JPH0995498A - 新規蛋白質およびそれをコードするｄｎａ並びに該蛋白質の産生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）活性化因子のプロ
テアーゼ活性を阻害する活性を有する新規な蛋白質を精
製、単離した。さらに、分子量（３０，０００ダルトン
前後）及び部分アミノ酸配列を決定し、それをコードす
る遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定した。さら
に、この遺伝子ＤＮＡをベクターに組込み、宿主細胞を
形質転換し、形質転換体を培養して目的とする蛋白質を
得た。 【効果】 本発明の蛋白質は、in vivoまたはin vitro
でのＨＧＦやＨＧＦ活性化因子の活性調節因子として用
いることができる。また、本発明蛋白質の動態解析の手
段として用いることができる抗体を得るための抗原やそ
のアッセイ系での標準品として用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規な蛋白質および
それをコードするＤＮＡに関し、詳細には肝細胞増殖因
子活性化因子（ＨＧＦ活性化因子）のプロテアーゼ活性
を阻害する活性を有する新規な蛋白質（以下、本蛋白質
を「ＨＡＩ−ＩＩ」と称することもある）およびそれを
コードする遺伝子、該遺伝子を含有してなる発現ベクタ
ー、該発現ベクターで形質転換された形質転換体、該形
質転換体を用いたＨＡＩ−ＩＩの産生方法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ＨＧ
Ｆ活性化因子（特開平5-103670号、同6-141859号、同6-
153946号、および同6-153966号各号公報参照；肝細胞増
殖因子（ＨＧＦ）を一本鎖から二本鎖へ変換する活性を
有する因子）の正の活性制御としてその前駆体の活性化
をトロンビンが担うことが既に報告されていたが、負の
制御因子としてその生理活性を阻害する生体由来のプロ
テアーゼインヒビターは知られていなかった。そのた
め、ＨＧＦ活性化因子が生体内でどのように制御されて
いるかは不明であった。また、ＨＧＦ活性化因子が作用
する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の活性をも間接的に影響
を及ぼす可能性があり、ＨＧＦのin vivoでの作用機構
解析のためにも生体由来のプロテアーゼインヒビターの
単離、同定が求められていた。

【０００３】このプロテアーゼインヒビター、並びにプ
ロテアーゼインヒビターに対する抗体を用いることでＨ
ＧＦ活性化因子のin vivoでの生理作用とその作用解析
や、ＨＧＦの活性化の制御機構の解析等を従来と異なる
面から行うことが可能となる。

【０００４】さらに、ＨＡＩ−ＩＩの生体における詳細
な機能、あるいは肝障害時におけるＨＡＩ−ＩＩの働き
等を調べるためには多量のＨＡＩ−ＩＩを必要とする。
しかしながら、現在に至るまでＨＡＩ−ＩＩを取得する
方法としては、ＭＫＮ４５細胞、Ａ５４９細胞等のヒト
癌細胞株の培養上清を材料として、その中に微量に存在
するＨＡＩ−ＩＩを精製するしかなかった。この方法
は、人的、時間的、価格的に必ずしも最良の方法ではな
く、また、微量なＨＡＩ−ＩＩのみを安定に取り出すこ
とは困難を極める。そこで、ＨＡＩ−ＩＩの安定かつ大
量取得のために、発現系の構築が望まれていた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本願発明者らは、肝細胞
増殖因子活性化因子のプロテアーゼ活性を阻害する活性
を指標に種々の培養細胞株をスクリーニングし、ヒト癌
細胞株（ＭＫＮ４５細胞、Ａ５４９細胞等の上皮様細胞
株）の培養上清中にその活性を持つ物質が存在すること
を見い出した。さらに、その阻害活性の本体を明らかに
すべく、ＭＫＮ４５細胞の培養上清から種々のカラムク
ロマトグラフィーを用いてその精製を試みた。その結
果、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）による分子量が約３
０，０００ダルトン付近の新規の蛋白質を見い出し、こ
れをプロテインシークエンサーで分析することにより、
この蛋白質のアミノ末端アミノ酸配列を得た。またこの
蛋白質を蛋白質分解酵素で分解し生成するペプチドを分
離した後、各ペプチドを上記と同様にしてアミノ酸配列
分析することにより部分アミノ酸配列を決定した。更
に、この部分アミノ酸配列からＤＮＡ塩基配列を推定
し、そのオリゴヌクレオチドをプローブとしてｃＤＮＡ
ライブラリーからスクリーニングすることにより、本蛋
白質をコードする遺伝子をクローニングすることに成功
し、本発明を完成するに至った。

【０００６】また、本発明者らは、この蛋白質を組換え
ＤＮＡ技術により安定かつ大量に取得するため種々の検
討をした結果、この目的に有用な、この蛋白質をコード
する発現ベクターを新たに構築し、この蛋白質の発現を
可能にした。すなわち、この蛋白質の一部または全部の
アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を、例えば、動物
細胞発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ等のプラスミドベクター
あるいは酵母、大腸菌等における発現ベクターのプロモ
ーターの下流に挿入した蛋白質発現用プラスミドを作製
し、該プラスミドで宿主細胞を形質転換することにより
得られる形質転換体が優れたＨＡＩ−ＩＩ産生能を有す
ることを見いだし、本発明を完成するに至った。

【０００７】即ち本発明の要旨は、下記の理化学的性質
（１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
分子量が約３０，０００ダルトンであり、（２）肝細胞
増殖因子活性化因子のプロテアーゼ活性を阻害する活性
を有し、（３）配列表の配列番号１〜３のいずれかに記
載のアミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸
配列を有する蛋白質；配列表の配列番号１〜３に記載の
アミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列
を有し、肝細胞増殖因子活性化因子のプロテアーゼ活性
を阻害する活性を有する蛋白質；配列表の配列番号４に
記載のアミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ
酸配列を有する蛋白質；配列表の配列番号４に記載のア
ミノ酸配列において２８番目のアラニンから２５２番目
のロイシンまでの配列またはこれと実質的に同一のアミ
ノ酸配列を有する蛋白質；それらの蛋白質をコ−ドする
ＤＮＡおよび遺伝子；該ＤＮＡまたは遺伝子を含有して
なる発現ベクター；該発現ベクターで宿主細胞を形質転
換することにより得られる形質転換体；ならびに該形質
転換体を培養することによる肝細胞増殖因子活性化因子
のプロテアーゼ活性を阻害する活性を有する蛋白質の産
生方法に存する。

