JPH0989895A - Reagent and method for measuring transferrin-transferrin receptor complex - Google Patents
Reagent and method for measuring transferrin-transferrin receptor complexInfo
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト体液中のトランス
フェリンレセプター(以下TfRと省略する)濃度に基
づいて各種疾病の診断に利用するための測定試薬と、こ
の試薬によるTfRの測定方法に関する。TfRは各種
細胞の表層に存在し、鉄輸送蛋白トランスフェリン(以
下Tfと省略する)と結合する役割を担っている。Tf
RとTfの親和性は約10-9と抗原抗体反応に匹敵する
ほど強く、そのうえ一般には血中のTfがTfRの10
3倍も多量に存在することから、血中においてはほとん
どのTfRがTfと結合した型で存在する。血中TfR
濃度は、癌や造血機能等の指標として有用であることが
知られている。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a measuring reagent for use in diagnosing various diseases based on the concentration of transferrin receptor (hereinafter abbreviated as TfR) in human body fluid, and a method for measuring TfR using this reagent. TfR exists on the surface layer of various cells and plays a role in binding to the iron transport protein transferrin (hereinafter abbreviated as Tf). Tf
The affinity between R and Tf is about 10 -9 , which is strong enough to be comparable to the antigen-antibody reaction.
Since it is present in an amount as much as 3- fold, most TfR exists in the form bound to Tf in blood. Blood TfR
It is known that the concentration is useful as an index of cancer, hematopoietic function and the like.
【0002】[0002]
【従来の技術】体液中のTfRを測定する方法として
は、癌診断を目的として標識免疫測定法を応用した報告
(特開昭62−6169)があった。この報告で採用さ
れている酵素免疫測定法(以下EIAと省略する)に代
表される標識物質を利用した免疫測定法は、一般的には
感度を上げる場合に用いられる方法である。標識物質と
してしばしば用いられる物としては、125Iのような放
射性同位元素や、ペルオキシダーゼ(以下PODと省略
する)、βガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ
等の酵素が挙げられる。放射性同位元素を標識物質とし
て用いる免疫測定法をRIA法、酵素を標識物質として
用いる免疫測定法をEIA法と呼んでいる。RIA法
は、標識物質として放射性同位元素を用いるために特別
な施設や装置を求められるので簡易であるとは言い難
い。またEIA法は、免疫反応の他に標識物質である酵
素を特定の基質に反応させる酵素反応のステップがある
ため、反応様式や試薬構成が複雑となる。またいずれの
方法においても、不均一系の反応原理を採用する限りは
結合相と遊離相との分離(B/F分離)が要求され、自
動化や迅速化の障害となりやすい。2. Description of the Related Art As a method for measuring TfR in body fluid, there has been a report (Japanese Patent Laid-Open No. 62-6169) in which a labeled immunoassay method is applied for the purpose of diagnosing cancer. An immunoassay using a labeling substance, which is represented by the enzyme immunoassay (hereinafter abbreviated as EIA) adopted in this report, is a method generally used for increasing the sensitivity. Examples of substances often used as labeling substances include radioisotopes such as 125 I, enzymes such as peroxidase (hereinafter abbreviated as POD), β-galactosidase, and alkaline phosphatase. An immunoassay using a radioisotope as a labeling substance is called an RIA method, and an immunoassay using an enzyme as a labeling substance is called an EIA method. The RIA method cannot be said to be simple because a special facility or device is required because a radioisotope is used as a labeling substance. In addition, the EIA method has a step of an enzymatic reaction in which an enzyme that is a labeling substance is reacted with a specific substrate in addition to the immunoreaction, so that the reaction mode and the reagent composition are complicated. Further, in any of the methods, as long as the heterogeneous reaction principle is adopted, the separation of the bound phase and the free phase (B / F separation) is required, which tends to be an obstacle to automation and speedup.
【0003】更にRIA法、EIA法ともに測定の感度
を上げる方向で発達してきた経緯があるため、検体であ
る体液中に測定対象である物質が測定可能範囲の上限を
越えて多量に存在する場合には検体を希釈するステップ
が必要となる。TfRは血中に比較的高い濃度で存在す
るので、EIA法のような標識法による測定技術ではし
ばしば検体の希釈を要求される。Further, since both the RIA method and the EIA method have been developed in the direction of increasing the sensitivity of measurement, when the substance to be measured is present in a large amount in the body fluid as the sample, exceeding the upper limit of the measurable range. Requires a step of diluting the sample. Since TfR is present in blood at a relatively high concentration, a measurement technique using a labeling method such as the EIA method often requires dilution of the sample.
【0004】ところでTfRは先に紹介した癌の診断マ
ーカーとしての用途の他に造血機能のマーカーとなるこ
とも指摘されている(Clin.Chem.41/7,1053-1064;199
5)。造血機能のマーカーとしてTfRを測定するときに
は、癌マーカーとして測定する場合に比べてより高い水
準のTfR値を測定することが多くなる。そのためこれ
までに知られているような高い感度を追求した測定系で
はしばしば測定範囲を越える試料が出現することにな
り、希釈操作が要求される。つまりこれまでに報告され
ているTfRの測定技術の測定濃度域は、実際に要求さ
れる濃度域をカバーできていないのである。したがって
造血機能障害を疑う患者の機能検査に用いることのでき
る簡便なTfR測定技術の提供が望まれている。また標
識法による測定技術においては、高い感度を得やすいよ
うに反応時間を長く取る場合が少なくない。このような
背景から、より簡便な操作で迅速な測定を実現するTf
R測定技術の提供が待たれている。By the way, it has been pointed out that TfR serves as a marker of hematopoietic function in addition to the use as a diagnostic marker for cancer introduced above (Clin. Chem. 41/7, 1053-1064; 199).
Five). When measuring TfR as a marker for hematopoietic function, a higher level of TfR value is often measured than when measuring as a cancer marker. Therefore, in a measurement system which has hitherto been known to pursue high sensitivity, a sample often exceeds the measurement range, and a dilution operation is required. In other words, the measured concentration range of the TfR measurement techniques reported so far does not cover the actually required concentration range. Therefore, it is desired to provide a simple TfR measurement technique that can be used for functional tests of patients suspected of hematopoietic dysfunction. In addition, in the measurement technique by the labeling method, it is not uncommon for the reaction time to be long so that high sensitivity can be easily obtained. Against this background, Tf realizes quick measurement with simpler operation.
Providing R measurement technology is awaited.
