JP3618909B2 - 免疫測定試薬及び免疫測定法 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は、抗原抗体反応による凝集反応によって抗原物質を測定する免疫測定法に関する。
【0002】
【従来の技術】
近年、病院や検査センター等においては、人手不足、コスト削減、あるいは多量検体処理の要請等の点から、臨床検査などの諸検査の自動化及び測定時間の短縮化が図られている。このような自動化に適した方法として、不溶性担体粒子の凝集反応を利用して抗原性物質を定性ないし定量する方法が汎用されている(例えば、特公昭58−11575号公報等)。
上記の凝集法とは、被検試料中の抗原性物質を測定する場合、抗原性物質に特異的に結合する抗体もしくはそのフラグメントを担持させた不溶性担体と試料とを反応させ、不溶性担体の凝集の度合いを測定することにより、前記抗原性物質を検出または定量するものである。
【0003】
上記抗体としては通常ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体が選択される。しかしながら、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を比較すると、抗原に対する特異性はモノクローナル抗体の方がだんぜん優れている。またポリクローナル抗体は動物の固体差や採血の時期により同じ品質のものを常に得ることは難しく、特異抗体に精製する段階での抗体自信の損失や活性の低下が大きいのに対し、モノクローナル抗体はその点では品質の一定した抗体の大量生産に向いている。
一方モノクローナル抗体は、抗原分子上の特定のエピトープのみと反応するため、抗原性物質が多価抗原である場合でも、特定のエピトープに関しては多価であるとは限らない。従って、抗原は、特定のモノクローナル抗体に対するエピトープに関しては一価となる可能性が高くなる。測定の目的とする抗原物質が一価抗原である場合、不溶性担体に担持された1種のモノクローナル抗体と試料中の抗原性物質が反応もしくは結合しても、通常凝集はおこらない。このため、実質的にはポリクローナル抗体が多用されている。
【0004】
このような問題点に対し、特公平3−40341号公報には、特定の抗原に対して、異なる2種又は3種のモノクローナル抗体を不溶性担体に担持させ、抗原と反応させて不溶性担体の凝集の程度を測定することにより、抗原性物質を検出または定量する方法が開示されている。
しかしながら、上記のような従来のモノクローナル抗体を不溶性担体に担持させる方法では、不溶性担体の立体障害により、抗体と抗原性物質との間の抗原抗体反応とそれに続く凝集が阻害される可能性がある。すなわち抗原性物質が1種類のモノクローナル抗体と、少なくとももう1種類のモノクローナル抗体とに同時に結合することによって、不溶性担体の凝集が生じるわけであるが、全てのモノクローナル抗体が不溶性担体に担持されていると、2種のモノクローナル抗体の認識する抗原のエピトープが構造的に接近した部位にある場合、不溶性担体間の立体構造により、異なる2種または3種のモノクローナル抗体が1つの抗原性物質に対し、同時に結合することが阻害される場合がある。また、この方法では、不溶性担体に担持させうる抗体量に限界があり、不溶性担体への担持が困難なモノクローナル抗体もある。さらにモノクローナル抗体の性状によっては、不溶性担体に担持させた場合、自己凝集が生じて試薬としての性能を発揮できない場合がある。従って、上記の方法では抗原性物質を正確に定量できない可能性がある。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点を解決するものであり、その目的とするところは、不溶性担体の立体障害による凝集阻害がなく、多量の抗体を用いることができ、その結果、正確な測定値を得ることのできる免疫測定試薬及び免疫測定法を提供することである。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明の免疫測定試薬は、特定の抗原物質に対する異なる2種以上のモノクローナル抗体と水不溶性担体とからなり、上記特定の抗原物質に対するモノクローナル抗体の一部が水不溶性担体に担持される。
