JPS61192288A - ヒトエラスタ−ゼ2の生物工学的製造 - Google Patents
ヒトエラスタ−ゼ2の生物工学的製造Info
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- JPS61192288A JPS61192288A JP60034049A JP3404985A JPS61192288A JP S61192288 A JPS61192288 A JP S61192288A JP 60034049 A JP60034049 A JP 60034049A JP 3404985 A JP3404985 A JP 3404985A JP S61192288 A JPS61192288 A JP S61192288A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6448—Elastases, e.g. pancreatic elastase (3.4.21.36); leukocyte elastase (3.4.31.37)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ル明の背!貝
技術分野
本発明、ヒトエラスターゼ■の!1.物工学的・製造に
関する。さらに4休的には、本発明は、(1)ヒトエラ
スター[!■の牛物工学的産牛能を右゛りる1) N
A鎖、(2)このDNA鎖を王の遺伝情報が発現可能な
状態で含むプラスミドににつて形質転換されIこヒ1−
エラスターゼ■産生性微生物、すなわら−1−記D N
Δ鎖の性質を専ら利用する物、および(3)この微生物
の培養によるヒトエラスターゼ■の生産法、すなわち上
記DNA鎖を使用する方法、に関する。
関する。さらに4休的には、本発明は、(1)ヒトエラ
スター[!■の牛物工学的産牛能を右゛りる1) N
A鎖、(2)このDNA鎖を王の遺伝情報が発現可能な
状態で含むプラスミドににつて形質転換されIこヒ1−
エラスターゼ■産生性微生物、すなわら−1−記D N
Δ鎖の性質を専ら利用する物、および(3)この微生物
の培養によるヒトエラスターゼ■の生産法、すなわち上
記DNA鎖を使用する方法、に関する。
一般に、1ラスターゼは、Qli乳動物膵臓細胞等によ
って産生される所謂セリンブロテアーピの一種であって
、不溶性硬蛋白であるエラスチンを分解するきわめて特
異なプロテアーゼである。]〕ラ一 3 − スクーゼは経口段!jで人の動脈硬化症等の治療に有効
であることが確認されており、従来ブタの膵臓から抽出
された所謂ブタ1−ラスターゼが医薬品(血−代謝改善
剤)として既に実用化されており、ヒトエラスターゼに
ついて同様の薬効が期待されている。
って産生される所謂セリンブロテアーピの一種であって
、不溶性硬蛋白であるエラスチンを分解するきわめて特
異なプロテアーゼである。]〕ラ一 3 − スクーゼは経口段!jで人の動脈硬化症等の治療に有効
であることが確認されており、従来ブタの膵臓から抽出
された所謂ブタ1−ラスターゼが医薬品(血−代謝改善
剤)として既に実用化されており、ヒトエラスターゼに
ついて同様の薬効が期待されている。
吐乳動物の膵臓細胞では、211i類のエラスターゼが
産生され、それらは互いに物理化学的に、酵素学的にま
た抗原性の面から異なっていて、エラスターゼ■および
エラスターゼI[とそれぞれ呼ばれている。なお、医薬
品として実用化されているブタエラスターぜは、前者を
有効成分とするものである。
産生され、それらは互いに物理化学的に、酵素学的にま
た抗原性の面から異なっていて、エラスターゼ■および
エラスターゼI[とそれぞれ呼ばれている。なお、医薬
品として実用化されているブタエラスターぜは、前者を
有効成分とするものである。
エラスターゼは、■、■ともに、それぞれ、膵臓細胞内
でプレプロエラスターゼとして産生きれ、これが細胞外
に分泌されるどきにプロエラスターゼ(不活性なエラス
ターゼ前駆体)となり、さらに細胞外でトリプシン等の
酵素作用を受1ノでエラスチン分解活性を有するエラス
ターゼに変化するものど考えられている。
でプレプロエラスターゼとして産生きれ、これが細胞外
に分泌されるどきにプロエラスターゼ(不活性なエラス
ターゼ前駆体)となり、さらに細胞外でトリプシン等の
酵素作用を受1ノでエラスチン分解活性を有するエラス
ターゼに変化するものど考えられている。
= 4 −
先行技*
ブタエラスタービ■については、D、H,St+ott
onet atによりモのアミノ酸配列が報告されてい
る(Nature、 2251’eb 28.802(
1970) )。
onet atによりモのアミノ酸配列が報告されてい
る(Nature、 2251’eb 28.802(
1970) )。
また、ラットエラスターゼ■および■については、Ra
ymond J、 HacDonald et a’l
らが行った分子生物学的解析により、関連するmRN△
の塩基配列並びにアミノ酸配列が解明されている( B
10ChOIIliSIry、 21.1453−14
63(InO2) )。
ymond J、 HacDonald et a’l
らが行った分子生物学的解析により、関連するmRN△
の塩基配列並びにアミノ酸配列が解明されている( B
10ChOIIliSIry、 21.1453−14
63(InO2) )。
さらにヒトエラスターゼについてはC,largman
at alにより、1と■がヒl−の膵臓組織から精製
されて、それらの性質が調査報告されている( Bio
chemistry、’ 1!1(11)、2491(
1976)) 。さらに、ヒトエラスターゼ 末端のアミノ酸配列(16り)も報告されている(C,
largman Ot at : Bioc
himica at Biophysica八ct
a 623へ1980)20B −212) 。
at alにより、1と■がヒl−の膵臓組織から精製
されて、それらの性質が調査報告されている( Bio
chemistry、’ 1!1(11)、2491(
1976)) 。さらに、ヒトエラスターゼ 末端のアミノ酸配列(16り)も報告されている(C,
largman Ot at : Bioc
himica at Biophysica八ct
a 623へ1980)20B −212) 。
また膵臓中のエラスターゼの存在量は、ブタについては
Tラスターゼ■が多く、ヒ1−についてはエラスターゼ
11が多いことが報告されでいる(Biocb、15
2491(1976)) 。
Tラスターゼ■が多く、ヒ1−についてはエラスターゼ
11が多いことが報告されでいる(Biocb、15
2491(1976)) 。
発明の概要
要 旨
本発明は、組換えDNA技術による新規なヒトエラスタ
ーゼ11の製造手段を提供づるものである。
ーゼ11の製造手段を提供づるものである。
寸なわら、本発明によるに1〜エラスターゼ■の生物工
学的産生能を右Jるl) N A鎖は、下記の(1)〜
(3)からなる群から選ばれるアミノ酸配列のポリペプ
チドを]−ド覆る塩基配列を有Jること、を特徴とする
ものである。
学的産生能を右Jるl) N A鎖は、下記の(1)〜
(3)からなる群から選ばれるアミノ酸配列のポリペプ
チドを]−ド覆る塩基配列を有Jること、を特徴とする
ものである。
また、本発明ににるヒトエラスターゼ■産生能を有Jる
微生物は、下記の(1)〜(3)からなる群から選ばれ
るアミノ酸配列のポリペプチドをコードする塩基配列を
有するDNA鎖をその遺伝情報I界発現可能な状態で含
むプラスミドによって形質転換されたものであること、
を特徴どするものである。
微生物は、下記の(1)〜(3)からなる群から選ばれ
るアミノ酸配列のポリペプチドをコードする塩基配列を
有するDNA鎖をその遺伝情報I界発現可能な状態で含
むプラスミドによって形質転換されたものであること、
を特徴どするものである。
さらにまた、本発明によるヒトエラスターゼ■の生物工
