JPS61192288A - ヒトエラスタ−ゼ２の生物工学的製造 - Google Patents
ヒトエラスタ−ゼ２の生物工学的製造Info
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- JPS61192288A JPS61192288A JP60034049A JP3404985A JPS61192288A JP S61192288 A JPS61192288 A JP S61192288A JP 60034049 A JP60034049 A JP 60034049A JP 3404985 A JP3404985 A JP 3404985A JP S61192288 A JPS61192288 A JP S61192288A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6448—Elastases, e.g. pancreatic elastase (3.4.21.36); leukocyte elastase (3.4.31.37)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ル明の背！貝
技術分野
本発明、ヒトエラスターゼ■の！１．物工学的・製造に
関する。さらに４休的には、本発明は、（１）ヒトエラ
スター［！■の牛物工学的産牛能を右゛りる１） Ｎ
Ａ鎖、（２）このＤＮＡ鎖を王の遺伝情報が発現可能な
状態で含むプラスミドににつて形質転換されＩこヒ１−
エラスターゼ■産生性微生物、すなわら−１−記Ｄ Ｎ
Δ鎖の性質を専ら利用する物、および（３）この微生物
の培養によるヒトエラスターゼ■の生産法、すなわち上
記ＤＮＡ鎖を使用する方法、に関する。
関する。さらに４休的には、本発明は、（１）ヒトエラ
スター［！■の牛物工学的産牛能を右゛りる１） Ｎ
Ａ鎖、（２）このＤＮＡ鎖を王の遺伝情報が発現可能な
状態で含むプラスミドににつて形質転換されＩこヒ１−
エラスターゼ■産生性微生物、すなわら−１−記Ｄ Ｎ
Δ鎖の性質を専ら利用する物、および（３）この微生物
の培養によるヒトエラスターゼ■の生産法、すなわち上
記ＤＮＡ鎖を使用する方法、に関する。
一般に、１ラスターゼは、Ｑｌｉ乳動物膵臓細胞等によ
って産生される所謂セリンブロテアーピの一種であって
、不溶性硬蛋白であるエラスチンを分解するきわめて特
異なプロテアーゼである。］〕ラ一 ３ − スクーゼは経口段！ｊで人の動脈硬化症等の治療に有効
であることが確認されており、従来ブタの膵臓から抽出
された所謂ブタ１−ラスターゼが医薬品（血−代謝改善
剤）として既に実用化されており、ヒトエラスターゼに
ついて同様の薬効が期待されている。
って産生される所謂セリンブロテアーピの一種であって
、不溶性硬蛋白であるエラスチンを分解するきわめて特
異なプロテアーゼである。］〕ラ一 ３ − スクーゼは経口段！ｊで人の動脈硬化症等の治療に有効
であることが確認されており、従来ブタの膵臓から抽出
された所謂ブタ１−ラスターゼが医薬品（血−代謝改善
剤）として既に実用化されており、ヒトエラスターゼに
ついて同様の薬効が期待されている。
吐乳動物の膵臓細胞では、２１１ｉ類のエラスターゼが
産生され、それらは互いに物理化学的に、酵素学的にま
た抗原性の面から異なっていて、エラスターゼ■および
エラスターゼＩ［とそれぞれ呼ばれている。なお、医薬
品として実用化されているブタエラスターぜは、前者を
有効成分とするものである。
産生され、それらは互いに物理化学的に、酵素学的にま
た抗原性の面から異なっていて、エラスターゼ■および
エラスターゼＩ［とそれぞれ呼ばれている。なお、医薬
品として実用化されているブタエラスターぜは、前者を
有効成分とするものである。
エラスターゼは、■、■ともに、それぞれ、膵臓細胞内
でプレプロエラスターゼとして産生きれ、これが細胞外
に分泌されるどきにプロエラスターゼ（不活性なエラス
ターゼ前駆体）となり、さらに細胞外でトリプシン等の
酵素作用を受１ノでエラスチン分解活性を有するエラス
ターゼに変化するものど考えられている。
でプレプロエラスターゼとして産生きれ、これが細胞外
に分泌されるどきにプロエラスターゼ（不活性なエラス
ターゼ前駆体）となり、さらに細胞外でトリプシン等の
酵素作用を受１ノでエラスチン分解活性を有するエラス
ターゼに変化するものど考えられている。
＝ ４ −
先行技＊
ブタエラスタービ■については、Ｄ、Ｈ，Ｓｔ＋ｏｔｔ
ｏｎｅｔ ａｔによりモのアミノ酸配列が報告されてい
る（Ｎａｔｕｒｅ、 ２２５１’ｅｂ ２８．８０２（
１９７０） ）。
ｏｎｅｔ ａｔによりモのアミノ酸配列が報告されてい
る（Ｎａｔｕｒｅ、 ２２５１’ｅｂ ２８．８０２（
１９７０） ）。
また、ラットエラスターゼ■および■については、Ｒａ
ｙｍｏｎｄ Ｊ、 ＨａｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａ’ｌ
らが行った分子生物学的解析により、関連するｍＲＮ△
の塩基配列並びにアミノ酸配列が解明されている（ Ｂ
１０ＣｈＯＩＩｌｉＳＩｒｙ、 ２１．１４５３−１４
６３（ＩｎＯ２） ）。
ｙｍｏｎｄ Ｊ、 ＨａｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａ’ｌ
らが行った分子生物学的解析により、関連するｍＲＮ△
の塩基配列並びにアミノ酸配列が解明されている（ Ｂ
１０ＣｈＯＩＩｌｉＳＩｒｙ、 ２１．１４５３−１４
６３（ＩｎＯ２） ）。
さらにヒトエラスターゼについてはＣ，ｌａｒｇｍａｎ
ａｔ ａｌにより、１と■がヒｌ−の膵臓組織から精製
されて、それらの性質が調査報告されている（ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、’ １！１（１１）、２４９１（
１９７６）） 。さらに、ヒトエラスターゼ 末端のアミノ酸配列（１６り）も報告されている（Ｃ，
ｌａｒｇｍａｎ Ｏｔ ａｔ ： Ｂｉｏｃ
ｈｉｍｉｃａ ａｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ八ｃｔ
ａ ６２３へ１９８０）２０Ｂ −２１２） 。
ａｔ ａｌにより、１と■がヒｌ−の膵臓組織から精製
されて、それらの性質が調査報告されている（ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、’ １！１（１１）、２４９１（
１９７６）） 。さらに、ヒトエラスターゼ 末端のアミノ酸配列（１６り）も報告されている（Ｃ，
ｌａｒｇｍａｎ Ｏｔ ａｔ ： Ｂｉｏｃ
ｈｉｍｉｃａ ａｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ八ｃｔ
ａ ６２３へ１９８０）２０Ｂ −２１２） 。
また膵臓中のエラスターゼの存在量は、ブタについては
Ｔラスターゼ■が多く、ヒ１−についてはエラスターゼ
１１が多いことが報告されでいる（Ｂｉｏｃｂ、１５
２４９１（１９７６）） 。
Ｔラスターゼ■が多く、ヒ１−についてはエラスターゼ
１１が多いことが報告されでいる（Ｂｉｏｃｂ、１５
２４９１（１９７６）） 。
発明の概要
要 旨
本発明は、組換えＤＮＡ技術による新規なヒトエラスタ
ーゼ１１の製造手段を提供づるものである。
ーゼ１１の製造手段を提供づるものである。
寸なわら、本発明によるに１〜エラスターゼ■の生物工
学的産生能を右Ｊるｌ） Ｎ Ａ鎖は、下記の（１）〜
（３）からなる群から選ばれるアミノ酸配列のポリペプ
チドを］−ド覆る塩基配列を有Ｊること、を特徴とする
ものである。
学的産生能を右Ｊるｌ） Ｎ Ａ鎖は、下記の（１）〜
（３）からなる群から選ばれるアミノ酸配列のポリペプ
チドを］−ド覆る塩基配列を有Ｊること、を特徴とする
ものである。
また、本発明ににるヒトエラスターゼ■産生能を有Ｊる
微生物は、下記の（１）〜（３）からなる群から選ばれ
るアミノ酸配列のポリペプチドをコードする塩基配列を
有するＤＮＡ鎖をその遺伝情報Ｉ界発現可能な状態で含
むプラスミドによって形質転換されたものであること、
を特徴どするものである。
微生物は、下記の（１）〜（３）からなる群から選ばれ
るアミノ酸配列のポリペプチドをコードする塩基配列を
有するＤＮＡ鎖をその遺伝情報Ｉ界発現可能な状態で含
むプラスミドによって形質転換されたものであること、
を特徴どするものである。
さらにまた、本発明によるヒトエラスターゼ■の生物工
学的製造法は、下記の（１）〜（３）からなる群から選
ば、れるアミノ酸配列のポリペプチドをコードするｉＭ
１基配列配列するＤＮＡ鎖を用意し、このＤ ＮＡ鎖を