上記特定のモノクローナル抗体の水不溶性担体に担持されない抗体は、抗原抗体反応に伴う凝集反応において、水不溶性担体と立体障害をおこさない状態とされていればよく、例えば、水可溶性担体に担持されるか又は2以上の多量体とされるのが好ましい。
【0007】
この時、水不溶性担体に担持されるモノクローナル抗体と、水可溶性担体に担持されるあるいは多量体とされるモノクローナル抗体は、特定の抗原物質に対する異なるモノクローナル抗体である。少なくとも1種の異なるモノクローナル抗体が担持あるいは多量体とされていれば、例えば、水不溶性担体に2種、水可溶性担体に別の1種が担持されていてもよい。
また、特定の抗原物質に対する異なる2種以上のモノクローナル抗体の混合物の、一部が水不溶性担体に担持され、一部が水可溶性担体に担持されるかあるいは2以上の多量体とされていてもよく、1種のモノクローナル抗体が水不溶性担体に担持され、異なる2種以上のモノクローナル抗体の混合物が水可溶性担体に担持されるかあるいは2以上の多量体とされていてもよい。
【0008】
上記モノクローナル抗体の水不溶性担体に担持される量は、少なくなると凝集はしても凝集の程度を測定するのが困難となり、多くなると立体障害による凝集反応阻害が起こりやすくなるので、モノクローナル抗体全体の30〜80%が好ましい。
【0009】
上記モノクローナル抗体としては、細胞融合技術分野において、公知の手法を適宜選択し、またはそれらを組み合わせることによりモノクローナル抗体産生融合細胞株を形成し、この細胞株を利用して産生、取得したものを用いることができる(「単クローン抗体・ハイブリドーマとELISA」,岩崎辰夫ら著;講談社)。
【0010】
その一態様としては、ある特定の完全抗原を用いて、これを適当な動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の動物に、例えば、アジュバントとともに皮下注射するなどの手法により投与し、動物を免疫した後、この免疫動物、例えば免疫マウスの上記抗原に対する抗体産生細胞、例えば脾細胞、胸腺細胞、リンパ節細胞及び/又は末梢血細胞等の細胞を採取し、これらの細胞と自己増殖能を有するが実質的に抗体産生能を有しない適当な株化細胞(ミエローマ細胞)、例えばマウス骨髄腫株化細胞とを、公知の手法により細胞融合処理する。
モノクローナル抗体を得るための抗体産生細胞とミエローマ細胞との組み合わせは、各細胞が融合して増殖しつつ抗体を産生することが可能であれば、それぞれの細胞の由来する動物の種類は限定されず、任意に組み合わせることができる。
【0011】
上記ミエローマ細胞としては、特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト等の種々の動物の細胞体を用いることができる。好ましくは、株化細胞は薬剤抵抗性のものであり、かつ未融合のミエローマ細胞が選択培地で生存せず、融合細胞のみが生存するようなものである。
一般には、8−アザグアニジン抵抗性の株化細胞が用いられ、これはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン・アミンプテリン・チミジン(HAT)培地に生育できない性質を有する。
さらに、株化細胞としては非分泌型のものが好ましく、例えば、マウスミエローマMOPC−21株由来のP3 /X63−Ag8U1(P3 U1)、P3 /X63−Ag8・6・5・3、P3 /NSI−1−Ag4−1、Sp2/O−Ag14、ラットミエローマ210・RCY3・Ag1・2・3等が挙げられる。
【0012】