【0005】更に従来のTfR測定技術は、標準物質に
ついての問題も持っていた。つまり、TfRの精製物を
入手することはできるものの遊離した状態では安定性に
問題が有った。具体的には、精製TfRを放置しておく
と不溶性のアグリゲートもしくはオリゴマーの形成が観
察されるのである。精製TfRがアグリゲートを形成し
ていることはG3000によるゲルろ過のパターンで確
認できる。またアグリゲートを解離させるために界面活
性剤処理すると、反応性が約2倍に上がるケースが有る
ことも確認した。このような不安定な標準物質に基づい
て得られた測定値の信頼性には限界が有る。加えて精製
TfRと血中に存在するTf−TfRコンプレックスと
では同じ抗体に対する反応性に差の出ることがある。発
明者らの知見によれば、血清から精製したTf−TfR
コンプレックスは精製TfRに比べて4倍も高い反応性
を示した。たとえば今までの報告ではTfRとして正常
値が約5000ng/ml、また測定範囲として1000〜
50000ng/mlとある。しかしこれは用いた標準が組
織由来の精製TfRであるためその値の信頼性は低いと
言える。したがってTfRの測定技術を一般に普及させ
るには、測定のための標準物質を安定な状態で流通させ
るための配慮が求められる。そのうえ先に述べたように
高い濃度域の測定を行うには、目的とする濃度域に応じ
た高濃度の標準が求められる。しかし従来はこのような
条件を満足する標準物質は提供されていなかった。Further, the conventional TfR measuring technique also has a problem with reference materials. That is, although a purified product of TfR can be obtained, there was a problem in stability in the free state. Specifically, when the purified TfR is allowed to stand, formation of insoluble aggregates or oligomers is observed. The fact that purified TfR forms an aggregate can be confirmed by the gel filtration pattern by G3000. In addition, it was also confirmed that when a surfactant treatment was performed to dissociate the aggregate, the reactivity increased about twice in some cases. There is a limit to the reliability of the measurement values obtained based on such an unstable standard substance. In addition, the purified TfR and the Tf-TfR complex existing in blood may differ in reactivity with the same antibody. According to the findings of the inventors, Tf-TfR purified from serum
The complex was four times more reactive than purified TfR. For example, in the previous reports, the normal value for TfR was about 5000 ng / ml, and the measurement range was 1000-
It is 50,000 ng / ml. However, since the standard used was purified TfR derived from tissue, it can be said that the reliability of the value is low. Therefore, in order to popularize the TfR measurement technique to the general public, consideration must be given to the stable distribution of the reference substance for measurement. In addition, as described above, in order to measure in the high concentration range, a high concentration standard corresponding to the target concentration range is required. However, hitherto, no standard substance satisfying such conditions has been provided.
【0006】[0006]
【発明が解決しようとする課題】本発明者は鉄と造血機
能との関連から、鉄輸送蛋白Tfの受容体である体液中
のTfR濃度を測定することの意義が大きいと考えた。
そしてそのためには、より簡易に測定でき、しかも自動
化しやすい測定系と、より適切な測定濃度域を持つ試薬
が必要である。すなわち本発明は、従来のTfR測定技
術では試料の希釈を要求されるような高濃度域であって
も、低濃度域と同じ条件で測定可能な広い測定レンジを
実現する新しいTfRの測定技術の提供を課題とするも
のである。更には、この新しい測定技術をサポートす
る、安定性と信頼性に優れる新規な標準物質を提供する
ことを課題としている。The present inventor considered that it is significant to measure the concentration of TfR in the body fluid, which is a receptor for the iron transport protein Tf, in view of the relation between iron and hematopoietic function.
For that purpose, a measurement system that can be more easily measured and easily automated, and a reagent having a more appropriate measurement concentration range are required. That is, the present invention provides a new TfR measurement technique that realizes a wide measurement range that can be measured under the same conditions as a low concentration range even in a high concentration range where the conventional TfR measurement technique requires dilution of a sample. The challenge is to provide. Furthermore, it is an object to provide a new standard substance which is excellent in stability and reliability and which supports this new measurement technique.
【0007】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明の課題は、TfR
親和性物質を固定した不溶性粒子、またはTfR親和性
物質とTf親和性物質とを個別にまたは混合して固定し
た不溶性粒子で構成されるTf−TfRコンプレックス
測定試薬、ならびにこの試薬を用いた測定方法によって
解決される。The object of the present invention is to provide a TfR
Tf-TfR complex measuring reagent composed of insoluble particles on which an affinity substance is immobilized, or insoluble particles on which a TfR affinity substance and a Tf affinity substance are individually or mixed and immobilized, and a measurement method using this reagent Will be solved by.
【0008】本発明におけるTfR親和性物質の代表的
なものは、抗TfR抗体や抗Tf−TfRコンプレック
ス抗体などの抗体である。またTf−TfRコンプレッ
クスを測定対象としているので、抗Tf抗体も親和性物
質として挙げることができる。Tfを介してTfRと特
異的に結合すると考えられるためである。親和性物質と
して抗体を用いる場合は、充分抗体価の高い抗体を選び
さえすれば検体となる生体体液中に親和性の点で競合す
るものがなく有利である。抗体としては通常の方法によ
りマウス、ラット、家兎、山羊などを免疫して得たポリ
クローナル抗体を利用できる。もちろん、モノクローナ
ル抗体も使用できることは言うまでもない。TfRに対
する抗体は、これまでにいくつか報告されている。これ
ら公知の抗体は、ポリクローナル抗体であれ、モノクロ
ーナル抗体であれ、不溶性粒子に感作した状態でTfR
と反応して凝集しうる親和性と特異性を備えているもの
であれば本発明に利用することができる。Representative examples of the TfR affinity substance in the present invention are antibodies such as anti-TfR antibody and anti-Tf-TfR complex antibody. In addition, since the Tf-TfR complex is the measurement target, anti-Tf antibody can also be used as an affinity substance. This is because it is considered that it specifically binds to TfR via Tf. When an antibody is used as the affinity substance, as long as an antibody having a sufficiently high antibody titer is selected, there is no competition in the biological body fluid as a sample in terms of affinity, which is advantageous. As an antibody, a polyclonal antibody obtained by immunizing a mouse, a rat, a rabbit, a goat or the like by a usual method can be used. Of course, it goes without saying that monoclonal antibodies can also be used. Several antibodies against TfR have been reported so far. These known antibodies, whether they are polyclonal antibodies or monoclonal antibodies, are TfR-sensitized to insoluble particles.
Any substance having an affinity and a specificity capable of reacting with and agglutinating can be used in the present invention.
【0009】中でもポリクローナル抗体は、次のような
背景から好ましい抗体として示すことができる。まず凝
集反応の反応原理から考えると、粒子に固定する親和性
物質と被検物質との結合部位の数が多いほうが一般的に
有利である。つまり結合部位が制限されるモノクローナ
ル抗体よりも多数の結合部位を認識するポリクローナル
抗体の方が有利となる。更にTfとコンプレックスを形
成したTfRを測定するために、TfR上のTf結合部
位はTfにカバーされてしまっている。このようなコン
プレックスでは、Tf結合部位を認識する抗体はもはや
結合することができない。これらの理由からポリクロー
ナル抗体が好ましい抗体として挙げられるのである。Among them, the polyclonal antibody can be shown as a preferable antibody from the following background. First, considering the reaction principle of the agglutination reaction, it is generally advantageous that the number of binding sites of the affinity substance fixed to the particles and the test substance is large. That is, a polyclonal antibody that recognizes a large number of binding sites is more advantageous than a monoclonal antibody that has a limited binding site. Further, in order to measure TfR that forms a complex with Tf, the Tf binding site on TfR is covered by Tf. In such a complex, the antibody recognizing the Tf binding site can no longer bind. For these reasons, polyclonal antibodies are mentioned as preferred antibodies.