学的製造法は、下記の(1)〜(3)からなる群から選
ば、れるアミノ酸配列のポリペプチドをコードするiM
1基配列配列するDNA鎖を用意し、このD NA鎖を
、これをその遺伝情報が発現可能な状態で含むプラスミ
ドの作成、このプラスミドにJ、る微I(−物の形質転
換および得られた形質転換体の培養からhる1稈に付し
て、培養物中にヒトエラスターゼ■を産生ざけることを
特徴とするbのeある。
学的製造法は、下記の(1)〜(3)からなる群から選
ば、れるアミノ酸配列のポリペプチドをコードするiM
1基配列配列するDNA鎖を用意し、このD NA鎖を
、これをその遺伝情報が発現可能な状態で含むプラスミ
ドの作成、このプラスミドにJ、る微I(−物の形質転
換および得られた形質転換体の培養からhる1稈に付し
て、培養物中にヒトエラスターゼ■を産生ざけることを
特徴とするbのeある。
(1) 第1図および第2図にわたって示されているア
ミノ酸配列のうち、CからDまでのもの、(2) 第1
図および第2図にわI、:つて示されているアミノ酸配
列のうち、BからDまでのもの、(3) 第1図および
第2図にわたー)で示されているアミノ酸配列のうら、
△から])までのもの。
ミノ酸配列のうち、CからDまでのもの、(2) 第1
図および第2図にわI、:つて示されているアミノ酸配
列のうち、BからDまでのもの、(3) 第1図および
第2図にわたー)で示されているアミノ酸配列のうら、
△から])までのもの。
なお、本発明は上記の(1)〜(3)からなる群から選
ばれるアミノ酸配列のポリペプチドからなる、微(1物
によって生産されたヒ1〜エラスターゼ■、に関するも
のともいえる。
ばれるアミノ酸配列のポリペプチドからなる、微(1物
によって生産されたヒ1〜エラスターゼ■、に関するも
のともいえる。
効 果
本発明によれば、ヒ1〜エラスターゼ■を、形り1転換
さ4!た微生物により産生さt!ることができる。
さ4!た微生物により産生さt!ることができる。
従って、膵臓器から抽出づ−る方法に比べ、より有効に
ヒトエラスターゼ■を産生させ、単離し得る可能性があ
る。
ヒトエラスターゼ■を産生させ、単離し得る可能性があ
る。
本発明によって産と1]されるヒトエラスターゼ■はヒ
ト型であるので、医薬として用いる場合にはブタエラス
ターゼ■を凌ぐ薬効が期待される。
ト型であるので、医薬として用いる場合にはブタエラス
ターゼ■を凌ぐ薬効が期待される。
また、本発明の好ましい一実施態様(詳細後記)によれ
ば、DNAの発現産物として直接活性を右づるヒトエラ
スターゼ■を産生させることができる(膵臓からエラス
ターゼを抽出する場合には、不活性なプロエラスターゼ
として存在するので、精製操作に加えて活性化処理を行
なうことが必要であった)。
ば、DNAの発現産物として直接活性を右づるヒトエラ
スターゼ■を産生させることができる(膵臓からエラス
ターゼを抽出する場合には、不活性なプロエラスターゼ
として存在するので、精製操作に加えて活性化処理を行
なうことが必要であった)。
なお、組換えDNA技術が今日非常な発展を遂げている
とはいえ、個々の蛋白に関して常にそれをコードする遺
伝子のり[1−ニングとその発現(産生)成υJを予測
し帽るほとには到っていないのが現状なので、本発明に
よりヒトエラスターゼ■を産生させ得たことは思いが(
プなかったことというべきであろう。
とはいえ、個々の蛋白に関して常にそれをコードする遺
伝子のり[1−ニングとその発現(産生)成υJを予測
し帽るほとには到っていないのが現状なので、本発明に
よりヒトエラスターゼ■を産生させ得たことは思いが(
プなかったことというべきであろう。
= 8 一
定 義
本発明によるヒl−、J’ラスターゼ■の生物]−学的
産生能を右づ゛るI) NΔ鎖づなわノうヒl−1−ラ
スターゼ■遺伝子は、アミノ酸配列が第1図および第2
図にわたって示されているアミノ酸配列のうちCからD
までのもの、BからDまでのもの、または八からDまで
のもの、であるポリペプチドを]−ドする一bのである
。なお、第1図は△から始まるアミノ酸配列の1〜18
0番を、第2図はそれに続く181〜269番を示すも
のであることはいうまでもない(第2図には、269番
目のアミノ酸に対応する]−トンに続<DNAも示され
ている)。
産生能を右づ゛るI) NΔ鎖づなわノうヒl−1−ラ
スターゼ■遺伝子は、アミノ酸配列が第1図および第2
図にわたって示されているアミノ酸配列のうちCからD
までのもの、BからDまでのもの、または八からDまで
のもの、であるポリペプチドを]−ドする一bのである
。なお、第1図は△から始まるアミノ酸配列の1〜18
0番を、第2図はそれに続く181〜269番を示すも
のであることはいうまでもない(第2図には、269番
目のアミノ酸に対応する]−トンに続<DNAも示され
ている)。
ここで、rDNΔ鎖」とはある長さを有するポリデオキ
シリボ核酸の相補的二本鎖を意味づるものである。そし
て、本発明ではこのrDNA鎖」はそれがコードJるポ
リペプチドのアミノ酸配列によって特定されているとこ
ろ、このポリペブヂドは上記にように有限の長さのもの
であるから、このDNA鎖も有限の良さのものである。
シリボ核酸の相補的二本鎖を意味づるものである。そし
て、本発明ではこのrDNA鎖」はそれがコードJるポ
リペプチドのアミノ酸配列によって特定されているとこ
ろ、このポリペブヂドは上記にように有限の長さのもの
であるから、このDNA鎖も有限の良さのものである。
しかし、このDNA鎖はヒ1へエラスターゼ■の遺伝子
を含んでいてこのポリペプチドの生物T学的産生を行な
わけるものであるどころ、この有限の長さの1) N
A鎖のみににってこのJ:うな生物工学的産生が行なえ
るのではなく、その5′ −側上流および(または)3
′ −側IZ流に適当艮ざのD N A鎖が結合した状
態でこのポリペプチドの生物工学的産生が可能どなる訳
である。従って、本発明でrr)NA鎖」というときは
、この特定の長さのもの(第1〜2図の対応アミノ酸配
列でいえばC−D、B−DまたはΔ−Dの長さ)の外に
、この特定の長さのDNA鎖を構成員とづる鎖状または
環状DNA鎖の形態に在るものをも包含するものとする
(ただし、発明の性質からいって、このDNA鎖はヒト
・膵臓中に存在1−る場合を含まないことはいうJ:で
もない。本発明によるDNA鎖を[ヒ1− ■ラスター
1■の生物工学的産生能を有するDNA鎖」と呼ぶ所以
である)。
を含んでいてこのポリペプチドの生物T学的産生を行な
わけるものであるどころ、この有限の長さの1) N
A鎖のみににってこのJ:うな生物工学的産生が行なえ
るのではなく、その5′ −側上流および(または)3
′ −側IZ流に適当艮ざのD N A鎖が結合した状
態でこのポリペプチドの生物工学的産生が可能どなる訳
である。従って、本発明でrr)NA鎖」というときは
、この特定の長さのもの(第1〜2図の対応アミノ酸配
列でいえばC−D、B−DまたはΔ−Dの長さ)の外に
、この特定の長さのDNA鎖を構成員とづる鎖状または
環状DNA鎖の形態に在るものをも包含するものとする
(ただし、発明の性質からいって、このDNA鎖はヒト
・膵臓中に存在1−る場合を含まないことはいうJ:で
もない。本発明によるDNA鎖を[ヒ1− ■ラスター
1■の生物工学的産生能を有するDNA鎖」と呼ぶ所以
である)。
11一
本発明によるDNA鎖の存在状態のうら代表的なのは、
このD NA鎖を構成員の一部とづるブ°ノスミドの形
態4Tらびにプラスミドとし゛C微9−物、vlに大腸
菌おJ、び酵n1、中に存在する形態である。
このD NA鎖を構成員の一部とづるブ°ノスミドの形
態4Tらびにプラスミドとし゛C微9−物、vlに大腸
菌おJ、び酵n1、中に存在する形態である。
本発明にJ:るI) NΔ鎖の一つのぞして好ましい存
在形態どしてのプラスミドは、バラレンジ〜7−ないし
外来遺伝子どしての本発明I)NΔ鎖ど微イ1物中で安