上記細胞融合処理は、例えば、イーグル最小基本(MEM)培地、RPMI−1640培地等の培地中で、上記免疫マウスの脾細胞1〜5×108 個と、上記マウス骨髄腫株化細胞1〜5×107 個とを混合して行うことができる。融合促進剤としては、平均分子量1000〜6000のポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルアルコール、ウイルス等が挙げられ、特にPEGが好ましく、PEGは約30〜50重量%で用いられる。
上記のようにして得られる融合細胞含有系から、融合細胞を、公知の手法により、選別処理、抗体活性スクリーニング処理及びクローニング処理して、免疫マウスの形成に用いた完全抗原に対するモノクローナル抗体産生能を有し、かつ自己増殖能をもつ融合細胞株を得ることができる。
【0013】
上記融合細胞の選別処理は、例えば、20重量%ウシ胎児血清含有RPMI−1640培地等で細胞融合を終えた細胞を適当に希釈し、96穴マイクロプレートに105 〜106 個/ウェル程度に分注し、各ウェルに選択培地(HAT培地等)を加え、以後選択培地の交換を行いながら、5%CO2 培養器(37℃)で培養を続けることにより行うことができる。ミエローマ細胞として8−アザグアニン抵抗性株を用いれば、未融合のミエローマ細胞はHAT培地で死滅し、また抗体産生細胞は正常細胞なので、in vitro培養では長期間生育できない。従って、培養後10〜14日ぐらいから生育してくる細胞を融合細胞として選別できる。
【0014】
上記のようにして得られる融合細胞株の抗体活性スクリーニング処理及びクローニング処理は、公知の方法により行うことができる。
例えば、融合細胞の生育したウェルの培養上清の一部を採取し、一定量の標識抗原とインキュベーションし、標識抗原との結合能を測定することにより目的とする抗体を分泌しているウェルを検索する方法が挙げられる。すなわち 125I、 131I等のラジオアイソトープ又は酵素等で標識した抗原と培養上清を反応させた後、各反応液について抗原−抗体結合物を分離し、標識量を測定することにより、目的とする抗体の存在及び結合能を検索することができる。
目的とする抗体活性の認められる各ウェル中には、2種以上の融合細胞が生育している可能性があるので、限界希釈法や軟寒天によるコロニー形成法によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生融合細胞株を得ることができる。
【0015】
上記のようにして得られるモノクローナル抗体産生融合細胞株を用いて、前記免疫動物の形成に用いた完全抗原に対するモノクローナル抗体を取得する方法としては、例えば、上記モノクローナル抗体産生融合細胞株を適当な培地に培養し、培地からモノクローナル抗体を採取する方法、ミエローマ細胞由来動物と同系の動物に上記細胞株を移植し、腹水中のモノクローナル抗体を採取する方法等の公知の手法が挙げられる。
上記前者の態様としては、例えば、モノクローナル抗体産生融合細胞株を10重量%ウシ胎児血清含有RPMI−1640培地等の培養液で培養し、その培養上清を硫安分画、抗原を結合させたセファロース4B等のアフィニティークロマトグラフィーなどによって精製することにより目的とするモノクローナル抗体を得ることができる。
【0016】
また、上記後者の態様としては、例えば、同系動物にプリスタン(2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン)等の鉱物油を腹腔内投与することによりin vivoで融合細胞を大量に増殖させ、高濃度のモノクローナル抗体が含まれた腹水を得る。この腹水から硫安分画及び必要に応じて前記アフィニティークロマトグラフィー等により、目的とするモノクローナル抗体を得ることができる。
本発明のモノクローナル抗体として、上述のようにして取得できるもの以外に市販のものを用いることも可能である。
【0017】
前記水不溶性担体としては、従来より免疫化学的凝集反応及び凝集阻止反応において、一般的に用いられている微粒子の担体を用いることができるが、工業的に大量生産が可能な有機系微粒子が好ましい。