【0010】より高い特異性を期待するとき、あるいは
免疫原としてのTfRやTfの消費量を少なくしたいと
きには、抗体としてモノクローナル抗体を利用しても良
い。ただしモノクローナル抗体を利用するときには先に
述べたような事情を考慮して、より有利な結合親和性を
持つクローンを選択するべきである。たとえば、TfR
のTf結合部位を認識するような抗体は、Tfによって
結合部位をブロックされてしまうので選択すべきではな
い。したがってモノクローナル抗体の結合部位として、
TfRのTf結合部位以外に存在する抗原決定基、Tf
−TfRコンプレックスに特異的に存在する抗原決定
基、Tfに特異的な抗原決定基等を利用するのが好まし
い。特にTfRのTf結合部位以外に存在する抗原決定
基とTfに特異的な抗原決定基とを認識するモノクロー
ナル抗体の組合せは、血液中でコンプレックスを形成し
ているTfRを確実に測定することができる好ましい組
合せである。これらのモノクローナル抗体を固定した不
溶性粒子を混合するか、あるいはモノクローナル抗体の
混合物を不溶性粒子に固定することにより本発明による
試薬を得ることができる。抗Tfモノクローナル抗体で
構成した本発明による試薬は、遊離のTfにも結合する
ものの架橋構造を構成できないので凝集反応にはつなが
らない。つまりTf−TfRコンプレックスが存在する
時にだけ特異的に凝集を起こす高い精度を備えた試薬と
なることから、モノクローナル抗体の採用が有利となる
態様として示すことができる。またモノクローナル抗体
をポリクローナル抗体に組み合せて用いることも可能で
ある。When higher specificity is expected, or when it is desired to reduce the consumption of TfR or Tf as an immunogen, a monoclonal antibody may be used as the antibody. However, when using a monoclonal antibody, the clone having a more favorable binding affinity should be selected in consideration of the above-mentioned circumstances. For example, TfR
Antibodies that recognize the Tf binding site of E. coli should not be selected because the binding site is blocked by Tf. Therefore, as a binding site for monoclonal antibodies,
An antigenic determinant present in the TfR other than the Tf binding site, Tf
It is preferable to use an antigenic determinant specifically present in the -TfR complex, an antigenic determinant specific to Tf, and the like. In particular, a combination of a monoclonal antibody that recognizes an antigenic determinant present at a site other than the Tf binding site of TfR and an antigenic determinant specific to Tf can reliably measure TfR forming a complex in blood. A preferred combination. The reagent according to the present invention can be obtained by mixing insoluble particles on which these monoclonal antibodies are immobilized or by immobilizing a mixture of monoclonal antibodies on the insoluble particles. The reagent according to the present invention composed of an anti-Tf monoclonal antibody does not lead to an agglutination reaction because it binds to free Tf but cannot form a crosslinked structure. That is, since it becomes a reagent with high accuracy that causes specific agglutination only when the Tf-TfR complex is present, it can be shown as an aspect in which adoption of a monoclonal antibody is advantageous. It is also possible to use a monoclonal antibody in combination with a polyclonal antibody.
【0011】Tfに対するモノクローナル抗体を利用す
る場合、Tf−TfRに比較して血中に多量に存在する
遊離のTfがこのモノクローナル抗体に競合するので十
分な粒子凝集を期待できない場合が予想される。このよ
うな場合には、粒子に固定したものと同じTfに対する
モノクローナル抗体を粒子に固定しない状態で加え、そ
の共存下で反応させると良い。When a monoclonal antibody against Tf is used, it is expected that a sufficient amount of particle aggregation cannot be expected because free Tf, which is present in a large amount in blood as compared with Tf-TfR, competes with this monoclonal antibody. In such a case, it is advisable to add the same monoclonal antibody against Tf as that immobilized on the particles without immobilizing it on the particles, and react in the coexistence thereof.
【0012】本発明に用いる抗体は、Fc部位を取り除
くことによって補体やリウマチ因子等による非特異反応
の影響を受けにくくすることができる。Fc部位を除去
する方法は、各種蛋白分解酵素を作用させる方法が公知
である。The antibody used in the present invention can be made less susceptible to the effects of non-specific reactions such as complement and rheumatoid factor by removing the Fc portion. As a method of removing the Fc portion, a method of acting various proteolytic enzymes is known.
【0013】抗体以外の親和性物質としてはTfRに対
するα−1アンチトリプシンなどが想定できる。これら
の親和性物質には、各々生体体液中に親和性の点でTf
Rと競合する物質が存在するので、できるだけTfRへ
の親和性の方が大きくなる条件のもとで反応させるのが
好ましい。あるいは競合物質との結合サイトをブロック
する方法も有効である。たとえばα−1アンチトリプシ
ンを利用する時には、トリプシンを結合した粒子を用意
しこれにトリプシンを介してα−1アンチトリプシンを
間接的に結合させると良い。この方法によって、α−1
アンチトリプシンのトリプシン結合サイトはブロックさ
れ、TfRとの結合活性が粒子上に存在する形となる。As an affinity substance other than the antibody, α-1 antitrypsin for TfR can be envisioned. Each of these affinity substances has Tf in terms of affinity in biological fluid.
Since there is a substance that competes with R, it is preferable to carry out the reaction under the condition that the affinity for TfR is as large as possible. Alternatively, a method of blocking the binding site with a competitor is also effective. For example, when α-1 antitrypsin is used, it is advisable to prepare particles bound with trypsin and indirectly bind α-1 antitrypsin via trypsin thereto. By this method, α-1
The trypsin binding site of antitrypsin is blocked, and the binding activity with TfR is present on the particle.
【0014】本発明に利用する不溶性粒子としては、動
物の赤血球、金属ゾル、ラテックス、ゼラチン、あるい
は顔料のような免疫学の分野で常用されているものが考
えられるが、これらに限られるものではない。中でもポ
リスチレン等の合成樹脂製ラテックス粒子は既に広く利
用されているので入手し易く安価であり、動物赤血球よ
りは質的に均一な点で有利である。ポリスチレンラテッ
クスとしては平均粒径0.02−1.0μm、好ましく
は0.04−0.6μmのものを示すことができる。The insoluble particles used in the present invention may be those commonly used in the field of immunology such as animal red blood cells, metal sols, latex, gelatin, and pigments, but are not limited to these. Absent. Among them, since latex particles made of synthetic resin such as polystyrene are already widely used, they are easily available and inexpensive, and are advantageous over animal red blood cells in that they are qualitatively uniform. The polystyrene latex may have an average particle size of 0.02-1.0 μm, preferably 0.04-0.6 μm.
【0015】本発明の親和性粒子を分散させる分散溶液
は、免疫反応に必要なpHを提供する緩衝液に分散剤、
界面活性剤、非特異反応を防ぐ物質、少量の防腐剤等を
添加して用いる。これらの添加物質や濃度の選択は固定
する親和性物質およびその量、不溶性粒子の種類などに
応じて適宜に調整する。たとえばゼラチンやウシ血清ア
ルブミンのような不活性蛋白質は、凝集反応の安定化や
非特異反応の防止に有効である。具体的には親和性物質
として抗体を固定したポリスチレンラテックスを分散さ
せるとき、リン酸緩衝液(以下PBSと省略する)やH
EPESのような中性域を与える緩衝液に、BSAや正
常動物血清等を加える。The dispersion solution in which the affinity particles of the present invention are dispersed is a dispersant in a buffer solution that provides a pH necessary for an immune reaction,
A surfactant, a substance that prevents nonspecific reaction, a small amount of a preservative, etc. are added and used. The selection of these added substances and concentrations is appropriately adjusted according to the affinity substance to be immobilized and its amount, the type of insoluble particles, and the like. For example, inactive proteins such as gelatin and bovine serum albumin are effective in stabilizing the agglutination reaction and preventing nonspecific reaction. Specifically, when dispersing polystyrene latex with an antibody immobilized as an affinity substance, a phosphate buffer (hereinafter abbreviated as PBS) or H
BSA, normal animal serum, etc. are added to a buffer solution such as EPES that gives a neutral range.