、これをその遺伝情報が発現可能な状態で含むプラスミ
ドの作成、このプラスミドにＪ、る微Ｉ（−物の形質転
換および得られた形質転換体の培養からｈる１稈に付し
て、培養物中にヒトエラスターゼ■を産生ざけることを
特徴とするｂのｅある。
学的製造法は、下記の（１）〜（３）からなる群から選
ば、れるアミノ酸配列のポリペプチドをコードするｉＭ
１基配列配列するＤＮＡ鎖を用意し、このＤ ＮＡ鎖を
、これをその遺伝情報が発現可能な状態で含むプラスミ
ドの作成、このプラスミドにＪ、る微Ｉ（−物の形質転
換および得られた形質転換体の培養からｈる１稈に付し
て、培養物中にヒトエラスターゼ■を産生ざけることを
特徴とするｂのｅある。
（１） 第１図および第２図にわたって示されているア
ミノ酸配列のうち、ＣからＤまでのもの、（２） 第１
図および第２図にわＩ、：つて示されているアミノ酸配
列のうち、ＢからＤまでのもの、（３） 第１図および
第２図にわたー）で示されているアミノ酸配列のうら、
△から］）までのもの。
ミノ酸配列のうち、ＣからＤまでのもの、（２） 第１
図および第２図にわＩ、：つて示されているアミノ酸配
列のうち、ＢからＤまでのもの、（３） 第１図および
第２図にわたー）で示されているアミノ酸配列のうら、
△から］）までのもの。
なお、本発明は上記の（１）〜（３）からなる群から選
ばれるアミノ酸配列のポリペプチドからなる、微（１物
によって生産されたヒ１〜エラスターゼ■、に関するも
のともいえる。
ばれるアミノ酸配列のポリペプチドからなる、微（１物
によって生産されたヒ１〜エラスターゼ■、に関するも
のともいえる。
効 果
本発明によれば、ヒ１〜エラスターゼ■を、形り１転換
さ４！た微生物により産生さｔ！ることができる。
さ４！た微生物により産生さｔ！ることができる。
従って、膵臓器から抽出づ−る方法に比べ、より有効に
ヒトエラスターゼ■を産生させ、単離し得る可能性があ
る。
ヒトエラスターゼ■を産生させ、単離し得る可能性があ
る。
本発明によって産と１］されるヒトエラスターゼ■はヒ
ト型であるので、医薬として用いる場合にはブタエラス
ターゼ■を凌ぐ薬効が期待される。
ト型であるので、医薬として用いる場合にはブタエラス
ターゼ■を凌ぐ薬効が期待される。
また、本発明の好ましい一実施態様（詳細後記）によれ
ば、ＤＮＡの発現産物として直接活性を右づるヒトエラ
スターゼ■を産生させることができる（膵臓からエラス
ターゼを抽出する場合には、不活性なプロエラスターゼ
として存在するので、精製操作に加えて活性化処理を行
なうことが必要であった）。
ば、ＤＮＡの発現産物として直接活性を右づるヒトエラ
スターゼ■を産生させることができる（膵臓からエラス
ターゼを抽出する場合には、不活性なプロエラスターゼ
として存在するので、精製操作に加えて活性化処理を行
なうことが必要であった）。
なお、組換えＤＮＡ技術が今日非常な発展を遂げている
とはいえ、個々の蛋白に関して常にそれをコードする遺
伝子のり［１−ニングとその発現（産生）成υＪを予測
し帽るほとには到っていないのが現状なので、本発明に
よりヒトエラスターゼ■を産生させ得たことは思いが（
プなかったことというべきであろう。
とはいえ、個々の蛋白に関して常にそれをコードする遺
伝子のり［１−ニングとその発現（産生）成υＪを予測
し帽るほとには到っていないのが現状なので、本発明に
よりヒトエラスターゼ■を産生させ得たことは思いが（
プなかったことというべきであろう。
＝ ８ 一
定 義
本発明によるヒｌ−、Ｊ’ラスターゼ■の生物］−学的
産生能を右づ゛るＩ） ＮΔ鎖づなわノうヒｌ−１−ラ
スターゼ■遺伝子は、アミノ酸配列が第１図および第２
図にわたって示されているアミノ酸配列のうちＣからＤ
までのもの、ＢからＤまでのもの、または八からＤまで
のもの、であるポリペプチドを］−ドする一ｂのである
。なお、第１図は△から始まるアミノ酸配列の１〜１８
０番を、第２図はそれに続く１８１〜２６９番を示すも
のであることはいうまでもない（第２図には、２６９番
目のアミノ酸に対応する］−トンに続＜ＤＮＡも示され
ている）。
産生能を右づ゛るＩ） ＮΔ鎖づなわノうヒｌ−１−ラ
スターゼ■遺伝子は、アミノ酸配列が第１図および第２
図にわたって示されているアミノ酸配列のうちＣからＤ
までのもの、ＢからＤまでのもの、または八からＤまで
のもの、であるポリペプチドを］−ドする一ｂのである
。なお、第１図は△から始まるアミノ酸配列の１〜１８
０番を、第２図はそれに続く１８１〜２６９番を示すも
のであることはいうまでもない（第２図には、２６９番
目のアミノ酸に対応する］−トンに続＜ＤＮＡも示され
ている）。
ここで、ｒＤＮΔ鎖」とはある長さを有するポリデオキ
シリボ核酸の相補的二本鎖を意味づるものである。そし
て、本発明ではこのｒＤＮＡ鎖」はそれがコードＪるポ
リペプチドのアミノ酸配列によって特定されているとこ
ろ、このポリペブヂドは上記にように有限の長さのもの
であるから、このＤＮＡ鎖も有限の良さのものである。
シリボ核酸の相補的二本鎖を意味づるものである。そし
て、本発明ではこのｒＤＮＡ鎖」はそれがコードＪるポ
リペプチドのアミノ酸配列によって特定されているとこ
ろ、このポリペブヂドは上記にように有限の長さのもの
であるから、このＤＮＡ鎖も有限の良さのものである。
しかし、このＤＮＡ鎖はヒ１へエラスターゼ■の遺伝子
を含んでいてこのポリペプチドの生物Ｔ学的産生を行な
わけるものであるどころ、この有限の長さの１） Ｎ
Ａ鎖のみににってこのＪ：うな生物工学的産生が行なえ
るのではなく、その５′ −側上流および（または）３
′ −側ＩＺ流に適当艮ざのＤ Ｎ Ａ鎖が結合した状
態でこのポリペプチドの生物工学的産生が可能どなる訳
である。従って、本発明でｒｒ）ＮＡ鎖」というときは
、この特定の長さのもの（第１〜２図の対応アミノ酸配
列でいえばＣ−Ｄ、Ｂ−ＤまたはΔ−Ｄの長さ）の外に
、この特定の長さのＤＮＡ鎖を構成員とづる鎖状または
環状ＤＮＡ鎖の形態に在るものをも包含するものとする
（ただし、発明の性質からいって、このＤＮＡ鎖はヒト
・膵臓中に存在１−る場合を含まないことはいうＪ：で
もない。本発明によるＤＮＡ鎖を［ヒ１− ■ラスター
１■の生物工学的産生能を有するＤＮＡ鎖」と呼ぶ所以
である）。
を含んでいてこのポリペプチドの生物Ｔ学的産生を行な
わけるものであるどころ、この有限の長さの１） Ｎ
Ａ鎖のみににってこのＪ：うな生物工学的産生が行なえ
るのではなく、その５′ −側上流および（または）３
′ −側ＩＺ流に適当艮ざのＤ Ｎ Ａ鎖が結合した状
態でこのポリペプチドの生物工学的産生が可能どなる訳
である。従って、本発明でｒｒ）ＮＡ鎖」というときは
、この特定の長さのもの（第１〜２図の対応アミノ酸配
列でいえばＣ−Ｄ、Ｂ−ＤまたはΔ−Ｄの長さ）の外に
、この特定の長さのＤＮＡ鎖を構成員とづる鎖状または
環状ＤＮＡ鎖の形態に在るものをも包含するものとする
（ただし、発明の性質からいって、このＤＮＡ鎖はヒト
・膵臓中に存在１−る場合を含まないことはいうＪ：で
もない。本発明によるＤＮＡ鎖を［ヒ１− ■ラスター
１■の生物工学的産生能を有するＤＮＡ鎖」と呼ぶ所以
である）。
１１一
本発明によるＤＮＡ鎖の存在状態のうら代表的なのは、
このＤ ＮＡ鎖を構成員の一部とづるブ°ノスミドの形
態４Ｔらびにプラスミドとし゛Ｃ微９−物、ｖｌに大腸
菌おＪ、び酵ｎ１、中に存在する形態である。
このＤ ＮＡ鎖を構成員の一部とづるブ°ノスミドの形
態４Ｔらびにプラスミドとし゛Ｃ微９−物、ｖｌに大腸
菌おＪ、び酵ｎ１、中に存在する形態である。
本発明にＪ：るＩ） ＮΔ鎖の一つのぞして好ましい存
在形態どしてのプラスミドは、バラレンジ〜７−ないし
外来遺伝子どしての本発明Ｉ）ＮΔ鎖ど微イ１物中で安
定に存在して複製可能なプラスミドベクターど本発明Ｄ
ＮＡ鎖をｍＲＮ△へ転写さ口るプロモーターとを一体に
結合させたもので・ある。プラスミドベクターおよびプ
ロモーターどしては公知のｂのを適宜組合わせて用いる
ことができるが、次のものを例示Ｊ゛ることができる。
在形態どしてのプラスミドは、バラレンジ〜７−ないし
外来遺伝子どしての本発明Ｉ）ＮΔ鎖ど微イ１物中で安
定に存在して複製可能なプラスミドベクターど本発明Ｄ
ＮＡ鎖をｍＲＮ△へ転写さ口るプロモーターとを一体に
結合させたもので・ある。プラスミドベクターおよびプ
ロモーターどしては公知のｂのを適宜組合わせて用いる
ことができるが、次のものを例示Ｊ゛ることができる。
ζ〜盲伝子がコードするポリペプチド
上記のように、本発明ににるＩ） Ｎ Ａ鎖はこれが＝
１−ドするポリペプチドのアミノ酸配列にＪ：って特定
されている。
