JPH0995497A - 新規蛋白質およびそれをコードするdna並びに該蛋白質の産生方法 - Google Patents
新規蛋白質およびそれをコードするdna並びに該蛋白質の産生方法Info
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- JPH0995497A JPH0995497A JP8193585A JP19358596A JPH0995497A JP H0995497 A JPH0995497 A JP H0995497A JP 8193585 A JP8193585 A JP 8193585A JP 19358596 A JP19358596 A JP 19358596A JP H0995497 A JPH0995497 A JP H0995497A
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Abstract
テアーゼ活性を阻害する活性を有する新規蛋白質を精
製、単離した。さらに、分子量(40,000ダルトン
前後)、N末端アミノ酸配列および部分アミノ酸配列を
決定し、それをコードする遺伝子をクローニングし、塩
基配列を決定した。さらに、この遺伝子DNAをベクタ
ーに組込み、宿主細胞を形質転換し、形質転換体を培養
して目的とする蛋白質を得た。 【効果】 本願蛋白質は、in vivoまたはin vitroでの
HGFやHGF活性化因子の活性調節因子として用いる
ことができる。また、本願蛋白質の動態解析の手段とし
て用いることができる抗体を得るための抗原やそのアッ
セイ系での標準品として用いられる。
Description
それをコードするDNAに関し、詳細には肝細胞増殖因
子活性化因子(HGF活性化因子)のプロテアーゼ活性
を阻害する活性を有する新規な蛋白質(以下、本蛋白質
を「HAI−I」と称することもある)およびそれをコ
ードする遺伝子、該遺伝子を含有してなる発現ベクタ
ー、該発現ベクターで形質転換された形質転換体、該形
質転換体を用いたHAI−Iの産生方法に関する。
F活性化因子(特開平5-103670号、同6-141859号、同6-
153946号、および同6-153966号各号公報参照;肝細胞増
殖因子(HGF)を一本鎖から二本鎖へ変換する活性を
有する因子)の正の活性制御としてその前駆体の活性化
をトロンビンが担うことが既に報告されていたが、負の
制御因子としてその生理活性を阻害する生体由来のプロ
テアーゼインヒビターは知られていなかった。そのた
め、HGF活性化因子が生体内でどのように制御されて
いるかは不明であった。また、HGF活性化因子が作用
する肝細胞増殖因子(HGF)の活性をも間接的に影響
を及ぼす可能性があり、HGFのin vivoでの作用機構
解析のためにも生体由来のプロテアーゼインヒビターの
単離、同定が求められていた。
ロテアーゼインヒビターに対する抗体を用いることでH
GF活性化因子のin vivoでの生理作用とその作用解析
や、HGFの活性化の制御機構の解析等を従来と異なる
面から行うことが可能となる。
機能、あるいは肝障害時におけるHAI−Iの働き等を
調べるためには多量のHAI−Iを必要とする。しかし
ながら、現在に至るまでHAI−Iを取得する方法とし
ては、MKN45細胞、A549細胞等のヒト癌細胞株
の培養上清を材料として、その中に微量に存在するHA
I−Iを精製するしかなかった。この方法は、人的、時
間的、価格的に必ずしも最良の方法ではなく、また、微
量なHAI−Iのみを安定に取り出すことは困難を極め
る。そこで、HAI−Iの安定かつ大量取得のために、
発現系の構築が望まれていた。
増殖因子活性化因子のプロテアーゼ活性を阻害する活性
を指標に種々の培養細胞株をスクリーニングし、ヒト癌
細胞株(MKN45細胞、A549細胞等の上皮様細胞
株)の培養上清中にその活性を持つ物質が存在すること
を見い出した。さらに、その阻害活性の本体を明らかに
すべく、MKN45細胞の培養上清から種々のカラムク
ロマトグラフィーを用いてその精製を試みた。その結
果、SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動(PAGE)による分子量が約4
0,000ダルトン付近の新規の蛋白質を見い出し、こ
れをプロテインシークエンサーで分析することにより、
この蛋白質のアミノ末端アミノ酸配列を得た。またこの
蛋白質を蛋白質分解酵素で分解し生成するペプチドを分
離した後、各ペプチドを上記と同様にしてアミノ酸配列
分析することにより部分アミノ酸配列を決定した。更
に、この部分アミノ酸配列からDNA 塩基配列を推定
し、そのオリゴヌクレオチドをプローブとしてcDNA
ライブラリーからスクリーニングすることにより、本蛋
白質をコードする遺伝子をクローニングすることに成功
し、本発明を完成するに至った。
DNA技術により安定かつ大量に取得するため種々の検
討をした結果、この目的に有用な、この蛋白質をコード
する発現ベクターを新たに構築し、この蛋白質の発現を
可能にした。すなわち、この蛋白質の一部または全部の
アミノ酸配列をコードするDNA断片を、例えば、動物
細胞発現ベクターpME18S等のプラスミドベクター
あるいは酵母、大腸菌等における発現ベクターのプロモ
ーターの下流に挿入した蛋白質発現用プラスミドを作製
し、該プラスミドで宿主細胞を形質転換することにより
得られる形質転換体が優れたHAI−I産生能を有する