【0016】本発明は、前記Tf−TfRコンプレック
ス測定試薬によってTf−TfRコンプレックスを測定
する方法をも提供する。本発明の試薬とTf−TfRコ
ンプレックスとの反応は、凝集程度を観察することで追
跡可能である。凝集反応を観察する方法としては、肉眼
による方法および光学的装置により散乱光または透過光
の量の変化として計測する方法がある。一般的に、肉眼
で観察する方法は、検体を数段階の濃度に希釈しその各
々を観察することによってしか定量的な測定ができな
い。光学的方法においては適切な検量曲線を予めまたは
測定時に作成することにより検体の濃度を数段階取るこ
となく定量的測定ができるので、本発明の具現例として
はより好ましいものである。The present invention also provides a method for measuring the Tf-TfR complex using the Tf-TfR complex measuring reagent. The reaction between the reagent of the present invention and the Tf-TfR complex can be traced by observing the degree of aggregation. As a method of observing the agglutination reaction, there are a method with the naked eye and a method of measuring the change in the amount of scattered light or transmitted light with an optical device. In general, the method of observing with the naked eye can perform quantitative measurement only by diluting a sample to several concentrations and observing each of them. In the optical method, a suitable calibration curve is prepared in advance or at the time of measurement, so that quantitative measurement can be performed without taking the concentration of the sample in several steps, which is more preferable as an embodiment of the present invention.
【0017】このときに血液材料に由来するTf−Tf
Rコンプレックスを標準物質として用いると良い。細胞
から血中に遊離したTfRは組織から抽出したTfRと
は構造が違うことから、精製TfRを標準とする方法で
は反応性の違いのために正確な結果を期待できない可能
性が有る。実際、血中に遊離したTfRは組織に存在す
る完全なTfRに比べてN末端側の100残基のアミノ
酸が欠損している。また血中TfRの大部分がTfとコ
ンプレックスとなっていることから考えて、血中TfR
の値を得るにはTf−TfRコンプレックスとして測定
すべきである。なお血中のTfとコンプレックスを形成
していない遊離のTfRを測定するのであれば、フリー
のTfRを標準として用いる。At this time, Tf-Tf derived from the blood material
It is preferable to use R complex as a standard substance. Since TfR released into blood from cells has a different structure from TfR extracted from tissue, accurate results may not be expected due to differences in reactivity in a method using purified TfR as a standard. In fact, the TfR released into blood lacks 100 amino acid residues on the N-terminal side of the complete TfR existing in tissues. Considering that most of blood TfR is complexed with Tf, blood TfR
Should be measured as the Tf-TfR complex to obtain the value of When measuring free TfR that does not form a complex with Tf in blood, free TfR is used as a standard.
【0018】本発明のTfR測定試薬は従来に無い広い
濃度範囲の測定を実現する。この特徴によって、本発明
は大部分の血清試料を希釈操作無しで測定するTf−T
fRコンプレックス測定方法を提供する。なおここで言
う希釈操作を必要としない測定とは、低濃度試料と高濃
度試料とを同一の反応条件で測定可能であることを意味
する。つまり、測定可能な濃度範囲が狭い従来の測定方
法においては、高濃度試料の測定にあたっては低濃度試
料とは違う希釈条件が必要であった。一方本発明では、
たとえ高濃度試料であっても低濃度試料と同じ条件で測
定が可能となる。The TfR measuring reagent of the present invention realizes measurement in a wide concentration range which has never been obtained. Due to this feature, the present invention allows Tf-T to measure most serum samples without dilution.
An fR complex measurement method is provided. It should be noted that the measurement not requiring a dilution operation here means that a low-concentration sample and a high-concentration sample can be measured under the same reaction conditions. That is, in the conventional measuring method in which the measurable concentration range is narrow, the measurement of a high-concentration sample requires a dilution condition different from that of the low-concentration sample. On the other hand, in the present invention,
Even high-concentration samples can be measured under the same conditions as low-concentration samples.
【0019】本発明によって得られたTf−TfRコン
プレックスの測定値は、TfR値に換算することも可能
である。TfRとTfとは1:1で結合するので両者の
モル比は1:1となる。血中のTfRの大部分がTfと
結合した状態で存在していることから、Tf−TfRコ
ンプレックスの測定値に占めるTfRの蛋白量の比をか
ければTfR値となる。この値は実施例で示すように4
7%であり、本発明による測定値に対して47%をかけれ
ばTfR値に換算できるということである。The measured value of the Tf-TfR complex obtained by the present invention can be converted into a TfR value. Since TfR and Tf are bound at a ratio of 1: 1, the molar ratio of both is 1: 1. Since most of TfR in blood exists in a state of being bound to Tf, the TfR value is obtained by multiplying the ratio of the amount of TfR protein in the measured value of the Tf-TfR complex. This value is 4 as shown in the embodiment.
It is 7%, which means that the TfR value can be converted by adding 47% to the measured value according to the present invention.
【0020】本発明は、TfR親和性物質を固定した不
溶性粒子で構成されるTf−TfRコンプレックス測定
試薬によるTf−TfRコンプレックスの測定に有用な
標準物質をも提案する。本発明が提供する標準物質と
は、Tf−TfRコンプレックスを含むTf−TfRコ
ンプレックス測定用標準物質である。Tf−TfRコン
プレックスは、TfR高値の血清を原料として精製する
ことができる。血中のTf−TfRコンプレックスを測
定するのであれば、試薬との反応性を共通とするために
も標準物質も血中から精製したものを用いるのが有利で
ある。血清からTf−TfRコンプレックスを精製する
には、血清の硫安分画、陰イオン交換クロマトグラフィ
ー、免疫吸着クロマトグラフィー等の精製ステップによ
り容易に行うことができる。こうして精製したTf−T
fRコンプレックスは、適当な緩衝液に希釈するか、あ
るいはTfRフリーとした血清に添加して濃度を検定し
標準物質とすることができる。本発明の標準物質は、造
血機能の診断をも可能とする広い濃度域にわたって標準
物質として利用できるよう14000〜70000ng/m
l程度の高い濃度を備えたものが有用である。The present invention also proposes a standard substance useful for the measurement of the Tf-TfR complex with a Tf-TfR complex measuring reagent composed of insoluble particles on which a TfR affinity substance is immobilized. The standard substance provided by the present invention is a standard substance for Tf-TfR complex measurement containing a Tf-TfR complex. The Tf-TfR complex can be purified using TfR high serum as a raw material. If the Tf-TfR complex in blood is to be measured, it is advantageous to use a standard substance purified from blood in order to have the same reactivity with a reagent. Purification of the Tf-TfR complex from serum can be easily carried out by purification steps such as ammonium sulfate fractionation, anion exchange chromatography and immunoadsorption chromatography of serum. Tf-T thus purified
The fR complex can be used as a standard substance by diluting it in an appropriate buffer or by adding it to TfR-free serum and assaying its concentration. The standard substance of the present invention is 14,000 to 70000 ng / m so that it can be used as a standard substance over a wide concentration range that enables diagnosis of hematopoietic function.
Those with concentrations as high as l are useful.
【0021】[0021]
【作用】本発明におけるTfR親和性物質を固定した不
溶性粒子は、Tf−TfRコンプレックスと結合してそ
の分析を可能とする。本発明は、従来TfRの測定に利
用されていた高感度を実現するための測定技術に換え
て、より簡便な操作で実施可能な粒子凝集反応を応用し
た点において新規である。粒子凝集反応の応用によっ
て、試料を希釈することなく低濃度域の測定と同じ条件
のもとで、高い濃度までを十分な精度で測定することが
可能となる。更に均一系反応である粒子凝集反応では、
標識による測定で要求されるB/F分離が不要となり自
動化が容易である。更に迅速化にも貢献するものであ
る。The insoluble particles to which the TfR affinity substance of the present invention is immobilized binds to the Tf-TfR complex and enables its analysis. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is novel in that a particle agglutination reaction, which can be carried out by a simpler operation, is applied instead of the measuring technique for realizing high sensitivity that has been conventionally used for measuring TfR. By applying the particle agglutination reaction, it is possible to measure up to a high concentration with sufficient accuracy under the same conditions as the measurement in the low concentration range without diluting the sample. In the particle aggregation reaction, which is a more homogeneous reaction,
The B / F separation required for the measurement by the label is not necessary and the automation is easy. It also contributes to speeding up.