上記有機系微粒子としては、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体及び/又は共重合体;スチレン−ブタジエン共重合体、メタクリル酸メチル−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体;並びに官能基としてカルボキシル基、第1級アミノ基、カルボアミノ基(−CONH2)、水酸基、アルデヒド基等を有し、かつ基体が前記有機系微粒子からなる反応性有機系微粒子などが挙げられ、抗体の吸着性に優れ、生物学的活性を長期間安定に保持できる等の理由から、特にスチレンを主成分とするポリスチレン系のラテックス粒子が好ましい。
【0018】
その他、動物の赤血球、細菌の細胞等の生物学的粒子;ベントナイト、コロジオン、コレステロール結晶、シリカ、カオリン、炭素末等の非生物学的粒子なども用いることができる。
上記水不溶性担体の平均粒径は、測定方法、測定機器によって異なるが、0.05〜1.0μmのものが通常用いられる。
【0019】
上記水不溶性担体にモノクローナル抗体を担持させる方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、水不溶性担体に物理的に吸着させる方法、官能基を有する水不溶性担体表面に、公知の化学結合法や共有結合法により担持させる方法等が挙げられる。
【0020】
前記水可溶性担体としては、モノクローナル抗体を2以上担持でき、かつ水可溶性であれば特に限定されない。例えば、二塩酸スベリミジン酸ジメチル、アルキルジイミデート等のビスイミドエステル類;アシルアジド類;イソシアネート類;グルタルアルデヒド等のジアルデヒド類;メルカプトアルキルイミデート類;イミノチオ等のチオール化試薬;SPDP(N−スクシンイイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート);MBS(m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミド);GMBS(N−(γ−マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド);EMCS(N−(ε−マレイミドヘキサノイルオキシ)スクシンイミド);EDC(1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド);ニトレン類;アリールハライド類;スルホニルハライド類;ブロモシアン;過ヨウ素酸塩等の低分子化合物などのタンパク質の架橋剤が挙げられ、なかでも二塩酸スベリミジン酸ジメチルが好ましい。
その他、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース等のセルロース誘導体;ポリビニルアルコール等の水溶性高分子化合物などが挙げられる。
【0021】
上記水可溶性担体にモノクローナル抗体を担持させる方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、公知の化学結合法や共有結合法により担持させる方法、水可溶性担体に物理的に吸着させる方法、アビジン−ビオチン等の親和性をもつ物質を用いて担持させる方法等が挙げられる。
【0022】
前記モノクローナル抗体を2以上の多量体にする方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、抗体濃度5〜30mg/ml、pH7〜10の抗体希釈液を加熱し、熱変性により抗原認識部位に関与しないFc部位で抗体どうしを結合させる方法等が挙げられる。
上記加熱処理は、温度が高かったり時間が長くなると抗体が変性するため、40〜80℃で60分以内が好ましく、より好ましくは50〜75℃で30分以内である。
【0023】
本発明の免疫測定法は、上記本発明の免疫測定試薬と、上記特定の抗原物質とを反応させ、凝集の度合いにより上記特定の抗原物質を測定する方法である。
【0024】