ことを見いだし、本発明を完成するに至った。
(1)SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
分子量が約40,000ダルトンであり、(2)肝細胞
増殖因子活性化因子のプロテアーゼ活性を阻害する活性
を有し、(3)配列表の配列番号1〜7のいずれかに記
載のアミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸
配列を有する蛋白質;配列表の配列番号1〜7に記載の
アミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列
を有し、肝細胞増殖因子活性化因子のプロテアーゼ活性
を阻害する活性を有する蛋白質;配列表の配列番号8に
記載のアミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ
酸配列を有する蛋白質;配列表の配列番号8に記載のア
ミノ酸配列において36番目のグリシンから513番目
のロイシンまでの配列またはこれと実質的に同一のアミ
ノ酸配列を有する蛋白質;それらの蛋白質をコ−ドする
DNAおよび遺伝子;該DNAまたは遺伝子を含有して
なる発現ベクター;該発現ベクターで宿主細胞を形質転
換することにより得られる形質転換体;ならびに該形質
転換体を培養することによる肝細胞増殖因子活性化因子
のプロテアーゼ活性を阻害する活性を有する蛋白質の産
生方法に存する。
は他の相補的な塩基配列を省略し一本鎖のみを記載し
た。この遺伝子より組み換えDNA技術により、例えば
配列表の配列番号8に示すアミノ酸配列を有する当該蛋
白質を発現することができる。この時、当該蛋白質をコ
ードするmRNAから翻訳される蛋白質はシグナル配列
を含んでいるが、細胞から分泌される場合にはシグナル
配列が切断され配列表の配列番号8に示すアミノ酸配列
の36番目のグリシン残基以降のアミノ酸配列を有する
当該蛋白質が産生される。シグナル配列として、他の蛋
白質のシグナル配列を利用することもできる。また、宿
主細胞内にシグナル配列のない成熟型蛋白質を発現させ
る場合は、当該蛋白質をコードする遺伝子として配列表
の配列番号8に示す塩基配列のうち106番目のグアニ
ン残基から以降の塩基配列を有する遺伝子をベクターの
ATGコドンにつなげて使用すればよい。さらに本発明
においては、HGF活性化因子のプロテアーゼ活性を阻
害する活性を損なわない範囲内で、一部のアミノ酸もし
くは核酸を除去、変更あるいは追加する等の改変を行っ
たもの、即ち「実質的に同一なアミノ酸配列」および
「実質的に同一な塩基配列」を有するものも本発明に含
まれる。
に、本発明のプロテアーゼインヒビター活性を有する新
規な蛋白質は、以下のような精製段階を経ることにより
得られる。例えば、ヒト癌細胞株(MKN45細胞、A
549細胞(それぞれ財団法人がん研究振興財団(Japa
nese Cancer Research Resources Bank)に、登録番号JC
RB0254、JCRB0076として登録)等の上皮様細胞株)を無
血清培地で数日培養して、その培養上清を回収して細胞
を除去後、濃縮して、ヘパリン−セファロースカラム
(ファルマシア社製等)に供する。その素通り画分をC
onA−セファロースカラム(ファルマシア社製等)に
供し、吸着画分と素通り画分に分離する。吸着画分をP
henyl−5PW(東ソー社製等)等の疎水クロマト
グラフィーに供する。得られた当該タンパク質を含む画
分をDEAEイオン交換カラムクロマトグラフィー(ポ
リマーラボラトリー社製等)に供し、その後、ハイドロ
キシアパタイトカラム(三井東圧化学社、生化学工業社
等)に供す。その後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィ
ー(旭化成社製GS520等)に供し、当該蛋白質を得
ることができる。必要に応じて、逆相カラムクロマトグ
ラフィー等を精製のステップに組み込むこともできる。
アクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約40,0
00ダルトンで、糖鎖、アミノ酸残基の修飾、C末端側
の変異の相違と思われる数本のフラグメントもしくはス
メアーなバンドとして泳動する。当該蛋白質はHGF活
性化因子と反応させることで、HGF活性化因子のプロ
テアーゼ活性を阻害する活性を有する。また、本発明の
蛋白質は下記実施例2の表1に記載のアミノ酸配列を含
む。
DNA断片は次のようにして得ることができる。上記の
ようにして精製した新規蛋白質を気相プロテインシーケ
ンサー(アプライド・バイオシステムズ社製等)で分析
することにより、アミノ末端アミノ酸配列を決定するこ
とができる。更に、当該蛋白質をリジルエンドペプチダ
ーゼ(アクロモバクタープロテアーゼI等)で分解し、
生成するペプチド断片を逆相高速液体クロマトグラフィ
ー(YMC社製等)で分離した後、各ペプチド断片を上
記と同様にしてアミノ酸配列分析すれば、蛋白質内部の
アミノ酸配列を知ることができる。
塩基配列を推定し、オリゴヌクレオチドを合成してプロ
ーブとして使用する。当該蛋白質をコードする遺伝子を
スクリーニングするcDNAライブラリーとしてはヒト
由来の肝臓cDNAライブラリー、脾臓cDNAライブ
ラリー、胎盤cDNAライブラリー等(クローンテック
社製等)が利用できる。その他当該蛋白質を発現してい
