得ることのできる免疫測定試薬及び免疫測定法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の免疫測定試薬は、特定の抗原物質に対する異なる２種以上のモノクローナル抗体と水不溶性担体とからなり、上記特定の抗原物質に対するモノクローナル抗体の一部が水不溶性担体に担持される。
上記特定のモノクローナル抗体の水不溶性担体に担持されない抗体は、抗原抗体反応に伴う凝集反応において、水不溶性担体と立体障害をおこさない状態とされていればよく、例えば、水可溶性担体に担持されるか又は２以上の多量体とされるのが好ましい。
【０００７】
この時、水不溶性担体に担持されるモノクローナル抗体と、水可溶性担体に担持されるあるいは多量体とされるモノクローナル抗体は、特定の抗原物質に対する異なるモノクローナル抗体である。少なくとも１種の異なるモノクローナル抗体が担持あるいは多量体とされていれば、例えば、水不溶性担体に２種、水可溶性担体に別の１種が担持されていてもよい。
また、特定の抗原物質に対する異なる２種以上のモノクローナル抗体の混合物の、一部が水不溶性担体に担持され、一部が水可溶性担体に担持されるかあるいは２以上の多量体とされていてもよく、１種のモノクローナル抗体が水不溶性担体に担持され、異なる２種以上のモノクローナル抗体の混合物が水可溶性担体に担持されるかあるいは２以上の多量体とされていてもよい。
【０００８】
上記モノクローナル抗体の水不溶性担体に担持される量は、少なくなると凝集はしても凝集の程度を測定するのが困難となり、多くなると立体障害による凝集反応阻害が起こりやすくなるので、モノクローナル抗体全体の３０〜８０％が好ましい。
【０００９】
上記モノクローナル抗体としては、細胞融合技術分野において、公知の手法を適宜選択し、またはそれらを組み合わせることによりモノクローナル抗体産生融合細胞株を形成し、この細胞株を利用して産生、取得したものを用いることができる（「単クローン抗体・ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ」，岩崎辰夫ら著；講談社）。
【００１０】
その一態様としては、ある特定の完全抗原を用いて、これを適当な動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の動物に、例えば、アジュバントとともに皮下注射するなどの手法により投与し、動物を免疫した後、この免疫動物、例えば免疫マウスの上記抗原に対する抗体産生細胞、例えば脾細胞、胸腺細胞、リンパ節細胞及び／又は末梢血細胞等の細胞を採取し、これらの細胞と自己増殖能を有するが実質的に抗体産生能を有しない適当な株化細胞（ミエローマ細胞）、例えばマウス骨髄腫株化細胞とを、公知の手法により細胞融合処理する。
モノクローナル抗体を得るための抗体産生細胞とミエローマ細胞との組み合わせは、各細胞が融合して増殖しつつ抗体を産生することが可能であれば、それぞれの細胞の由来する動物の種類は限定されず、任意に組み合わせることができる。
【００１１】
上記ミエローマ細胞としては、特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト等の種々の動物の細胞体を用いることができる。好ましくは、株化細胞は薬剤抵抗性のものであり、かつ未融合のミエローマ細胞が選択培地で生存せず、融合細胞のみが生存するようなものである。
一般には、８−アザグアニジン抵抗性の株化細胞が用いられ、これはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン・アミンプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地に生育できない性質を有する。
さらに、株化細胞としては非分泌型のものが好ましく、例えば、マウスミエローマＭＯＰＣ−２１株由来のＰ３ ／Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３ Ｕ１）、Ｐ３ ／Ｘ６３−Ａｇ８・６・５・３、Ｐ３ ／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４、ラットミエローマ２１０・ＲＣＹ３・Ａｇ１・２・３等が挙げられる。