【0022】他方本発明の標準物質は、TfRをTf−
TfRコンプレックスとしてとらえ、これを測定対象と
しうる広い濃度域をカバーする測定技術をサポートする
ものである。従来用いられていたTfRを基礎とする標
準では血中に存在するTf−TfRコンプレックスとは
異なる物質を標準としていたことになる。本発明の標準
物質は、従来の標準ではカバーすることが困難な高い濃
度域までを保証すると同時に、精製TfRの安定性の問
題を解決するものである。本発明によるTf−TfRコ
ンプレックス測定技術によれば広い濃度範囲のTfRを
測定することが可能である。そのため従来のような濃度
既知の血清を適当に希釈して標準とする方法では、測定
可能範囲の上限まで完全に測定値を保証することができ
ない。TfR含有血清の他、精製TfRを希釈して標準
とする方法も考えられる。しかし本発明者らの知見によ
れば、公知の方法でたとえば胎盤等から精製したTfR
の測定値は血清のTfR測定値と必ずしも一致しないの
である。この理由の一つには先に述べたような構造的な
違いも挙げられる。つまり、公知の精製TfRでは信頼
できる標準物質とすることができないのである。このよ
うな背景から、本発明によって新たに提案された測定技
術をサポートする新規な標準物質が必要となるのであ
る。On the other hand, in the standard substance of the present invention, TfR is changed to Tf-
The TfR complex is regarded as a TfR complex, and it supports a measurement technique that covers a wide concentration range that can be measured. The TfR-based standard that has been used conventionally uses a substance different from the Tf-TfR complex existing in blood as the standard. The standard substance of the present invention guarantees a high concentration range which is difficult to be covered by the conventional standard, and at the same time solves the problem of stability of purified TfR. According to the Tf-TfR complex measurement technique of the present invention, it is possible to measure TfR in a wide concentration range. Therefore, it is impossible to completely guarantee the measured value up to the upper limit of the measurable range by the conventional method of appropriately diluting serum of known concentration and using it as a standard. In addition to TfR-containing serum, a method in which purified TfR is diluted and used as a standard is also conceivable. However, according to the findings of the present inventors, TfR purified from a placenta by a known method, for example.
The measured value of 1 does not always match the measured value of TfR of serum. One of the reasons for this is the structural difference described above. That is, the known purified TfR cannot be used as a reliable standard substance. From such a background, a new standard substance that supports the measurement technique newly proposed by the present invention is required.
【0023】[0023]
【発明の効果】本発明は、操作性に優れた粒子凝集反応
によるTf−TfRコンプレックスの測定を可能とす
る。本発明によってTfRの測定範囲が拡大し、試料を
希釈すること無く広い濃度範囲を測定することができ
る。測定範囲の拡大は、特に造血機能の診断マーカーと
してTf−TfRコンプレックスを測定する場合に有効
である。更に本発明によれば、標識技術を利用した高感
度測定法に比べて容易に迅速化、自動化を実現すること
ができる。また本発明は、新たに提案された測定技術の
広い濃度範囲をカバーする新規な標準物質をも提供す
る。以下に本発明の実施例を示す。INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention enables the measurement of the Tf-TfR complex by the particle aggregation reaction which is excellent in operability. According to the present invention, the measurement range of TfR is expanded, and a wide concentration range can be measured without diluting the sample. Expanding the measurement range is particularly effective when measuring the Tf-TfR complex as a diagnostic marker for hematopoietic function. Furthermore, according to the present invention, speeding up and automation can be easily realized as compared with a high-sensitivity measurement method using a labeling technique. The present invention also provides new standards that cover the broad concentration range of the newly proposed assay technique. Examples of the present invention will be shown below.
【0024】また本発明の標準物質は、Tf−TfR測
定値の信頼性を高める。まず従来の測定技術ではカバー
できなかった高濃度域の標準を提供しうる点で信頼性の
向上をもたらず。更に、Tf−TfRコンプレックスと
して提供したことによって保存中の安定性を改善し、結
果として信頼性の向上に貢献する。The standards of the invention also increase the reliability of Tf-TfR measurements. First, it does not improve reliability in that it can provide a standard for high concentration range that cannot be covered by conventional measurement techniques. Furthermore, by providing as a Tf-TfR complex, stability during storage is improved, and as a result, reliability is improved.
【0025】[0025]
1.試薬の調製 抗TfR抗体の作成:公知の方法(J.Biol.Chem.,263,83
18-8325,1988)で胎盤から精製したヒトTfRをフロイ
ントのコンプリート・アジュバントと等量混合し、充分
乳化した後、家兎フットパットに初回の免疫を行い、4
週毎に背部皮内に2回の追加免疫を行った。精製ヒトT
fRとのオクテロニー法により抗体価の上昇を確認し
て、最終免疫後2週目に採血を行い抗血清を分離した。
抗血清をDEAE−セルロース・イオン交換クロマトグ
ラフィーで精製し、そのIgG分画をもって抗TfR抗
体とした。 本発明試薬の調製例:抗TfR抗体をポリスチレンラテ
ックス(平均粒径0.104μm)と混和し37℃1時
間反応させた。3,000×G、15分遠心によりラテ
ックス粒子を分離した後、1%BSAを含むPBS緩衝
液に懸濁して0.5%ラテックス乳液を得、本発明の測定
試薬とした。1. Preparation of Reagents Preparation of Anti-TfR Antibody: Known Method (J. Biol. Chem., 263,83
18-8325, 1988) human TfR purified from placenta was mixed with Freund's complete adjuvant in an equal amount, and after sufficiently emulsified, the rabbit foot pad was immunized for the first time.
Two weekly booster immunizations were given. Purified human T
An increase in antibody titer was confirmed by the Octelony method with fR, and blood was collected 2 weeks after the final immunization to separate antiserum.
The antiserum was purified by DEAE-cellulose ion exchange chromatography, and the IgG fraction was used as an anti-TfR antibody. Preparation Example of Reagent of the Present Invention: An anti-TfR antibody was mixed with polystyrene latex (average particle size 0.104 μm) and reacted at 37 ° C. for 1 hour. The latex particles were separated by centrifugation at 3,000 x G for 15 minutes and then suspended in a PBS buffer containing 1% BSA to obtain a 0.5% latex emulsion, which was used as a measuring reagent of the present invention.
【0026】参考試薬の調製例:上記抗TfR抗体をP
BS緩衝液で10mg/lとし96穴マイクロタイタープレ
ート(ヌンク社製)のウエルに0.1ml宛分注後、37
℃1時間静置し、更にプレートを生理食塩液で洗浄後B
SAによるブロック操作をほどこしてELISA用固相
プレートとした。また抗TfR抗体を過ヨウ素酸架橋法
にてPOD標識し、ELISA用標識抗体とした。Preparation example of reference reagent: The above anti-TfR antibody was added to P
37 mg after dispensing 0.1 ml to the wells of 96-well microtiter plate (Nunc Co., Ltd.) with BS buffer at 10 mg / l.