１−ドするポリペプチドのアミノ酸配列にＪ：って特定
されている。
このポリペプチドは、アミノ酸配りｌが第１〜２図にわ
たって示されているアミノ酸配列のうちＣ−り、Ｂ−Ｄ
またはＡ−Ｄのものであるものである。ここで、アミノ
酸配列がＣ−１’）、、Ｂ−ＤおＪこびＡ−Ｄのポリペ
プチドは、それぞれヒ１〜エラスターゼ■、ヒトプ［１
エラスターゼ■およびヒ１〜プレアロエラスクー１２Ｔ
Ｉである。
たって示されているアミノ酸配列のうちＣ−り、Ｂ−Ｄ
またはＡ−Ｄのものであるものである。ここで、アミノ
酸配列がＣ−１’）、、Ｂ−ＤおＪこびＡ−Ｄのポリペ
プチドは、それぞれヒ１〜エラスターゼ■、ヒトプ［１
エラスターゼ■およびヒ１〜プレアロエラスクー１２Ｔ
Ｉである。
ヒｌ〜エラスター１ｆｆｉ ＩＩは、２４１個のアミノ
酸からなるものである。
酸からなるものである。
ヒトプロエラスターゼ（Ｂ−Ｄ）は、上記のヒ１−エラ
スターゼＩＦ（０−Ｄ）のＮ−末端に１２個のアミノ酸
が結合したものに相当する。
スターゼＩＦ（０−Ｄ）のＮ−末端に１２個のアミノ酸
が結合したものに相当する。
ヒトプレプロエラスターゼＴＩ（Ａ−Ｄ）は、このヒト
プロエラスターゼＴＩ（Ｂ−Ｄ）のＮ−末端にざらに１
６個のアミノ酸が結合したものである。
プロエラスターゼＴＩ（Ｂ−Ｄ）のＮ−末端にざらに１
６個のアミノ酸が結合したものである。
これらの１ラスターぜ■化合物（」−記３種を含めたも
の）は従来そのアミノ酸配列が知られていなかったもの
である。
の）は従来そのアミノ酸配列が知られていなかったもの
である。
ＤＮＡ鎖の塩基配列
ヒトエラスター１■化合物が３種存在することによって
、イれを二１−ドする塩基配列を右りるＤＮへ鎖も基本
的には３種存右Ｊ−る。
、イれを二１−ドする塩基配列を右りるＤＮへ鎖も基本
的には３種存右Ｊ−る。
ヒト］二゛ラスターゼ■を二１−ドづ−るＤＮＡ鎖は、
第１〜２図の０−Ｄの塩基配列を持つしのまたはその縮
重異Ｐ１体である。ここで［縮重異ｆ１体１とは、縮重
コードンにおいてのみ異なっていて同一のポリペプチド
を］−ドすることのできるＤＮＡ鎖を意味づ“るものと
する。たとえば、第１〜２図のＣ−Ｄの塩基配列を持つ
ＤＮＡ鎖に対して、そのアミノ酸のどれかに対応Ｊ−る
］−トンたとえばＮ−末端のＶａｌに対応づ−るコード
ン（Ｇ １− Ｔ ）がこれど縮重関係にあるたとえば
Ｇ Ｔ Ｃに変ったものを本発明では縮重異性体と呼ぶ
ものとする。
第１〜２図の０−Ｄの塩基配列を持つしのまたはその縮
重異Ｐ１体である。ここで［縮重異ｆ１体１とは、縮重
コードンにおいてのみ異なっていて同一のポリペプチド
を］−ドすることのできるＤＮＡ鎖を意味づ“るものと
する。たとえば、第１〜２図のＣ−Ｄの塩基配列を持つ
ＤＮＡ鎖に対して、そのアミノ酸のどれかに対応Ｊ−る
］−トンたとえばＮ−末端のＶａｌに対応づ−るコード
ン（Ｇ １− Ｔ ）がこれど縮重関係にあるたとえば
Ｇ Ｔ Ｃに変ったものを本発明では縮重異性体と呼ぶ
ものとする。
好ましい具体例は、５′ −側上流に接して開始コード
ンＡ Ｔ Ｇと３′ −側末喘にｉｆｌ Ｌで停止コー
ドンを少なくとも１個（そのうちの一つは、たとえばＴ
ＧＡ）を持つものである。
ンＡ Ｔ Ｇと３′ −側末喘にｉｆｌ Ｌで停止コー
ドンを少なくとも１個（そのうちの一つは、たとえばＴ
ＧＡ）を持つものである。
ヒトプロエラスターゼ■を］−ドするＤＮＡ鎖は、第１
〜２図のＢ−Ｄ（７）塩基配列を持つものまたはその縮
重異性体である。ヒトプロエラスターゼ■を］−ドする
ＤＮＡ鎖も、その５′ −末端に開始コードンΔＴＧを
、また３′ −末端に停止コードンを少なくども１個（
そのうちの一つは、たとえばＴＧＡ）を有することが好
ましい。
〜２図のＢ−Ｄ（７）塩基配列を持つものまたはその縮
重異性体である。ヒトプロエラスターゼ■を］−ドする
ＤＮＡ鎖も、その５′ −末端に開始コードンΔＴＧを
、また３′ −末端に停止コードンを少なくども１個（
そのうちの一つは、たとえばＴＧＡ）を有することが好
ましい。
ヒトプロエラスターゼ■をコードするＤＮＡ鎖は、第１
〜２図のへ一部の塩基配列を持つものまたはその縮重責
性体である。このＤＮＡ鎖はその５′ −末端に開始コ
ードンＡＴＧを右するが、このＤＮＡ鎖もその３′ −
末端に停止１−」−トンを少なくとも１個（そのうちの
一つは、たとえばＴ Ｇ Ａ ）を右Ｊることが０７ま
しい。
〜２図のへ一部の塩基配列を持つものまたはその縮重責
性体である。このＤＮＡ鎖はその５′ −末端に開始コ
ードンＡＴＧを右するが、このＤＮＡ鎖もその３′ −
末端に停止１−」−トンを少なくとも１個（そのうちの
一つは、たとえばＴ Ｇ Ａ ）を右Ｊることが０７ま
しい。
上記のいずれのヒＩ〜エラスターゼ■化合物をコードす
るＤＮＡ鎖においても、該ポリペプチドのＣ−末端のＡ
ｓｎに対応するコードン（図示の例ではΔΔＣ）の３′
−側下流には、非翻訳領域どしてのＤＮＡ鎖（その最
初の部分は、ＴＡＧのような停止コードンであることが
ふつうである）がある長ざで続い−Ｃいることができ、
またイのさらに３′ −側下流に真核生物遺伝子共通の
ポリ（Ａ）鎖がイ；１加していてもよい。ポリ（Ａ）鎖
が付加している場合には、それの５′ −側−［流の−
１−記非翻訳領域にはΔΔＴＡＡＡというポリ（Δ）付
加シグナルが含まれていることがふつうである。なお、
第１〜２図に示したＤＮＡ鎖（５′ −末端のＡＴＧか
ら３′ −末端のポリ（Δ）鎖まで）の塩基配列は、ヒ
１〜プレプロエラスターげ■のｍ ＲＮ Ａから１ｑた
ＣＤＮＡについてマキ→ナム・ギルバート法ににって決
定したものである。
るＤＮＡ鎖においても、該ポリペプチドのＣ−末端のＡ
ｓｎに対応するコードン（図示の例ではΔΔＣ）の３′
−側下流には、非翻訳領域どしてのＤＮＡ鎖（その最
初の部分は、ＴＡＧのような停止コードンであることが
ふつうである）がある長ざで続い−Ｃいることができ、
またイのさらに３′ −側下流に真核生物遺伝子共通の
ポリ（Ａ）鎖がイ；１加していてもよい。ポリ（Ａ）鎖
が付加している場合には、それの５′ −側−［流の−
１−記非翻訳領域にはΔΔＴＡＡＡというポリ（Δ）付
加シグナルが含まれていることがふつうである。なお、
第１〜２図に示したＤＮＡ鎖（５′ −末端のＡＴＧか
ら３′ −末端のポリ（Δ）鎖まで）の塩基配列は、ヒ
１〜プレプロエラスターげ■のｍ ＲＮ Ａから１ｑた
ＣＤＮＡについてマキ→ナム・ギルバート法ににって決
定したものである。
ＤＮＡ鎖の取１ｑ
上記のヒトエラスターゼ■化合物のアミノ酸配夕１１を
］−ドする塩基配列を有するＤＮＡ鎖を取得する一つの
手段は、核酸合成の方法に従ってその鎖長の少なくとも
一部を化学合成することである。
］−ドする塩基配列を有するＤＮＡ鎖を取得する一つの
手段は、核酸合成の方法に従ってその鎖長の少なくとも
一部を化学合成することである。
結合アミノ酸が少＜’Ｋ くとも２４１個であるという
ことを考えれば、この化学合成法よりもと１へ膵臓から
得たｍＲＮＡからの酵素的な方法による方 ・が好まし
いといえる。
ことを考えれば、この化学合成法よりもと１へ膵臓から
得たｍＲＮＡからの酵素的な方法による方 ・が好まし
いといえる。
すなわち、ヒトエラスターゼ■遺伝子の製造のためには
じトエラスターゼｍＲＮＡを含む臓器よりｍＲＮＡを取
得し、これをテンプレートどして逆転写酵素を用いてＣ
ＤＮＡバンクを作成し、そのＣＤＮＡバンクの中から適
当なプローブを用いて、ヒトエラスターゼ■遺伝子を含
むクローンを取得するのが一般的方法である。このプロ
ーブとしては、ラットエラスターゼＴｒ ｉｌｌ伝子の
一部を利用するのが便利である。一般に、生物界におい
て同一の機能を司るタンパク質はアミノ酸−泡構造レベ
ルとともにＤＮＡ塩基配列レベルでも相同性があること
が知られており、その場合に系統発生的に近縁のものほ
ど相同性は高い。ヒトとラットでは、本発明者らが遺伝
子取得後に比較した結果、アミノ酸、ＤＮＡ配列とも８
０％程度の相同性が見られた。ラットエラスターＬ’Ｉ
遺伝子についてはずでに報告があって（前掲文献）、Ｄ
ＮＡ塩基配列が知られている。
じトエラスターゼｍＲＮＡを含む臓器よりｍＲＮＡを取
得し、これをテンプレートどして逆転写酵素を用いてＣ
ＤＮＡバンクを作成し、そのＣＤＮＡバンクの中から適
当なプローブを用いて、ヒトエラスターゼ■遺伝子を含
むクローンを取得するのが一般的方法である。このプロ
ーブとしては、ラットエラスターゼＴｒ ｉｌｌ伝子の
一部を利用するのが便利である。一般に、生物界におい
て同一の機能を司るタンパク質はアミノ酸−泡構造レベ
ルとともにＤＮＡ塩基配列レベルでも相同性があること