【００１２】
上記細胞融合処理は、例えば、イーグル最小基本（ＭＥＭ）培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地等の培地中で、上記免疫マウスの脾細胞１〜５×１０８ 個と、上記マウス骨髄腫株化細胞１〜５×１０７ 個とを混合して行うことができる。融合促進剤としては、平均分子量１０００〜６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、ウイルス等が挙げられ、特にＰＥＧが好ましく、ＰＥＧは約３０〜５０重量％で用いられる。
上記のようにして得られる融合細胞含有系から、融合細胞を、公知の手法により、選別処理、抗体活性スクリーニング処理及びクローニング処理して、免疫マウスの形成に用いた完全抗原に対するモノクローナル抗体産生能を有し、かつ自己増殖能をもつ融合細胞株を得ることができる。
【００１３】
上記融合細胞の選別処理は、例えば、２０重量％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地等で細胞融合を終えた細胞を適当に希釈し、９６穴マイクロプレートに１０５ 〜１０６ 個／ウェル程度に分注し、各ウェルに選択培地（ＨＡＴ培地等）を加え、以後選択培地の交換を行いながら、５％ＣＯ２ 培養器（３７℃）で培養を続けることにより行うことができる。ミエローマ細胞として８−アザグアニン抵抗性株を用いれば、未融合のミエローマ細胞はＨＡＴ培地で死滅し、また抗体産生細胞は正常細胞なので、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養では長期間生育できない。従って、培養後１０〜１４日ぐらいから生育してくる細胞を融合細胞として選別できる。
【００１４】
上記のようにして得られる融合細胞株の抗体活性スクリーニング処理及びクローニング処理は、公知の方法により行うことができる。
例えば、融合細胞の生育したウェルの培養上清の一部を採取し、一定量の標識抗原とインキュベーションし、標識抗原との結合能を測定することにより目的とする抗体を分泌しているウェルを検索する方法が挙げられる。すなわち １２５Ｉ、 １３１Ｉ等のラジオアイソトープ又は酵素等で標識した抗原と培養上清を反応させた後、各反応液について抗原−抗体結合物を分離し、標識量を測定することにより、目的とする抗体の存在及び結合能を検索することができる。
目的とする抗体活性の認められる各ウェル中には、２種以上の融合細胞が生育している可能性があるので、限界希釈法や軟寒天によるコロニー形成法によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生融合細胞株を得ることができる。
【００１５】
上記のようにして得られるモノクローナル抗体産生融合細胞株を用いて、前記免疫動物の形成に用いた完全抗原に対するモノクローナル抗体を取得する方法としては、例えば、上記モノクローナル抗体産生融合細胞株を適当な培地に培養し、培地からモノクローナル抗体を採取する方法、ミエローマ細胞由来動物と同系の動物に上記細胞株を移植し、腹水中のモノクローナル抗体を採取する方法等の公知の手法が挙げられる。
上記前者の態様としては、例えば、モノクローナル抗体産生融合細胞株を１０重量％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地等の培養液で培養し、その培養上清を硫安分画、抗原を結合させたセファロース４Ｂ等のアフィニティークロマトグラフィーなどによって精製することにより目的とするモノクローナル抗体を得ることができる。
【００１６】
また、上記後者の態様としては、例えば、同系動物にプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）等の鉱物油を腹腔内投与することによりｉｎ ｖｉｖｏで融合細胞を大量に増殖させ、高濃度のモノクローナル抗体が含まれた腹水を得る。この腹水から硫安分画及び必要に応じて前記アフィニティークロマトグラフィー等により、目的とするモノクローナル抗体を得ることができる。
