JPH04254760A - 血清アミロイドa標準物質、およびその設定方法 - Google Patents
血清アミロイドa標準物質、およびその設定方法Info
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- JPH04254760A JPH04254760A JP2769991A JP2769991A JPH04254760A JP H04254760 A JPH04254760 A JP H04254760A JP 2769991 A JP2769991 A JP 2769991A JP 2769991 A JP2769991 A JP 2769991A JP H04254760 A JPH04254760 A JP H04254760A
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、血清中のアミロイドA
(以下、SAAと略称する)の免疫学的測定に利用され
る標準物質に関するものである。SAAはある種のアミ
ロイドーシスにおいて組織に沈着するアミロイド蛋白A
(以下、AA蛋白と略称する)の前駆体蛋白とされる、
分子量約12000の血清蛋白である。[ ジャーナル
・オブ・クリニカル・インベスティゲーション(J.C
lin.Invest.)53:1054−1061,
1974 ]近年になって、このSAAの血清値がア
ミロイドーシス以外の炎症性疾患で上昇することが明ら
かにされ、鋭敏な炎症マーカーとして評価されている。 (臨床検査 32:2,P168,1988 )
(以下、SAAと略称する)の免疫学的測定に利用され
る標準物質に関するものである。SAAはある種のアミ
ロイドーシスにおいて組織に沈着するアミロイド蛋白A
(以下、AA蛋白と略称する)の前駆体蛋白とされる、
分子量約12000の血清蛋白である。[ ジャーナル
・オブ・クリニカル・インベスティゲーション(J.C
lin.Invest.)53:1054−1061,
1974 ]近年になって、このSAAの血清値がア
ミロイドーシス以外の炎症性疾患で上昇することが明ら
かにされ、鋭敏な炎症マーカーとして評価されている。 (臨床検査 32:2,P168,1988 )
【00
02】
02】
【従来技術の問題点】臨床検査等の分野では、蛋白物質
の測定を簡便に行うためにしばしば免疫学的な測定が利
用される。SAAについても例外ではなくRIAやEL
ISA[スカンジナビアンジャーナル・オブ・イムノロ
ジー(Scand.J.Immunol.)18:P3
29、1983 ]、免疫比濁法[マーカー・プロテイ
ンズ・イン・インフラメーション(Marker Pr
oteins in Inflammation)3:
P157,1986 ]等、免疫学的測定法に関する多
くの報告がある。これらの測定法で利用されていた標準
物質はSAAの純品を希釈したり、血清に添加すること
によって調製されていた。しかしこうして得られた標準
物質を用いて測定を行うと、しばしば実際の値と大きく
異なる値を示すことがある。この差は、血清中のSAA
が純品のSAAとは違う形で存在していること、あるい
は精製過程でSAAが変性していること等によるものと
予想される。また本来不溶性であるSAAを蛋白変性剤
等で溶解させる場合には、SAAの免疫学的な反応性の
変化は避けられない。 更に高度に精製されたSAAを得るためには、複雑なス
テップが必要であり、収率も低くなりがちである。そこ
で簡単な操作で調製することができ、しかも免疫学的な
測定にあたっては前述のような支障を生じることがない
標準物質が望まれている。
の測定を簡便に行うためにしばしば免疫学的な測定が利
用される。SAAについても例外ではなくRIAやEL
ISA[スカンジナビアンジャーナル・オブ・イムノロ
ジー(Scand.J.Immunol.)18:P3
29、1983 ]、免疫比濁法[マーカー・プロテイ
ンズ・イン・インフラメーション(Marker Pr