る細胞株および組織材料から常法に従ってcDNAライ
ブラリーを作成してもよい。
ージを大腸菌に感染させ(Maniatisらの方法:「モレキ
ュラークローニング」)、これを培養する。形成された
プラークを当該蛋白質の一部のアミノ酸配列から推定さ
れる塩基配列から作成したオリゴヌクレオチドをプロー
ブとしてプラークハイブリダイゼイション法に従って選
択することにより、容易に目的とする当該蛋白質のアミ
ノ酸配列を有し、なおかつ当該蛋白質のアミノ酸配列の
プローブ以外の領域に相当する塩基配列をも有する、異
なるλファージクローンをいくつか得ることができる。
からManiatisらの方法によりファージを増殖させ、その
ものからグリセロールグラディエント法に従ってDNA
を精製し適切な制限酵素で切断後、pUC18、pUC
19等のプラスミドベクターあるいはM13mp18、
M13mp19等の一本鎖ファージベクターにcDNA
をサブクローニングし、Sangerらのジデオキシ法に従っ
て目的cDNAフラグメントの塩基配列を決定すること
ができる。得られたクローンの塩基配列を解析し、それ
らを統合することにより当該蛋白質の一部をコードする
cDNA群によって配列表の配列番号8に示す当該蛋白
質の全アミノ酸配列のすべてに対応する遺伝子を得るこ
とができる。
使用し、PCR法を用いることにより、各種cDNAラ
イブラリーから、本cDNAの全てを含む遺伝子、本c
DNAの一部の塩基配列が欠失した遺伝子、本cDNA
に他の塩基配列が挿入された遺伝子もしくは本cDNA
の一部の塩基配列が他の塩基配列に置換された遺伝子な
ども得ることができる。このような塩基配列の欠失、付
加あるいは置換等の部位特異的変異は、Method in Enzy
mol., 217, 218-227(993)、同217, 270-279(1993)
等に記載の方法により容易に行うことができる。
塩基配列の順番が本蛋白質のアミノ酸配列に従う形でつ
なぎ、当該蛋白質の全領域を含むDNA断片とし、これ
をpCDL−SRα296等のプラスミドのプロモータ
ーの下流に翻訳開始コドンATGとフェーズを合わせ
て、蛋白質発現用プラスミドを構築し、当該プラスミド
で形質転換された動物細胞の宿主内等で当該蛋白質を発
現させることができる。続いて常法に従い精製し、発現
された当該蛋白質を得ることができる。
cDNAをpME18S等のプラスミドのプロモーター
の下流に挿入して、蛋白質発現用プラスミドを構築し、
当該プラスミドで形質転換された動物細胞の宿主等で、
当該蛋白質、当該蛋白質の一部のアミノ酸配列が欠失し
た蛋白質、当該蛋白質に他のアミノ酸配列が挿入された
蛋白質もしくは当該蛋白質の一部のアミノ酸配列が他の
アミノ酸配列に置換された蛋白質を発現させることがで
きる。具体的には、動物細胞としてCHO細胞、COS
細胞、マウスL細胞、マウスC127細胞、マウスFM
3A細胞等を用いて発現させることが可能である。これ
らの動物細胞等を宿主とする場合は、シグナル配列とし
て、配列表の配列番号8に示すDNA塩基配列、すなわ
ち当該蛋白質の遺伝子の1から35番目の塩基配列もし
くは既存のシグナル配列を使用することにより、当該蛋
白質が細胞外に分泌生産、もしくは細胞膜表面上に生産
されることが期待される。
次のように構築される。プロモーターとしては全ての既
存のプロモーターが使用可能であるが、例えばSRαプ
ロモーター、SV40プロモーター、またはメタルチオ
ネイン遺伝子のプロモーターが使用できる。このプロモ
ーター下流に上記シグナル様配列を含む当該蛋白質の遺
伝子の全てを含むDNA、本遺伝子の一部の塩基配列が
欠失したDNA、本遺伝子に塩基配列が挿入されたDN
Aもしくは本遺伝子の一部の塩基配列が別の塩基配列に
置換されたDNAを転写方向にしたがって挿入する。
には該プロモーターの下流に当該蛋白質をコードする遺
伝子のDNA断片を2〜3個結合したものを挿入しても
よい。また当該蛋白質をコードする遺伝子のDNA断片
の5’上流側にSV40などのプロモーターを結合した
DNA断片を単位としたものを転写方向を揃えて2〜3
個結合してベクターに挿入してもよい。
にはポリアデニル化部位を付加する。例えば、SV40
DNA、β−グロビン遺伝子またはメタルチオネイン
遺伝子由来のポリアデニル化部位が当該蛋白質をコード
する遺伝子の下流に付加することが可能である。また、
プロモーターと当該蛋白質をコードする遺伝子を結合し
たDNA断片を2〜3個結合する場合には、各単位の当
該蛋白質をコードする遺伝子の3’側にそれぞれポリア
デニル化部位を存在させることもできる。この発現ベク
ターを用いて、動物細胞、例えばCHO細胞を形質転換
する際に、薬剤耐性遺伝子を使用し、目的とする発現細
胞を選択することが可能である。
ト耐性を与えるDHFR遺伝子(ジャーナルオブモレキ
ュラバイオロジー(J. Mol. Biol.)159巻601頁(198
2))、抗生物質G−418耐性を与えるNeo遺伝子
(ジャーナルオブモレキュラアプライドジェネティクス
(J. Mol. Appl. Genet.)1巻327頁(1982))、ミコフ
ェノール酸耐性を与える大腸菌由来のEcogpt遺伝
子(プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサ
イエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.)78巻2072