定に存在して複製可能なプラスミドベクターど本発明D
NA鎖をmRN△へ転写さ口るプロモーターとを一体に
結合させたもので・ある。プラスミドベクターおよびプ
ロモーターどしては公知のbのを適宜組合わせて用いる
ことができるが、次のものを例示J゛ることができる。
在形態どしてのプラスミドは、バラレンジ〜7−ないし
外来遺伝子どしての本発明I)NΔ鎖ど微イ1物中で安
定に存在して複製可能なプラスミドベクターど本発明D
NA鎖をmRN△へ転写さ口るプロモーターとを一体に
結合させたもので・ある。プラスミドベクターおよびプ
ロモーターどしては公知のbのを適宜組合わせて用いる
ことができるが、次のものを例示J゛ることができる。
ζ〜盲伝子がコードするポリペプチド
上記のように、本発明ににるI) N A鎖はこれが=
1−ドするポリペプチドのアミノ酸配列にJ:って特定
されている。
1−ドするポリペプチドのアミノ酸配列にJ:って特定
されている。
このポリペプチドは、アミノ酸配りlが第1〜2図にわ
たって示されているアミノ酸配列のうちC−り、B−D
またはA−Dのものであるものである。ここで、アミノ
酸配列がC−1’)、、B−DおJこびA−Dのポリペ
プチドは、それぞれヒ1〜エラスターゼ■、ヒトプ[1
エラスターゼ■およびヒ1〜プレアロエラスクー12T
Iである。
たって示されているアミノ酸配列のうちC−り、B−D
またはA−Dのものであるものである。ここで、アミノ
酸配列がC−1’)、、B−DおJこびA−Dのポリペ
プチドは、それぞれヒ1〜エラスターゼ■、ヒトプ[1
エラスターゼ■およびヒ1〜プレアロエラスクー12T
Iである。
ヒl〜エラスター1ffi IIは、241個のアミノ
酸からなるものである。
酸からなるものである。
ヒトプロエラスターゼ(B−D)は、上記のヒ1−エラ
スターゼIF(0−D)のN−末端に12個のアミノ酸
が結合したものに相当する。
スターゼIF(0−D)のN−末端に12個のアミノ酸
が結合したものに相当する。
ヒトプレプロエラスターゼTI(A−D)は、このヒト
プロエラスターゼTI(B−D)のN−末端にざらに1
6個のアミノ酸が結合したものである。
プロエラスターゼTI(B−D)のN−末端にざらに1
6個のアミノ酸が結合したものである。
これらの1ラスターぜ■化合物(」−記3種を含めたも
の)は従来そのアミノ酸配列が知られていなかったもの
である。
の)は従来そのアミノ酸配列が知られていなかったもの
である。
DNA鎖の塩基配列
ヒトエラスター1■化合物が3種存在することによって
、イれを二1−ドする塩基配列を右りるDNへ鎖も基本
的には3種存右J−る。
、イれを二1−ドする塩基配列を右りるDNへ鎖も基本
的には3種存右J−る。
ヒト]二゛ラスターゼ■を二1−ドづ−るDNA鎖は、
第1〜2図の0−Dの塩基配列を持つしのまたはその縮
重異P1体である。ここで[縮重異f1体1とは、縮重
コードンにおいてのみ異なっていて同一のポリペプチド
を]−ドすることのできるDNA鎖を意味づ“るものと
する。たとえば、第1〜2図のC−Dの塩基配列を持つ
DNA鎖に対して、そのアミノ酸のどれかに対応J−る
]−トンたとえばN−末端のValに対応づ−るコード
ン(G 1− T )がこれど縮重関係にあるたとえば
G T Cに変ったものを本発明では縮重異性体と呼ぶ
ものとする。
第1〜2図の0−Dの塩基配列を持つしのまたはその縮
重異P1体である。ここで[縮重異f1体1とは、縮重
コードンにおいてのみ異なっていて同一のポリペプチド
を]−ドすることのできるDNA鎖を意味づ“るものと
する。たとえば、第1〜2図のC−Dの塩基配列を持つ
DNA鎖に対して、そのアミノ酸のどれかに対応J−る
]−トンたとえばN−末端のValに対応づ−るコード
ン(G 1− T )がこれど縮重関係にあるたとえば
G T Cに変ったものを本発明では縮重異性体と呼ぶ
ものとする。
好ましい具体例は、5′ −側上流に接して開始コード
ンA T Gと3′ −側末喘にifl Lで停止コー
ドンを少なくとも1個(そのうちの一つは、たとえばT
GA)を持つものである。
ンA T Gと3′ −側末喘にifl Lで停止コー
ドンを少なくとも1個(そのうちの一つは、たとえばT
GA)を持つものである。
ヒトプロエラスターゼ■を]−ドするDNA鎖は、第1
〜2図のB−D(7)塩基配列を持つものまたはその縮
重異性体である。ヒトプロエラスターゼ■を]−ドする
DNA鎖も、その5′ −末端に開始コードンΔTGを
、また3′ −末端に停止コードンを少なくども1個(
そのうちの一つは、たとえばTGA)を有することが好
ましい。
〜2図のB−D(7)塩基配列を持つものまたはその縮
重異性体である。ヒトプロエラスターゼ■を]−ドする
DNA鎖も、その5′ −末端に開始コードンΔTGを
、また3′ −末端に停止コードンを少なくども1個(
そのうちの一つは、たとえばTGA)を有することが好
ましい。
ヒトプロエラスターゼ■をコードするDNA鎖は、第1
〜2図のへ一部の塩基配列を持つものまたはその縮重責
性体である。このDNA鎖はその5′ −末端に開始コ
ードンATGを右するが、このDNA鎖もその3′ −
末端に停止1−」−トンを少なくとも1個(そのうちの
一つは、たとえばT G A )を右Jることが07ま
しい。
〜2図のへ一部の塩基配列を持つものまたはその縮重責
性体である。このDNA鎖はその5′ −末端に開始コ
ードンATGを右するが、このDNA鎖もその3′ −
末端に停止1−」−トンを少なくとも1個(そのうちの
一つは、たとえばT G A )を右Jることが07ま
しい。
上記のいずれのヒI〜エラスターゼ■化合物をコードす
るDNA鎖においても、該ポリペプチドのC−末端のA
snに対応するコードン(図示の例ではΔΔC)の3′
−側下流には、非翻訳領域どしてのDNA鎖(その最
初の部分は、TAGのような停止コードンであることが
ふつうである)がある長ざで続い−Cいることができ、
またイのさらに3′ −側下流に真核生物遺伝子共通の
ポリ(A)鎖がイ;1加していてもよい。ポリ(A)鎖
が付加している場合には、それの5′ −側−[流の−
1−記非翻訳領域にはΔΔTAAAというポリ(Δ)付
加シグナルが含まれていることがふつうである。なお、
第1〜2図に示したDNA鎖(5′ −末端のATGか
ら3′ −末端のポリ(Δ)鎖まで)の塩基配列は、ヒ
1〜プレプロエラスターげ■のm RN Aから1qた
CDNAについてマキ→ナム・ギルバート法ににって決
定したものである。
るDNA鎖においても、該ポリペプチドのC−末端のA
snに対応するコードン(図示の例ではΔΔC)の3′
−側下流には、非翻訳領域どしてのDNA鎖(その最
初の部分は、TAGのような停止コードンであることが
ふつうである)がある長ざで続い−Cいることができ、
またイのさらに3′ −側下流に真核生物遺伝子共通の
ポリ(A)鎖がイ;1加していてもよい。ポリ(A)鎖
が付加している場合には、それの5′ −側−[流の−
1−記非翻訳領域にはΔΔTAAAというポリ(Δ)付
加シグナルが含まれていることがふつうである。なお、
第1〜2図に示したDNA鎖(5′ −末端のATGか
ら3′ −末端のポリ(Δ)鎖まで)の塩基配列は、ヒ
1〜プレプロエラスターげ■のm RN Aから1qた
CDNAについてマキ→ナム・ギルバート法ににって決
定したものである。
DNA鎖の取1q
上記のヒトエラスターゼ■化合物のアミノ酸配夕11を
]−ドする塩基配列を有するDNA鎖を取得する一つの
手段は、核酸合成の方法に従ってその鎖長の少なくとも
一部を化学合成することである。
]−ドする塩基配列を有するDNA鎖を取得する一つの
手段は、核酸合成の方法に従ってその鎖長の少なくとも
一部を化学合成することである。
結合アミノ酸が少<’K くとも241個であるという
ことを考えれば、この化学合成法よりもと1へ膵臓から
得たmRNAからの酵素的な方法による方 ・が好まし
いといえる。
ことを考えれば、この化学合成法よりもと1へ膵臓から