oteins in Inflammation)3:
P157,1986 ]等、免疫学的測定法に関する多
くの報告がある。これらの測定法で利用されていた標準
物質はSAAの純品を希釈したり、血清に添加すること
によって調製されていた。しかしこうして得られた標準
物質を用いて測定を行うと、しばしば実際の値と大きく
異なる値を示すことがある。この差は、血清中のSAA
が純品のSAAとは違う形で存在していること、あるい
は精製過程でSAAが変性していること等によるものと
予想される。また本来不溶性であるSAAを蛋白変性剤
等で溶解させる場合には、SAAの免疫学的な反応性の
変化は避けられない。 更に高度に精製されたSAAを得るためには、複雑なス
テップが必要であり、収率も低くなりがちである。そこ
で簡単な操作で調製することができ、しかも免疫学的な
測定にあたっては前述のような支障を生じることがない
標準物質が望まれている。
【0003】一方従来は、例えば特開昭62−2161
号公報のように報告ごとに適宜標準物質を設定している
のが現状であり、異なる測定法の間で測定結果を比較す
ることが困難であった。したがって前述した文献 (M
arkerProtein in Inflammat
ion3:P157、1986) にもあるように、幅
広い免疫学的測定に適用可能な標準物質が必要とされて
いる。このように広い範囲で利用される標準物質には調
製や取扱が容易であることが要求されるが、この条件を
満足するSAAの標準物質は未だ知られていない。特開
昭61−191697号公報にはSAA測定用抗原に有
用なペプチド断片が開示されている。しかしこのペプチ
ド断片は血清中のSAAと分子量が異なることはいうま
でもなく、また特定の抗体としか反応性を持たないので
標準物質としては不適当である。
号公報のように報告ごとに適宜標準物質を設定している
のが現状であり、異なる測定法の間で測定結果を比較す
ることが困難であった。したがって前述した文献 (M
arkerProtein in Inflammat
ion3:P157、1986) にもあるように、幅
広い免疫学的測定に適用可能な標準物質が必要とされて
いる。このように広い範囲で利用される標準物質には調
製や取扱が容易であることが要求されるが、この条件を
満足するSAAの標準物質は未だ知られていない。特開
昭61−191697号公報にはSAA測定用抗原に有
用なペプチド断片が開示されている。しかしこのペプチ
ド断片は血清中のSAAと分子量が異なることはいうま
でもなく、また特定の抗体としか反応性を持たないので
標準物質としては不適当である。
【0004】
【発明の課題】本発明の課題は、次のような条件を満足
するSAAの標準物質を提供することにある。 1)SAAの純品を標準物質として利用したときに観察
されるような実際の値との差が生じないこと。 2)簡単な操作で取得できること。 3)幅広い測定法に適用可能なこと。 4)水溶性であること。
するSAAの標準物質を提供することにある。 1)SAAの純品を標準物質として利用したときに観察
されるような実際の値との差が生じないこと。 2)簡単な操作で取得できること。 3)幅広い測定法に適用可能なこと。 4)水溶性であること。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明は、「SAAを高
比重リポ蛋白質(以下HDLと略す)と会合した形(以
下HDL−SAAと略す)で精製した血清アミロイドA
標準物質」、および「高比重リポ蛋白質と会合した血清
アミロイドA中の血清アミロイドA含量を、蛋白量既知
の血清アミロイドAの純品とともに電気泳動分析するこ
とによって決定する免疫学的測定用血清アミロイドA標
準物質の設定方法」である。
比重リポ蛋白質(以下HDLと略す)と会合した形(以
下HDL−SAAと略す)で精製した血清アミロイドA
標準物質」、および「高比重リポ蛋白質と会合した血清
アミロイドA中の血清アミロイドA含量を、蛋白量既知