が知られており、その場合に系統発生的に近縁のものほ
ど相同性は高い。ヒトとラットでは、本発明者らが遺伝
子取得後に比較した結果、アミノ酸、ＤＮＡ配列とも８
０％程度の相同性が見られた。ラットエラスターＬ’Ｉ
遺伝子についてはずでに報告があって（前掲文献）、Ｄ
ＮＡ塩基配列が知られている。
そこで、本発明者らの行なった方法は、下記の通りであ
る。寸なわち、ラットエラスター１ｉ Ｉｆ ３！仏子
のＤＮＡ塩基配列の一部を化学合成し、それをプローブ
として用いて、ラフ１〜膵１１ｍＲＮ△より逆転写酵素
を用いて作成したｃＤＮ△ＤＮＡよりスクリーニングを
行なって、クツ１〜エラスターゼ■遺伝子クローンを取
得した。この遺伝子がラットエラスターゼ■遺伝子であ
ることはＤＮＡ塩基配列を調べることににすＨＥ定した
。この遺伝子を制限酵素で切断して約７７０ｂｐ（ｔｕ
ｇ対）はどの断片を取得し、この断片に３２１）ラベル
を入れてプローブとして用いた。ヒト膵臓ｍＲＮＡより
逆転写酵素を用いで作成したＣ Ｉ） ＮΔバンクにつ
いて、上記プ「１−ブを用いてスクリーニングを行なっ
た。得られたクローンのうｌう一番ＣＤＮＡ部分の長い
ものについて塩基配り１１をマキ４ツムギルバート法に
にり決定した。
る。寸なわち、ラットエラスター１ｉ Ｉｆ ３！仏子
のＤＮＡ塩基配列の一部を化学合成し、それをプローブ
として用いて、ラフ１〜膵１１ｍＲＮ△より逆転写酵素
を用いて作成したｃＤＮ△ＤＮＡよりスクリーニングを
行なって、クツ１〜エラスターゼ■遺伝子クローンを取
得した。この遺伝子がラットエラスターゼ■遺伝子であ
ることはＤＮＡ塩基配列を調べることににすＨＥ定した
。この遺伝子を制限酵素で切断して約７７０ｂｐ（ｔｕ
ｇ対）はどの断片を取得し、この断片に３２１）ラベル
を入れてプローブとして用いた。ヒト膵臓ｍＲＮＡより
逆転写酵素を用いで作成したＣ Ｉ） ＮΔバンクにつ
いて、上記プ「１−ブを用いてスクリーニングを行なっ
た。得られたクローンのうｌう一番ＣＤＮＡ部分の長い
ものについて塩基配り１１をマキ４ツムギルバート法に
にり決定した。
このように、本発明ＤＮＡ鎖は上記のＪ：うにヒ１〜膵
臓ＣＩ） Ｎ△バンクより大賜菌プラスミド１−に組み
込まれた形で得られたが、もちろんこのＤＮＡ鎖を化学
合成によってすべてもしく番；１途中から作成して取１
！ｌ？づることも可能であることは前記したところであ
る。
臓ＣＩ） Ｎ△バンクより大賜菌プラスミド１−に組み
込まれた形で得られたが、もちろんこのＤＮＡ鎖を化学
合成によってすべてもしく番；１途中から作成して取１
！ｌ？づることも可能であることは前記したところであ
る。
腹Ｉ」１１杯
上記のＪ：うにして取得される本発明ＤＮＡ鎖はヒトエ
ラスターゼ■蛋白をつくるための遺伝情報を含んでいる
ので、これを生物工学的手法によって微生物に導入して
形質転換体をつくり、この形質転換微生物にヒト・エラ
スターゼ■蛋白をつくらＵることができる。
ラスターゼ■蛋白をつくるための遺伝情報を含んでいる
ので、これを生物工学的手法によって微生物に導入して
形質転換体をつくり、この形質転換微生物にヒト・エラ
スターゼ■蛋白をつくらＵることができる。
宿主微生物
適当なプラスミドベクターが存在する限り、各種の微／
ｌＺ物が本発明ＤＮＡ鎖を構成員どして含むプラスミド
により形質転換の対象となりうる。
ｌＺ物が本発明ＤＮＡ鎖を構成員どして含むプラスミド
により形質転換の対象となりうる。
そのような微生物の一群は［５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉであり、伯の一群は５ａｃｃｈａｒｏＩＩｌｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｃである。
ｏｌｉであり、伯の一群は５ａｃｃｈａｒｏＩＩｌｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｃである。
形質転換
形質転換体の作成（おにびそれによるヒ１−１ラスター
ゼＩｆの産生）のための手順イｒいし方法そのものは、
分子生物学、生物工学ないし遺伝子工学の分野において
慣用されているものでありうるので、本発明においても
下記したどころ以外の・ｂのについてはこれら慣用技術
に準じて実施りればＪ、い。
ゼＩｆの産生）のための手順イｒいし方法そのものは、
分子生物学、生物工学ないし遺伝子工学の分野において
慣用されているものでありうるので、本発明においても
下記したどころ以外の・ｂのについてはこれら慣用技術
に準じて実施りればＪ、い。
微生物中で本発明ＤＮＡ鎖の遺伝子を発現’ｃ５ ’ｔ
！るためには、４二すその微生物中で安定に存在するプ
ラスミドベクター中にこの遺伝子をつなぎかえる必要が
ある。この際用いられるプラスミドベクターは、大腸菌
に対してはｌ） Ｂ Ｒ３２２智、酵母に対し−（はＹ
Ｒｐ７等−秤々知られているものすべてが用いられる。
！るためには、４二すその微生物中で安定に存在するプ
ラスミドベクター中にこの遺伝子をつなぎかえる必要が
ある。この際用いられるプラスミドベクターは、大腸菌
に対してはｌ） Ｂ Ｒ３２２智、酵母に対し−（はＹ
Ｒｐ７等−秤々知られているものすべてが用いられる。
一方、本発明ＤＮＡ鎖の潰伝子をｗＩＩ４：物で発現さ
せるためには、イのＤＮＡをｍ ＲＮΔへ転写さける必
要がある。そのためには、転写のためのシグナルである
プロモーターの遺伝子を本発明ＤＮＡ鎖の５′ −側上
流に組込めばＪ、い。このプロモーターについてＩ、１
すでに１： ｒ ｐ、 ｌ 、＜） ｃ。
せるためには、イのＤＮＡをｍ ＲＮΔへ転写さける必
要がある。そのためには、転写のためのシグナルである
プロモーターの遺伝子を本発明ＤＮＡ鎖の５′ −側上
流に組込めばＪ、い。このプロモーターについてＩ、１
すでに１： ｒ ｐ、 ｌ 、＜） ｃ。
ｏｍｐＦ （以上、大腸菌用）、ＡＩ） Ｈ１、Ｇ Ａ
Ｌ７、ＩＩＧＫ、ＴＦぐ［〕１（以に、酸０１用）−
Ｓ種々知られており、本発明で′ｂこれらのいずれをも
利用することができる。
Ｌ７、ＩＩＧＫ、ＴＦぐ［〕１（以に、酸０１用）−
Ｓ種々知られており、本発明で′ｂこれらのいずれをも
利用することができる。
また、ｍＲＮＡを蛋白に翻訳させる段階では蛋白合成の
場であるリポソームが翻訳開始部位の先端に結合するた
めに必要な配列（大腸菌ではＳＤ配列と呼ばれる）を蛋
白合成の開始信号であるＡＴＧの前につ番ノる必要があ
る。なお、ポリ（Δ）付加シグナルを含む３′非翻訳領
域についでは蛋白を合成させるために特に必要ではない
ど考えられているので、場合ににっでは削り取ることし
できる。ただし、宿主微生物がＭｍであるどきはこの３
′非翻訳領域の有無が蛋白合成量の大小に関与するとい
われている場合もあるので、多量にヒトエラスターゼ■
蛋白を合成しようというときは注意を要する。
場であるリポソームが翻訳開始部位の先端に結合するた
めに必要な配列（大腸菌ではＳＤ配列と呼ばれる）を蛋
白合成の開始信号であるＡＴＧの前につ番ノる必要があ
る。なお、ポリ（Δ）付加シグナルを含む３′非翻訳領
域についでは蛋白を合成させるために特に必要ではない
ど考えられているので、場合ににっでは削り取ることし
できる。ただし、宿主微生物がＭｍであるどきはこの３
′非翻訳領域の有無が蛋白合成量の大小に関与するとい
われている場合もあるので、多量にヒトエラスターゼ■
蛋白を合成しようというときは注意を要する。
さて、一般的には、エラスターゼ蛋白をつくろうとすれ
ば上記のような操作が必要であるが、本発明ＤＮＡ鎖の
うち塩基配列がＢ−ＤおよびＡ−りのものは前駆体ペブ
ヂドを＝１−ドする配列が含まれているので、ヒ１〜エ
ラスターゼ■蛋白をつくる際に前駆体ペブヂドを含むヒ
１−エラスターゼ■蛋白（じｊ〜丁シラスクー１ｆｆｉ
Ｉｒ前駆なわ１５プロエラスターゼ■またはプレプロＪ
ラスターげ■をつくることができ、また塩基配列Ｃ−Ｄ
のものからはこの前駆体ペブブドのない蛋白をつくるこ
ともできる。ただしｉｒ１駆休ペ体ブード（△−Ｃ）を
含まない場合は蛋白合成開始のためのシグナルであるＡ
ＴＧが必要なので、最低１個のメチオニンをＮ−末端ア
ミノ酸の前に付加さけておかな（′Ｊればむらない。ま
た、ヒｌ− Ｉラスターゼ■蛋白をつくるばあにエラス
ターげ活性さえ保持されれば、Ｎ−末端アミノ酸の前に
１個または複数個のアミノ酸を付加することや、いくつ
かのアミノ酸をＮ−末端側もしくはＣ−末端側で削るこ
と・ｂできる。また、読粋の調整その他の目的で適当な
長さのＤＮＡ鎖をリンノＪ−として結合さけることもで
きる。このＪ：うなりＮＡ鎖の加工は、現在の遺伝子Ｔ
学技術では、制限酵素おにびｒｌＮＡ化学合成技術を利