頁(1981))、抗生物質ハイグロマイシン耐性を与える
hph遺伝子(モレキュラセルバイオロジー(Mol. Cel
l. Biol.)5巻410頁(1985))等が挙げられ、各耐性遺
伝子の5’上流側にはプロモーター、例えば前述のSV
40由来のプロモーターが挿入されており、各耐性遺伝
子の3’下流側には、前述のポリアデニル化部位が含ま
れる。
遺伝子を挿入する場合、当該蛋白質をコードする遺伝子
のポリアデニル化部位下流に順方向あるいは逆方向に挿
入すればよい。これらの発現ベクターは、形質転換体を
得る際に選択マーカー遺伝子を含む別のプラスミドを二
重形質転換する必要がない。また当該蛋白質の発現ベク
ターにこれらの選択マーカー遺伝子が挿入されていない
場合には、形質転換体の選択のマーカーを有するベクタ
ー、例えばpSV2neo(ジャーナルオブモレキュラ
アプライドジェネティクス(J. Mol. Appl. Genet.)1
巻327頁(1982))、pMBG(ネイチャー(Nature)2
94巻228頁(1981))、pSV2gpt(プロシーディ
ングオブナショナルアカデミーオブサイエンス(Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A.)78巻2072頁(1981))、p
Ad-D26-1(ジャーナルオブモレキュラバイオロジ
ー(J. Mol. Biol.)159巻601頁(1982))などを当該
蛋白質をコードする遺伝子の発現ベクターと共に形質転
換し、薬剤耐性遺伝子の表現形質により形質転換体を容
易に選択できる。
酸カルシウム法(ヴァイロロジー(Virology)52巻456
頁(1973))、エレクトロポレーション法(ジャーナル
オブメンブレンバイオロジー(J. Membr. Biol.)10巻2
79頁(1972))等により行うことができる。
より浮遊培養または付着培養で行うことができる。培地
としては、MEM、RPMI1640などを用い、5〜
10%血清の存在下もしくは適当量のインシュリン、ト
ランスフェリン等の存在下、もしくは無血清下にて培養
する。さらに当該蛋白質を、酵母や大腸菌、例えば、Sa
ccharomyes cerevisiae株や Escherichia coli YA-21株
等の微生物を使用して生産することも出来る。
上清中、もしくは細胞表面上に当該蛋白質を発現するこ
とから、この組換え体の培養上清もしくは細胞を用いて
当該蛋白質の分離精製を行うことが可能である。具体的
には、生産された当該蛋白質を含む培養上清もしくは細
胞抽出液を各種クロマトグラフィー、例えば、ヘパリン
−セファロース、ConA−セファロース、ハイドロキ
シアパタイト等を組み合わせたクロマトグラフィーにて
精製することにより当該蛋白質を単離精製することがで
きる。
ー活性を有する蛋白質は、HGF活性化因子のプロテア
ーゼ活性を阻害する活性を持つため、in vivoまたはin
vitroでのHGF活性化因子の調節因子として、また、
間接的にはHGFの活性の調節因子として、さらにはそ
れら因子の機能解析の道具、手段として、当該蛋白質に
対する抗体、当該蛋白質をコードする遺伝子も含めて使
用される。
入された発現ベクターを動物細胞に導入することにより
今まで困難であった生物学的活性のある当該蛋白質の一
部または全部あるいは当該蛋白質様蛋白質を、大量、安
定かつ容易に生産することが可能となる。
細に説明するが、本発明は、その要旨を越えない限り、
以下の実施例によって限定されるものではない。
いての当該蛋白質の精製 MKN45細胞[内藤ら、癌と化学療法、5、89(197
8);免疫生物研究所から入手]をローラーボトル85
0の5%FBSを含むeRDF培地中に播種して、コン
フルエントな状態になるまで増殖させた。増殖後、FB
Sを含む培養液を除去後、無血清eRDF培地で2度洗
浄した。洗浄用培地を除去後、無血清eRDF培地50
0mlを加えて3〜6日間37℃でインキュベーション
した。インキュベーション後、培養液を回収して、新し
い無血清eRDF培地500mlを加えて再度インキュ
ベーションした。これを数回繰り返して、回収した培養
上清をYM30限外濾過膜(アミコン社製)にて約20
倍にまで濃縮した。
ム(PBSで平衡化)に供し、その素通り画分を回収し
た。このヘパリンカラム素通り画分を、ConA−セフ
ァロースカラム(PBSで平衡化)に供し、素通り画分
と、200mM α−メチルD−マンノシドを含むPB
S溶液での溶出画分に分離した。ConA吸着画分をY
M30を用いて濃縮、1M硫酸アンモニウムを含む10
mMリン酸緩衝液(pH6.8)溶液へ緩衝液置換を行
い、Phenyl−5PW(東ソー社製;1M硫酸アン
モニウムを含む10mMリン酸緩衝液(pH6.8)で
平衡化)を用いたHPLCに供し、1M硫酸アンモニウ
ムから0Mへの直線濃度勾配溶出を行い、目的のプロテ
アーゼインヒビター活性が存在する画分を回収した。
mMトリス/塩酸緩衝液(pH8)に透析後、DEAE
(0.05%CHAPSを含む20mMトリス/塩酸緩
衝液(pH8)で平衡化)を用いたHPLCに供し、0
Mから500mM NaClへの直線濃度勾配溶出を行
い、目的のプロテアーゼインヒビター活性が存在する画
分を回収した。当画分を0.05%CHAPSを含む5
mMリン酸緩衝液(pH 6.8)に透析して、HCA
A−4007カラム(三井東圧化学社製)(0.05
%CHAPSを含む5mM リン酸緩衝液(pH 6.