【０００８】なお、配列表の配列番号４に示す塩基配列
は他の相補的な塩基配列を省略し一本鎖のみを記載し
た。この遺伝子より組み換えＤＮＡ技術により、例えば
配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列を有する当該蛋
白質を発現することができる。この時、当該蛋白質をコ
ードするｍＲＮＡから翻訳される蛋白質はシグナル配列
を含んでいるが、細胞から分泌される場合にはシグナル
配列が切断され配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列
の２８番目のアラニン残基以降のアミノ酸配列を有する
当該蛋白質が産生される。シグナル配列として、他の蛋
白質のシグナル配列を利用することもできる。また、宿
主細胞内にシグナル配列のない成熟型蛋白質を発現させ
る場合は、当該蛋白質をコードする遺伝子として配列表
の配列番号４に示す塩基配列のうち８２番目のグアニン
残基から以降の塩基配列を有する遺伝子をベクターのＡ
ＴＧコドンにつなげて使用すればよい。さらに本発明に
おいては、ＨＧＦ活性化因子のプロテアーゼ活性を阻害
する活性を損なわない範囲内で、一部のアミノ酸もしく
は核酸を除去、変更あるいは追加する等の改変を行った
もの、即ち「実質的に同一なアミノ酸配列」および「実
質的に同一な塩基配列」を有するものも本発明に含まれ
る。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明をさらに詳細に説明する
に、本発明のプロテアーゼインヒビター活性を有する新
規な蛋白質は、以下のような精製段階を経ることにより
得られる。例えば、ヒト癌細胞株（ＭＫＮ４５細胞、Ａ
５４９細胞（それぞれ財団法人がん研究振興財団（Japa
nese Cancer Research Resources Bank）に登録番号JCR
B0254、JCRB0076として登録）等の上皮様細胞株）を無
血清培地で数日培養して、その培養上清を回収して細胞
を除去後、濃縮して、ヘパリン−セファロースカラム
(ファルマシア社製等)に供する。その素通り画分をＣｏ
ｎＡ−セファロースカラム(ファルマシア社製等）に供
し、吸着画分と素通り画分に分離する。素通り画分をＰ
ｈｅｎｙｌ−５ＰＷ（東ソー社製等）等の疎水クロマト
グラフィーに供する。得られた当該タンパク質を含む画
分をＤＥＡＥイオン交換カラムクロマトグラフィー（ポ
リマーラボラトリー社製等）に供し、その後、ハイドロ
キシアパタイトカラム（三井東圧化学社、生化学工業社
等）に供す。その後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィ
ー（旭化成社製ＧＳ５２０等）に供し、当該蛋白質を得
ることができる。必要に応じて、逆相カラムクロマトグ
ラフィー等を精製のステップに組み込むこともできる。

【００１０】精製された本発明の蛋白質はＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約３０，０
００ダルトンで、糖鎖、アミノ酸残基の修飾、Ｃ末端側
の変異の相違と思われる数本のフラグメントもしくはス
メアーなバンドとして泳動する。当該蛋白質はＨＧＦ活
性化因子と反応させることで、ＨＧＦ活性化因子のプロ
テアーゼ活性を阻害する活性を有する。また、本発明の
蛋白質は下記実施例２の表１に記載のアミノ酸配列を含
む。

【００１１】本発明の新規蛋白質をコードする遺伝子の
ＤＮＡ断片は次のようにして得ることができる。上記の
ようにして精製した新規蛋白質を気相プロテインシーケ
ンサー（アプライド・バイオシステムズ社製等）で分析
することにより、アミノ末端アミノ酸配列を決定するこ
とができる。更に、当該蛋白質をリジルエンドペプチダ
ーゼ（アクロモバクタープロテアーゼＩ等）で分解し、
生成するペプチド断片を逆相高速液体クロマトグラフィ
ー（ＹＭＣ社製等）で分離した後、各ペプチド断片を上
記と同様にしてアミノ酸配列分析すれば、蛋白質内部の
アミノ酸配列を知ることができる。

【００１２】こうして決定したアミノ酸配列からＤＮＡ
塩基配列を推定し、オリゴヌクレオチドを合成してプロ
ーブとして使用する。当該蛋白質をコードする遺伝子を
スクリーニングするｃＤＮＡライブラリーとしてはヒト
由来の肝臓ｃＤＮＡライブラリー、脾臓ｃＤＮＡライブ
ラリー、胎盤ｃＤＮＡライブラリー等（クローンテック
社製等）が利用できる。その他当該蛋白質を発現してい
る細胞株および組織材料から常法に従ってｃＤＮＡライ
ブラリーを作成してもよい。

【００１３】このようなｃＤＮＡが組み込まれたλファ
ージを大腸菌に感染させ（Maniatisらの方法：「モレキ
ュラークローニング」）、これを培養する。形成された
プラークを当該蛋白質の一部のアミノ酸配列から推定さ
れる塩基配列から作成したオリゴヌクレオチドをプロー
ブとしてプラークハイブリダイゼイション法に従って選
択することにより、容易に目的とする当該蛋白質のアミ
ノ酸配列を有し、なおかつ当該蛋白質のアミノ酸配列の
プローブ以外の領域に相当する塩基配列をも有する、異
なるλファージクローンをいくつか得ることができる。

【００１４】更に、上記スクリーニング陽性のプラーク
からManiatisらの方法によりファージを増殖させ、その
ものからグリセロールグラディエント法に従ってＤＮＡ
を精製し適切な制限酵素で切断後、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ
１９等のプラスミドベクターあるいはＭ１３ｍｐ１８、
Ｍ１３ｍｐ１９等の一本鎖ファージベクターにｃＤＮＡ
をサブクローニングし、Sangerらのジデオキシ法に従っ
て目的ｃＤＮＡフラグメントの塩基配列を決定すること
ができる。得られたクローンの塩基配列を解析し、それ
らを統合することにより当該蛋白質の一部をコードする
ｃＤＮＡ群によって配列表の配列番号４に示す当該蛋白
質の全アミノ酸配列のすべてに対応する遺伝子を得るこ
とができる。

【００１５】また、本ｃＤＮＡの塩基配列の一部をプロ
ーブとして使用し、ＰＣＲ法を用いることにより、各種
ｃＤＮＡライブラリーから、本ｃＤＮＡの全てを含む遺
伝子、本ｃＤＮＡの一部の塩基配列が欠失した遺伝子、
本ｃＤＮＡに他の塩基配列が挿入された遺伝子もしくは
本ｃＤＮＡの一部の塩基配列が他の塩基配列に置換され
た遺伝子なども得ることができる。このような塩基配列
の欠失、付加あるいは置換等の部位特異的変異は、Meth
od in Enzymol., 217, 218-227（1993）、同217, 270-2
79（1993）等に記載の方法により容易に行うことができ
る。