用すれば容易に実施することができる。
ば上記のような操作が必要であるが、本発明ＤＮＡ鎖の
うち塩基配列がＢ−ＤおよびＡ−りのものは前駆体ペブ
ヂドを＝１−ドする配列が含まれているので、ヒ１〜エ
ラスターゼ■蛋白をつくる際に前駆体ペブヂドを含むヒ
１−エラスターゼ■蛋白（じｊ〜丁シラスクー１ｆｆｉ
Ｉｒ前駆なわ１５プロエラスターゼ■またはプレプロＪ
ラスターげ■をつくることができ、また塩基配列Ｃ−Ｄ
のものからはこの前駆体ペブブドのない蛋白をつくるこ
ともできる。ただしｉｒ１駆休ペ体ブード（△−Ｃ）を
含まない場合は蛋白合成開始のためのシグナルであるＡ
ＴＧが必要なので、最低１個のメチオニンをＮ−末端ア
ミノ酸の前に付加さけておかな（′Ｊればむらない。ま
た、ヒｌ− Ｉラスターゼ■蛋白をつくるばあにエラス
ターげ活性さえ保持されれば、Ｎ−末端アミノ酸の前に
１個または複数個のアミノ酸を付加することや、いくつ
かのアミノ酸をＮ−末端側もしくはＣ−末端側で削るこ
と・ｂできる。また、読粋の調整その他の目的で適当な
長さのＤＮＡ鎖をリンノＪ−として結合さけることもで
きる。このＪ：うなりＮＡ鎖の加工は、現在の遺伝子Ｔ
学技術では、制限酵素おにびｒｌＮＡ化学合成技術を利
用すれば容易に実施することができる。
このようにしてつくったプラスミドににる微牛物の形質
転換は、遺伝子工学ないし生物Ｔ学の分野で慣用されて
いる合口目的な任意の方法ににつて行イｔうことができ
る。その一般的な事項については適当イ【成書または総
説！ことえばＴ、Ｈａｎｉａｔｉｓ。
転換は、遺伝子工学ないし生物Ｔ学の分野で慣用されて
いる合口目的な任意の方法ににつて行イｔうことができ
る。その一般的な事項については適当イ【成書または総
説！ことえばＴ、Ｈａｎｉａｔｉｓ。
Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、 Ｊ、Ｓａｍｈｒｏｏに：
「Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−＾ １ａｂｏ
ｒａｒｏｙ Ｍａｎｕａｌ Ｊ 、Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、
（１９８２）を参照すればよい。
「Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−＾ １ａｂｏ
ｒａｒｏｙ Ｍａｎｕａｌ Ｊ 、Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、
（１９８２）を参照すればよい。
形質転換体は、本発明ＤＮＡ鎖にＪ：つで導入された遺
伝情報による新しい形質（すなわらヒトエラスターゼ■
の産生能）おＪ：び使用ベクター由来の形質４にらびに
場合によっては生じているかも知れない遺伝子組換時の
使用ベクターからの一部の遺伝情報の欠落による対応形
質の欠落を除けば、そのゼノタイプないしフェノタイプ
あるいは菌学的性質において使用宿主微生物と同じであ
る。
伝情報による新しい形質（すなわらヒトエラスターゼ■
の産生能）おＪ：び使用ベクター由来の形質４にらびに
場合によっては生じているかも知れない遺伝子組換時の
使用ベクターからの一部の遺伝情報の欠落による対応形
質の欠落を除けば、そのゼノタイプないしフェノタイプ
あるいは菌学的性質において使用宿主微生物と同じであ
る。
ｌ匠性皿旦犬Ｊ／蛋白の生産
上記のようにして得られる形質転換体のクローンは、こ
れを培養すれば培養物中にヒ１へ１ラスターゼ■、ヒト
プロエラスター１２ ｍまたはヒ１−プレプロエラスタ
ーゼ■を産生ずる。ブレアロエラスクーゼＩ［は、膵臓
外に分泌されるときにブ［１エラスターゼ■となり、こ
れがざらに−１−指腹でトリプシン等にＪ：り分解され
て成熟蛋白寸なわ）５ヒ１〜エラスターゼ■に変化する
といわれているのぐ、本発明ににつてこのようなヒｌ−
Ｉラスターゼ■前駆体蛋白が街られたときはこれをトリ
プシン等によって処理すればヒトプエラスターゼ■と同
一のものが得られると考えられる。
れを培養すれば培養物中にヒ１へ１ラスターゼ■、ヒト
プロエラスター１２ ｍまたはヒ１−プレプロエラスタ
ーゼ■を産生ずる。ブレアロエラスクーゼＩ［は、膵臓
外に分泌されるときにブ［１エラスターゼ■となり、こ
れがざらに−１−指腹でトリプシン等にＪ：り分解され
て成熟蛋白寸なわ）５ヒ１〜エラスターゼ■に変化する
といわれているのぐ、本発明ににつてこのようなヒｌ−
Ｉラスターゼ■前駆体蛋白が街られたときはこれをトリ
プシン等によって処理すればヒトプエラスターゼ■と同
一のものが得られると考えられる。
また、キモシン道伝子を酵母で発現さけるときにキモシ
ンを直接つくらせるにりもブロー１＝ Ｅシンをつくら
ｌたどきに１０倍以上の生産効率があったとの報告があ
るので（Ｊ、Ｈｃｌｌｏｒ、 Ｈ，，１，Ｄｏｂｓｏｎ
。
ンを直接つくらせるにりもブロー１＝ Ｅシンをつくら
ｌたどきに１０倍以上の生産効率があったとの報告があ
るので（Ｊ、Ｈｃｌｌｏｒ、 Ｈ，，１，Ｄｏｂｓｏｎ
。
Ｎ、＾、Ｒｏｂｃｒｔｓ、 Ｈ，ｒ、１ｕｉｔｅ、 、
１．Ｓ、Ｆｍｔａｇｌ、 Ｓ、Ｗ旧ｔｅ。
１．Ｓ、Ｆｍｔａｇｌ、 Ｓ、Ｗ旧ｔｅ。
Ｐ、Ａ、ｌ−ｏｗｅ、 １’、Ｐａｌ：ｅ、 Ａ、、１
．Ｋｉｎｇｓｍａｎ、 Ｓ、１４．Ｋｉｎｇｓｎ＋ａｎ
Ｇｅｎｅ、 ２４．１〜１４ （１９８３） ） 、本
発明でもこのブレプ［１部分の配列を利用して大量生産
を容易に覆ることも考えられる３゜ 形質転換体の培養ないし増殖条イ′１は、使用宿主微生
物に対するそれど本質的には変らない。また、培養物す
なわち菌体内おＪ：び（または）培養液からの産生蛋白
の回収−ｂ常法に従って行なうことができる。
．Ｋｉｎｇｓｍａｎ、 Ｓ、１４．Ｋｉｎｇｓｎ＋ａｎ
Ｇｅｎｅ、 ２４．１〜１４ （１９８３） ） 、本
発明でもこのブレプ［１部分の配列を利用して大量生産
を容易に覆ることも考えられる３゜ 形質転換体の培養ないし増殖条イ′１は、使用宿主微生
物に対するそれど本質的には変らない。また、培養物す
なわち菌体内おＪ：び（または）培養液からの産生蛋白
の回収−ｂ常法に従って行なうことができる。
実 験 例
■、ラッ１〜エラスターゼ■遺伝−のクローニングウイ
スターラッ１〜（日本チャールスリバー社Ｊ：り入手）
をエーテル麻酔後、ただちに膵臓を取り出し、グアニジ
ンヂオシアネ−１〜を変性剤として用い、かつ塩化セシ
・クム密度勾配遠心で精製する方法によって、ＲＮＡを
取得した（詳細な実験条件は、十用和１（ν、藤月義明
二［細胞■学ＩＬ、２９８〜３０３ （１９８２）参照
）。このＲＮ Ａ Ｊ：すｍＲＮＡを得るため、これを
オリゴｄＴセルロースカラムクロマトグラフィーにより
精製し、オリゴｄ王に吸着するポリ（Δ）をもったｍＲ
ＮＡだけを取得した。ラフ１ル１匹より約１０の膵臓が
得られ、ｍＲＮＡは２００μｑ得られた。次に、このｍ
ＲＮＡをデンプμ−］へとしてオカヤマバーク法により
ｃＤＮＡを作成した。実験手順は下記の通りである（訂
細な実験条件は、重定勝哉：［細胞■学Ｊ２，６１（１
〜６２６ （１９８３）を参照）。
スターラッ１〜（日本チャールスリバー社Ｊ：り入手）
をエーテル麻酔後、ただちに膵臓を取り出し、グアニジ
ンヂオシアネ−１〜を変性剤として用い、かつ塩化セシ
・クム密度勾配遠心で精製する方法によって、ＲＮＡを
取得した（詳細な実験条件は、十用和１（ν、藤月義明
二［細胞■学ＩＬ、２９８〜３０３ （１９８２）参照
）。このＲＮ Ａ Ｊ：すｍＲＮＡを得るため、これを
オリゴｄＴセルロースカラムクロマトグラフィーにより
精製し、オリゴｄ王に吸着するポリ（Δ）をもったｍＲ
ＮＡだけを取得した。ラフ１ル１匹より約１０の膵臓が
得られ、ｍＲＮＡは２００μｑ得られた。次に、このｍ
ＲＮＡをデンプμ−］へとしてオカヤマバーク法により
ｃＤＮＡを作成した。実験手順は下記の通りである（訂
細な実験条件は、重定勝哉：［細胞■学Ｊ２，６１（１
〜６２６ （１９８３）を参照）。
′！Ｊ′イ１わノ５、ｍＲＮＡどＡリボｄ １を末端に
５０個はど１・１加されたベクターブライマーＤ ＮＡ
とをまげ、逆転写酵素を加えて、ベクタープライマーＤ
ＮＡの（１丁部分をブライマーにしてｍＲＮＡにｆｆ１
＝ｉ ＴＪる相補鎖ＤＮＡを合成させる。次にこのＤＮ
Ａ断片にｄＣＴＰとターミナルトランスフエラーびとを
加えて両末端にｄＣを２０個はどト）加する。制限酵素
ｔ−１ｉ ｎ ｄ ｍでこのベクターブライマーＤＮＡ
部分の一部を切断（）で、ｄＣ（Ｎｌ加端部をある艮ざ
にわたって取り除く。一方、一方の端が１ｌｉｎｄ［［
ど同じ切断末端をもちかつ他方の末端にｄＧを２０個程
度イ」加したリンカ−１−］Ｎ△断片を用意して、これ