8)で平衡化)を用いたHPLCに供し、その素通り画
分を回収した。当画分をGS−520(0.05%CH
APSを含むPBSで平衡化)に供し、活性画分(約5
0〜30kDa付近の画分)を回収した。マイナーバン
ドを除去するため、当画分をYMC packC4カラ
ム(YMC社製)に供し、0.1%TFAを含むアセト
ニトリル/イソプロピルアルコール(3/7)濃度10
%から50%まで30分間の直線濃度勾配溶出を行い、
活性画分を1Mトリス/塩酸緩衝液(pH8)にて中和
後、減圧下で乾燥させた。乾燥後、0.05%CHAP
Sを含むPBSに溶解して、精製蛋白質を得た。
酸配列および部分アミノ酸配列の決定 実施例1に従って精製し、逆相HPLCで溶出させたプ
ロテアーゼインヒビター活性を有する蛋白質を、中和せ
ずに減圧下で乾燥させた。これを、50%TFA(トリ
フルオロ酢酸)60μlに溶解し、ポリブレン処理した
グラスフィルターに添加し、Applied Biosystems社製4
70Aシークエンサーでエドマン分解し、N末端領域の
アミノ酸配列を決定した。フェニルヒダントイン(PT
H)アミノ酸の同定は、三菱化学社製MCI gel
ODS IHU(0.46x15cm)カラムを用い、
酢酸緩衝液(10mM酢酸緩衝液(pH4.7)、0.
01%SDS、38%アセトニトリル)による単一溶媒
溶出法を流速1.2ml/分、温度43℃で行い、PT
Hアミノ酸の検出は269nmの吸光度で行った。
を同定した。次に、同じく実施例1に従って精製し、逆
相HPLCで溶出させたプロテアーゼインヒビター活性
を有する蛋白質を、4M尿素を含む50mMトリス塩酸
(pH9.0)100μlに溶解し、これにリジルエン
ドペプチダーゼ(アクロモバクタープロテアーゼI)を
添加して37℃で8時間反応させた。生成したペプチド
混合物はYMC pack C8カラム(YMC社)を
用いた逆相HPLCにより分離して各ペプチド断片を得
た。6つのペプチドについて気相プロテインシークエン
サー(Applied Biosystems社製 model470A)を用いて
アミノ酸配列分析を行ったところ、表1に示す配列が見
い出された。
a-Gly-Ala-Asp-Cys-Leu-Asn-Ser-Phe-Thr-Ala-Gly-Val-
Pro-Gly-Phe-Val-Leu-Asp-Thr-Xaa-Ala-Ser-Val-Ser-As
n-Gly-Ala-Thr-Phe(配列表の配列番号1) 部分アミノ酸配列 1:Val-Gln-Pro-Gln-Glu-Pro-Leu-Val-Leu-Lys(配列
表の配列番号2) 2:Asp-Val-Glu-Asn-Thr-Asp-Trp-Arg-Leu-Leu-Arg-Gl
y-Asp-Thr-Asp-Val-Arg-Val-Glu-Arg-Lys(配列表の配
列番号3) 3:Ala-Trp-Ala-Gly-Ile-Asp-Leu-Lys(配列表の配列
番号4) 4:Ser-Xaa-Val-Tyr-Gly-Gly-Xaa-Leu-Gly-Asn-Lys
(配列表の配列番号5) 5:Asp-Pro-Asn-Gln-Val-Glu-Leu-Trp-Gly-Leu-Lys
(配列表の配列番号6) 6:Asn-Asn-Tyr-Leu-Arg-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Leu-Al
a-Xaa-Arg-Gly-Val-Gln(配列表の配列番号7) (配列中、Xaaは未決定のアミノ酸を示す。)
ての当該蛋白質の精製とアミノ酸配列解析 A549細胞[財団法人がん研究振興財団(Japanese C
ancer Research Resources Bank)から入手]を実施例1
と同様に培養して培養上清を調製した。その培養上清を
用いて実施例1と同じ操作によって、HGF活性化因子
のプロテアーゼ活性を阻害する活性を持つ蛋白質を得
た。この蛋白質はSDS−PAGE上、MKN45細胞
由来のものと同じ分子量を示した。また、この蛋白質の
N末端領域のアミノ酸配列を実施例1と同様の方法で決
定した。この結果、その配列はMKN45細胞由来と同
じであった。このことより、当該蛋白質はMKN45由
来の蛋白質と同じである可能性が示された。
のプロテアーゼ活性を阻害する活性を測定する方法とそ
の活性 測定しようとするサンプル1〜10μlを、2〜5ng
血清由来HGF活性化因子を含むPBS、0.05%C
HAPS溶液30〜40μlに添加した。37℃で30
分間インキュベーション後、5〜10μgの一本鎖HG
Fを添加し、さらに2時間インキュベーションを継続し
た。この混合液を、還元条件下でSDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動に供した。電気泳動後、クマシーブ
リリアントブルーR250(CBB)で染色し、一本鎖
HGFと二本鎖HGFの割合を比較することで、活性を
検出した。
清由来HGF活性化因子をPBS、0.05%CHAP
S溶液30〜40μl中で37℃で30分間インキュベ
ーションした後、10μg一本鎖HGFを添加し、さら
に2時間インキュベーションを継続した。この混合液
を、還元条件下でSDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動に供し、電気泳動後、CBBで染色した。結果を図
1に示す。図中、1はHGF活性化因子と当該蛋白質を
無添加の場合を、2はHGF活性化因子を添加、当該蛋