【００１６】このようにして得られるｃＤＮＡ群をその
塩基配列の順番が本蛋白質のアミノ酸配列に従う形でつ
なぎ、当該蛋白質の全領域を含むＤＮＡ断片とし、これ
をｐＣＤＬ−ＳＲα２９６等のプラスミドのプロモータ
ーの下流に翻訳開始コドンＡＴＧとフェーズを合わせ
て、蛋白質発現用プラスミドを構築し、当該プラスミド
で形質転換された動物細胞の宿主内等で当該蛋白質を発
現させることができる。続いて常法に従い精製し、発現
された当該蛋白質を得ることができる。

【００１７】すなわち、上記のようにして得られる各種
ｃＤＮＡをｐＭＥ１８Ｓ等のプラスミドのプロモーター
の下流に挿入して、蛋白質発現用プラスミドを構築し、
当該プラスミドで形質転換された動物細胞の宿主等で、
当該蛋白質、当該蛋白質の一部のアミノ酸配列が欠失し
た蛋白質、当該蛋白質に他のアミノ酸配列が挿入された
蛋白質もしくは当該蛋白質の一部のアミノ酸配列が他の
アミノ酸配列に置換された蛋白質を発現させることがで
きる。具体的には、動物細胞としてＣＨＯ細胞、ＣＯＳ
細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、マウスＦＭ
３Ａ細胞等を用いて発現させることが可能である。これ
らの動物細胞等を宿主とする場合は、シグナル配列とし
て、配列表の配列番号８に示すＤＮＡ塩基配列、すなわ
ち当該蛋白質の遺伝子の１から３５番目の塩基配列もし
くは既存のシグナル配列を使用することにより、当該蛋
白質が細胞外に分泌生産、もしくは細胞膜表面上に生産
されることが期待される。

【００１８】動物細胞を宿主とした発現用プラスミドは
次のように構築される。プロモーターとしては全ての既
存のプロモーターが使用可能であるが、例えばＳＲαプ
ロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはメタルチオ
ネイン遺伝子のプロモーターが使用できる。このプロモ
ーター下流に上記シグナル様配列を含む当該蛋白質の遺
伝子の全てを含むＤＮＡ、本遺伝子の一部の塩基配列が
欠失したＤＮＡ、本遺伝子に塩基配列が挿入されたＤＮ
Ａもしくは本遺伝子の一部の塩基配列が別の塩基配列に
置換されたＤＮＡを転写方向にしたがって挿入する。ま
た当該蛋白質の発現ベクター構築の際には該プロモータ
ーの下流に当該蛋白質をコードする遺伝子のＤＮＡ断片
を２〜３個結合したものを挿入してもよい。また当該蛋
白質をコードする遺伝子のＤＮＡ断片の５’上流側にＳ
Ｖ４０などのプロモーターを結合したＤＮＡ断片を単位
としたものを転写方向を揃えて２〜３個結合してベクタ
ーに挿入してもよい。

【００１９】この当該蛋白質をコードする遺伝子の下流
にはポリアデニル化部位を付加する。例えば、ＳＶ４０
ＤＮＡ、β−グロビン遺伝子またはメタルチオネイン
遺伝子由来のポリアデニル化部位が当該蛋白質をコード
する遺伝子の下流に付加することが可能である。またプ
ロモーターと当該蛋白質をコードする遺伝子を結合した
ＤＮＡ断片を２〜３個結合する場合には、各単位の当該
蛋白質をコードする遺伝子の３’側にそれぞれポリアデ
ニル化部位を存在させることもできる。この発現ベクタ
ーを用いて動物細胞例えばＣＨＯ細胞を形質転換する際
に、薬剤耐性遺伝子を使用し、目的とする発現細胞を選
択することが可能である。

【００２０】薬剤耐性遺伝子としては、メトトレキセー
ト耐性を与えるＤＨＦＲ遺伝子（ジャーナルオブモレキ
ュラバイオロジー（J. Mol. Biol.）159巻601頁（198
2））、抗生物質Ｇ−４１８耐性を与えるＮｅｏ遺伝子
（ジャーナルオブモレキュラアプライドジェネティクス
（J. Mol. Appl. Genet.）1巻327頁（1982））、ミコフ
ェノール酸耐性を与える大腸菌由来のＥｃｏｇｐｔ遺伝
子（プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサ
イエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）78巻2072
頁（1981））、抗生物質ハイグロマイシン耐性を与える
ｈｐｈ遺伝子（モレキュラセルバイオロジー（Mol. Cel
l. Biol.）5巻410頁（1985））等が挙げられ、各耐性遺
伝子の５’上流側にはプロモーター、例えば前述のＳＶ
４０由来のプロモーターが挿入されており、各耐性遺伝
子の３’下流側には、前述のポリアデニル化部位が含ま
れる。

【００２１】当該蛋白質の発現ベクターにこれらの耐性
遺伝子を挿入する場合、当該蛋白質をコードする遺伝子
のポリアデニル化部位下流に順方向あるいは逆方向に挿
入すればよい。これらの発現ベクターは、形質転換体を
得る際に選択マーカー遺伝子を含む別のプラスミドを二
重形質転換する必要がない。また当該蛋白質の発現ベク
ターにこれらの選択マーカー遺伝子が挿入されていない
場合には、形質転換体の選択のマーカーを有するベクタ
ー例えばｐＳＶ２ｎｅｏ（ジャーナルオブモレキュラア
プライドジェネティクス（J. Mol. Appl. Genet.）1巻3
27頁（1982））、ｐＭＢＧ（ ネイチャー（Nature）294
巻228頁（1981））ｐＳＶ２ｇｐｔ（プロシーディング
オブナショナルアカデミーオブサイエンス（Proc. Nat
l. Acad.Sci. U.S.A.）78巻2072頁（1981））、ｐＡｄ-
Ｄ２６-１（ジャーナルオブモレキュラバイオロジー
（J. Mol. Biol.）159巻601頁（1982））などを当該蛋
白質をコードする遺伝子の発現ベクターと共に形質転換
し、薬剤耐性遺伝子の表現形質により形質転換体を容易
に選択できる。

