JPH09510108A - 移植用処理組織及び調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本開示は、機能的雑種生体プロテーゼの生成方法を含む。間隙性コラーゲンの天然に形成された組織を処理して本来の細胞を殺し、免疫学的に活性である可能性のある可溶性分子を除去する。その後細胞外基質付着因子、細胞外基質グリコサミノグリカン、及び基質内で機能する必要のある種類の細胞に適した成長因子で順次処理し、受容者に関して同種異系又は自己由来の細胞とともに移植組織基質をインキュベートし、それにより選択された種類の細胞及び組織の特徴を基質に付与し得る。したがって、受容者における免疫学的反応の刺激の低減を示すか又は全く示さない種々の機能的生体活性を有する組織を、移植前にin vitroに形成し得る。

Description

【発明の詳細な説明】 移植用処理組織及び調製方法 発明の背景 外科的心臓弁取替えは、３つの異なる種類のプロテーゼ、即ち人工的（合成） 、生体プロテーゼ（化学的固定ブタ弁又はウシ心膜）、あるいはヒト同種異系移 植片のうちの１つを移植することに関連する。これらのプロテーゼは、先天的に 奇形であるかあるいは大動脈弁閉鎖不全又は大動脈弁狭窄を引き起こす変性的変 化又は疾患により損傷を受けた本来の大動脈弁の取替えに有効な血液動態的改良 を提供する。米国における約55,000例の大動脈弁移植片のうち、75 % が人工弁 である。残りの取替物は移植組織である。このうち80 %がブタ生体プロテーゼで あって、同種異系移植片（2,500 例／年）が相対的に少数であるのは主にその利 用可能性が限定されているためである。 理想的プロテーゼの判定基準としては、自然な血液動態、長期耐久性、血栓塞 栓性合併症の発生率が低いこと、石灰化しないこと、免疫原性がないことが立証 されていること、及び移植後の不適切な過形成性反応が認められないことが挙げ られる。自己移植の場合でも、例えば静脈移植片のような組織の外科的取扱いは 、それ自体が組織過形成を刺激し、その後の移植を失敗させる可能性がある。 本発明によれば、装着、石灰化傾向、免疫反応の刺激、及び入手困難性の低減 に関して有益な特性を有する心臓弁、即ち肺動脈弁及び大動脈弁を調製し得る。 本発明は、他の形態の組織、特に構造性間隙性コラーゲンにも適用できる。 種々の合成移植片及び人工器官が開発されてきたし、現在使用さ れている。しかし、これらの合成取替物は、塞栓性合併症又は長期移植中の物質 的強度の低減を蒙ることが公知である。心臓弁のような人工プロテーゼの構造的 修正はその装着特性に関して改良されてきたが、突発的に且つ警告なしに起こっ て、その結果外科的介入及び人工プロテーゼ装置の取替えを要する緊急事態を生 じ得る弁機能不全を依然として免れない。血管系に用いられる合成／人工プロテ ーゼの表面特性のために、血小板付着が血栓形成の可能性を増大して、移植片を 生かすために抗凝血療法が提供されねばならず、そしてある種の受容者（例えば 出産可能な年齢の女性）にとってこのような移植片を望ましくないものにする。 それに代わるもの、即ち生体プロテーゼ心臓弁が、ブタ又はウシ起源の弁組織 から調製される。これらはヒトとは免疫学的に種不一致であるため、そうでなけ れば同種異系移植片を保持し得る免疫抑制剤療法の使用にもかかわらず移植片受 容者により迅速に拒絶される。これらの組織は、外来細胞、特に心臓弁及び血管 の内皮の裏打ちを有する細胞の表面上で抗原を認識する予め形成された天然抗体 が受容者に存在するために、受容者による超過敏性拒絶を受けやすいということ は重要である。