Let stand for 1 hour at ℃, wash the plate with physiological saline, and then B
The solid phase plate for ELISA was subjected to a block operation with SA. The anti-TfR antibody was POD-labeled by the periodate cross-linking method to give a labeled antibody for ELISA.
【0027】標準物質の調製:血清を45〜70%飽和
硫安で分画後、20mMトリス塩酸(pH8.6)の緩衝
液で透析し、陰イオン交換カラム(Q−セファロース、
ファルマシア社)にアプライした。0.5MのNaCl
を含む20mMのトリス塩酸緩衝液(pH8.6)でリニ
アグラジエントに溶出した。ELISAによってTfR
濃度を追跡してTfRに富む分画をプールし、抗Tf抗
体を固定化したアフィニティーカラムにかけた。カラム
はまず0.1MのNaClを含む50mMのHEPES緩
衝液(pH7.5)、次いで100mMのNaClと1mM
の desferroxamine mesilateを含む50mMのクエン酸緩
衝液(pH4.9)でこのカラムを洗浄してTfから鉄
を遊離させた。再び0.1MのNaClを含む50mMの
HEPES緩衝液(pH7.5)で洗浄後、3MのKC
lを含む50mMのHEPES緩衝液(pH7.5)で鉄
の遊離によってTfとの結合性の低下したTfRを溶出
した。アフィニティーカラムの溶出物は、過剰量の鉄飽
和Tfと反応させて完全にTf−TfRコンプレックス
を形成させ20mMトリス塩酸(pH8.6)の緩衝液で
透析した後、さらにゲルろ過カラム及び陰イオン交換カ
ラム(リソース−Q、ファルマシア社)を用いて、精製
Tf−TfRコンプレックスを得た。この方法によるコ
ンプレックスの収率は約50%であった(2000ng/ml
のTf−TfRコンプレックスを含む血清2Lから約
2.0mgのTf−TfRコンプレックスを回収)。Preparation of standard substance: Serum was fractionated with 45-70% saturated ammonium sulfate, dialyzed against a buffer solution of 20 mM Tris-HCl (pH 8.6), and anion exchange column (Q-Sepharose,
Pharmacia) was applied. 0.5M NaCl
Elution was performed in a linear gradient with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.6) containing TfR by ELISA
Fractions rich in TfR were pooled by tracking the concentration and applied to an affinity column with immobilized anti-Tf antibody. The column was first 50 mM HEPES buffer (pH 7.5) containing 0.1 M NaCl, then 100 mM NaCl and 1 mM.
This column was washed with a 50 mM citrate buffer (pH 4.9) containing desferroxamine mesilate of No. 1 to release iron from Tf. After washing again with 50 mM HEPES buffer (pH 7.5) containing 0.1 M NaCl, 3 M KC
The TfR, which had decreased binding to Tf due to release of iron, was eluted with 50 mM HEPES buffer (pH 7.5) containing 1 ml. The eluate of the affinity column was reacted with an excess amount of iron-saturated Tf to completely form a Tf-TfR complex and dialyzed with a buffer solution of 20 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.6), followed by further gel filtration column and anion exchange. A purified Tf-TfR complex was obtained using a column (Resource-Q, Pharmacia). The yield of complex by this method was about 50% (2000 ng / ml
(About 2.0 mg of Tf-TfR complex was recovered from 2 L of serum containing Tf-TfR complex).
【0028】精製物は、非還元状態でのSDS−PAG
Eにより分子量約85kDaと65kDaの2つのバンドが認
められた。還元状態では、Tfは分子内SS結合がはず
れて見かけの分子量が大きくなるので、2つのバンドが
近接する。PVDF膜へブロッティング後それぞれの蛋
白についてアミノ酸配列分析を行ったところ、85kDa
はTfRの101番目からの配列と一致し、65kDaは
TfのN末端からの配列と一致することが確認できた。
TfRとTfの組成比率は、染色したSDS−PAGE
ゲルのデンシトグラムからほぼ47%対53%であり、
アミノ酸残基数がTfRが660、Tfが719の比と
一致した。つまりモル比として1対1であったと考えら
れる。蛋白量にTfRの濃度比(47%)を乗じた値を
精製したコンプレックス中のTfR量として決定した。
なお精製Tf−TfRコンプレックスの蛋白量は、BC
A蛋白定量法により決定した。この精製Tf−TfRコ
ンプレックスを1%のBSA、0.1%のTfを含むPB
Sで希釈して1次標準として使用した。ELISAでは
血清を適宜希釈したものの凍結乾燥品を、ラテックス凝
集法では、血清からTf−TfRコンプレックスをイオ
ン交換カラムにより部分的に精製濃縮した物の凍結乾燥
品をそれぞれ1次標準で検定し、2次標準として用い
た。従って、この標準を用いた測定によって得られる濃
度値は、Tf−TfRコンプレックスの濃度である。The purified product was SDS-PAG in a non-reducing state.
E showed two bands with molecular weights of about 85 kDa and 65 kDa. In the reduced state, Tf loses the intramolecular SS bond and increases the apparent molecular weight, so that the two bands come close to each other. Amino acid sequence analysis of each protein after blotting onto a PVDF membrane showed 85 kDa.
Was consistent with the sequence from the 101st position of TfR, and 65 kDa was confirmed to be consistent with the sequence from the N-terminus of Tf.
The composition ratio of TfR and Tf was determined by staining SDS-PAGE.
Approximately 47% vs. 53% from the gel densitogram,
The number of amino acid residues coincided with the ratio of TfR of 660 and Tf of 719. That is, it is considered that the molar ratio was 1: 1. The value obtained by multiplying the protein amount by the TfR concentration ratio (47%) was determined as the TfR amount in the purified complex.
The protein amount of the purified Tf-TfR complex was BC.
It was determined by the A protein quantification method. This purified Tf-TfR complex was added to PB containing 1% BSA and 0.1% Tf.
Diluted with S and used as primary standard. In the ELISA, the lyophilized product obtained by appropriately diluting the serum was assayed with the primary standard by the latex agglutination method. Used as the next standard. Therefore, the concentration value obtained by measurement using this standard is the concentration of the Tf-TfR complex.
【0029】2.本発明の測定試薬と参考試薬の検量線
比較:1で作成した本発明の測定試薬を用い試料液(検
量線の場合は標準希釈濃度液、一般測定の場合は検体
液)30μl、と本試薬乳液300μlを測定セルに分注
して混和し、25秒後および300秒後に散乱光(波長
660nm)を測定し散乱光の強度の差を求めた。標準希
釈液は部分精製ヒトTf−TfRコンプレックスを16
000ng/mlより順次2倍希釈した5段階の各々を用い
て測定し検量曲線を作成した。測定には全自動免疫化学
分析装置LX−3000(栄研化学・アナリテイカルイ
ンスツルメント社製、商品名)を用いた。2. Calibration curve comparison between the measurement reagent of the present invention and the reference reagent: Using the measurement reagent of the present invention prepared in 1, 30 μl of sample solution (standard dilution concentration solution for calibration curve, sample solution for general measurement), and this reagent 300 μl of milky lotion was dispensed into a measuring cell and mixed, and after 25 seconds and 300 seconds, scattered light (wavelength 660 nm) was measured to obtain the difference in scattered light intensity. The standard dilution solution is a partially purified human Tf-TfR complex.
A calibration curve was prepared by measuring using 5 steps each of which was serially diluted 2-fold from 000 ng / ml. For the measurement, a fully automatic immunochemical analyzer LX-3000 (trade name, manufactured by Eiken Chemical and Analytical Instruments) was used.