得たmRNAからの酵素的な方法による方 ・が好まし
いといえる。
すなわち、ヒトエラスターゼ■遺伝子の製造のためには
じトエラスターゼmRNAを含む臓器よりmRNAを取
得し、これをテンプレートどして逆転写酵素を用いてC
DNAバンクを作成し、そのCDNAバンクの中から適
当なプローブを用いて、ヒトエラスターゼ■遺伝子を含
むクローンを取得するのが一般的方法である。このプロ
ーブとしては、ラットエラスターゼTr ill伝子の
一部を利用するのが便利である。一般に、生物界におい
て同一の機能を司るタンパク質はアミノ酸−泡構造レベ
ルとともにDNA塩基配列レベルでも相同性があること
が知られており、その場合に系統発生的に近縁のものほ
ど相同性は高い。ヒトとラットでは、本発明者らが遺伝
子取得後に比較した結果、アミノ酸、DNA配列とも8
0%程度の相同性が見られた。ラットエラスターL’I
遺伝子についてはずでに報告があって(前掲文献)、D
NA塩基配列が知られている。
じトエラスターゼmRNAを含む臓器よりmRNAを取
得し、これをテンプレートどして逆転写酵素を用いてC
DNAバンクを作成し、そのCDNAバンクの中から適
当なプローブを用いて、ヒトエラスターゼ■遺伝子を含
むクローンを取得するのが一般的方法である。このプロ
ーブとしては、ラットエラスターゼTr ill伝子の
一部を利用するのが便利である。一般に、生物界におい
て同一の機能を司るタンパク質はアミノ酸−泡構造レベ
ルとともにDNA塩基配列レベルでも相同性があること
が知られており、その場合に系統発生的に近縁のものほ
ど相同性は高い。ヒトとラットでは、本発明者らが遺伝
子取得後に比較した結果、アミノ酸、DNA配列とも8
0%程度の相同性が見られた。ラットエラスターL’I
遺伝子についてはずでに報告があって(前掲文献)、D
NA塩基配列が知られている。
そこで、本発明者らの行なった方法は、下記の通りであ
る。寸なわち、ラットエラスター1i If 3!仏子
のDNA塩基配列の一部を化学合成し、それをプローブ
として用いて、ラフ1〜膵11mRN△より逆転写酵素
を用いて作成したcDN△DNAよりスクリーニングを
行なって、クツ1〜エラスターゼ■遺伝子クローンを取
得した。この遺伝子がラットエラスターゼ■遺伝子であ
ることはDNA塩基配列を調べることににすHE定した
。この遺伝子を制限酵素で切断して約770bp(tu
g対)はどの断片を取得し、この断片に321)ラベル
を入れてプローブとして用いた。ヒト膵臓mRNAより
逆転写酵素を用いで作成したC I) NΔバンクにつ
いて、上記プ「1−ブを用いてスクリーニングを行なっ
た。得られたクローンのうlう一番CDNA部分の長い
ものについて塩基配り11をマキ4ツムギルバート法に
にり決定した。
る。寸なわち、ラットエラスター1i If 3!仏子
のDNA塩基配列の一部を化学合成し、それをプローブ
として用いて、ラフ1〜膵11mRN△より逆転写酵素
を用いて作成したcDN△DNAよりスクリーニングを
行なって、クツ1〜エラスターゼ■遺伝子クローンを取
得した。この遺伝子がラットエラスターゼ■遺伝子であ
ることはDNA塩基配列を調べることににすHE定した
。この遺伝子を制限酵素で切断して約770bp(tu
g対)はどの断片を取得し、この断片に321)ラベル
を入れてプローブとして用いた。ヒト膵臓mRNAより
逆転写酵素を用いで作成したC I) NΔバンクにつ
いて、上記プ「1−ブを用いてスクリーニングを行なっ
た。得られたクローンのうlう一番CDNA部分の長い
ものについて塩基配り11をマキ4ツムギルバート法に
にり決定した。
このように、本発明DNA鎖は上記のJ:うにヒ1〜膵
臓CI) N△バンクより大賜菌プラスミド1−に組み
込まれた形で得られたが、もちろんこのDNA鎖を化学
合成によってすべてもしく番;1途中から作成して取1
!l?づることも可能であることは前記したところであ
る。
臓CI) N△バンクより大賜菌プラスミド1−に組み
込まれた形で得られたが、もちろんこのDNA鎖を化学
合成によってすべてもしく番;1途中から作成して取1
!l?づることも可能であることは前記したところであ
る。
腹I」11杯
上記のJ:うにして取得される本発明DNA鎖はヒトエ
ラスターゼ■蛋白をつくるための遺伝情報を含んでいる
ので、これを生物工学的手法によって微生物に導入して
形質転換体をつくり、この形質転換微生物にヒト・エラ
スターゼ■蛋白をつくらUることができる。
ラスターゼ■蛋白をつくるための遺伝情報を含んでいる
ので、これを生物工学的手法によって微生物に導入して
形質転換体をつくり、この形質転換微生物にヒト・エラ
スターゼ■蛋白をつくらUることができる。
宿主微生物
適当なプラスミドベクターが存在する限り、各種の微/
lZ物が本発明DNA鎖を構成員どして含むプラスミド
により形質転換の対象となりうる。
lZ物が本発明DNA鎖を構成員どして含むプラスミド
により形質転換の対象となりうる。
そのような微生物の一群は[5cherichia c
oliであり、伯の一群は5accharoIIlyc
es cerevisiacである。
oliであり、伯の一群は5accharoIIlyc
es cerevisiacである。
形質転換
形質転換体の作成(おにびそれによるヒ1−1ラスター
ゼIfの産生)のための手順イrいし方法そのものは、
分子生物学、生物工学ないし遺伝子工学の分野において
慣用されているものでありうるので、本発明においても
下記したどころ以外の・bのについてはこれら慣用技術
に準じて実施りればJ、い。
ゼIfの産生)のための手順イrいし方法そのものは、
分子生物学、生物工学ないし遺伝子工学の分野において
慣用されているものでありうるので、本発明においても
下記したどころ以外の・bのについてはこれら慣用技術
に準じて実施りればJ、い。
微生物中で本発明DNA鎖の遺伝子を発現’c5 ’t
!るためには、4二すその微生物中で安定に存在するプ
ラスミドベクター中にこの遺伝子をつなぎかえる必要が
ある。この際用いられるプラスミドベクターは、大腸菌
に対してはl) B R322智、酵母に対し−(はY
Rp7等−秤々知られているものすべてが用いられる。
!るためには、4二すその微生物中で安定に存在するプ
ラスミドベクター中にこの遺伝子をつなぎかえる必要が
ある。この際用いられるプラスミドベクターは、大腸菌
に対してはl) B R322智、酵母に対し−(はY
Rp7等−秤々知られているものすべてが用いられる。
一方、本発明DNA鎖の潰伝子をwII4:物で発現さ
せるためには、イのDNAをm RNΔへ転写さける必
要がある。そのためには、転写のためのシグナルである
プロモーターの遺伝子を本発明DNA鎖の5′ −側上
流に組込めばJ、い。このプロモーターについてI、1
すでに1: r p、 l 、<) c。
せるためには、イのDNAをm RNΔへ転写さける必
要がある。そのためには、転写のためのシグナルである
プロモーターの遺伝子を本発明DNA鎖の5′ −側上
流に組込めばJ、い。このプロモーターについてI、1
すでに1: r p、 l 、<) c。
ompF (以上、大腸菌用)、AI) H1、G A
L7、IIGK、TFぐ[〕1(以に、酸01用)−
S種々知られており、本発明で′bこれらのいずれをも
利用することができる。
L7、IIGK、TFぐ[〕1(以に、酸01用)−
S種々知られており、本発明で′bこれらのいずれをも
利用することができる。
また、mRNAを蛋白に翻訳させる段階では蛋白合成の
場であるリポソームが翻訳開始部位の先端に結合するた
めに必要な配列(大腸菌ではSD配列と呼ばれる)を蛋
白合成の開始信号であるATGの前につ番ノる必要があ
る。なお、ポリ(Δ)付加シグナルを含む3′非翻訳領
域についでは蛋白を合成させるために特に必要ではない
ど考えられているので、場合ににっでは削り取ることし
できる。ただし、宿主微生物がMmであるどきはこの3