上記抗体が担持された水不溶性担体、及び抗体が担持された水可溶性担体又は少なくとも2以上の抗体の多量体と、特定の抗原物質との反応は、抗原抗体反応及びそれに伴う凝集反応である。反応条件は、上記反応が起こりうるものであれば特に限定されないが、反応温度は恒温で25〜37℃の範囲内で行うのが好ましい。反応時間は5秒〜15分が好ましい。
上記反応を行う際の反応液としては、抗原抗体反応が起こりうる生理的条件を満たす水溶液であれば特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。反応液のpHは、5.5〜8.5が好ましく、さらに好ましくは6.5〜8.0である。
【0025】
上記反応液には、更に必要に応じて、牛血清アルブミン、ショ糖等の安定化剤、感度を高める効果が期待されるポリエチレングリコール、デキストラン等の水溶性多糖類、アジ化ナトリウム等の防腐剤、塩化ナトリウム等の塩濃度調整剤などを添加してもよい。
【0026】
本発明の方法において、測定対象となる試料としては、抗原、抗体等の免疫学的に活性な抗原物質を含有する試料、特に生体試料である。生体試料としては、例えば、血液、胸水、腹水、リンパ液等の体液、尿、便、汗等の***物、及び組織の抽出物などが挙げられる。
【0027】
上記特定の抗原物質としては、抗原抗体反応しうる抗原、抗体等の免疫学的に活性なあらゆる物質、すなわち従来測定されていた物質のいずれもが包含され、例えばタンパク質、ポリペプチド、多糖類、脂質、ステロイド等が挙げられる。上記タンパク質としては、例えば、アルファフェトプロテイン(AFP)、フィブリノーゲン分解産物(FDP)、C反応性タンパク(CRP)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)等の血液中タンパク質、B型肝炎ウイルス(HB)、C型肝炎ウイルス(HC)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)等の感染症に対する抗原及びその抗体、レセプター、酵素などが挙げられる。
【0028】
前記凝集の度合いを測定する方法としては、特に限定されないが、例えば、凝集を定性的又は半定量的に測定する場合には、既知の試料の濁度の程度との比較から、測定すべき試料の濁度の程度を目視により観察する方法を用いることができ、定量的に測定する場合には、簡便性及び精度の点から、上記濁度の程度を光学的に測定する方法が好ましい。
【0029】
上記目視により観察する方法としては、、試料と抗体が担持された水不溶性担体及び抗体が担持された水可溶性担体(又は多量体)を含む溶液を判定板上で混合し、揺り動かした後、凝集の有無を判定する。判定には、単に肉眼で判定する以外に、ビデオカメラで撮影し画像処理を施すことによって判定することもできる。
【0030】
上記光学的に測定する方法としては、公知の方法が用いられ、例えば、凝集塊の形成を濁度の増加としてとらえる比濁法、凝集塊の形成を粒度分布又は平均粒径の変化としてとらえる方法、凝集塊の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し透過光強度との比を比較する積分球濁度法等が挙げられる。
上記の測定法において、異なる時点で少なくとも2つの測定値を得、これらの時点間における測定値の増加分(すなわち増加速度)に基づき凝集の程度を求める速度試験(レートアッセイ)、及びある時点(通常は反応の終点と考えられる時点)で1つの測定値を得、この測定値に基づき凝集の程度を求める終点試験(エンドポイントアッセイ)を利用でき、測定の簡便性、迅速性の点から比濁法による速度試験を行うことが好ましい。
【0031】
【作用】
上述のように、本発明によれば、特定の抗原物質に対する2種以上のモノクローナル抗体の一部が水不溶性担体に担持され、例えば、残りの一部が水可溶性担体に担持されるか又は2以上の多量体とされていることにより、凝集反応の際に水不溶性担体の立体障害による凝集反応阻害が抑えられるので、特定の抗原物質との結合物を選択的に凝集させることができ、高感度に抗原物質量を測定することができる。