を前記１１ｉｎｄｌｌ［消化物に加え、両ＤＮＡを環状
に結合さ口る。
５０個はど１・１加されたベクターブライマーＤ ＮＡ
とをまげ、逆転写酵素を加えて、ベクタープライマーＤ
ＮＡの（１丁部分をブライマーにしてｍＲＮＡにｆｆ１
＝ｉ ＴＪる相補鎖ＤＮＡを合成させる。次にこのＤＮ
Ａ断片にｄＣＴＰとターミナルトランスフエラーびとを
加えて両末端にｄＣを２０個はどト）加する。制限酵素
ｔ−１ｉ ｎ ｄ ｍでこのベクターブライマーＤＮＡ
部分の一部を切断（）で、ｄＣ（Ｎｌ加端部をある艮ざ
にわたって取り除く。一方、一方の端が１ｌｉｎｄ［［
ど同じ切断末端をもちかつ他方の末端にｄＧを２０個程
度イ」加したリンカ−１−］Ｎ△断片を用意して、これ
を前記１１ｉｎｄｌｌ［消化物に加え、両ＤＮＡを環状
に結合さ口る。
次に、ＲＮ ａｓ ｅ ｌ−（、ＤＮＡボリメラーＬ’
Ｈａ’；よびＤＮΔＮＡ−ぜによりｍＲＮＡ部分をと
りのぞいてＤＮ’Ａに回きかえる。このようにして、ラ
ット膵Ｈａ ｍ ｒ＜ ＮＡ２．５μ０どベクタープラ
イマーＤＮＡ１．５１１＜ｈとを使用し、リンツノ−１
１ＮΔ断片Ｑ、０７７１Ｏを加えてａ Ｄ ＮＡを（ｑ
だ。
Ｈａ’；よびＤＮΔＮＡ−ぜによりｍＲＮＡ部分をと
りのぞいてＤＮ’Ａに回きかえる。このようにして、ラ
ット膵Ｈａ ｍ ｒ＜ ＮＡ２．５μ０どベクタープラ
イマーＤＮＡ１．５１１＜ｈとを使用し、リンツノ−１
１ＮΔ断片Ｑ、０７７１Ｏを加えてａ Ｄ ＮＡを（ｑ
だ。
このＧＤＮＡで大腸菌ＲＲＴ株（Ｂｏｌ １ｖａｒ、
Ｆ、 ：Ｇｅｎｅ、 ２ 、９５ （１９７７） ）を
形質転換させたところ、形質転換体として約５万個のク
ローンが得られた。
Ｆ、 ：Ｇｅｎｅ、 ２ 、９５ （１９７７） ）を
形質転換させたところ、形質転換体として約５万個のク
ローンが得られた。
この大腸菌の中からラツ］〜エラスターゼ■遺伝了を持
つものを探すため、既知のラットエラスターゼＩＩ ３
Ｗ伝子（前記ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＳ２１． １４
５３−１４６３（１９８２））の一部を化学合成してプ
ローブとした。
つものを探すため、既知のラットエラスターゼＩＩ ３
Ｗ伝子（前記ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＳ２１． １４
５３−１４６３（１９８２））の一部を化学合成してプ
ローブとした。
さらに詳しくは、ラットエラスターゼ■遺伝子のＣ−末
端部分に相当する ＡＵＬＪ ＧＣＡ ＡＡＧ ＡＡＧ ＵＡΔ３
’ＴＡＡ ＣＧＴ ＴＴＣＴＴＧ ＡＴＴ５のｆ
ｌＸｌＸ列配列る。上側がラットエラスターゼｍＲＮＡ
であり、下側が合成されたＡリゴヌクレオヂドのプロー
ブであって、ｍＲＮＡに対する相補鎖どなっている。合
成法は固相リン酸トリエステル法に依った（詳細は、Ｆ
、０ｈｔｓｕｋａ、 Ｈｊｋｅｈａｒａ。
端部分に相当する ＡＵＬＪ ＧＣＡ ＡＡＧ ＡＡＧ ＵＡΔ３
’ＴＡＡ ＣＧＴ ＴＴＣＴＴＧ ＡＴＴ５のｆ
ｌＸｌＸ列配列る。上側がラットエラスターゼｍＲＮＡ
であり、下側が合成されたＡリゴヌクレオヂドのプロー
ブであって、ｍＲＮＡに対する相補鎖どなっている。合
成法は固相リン酸トリエステル法に依った（詳細は、Ｆ
、０ｈｔｓｕｋａ、 Ｈｊｋｅｈａｒａ。
Ｄ、５ｏｌｌ ： Ｎｕｃｌｃｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ １０．６５５．３−６５７０ （１９
８２）参照）。この合成オリゴヌクレオヂドにＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼをつかってγ〔３２Ｐ〕△ＴＰよ
りリン酸基を転移させて、これを標識した。これをプロ
ーブとして、ｃＤＮＡの入った形質転換体をスクリーニ
ングした。スクリーニング法は］ロニーハイプリダイゼ
ーション法でおこなった。号なわら、二１−ロセルロー
スーノイルター上で成育した菌体をアルカリ変性さけて
、菌体内のｌ） Ｎ Ａをフィルター」−に焼付（）る
。そのフィルターをプローブＤＮＡを含むハイブリダイ
ゼーション液中におくと、ＤＮＡの塩廿配列に相同性の
あるものだＩ′ｊがある条件下で結合する（詳細は、高
木庫敬編［遺伝子操作マニコアル−１（講談社）参照）
。これをオートラジオグラフィーに付しで、プラスかマ
イナスかを判定する。相同の配列を含むクローン゛は黒
く着色される。実際には、約２０００個のクローンをス
クリーニングして、１２個のポジティブクローンが得ら
れた。ハイブリダイゼーションの条件は６ＸＳＳＣ１５
Ｘデンハルト溶液／３５℃／１６時間であり、６×ＳＳ
Ｃ／３５℃／３０分で２回洗浄した。これらのクローン
について、プラスミドをアルカリ法（Ｔ、Ｈａｎｉａｔ
ｉｓ、 ｃ、ｒ、「ｒ目ｓｃｈ、 、１．５ａｎｂｒｏ
ｏｋ ニー ２ ｌ − 口（ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｉ−ｏ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｊ 参照）に
より取得し、制限酵素切断地図を作成して文献報告のも
のと比較したところ、完全に一致した。このようにして
、ラットエラスターゼＩｍ仏子が得られた。
５ｅａｒｃｈ １０．６５５．３−６５７０ （１９
８２）参照）。この合成オリゴヌクレオヂドにＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼをつかってγ〔３２Ｐ〕△ＴＰよ
りリン酸基を転移させて、これを標識した。これをプロ
ーブとして、ｃＤＮＡの入った形質転換体をスクリーニ
ングした。スクリーニング法は］ロニーハイプリダイゼ
ーション法でおこなった。号なわら、二１−ロセルロー
スーノイルター上で成育した菌体をアルカリ変性さけて
、菌体内のｌ） Ｎ Ａをフィルター」−に焼付（）る
。そのフィルターをプローブＤＮＡを含むハイブリダイ
ゼーション液中におくと、ＤＮＡの塩廿配列に相同性の
あるものだＩ′ｊがある条件下で結合する（詳細は、高
木庫敬編［遺伝子操作マニコアル−１（講談社）参照）
。これをオートラジオグラフィーに付しで、プラスかマ
イナスかを判定する。相同の配列を含むクローン゛は黒
く着色される。実際には、約２０００個のクローンをス
クリーニングして、１２個のポジティブクローンが得ら
れた。ハイブリダイゼーションの条件は６ＸＳＳＣ１５
Ｘデンハルト溶液／３５℃／１６時間であり、６×ＳＳ
Ｃ／３５℃／３０分で２回洗浄した。これらのクローン
について、プラスミドをアルカリ法（Ｔ、Ｈａｎｉａｔ
ｉｓ、 ｃ、ｒ、「ｒ目ｓｃｈ、 、１．５ａｎｂｒｏ
ｏｋ ニー ２ ｌ − 口（ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｉ−ｏ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｊ 参照）に
より取得し、制限酵素切断地図を作成して文献報告のも
のと比較したところ、完全に一致した。このようにして
、ラットエラスターゼＩｍ仏子が得られた。
■６ヒ１〜エラスターゼＴＥＭ伝子のクローニングラッ
ト■ラスターゼＩＩＩ伝子の場合とまったく同じ方法で
ｍＲＮＡを取得し、ざらにｃＤＮＡを作成した。ヒトの
膵臓約２０よりｍＲＮＡ２００μａが得られた。ざらに
、ｍＲＮＡ５．０／ｌＱ。
ト■ラスターゼＩＩＩ伝子の場合とまったく同じ方法で
ｍＲＮＡを取得し、ざらにｃＤＮＡを作成した。ヒトの
膵臓約２０よりｍＲＮＡ２００μａが得られた。ざらに
、ｍＲＮＡ５．０／ｌＱ。
ベクターブライマーＤＮＡ１．５μＱおよびリンカ−Ｄ
ＮＡ０．０８Ｉｌｑを使って、ｃＤＮＡを含んだ形質転
換体が約３万個得られた。この中からヒトエラスターゼ
ＩＩ ｉｌ！仏子をスクリーニングしたわけであるが、
プローブとしてラットエラスターゼＩ［３１ｆ伝子の一
部を利用した。ラットエラスターゼ■遺伝子を制限酵素
［）ｄｅ■で分解したのちアガロースゲル電気泳動で分
離を行なって、約７７０ｂｐのフラグメントを得た。こ
の断片にニックトランスレーション法によりα（３”Ｐ
）ｄ ＣＴ Ｐを用いてアイソ１ヘーブラベルを入れＩ
こにツク１〜ランス１ノージョン法の詳細は前掲「遺伝
子操作マニコアル」参照）これをプローブに用い、先に
クツ１〜エラスターゼ■遺伝子のクローニングの際に採
用した］ロニーハイプリダイピーション法でスクリーニ
ングした。ハイブリダイゼーションの条件は６ｘＳＳＣ
１５ｘデンハルト溶液中／６０°Ｃ／１６時間であり、
洗いは６０℃／３０分／２回で行なった。約１０．００