【0030】対照として、1で作成した参考試薬による
ELISA法の検量線を作成した。測定は固相プレート
にウエル当たり100μlの試料液を分注し37℃で1
時間反応後0.1%のTween20加PBSで洗浄、
標識抗体を100μlを加え37℃30分反応させ洗
浄、TMB(テトラメチルベンチジン)で発色させ波長
450nmでの吸光度を測定、という操作によって行っ
た。標準希釈濃度液はTf−TfRコンプレックス値既
知の血清を78.0ng/mlより順次2倍希釈した5段階
の各々を用いて測定し検量曲線を作成した。この標準物
質の濃度は、予備的に行った実験で確認した実用的な精
度で測定が可能な濃度範囲に基づいて設定したものであ
る。結果は図1および図2に示した。本発明の測定試薬
では測定範囲が500〜16000ng/mlである(図
1)のに対し、参考例ELISA法(図2)では2.4
4〜78.0ng/mlである。つまりELISA法で本発
明の測定試薬と同じ測定範囲を得るには試料を予め20
0倍に希釈する必要があることが確認された。As a control, a calibration curve for the ELISA method using the reference reagent prepared in 1 was prepared. For the measurement, dispense 100 μl of sample solution per well into the solid phase plate and
After reacting for time, wash with PBS containing 0.1% Tween20,
100 μl of the labeled antibody was added, the mixture was reacted at 37 ° C. for 30 minutes, washed, developed with TMB (tetramethylbenzidine), and the absorbance at a wavelength of 450 nm was measured. The standard dilution concentration solution was measured by using each of 5 steps in which serum having a known Tf-TfR complex value was serially diluted 2-fold from 78.0 ng / ml to prepare a calibration curve. The concentration of the standard substance is set based on the concentration range that can be measured with the practical accuracy confirmed by the preliminary experiment. The results are shown in FIGS. 1 and 2. The measuring range of the measuring reagent of the present invention is 500 to 16000 ng / ml (FIG. 1), whereas the measuring range of the reference example ELISA method (FIG. 2) is 2.4.
It is 4-78.0 ng / ml. That is, in order to obtain the same measurement range as that of the measurement reagent of the present invention by the ELISA method, 20
It was confirmed that it was necessary to dilute 0 times.
【0031】3.本発明によるラテックス凝集法とEL
ISA法の相関:様々な濃度のTf−TfRコンプレッ
クス値を持つ血清検体80検体を1で調製した本発明に
よるラテックス凝集反応試薬と、参考試薬であるELI
SA試薬により測定し測定値の相関を調査した。ELI
SA法では直接測定できない高値検体は適宜希釈して測
定した。結果は図3に示すとおりである。本発明による
測定値とELISAによる測定値とは良好な相関を示し
高精度な測定が可能なことが確認された。3. Latex aggregation method and EL according to the present invention
Correlation of ISA method: Latex agglutination reagent according to the present invention prepared by preparing 80 serum samples having various Tf-TfR complex values at various concentrations in 1 and ELI as a reference reagent
The measurement was performed using the SA reagent, and the correlation of the measured values was investigated. ELI
High-value specimens that cannot be directly measured by the SA method were appropriately diluted and measured. The results are as shown in FIG. It was confirmed that the measured value according to the present invention and the measured value by ELISA show a good correlation and that highly accurate measurement is possible.
【0032】4.本発明の測定試薬による測定例:2に
示した本発明の測定試薬により、健常者15名、鉄欠乏
性貧血症患者10名、安定期透析患者15名、鉄欠乏を
伴う透析患者10名、多血症患者2名、腎移植患者2名
の血清についてTf−TfRコンプレックス値を測定し
た。結果は表1に示した。鉄欠乏性貧血症、多血症等の
患者血清中のTfR値は異常に高く、本発明によるTf
Rの測定が造血機能の診断マーカーとして有用なことが
確認された。このような高い値は、ELISA法の測定
可能範囲を越えている。4. Measurement example with the measurement reagent of the present invention: With the measurement reagent of the present invention shown in 2, 15 healthy subjects, 10 iron deficiency anemia patients, 15 stable phase dialysis patients, 10 dialysis patients with iron deficiency, The Tf-TfR complex value was measured for the sera of 2 polycythemia patients and 2 kidney transplant patients. The results are shown in Table 1. The TfR value in the serum of patients with iron deficiency anemia, polycythemia, etc. is abnormally high.
It was confirmed that the measurement of R is useful as a diagnostic marker for hematopoietic function. Such a high value exceeds the measurable range of the ELISA method.
【0033】[0033]
【表1】 [Table 1]
【0034】4.本発明の測定試薬による測定例 TfRのTf結合部位以外を認識するモノクローナル抗
体と、Tfを認識するモノクローナルにより本発明の測
定試薬を構成した。特開昭62−6169に記載された
方法にしたがって前記モノクローナル抗体を調製し、こ
れをそれぞれ不溶性粒子に固定した後に混合した。具体
的な操作は次のとおりである。1で用いたのと同じ精製
TfRをフロイントのコンプリート・アジュバントと等
量混合しBalb/cマウスの皮下に免疫した。2週間
おきに免疫をくり返し、4回の免疫の後に50μgのT
fRを腹腔内に免疫した。最終免疫の3日後に抗体価の
上昇していることを確認して脾臓を摘出し、常法(Harad
a.NらProc.Natl.Acad.Sci. USA 84:4581-4585,1987)に
よってマウスミエローマ細胞P3−X63Ag8.65
3と細胞融合させた。4. Example of measurement using the measuring reagent of the present invention The measuring reagent of the present invention was composed of a monoclonal antibody that recognizes a site other than the Tf binding site of TfR and a monoclonal that recognizes Tf. The above-mentioned monoclonal antibodies were prepared according to the method described in JP-A-62-6169, immobilized on insoluble particles, and then mixed. The specific operation is as follows. The same purified TfR used in 1 was mixed with Freund's complete adjuvant in an equal amount, and Balb / c mice were subcutaneously immunized. Repeat immunization every 2 weeks, and after 4 times immunization, 50 μg T
fR was immunized intraperitoneally. Three days after the final immunization, it was confirmed that the antibody titer had risen, the spleen was removed, and the spleen was removed by a conventional method (Harad
aN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4581-4585, 1987) mouse myeloma cells P3-X63Ag8.65.
Cell fusion with 3.
【0035】ハイブリドーマは精製TfRを抗原とする
イムノブロッティングアッセイによって、まずTfRに
特異的な抗体についてスクリーニングした。TfRを認
識するモノクローナル抗体を産生するクローンは、更に
TfRとTfを用いたインヒビションアッセイによりス
クリーニングしてTf結合部位以外の部分に存在する抗
原決定基を認識するモノクローナル抗体を産生するもの
をセレクションした。こうしてTfRのTf結合部位以
外を認識するモノクローナル抗体を得た。一方Tfを認
識するモノクローナル抗体については、免疫原をTfと
すること、またスクリーニングを単にTfについて行う
こと以外はほぼ同じ操作によって得た。Hybridomas were first screened for antibodies specific to TfR by an immunoblotting assay using purified TfR as an antigen. Clones producing a monoclonal antibody recognizing TfR were further screened by an inhibition assay using TfR and Tf to select those producing a monoclonal antibody recognizing an antigenic determinant present in a portion other than the Tf binding site. did. Thus, a monoclonal antibody that recognizes the TfR other than the Tf binding site was obtained. On the other hand, a monoclonal antibody that recognizes Tf was obtained by almost the same operation except that Tf was used as the immunogen and that the screening was simply performed for Tf.