の血清アミロイドAの純品とともに電気泳動分析するこ
とによって決定する免疫学的測定用血清アミロイドA標
準物質の設定方法」である。
【0006】従来は高度に精製されたSAAを標準とし
て利用していたのに対して、本発明においてはSAAを
多く含む血清や腹水等からHDL分画としてSAAを分
取し、それ以上精製しない状態で標準物質として利用す
る。SAAが血清中でHDLと会合した状態で存在して
いることは知られているが(Scand.J.Immu
nol.14:P201、1985) 、これをそのま
ま免疫学的測定法における標準物質として利用した例は
知られていない。これはHDL等の夾雑蛋白が共存した
ままではSAAの蛋白量を決定できないと考えられてい
たためである。特にHDLはその表面に脂質分子を有す
るために、BSA等の蛋白とは異なる反応性を示す。そ
のためBSA等を標準とする公知の蛋白定量法(ロウリ
ー法等)では、HDL−SAAにおけるSAAの蛋白量
を決定することは困難である。本発明者らは、例えば電
気泳動分析等の技術を利用することで夾雑蛋白存在下で
もSAAの蛋白量を決定することが可能なことを見出し
本発明に達したものである。
て利用していたのに対して、本発明においてはSAAを
多く含む血清や腹水等からHDL分画としてSAAを分
取し、それ以上精製しない状態で標準物質として利用す
る。SAAが血清中でHDLと会合した状態で存在して
いることは知られているが(Scand.J.Immu
nol.14:P201、1985) 、これをそのま
ま免疫学的測定法における標準物質として利用した例は
知られていない。これはHDL等の夾雑蛋白が共存した
ままではSAAの蛋白量を決定できないと考えられてい
たためである。特にHDLはその表面に脂質分子を有す
るために、BSA等の蛋白とは異なる反応性を示す。そ
のためBSA等を標準とする公知の蛋白定量法(ロウリ
ー法等)では、HDL−SAAにおけるSAAの蛋白量
を決定することは困難である。本発明者らは、例えば電
気泳動分析等の技術を利用することで夾雑蛋白存在下で
もSAAの蛋白量を決定することが可能なことを見出し
本発明に達したものである。
【0007】本発明に用いるHDL−SAAは必ずしも
高度に精製する必要はなく、SAAの検定を妨害する成
分を除く程度で十分である。具体的には、例えばSAA
の純品を対照としてSDS−PAGE等によってSAA
含量を決定するのであれば、SAAが単一のバンドとし
て得られる程度に精製すれば良い。この場合出発原料と
しては従来のSAA純品を得るために用いられていたも
のと同様のもの、例えばSAAに富む腹水、血漿、血清
等を利用できる。これらの材料から超遠心法によりHD
L分画を採取する。(J.Clin.Invest.3
4:P1345,1955 等)
高度に精製する必要はなく、SAAの検定を妨害する成
分を除く程度で十分である。具体的には、例えばSAA
の純品を対照としてSDS−PAGE等によってSAA
含量を決定するのであれば、SAAが単一のバンドとし
て得られる程度に精製すれば良い。この場合出発原料と
しては従来のSAA純品を得るために用いられていたも
のと同様のもの、例えばSAAに富む腹水、血漿、血清
等を利用できる。これらの材料から超遠心法によりHD
L分画を採取する。(J.Clin.Invest.3
4:P1345,1955 等)
【0008】この段階では他のアポリポ蛋白が混在して
いるので、SAAの純品を得るためには更に脱脂、ゲル
濾過やイオン交換クロマトグラフィー等による精製過程
が不可欠である。しかし本発明においてはここで得られ
たHDL−SAAをそのまま標準物質として利用する。 HDL−SAA中に占めるSAAの蛋白量を決定するに
は、例えばSDS−PAGE等の技術を応用できる。S
DS−PAGEではHDLとの会合とは無関係にSAA
を分析することが可能なため、予め蛋白量を測定してお
いたSAA純品に対してHDL−SAA中に占めるSA
Aの蛋白量を検定することができる。このようにしてS