本発明のモノクローナル抗体として、上述のようにして取得できるもの以外に市販のものを用いることも可能である。
【００１７】
前記水不溶性担体としては、従来より免疫化学的凝集反応及び凝集阻止反応において、一般的に用いられている微粒子の担体を用いることができるが、工業的に大量生産が可能な有機系微粒子が好ましい。
上記有機系微粒子としては、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体及び／又は共重合体；スチレン−ブタジエン共重合体、メタクリル酸メチル−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体；並びに官能基としてカルボキシル基、第１級アミノ基、カルボアミノ基（−ＣＯＮＨ２）、水酸基、アルデヒド基等を有し、かつ基体が前記有機系微粒子からなる反応性有機系微粒子などが挙げられ、抗体の吸着性に優れ、生物学的活性を長期間安定に保持できる等の理由から、特にスチレンを主成分とするポリスチレン系のラテックス粒子が好ましい。
【００１８】
その他、動物の赤血球、細菌の細胞等の生物学的粒子；ベントナイト、コロジオン、コレステロール結晶、シリカ、カオリン、炭素末等の非生物学的粒子なども用いることができる。
上記水不溶性担体の平均粒径は、測定方法、測定機器によって異なるが、０．０５〜１．０μｍのものが通常用いられる。
【００１９】
上記水不溶性担体にモノクローナル抗体を担持させる方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、水不溶性担体に物理的に吸着させる方法、官能基を有する水不溶性担体表面に、公知の化学結合法や共有結合法により担持させる方法等が挙げられる。
【００２０】
前記水可溶性担体としては、モノクローナル抗体を２以上担持でき、かつ水可溶性であれば特に限定されない。例えば、二塩酸スベリミジン酸ジメチル、アルキルジイミデート等のビスイミドエステル類；アシルアジド類；イソシアネート類；グルタルアルデヒド等のジアルデヒド類；メルカプトアルキルイミデート類；イミノチオ等のチオール化試薬；ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）；ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）；ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド）；ＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−マレイミドヘキサノイルオキシ）スクシンイミド）；ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）；ニトレン類；アリールハライド類；スルホニルハライド類；ブロモシアン；過ヨウ素酸塩等の低分子化合物などのタンパク質の架橋剤が挙げられ、なかでも二塩酸スベリミジン酸ジメチルが好ましい。
その他、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース等のセルロース誘導体；ポリビニルアルコール等の水溶性高分子化合物などが挙げられる。
【００２１】
上記水可溶性担体にモノクローナル抗体を担持させる方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、公知の化学結合法や共有結合法により担持させる方法、水可溶性担体に物理的に吸着させる方法、アビジン−ビオチン等の親和性をもつ物質を用いて担持させる方法等が挙げられる。
【００２２】
前記モノクローナル抗体を２以上の多量体にする方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、抗体濃度５〜３０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７〜１０の抗体希釈液を加熱し、熱変性により抗原認識部位に関与しないＦｃ部位で抗体どうしを結合させる方法等が挙げられる。
上記加熱処理は、温度が高かったり時間が長くなると抗体が変性するため、４０〜８０℃で６０分以内が好ましく、より好ましくは５０〜７５℃で３０分以内である。