【0036】こうして得た2種類のモノクローナル抗体
(IgG、0.11mg/ml)をそれぞれ粒径0.104
μmのポリスチレンラテックスに37℃で1時間物理吸
着させた。HEPES緩衝液で洗浄後、1%のBSAを
含むHEPES緩衝液に粒子濃度0.5%となるように
等量分散させてモノクローナル抗体で構成された本発明
の試薬とした。The thus-obtained two types of monoclonal antibodies (IgG, 0.11 mg / ml) were added to a particle size of 0.104, respectively.
Physical adsorption was carried out for 1 hour at 37 ° C. on a polystyrene latex of μm. After washing with a HEPES buffer, the reagent of the present invention composed of a monoclonal antibody was obtained by dispersing the same amount in a HEPES buffer containing 1% BSA to a particle concentration of 0.5%.
【0037】モノクローナル抗体で構成された本発明に
よる試薬は、2と同じ操作によって精製Tf−TfRコ
ンプレックスと反応させた時、光学測定が可能な凝集を
定量的に生じることを確認した。この凝集は精製したT
fやTfRでは観察できず、Tf−TfRコンプレック
スに特異的であることが明らかであった。It was confirmed that the reagent composed of the monoclonal antibody according to the present invention quantitatively produced an aggregate capable of optical measurement when reacted with the purified Tf-TfR complex by the same procedure as in 2. This aggregation is purified T
It was not observed in f or TfR, and it was clear that it was specific to the Tf-TfR complex.
【図1】本発明の測定試薬を用い、免疫学的ラテックス
凝集反応法によって得られた標準曲線。図中、縦軸は6
60nmにおける散乱光強度の変化量(DLSE)を、横
軸はTf−TfRコンプレックス濃度(ng/ml)を示
す。FIG. 1 is a standard curve obtained by an immunological latex agglutination reaction method using the measuring reagent of the present invention. In the figure, the vertical axis is 6
The amount of change in scattered light intensity (DLSE) at 60 nm is shown, and the horizontal axis shows the Tf-TfR complex concentration (ng / ml).
【図2】参考試薬を用いELISA法によって得られた
標準曲線。図中、縦軸は450nmにおける吸光度を、横
軸はTf−TfRコンプレックス濃度(ng/ml)を示
す。FIG. 2 is a standard curve obtained by an ELISA method using a reference reagent. In the figure, the vertical axis shows the absorbance at 450 nm, and the horizontal axis shows the Tf-TfR complex concentration (ng / ml).
【図3】本発明によるラテックス凝集反応試薬(LA
法)による測定値(ng/ml、横軸)、ELISA試薬によ
る測定値(ng/ml、縦軸)の相関を示すグラフ。FIG. 3 shows a latex agglutination reagent (LA) according to the present invention.
The graph showing the correlation between the measured value (ng / ml, horizontal axis) by the method) and the measured value (ng / ml, vertical axis) by the ELISA reagent.
Claims (16)
固定した不溶性粒子で構成されるトランスフェリン−ト
ランスフェリンレセプター・コンプレックス測定試薬1. A transferrin-transferrin receptor complex measuring reagent comprising insoluble particles having a transferrin receptor affinity substance immobilized thereon.
抗体である請求項1のトランスフェリン−トランスフェ
リンレセプター・コンプレックス測定試薬2. The transferrin-transferrin receptor complex measuring reagent according to claim 1, wherein the substance having affinity for transferrin receptor is an antibody.
体、および抗トランスフェリン−トランスフェリンレセ
プター・コンプレックス抗体から選択される請求項2の
トランスフェリン−トランスフェリンレセプター・コン
プレックス測定試薬3. The transferrin-transferrin receptor complex measuring reagent according to claim 2, wherein the antibody is selected from an anti-transferrin receptor antibody and an anti-transferrin-transferrin receptor complex antibody.
のトランスフェリン−トランスフェリンレセプター・コ
ンプレックス測定試薬4. The antibody is a polyclonal antibody.
Transferrin-transferrin receptor complex measuring reagent
1のトランスフェリン−トランスフェリンレセプター・
コンプレックス測定試薬5. The transferrin-transferrin receptor according to claim 1, wherein the insoluble particles are latex particles.
Complex measurement reagent
た不溶性粒子を含む請求項1のトランスフェリン−トラ
ンスフェリンレセプター・コンプレックス測定試薬6. The transferrin-transferrin receptor complex measuring reagent according to claim 1, further comprising insoluble particles having a transferrin affinity substance immobilized thereon.
ェリンレセプター親和性物質とともに固定した不溶性粒
子を含む請求項1のトランスフェリン−トランスフェリ
ンレセプター・コンプレックス測定試薬7. The transferrin-transferrin receptor complex measuring reagent according to claim 1, comprising insoluble particles in which a transferrin affinity substance is immobilized together with a transferrin receptor affinity substance.
フェリンに対するモノクローナル抗体である請求項6ま
たは7のトランスフェリン−トランスフェリンレセプタ
ー・コンプレックス測定試薬8. The transferrin-transferrin receptor complex measuring reagent according to claim 6 or 7, wherein the transferrin affinity substance is a monoclonal antibody against transferrin.
固定した不溶性粒子をトランスフェリン−トランスフェ
リンレセプター・コンプレックスと反応させ、不溶性粒
子の凝集を指標としてヒト体液中のトランスフェリン−
トランスフェリンレセプター・コンプレックスを測定す
る方法9. An insoluble particle having a transferrin receptor affinity substance immobilized thereon is reacted with transferrin-transferrin receptor complex, and the aggregation of the insoluble particle is used as an index for transferrin-in human body fluid.
Method for measuring transferrin receptor complex
追跡する請求項9のヒト体液中のトランスフェリン−ト
ランスフェリンレセプター・コンプレックスを測定する
方法10. The method for measuring the transferrin-transferrin receptor complex in human body fluid according to claim 9, wherein the aggregation of insoluble particles is followed by using an optical measurement.
求項9−10のトランスフェリン−トランスフェリンレ
セプター・コンプレックスを測定する方法11. A method for measuring a transferrin-transferrin receptor complex according to claim 9, which uses undiluted serum as a sample.
ンスフェリンレセプター・コンプレックスを利用するト
ランスフェリン−トランスフェリンレセプター・コンプ
レックスを測定する方法12. A method for measuring transferrin-transferrin receptor complex using transferrin-transferrin receptor complex as a standard substance.
を固定した不溶性粒子をトランスフェリンレセプターと
反応させ、不溶性粒子の凝集を指標としてヒト体液中の
トランスフェリンレセプターを測定する方法であって、
標準物質としてトランスフェリンとコンプレックスを形
成していないトランスフェリンレセプターを用いる測定
方法13. A method for measuring the transferrin receptor in human body fluid by reacting insoluble particles having a transferrin receptor affinity substance immobilized thereon with transferrin receptor, and using the aggregation of the insoluble particles as an index.
Assay method using transferrin receptor not forming a complex with transferrin as a standard substance
セプター・コンプレックスを含む、トランスフェリン−
トランスフェリンレセプター・コンプレックスを測定す
るための標準物質14. A transferrin-containing transferrin-transferrin receptor complex.
Standard for measuring transferrin receptor complex
セプター・コンプレックスが血清から精製したものであ
る請求項14の標準物質15. The standard substance according to claim 14, wherein the transferrin-transferrin receptor complex is purified from serum.
セプター・コンプレックスを少なくとも14000ng/m
l含む請求項14の標準物質16. Transferrin-transferrin receptor complex at least 14000 ng / m 2.
The reference material according to claim 14, including l
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