AAの蛋白量を決定したHDL−SAAを一次標準物質
とし、SAA陽性血清をプールしたもののSAA含量を
測定すれば二次標準を設定することができる。本発明に
よるSAA標準物質は、SAAの蛋白量を正確に検定で
きる程度の濃度、すなわちSDS−PAGEによって蛋
白量の検定を行うのであれば少なくとも10μg/ml
以上の濃度が必要である。本発明によるSAA標準物質
が一次標準として用いられることを考慮すると、その濃
度の下限を少なくとも二次標準の最高濃度(およそ50
μg/ml前後)以上に設定するのが好ましい。以下実
施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。
いるので、SAAの純品を得るためには更に脱脂、ゲル
濾過やイオン交換クロマトグラフィー等による精製過程
が不可欠である。しかし本発明においてはここで得られ
たHDL−SAAをそのまま標準物質として利用する。 HDL−SAA中に占めるSAAの蛋白量を決定するに
は、例えばSDS−PAGE等の技術を応用できる。S
DS−PAGEではHDLとの会合とは無関係にSAA
を分析することが可能なため、予め蛋白量を測定してお
いたSAA純品に対してHDL−SAA中に占めるSA
Aの蛋白量を検定することができる。このようにしてS
AAの蛋白量を決定したHDL−SAAを一次標準物質
とし、SAA陽性血清をプールしたもののSAA含量を
測定すれば二次標準を設定することができる。本発明に
よるSAA標準物質は、SAAの蛋白量を正確に検定で
きる程度の濃度、すなわちSDS−PAGEによって蛋
白量の検定を行うのであれば少なくとも10μg/ml
以上の濃度が必要である。本発明によるSAA標準物質
が一次標準として用いられることを考慮すると、その濃
度の下限を少なくとも二次標準の最高濃度(およそ50
μg/ml前後)以上に設定するのが好ましい。以下実
施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。
【0009】
【実施例】1.HDL−SAAIの精製SAAを高濃度
に含むリウマチ患者血清−I[SAA含量309μg/
ml山田らの方法(臨床検査32:P167、1988
)により測定、以下同様]76mlを出発原料とし、ま
ず超遠心法により比重1.23g/lの上層部を採取し
た。次いで比重を1.063g/l に調整して再度超
遠心を行い、その下層部を採取した。この分画をポリエ
チレングリコールで濃縮後、HDL−SAAの濃度を高
めるためにセファロースCL6Bカラム1.6×85c
m(ファルマシア製)にアプライし、0.5M 食塩、
2mMEDTAを含む0.01M トリス−塩酸緩衝液
pH8.6で溶出して280nmにおける吸収を追跡し
、ピークフラクション2mlを分取してHDL−SAA
Iを得た。このHDL−SAAをアガロースフィルム(
ポリモ−フィルムシステム、日本商事製)に塗布して電
気泳動を行い、コレステロール発色試薬(日本商事製)
で発色させたところ高純度のHDL分画であることが証
明された。更に、アポAI、アポ−AII、アポ−CI
I、アポ−CIII 、SAAの各リポ蛋白に対する抗
体を用いてウエスタン・ブロット法を行い、SAAのバ
ンドが単一の蛋白からなることを確認した。
に含むリウマチ患者血清−I[SAA含量309μg/
ml山田らの方法(臨床検査32:P167、1988
)により測定、以下同様]76mlを出発原料とし、ま
ず超遠心法により比重1.23g/lの上層部を採取し
た。次いで比重を1.063g/l に調整して再度超
遠心を行い、その下層部を採取した。この分画をポリエ
チレングリコールで濃縮後、HDL−SAAの濃度を高
めるためにセファロースCL6Bカラム1.6×85c
m(ファルマシア製)にアプライし、0.5M 食塩、
2mMEDTAを含む0.01M トリス−塩酸緩衝液
pH8.6で溶出して280nmにおける吸収を追跡し
、ピークフラクション2mlを分取してHDL−SAA