【００２３】
本発明の免疫測定法は、上記本発明の免疫測定試薬と、上記特定の抗原物質とを反応させ、凝集の度合いにより上記特定の抗原物質を測定する方法である。
【００２４】
上記抗体が担持された水不溶性担体、及び抗体が担持された水可溶性担体又は少なくとも２以上の抗体の多量体と、特定の抗原物質との反応は、抗原抗体反応及びそれに伴う凝集反応である。反応条件は、上記反応が起こりうるものであれば特に限定されないが、反応温度は恒温で２５〜３７℃の範囲内で行うのが好ましい。反応時間は５秒〜１５分が好ましい。
上記反応を行う際の反応液としては、抗原抗体反応が起こりうる生理的条件を満たす水溶液であれば特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。反応液のｐＨは、５．５〜８．５が好ましく、さらに好ましくは６．５〜８．０である。
【００２５】
上記反応液には、更に必要に応じて、牛血清アルブミン、ショ糖等の安定化剤、感度を高める効果が期待されるポリエチレングリコール、デキストラン等の水溶性多糖類、アジ化ナトリウム等の防腐剤、塩化ナトリウム等の塩濃度調整剤などを添加してもよい。
【００２６】
本発明の方法において、測定対象となる試料としては、抗原、抗体等の免疫学的に活性な抗原物質を含有する試料、特に生体試料である。生体試料としては、例えば、血液、胸水、腹水、リンパ液等の体液、尿、便、汗等の***物、及び組織の抽出物などが挙げられる。
【００２７】
上記特定の抗原物質としては、抗原抗体反応しうる抗原、抗体等の免疫学的に活性なあらゆる物質、すなわち従来測定されていた物質のいずれもが包含され、例えばタンパク質、ポリペプチド、多糖類、脂質、ステロイド等が挙げられる。上記タンパク質としては、例えば、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、フィブリノーゲン分解産物（ＦＤＰ）、Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）等の血液中タンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）等の感染症に対する抗原及びその抗体、レセプター、酵素などが挙げられる。
【００２８】
前記凝集の度合いを測定する方法としては、特に限定されないが、例えば、凝集を定性的又は半定量的に測定する場合には、既知の試料の濁度の程度との比較から、測定すべき試料の濁度の程度を目視により観察する方法を用いることができ、定量的に測定する場合には、簡便性及び精度の点から、上記濁度の程度を光学的に測定する方法が好ましい。
【００２９】
上記目視により観察する方法としては、、試料と抗体が担持された水不溶性担体及び抗体が担持された水可溶性担体（又は多量体）を含む溶液を判定板上で混合し、揺り動かした後、凝集の有無を判定する。判定には、単に肉眼で判定する以外に、ビデオカメラで撮影し画像処理を施すことによって判定することもできる。
【００３０】
上記光学的に測定する方法としては、公知の方法が用いられ、例えば、凝集塊の形成を濁度の増加としてとらえる比濁法、凝集塊の形成を粒度分布又は平均粒径の変化としてとらえる方法、凝集塊の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し透過光強度との比を比較する積分球濁度法等が挙げられる。
上記の測定法において、異なる時点で少なくとも２つの測定値を得、これらの時点間における測定値の増加分（すなわち増加速度）に基づき凝集の程度を求める速度試験（レートアッセイ）、及びある時点（通常は反応の終点と考えられる時点）で１つの測定値を得、この測定値に基づき凝集の程度を求める終点試験（エンドポイントアッセイ）を利用でき、測定の簡便性、迅速性の点から比濁法による速度試験を行うことが好ましい。
【００３１】
【作用】
上述のように、本発明によれば、特定の抗原物質に対する２種以上のモノクローナル抗体の一部が水不溶性担体に担持され、例えば、残りの一部が水可溶性担体に担持されるか又は２以上の多量体とされていることにより、凝集反応の際に水不溶性担体の立体障害による凝集反応阻害が抑えられるので、特定の抗原物質との結合物を選択的に凝集させることができ、高感度に抗原物質量を測定することができる。