【0032】
【実施例】
本発明を実施例につき説明する。実施例及び比較例に用いた試薬は以下のとおりである。
〔抗ヒトAFPモノクローナル抗体〕
マウスの培養細胞上清からプロテインAにより精製した、エピトープの異なる2種のマウス抗ヒトAFPモノクローナル抗体、クローンNo.AFP4−F11(IgG−1、以下抗体Iとする)、及びクローンNo.AFP4−F67(IgG−1、以下抗体IIとする)を用いた(共にDACO社製)。
〔抗体架橋反応用緩衝液〕
200mM Na2 HPO4 と200mM NaH2 PO4 をpH8となるように混合して用いた。
〔ラテックス希釈用緩衝液、抗体希釈用緩衝液〕
50mM Na2 HPO4 と50mM NaH2 PO4 をpH7.5となるように混合して用いた。
〔ブロッキング用緩衝液〕
100mM Na2 HPO4 と100mM NaH2 PO4 をpH7.4となるように混合し、さらにウシ血清アルブミン(フラクションV、Reagent Grade 、Miles Corp.社製)を1%(W/V)になるように、またNaN3 (試薬特級、ナカライテスク社製)を0.1%(W/V)になるように添加し溶解させたものを用いた。
〔検体希釈液〕
上記ブロッキング用緩衝液に、ポリエチレングリコール6000(平均分子量7500、和光純薬社製)を3%(W/V)となるように溶解して用いた。
【0033】
(実施例1)
1)水可溶性担体試薬▲1▼の調製
抗体Iを、抗体架橋反応用緩衝液1500mlで透析した後、タンパク濃度が5mg/mlとなるように抗体架橋反応用緩衝液で希釈し、抗体液とした。
また、二塩化スベリミジン酸ジメチル(東京化成社製)11.4mgを上記抗体架橋反応用緩衝液5mlに溶解し、抗体架橋剤を調製した。
上記抗体液1mlを25℃のインキュベーター中でマグネチックスターラーで攪拌しながら、上記抗体架橋剤1μlを2分おきに計5回添加し、その後さらに10分間攪拌した。
次いで、酢酸アンモニウム(試薬特級、和光純薬社製)7.7mgを上記抗体架橋反応用緩衝液500μlに溶解して調製した抗体架橋反応停止剤5μlを添加し、この粗生成物を0.15M NaClを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.4)で平衡化したSuperose6 HR10/30(ゲル濾過カラム、ファルマシア社製)に供し、同緩衝液で0.5ml/分で溶出させ、分子量250000〜500000の画分を分取した。最終タンパク濃度が40μg/mlになるように抗体希釈用緩衝液で希釈し、水可溶性担体試薬▲1▼を調製した。
【0034】
2)AFP測定試薬▲1▼の調製
平均粒径0.304μmのポリスチレンラテックス(固形分10%(w/v)、積水化学工業社製)1容に、上記ラテックス希釈用緩衝液9容を添加希釈し、ラテックス液とした。
抗体IIは、タンパク濃度が66.7μg/mlとなるように上記抗体希釈用緩衝液で希釈し、感作抗体液とした。
上記ラテックス液600μlを25℃のインキュベーター中で、マグネチックスターラーで攪拌しながら、上記感作抗体液1200μlを素早く添加し、さらに1時間攪拌した。次いでブロッキング用緩衝液3mlを添加し、25℃で続けて2時間攪拌した。その後15℃、15000rpmで15分間遠心分離し沈殿を得た。この沈殿にブロッキング用緩衝液4mlを添加し、同様に遠心分離して沈殿を洗浄した。この洗浄操作をさらに2回行った後、ブロッキング用緩衝液1.8mlを添加し、よく攪拌し、超音波破砕機で分散処理を行った。
この分散液に上記水可溶性担体試薬▲1▼1.8mlを添加し、固形分0.17%(w/v)のAFP測定試薬▲1▼を調製した。この試薬は4℃で保存した。
【0035】
3)AFP量の測定
ヒトプール血清から精製されたAFP標準品(WHO標準品、90890I.U./ml、110μg/ml、DACO社製)を用い、生理食塩水で2000、500、100、20、10、5ng/mlにそれぞれ希釈し、各濃度のAFP標準品を調製した。また、AFP標準品を含まない生理食塩水のみのものを0ng/mlとした。