【００２２】発現ベクターの動物細胞への導入は、リン
酸カルシウム法（ヴァイロロジー（Virology）52巻456
頁（1973））、エレクトロポレーション法（ジャーナル
オブメンブレンバイオロジー（J. Membr. Biol.）10巻2
79頁（1972））等により行うことができる。

【００２３】形質転換された動物細胞の培養は、常法に
より浮遊培養または付着培養で行うことができる。培地
としては、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０などを用い、５〜
１０％血清の存在下もしくは適当量のインシュリン、ト
ランスフェリン等の存在下、もしくは無血清下にて培養
する。さらに当該蛋白質を、酵母や大腸菌、例えば、Sa
ccharomyes cerevisiae株や Escherichia coli YA-21株
等の微生物を使用して生産することも出来る。

【００２４】当該蛋白質を発現している細胞は、その培
養上清中、もしくは細胞表面上に当該蛋白質を発現する
ことから、この組換え体の培養上清もしくは細胞を用い
て当該蛋白質の分離精製を行うことが可能である。具体
的には、生産された当該蛋白質を含む培養上清もしくは
細胞抽出液を各種クロマトグラフィー、例えば、ヘパリ
ン−セファロース、ＣｏｎＡ−セファロース、ハイドロ
キシアパタイト等を組み合わせたクロマトグラフィーに
て精製することにより当該蛋白質を単離精製することが
できる。

【００２５】

【発明の効果】本発明に関わるプロテアーゼインヒビタ
ー活性を有する蛋白質はＨＧＦ活性化因子のプロテアー
ゼ活性を阻害する活性を持つため、in vivoまたはin vi
troでのＨＧＦ活性化因子の調節因子として、また、間
接的にはＨＧＦの活性の調節因子として、さらにはそれ
ら因子の機能解析の道具、手段として、当該蛋白質に対
する抗体、当該蛋白質をコードする遺伝子も含めて使用
される。

【００２６】また、当該蛋白質をコードする遺伝子が導
入された発現ベクターを動物細胞に導入することによ
り、今まで困難であった生物学的活性のある当該蛋白質
の一部または全部あるいは当該蛋白質様蛋白質を、大
量、安定かつ容易に生産することが可能となる。

【００２７】

【実施例】以下の実施例により、本発明をさらにより詳
細に説明するが、本発明は、その要旨を越えない限り、
以下の実施例によって限定されるものではない。

【００２８】実施例１ ＭＫＮ４５細胞の培養上清を用
いての当該蛋白質の精製 ＭＫＮ４５細胞［内藤ら、癌と化学療法、5、89（197
8）；免疫生物研究所から入手］をローラーボトル８５
０の５％ＦＢＳを含むｅＲＤＦ培地中に播種して、コン
フルエントな状態になるまで増殖させた。増殖後、ＦＢ
Ｓを含む培養液を除去後、無血清ｅＲＤＦ培地で２度洗
浄した。洗浄用培地を除去後、無血清ｅＲＤＦ培地５０
０ｍｌを加えて３〜６日間３７℃でインキュベーション
した。インキュベーション後、培養液を回収して、新し
い無血清ｅＲＤＦ培地５００ｍｌを加えて再度インキュ
ベーションした。これを数回繰り返して、回収した培養
上清をＹＭ３０限外濾過膜（アミコン社製）にて約２０
倍にまで濃縮した。

【００２９】この濃縮液をヘパリン−セファロースカラ
ム（ＰＢＳで平衡化）に供し、その素通り画分を回収し
た。このヘパリンカラム素通り画分を、ＣｏｎＡ−セフ
ァロースカラム（ＰＢＳで平衡化）に供し、素通り画分
と、２００ｍＭ α−メチルＤ−マンノシドを含むＰＢ
Ｓ溶液での溶出画分に分離した。ＣｏｎＡ素通り画分を
ＹＭ３０を用いて濃縮、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む１
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）溶液へ緩衝液置換を
行い、Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ（東ソー社製；１Ｍ硫酸ア
ンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
で平衡化）を用いたＨＰＬＣに供し、１Ｍ硫酸アンモニ
ウムから０Ｍへの直線濃度勾配溶出を行い、目的のプロ
テアーゼインヒビター活性が存在する画分を回収した。

【００３０】当画分を０．０５％ＣＨＡＰＳを含む２０
ｍＭトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ８）に透析後、ＤＥＡＥ
（０．０５％ＣＨＡＰＳを含む２０ｍＭトリス／塩酸緩
衝液（ｐＨ８）で平衡化）を用いたＨＰＬＣに供し、０
Ｍから５００ｍＭ ＮａＣｌへの直線濃度勾配溶出を行
い、目的のプロテアーゼインヒビター活性が存在する画
分を回収した。当画分を０．０５％ＣＨＡＰＳを含む５
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に透析して、ＨＣＡ
Ａ−４００７カラム（三井東圧化学社製）（０．０５％
ＣＨＡＰＳを含む５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で
平衡化）を用いたＨＰＬＣに供し、その素通り画分を回
収した。当画分をＧＳ−５２０（０．０５％ＣＨＡＰＳ
を含むＰＢＳで平衡化）に供し、活性画分（約４０〜２
０ｋＤａ付近の画分）を回収した。マイナーバンドを除
去するため、当画分をＹＭＣ ｐａｃｋＣ４カラム（Ｙ
ＭＣ社製）に供し、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリ
ル／イソプロピルアルコール（３／７）濃度１０％から
５０％まで４０分間の直線濃度勾配溶出を行い、活性画
分を１Ｍトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ８）にて中和後、減
圧下で乾燥させた。乾燥後、０．０５％ＣＨＡＰＳを含
むＰＢＳに溶解して、精製蛋白質を得た。

【００３１】実施例２ 当該蛋白質のアミノ末端アミノ
酸配列および部分アミノ酸配列の決定 実施例１に従って精製し、逆相ＨＰＬＣで溶出させたプ
ロテアーゼインヒビター活性を有する蛋白質を、中和せ
ずに減圧下で乾燥させた。これを、５０％ＴＦＡ（トリ
フルオロ酢酸）６０μｌに溶解し、ポリブレン処理した
グラスフィルターに添加し、Applied Biosystems社製４
７０Ａシークエンサーでエドマン分解し、Ｎ末端領域の
アミノ酸配列を決定した。フェニルヒダントイン（ＰＴ
Ｈ）アミノ酸の同定は、三菱化学社製ＭＣ ｇｅｌ Ｏ
ＤＳ ＩＨＵ（０．４６ｘ１５ｃｍ）カラムを用い、酢
酸緩衝液（１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．７）、０．０
１％ＳＤＳ、３８％アセトニトリル）による単一溶媒溶
出法を流速１．２ｍｌ／分、温度４３℃で行い、ＰＴＨ
アミノ酸の検出は２６９ｎｍの吸光度で行った。