【００３２】
【実施例】
本発明を実施例につき説明する。実施例及び比較例に用いた試薬は以下のとおりである。
〔抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体〕
マウスの培養細胞上清からプロテインＡにより精製した、エピトープの異なる２種のマウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体、クローンＮｏ．ＡＦＰ４−Ｆ１１（ＩｇＧ−１、以下抗体Ｉとする）、及びクローンＮｏ．ＡＦＰ４−Ｆ６７（ＩｇＧ−１、以下抗体ＩＩとする）を用いた（共にＤＡＣＯ社製）。
〔抗体架橋反応用緩衝液〕
２００ｍＭ Ｎａ２ ＨＰＯ４ と２００ｍＭ ＮａＨ２ ＰＯ４ をｐＨ８となるように混合して用いた。
〔ラテックス希釈用緩衝液、抗体希釈用緩衝液〕
５０ｍＭ Ｎａ２ ＨＰＯ４ と５０ｍＭ ＮａＨ２ ＰＯ４ をｐＨ７．５となるように混合して用いた。
〔ブロッキング用緩衝液〕
１００ｍＭ Ｎａ２ ＨＰＯ４ と１００ｍＭ ＮａＨ２ ＰＯ４ をｐＨ７．４となるように混合し、さらにウシ血清アルブミン（フラクションＶ、Ｒｅａｇｅｎｔ Ｇｒａｄｅ 、Ｍｉｌｅｓ Ｃｏｒｐ．社製）を１％（Ｗ／Ｖ）になるように、またＮａＮ３ （試薬特級、ナカライテスク社製）を０．１％（Ｗ／Ｖ）になるように添加し溶解させたものを用いた。
〔検体希釈液〕
上記ブロッキング用緩衝液に、ポリエチレングリコール６０００（平均分子量７５００、和光純薬社製）を３％（Ｗ／Ｖ）となるように溶解して用いた。
【００３３】
（実施例１）
１）水可溶性担体試薬▲１▼の調製
抗体Ｉを、抗体架橋反応用緩衝液１５００ｍｌで透析した後、タンパク濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように抗体架橋反応用緩衝液で希釈し、抗体液とした。
また、二塩化スベリミジン酸ジメチル（東京化成社製）１１．４ｍｇを上記抗体架橋反応用緩衝液５ｍｌに溶解し、抗体架橋剤を調製した。
上記抗体液１ｍｌを２５℃のインキュベーター中でマグネチックスターラーで攪拌しながら、上記抗体架橋剤１μｌを２分おきに計５回添加し、その後さらに１０分間攪拌した。
次いで、酢酸アンモニウム（試薬特級、和光純薬社製）７．７ｍｇを上記抗体架橋反応用緩衝液５００μｌに溶解して調製した抗体架橋反応停止剤５μｌを添加し、この粗生成物を０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ ＨＲ１０／３０（ゲル濾過カラム、ファルマシア社製）に供し、同緩衝液で０．５ｍｌ／分で溶出させ、分子量２５００００〜５０００００の画分を分取した。最終タンパク濃度が４０μｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希釈し、水可溶性担体試薬▲１▼を調製した。
【００３４】
２）ＡＦＰ測定試薬▲１▼の調製
平均粒径０．３０４μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０％（ｗ／ｖ）、積水化学工業社製）１容に、上記ラテックス希釈用緩衝液９容を添加希釈し、ラテックス液とした。
抗体ＩＩは、タンパク濃度が６６．７μｇ／ｍｌとなるように上記抗体希釈用緩衝液で希釈し、感作抗体液とした。
上記ラテックス液６００μｌを２５℃のインキュベーター中で、マグネチックスターラーで攪拌しながら、上記感作抗体液１２００μｌを素早く添加し、さらに１時間攪拌した。次いでブロッキング用緩衝液３ｍｌを添加し、２５℃で続けて２時間攪拌した。その後１５℃、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し沈殿を得た。この沈殿にブロッキング用緩衝液４ｍｌを添加し、同様に遠心分離して沈殿を洗浄した。この洗浄操作をさらに２回行った後、ブロッキング用緩衝液１．８ｍｌを添加し、よく攪拌し、超音波破砕機で分散処理を行った。
この分散液に上記水可溶性担体試薬▲１▼１．８ｍｌを添加し、固形分０．１７％（ｗ／ｖ）のＡＦＰ測定試薬▲１▼を調製した。この試薬は４℃で保存した。