０個Ｊ：す１５個のクローンが得られ、その中で最も艮
いｃＤＮＡ部分を有するもの（Ｅ Ｉ−Ｉ Ｅ １２株
と呼ぶ。
ＮＡ０．０８Ｉｌｑを使って、ｃＤＮＡを含んだ形質転
換体が約３万個得られた。この中からヒトエラスターゼ
ＩＩ ｉｌ！仏子をスクリーニングしたわけであるが、
プローブとしてラットエラスターゼＩ［３１ｆ伝子の一
部を利用した。ラットエラスターゼ■遺伝子を制限酵素
［）ｄｅ■で分解したのちアガロースゲル電気泳動で分
離を行なって、約７７０ｂｐのフラグメントを得た。こ
の断片にニックトランスレーション法によりα（３”Ｐ
）ｄ ＣＴ Ｐを用いてアイソ１ヘーブラベルを入れＩ
こにツク１〜ランス１ノージョン法の詳細は前掲「遺伝
子操作マニコアル」参照）これをプローブに用い、先に
クツ１〜エラスターゼ■遺伝子のクローニングの際に採
用した］ロニーハイプリダイピーション法でスクリーニ
ングした。ハイブリダイゼーションの条件は６ｘＳＳＣ
１５ｘデンハルト溶液中／６０°Ｃ／１６時間であり、
洗いは６０℃／３０分／２回で行なった。約１０．００
０個Ｊ：す１５個のクローンが得られ、その中で最も艮
いｃＤＮＡ部分を有するもの（Ｅ Ｉ−Ｉ Ｅ １２株
と呼ぶ。
また、これに含まれるｃＤＮＡ含有プラスミドを１）
ＨＥ Ｉ−２と呼ぶ）についてベタターブライマー以外
のＤＮＡ部分の塩基配列を決定した。ｊｎ基配列決定は
マキサムギルバー１−法を用い、両方向の鎖を読むよう
にして行なった（方法の詳細は、高浪満、大井龍夫編ｒ
Ｄ Ｎ△シーケンス解析マニュ □アル」 （講
談ネ１）参照）。決定された配列は、第１〜２図に示し
た通りである。このＤＮＡ塩基配列より］−トン表に従
ってアミノ酸に翻訳したものも同時に示されている。
ＨＥ Ｉ−２と呼ぶ）についてベタターブライマー以外
のＤＮＡ部分の塩基配列を決定した。ｊｎ基配列決定は
マキサムギルバー１−法を用い、両方向の鎖を読むよう
にして行なった（方法の詳細は、高浪満、大井龍夫編ｒ
Ｄ Ｎ△シーケンス解析マニュ □アル」 （講
談ネ１）参照）。決定された配列は、第１〜２図に示し
た通りである。このＤＮＡ塩基配列より］−トン表に従
ってアミノ酸に翻訳したものも同時に示されている。
このアミノ酸配列をＣ，ｌ−ａｒｇｍａｎらにより報告
（前記）されているヒトエラスターＬ４ＩＩのプロ体の
Ｎ末端のアミノ酸配列（Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Δ５ｐ−ｐｒ
ｏ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−ｐｒｏ−Ｐ ｒ Ｏ−１−Ｖ ｒ
−Ｖ ａ Ｉ −Ｔ ｈ ｒ −Ａ ｒ ＣＪ −Ｖａ
ｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＧＩＶ）と比較したところブロヒ
］〜エラスターゼＩｒ（Ｂ−Ｄの部分）のＮ末端のアミ
ノ酸配列が完全に一致した。
（前記）されているヒトエラスターＬ４ＩＩのプロ体の
Ｎ末端のアミノ酸配列（Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Δ５ｐ−ｐｒ
ｏ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−ｐｒｏ−Ｐ ｒ Ｏ−１−Ｖ ｒ
−Ｖ ａ Ｉ −Ｔ ｈ ｒ −Ａ ｒ ＣＪ −Ｖａ
ｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＧＩＶ）と比較したところブロヒ
］〜エラスターゼＩｒ（Ｂ−Ｄの部分）のＮ末端のアミ
ノ酸配列が完全に一致した。
微生物の寄託
本発明に関係する下記の微生物は、■業技術院微生物工
業技術研究所から受託が拒否された。
業技術研究所から受託が拒否された。
（１） ヒトエラスターゼ■遺伝子含有プラスミドｐ１
〜ＩＥ［２を含む大腸菌ＲＲ１株（Ｅｌ−ＩＥ１２株）
。
〜ＩＥ［２を含む大腸菌ＲＲ１株（Ｅｌ−ＩＥ１２株）
。
第１〜２図は、ヒトエラスターゼ■遺伝子おＪ：びその
前駆体遺伝子のＤＮＡ塩基配夕１１とその塩基配列にり
推定されるアミノ酸配列とを示すものであつで、第１図
は１８０番目のアミノ酸までを、第２図は１８１番目以
降のアミノ酸を示すものである。 出願人代即人 猪 股 清 箆Ｉ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｔ Ｔ
ｈｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｖａｌ １ＣＣＣＴＧＧ ＣＡ
Ｇ ＧＴＣＴＣＣＣＴＧ ＣＡＧ ＴＡＣＡＧＣＴＣＣ
。 Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇ
ｉｎ Ｔｙｒ Ｓｅｒ ＳｅトＴＣＣＣＴＧ ＡＴＡ
ＧＣＣＭＣＡＧＣＴＧＧ ＧＴＣＣＴＧ ＡＣＧ・Ｓｅ
ｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｓｎ Ｓｅ
ｒ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｌｅｕ ＴｈＧＡＣＡＴ
Ｔ ＧＣＣＣＴＧ ＣＴＣＡＡＡ ＣＴＧ ＧＣＴ Ａ
ＡＣＣＣＧｌｙ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａ
ｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒ図 ；ＧＣＧＧＴ ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＣＧ ＡＧＧ ＣＣ
ＣＭＣＡＧＣＴＧＧ；ｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ△
ｌａ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｔｒｐ＼ＡＴ
ＧＧＣＡＡＧ ＴＧＧ ＴＡＣＣＡＣＡＣＣＴＧＣＧ
ＧＡ ＧＧＧ＼ｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｒｐ
Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｙ
ＧｌｙＥＣＴ ＧＣＣＣＡＣＴＧＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣ
ＴＣＣＡＧＧ ＡＣＣｒＧＧ ＡＡＣＴＣＣＡＡＣＣＡ
Ａ ＡＴＣＴＣＣＡＡＡ ＧＧＧ ＡＡＣ兎２ ＧＴＧ’ ＧＡＣＴＡＴ ＧＣＣＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡ
ＧＣＴＣＴ ＧＣＣＶａｌ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ ＡＩＯＴＴ
Ｇ ＧＡＡ ＡＧＧ ＴＣＡ ＣＡＧ ＭＧ ＧＡＡ
ＡＴＡ ＡＴＡ ＴＡＡ図 ＴＧＧ ＴＧＧ ＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧ ＡＡＡ
ＡＣＣＡＧＴ ＡＴＧＴｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ ＭｅｔＧ
ＴＣＴＴＣＡＣＧ ＣＧＧ ＧＴＣＴＣＣＡＡＴ ＴＣ
ＣＡＴＣＧＡＣＴＡＡ ＡＧＴ ＧＡＣＡＡＣＴＡＴ
ＧＣＡ ＡＡＴ Ｃ手υｃンｔｉｉ−ＩＩＥ書 昭和６０年１０月３Ｌ＋
前駆体遺伝子のＤＮＡ塩基配夕１１とその塩基配列にり
推定されるアミノ酸配列とを示すものであつで、第１図
は１８０番目のアミノ酸までを、第２図は１８１番目以
降のアミノ酸を示すものである。 出願人代即人 猪 股 清 箆Ｉ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｔ Ｔ
ｈｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｖａｌ １ＣＣＣＴＧＧ ＣＡ
Ｇ ＧＴＣＴＣＣＣＴＧ ＣＡＧ ＴＡＣＡＧＣＴＣＣ
。 Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇ
ｉｎ Ｔｙｒ Ｓｅｒ ＳｅトＴＣＣＣＴＧ ＡＴＡ
ＧＣＣＭＣＡＧＣＴＧＧ ＧＴＣＣＴＧ ＡＣＧ・Ｓｅ
ｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｓｎ Ｓｅ
ｒ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｌｅｕ ＴｈＧＡＣＡＴ