【００３２】この結果、表１に示すＮ末端アミノ酸配列
を同定した。次に、同じく実施例１に従って精製し、逆
相ＨＰＬＣで溶出させたプロテアーゼインヒビター活性
を有する蛋白質を、４Ｍ尿素を含む５０ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ９．０）１００μｌに溶解し、これにリジルエン
ドペプチダーゼ（アクロモバクタープロテアーゼＩ）を
添加して３７℃で８時間反応させた。生成したペプチド
混合物はＹＭＣ ｐａｃｋ Ｃ８カラム（ＹＭＣ社）を
用いた逆相ＨＰＬＣにより分離して各ペプチド断片を得
た。２つのペプチドについて気相プロテインシークエン
サー（Applied Biosystems社製 model470A）を用いて
アミノ酸配列分析を行ったところ、表1に示す配列が見
い出された。

【００３３】

【表１】表１ ペプチドのアミノ酸配列 Ｎ末端：Ala-Asp-Arg-Glu-Arg-Ser-Ile-His-Asp-Phe-Xa
a-Leu-Val-Ser-Lys（配列表の配列番号１） 部分アミノ酸配列 １：Lys-Val-Val-Gly-Arg-Xaa-Arg-Ala-Ser-Met-Pro-Ar
g-Trp-Trp-Tyr-Asn-Val-Thr-Asp-Gly-Ser-Xaa-Gln-Leu-
Phe-Val-Tyr-Gly-Gly（配列表の配列番号２） ２：Ala-Thr-Val-Thr-Glu-Asn-Ala-Thr-Gly-Asp-Leu-Al
a-Thr-Ser-Arg-Asn-Ala-Ala-Asp-Ser-Ser-Val-Pro-Ser-
Ala-Pro（配列表の配列番号３） （配列中、Xaaは未決定のアミノ酸を示す。）

【００３４】実施例３ Ａ５４９細胞の培養上清を用い
ての当該蛋白質の精製とアミノ酸配列解析 Ａ５４９細胞［財団法人がん研究振興財団（Japanese C
ancer Research Resources Bank)」から入手］を実施例
1と同様に培養して培養上清を調製した。その培養上清
を用いて実施例１と同じ操作によって、ＨＧＦ活性化因
子のプロテアーゼ活性を阻害する活性を持つ蛋白質を得
た。この蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上、ＭＫＮ４５細胞
由来のものと同じ分子量を示した。また、この蛋白質の
Ｎ末端領域のアミノ酸配列を実施例１と同様の方法で決
定した。この結果、その配列はＭＫＮ４５細胞由来と同
じであった。このことより、当該蛋白質はＭＫＮ４５由
来の蛋白質と同じである可能性が示された。

【００３５】実施例４ 当該蛋白質のＨＧＦ活性化因子
のプロテアーゼ活性を阻害する活性を測定する方法とそ
の活性 測定しようとするサンプル１〜１０μｌを、２〜５ｎｇ
血清由来ＨＧＦ活性化因子を含むＰＢＳ、０．０５％
ＣＨＡＰＳ溶液３０〜４０μｌに添加した。３７℃で３
０分間インキュベーション後、５〜１０μｇの一本鎖Ｈ
ＧＦを添加し、さらに２時間インキュベーションを継続
した。この混合液を、還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動に供した。電気泳動後、クマシー
ブリリアントブルーＲ２５０（ＣＢＢ）で染色し、一本
鎖ＨＧＦと二本鎖ＨＧＦの割合を比較することで、活性
を検出した。

【００３６】精製した当該蛋白質数１０ｎｇと５ｎｇ血
清由来ＨＧＦ活性化因子をＰＢＳ、０．０５％ＣＨＡＰ
Ｓ溶液３０〜４０μｌ中で３７℃で３０分間インキュベ
ーションした後、１０μｇ一本鎖ＨＧＦを添加し、さら
に２時間インキュベーションを継続した。この混合液
を、還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動に供し、電気泳動後、ＣＢＢで染色した。結果を図
１に示す。図中、１はＨＧＦ活性化因子と当該蛋白質を
無添加の場合を、２はＨＧＦ活性化因子を添加、当該蛋
白質無添加の場合を、３はＨＧＦ活性化因子と当該蛋白
質を添加した場合の結果を表す。当該蛋白質の添加によ
り、ＨＧＦ活性化因子のＨＧＦを一本鎖から二本鎖に変
換する活性が抑制された。

【００３７】実施例５ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動 ＭＫＮ４５細胞の培養上清とＡ５４９細胞の培養上清よ
り実施例１と２に従って精製されたプロテアーゼインヒ
ビター活性を持つ当該蛋白質の見かけ上の分子量を求め
るため、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
った。最終的に精製された当該蛋白質を１２．５％のポ
リアクリルアミド・スラブゲルを用いたＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動に、非還元下で供した。分子
量マーカーとしては、分子量マーカー「第一」III Laem
mli法用(第一化学薬品社製)を用いた。電気泳動後、銀
染色試薬（関東化学社製）を用いて発色させた。当該蛋
白質と標準分子量マーカーの蛋白質との泳動距離の相対
的比較により、ＭＫＮ４５細胞の培養上清とＡ５４９細
胞の培養上清から得られた当該蛋白質は、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動上のみかけの分子量として
約３０，０００ダルトン前後に糖鎖、アミノ酸残基の修
飾または末端領域の相違によるものと思われる数本のフ
ラグメントもしくはスメアーなバンドを示した。

【００３８】実施例６ 当該蛋白質をコードする遺伝子
のクローニングおよび塩基配列の決定 実施例２によって得られた、当該蛋白質の部分アミノ酸
配列（配列表の配列番号２）に含まれる、Lys-Val-Val-
Gly-Arg-Xaa-Arg および Xaa-Gln-Leu-Phe-Val-Tyr-Gly
-Glyの配列をもとに、XaaがCysであろうとの予測をたて
て、以下に示す二種類のオリゴヌクレオチドプライマー
を設計した。 プライマー１：5'-AAGGTNGTNGGNMGNTGYMG-3'（配列表の
配列番号：５） プライマー２：5'-CNCCGTANACGAANARYTGRC-3'（配列表
の配列番号：６） （配列中、N=TまたはG、M=AまたはC、Y=TまたはC、R=A
またはGを示す。） 次に、ＭＫＮ４５細胞株よりトータルＲＮＡをアナリテ
ィカルバイオケミストリー(Anal. Biochem.）162卷156
頁（1987）に記載の方法に従って調製し、これをオリゴ
（ｄＴ）セルロースカラムに供すことによりｐｏｌｙ−
（Ａ）＋ＲＮＡを取得した。