【００３５】
３）ＡＦＰ量の測定
ヒトプール血清から精製されたＡＦＰ標準品（ＷＨＯ標準品、９０８９０Ｉ．Ｕ．／ｍｌ、１１０μｇ／ｍｌ、ＤＡＣＯ社製）を用い、生理食塩水で２０００、５００、１００、２０、１０、５ｎｇ／ｍｌにそれぞれ希釈し、各濃度のＡＦＰ標準品を調製した。また、ＡＦＰ標準品を含まない生理食塩水のみのものを０ｎｇ／ｍｌとした。
測定は、各ＡＦＰ標準品２０μｌを分注後、直ちに上記検体希釈液２１０μｌを添加混合し、次いで上記ＡＦＰ測定試薬▲１▼３０μｌの添加混合を行った。
生化学用自動分析装置（日立７１５０型、日立製作所社製）を使用し、測定条件は温度３７℃、波長５７０ｎｍとした。
反応量は、ＡＦＰ測定試薬添加後８０秒後の吸光度と３２０秒後の吸光度を測定し、その差を１００００倍したものを吸光度変化量とし、各ＡＦＰ標準品の抗体濃度と吸光度変化量の検量線を作成した。結果を表２及び図１に示す。
【００３６】
（比較例１）
１）ＡＦＰ測定試薬▲２▼の調製
上記実施例１のＡＦＰ測定試薬▲１▼の調製において、分散液に水可溶性担体試薬▲１▼を添加するかわりに、ブロッキング用緩衝液１．８ｍｌを添加したこと以外は同様にして、ＡＦＰ測定試薬▲２▼を調製した。
２）ＡＦＰ測定試薬▲３▼の調製
上記ＡＦＰ測定試薬▲２▼の調製において、抗体として抗体Ｉを用いて感作抗体液としたこと以外は同様にして、ＡＦＰ測定試薬▲３▼を調製した。
３）ラテックス凝集免疫試薬の調製
上記ＡＦＰ測定試薬▲２▼とＡＦＰ測定試薬▲３▼を等量混合し、固形分０．１７％（ｗ／ｖ）のラテックス凝集免疫試薬を調製した。この試薬は４℃で保存した。
４）ＡＦＰ量の測定
上記実施例１のＡＦＰ量の測定において、ＡＦＰ測定試薬▲１▼のかわりに、上記ラテックス凝集免疫試薬を用いたこと以外は同様にして、ＡＦＰ量を測定し、検量線を作成した。結果を表２及び図１に示す。
【００３７】
（実施例２）
１）抗体多量体▲１▼の調製
抗体Ｉの１ｍｌを、抗体架橋反応用緩衝液１５００ｍｌで透析した後、タンパク濃度が５ｍｇ／ｍｌになるように抗体架橋反応用緩衝液で希釈した。この抗体液１ｍｌを５６℃のインキュベーター中で３０分間加熱した後、氷冷した。この後タンパク濃度が４０μｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希釈し、抗体多量体▲１▼を調製した。
【００３８】
２）ＡＦＰ測定試薬▲４▼の調製
上記実施例１のＡＦＰ測定試薬▲１▼の調製において、分散液に水可溶性担体試薬▲１▼を添加するかわりに、上記抗体多量体▲１▼１．８ｍｌを添加したこと以外は同様にして、ＡＦＰ測定試薬▲４▼を調製した。この試薬は４℃で保存した。
３）ＡＦＰ量の測定
上記実施例１のＡＦＰ量の測定において、ＡＦＰ測定試薬▲１▼のかわりに、上記ＡＦＰ測定試薬▲４▼を用いたこと以外は同様にして、ＡＦＰ量を測定し、検量線を作成した。結果を表２及び図２に示す。
【００３９】
（実施例３）
１）水可溶性担体試薬▲２▼の調製
抗体Ｉ及びＩＩを、同じ濃度で等量混合し、抗ＡＦＰ抗体混合液とした。
上記実施例１の水可溶性担体試薬▲１▼の調製において、抗体Ｉのかわりに、上記抗ＡＦＰ抗体混合液を用いたこと以外は同様にして、水可溶性担体試薬▲２▼を調製した。
２）ＡＦＰ測定試薬▲５▼の調製
上記実施例１のＡＦＰ測定試薬▲１▼の調製において、抗体ＩＩのかわりに上記抗ＡＦＰ抗体混合液を用い、分散液に水可溶性担体試薬▲１▼を添加するかわりに上記水可溶性担体試薬▲２▼１．８ｍｌを添加したこと以外は同様にして、ＡＦＰ測定試薬▲５▼を調製した。この試薬は４℃で保存した。
３）ＡＦＰ量の測定
上記実施例１のＡＦＰ量の測定において、ＡＦＰ測定試薬▲１▼のかわりに、上記ＡＦＰ測定試薬▲５▼を用いたこと以外は同様にして、ＡＦＰ量を測定し、検量線を作成した。結果を表２及び図３に示す。
【００４０】
（実施例４）
１）抗体多量体▲２▼の調製
上記実施例２の抗体多量体▲１▼の調製において、抗体Ｉのかわりに、上記実施例３で調製した抗ＡＦＰ抗体混合液を用いたこと以外は同様にして、抗体多量体▲２▼を調製した。
２）ＡＦＰ測定試薬▲６▼の調製