Iを得た。このHDL−SAAをアガロースフィルム(
ポリモ−フィルムシステム、日本商事製)に塗布して電
気泳動を行い、コレステロール発色試薬(日本商事製)
で発色させたところ高純度のHDL分画であることが証
明された。更に、アポAI、アポ−AII、アポ−CI
I、アポ−CIII 、SAAの各リポ蛋白に対する抗
体を用いてウエスタン・ブロット法を行い、SAAのバ
ンドが単一の蛋白からなることを確認した。
【0010】2.HDL−SAAIIの精製SAAを高
濃度に含むリウマチ患者血清−II(SAA含量132
0μg/ml)76mlから、実施例1と同じ操作によ
りHDL−SAAII(2ml)を得た。
濃度に含むリウマチ患者血清−II(SAA含量132
0μg/ml)76mlから、実施例1と同じ操作によ
りHDL−SAAII(2ml)を得た。
【0011】3.HDL−SAA中に占めるSAAの蛋
白量の決定 3−1.精製SAA SAAの蛋白量の決定に先だち、まず精製SAAを次の
ような方法によって得た。SAAを多く含む患者腹水プ
ール(118μg/ml)1l を出発原料とし、まず
超遠心法により比重1.23g/l の上層部を採取、
次いで比重1.063g/l の下層部を採取し、冷却
下メタノール/エーテル (1:2)で脱脂後、セファ
デックスG−200カラム(6M尿素、0.5%Twe
en 20を含む0.01M トリス−塩酸緩衝液pH
8.6で平衡化)にアプライし、更にブロムシアンで活
性化したセファロース4B(ファルマシア)に常法通り
、抗アポAI、アポCIII 、ヒト血清アルブミン抗
体を結合させたカラムに通して夾雑蛋白を除去し、1l
の患者腹水より精製SAA31mgが得られた。精製
SAAはSDS−PAGEにより、分子量12000の
所に単一のバンドを示し、他のアポリポ蛋白抗体とは反
応しなかった。また、アミノ酸配列はN末端からSer
Phe Phe Ser Phe Leu Gly
Glu Ala Phe Asp Gly Ala A
rg Asp Met Trp Arg Ala Ty
r であり、データベース検索から、ダウレット他の報
告[バイオケミストリー(Biochem.)27:P
1677,1988 ]によるN末端のArg を欠い
たformII, IVと同一であることがわかった。
白量の決定 3−1.精製SAA SAAの蛋白量の決定に先だち、まず精製SAAを次の
ような方法によって得た。SAAを多く含む患者腹水プ
ール(118μg/ml)1l を出発原料とし、まず
超遠心法により比重1.23g/l の上層部を採取、
次いで比重1.063g/l の下層部を採取し、冷却
下メタノール/エーテル (1:2)で脱脂後、セファ
デックスG−200カラム(6M尿素、0.5%Twe
en 20を含む0.01M トリス−塩酸緩衝液pH
8.6で平衡化)にアプライし、更にブロムシアンで活
性化したセファロース4B(ファルマシア)に常法通り
、抗アポAI、アポCIII 、ヒト血清アルブミン抗
体を結合させたカラムに通して夾雑蛋白を除去し、1l
の患者腹水より精製SAA31mgが得られた。精製
SAAはSDS−PAGEにより、分子量12000の
所に単一のバンドを示し、他のアポリポ蛋白抗体とは反
応しなかった。また、アミノ酸配列はN末端からSer
Phe Phe Ser Phe Leu Gly
Glu Ala Phe Asp Gly Ala A
rg Asp Met Trp Arg Ala Ty
r であり、データベース検索から、ダウレット他の報
告[バイオケミストリー(Biochem.)27:P
1677,1988 ]によるN末端のArg を欠い
たformII, IVと同一であることがわかった。
【0012】3−2.SAAの蛋白量の決定こうして得
た精製SAA(6M 尿素、0.5% Tween20
、0.01M トリス−塩酸緩衝液)の蛋白量をBSA
を標準としてロウリー法によって求めたところ31mg
(収率26.3%)であった。SDS−PAGE(15
%ゲル)において、上記精製SAAの段階希釈したもの