【００３９】得られたｐｏｌｙ−（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型
として用い、ＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcription-po
lymerase chain reaction、羊土社、林 件志 編、1995
年2月5日発刊「ＰＣＲ法の最新技術」p44-p52参照）を
行った。このＲＴ−ＰＣＲにて得られた反応液をポリア
クリルアミド電気泳動法にて解析した結果、約８５ｂｐ
のＤＮＡ断片が検出された。そこでこのＤＮＡ断片をポ
リアクリルアミドより抽出後、フェノールクロロホルム
処理およびエタノール沈殿を行いＤＮＡ断片を回収後、
ダイデオキシ法にて塩基配列を決定した。さらに、この
ＤＮＡ断片はモレキュラークローニング（コールドスプ
リングハーバーラボラトリー、1982年）に記載の方法に
従って³²Ｐ標識し、これをスクリーニング用プローブと
した。

【００４０】スクリーニング用のライブラリーとして
は、ＭＫＮ４５細胞株のｐｏｌｙ−（Ａ）＋ＲＮＡをも
とに、ｃＤＮＡ合成キット（ファルマシア社製）を用い
てｃＤＮＡを合成し、ラムダＺＡＰＩＩ（ストラテジー
ン社製）をベクターとしたファージライブラリーを作製
した。大腸菌はＸＬ−Ｂｌｕｅ（ストラテジーン社製）
を用い、約１０万プラークとなるように上記のファージ
を感染させた。

【００４１】ＮＺＹ培地で一晩生育させた後、ジーンス
クリーニングプラス（デュポン社製）にトランスファー
させた。そのメンブレンを０．１Ｍ水酸化ナトリウム／
０．５Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）が染み込
んだ濾紙上に２分間静置し、続いて１．５Ｍ塩化ナトリ
ウム／０．５Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）が
染み込んだ濾紙上で５分間静置した。この一連の処理を
更に２回繰り返した後、２ｘＳＳＣ（２倍ＳＳＣ）で洗
浄し、乾いた濾紙上で風乾した。次にこのメンブレンに
１２０ｍＪ／ｃｍ²のＵＶ照射を行うことにより、メン
ブレンに移したＤＮＡの固定を行った。こうして処理し
たメンブレンを５０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ
７．５）、１Ｍ塩化ナトリウムおよび１％ＳＤＳよりな
る溶液５０ｍｌに浸漬し、６５℃で２時間保持した。

【００４２】次に、上記の³²Ｐで標識したプローブ５ｎ
ｇ／ｍｌ、鮭***ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌ、５０ｍＭト
リス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）、１Ｍ塩化ナトリウ
ムおよび１％ＳＤＳよりなる溶液４０ｍｌに浸漬し、６
５℃で１６時間保持した。その後、このメンブレンを２
ｘＳＳＣで室温５分間、０．１ｘＳＳＣで室温３０分間
２回の順に洗浄した後、オートラジオグラフィーを行
い、当該蛋白質ｃＤＮＡを含むと考えられる２２個のポ
ジティブクローンを得た。各ポジティブクローンから、
東洋紡社ライフサイエンスカタログ（p114-115）および
ストラテジーン社製マニアルに従ってエキシジョン法
（東洋紡社ライフサイエンスカタログ、p114-115）を行
い、プラスミドの構築を行った。

【００４３】次に、このプラスミドＤＮＡを取得後、制
限酵素ＥｃｏＲＩにて切断し、アガロース電気泳動によ
り、最長の当該蛋白質ｃＤＮＡが挿入されたクローンを
選択した。次にこのクローンが有するプラスミド（ｐＨ
ＡＩ−ＩＩ）について塩基配列を解析することにより、
当該蛋白質をコードする遺伝子の全塩基配列を決定した
（配列表の配列番号４）。

【００４４】施例７ 当該蛋白質発現プラスミドの調製 実施例６によって得られた当該蛋白質ｃＤＮＡを含むプ
ラスミド（ｐＨＡＩ−ＩＩ）１０μｇを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで切断後、アガロースゲル電気泳動により当該蛋白
質ｃＤＮＡを含む約１．４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲ
ＩＤＮＡ断片を分離および抽出した。得られた当該蛋白
質ｃＤＮＡ断片の末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼにて平
滑末端にした後、フェノールクロロホルム抽出およびエ
タノール沈澱を行い、１０μｌの水に溶解した。

【００４５】一方、発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ（メディ
カルイミュノロジー、20卷27頁（1990））は制限酵素Ｘ
ｈｏＩで切断後、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼにて平
滑末端にした。この後、フェノールクロロホルム抽出お
よびエタノール沈澱を行い、４００μｌの５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂溶液に
溶解した。さらにバクテリアルアルカリホスファターゼ
（東洋紡、ＢＡＰ−１０１）１ｕｎｉｔを添加し、６５
℃下３０分の反応を施し脱燐酸化処理を行った。次にこ
の反応液からフェノールクロロホルム抽出とエタノール
沈澱により制限酵素ＸｈｏＩで切断されたｐＭＥ１８Ｓ
ベクターを精製し、１０μｌの水に溶解した。

【００４６】このｐＭＥ１８ＳベクターのＤＮＡ断片
０．０１μｇと前述の平滑末端化されたＨＡＩｃＤＮＡ
のＥｃｏＲＩ断片０．１μｇを含む溶液２０μｌ（６６
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ₂、１０ｍＭジチオトレイトール、６６μＭ Ａ
ＴＰ）をＴ４ＤＮＡリガーゼ（東洋紡ＬＧＡ−１０１）
存在下で１４℃で１２時間反応させ、両ＤＮＡ断片の結
合反応を行った。

【００４７】次に、この反応液１０μｌを用いて大腸菌
ＨＢ１０１株（宝酒造）を形質転換し、アンピシリンを
５０μｇ／ｍｌの濃度で含む培地上で培養することによ
り数十個のアンピシリン耐性株を得た。これらの組換え
体をManiatisらの方法（「モレキュラークローニン
グ」、コールドスプリングハーバーラボラトリー、86頁
〜96頁（1982））に従い解析することにより、発現ベク
ターｐＭＥ１８Ｓのプロモーターとポリアデニレーショ
ン部位の中間に存在する制限酵素ＸｈｏＩ切断部位に当
該蛋白質をコードする遺伝子が挿入されたプラスミド、
ｐＭＥ１８Ｓ−ＨＡＩ−ＩＩプラスミドを得ることが出
来た。その構造を図２に示す。