測定は、各AFP標準品20μlを分注後、直ちに上記検体希釈液210μlを添加混合し、次いで上記AFP測定試薬▲1▼30μlの添加混合を行った。
生化学用自動分析装置(日立7150型、日立製作所社製)を使用し、測定条件は温度37℃、波長570nmとした。
反応量は、AFP測定試薬添加後80秒後の吸光度と320秒後の吸光度を測定し、その差を10000倍したものを吸光度変化量とし、各AFP標準品の抗体濃度と吸光度変化量の検量線を作成した。結果を表2及び図1に示す。
【0036】
(比較例1)
1)AFP測定試薬▲2▼の調製
上記実施例1のAFP測定試薬▲1▼の調製において、分散液に水可溶性担体試薬▲1▼を添加するかわりに、ブロッキング用緩衝液1.8mlを添加したこと以外は同様にして、AFP測定試薬▲2▼を調製した。
2)AFP測定試薬▲3▼の調製
上記AFP測定試薬▲2▼の調製において、抗体として抗体Iを用いて感作抗体液としたこと以外は同様にして、AFP測定試薬▲3▼を調製した。
3)ラテックス凝集免疫試薬の調製
上記AFP測定試薬▲2▼とAFP測定試薬▲3▼を等量混合し、固形分0.17%(w/v)のラテックス凝集免疫試薬を調製した。この試薬は4℃で保存した。
4)AFP量の測定
上記実施例1のAFP量の測定において、AFP測定試薬▲1▼のかわりに、上記ラテックス凝集免疫試薬を用いたこと以外は同様にして、AFP量を測定し、検量線を作成した。結果を表2及び図1に示す。
【0037】
(実施例2)
1)抗体多量体▲1▼の調製
抗体Iの1mlを、抗体架橋反応用緩衝液1500mlで透析した後、タンパク濃度が5mg/mlになるように抗体架橋反応用緩衝液で希釈した。この抗体液1mlを56℃のインキュベーター中で30分間加熱した後、氷冷した。この後タンパク濃度が40μg/mlになるように抗体希釈用緩衝液で希釈し、抗体多量体▲1▼を調製した。
【0038】
2)AFP測定試薬▲4▼の調製
上記実施例1のAFP測定試薬▲1▼の調製において、分散液に水可溶性担体試薬▲1▼を添加するかわりに、上記抗体多量体▲1▼1.8mlを添加したこと以外は同様にして、AFP測定試薬▲4▼を調製した。この試薬は4℃で保存した。
3)AFP量の測定
上記実施例1のAFP量の測定において、AFP測定試薬▲1▼のかわりに、上記AFP測定試薬▲4▼を用いたこと以外は同様にして、AFP量を測定し、検量線を作成した。結果を表2及び図2に示す。
【0039】
(実施例3)
1)水可溶性担体試薬▲2▼の調製
抗体I及びIIを、同じ濃度で等量混合し、抗AFP抗体混合液とした。
上記実施例1の水可溶性担体試薬▲1▼の調製において、抗体Iのかわりに、上記抗AFP抗体混合液を用いたこと以外は同様にして、水可溶性担体試薬▲2▼を調製した。
2)AFP測定試薬▲5▼の調製
上記実施例1のAFP測定試薬▲1▼の調製において、抗体IIのかわりに上記抗AFP抗体混合液を用い、分散液に水可溶性担体試薬▲1▼を添加するかわりに上記水可溶性担体試薬▲2▼1.8mlを添加したこと以外は同様にして、AFP測定試薬▲5▼を調製した。この試薬は4℃で保存した。
3)AFP量の測定
上記実施例1のAFP量の測定において、AFP測定試薬▲1▼のかわりに、上記AFP測定試薬▲5▼を用いたこと以外は同様にして、AFP量を測定し、検量線を作成した。結果を表2及び図3に示す。
【0040】
(実施例4)
1)抗体多量体▲2▼の調製
上記実施例2の抗体多量体▲1▼の調製において、抗体Iのかわりに、上記実施例3で調製した抗AFP抗体混合液を用いたこと以外は同様にして、抗体多量体▲2▼を調製した。
2)AFP測定試薬▲6▼の調製
上記実施例1のAFP測定試薬▲1▼の調製において、抗体IIのかわりに上記抗AFP抗体混合液を用い、分散液に水可溶性担体試薬▲1▼を添加するかわりに上記抗体多量体▲2▼1.8mlを添加したこと以外は同様にして、AFP測定試薬▲6▼を調製した。この試薬は4℃で保存した。