白質無添加の場合を、3はHGF活性化因子と当該蛋白
質を添加した場合の結果を表す。当該蛋白質の添加によ
り、HGF活性化因子のHGFを一本鎖から二本鎖に変
換する活性が抑制された。
ル電気泳動 MKN45細胞の培養上清とA549細胞の培養上清よ
り実施例1と2に従って精製されたプロテアーゼインヒ
ビター活性を持つ当該蛋白質の見かけ上の分子量を求め
るため、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
った。最終的に精製された当該蛋白質を12.5%のポ
リアクリルアミド・スラブゲルを用いたSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動に、非還元下で供した。分子
量マーカーとしては、分子量マーカー「第一」III Laem
mli法用(第一化学薬品社製)を用いた。電気泳動後、
銀染色試薬(関東化学社製)を用いて発色させた。当該
蛋白質と標準分子量マーカーの蛋白質との泳動距離の相
対的比較により、MKN45細胞の培養上清とA549
細胞の培養上清から得られた当該蛋白質は、SDS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動上のみかけの分子量とし
て約40,000ダルトン前後に糖鎖、アミノ酸残基の
修飾または末端領域の相違によるものと思われる数本の
フラグメントもしくはスメアーなバンドを示した。
のクローニングおよび塩基配列の決定 実施例2により得られた当該蛋白質のN末端アミノ酸配
列(配列表の配列番号1)に含まれる、Gly-Ala-Asp-Cy
s-Leu-Asn および Gly-Phe-Val-Leu-Asp-Thrの配列を基
に推定可能な二種類のオリゴヌクレオチドプライマー
(プライマー1およびプライマー2)を作成した。ま
た、当該蛋白質の部分アミノ酸配列(配列番号1)の中
で、Ser-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly (配列番号5)およびGl
n-Val-Glu-Leu-Trp-Gly (配列番号6)の配列を基に推
定可能な二種類のオリゴヌクレオチドプライマー(プラ
イマー3およびプライマー4)を作成した。これらプラ
イマーの配列を以下に示す。
列番号:9)および5'-GGNGCNGAYTGYCTNAA-3'(配列表
の配列番号:10)の混合物 プライマー2:5'-GTRTCYAANACRAANCC-3'(配列表の配
列番号:11)および5'-GTRTCNAGNACRAANCC-3'(配列
表の配列番号:12)の混合物 プライマー3:5'-CCNCCRTANACRAANGA-3'(配列表の配
列番号:13)および5'-CCNCCRTANACRAARCT-3'(配列
表の配列番号:14)の混合物 プライマー4:5'-CCCCANAGYTCNACYTG-3'(配列表の配
列番号:15)および5'-CCCCAYAAYTCNACYTG-3'(配列
表の配列番号:17)の混合物 (配列中、N=A, G, CまたはT、Y= C または T、R=A ま
たはGを示す。)
りトータルRNAをアナリティカルバイオケミストリー
(Anal. Biochem.)162卷156頁(1987)記載の方法に従
って調製し、これをオリゴ(dT)カラムに供すことに
よりpoly−(A)+RNAを調製した。
当するcDNA断片の取得を試みた。 MKN45細胞
より調製したpoly−(A)+RNAを鋳型とし、先
に作成した二種類のオリゴヌクレオチドプライマー(プ
ライマー1及びプライマー2)を用いてRT−PCR
(reverse transcription-polymerase chain reactio
n、羊土社、林 件志 編、1995年2月5日発刊「PCR法
の最新技術」p44-p52参照)を行った。このRT−PC
Rにて得られた反応液をポリアクリルアミドゲル電気泳
動法にて解析した結果、約56bpのDNA断片が検出
された。そこでこのDNA断片をポリアクリルアミドよ
り抽出後、フェノールクロロホルム処理およびエタノー
ル沈殿を行いDNA断片を回収後、ダイデオキシ法にて
塩基配列を決定した。
マーを5'-AACAGCTTTACCG-3'(プライマー5)(配列表
の配列番号:16)を作成し、以下の当該cDNA取得
に使用した。先に調製したMKN45細胞株のpoly
−(A)+RNAを鋳型とし、プライマー3及びプライ
マー5を使用してPCRを行った。更に、得られたPC
R増幅DNA、プライマー4及びプライマー5を用いて
PCRを行った結果、480bpの当該蛋白質特異的な
DNAフラグメントを取得した。ここに得られた480
bpのDNAフラグメントをモレキュラークローニング
(コールドスプリングハーバーラボラトリー、1982年)
に記載の方法に従って32P標識し、これをスクリーニン
グ用プローブとした。
のライブラリーとして、ヒト胎盤cDNAライブラリー
(クローンテック社製)を用いた。まず大腸菌Y−10
90株に、約4x105プラークとなるようにヒト胎盤
cDNAライブラリー(λgt11、クローンテック社
製)として調製されているファージを感染させ、NZY
培地中で42℃一晩培養した。次にジーンスクリーニン
グプラス(デュポン社製)にトランスファーさせた。そ
のメンブレンを0.1M水酸化ナトリウム/0.5Mト
リス塩酸バッファー(pH7.5)が染み込んだ濾紙上
に2分間静置し、続いて1.5M塩化ナトリウム/0.