Ｔ ＧＣＣＣＴＧ ＣＴＣＡＡＡ ＣＴＧ ＧＣＴ Ａ
ＡＣＣＣＧｌｙ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａ
ｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒ図 ；ＧＣＧＧＴ ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＣＧ ＡＧＧ ＣＣ
ＣＭＣＡＧＣＴＧＧ；ｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ△
ｌａ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｔｒｐ＼ＡＴ
ＧＧＣＡＡＧ ＴＧＧ ＴＡＣＣＡＣＡＣＣＴＧＣＧ
ＧＡ ＧＧＧ＼ｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｒｐ
Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｙ
ＧｌｙＥＣＴ ＧＣＣＣＡＣＴＧＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣ
ＴＣＣＡＧＧ ＡＣＣｒＧＧ ＡＡＣＴＣＣＡＡＣＣＡ
Ａ ＡＴＣＴＣＣＡＡＡ ＧＧＧ ＡＡＣ兎２ ＧＴＧ’ ＧＡＣＴＡＴ ＧＣＣＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡ
ＧＣＴＣＴ ＧＣＣＶａｌ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ ＡＩＯＴＴ
Ｇ ＧＡＡ ＡＧＧ ＴＣＡ ＣＡＧ ＭＧ ＧＡＡ
ＡＴＡ ＡＴＡ ＴＡＡ図 ＴＧＧ ＴＧＧ ＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧ ＡＡＡ
ＡＣＣＡＧＴ ＡＴＧＴｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ ＭｅｔＧ
ＴＣＴＴＣＡＣＧ ＣＧＧ ＧＴＣＴＣＣＡＡＴ ＴＣ
ＣＡＴＣＧＡＣＴＡＡ ＡＧＴ ＧＡＣＡＡＣＴＡＴ
ＧＣＡ ＡＡＴ Ｃ手υｃンｔｉｉ−ＩＩＥ書 昭和６０年１０月３Ｌ＋
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、下記の（１）〜（３）からなる群から選ばれるアミ
ノ酸配列のポリペプチドをコードする塩基配列を有する
ことを特徴とする、ヒトエラスターゼIIの生物工学的産
生能を有するＤＮＡ鎖。 （１）第１図および第２図にわたって示されているアミ
ノ酸配列のうち、ＣからＤまでのもの、（２）第１図お
よび第２図にわたって示されているアミノ酸配列のうち
、ＢからＤまでのもの、（３）第１図および第２図にわ
たって示されているアミノ酸配列のうち、ＡからＤまで
のもの。 ２、ポリペプチドをコードする塩基配列が第１図および
第２図にわたって示されている塩基配列のうちＣからＤ
までのもの、ＢからＤまでのもの、またはＡからＤまで
のもの、である特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ鎖
。 ３、下記の（１）〜（３）からなる群から選ばれるアミ
ノ酸配列のポリペプチドをコードする塩基配列を有する
ＤＮＡ鎖をその遺伝情報が発現可能な状態で含むプラス
ミドによって形質転換されたものであることを特徴とす
る、ヒトエラスターゼII産生能を有する微生物。 （１）第１図および第２図にわたって示されているアミ
ノ酸配列のうち、ＣからＤまでのもの、（２）第１図お
よび第２図にわたって示されているアミノ酸配列のうち
、ＢからＤまでのもの、（３）第１図および第２図にわ
たって示されているアミノ酸配列のうち、ＡからＤまで
のもの。 ４、微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉであ
る、特許請求の範囲第３項に記載の微生物。 ５、ＤＮＡ鎖が、その塩基が第１図および第２図にわた
って示されている塩基配列のうちＣからＤまでのもの、
ＢからＤまでのもの、またはＡからＤまでのもの、であ
る特許請求の範囲第３〜４項のいずれか１項に記載の微
生物。 ６、下記の（１）〜（３）からなる群から選ばれるアミ
ノ酸配列のポリペプチドをコードする塩基配列を有する
ＤＮＡ鎖を用意し、このＤＮＡ鎖を、これをその遺伝情
報が発現可能な状態で含むプラスミドの作成、このプラ
スミドによる微生物の形質転換および得られる形質転換
体の培養からなる工程に付して、培養物中にヒトエラス
ターゼIIを産生させることを特徴とする、ヒトエラスタ
ーゼIIの生物工学的製造法。 （１）第１図および第２図にわたって示されているアミ
ノ酸配列のうち、ＣからＤまでのもの、（２）第１図お
よび第２図にわたって示されているアミノ酸配列のうち
、ＢからＤまでのもの、（３）第１図および第２図にわ
たって示されているアミノ酸配列のうち、ＡからＤまで
のもの。 ７、微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである
、特許請求の範囲第６項に記載の方法。 ８、ＤＮＡ鎖が、その塩基が第１図および第２図にわた
って示されている塩基配列のうちＣからＤまでのもの、
ＢからＤまでのもの、またはＡからＤまでのもの、であ
る特許請求の範囲第６〜７項のいずれか１項に記載の方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60034049A JPS61192288A (ja) | 1985-02-22 | 1985-02-22 | ヒトエラスタ−ゼ２の生物工学的製造 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60034049A JPS61192288A (ja) | 1985-02-22 | 1985-02-22 | ヒトエラスタ−ゼ２の生物工学的製造 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61192288A true JPS61192288A (ja) | 1986-08-26 |
Family
ID=12403441
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60034049A Pending JPS61192288A (ja) | 1985-02-22 | 1985-02-22 | ヒトエラスタ−ゼ２の生物工学的製造 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61192288A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62130686A (ja) * | 1985-07-26 | 1987-06-12 | Sankyo Co Ltd | ヒト・膵臓エラスタ−ゼ−２ａ |
| EP0244189A2 (en) * | 1986-04-26 | 1987-11-04 | Sankyo Company Limited | Human pancreatic elastase I |
| US7034132B2 (en) | 2001-06-04 | 2006-04-25 | Anderson David W | Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use |
-
1985
- 1985-02-22 JP JP60034049A patent/JPS61192288A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62130686A (ja) * | 1985-07-26 | 1987-06-12 | Sankyo Co Ltd | ヒト・膵臓エラスタ−ゼ−２ａ |
| EP0244189A2 (en) * | 1986-04-26 | 1987-11-04 | Sankyo Company Limited | Human pancreatic elastase I |
| US7034132B2 (en) | 2001-06-04 | 2006-04-25 | Anderson David W | Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use |
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