3)AFP量の測定
上記実施例1のAFP量の測定において、AFP測定試薬▲1▼のかわりに、上記AFP測定試薬▲6▼を用いたこと以外は同様にして、AFP量を測定し、検量線を作成した。結果を表2及び図4に示す。
【0041】
なお、各実施例及び比較例で用いたAFP測定試薬の、担体と抗体の種類の構成を表1に示す。
【0042】
【表1】
【0043】
【表2】
【0044】
表2及び図1〜4より、実施例の本発明の試薬によって作成された検量線は、AFP低濃度域から高濃度域まで良好な直線性を示したが、比較例1の従来法によるラテックス凝集免疫試薬による検量線は、低濃度域及び高濃度域において良好な直線性を示さなかった。
これは、本発明の特定の抗原物質に対する異なる2種のモノクローナル抗体を、1種は水不溶性担体に、もう1種は水可溶性担体に担持させるか又は多量体として反応させたため、2種のモノクローナル抗体をそれぞれ水不溶性担体に担持させて反応させた場合(比較例1)と比べて、水不溶性担体の立体障害がないためと考えられる。また、低濃度域での感度も高く、モノクローナル抗体の生理活性もより高く保持されていると考えられる。
【0045】
【発明の効果】
本発明の免疫測定試薬及び免疫測定方法は上述のとおりであるので、従来のラテックス凝集免疫試薬でみられたような水不溶性担体の立体障害による凝集阻害がなく、かつより多くの抗体を用いることができ、その結果、低濃度域でも高い検出感度を示す。
従って、被検試料中の抗原物質を正確に定量することが可能となり、疾患の発見、病態の把握、治療方法の決定等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例1の免疫測定試薬と比較例1の従来法のラテックス凝集免疫試薬で、既知濃度のAFP標準品を測定したときのAFP量と吸光度変化量の相関を示すグラフである。
【図2】実施例2の免疫測定試薬と比較例1の従来法のラテックス凝集免疫試薬で、既知濃度のAFP標準品を測定したときのAFP量と吸光度変化量の相関を示すグラフである。
【図3】実施例3の免疫測定試薬と比較例1の従来法のラテックス凝集免疫試薬で、既知濃度のAFP標準品を測定したときのAFP量と吸光度変化量の相関を示すグラフである。
【図4】実施例4の免疫測定試薬と比較例1の従来法のラテックス凝集免疫試薬で、既知濃度のAFP標準品を測定したときのAFP量と吸光度変化量の相関を示すグラフである。
Claims (8)
- 特定の抗原物質に対する異なる2種以上のモノクローナル抗体と水不溶性担体からなり、上記モノクローナル抗体の一部が水不溶性担体に担持されていることを特徴とする免疫測定試薬。
- 特定の抗原物質に対する異なる2種以上のモノクローナル抗体の、少なくとも1種が担持された水不溶性担体と、少なくとも別の1種が担持された水可溶性担体とからなることを特徴とする免疫測定試薬。
- 特定の抗原物質に対する異なる2種以上のモノクローナル抗体の、少なくとも1種が担持された水不溶性担体と、少なくとも別の1種の2以上の多量体とからなることを特徴とする免疫測定試薬。
- 特定の抗原物質に対する異なる2種以上のモノクローナル抗体の混合物の、一部が担持された水不溶性担体と、一部が担持された水可溶性担体からなることを特徴とする免疫測定試薬。
- 特定の抗原物質に対する異なる2種以上のモノクローナル抗体の混合物の、一部が担持された水不溶性担体と、一部の2以上の多量体とからなることを特徴とする免疫測定試薬。
- 上記水不溶性担体がポリスチレン系ラテックスである請求項1〜5いずれかに記載の免疫測定試薬。
- 上記特定の抗原物質がアルファフェトプロテインである請求項1〜6いずれかに記載の免疫測定試薬。
- 請求項1〜7いずれかに記載の免疫測定試薬と、上記特定の抗原物質とを反応させ、凝集の度合いにより上記特定の抗原物質を測定することを特徴とする免疫測定法。
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