′非翻訳領域の有無が蛋白合成量の大小に関与するとい
われている場合もあるので、多量にヒトエラスターゼ■
蛋白を合成しようというときは注意を要する。
場であるリポソームが翻訳開始部位の先端に結合するた
めに必要な配列(大腸菌ではSD配列と呼ばれる)を蛋
白合成の開始信号であるATGの前につ番ノる必要があ
る。なお、ポリ(Δ)付加シグナルを含む3′非翻訳領
域についでは蛋白を合成させるために特に必要ではない
ど考えられているので、場合ににっでは削り取ることし
できる。ただし、宿主微生物がMmであるどきはこの3
′非翻訳領域の有無が蛋白合成量の大小に関与するとい
われている場合もあるので、多量にヒトエラスターゼ■
蛋白を合成しようというときは注意を要する。
さて、一般的には、エラスターゼ蛋白をつくろうとすれ
ば上記のような操作が必要であるが、本発明DNA鎖の
うち塩基配列がB−DおよびA−りのものは前駆体ペブ
ヂドを=1−ドする配列が含まれているので、ヒ1〜エ
ラスターゼ■蛋白をつくる際に前駆体ペブヂドを含むヒ
1−エラスターゼ■蛋白(じj〜丁シラスクー1ffi
Ir前駆なわ15プロエラスターゼ■またはプレプロJ
ラスターげ■をつくることができ、また塩基配列C−D
のものからはこの前駆体ペブブドのない蛋白をつくるこ
ともできる。ただしir1駆休ペ体ブード(△−C)を
含まない場合は蛋白合成開始のためのシグナルであるA
TGが必要なので、最低1個のメチオニンをN−末端ア
ミノ酸の前に付加さけておかな(′Jればむらない。ま
た、ヒl− Iラスターゼ■蛋白をつくるばあにエラス
ターげ活性さえ保持されれば、N−末端アミノ酸の前に
1個または複数個のアミノ酸を付加することや、いくつ
かのアミノ酸をN−末端側もしくはC−末端側で削るこ
と・bできる。また、読粋の調整その他の目的で適当な
長さのDNA鎖をリンノJ−として結合さけることもで
きる。このJ:うなりNA鎖の加工は、現在の遺伝子T
学技術では、制限酵素おにびrlNA化学合成技術を利
用すれば容易に実施することができる。
ば上記のような操作が必要であるが、本発明DNA鎖の
うち塩基配列がB−DおよびA−りのものは前駆体ペブ
ヂドを=1−ドする配列が含まれているので、ヒ1〜エ
ラスターゼ■蛋白をつくる際に前駆体ペブヂドを含むヒ
1−エラスターゼ■蛋白(じj〜丁シラスクー1ffi
Ir前駆なわ15プロエラスターゼ■またはプレプロJ
ラスターげ■をつくることができ、また塩基配列C−D
のものからはこの前駆体ペブブドのない蛋白をつくるこ
ともできる。ただしir1駆休ペ体ブード(△−C)を
含まない場合は蛋白合成開始のためのシグナルであるA
TGが必要なので、最低1個のメチオニンをN−末端ア
ミノ酸の前に付加さけておかな(′Jればむらない。ま
た、ヒl− Iラスターゼ■蛋白をつくるばあにエラス
ターげ活性さえ保持されれば、N−末端アミノ酸の前に
1個または複数個のアミノ酸を付加することや、いくつ
かのアミノ酸をN−末端側もしくはC−末端側で削るこ
と・bできる。また、読粋の調整その他の目的で適当な
長さのDNA鎖をリンノJ−として結合さけることもで
きる。このJ:うなりNA鎖の加工は、現在の遺伝子T
学技術では、制限酵素おにびrlNA化学合成技術を利
用すれば容易に実施することができる。
このようにしてつくったプラスミドににる微牛物の形質
転換は、遺伝子工学ないし生物T学の分野で慣用されて
いる合口目的な任意の方法ににつて行イtうことができ
る。その一般的な事項については適当イ【成書または総
説!ことえばT、Haniatis。
転換は、遺伝子工学ないし生物T学の分野で慣用されて
いる合口目的な任意の方法ににつて行イtうことができ
る。その一般的な事項については適当イ【成書または総
説!ことえばT、Haniatis。
E、F、Fr1tsch、 J、Samhrooに:
「Mo1ecular Cloning−^ 1abo
raroy Manual J 、Co1d S
pring 1larborLaboratory、
(1982)を参照すればよい。
「Mo1ecular Cloning−^ 1abo
raroy Manual J 、Co1d S
pring 1larborLaboratory、
(1982)を参照すればよい。
形質転換体は、本発明DNA鎖にJ:つで導入された遺
伝情報による新しい形質(すなわらヒトエラスターゼ■
の産生能)おJ:び使用ベクター由来の形質4にらびに
場合によっては生じているかも知れない遺伝子組換時の
使用ベクターからの一部の遺伝情報の欠落による対応形
質の欠落を除けば、そのゼノタイプないしフェノタイプ
あるいは菌学的性質において使用宿主微生物と同じであ
る。
伝情報による新しい形質(すなわらヒトエラスターゼ■
の産生能)おJ:び使用ベクター由来の形質4にらびに
場合によっては生じているかも知れない遺伝子組換時の
使用ベクターからの一部の遺伝情報の欠落による対応形
質の欠落を除けば、そのゼノタイプないしフェノタイプ
あるいは菌学的性質において使用宿主微生物と同じであ
る。
l匠性皿旦犬J/蛋白の生産
上記のようにして得られる形質転換体のクローンは、こ
れを培養すれば培養物中にヒ1へ1ラスターゼ■、ヒト
プロエラスター12 mまたはヒ1−プレプロエラスタ
ーゼ■を産生ずる。ブレアロエラスクーゼI[は、膵臓
外に分泌されるときにブ[1エラスターゼ■となり、こ
れがざらに−1−指腹でトリプシン等にJ:り分解され
て成熟蛋白寸なわ)5ヒ1〜エラスターゼ■に変化する
といわれているのぐ、本発明ににつてこのようなヒl−
Iラスターゼ■前駆体蛋白が街られたときはこれをトリ
プシン等によって処理すればヒトプエラスターゼ■と同
一のものが得られると考えられる。
れを培養すれば培養物中にヒ1へ1ラスターゼ■、ヒト
プロエラスター12 mまたはヒ1−プレプロエラスタ
ーゼ■を産生ずる。ブレアロエラスクーゼI[は、膵臓
外に分泌されるときにブ[1エラスターゼ■となり、こ
れがざらに−1−指腹でトリプシン等にJ:り分解され
て成熟蛋白寸なわ)5ヒ1〜エラスターゼ■に変化する
といわれているのぐ、本発明ににつてこのようなヒl−
Iラスターゼ■前駆体蛋白が街られたときはこれをトリ
プシン等によって処理すればヒトプエラスターゼ■と同
一のものが得られると考えられる。
また、キモシン道伝子を酵母で発現さけるときにキモシ
ンを直接つくらせるにりもブロー1= Eシンをつくら
lたどきに10倍以上の生産効率があったとの報告があ
るので(J、Hcllor、 H,,1,Dobson
。
ンを直接つくらせるにりもブロー1= Eシンをつくら
lたどきに10倍以上の生産効率があったとの報告があ
るので(J、Hcllor、 H,,1,Dobson
。
N、^、Robcrts、 H,r、1uite、 、
1.S、Fmtagl、 S、W旧te。
1.S、Fmtagl、 S、W旧te。
P、A、l−owe、 1’、Pal:e、 A、、1
.Kingsman、 S、14.Kingsn+an
Gene、 24.1〜14 (1983) ) 、本
発明でもこのブレプ[1部分の配列を利用して大量生産
を容易に覆ることも考えられる3゜ 形質転換体の培養ないし増殖条イ′1は、使用宿主微生
物に対するそれど本質的には変らない。また、培養物す
なわち菌体内おJ:び(または)培養液からの産生蛋白
の回収−b常法に従って行なうことができる。
.Kingsman、 S、14.Kingsn+an
Gene、 24.1〜14 (1983) ) 、本
発明でもこのブレプ[1部分の配列を利用して大量生産
を容易に覆ることも考えられる3゜ 形質転換体の培養ないし増殖条イ′1は、使用宿主微生
物に対するそれど本質的には変らない。また、培養物す
なわち菌体内おJ:び(または)培養液からの産生蛋白
の回収−b常法に従って行なうことができる。
実 験 例
■、ラッ1〜エラスターゼ■遺伝−のクローニングウイ
スターラッ1〜(日本チャールスリバー社J:り入手)