【００４８】実施例８ 当該蛋白質を発現する細胞株の
取得 実施例７で作製された発現ベクターｐＭＥ１８Ｓの制限
酵素ＸｈｏＩ切断部位に当該蛋白質ｃＤＮＡが挿入され
たプラスミドｐＭＥ１８Ｓ−ＨＡＩ−ＩＩをManiatisら
の方法（「モレキュラークローニング」、コールドスプ
リングハーバーラボラトリー、86頁〜96頁（1982））に
従い組換え体の大腸菌から回収、精製し当該蛋白質発現
プラスミドＤＮＡを大量に得た。

【００４９】一方、ＣＯＳ細胞をＦＢＳ（牛胎児血清）
が１０％入ったｅＲＤＦ培地中でセミコンフルエントな
状態になるまで培養した。次にシャーレから培地を除き
そこにＤＮＡ溶液を滴加するが、ＤＮＡ溶液は予め次に
示す手順に従って調製した。まず直径９ｃｍのシャーレ
一枚につき３００μｌの２ｘＨＥＢＳ溶液（２ｘＨＥＢ
Ｓ溶液；１．６％塩化ナトリウム、０．０７４％塩化カ
リウム、０．０５％燐酸水素二ナトリウム１２水塩、
０．２％デキストロース、１％ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０
５））と１０μｇのプラスミドＤＮＡを加え、滅菌水で
５７０μｌに合わせた溶液を、エッペンドルフ遠心管中
に準備する。次に該ＤＮＡ溶液に３０μｌの２．５Ｍの
塩化カルシウム溶液を滴加しながらボルテックスミキサ
ーを用い数秒間激しく混和する。これを室温で３０分間
放置するが、その間およそ１０分おきにボルテックスミ
キサーで混和する。

【００５０】この様にしてできたＤＮＡ溶液を、前述の
細胞にかけて室温で３０分間静置した。その後ＦＢＳが
１０％入ったｅＲＤＦ培地（極東製薬社製）９ｍｌをシ
ャーレに入れて３７℃、５％ＣＯ₂存在下で４〜５時間
培養した。次にシャーレから培地を除き５ｍｌの１ｘＴ
ＢＳ＋＋溶液（１ｘＴＢＳ＋＋溶液；２５ｍＭトリス−
塩酸（ｐＨ７．５）、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍ
Ｍ塩化カリウム、０．６ｍＭ燐酸水素二ナトリウム、
０．０８ｍＭ塩化カルシウム、０．０８ｍＭ塩化マグネ
シウム）で細胞を洗浄し、１ｘＴＢＳ＋＋溶液を除去し
た後、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキサイド）を１０％含
む１ｘＨＥＢＳ溶液を５ｍｌ細胞にかけて室温で１〜２
分間静置した後上清を除去した。その後５ｍｌの１ｘＴ
ＢＳ＋＋溶液で細胞を再び洗浄しＦＢＳが１０％入った
ｅＲＤＦ培地１０ｍｌをシャーレに入れて３７℃ ５％
ＣＯ₂存在下で培養し、４８時間が経過した時点で培地
を回収した。回収した培養上清を２０倍に濃縮して、Ｈ
ＧＦ活性化因子に対する阻害活性を測定したところ、阻
害活性が確認された。

【００５１】

【配列表】

配列列番号：１ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 起源 生物名：ホモ サピエンス(Homo sapiens) 株名：MKN45 他の情報 11番目のXaaは未同定のアミノ酸を示す 配列 Ala Asp Arg Glu Arg Ser Ile His Asp Phe Xaa Leu Val Ser Lys 1 5 10 15

【００５２】配列番号：２ 配列の長さ：２９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ホモ サピエンス(Homo sapiens) 株名：MKN45 他の情報 6番目及び22番目のXaaは未同定のアミノ酸を示す 配列 Lys Val Val Gly Arg Xaa Arg Ala Ser Met Pro Arg Trp Trp Tyr Asn 5 10 15 Val Thr Asp Gly Ser Xaa Gln Leu Phe Val Tyr Gly Gly 20 25

【００５３】配列番号：３ 配列の長さ：２６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ホモ サピエンス(Homo sapiens) 株名：MKN45 配列 Ala Thr Val Thr Glu Asn Ala Thr Gly Asp Leu Ala Thr Ser Arg Asn 1 5 10 15 Ala Ala Asp Ser Ser Val Pro Ser Ala Pro 20 25