5Mトリス塩酸バッファー(pH7.5)が染み込んだ
濾紙上で5分間静置した。この一連の処理を更に2回繰
り返した後、2xSSC(2倍SSC)で洗浄し、乾い
た濾紙上で風乾した。さらにこのメンブレンを20mJ
/cm2でUV照射することにより、メンブレンに移し
たDNAの固定を行った。こうして処理したメンブレン
を50mMトリス塩酸バッファー(pH7.5)、1M
塩化ナトリウムおよび1%SDSよりなる溶液50ml
に浸漬し、65℃で2時間保持した。
g/ml、鮭***DNA100μg/ml、50mMト
リス塩酸バッファー(pH7.5)、1M塩化ナトリウ
ムおよび1%SDSよりなる溶液40mlに浸漬し、6
5℃で16時間保持した。その後、このメンブレンを2
xSSCで室温5分間、0.1xSSCで室温30分間
2回の順に洗浄した後、オートラジオグラフィーを行
い、84個の当該蛋白質cDNAを含むと考えられるポ
ジティブクローンを得た。
Mバッファー(50mMトリス塩酸バッファー(pH
7.5)、100mM塩化ナトリウム、10mM硫酸マ
グネシウムおよび0.01%ゼラチン)と20μlのク
ロロホルムによりファージを抽出した。上記100μl
のファージ抽出液と100μlの10mM硫酸マグネシ
ウムに懸濁した大腸菌Y−1090株とを混合した後、
9cmのLB寒天培地に、3mlの上層寒天培地ととも
にまき、37℃で一晩培養した。プラークの形成を確認
した後、3mlのSMバッファーとクロロホルムを数滴
加え、室温で1時間放置した。ファージを含むこのSM
バッファーを回収し、8000rpm、10分間遠心
し、上清を回収した。
−1090株300μlを混合した後、10mM硫酸マ
グネシウムを含む10mlのLB培地に加え、37℃で
振盪培養した。溶菌後、クロロホルムを数滴加え、更に
10分間振盪し、10、000rpm、5分間遠心し
た。上清を回収し、終濃度5μg/mlのDNaseI
および2μg/mlのRNaseAを加え、37℃で3
0分間静置した。続いて5gのNaClおよび1.1g
のPEG6000を加え、4℃で1時間放置し、10、
000rpmで15分間遠心して、沈殿を回収した。こ
の沈殿をSMバッファー400μlに懸濁した。さらに
フェノール/クロロホルム処理およびエタノール沈殿を
行い、当該蛋白質cDNAを含むファージDNAを取得
した。次に、このDNAを制限酵素EcoRIにて切断
し、アガロースゲル電気泳動により、cDNA断片を解
析した。
DNA断片を分離および抽出後、プラスミドベクターP
UC19のEcoRIサイトに挿入し、当該蛋白質cD
NAを含むプラスミドベクターpHAIを作成した。得
られたプラスミドベクターpHAIに挿入されたcDN
Aの塩基配列を解析し、当該蛋白質をコードする全遺伝
子の塩基配列を決定した(配列表の配列番号8)。
製 実施例6によって得られた当該蛋白質cDNAを含むプ
ラスミド(pHAI)は制限酵素EcoRIで処理する
ことにより、プラスミドベクターpUC19と全長の当
該蛋白質cDNA断片(翻訳開始コドンである塩基配列
ATGと終止コドンであるTGAを含む全長の当該蛋白
質cDNA断片)を分離することが可能である。そこで
Maniatisらの方法(「モレキュラークローニング」、コ
ールドスプリングハーバーラボラトリー、164頁(198
2))に従い、アガロースゲル電気泳動を行い、当該蛋
白質cDNAを含む約2.4kbのEcoRI−Eco
RIDNA断片を分離および抽出した。得られた当該蛋
白質cDNA断片の末端をT4DNAポリメラーゼにて
平滑末端にした。この後、フェノールクロロホルム抽出
およびエタノール沈澱を行い、10μlの水に溶解し
た。
カルイミュノロジー、20卷27頁(1990))は制限酵素X
hoIで切断後、末端をT4DNAポリメラーゼにて平
滑末端にした。この後、フェノールクロロホルム抽出お
よびエタノール沈澱を行い、400μlの50mM T
ris−HCl(pH8)、1mM MgCl2溶液に
溶解した。さらにバクテリアルアルカリホスファターゼ
(東洋紡、BAP−101)1unitを添加し、65
℃下30分の反応を施し脱燐酸化処理を行った。次にこ
の反応液からフェノールクロロホルム抽出とエタノール
沈澱により制限酵素XhoIで切断されたpME18S
ベクターを精製し、10μlの水に溶解した。
0.01μgと前述の平滑末端化された当該蛋白質cD
NAのEcoRI断片0.1μgを含む溶液20μl
(66mM Tris−HCl(pH7.6)、6.6
mM MgCl2、10mMジチオトレイトール、66
μM ATP)をT4DNAリガーゼ(東洋紡LGA−
101)存在下で14℃で12時間反応させ、両DNA
断片の結合反応を行った。
B101株(宝酒造)を形質転換し、アンピシリンを5
0μg/mlの濃度で含む培地上で培養することにより
数十個のアンピシリン耐性株を得た。これらの組換え体
をManiatisらの方法(「モレキュラークローニング」、
コールドスプリングハーバーラボラトリー、86頁〜96頁
(1982))に従い解析することにより、発現ベクターp
ME18Sのプロモーターとポリアデニレーション部位
の中間に存在する制限酵素XhoI切断部位に当該蛋白
質をコードする遺伝子が挿入されたプラスミド、pME
18S−HAIプラスミドを得た。その構造を図2に示
す。
取得 実施例7で作製された発現ベクターpME18Sの制限
酵素XhoI切断部位に当該蛋白質cDNAが挿入され
たプラスミドpME18S−HAIを、Maniatisらの方
法(「モレキュラークローニング」、コールドスプリン
グハーバーラボラトリー、86頁〜96頁(1982))に従
い、組換え体の大腸菌から回収、精製し当該蛋白質発現
プラスミドDNAを大量に得た。
が10%入ったeRDF培地中でセミコンフルエントな
状態になるまで培養した。次にシャーレから培地を除き
そこにDNA溶液を滴加するが、DNA溶液は予め次に
示す手順に従って調製した。まず直径9cmのシャーレ
一枚につき300μlの2xHEBS溶液(2xHEB
S溶液;1.6%塩化ナトリウム、0.074%塩化カ
リウム、0.05%燐酸水素二ナトリウム12水塩、
0.2%デキストロース、1%HEPES(pH7.0
5))と10μgのプラスミドDNAを加え、滅菌水で
570μlに合わせた溶液を、エッペンドルフ遠心管中
に準備する。次に該DNA溶液に30μlの2.5Mの
塩化カルシウム溶液を滴加しながらボルテックスミキサ
ーを用い数秒間激しく混和する。これを室温で30分間
放置するが、その間およそ10分おきにボルテックスミ
キサーで混和する。
胞にかけて室温で30分間静置した。その後FBSが1