ウシ又はブタ弁組織はヒトに用いるのに構造的及び生体力学的に 適している一方、このような外来組織が受容者における免疫性拒絶反応を刺激す る可能性は、グルタルアルデヒドのような化学的架橋剤による従来の指図された 処置にある。組織のこのような処置は、外来組織に対する受容者による免疫学的 反応の刺激を低減し、その結果生じる非生存可能弁組織のコラーゲンタンパク質 を安定化して、タンパク質分解酵素による分解に対してより耐容性にさせる。し かし、これらの組織移植片は非生存可能性であるため、受容者における組織の操 作中に分解される構造タンパク質を修復する生合成メカニズムが認められない。 このような組 織移植片は時間とともに石灰化する傾向があり、構造的損傷及び結果的に生じる 不全の危険性を増大する。人工移植片と比較して低頻度で発生する一方で、血栓 塞栓はこれらの移植片の受容者に関する患者管理の問題点でもある。 同様に、腎臓のような臓器は、臓器拒絶反応を引き起こす移植片受容者におけ る免疫学的媒介反応を最小限にしようとして、兄弟姉妹の１人から別の兄弟姉妹 に同種異系的に移植されてきた。これらの患者、並びに兄弟姉妹以外の提供者か らの移植臓器を受容している患者は、免疫系を抑制するための薬剤を頻繁に投与 される。移植組織又は臓器に対する免疫学的反応は拒絶反応を最小限にする免疫 抑制剤の使用により抑制され得るが、免疫抑制療法は事実、普遍的である。ゆえ に、免疫抑制剤は免疫反応を全般的に抑制する傾向もあり、これは感染と戦う移 植片受容者の能力を低減する。 近年、非ヒト組織の処理により、ヒト又は哺乳類移植用の生体プロテーゼの改 良をおこなうための方法が記載されている（例えば、Orton，E．Christopher, 米国特許第5,192,312 号参照）。Orton は、例えばブタ起源の組織から本来の細 胞を除去し、次いで成長因子の存在下で新規の細胞で組織を再集団形成すること による移植組織の生成を開示する。再集団形成細胞は、意図された移植片受容者 と免疫学的に適合性である。この方法により生成される生体移植片は、他の従来 技術の生体プロテーゼの多数の欠点が有していない。 本発明の概要 本発明は、ヒト又は他の哺乳類における移植に適した移植組織を生成するため の新規の且つ有益な方法を提供する。本発明の方法は、一般に、移植時に受容者 による悪免疫反応を生じない、そして同種異系移植片の再生能力を有するが、一 方石灰化する限定的傾向の みを示し、血栓塞栓の刺激をほとんど示さない生育可能な生体プロテーゼを生成 するための異種又は同種異系組織の処理に関する。 前記にしたがって、本発明の方法は、脱細胞化組織基質から本来の細胞及び他 の抗原並びに細胞屑を除去することによりさらに処理加工するために異種（又は 同種異系）組織基質を調製し、基質を処理して新規の免疫学的部位の生成を阻止 する工程を包含する。次にこの組織基質を下記の細胞付着因子で処理してこのよ うな新規の細胞で組織基質を再集団形成する工程中の基質への細胞の付着を増強 する。 天然組織基質を再集団形成するために用いた細胞に依って、種雑種生体プロテ ーゼの種々の特性、例えばそうでなければ移植部位の天然組織に対して非定型性 の又はある年齢群に独特のタンパク質を合成する能力が得られる。これらの雑種 移植片は、生体プロテーゼ移植片の構造的利点と同種異系移植片の機能的及び再 生的可能性とを併有し、そして免疫反応の減衰を示すか又は免疫反応を全く示さ ず、石灰化の限定傾向を示し、血栓塞栓の刺激をほとんど示さない。現在使用中 のすべての生体プロテーゼ移植片を用いた場合と同様に、これらの修正化組織は 限定された供給ではなく、より多くの受容者に移植片の機能性を与える。さらに 、これらの移植片は必ずしも化学的に変化して受容者の免疫系に対してそれらを 安定にするわけではない。したがって、このような物質は、取り替えるために用 いられる組織と同様の生体力学的特性を示す。 