をエーテル麻酔後、ただちに膵臓を取り出し、グアニジ
ンヂオシアネ−1〜を変性剤として用い、かつ塩化セシ
・クム密度勾配遠心で精製する方法によって、RNAを
取得した(詳細な実験条件は、十用和1(ν、藤月義明
二[細胞■学IL、298〜303 (1982)参照
)。このRN A J:すmRNAを得るため、これを
オリゴdTセルロースカラムクロマトグラフィーにより
精製し、オリゴd王に吸着するポリ(Δ)をもったmR
NAだけを取得した。ラフ1ル1匹より約10の膵臓が
得られ、mRNAは200μq得られた。次に、このm
RNAをデンプμ−]へとしてオカヤマバーク法により
cDNAを作成した。実験手順は下記の通りである(訂
細な実験条件は、重定勝哉:[細胞■学J2,61(1
〜626 (1983)を参照)。
スターラッ1〜(日本チャールスリバー社J:り入手)
をエーテル麻酔後、ただちに膵臓を取り出し、グアニジ
ンヂオシアネ−1〜を変性剤として用い、かつ塩化セシ
・クム密度勾配遠心で精製する方法によって、RNAを
取得した(詳細な実験条件は、十用和1(ν、藤月義明
二[細胞■学IL、298〜303 (1982)参照
)。このRN A J:すmRNAを得るため、これを
オリゴdTセルロースカラムクロマトグラフィーにより
精製し、オリゴd王に吸着するポリ(Δ)をもったmR
NAだけを取得した。ラフ1ル1匹より約10の膵臓が
得られ、mRNAは200μq得られた。次に、このm
RNAをデンプμ−]へとしてオカヤマバーク法により
cDNAを作成した。実験手順は下記の通りである(訂
細な実験条件は、重定勝哉:[細胞■学J2,61(1
〜626 (1983)を参照)。
′!J′イ1わノ5、mRNAどAリボd 1を末端に
50個はど1・1加されたベクターブライマーD NA
とをまげ、逆転写酵素を加えて、ベクタープライマーD
NAの(1丁部分をブライマーにしてmRNAにff1
=i TJる相補鎖DNAを合成させる。次にこのDN
A断片にdCTPとターミナルトランスフエラーびとを
加えて両末端にdCを20個はどト)加する。制限酵素
t−1i n d mでこのベクターブライマーDNA
部分の一部を切断()で、dC(Nl加端部をある艮ざ
にわたって取り除く。一方、一方の端が1lind[[
ど同じ切断末端をもちかつ他方の末端にdGを20個程
度イ」加したリンカ−1−]N△断片を用意して、これ
を前記11indll[消化物に加え、両DNAを環状
に結合さ口る。
50個はど1・1加されたベクターブライマーD NA
とをまげ、逆転写酵素を加えて、ベクタープライマーD
NAの(1丁部分をブライマーにしてmRNAにff1
=i TJる相補鎖DNAを合成させる。次にこのDN
A断片にdCTPとターミナルトランスフエラーびとを
加えて両末端にdCを20個はどト)加する。制限酵素
t−1i n d mでこのベクターブライマーDNA
部分の一部を切断()で、dC(Nl加端部をある艮ざ
にわたって取り除く。一方、一方の端が1lind[[
ど同じ切断末端をもちかつ他方の末端にdGを20個程
度イ」加したリンカ−1−]N△断片を用意して、これ
を前記11indll[消化物に加え、両DNAを環状
に結合さ口る。
次に、RN as e l−(、DNAボリメラーL’
Ha’;よびDNΔNA−ぜによりmRNA部分をと
りのぞいてDN’Aに回きかえる。このようにして、ラ
ット膵Ha m r< NA2.5μ0どベクタープラ
イマーDNA1.511<hとを使用し、リンツノ−1
1NΔ断片Q、0771Oを加えてa D NAを(q
だ。
Ha’;よびDNΔNA−ぜによりmRNA部分をと
りのぞいてDN’Aに回きかえる。このようにして、ラ
ット膵Ha m r< NA2.5μ0どベクタープラ
イマーDNA1.511<hとを使用し、リンツノ−1
1NΔ断片Q、0771Oを加えてa D NAを(q
だ。
このGDNAで大腸菌RRT株(Bol 1var、
F、 :Gene、 2 、95 (1977) )を
形質転換させたところ、形質転換体として約5万個のク
ローンが得られた。
F、 :Gene、 2 、95 (1977) )を
形質転換させたところ、形質転換体として約5万個のク
ローンが得られた。
この大腸菌の中からラツ]〜エラスターゼ■遺伝了を持
つものを探すため、既知のラットエラスターゼII 3
W伝子(前記BiochemistryS21. 14
53−1463(1982))の一部を化学合成してプ
ローブとした。
つものを探すため、既知のラットエラスターゼII 3
W伝子(前記BiochemistryS21. 14
53−1463(1982))の一部を化学合成してプ
ローブとした。
さらに詳しくは、ラットエラスターゼ■遺伝子のC−末
端部分に相当する AULJ GCA AAG AAG UAΔ3
’TAA CGT TTCTTG ATT5のf
lXlX列配列る。上側がラットエラスターゼmRNA
であり、下側が合成されたAリゴヌクレオヂドのプロー
ブであって、mRNAに対する相補鎖どなっている。合
成法は固相リン酸トリエステル法に依った(詳細は、F
、0htsuka、 Hjkehara。
端部分に相当する AULJ GCA AAG AAG UAΔ3
’TAA CGT TTCTTG ATT5のf
lXlX列配列る。上側がラットエラスターゼmRNA
であり、下側が合成されたAリゴヌクレオヂドのプロー
ブであって、mRNAに対する相補鎖どなっている。合
成法は固相リン酸トリエステル法に依った(詳細は、F
、0htsuka、 Hjkehara。
D、5oll : Nuclcic Ac1ds Re
5earch 10.655.3−6570 (19
82)参照)。この合成オリゴヌクレオヂドにT4ポリ
ヌクレオチドキナーゼをつかってγ〔32P〕△TPよ
りリン酸基を転移させて、これを標識した。これをプロ
ーブとして、cDNAの入った形質転換体をスクリーニ
ングした。スクリーニング法は]ロニーハイプリダイゼ
ーション法でおこなった。号なわら、二1−ロセルロー
スーノイルター上で成育した菌体をアルカリ変性さけて
、菌体内のl) N Aをフィルター」−に焼付()る
。そのフィルターをプローブDNAを含むハイブリダイ
ゼーション液中におくと、DNAの塩廿配列に相同性の
あるものだI′jがある条件下で結合する(詳細は、高
木庫敬編[遺伝子操作マニコアル−1(講談社)参照)
。これをオートラジオグラフィーに付しで、プラスかマ
イナスかを判定する。相同の配列を含むクローン゛は黒
く着色される。実際には、約2000個のクローンをス
クリーニングして、12個のポジティブクローンが得ら
れた。ハイブリダイゼーションの条件は6XSSC15
Xデンハルト溶液/35℃/16時間であり、6×SS
C/35℃/30分で2回洗浄した。これらのクローン
について、プラスミドをアルカリ法(T、Haniat
is、 c、r、「r目sch、 、1.5anbro
ok ニー 2 l − 口(olecular Cloning−A I−o
boratory Manual J 参照)に
より取得し、制限酵素切断地図を作成して文献報告のも
のと比較したところ、完全に一致した。このようにして
、ラットエラスターゼIm仏子が得られた。
5earch 10.655.3−6570 (19
82)参照)。この合成オリゴヌクレオヂドにT4ポリ
ヌクレオチドキナーゼをつかってγ〔32P〕△TPよ
りリン酸基を転移させて、これを標識した。これをプロ
ーブとして、cDNAの入った形質転換体をスクリーニ
ングした。スクリーニング法は]ロニーハイプリダイゼ
ーション法でおこなった。号なわら、二1−ロセルロー
スーノイルター上で成育した菌体をアルカリ変性さけて
、菌体内のl) N Aをフィルター」−に焼付()る
。そのフィルターをプローブDNAを含むハイブリダイ
ゼーション液中におくと、DNAの塩廿配列に相同性の
あるものだI′jがある条件下で結合する(詳細は、高
木庫敬編[遺伝子操作マニコアル−1(講談社)参照)