0%入ったeRDF培地(極東製薬社製)9mlをシャ
ーレに入れて37℃、5%CO2存在下で4〜5時間培
養した。次にシャーレから培地を除き5mlの1xTB
S++溶液(1xTBS++溶液;25mMトリス−塩
酸(pH7.5)140mM塩化ナトリウム、5mM塩
化カリウム、0.6mM燐酸水素二ナトリウム、0.0
8mM塩化カルシウム、0.08mM塩化マグネシウ
ム)で細胞を洗浄し、1xTBS++溶液を除去した
後、DMSO(ジメチルスルホキサイド)を10%含む
1xHEBS溶液を、5ml細胞にかけて室温で1〜2
分間静置した後上清を除去した。その後5mlの1xT
BS++溶液で細胞を再び洗浄しFBSが10%入った
eRDF培地10mlをシャーレに入れて37℃、5%
CO2存在下で培養し、48時間が経過した時点で培地
を回収した。回収した培養上清を20倍に濃縮して、H
GF活性化因子に対する阻害活性を上述の実施例4と同
様にして測定したところ、阻害活性が確認された。
はA又はGを示す。 配列 GGNGCNGAYT GYTTRAA 17
はA又はGを示す。 配列 GGNGCNGAYT GYCNRAA 17
はA又はGを示す。 配列 GTRTCYAANA CRAANCC 17
性を阻害する活性を測定した結果を表す図である。
図である。
Claims (21)
- 【請求項1】 下記の理化学的性質を有する蛋白質。 (1)SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
分子量が約40,000ダルトンであり、(2)肝細胞
増殖因子活性化因子のプロテアーゼ活性を阻害する活性
を有し、(3)配列表の配列番号1〜7のいずれかに記
載のアミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸
配列を有する。 - 【請求項2】 配列表の配列番号1〜7に記載のアミノ
酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列を有
し、肝細胞増殖因子活性化因子のプロテアーゼ活性を阻
害する活性を有する蛋白質。 - 【請求項3】 配列表の配列番号8に記載のアミノ酸配
列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋
白質。 - 【請求項4】 配列表の配列番号8に記載のアミノ酸配
列において36番目のグリシンから513番目のロイシ
ンまでの配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列
を有する蛋白質。 - 【請求項5】 請求項1記載の蛋白質をコードするDN
A。 - 【請求項6】 請求項2記載の蛋白質をコードするDN
A。 - 【請求項7】 請求項3記載の蛋白質をコードするDN
A。 - 【請求項8】 配列表の配列番号8に記載の塩基配列ま
たはこれと実質的に同一の塩基配列で表わされることを
特徴とする請求項7記載のDNA。 - 【請求項9】 請求項4記載の蛋白質をコードするDN
A。 - 【請求項10】 配列表の配列番号8に記載の塩基配列
において106番目のグアニンから1542番目のアデ
ニンまでの塩基配列またはこれと実質的に同一の塩基配
列で表わされることを特徴とする請求項9記載のDN
A。 - 【請求項11】 請求項1記載の蛋白質をコードする遺
伝子。 - 【請求項12】 請求項2記載の蛋白質をコードする遺
伝子。 - 【請求項13】 請求項3記載の蛋白質をコードする遺
伝子。 - 【請求項14】 配列表の配列番号8に記載の塩基配列
またはこれと実質的に同一の塩基配列で表わされること
を特徴とする請求項13記載の遺伝子。 - 【請求項15】 請求項4記載の蛋白質をコードする遺
伝子。 - 【請求項16】 配列表の配列番号8に記載の塩基配列
において106番目のグアニンから1542番目のアデ
ニンまでの塩基配列またはこれと実質的に同一の塩基配
列で表わされることを特徴とする請求項15記載の遺伝
子。 - 【請求項17】 請求項5から16のいずれかに記載の
DNAまたは遺伝子を含有してなる発現ベクター。 - 【請求項18】 請求項17記載の発現ベクターで宿主
細胞を形質転換することにより得られる形質転換体。 - 【請求項19】 宿主細胞が動物細胞であることを特徴
とする請求項18記載の形質転換体。 - 【請求項20】 請求項18または19記載の形質転換
体を培養して肝細胞増殖因子活性化因子のプロテアーゼ
活性を阻害する活性を有する蛋白質を産生することを特
徴とする肝細胞増殖因子活性化因子のプロテアーゼ活性
を阻害する活性を有する蛋白質の産生方法。 - 【請求項21】 蛋白質が請求項1から4のいずれかに
記載の蛋白質であることを特徴とする請求項20記載の
蛋白質の産生方法。
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JP19358596A JP3896608B2 (ja) | 1995-07-24 | 1996-07-23 | 新規蛋白質およびそれをコードするdna並びに該蛋白質の産生方法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP18713595 | 1995-07-24 | ||
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Publication Number | Publication Date |
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JPH0995497A true JPH0995497A (ja) | 1997-04-08 |
JP3896608B2 JP3896608B2 (ja) | 2007-03-22 |
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Family Applications (1)
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Country | Link |
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-
1996
- 1996-07-23 JP JP19358596A patent/JP3896608B2/ja not_active Expired - Lifetime
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