【００５４】配列番号：４ 配列の長さ：７５９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA アンチセンス：Ｎｏ 起源 生物名：ホモ サピエンス(Homo sapiens) 株名：MKN45 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..759 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：1..81 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：82..759 特徴を決定した方法：E 配列 ATG GCG CAG CTG TGC GGG CTG AGG CGG AGC CGG GCG TTT CTC GCC CTG 48 Met Ala Gln Leu Cys Gly Leu Arg Arg Ser Arg Ala Phe Leu Ala Leu 1 5 10 15 CTG GGA TCG CTG CTC CTC TCT GGG GTC CTG GCG GCC GAC CGA GAA CGC 96 Leu Gly Ser Leu Leu Leu Ser Gly Val Leu Ala Ala Asp Arg Glu Arg 20 25 30 AGC ATC CAC GAC TTC TGC CTG GTG TCG AAG GTG GTG GGC AGA TGC CGG 144 Ser Ile His Asp Phe Cys Leu Val Ser Lys Val Val Gly Arg Cys Arg 35 40 45 GCC TCC ATG CCT AGG TGG TGG TAC AAT GTC ACT GAC GGA TCC TGC CAG 192 Ala Ser Met Pro Arg Trp Trp Tyr Asn Val Thr Asp Gly Ser Cys Gln 50 55 60 CTG TTT GTG TAT GGG GGC TGT GAC GGA AAC AGC AAT AAT TAC CTG ACC 240 Leu Phe Val Tyr Gly Gly Cys Asp Gly Asn Ser Asn Asn Tyr Leu Thr 65 70 75 80 AAG GAG GAG TGC CTC AAG AAA TGT GCC ACT GTC ACA GAG AAT GCC ACG 288 Lys Glu Glu Cys Leu Lys Lys Cys Ala Thr Val Thr Glu Asn Ala Thr 85 90 95 GGT GAC CTG GCC ACC AGC AGG AAT GCA GCG GAT TCC TCT GTC CCA AGT 336 Gly Asp Leu Ala Thr Ser Arg Asn Ala Ala Asp Ser Ser Val Pro Ser 100 105 110 GCT CCC AGA AGG CAG GAT TCT GAA GAC CAC TCC AGC GAT ATG TTC AAC 384 Ala Pro Arg Arg Gln Asp Ser Glu Asp His Ser Ser Asp Met Phe Asn 115 120 125 TAT GAA GAA TAC TGC ACC GCC AAC GCA GTC ACT GGG CCT TGC CGT GCA 432 Tyr Glu Glu Tyr Cys Thr Ala Asn Ala Val Thr Gly Pro Cys Arg Ala 130 135 140 TCC TTC CCA CGC TGG TAC TTT GAC GTG GAG AGG AAC TCC TGC AAT AAC 480 Ser Phe Pro Arg Trp Tyr Phe Asp Val Glu Arg Asn Ser Cys Asn Asn 145 150 155 160 TTC ATC TAT GGA GGC TGC CGG GGC AAT AAG AAC AGC TAC CGC TCT GAG 528 Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Arg Ser Glu 165 170 175 GAG GCC TGC ATG CTC CGC TGC TTC CGC CAG CAG GAG AAT CCT CCC CTG 576 Glu Ala Cys Met Leu Arg Cys Phe Arg Gln Gln Glu Asn Pro Pro Leu 180 185 190 CCC CTT GGC TCA AAG GTG GTG GTT CTG GCG GGG CTG TTC GTG ATG GTG 624 Pro Leu Gly Ser Lys Val Val Val Leu Ala Gly Leu Phe Val Met Val 195 200 205 TTG ATC CTC TTC CTG GGA GCC TCC ATG GTC TAC CTG ATC CGG GTG GCA 672 Leu Ile Leu Phe Leu Gly Ala Ser Met Val Tyr Leu Ile Arg Val Ala 210 215 220 CGG AGG AAC CAG GAG CGT GCC CTG CGC ACC GTC TGG AGC TCC GGA GAT 720 Arg Arg Asn Gln Glu Arg Ala Leu Arg Thr Val Trp Ser Ser Gly Asp 225 230 235 240 GAC AAG GAG CAG CTG GTG AAG AAC ACA TAT GTC CTG TGA 760 Asp Lys Glu Gln Leu Val Lys Asn Thr Tyr Val Leu * 245 250

【００５５】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状： 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 他の情報 ＮはＴ又はＧを示し、ＭはＡ又はＣを示し、ＹはＴ又は
Ｃを示し、ＲはＡ又はＧを示す。 配列 AAGGTNGTNG GNMGNTGYMG 20

【００５６】配列番号：６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状： 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 他の情報 ＮはＴ又はＧを示し、ＹはＴ又はＣを示し、ＲはＡ又は
Ｇを示す。 配列 CNCCGTANAC GAANARYTGR C 21

【００５７】

【図面の簡単な説明】

【図１】本願蛋白質のＨＧＦ活性化因子のプロテアーゼ
活性を阻害する活性を測定した結果を表す図である。

【図２】プラスミドｐＭＥ１８Ｓ−ＨＡＩ−ＩＩの構造
を表す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有する蛋白質。 （１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
   分子量が約３０，０００ダルトンであり、（２）肝細胞
   増殖因子活性化因子のプロテアーゼ活性を阻害する活性
   を有し、（３）配列表の配列番号１〜３のいずれかに記
   載のアミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸
   配列を有する。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１〜３に記載のアミノ
   酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列を有
   し、肝細胞増殖因子活性化因子のプロテアーゼ活性を阻
   害する活性を有する蛋白質。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配
   列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋
   白質。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配
   列において２８番目のアラニンから２５２番目のロイシ
   ンまでの配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列
   を有する蛋白質。
5. 【請求項５】 請求項１記載の蛋白質をコードするＤＮ
   Ａ。
6. 【請求項６】 請求項２記載の蛋白質をコードするＤＮ
   Ａ。
7. 【請求項７】 請求項３記載の蛋白質をコードするＤＮ
   Ａ。
8. 【請求項８】 配列表の配列番号４に記載の塩基配列ま
   たはこれと実質的に同一の塩基配列で表わされることを
   特徴とする請求項７記載のＤＮＡ。
9. 【請求項９】 請求項４記載の蛋白質をコードするＤＮ
   Ａ。
10. 【請求項１０】 配列表の配列番号４に記載の塩基配列
    において８２番目のグアニンから７５９番目のアデニン
    までの塩基配列またはこれと実質的に同一の塩基配列で
    表わされることを特徴とする請求項１０記載のＤＮＡ。
11. 【請求項１１】 請求項１記載の蛋白質をコードする遺
    伝子。
12. 【請求項１２】 請求項２記載の蛋白質をコードする遺
    伝子。
13. 【請求項１３】 請求項３記載の蛋白質をコードする遺
    伝子。
14. 【請求項１４】 配列表の配列番号４に記載の塩基配列
    またはこれと実質的に同一の塩基配列で表わされること
    を特徴とする請求項１５記載の遺伝子。
15. 【請求項１５】 請求項４記載の蛋白質をコードする遺
    伝子。
16. 【請求項１６】 配列表の配列番号４に記載の塩基配列
    において８２番目のグアニンから７５９番目のアデニン
    までの塩基配列またはこれと実質的に同一の塩基配列で
    表わされることを特徴とする請求項１７記載の遺伝子。
17. 【請求項１７】 請求項５から１６のいずれかに記載の
    ＤＮＡまたは遺伝子を含有してなる発現ベクター。
18. 【請求項１８】 請求項１７記載の発現ベクターで宿主
    細胞を形質転換することにより得られる形質転換体。
19. 【請求項１９】 宿主細胞が動物細胞であることを特徴
    とする請求項１８記載の形質転換体。
20. 【請求項２０】 請求項１８または１９に記載の形質転
    換体を培養して肝細胞増殖因子活性化因子のプロテアー
    ゼ活性を阻害する活性を有する蛋白質を産生することを
    特徴とする肝細胞増殖因子活性化因子のプロテアーゼ活
    性を阻害する活性を有する蛋白質の産生方法。
21. 【請求項２１】 蛋白質が請求項１から４のいずれかに
    記載の蛋白質であることを特徴とする請求項２０記載の
    蛋白質の産生方法。