数本と、実施例1で得たHDL−SAAとを同一ゲルに
泳動した。CBBを用いて常法により蛋白染色したSA
Aのバンドをデンシトメター(ACD−250DX,ア
トー製)で測定し、濃度積分値から精製SAA濃度曲線
を作成してHDL−SAAの蛋白量を決定した。結果は
表1に示すとおりである。なお分析は3回行った。
た精製SAA(6M 尿素、0.5% Tween20
、0.01M トリス−塩酸緩衝液)の蛋白量をBSA
を標準としてロウリー法によって求めたところ31mg
(収率26.3%)であった。SDS−PAGE(15
%ゲル)において、上記精製SAAの段階希釈したもの
数本と、実施例1で得たHDL−SAAとを同一ゲルに
泳動した。CBBを用いて常法により蛋白染色したSA
Aのバンドをデンシトメター(ACD−250DX,ア
トー製)で測定し、濃度積分値から精製SAA濃度曲線
を作成してHDL−SAAの蛋白量を決定した。結果は
表1に示すとおりである。なお分析は3回行った。
【表1】
【0013】HDL−SAAの蛋白量をロウリー法によ
って確認し、SDS−PAGEによって得られるHDL
−とSAAの構成比からSAAの蛋白量を決定すること
も試みたが、蛋白量の正確な測定が困難なため精製SA
Aに対してSAAの蛋白量を決定する方法を採用した。 HDLが表面に脂質分子を有するのでBSAとは異なる
反応性を示すことが原因と考えられる。
って確認し、SDS−PAGEによって得られるHDL
−とSAAの構成比からSAAの蛋白量を決定すること
も試みたが、蛋白量の正確な測定が困難なため精製SA
Aに対してSAAの蛋白量を決定する方法を採用した。 HDLが表面に脂質分子を有するのでBSAとは異なる
反応性を示すことが原因と考えられる。
【0014】4.本発明によるHDL−SAAの標準物
質としての評価 実施例3でSAAの蛋白量を決定したHDL−SAAが
、実際に他のSAA測定法の標準物質として利用できる
ことをラテックス凝集反応法、およびELISAにより
確認した。4−1.SAAのラテックス凝集反応用試薬 実施例3で得たSAAをフロイントのコンプリート・ア
ジュバントと等量混合後、充分乳化させた後に家兎の4
肢に免疫した。免疫は2週間毎に行い、4ケ月後に一部
採血してして得られる抗血清を、40%硫安分画〜透析
〜濃縮し抗SAA抗体(0.01mg/ml )とした
。この抗SAA抗体をポリスチレンラテックス(平均粒
径0.109μm 積水化学工業製)に56℃で1時間
物理吸着させた後、0.1M のHEPES緩衝液で洗
浄し、最終的にラテックス濃度1%となるように分散媒
(5%ショ糖、5%塩化コリンを含む0.1M のHE
PES緩衝液pH7.4)に懸濁させてSAAのラテッ
クス凝集反応用試薬を得た。
質としての評価 実施例3でSAAの蛋白量を決定したHDL−SAAが
、実際に他のSAA測定法の標準物質として利用できる
ことをラテックス凝集反応法、およびELISAにより
確認した。4−1.SAAのラテックス凝集反応用試薬 実施例3で得たSAAをフロイントのコンプリート・ア
ジュバントと等量混合後、充分乳化させた後に家兎の4
肢に免疫した。免疫は2週間毎に行い、4ケ月後に一部
採血してして得られる抗血清を、40%硫安分画〜透析
〜濃縮し抗SAA抗体(0.01mg/ml )とした
。この抗SAA抗体をポリスチレンラテックス(平均粒
径0.109μm 積水化学工業製)に56℃で1時間
物理吸着させた後、0.1M のHEPES緩衝液で洗
浄し、最終的にラテックス濃度1%となるように分散媒
(5%ショ糖、5%塩化コリンを含む0.1M のHE
PES緩衝液pH7.4)に懸濁させてSAAのラテッ
クス凝集反応用試薬を得た。
【0015】4−2.ラテックス凝集反応法によるSA
Aの測定 実施例4−1で調製したラテックス凝集反応用試薬を用
い、次のような方法によって本発明によるHDL−SA
Aと血清中のSAAとの反応性を比較した。すなわち、
一定量のSAAを含むリウマチ患者血清(以下仮標準と