上記実施例１のＡＦＰ測定試薬▲１▼の調製において、抗体ＩＩのかわりに上記抗ＡＦＰ抗体混合液を用い、分散液に水可溶性担体試薬▲１▼を添加するかわりに上記抗体多量体▲２▼１．８ｍｌを添加したこと以外は同様にして、ＡＦＰ測定試薬▲６▼を調製した。この試薬は４℃で保存した。
３）ＡＦＰ量の測定
上記実施例１のＡＦＰ量の測定において、ＡＦＰ測定試薬▲１▼のかわりに、上記ＡＦＰ測定試薬▲６▼を用いたこと以外は同様にして、ＡＦＰ量を測定し、検量線を作成した。結果を表２及び図４に示す。
【００４１】
なお、各実施例及び比較例で用いたＡＦＰ測定試薬の、担体と抗体の種類の構成を表１に示す。
【００４２】
【表１】
【表２】
表２及び図１〜４より、実施例の本発明の試薬によって作成された検量線は、ＡＦＰ低濃度域から高濃度域まで良好な直線性を示したが、比較例１の従来法によるラテックス凝集免疫試薬による検量線は、低濃度域及び高濃度域において良好な直線性を示さなかった。
これは、本発明の特定の抗原物質に対する異なる２種のモノクローナル抗体を、１種は水不溶性担体に、もう１種は水可溶性担体に担持させるか又は多量体として反応させたため、２種のモノクローナル抗体をそれぞれ水不溶性担体に担持させて反応させた場合（比較例１）と比べて、水不溶性担体の立体障害がないためと考えられる。また、低濃度域での感度も高く、モノクローナル抗体の生理活性もより高く保持されていると考えられる。
【００４５】
【発明の効果】
本発明の免疫測定試薬及び免疫測定方法は上述のとおりであるので、従来のラテックス凝集免疫試薬でみられたような水不溶性担体の立体障害による凝集阻害がなく、かつより多くの抗体を用いることができ、その結果、低濃度域でも高い検出感度を示す。
従って、被検試料中の抗原物質を正確に定量することが可能となり、疾患の発見、病態の把握、治療方法の決定等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の免疫測定試薬と比較例１の従来法のラテックス凝集免疫試薬で、既知濃度のＡＦＰ標準品を測定したときのＡＦＰ量と吸光度変化量の相関を示すグラフである。
【図２】実施例２の免疫測定試薬と比較例１の従来法のラテックス凝集免疫試薬で、既知濃度のＡＦＰ標準品を測定したときのＡＦＰ量と吸光度変化量の相関を示すグラフである。
【図３】実施例３の免疫測定試薬と比較例１の従来法のラテックス凝集免疫試薬で、既知濃度のＡＦＰ標準品を測定したときのＡＦＰ量と吸光度変化量の相関を示すグラフである。
【図４】実施例４の免疫測定試薬と比較例１の従来法のラテックス凝集免疫試薬で、既知濃度のＡＦＰ標準品を測定したときのＡＦＰ量と吸光度変化量の相関を示すグラフである。
Claims (8)
- 特定の抗原物質に対する異なる２種以上のモノクローナル抗体と水不溶性担体からなり、上記モノクローナル抗体の一部が水不溶性担体に担持されていることを特徴とする免疫測定試薬。
- 特定の抗原物質に対する異なる２種以上のモノクローナル抗体の、少なくとも１種が担持された水不溶性担体と、少なくとも別の１種が担持された水可溶性担体とからなることを特徴とする免疫測定試薬。
- 特定の抗原物質に対する異なる２種以上のモノクローナル抗体の、少なくとも１種が担持された水不溶性担体と、少なくとも別の１種の２以上の多量体とからなることを特徴とする免疫測定試薬。
- 特定の抗原物質に対する異なる２種以上のモノクローナル抗体の混合物の、一部が担持された水不溶性担体と、一部が担持された水可溶性担体からなることを特徴とする免疫測定試薬。
- 特定の抗原物質に対する異なる２種以上のモノクローナル抗体の混合物の、一部が担持された水不溶性担体と、一部の２以上の多量体とからなることを特徴とする免疫測定試薬。
- 上記水不溶性担体がポリスチレン系ラテックスである請求項１〜５いずれかに記載の免疫測定試薬。
- 上記特定の抗原物質がアルファフェトプロテインである請求項１〜６いずれかに記載の免疫測定試薬。
- 請求項１〜７いずれかに記載の免疫測定試薬と、上記特定の抗原物質とを反応させ、凝集の度合いにより上記特定の抗原物質を測定することを特徴とする免疫測定法。
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