。これをオートラジオグラフィーに付しで、プラスかマ
イナスかを判定する。相同の配列を含むクローン゛は黒
く着色される。実際には、約2000個のクローンをス
クリーニングして、12個のポジティブクローンが得ら
れた。ハイブリダイゼーションの条件は6XSSC15
Xデンハルト溶液/35℃/16時間であり、6×SS
C/35℃/30分で2回洗浄した。これらのクローン
について、プラスミドをアルカリ法(T、Haniat
is、 c、r、「r目sch、 、1.5anbro
ok ニー 2 l − 口(olecular Cloning−A I−o
boratory Manual J 参照)に
より取得し、制限酵素切断地図を作成して文献報告のも
のと比較したところ、完全に一致した。このようにして
、ラットエラスターゼIm仏子が得られた。
■6ヒ1〜エラスターゼTEM伝子のクローニングラッ
ト■ラスターゼIII伝子の場合とまったく同じ方法で
mRNAを取得し、ざらにcDNAを作成した。ヒトの
膵臓約20よりmRNA200μaが得られた。ざらに
、mRNA5.0/lQ。
ト■ラスターゼIII伝子の場合とまったく同じ方法で
mRNAを取得し、ざらにcDNAを作成した。ヒトの
膵臓約20よりmRNA200μaが得られた。ざらに
、mRNA5.0/lQ。
ベクターブライマーDNA1.5μQおよびリンカ−D
NA0.08Ilqを使って、cDNAを含んだ形質転
換体が約3万個得られた。この中からヒトエラスターゼ
II il!仏子をスクリーニングしたわけであるが、
プローブとしてラットエラスターゼI[31f伝子の一
部を利用した。ラットエラスターゼ■遺伝子を制限酵素
[)de■で分解したのちアガロースゲル電気泳動で分
離を行なって、約770bpのフラグメントを得た。こ
の断片にニックトランスレーション法によりα(3”P
)d CT Pを用いてアイソ1ヘーブラベルを入れI
こにツク1〜ランス1ノージョン法の詳細は前掲「遺伝
子操作マニコアル」参照)これをプローブに用い、先に
クツ1〜エラスターゼ■遺伝子のクローニングの際に採
用した]ロニーハイプリダイピーション法でスクリーニ
ングした。ハイブリダイゼーションの条件は6xSSC
15xデンハルト溶液中/60°C/16時間であり、
洗いは60℃/30分/2回で行なった。約10.00
0個J:す15個のクローンが得られ、その中で最も艮
いcDNA部分を有するもの(E I−I E 12株
と呼ぶ。
NA0.08Ilqを使って、cDNAを含んだ形質転
換体が約3万個得られた。この中からヒトエラスターゼ
II il!仏子をスクリーニングしたわけであるが、
プローブとしてラットエラスターゼI[31f伝子の一
部を利用した。ラットエラスターゼ■遺伝子を制限酵素
[)de■で分解したのちアガロースゲル電気泳動で分
離を行なって、約770bpのフラグメントを得た。こ
の断片にニックトランスレーション法によりα(3”P
)d CT Pを用いてアイソ1ヘーブラベルを入れI
こにツク1〜ランス1ノージョン法の詳細は前掲「遺伝
子操作マニコアル」参照)これをプローブに用い、先に
クツ1〜エラスターゼ■遺伝子のクローニングの際に採
用した]ロニーハイプリダイピーション法でスクリーニ
ングした。ハイブリダイゼーションの条件は6xSSC
15xデンハルト溶液中/60°C/16時間であり、
洗いは60℃/30分/2回で行なった。約10.00
0個J:す15個のクローンが得られ、その中で最も艮
いcDNA部分を有するもの(E I−I E 12株
と呼ぶ。
また、これに含まれるcDNA含有プラスミドを1)
HE I−2と呼ぶ)についてベタターブライマー以外
のDNA部分の塩基配列を決定した。jn基配列決定は
マキサムギルバー1−法を用い、両方向の鎖を読むよう
にして行なった(方法の詳細は、高浪満、大井龍夫編r
D N△シーケンス解析マニュ □アル」 (講
談ネ1)参照)。決定された配列は、第1〜2図に示し
た通りである。このDNA塩基配列より]−トン表に従
ってアミノ酸に翻訳したものも同時に示されている。
HE I−2と呼ぶ)についてベタターブライマー以外
のDNA部分の塩基配列を決定した。jn基配列決定は
マキサムギルバー1−法を用い、両方向の鎖を読むよう
にして行なった(方法の詳細は、高浪満、大井龍夫編r
D N△シーケンス解析マニュ □アル」 (講
談ネ1)参照)。決定された配列は、第1〜2図に示し
た通りである。このDNA塩基配列より]−トン表に従
ってアミノ酸に翻訳したものも同時に示されている。
このアミノ酸配列をC,l−argmanらにより報告
(前記)されているヒトエラスターL4IIのプロ体の
N末端のアミノ酸配列(Cys−Gly−Δ5p−pr
o−Thr−Tyr−pro−P r O−1−V r
−V a I −T h r −A r CJ −Va
l−Val−Gly−GIV)と比較したところブロヒ
]〜エラスターゼIr(B−Dの部分)のN末端のアミ
ノ酸配列が完全に一致した。
(前記)されているヒトエラスターL4IIのプロ体の
N末端のアミノ酸配列(Cys−Gly−Δ5p−pr
o−Thr−Tyr−pro−P r O−1−V r
−V a I −T h r −A r CJ −Va
l−Val−Gly−GIV)と比較したところブロヒ
]〜エラスターゼIr(B−Dの部分)のN末端のアミ
ノ酸配列が完全に一致した。
微生物の寄託
本発明に関係する下記の微生物は、■業技術院微生物工
業技術研究所から受託が拒否された。
業技術研究所から受託が拒否された。
(1) ヒトエラスターゼ■遺伝子含有プラスミドp1
〜IE[2を含む大腸菌RR1株(El−IE12株)
。
〜IE[2を含む大腸菌RR1株(El−IE12株)
。
第1〜2図は、ヒトエラスターゼ■遺伝子おJ:びその
前駆体遺伝子のDNA塩基配夕11とその塩基配列にり
推定されるアミノ酸配列とを示すものであつで、第1図
は180番目のアミノ酸までを、第2図は181番目以
降のアミノ酸を示すものである。 出願人代即人 猪 股 清 箆I Thr Tyr Pro Pro Tyr Vat T
hr Arg Val Val 1CCCTGG CA
G GTCTCCCTG CAG TACAGCTCC
。 Pro Trp Gln Val Ser Leu G
in Tyr Ser SeトTCCCTG ATA
GCCMCAGCTGG GTCCTG ACG・Se
r Leu Ile Ala Asn Se
r Trp Val Leu ThGACAT
T GCCCTG CTCAAA CTG GCT A
ACCCGly Arg Leu Gln Thr A
sn Gly Ala Val Pr図 ;GCGGT GAA GAA GCG AGG CC
CMCAGCTGG;ly Gly Glu Glu△
la Arg Pro Asn Ser Trp\AT
GGCAAG TGG TACCACACCTGCG
GA GGG\sn Gly Lys Trp
Tyr His Thr Cys Gly
GlyECT GCCCACTGCATCAGCTCC
TCCAGG ACCrGG AACTCCAACCA
A ATCTCCAAA GGG AAC兎2 GTG’ GACTAT GCCACCTGCTCCA
GCTCT GCCVal Asp Tyr Ala
Thr Cys Ser Ser Ser AIOTT
G GAA AGG TCA CAG MG GAA
ATA ATA TAA図 TGG TGG GGCAGCAGCGTG AAA
ACCAGT ATGTrp Trp Gly Ser
Ser Val Lys Thr Ser MetG
TCTTCACG CGG GTCTCCAAT TC
CATCGACTAA AGT GACAACTAT
GCA AAT C手υcンtii−IIE書 昭和60年10月3L+
前駆体遺伝子のDNA塩基配夕11とその塩基配列にり
推定されるアミノ酸配列とを示すものであつで、第1図
は180番目のアミノ酸までを、第2図は181番目以