略称する)を標準として実施例1、2、および実施例1
と同様の操作で精製しSAA含量を決定した4種の異な
る患者血清に由来するHDL−SAAIII 、IV、
V、VIについてラテックス凝集反応を行った。この実
験によれば、仮標準中のSAAと本発明によるHDL−
SAAとの間の反応性の差、あるいは出発原料の違いに
よるHDL−SAAの反応性の差を、ラテックス凝集反
応による値とSDS−PAGEで得られたSAAの蛋白
量とを比較することによって確認することができる。な
おラテックス凝集反応の条件は次のとおりである。 検体量:20μl (希釈する場合は50mMのHEP
ES緩衝液pH7.4を利用) ラテックス試薬量:300μl 反応温度:37℃ 測光条件:585nmの吸光度増加速度を500秒間測
定測定機器:LA2000(多摩精機製)
Aの測定 実施例4−1で調製したラテックス凝集反応用試薬を用
い、次のような方法によって本発明によるHDL−SA
Aと血清中のSAAとの反応性を比較した。すなわち、
一定量のSAAを含むリウマチ患者血清(以下仮標準と
略称する)を標準として実施例1、2、および実施例1
と同様の操作で精製しSAA含量を決定した4種の異な
る患者血清に由来するHDL−SAAIII 、IV、
V、VIについてラテックス凝集反応を行った。この実
験によれば、仮標準中のSAAと本発明によるHDL−
SAAとの間の反応性の差、あるいは出発原料の違いに
よるHDL−SAAの反応性の差を、ラテックス凝集反
応による値とSDS−PAGEで得られたSAAの蛋白
量とを比較することによって確認することができる。な
おラテックス凝集反応の条件は次のとおりである。 検体量:20μl (希釈する場合は50mMのHEP
ES緩衝液pH7.4を利用) ラテックス試薬量:300μl 反応温度:37℃ 測光条件:585nmの吸光度増加速度を500秒間測
定測定機器:LA2000(多摩精機製)
【0016】
結果は表2に示すとおり、ラテックス凝集反応による測
定値の方が常に1.8倍程度高い値を示し(すなわち仮
標準の値が1.8倍高い)、両者の間には良好な相関が
認められた。両者の相関が高いということは、ラテック
ス凝集反応試薬に対する反応性に差がないことを示すも
のである。
結果は表2に示すとおり、ラテックス凝集反応による測
定値の方が常に1.8倍程度高い値を示し(すなわち仮
標準の値が1.8倍高い)、両者の間には良好な相関が
認められた。両者の相関が高いということは、ラテック
ス凝集反応試薬に対する反応性に差がないことを示すも
のである。
【表2】
【0017】4−3
実施例4−1で得た抗SAA抗体を利用してEIAサン
ドイッチ法により実施例4−2と同じ試料について測定
を行った。操作は次のとおりである。抗SAA抗体0.
01mg/ml (0.05M のNaHCO3−Na
CO3 、pH9.5)を96穴マイクロタイタープレ
ートに分注し、感作後3%BSA(0.01M PBS
)でブロックして固相とした。一方同じ抗体を常法によ
りPOD標識して標識抗体を得た。実施例4−2と同じ
仮標準、および試料100μl (希釈には1%BSA
加0.01M PBSを利用)を各ウエルに分注し37
℃で1時間反応させた後混合液を捨て、ウエルを0.0
1M PBSで3回洗浄してからPOD標識抗体100
μl を分注し37℃で1時間反応させた。反応終了後
、反応液を捨ててPBSで洗浄し、0.84mM3,3
’,5,5’−テトラメチルベンチジン(0.1M ク
エン酸緩衝液pH6.0)50μl と2mM過酸化水
素(緩衝液は同じ)50μlを同時に加え37℃で30
分間反応させた。3.6Nの硫酸を加えて反応を停止後
、450nmおよび600nmにおける吸光度をマイク
ロオートリーダーMPRA4(東ソー製、商品名)で測
定し、仮標準に対してSAA濃度を決定した。結果は表
3に示すとおりである。
ドイッチ法により実施例4−2と同じ試料について測定
を行った。操作は次のとおりである。抗SAA抗体0.
01mg/ml (0.05M のNaHCO3−Na
CO3 、pH9.5)を96穴マイクロタイタープレ
ートに分注し、感作後3%BSA(0.01M PBS
)でブロックして固相とした。一方同じ抗体を常法によ
りPOD標識して標識抗体を得た。実施例4−2と同じ
仮標準、および試料100μl (希釈には1%BSA
加0.01M PBSを利用)を各ウエルに分注し37
℃で1時間反応させた後混合液を捨て、ウエルを0.0
1M PBSで3回洗浄してからPOD標識抗体100
μl を分注し37℃で1時間反応させた。反応終了後
、反応液を捨ててPBSで洗浄し、0.84mM3,3
’,5,5’−テトラメチルベンチジン(0.1M ク
エン酸緩衝液pH6.0)50μl と2mM過酸化水
素(緩衝液は同じ)50μlを同時に加え37℃で30
分間反応させた。3.6Nの硫酸を加えて反応を停止後
、450nmおよび600nmにおける吸光度をマイク
ロオートリーダーMPRA4(東ソー製、商品名)で測
定し、仮標準に対してSAA濃度を決定した。結果は表
3に示すとおりである。
【表3】
実施例4−2と同様両者の間には良好な相関が認められ
、EIA用の試薬に対する反応性にも大きな違いの無い
ことが確認された。
、EIA用の試薬に対する反応性にも大きな違いの無い
ことが確認された。
【0018】
【発明の効果】本発明によるHDL−SAAは、実施例
4で確認したとおり検体中に存在するSAAとの間に免
疫学的な反応性の差が認められず標準物質に好適である
。またHDL−SAAの精製は、SAAの純品を得るよ
りも簡便であり経済的にも有利である。加えてHDL−
SAAはSAAに比べ水溶性に優れるため蛋白変性剤等
による可溶化の必要がなく幅広い免疫学的測定法におい
て標準物質として利用できる。
4で確認したとおり検体中に存在するSAAとの間に免
疫学的な反応性の差が認められず標準物質に好適である
。またHDL−SAAの精製は、SAAの純品を得るよ
りも簡便であり経済的にも有利である。加えてHDL−
SAAはSAAに比べ水溶性に優れるため蛋白変性剤等
による可溶化の必要がなく幅広い免疫学的測定法におい
て標準物質として利用できる。
Claims (2)
- 【請求項1】血清アミロイドAを高比重リポ蛋白質と会
合した形で精製した免疫学的測定用血清アミロイドA標
準物質 - 【請求項2】高比重リポ蛋白質と会合した血清アミロイ
ドA中の血清アミロイドA含量を、蛋白量既知の血清ア
ミロイドAの純品とともに電気泳動分析することによっ
て決定する免疫学的測定用血清アミロイドA標準物質の
設定方法
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2769991A JPH04254760A (ja) | 1991-01-30 | 1991-01-30 | 血清アミロイドa標準物質、およびその設定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2769991A JPH04254760A (ja) | 1991-01-30 | 1991-01-30 | 血清アミロイドa標準物質、およびその設定方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04254760A true JPH04254760A (ja) | 1992-09-10 |
Family
ID=12228232
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2769991A Pending JPH04254760A (ja) | 1991-01-30 | 1991-01-30 | 血清アミロイドa標準物質、およびその設定方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH04254760A (ja) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6251624B1 (en) | 1999-03-12 | 2001-06-26 | Akzo Nobel N.V. | Apparatus and method for detecting, quantifying and characterizing microorganisms |
US6429017B1 (en) | 1999-02-04 | 2002-08-06 | Biomerieux | Method for predicting the presence of haemostatic dysfunction in a patient sample |
US6502040B2 (en) | 1997-12-31 | 2002-12-31 | Biomerieux, Inc. | Method for presenting thrombosis and hemostasis assay data |
US6564153B2 (en) | 1995-06-07 | 2003-05-13 | Biomerieux | Method and apparatus for predicting the presence of an abnormal level of one or more proteins in the clotting cascade |
US6898532B1 (en) | 1995-06-07 | 2005-05-24 | Biomerieux, Inc. | Method and apparatus for predicting the presence of haemostatic dysfunction in a patient sample |
US7179612B2 (en) | 2000-06-09 | 2007-02-20 | Biomerieux, Inc. | Method for detecting a lipoprotein-acute phase protein complex and predicting an increased risk of system failure or mortality |
US7211438B2 (en) | 1999-02-04 | 2007-05-01 | Biomerieux, Inc. | Method and apparatus for predicting the presence of haemostatic dysfunction in a patient sample |
-
1991
- 1991-01-30 JP JP2769991A patent/JPH04254760A/ja active Pending
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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