降のアミノ酸を示すものである。 出願人代即人 猪 股 清 箆I Thr Tyr Pro Pro Tyr Vat T
hr Arg Val Val 1CCCTGG CA
G GTCTCCCTG CAG TACAGCTCC
。 Pro Trp Gln Val Ser Leu G
in Tyr Ser SeトTCCCTG ATA
GCCMCAGCTGG GTCCTG ACG・Se
r Leu Ile Ala Asn Se
r Trp Val Leu ThGACAT
T GCCCTG CTCAAA CTG GCT A
ACCCGly Arg Leu Gln Thr A
sn Gly Ala Val Pr図 ;GCGGT GAA GAA GCG AGG CC
CMCAGCTGG;ly Gly Glu Glu△
la Arg Pro Asn Ser Trp\AT
GGCAAG TGG TACCACACCTGCG
GA GGG\sn Gly Lys Trp
Tyr His Thr Cys Gly
GlyECT GCCCACTGCATCAGCTCC
TCCAGG ACCrGG AACTCCAACCA
A ATCTCCAAA GGG AAC兎2 GTG’ GACTAT GCCACCTGCTCCA
GCTCT GCCVal Asp Tyr Ala
Thr Cys Ser Ser Ser AIOTT
G GAA AGG TCA CAG MG GAA
ATA ATA TAA図 TGG TGG GGCAGCAGCGTG AAA
ACCAGT ATGTrp Trp Gly Ser
Ser Val Lys Thr Ser MetG
TCTTCACG CGG GTCTCCAAT TC
CATCGACTAA AGT GACAACTAT
GCA AAT C手υcンtii−IIE書 昭和60年10月3L+
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、下記の(1)〜(3)からなる群から選ばれるアミ
ノ酸配列のポリペプチドをコードする塩基配列を有する
ことを特徴とする、ヒトエラスターゼIIの生物工学的産
生能を有するDNA鎖。 (1)第1図および第2図にわたって示されているアミ
ノ酸配列のうち、CからDまでのもの、(2)第1図お
よび第2図にわたって示されているアミノ酸配列のうち
、BからDまでのもの、(3)第1図および第2図にわ
たって示されているアミノ酸配列のうち、AからDまで
のもの。 2、ポリペプチドをコードする塩基配列が第1図および
第2図にわたって示されている塩基配列のうちCからD
までのもの、BからDまでのもの、またはAからDまで
のもの、である特許請求の範囲第1項に記載のDNA鎖
。 3、下記の(1)〜(3)からなる群から選ばれるアミ
ノ酸配列のポリペプチドをコードする塩基配列を有する
DNA鎖をその遺伝情報が発現可能な状態で含むプラス
ミドによって形質転換されたものであることを特徴とす
る、ヒトエラスターゼII産生能を有する微生物。 (1)第1図および第2図にわたって示されているアミ
ノ酸配列のうち、CからDまでのもの、(2)第1図お
よび第2図にわたって示されているアミノ酸配列のうち
、BからDまでのもの、(3)第1図および第2図にわ
たって示されているアミノ酸配列のうち、AからDまで
のもの。 4、微生物が、Escherichia coliであ
る、特許請求の範囲第3項に記載の微生物。 5、DNA鎖が、その塩基が第1図および第2図にわた
って示されている塩基配列のうちCからDまでのもの、
BからDまでのもの、またはAからDまでのもの、であ
る特許請求の範囲第3〜4項のいずれか1項に記載の微
生物。 6、下記の(1)〜(3)からなる群から選ばれるアミ
ノ酸配列のポリペプチドをコードする塩基配列を有する
DNA鎖を用意し、このDNA鎖を、これをその遺伝情
報が発現可能な状態で含むプラスミドの作成、このプラ
スミドによる微生物の形質転換および得られる形質転換
体の培養からなる工程に付して、培養物中にヒトエラス
ターゼIIを産生させることを特徴とする、ヒトエラスタ
ーゼIIの生物工学的製造法。 (1)第1図および第2図にわたって示されているアミ
ノ酸配列のうち、CからDまでのもの、(2)第1図お
よび第2図にわたって示されているアミノ酸配列のうち
、BからDまでのもの、(3)第1図および第2図にわ
たって示されているアミノ酸配列のうち、AからDまで
のもの。 7、微生物がEscherichia coliである
、特許請求の範囲第6項に記載の方法。 8、DNA鎖が、その塩基が第1図および第2図にわた
って示されている塩基配列のうちCからDまでのもの、
BからDまでのもの、またはAからDまでのもの、であ
る特許請求の範囲第6〜7項のいずれか1項に記載の方
法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60034049A JPS61192288A (ja) | 1985-02-22 | 1985-02-22 | ヒトエラスタ−ゼ2の生物工学的製造 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60034049A JPS61192288A (ja) | 1985-02-22 | 1985-02-22 | ヒトエラスタ−ゼ2の生物工学的製造 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61192288A true JPS61192288A (ja) | 1986-08-26 |
Family
ID=12403441
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60034049A Pending JPS61192288A (ja) | 1985-02-22 | 1985-02-22 | ヒトエラスタ−ゼ2の生物工学的製造 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS61192288A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62130686A (ja) * | 1985-07-26 | 1987-06-12 | Sankyo Co Ltd | ヒト・膵臓エラスタ−ゼ−2a |
EP0244189A2 (en) * | 1986-04-26 | 1987-11-04 | Sankyo Company Limited | Human pancreatic elastase I |
US7034132B2 (en) | 2001-06-04 | 2006-04-25 | Anderson David W | Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use |
-
1985
- 1985-02-22 JP JP60034049A patent/JPS61192288A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62130686A (ja) * | 1985-07-26 | 1987-06-12 | Sankyo Co Ltd | ヒト・膵臓エラスタ−ゼ−2a |
EP0244189A2 (en) * | 1986-04-26 | 1987-11-04 | Sankyo Company Limited | Human pancreatic elastase I |
US7034132B2 (en) | 2001-06-04 | 2006-04-25 | Anderson David W | Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use |
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