本明細書に記載された本発明は、ヒト移植に適した生体プロテーゼ異種移植片 を生成するのに有用である。それは、主な構造性成分が結合組織基質、例えば心 臓弁、特にブタ又はウシ起源の心臓弁である異種移植片を生成するのに特によく 適している。本発明に用いるのに適した他の組織の例としては、大動脈心臓弁、 肺動脈心臓弁 、大腿筋膜、硬膜、心膜、半月、皮膚、靱帯、腱及びその他の結合組織構造が挙 げられるが、これらに限定されない。 図面の簡単な説明 図１． 新鮮な大動脈弁小葉の顕微鏡写真。 図２ａ．脱細胞化後の肺動脈弁導管を示す顕微鏡写真。 図２ｂ．脱細胞化後の心筋層を示す顕微鏡写真。 図３ａ．脱細胞化大動脈弁小葉の顕微鏡写真。 図３ｂ．再集団形成化大動脈弁小葉の顕微鏡写真。 図４． ブタ大動脈心臓弁小葉におけるコラーゲン及び非コラーゲンタンパク 質合成。 図５． 凍結保存化又は脱集団形成化ブタ心臓弁小葉の抽出物に対して生じた ウサギ抗血清の反応性−抗体捕獲。 図６ａ．移植後に脱細胞化ブタ心臓弁小葉により誘発された最小細胞反応を示 す顕微鏡写真。 図６ｂ．移植後の凍結保存ブタ大動脈弁小葉により誘発された細胞反応を示す 顕微鏡写真。 図７ａ．ブタ細胞関連抗原に関して検定された新鮮なブタ大動脈弁小葉の顕微 鏡写真。 図７ｂ．ブタ細胞関連抗原に関して検定された脱細胞化ブタ大動脈弁小葉の顕 微鏡写真。 図８． ブタ大動脈弁小葉の応力−歪み関係。 図９． 予備状態調節後のブタ大動脈弁小葉の応力緩和曲線。 図１０．ブタ大動脈弁小葉に関する引っ張り失敗データ。 本発明の詳細な説明 意図される移植片の種類に依って、受容者がヒトである場合には、最初の移植 片組織又は器官は非ヒト起源のものである。これらの 組織又は器官は、ヒト消費に適合する動物から又はこれらの組織又は器官を提供 するために養われた家畜化動物群から屠殺場で入手できる。組織又は器官は滅菌 的に取扱、組織又は器官をさらに解剖する場合はすべて、無菌状態で実施する。 非ヒト供給源からの、及びヒト受容者に使用するよう意図された移植片組織を 処理加工して、異種移植皮片又は異種移植組織を生成し得る。これは非ヒト組織 基質から生成され、本来の細胞及び他の抗原性成分を有さず、そして生育可能な ヒト細胞で集団形成される（populate）。このような免疫学的に耐容性の移植片 を生成するための方法の工程を、以下で説明する。 収集及び解剖後、抗菌剤、例えば抗細菌剤、抗真菌剤又は移植片組織と適合性 の殺菌剤を含有する滅菌栄養緩衝液中でインキュベートすることにより移植片組 織を滅菌する。 次に、後にさらに処理加工するために滅菌移植片組織を凍結保存するか、ある いは本方法の組織基質又は他の組織生成物の後期の凍結保存を含めて本方法の次 の工程にしたがって直ちに処理加工し得る。 脱細胞化（decellularization） 本発明の予備工程は、本来の生育可能な細胞、並びに他の細胞性及び非細胞性 構造物あるいは移植片受容者による悪免疫反応を引き出し得る成分の除去を必要 とする。 物理学的、化学的及び生化学的方法を含めた、組織及び器官中の本来の細胞の 生存能力を低減するいくつかの手段が公知である（例えば、米国特許第5,192,31 2 号参照。この記載内容は参照により本明細書中に含まれる）。このような方法 は本明細書に記載された方法に用い得る。しかし、使用する脱細胞化法により、 移植片組織の解剖学的構造が全般的に壊されたり、その構造要素の生体力学的特 性が実質的に変えられるといったことが起きてはならない。脱細胞化組織基質を 生成するための組織の処理は、受容者に関して同種異系又は自己由来の細胞を用 いたその後の基質の再集団形成に対して緩和する細胞毒性環境を残すべきではな い。受容者に関して同種異系である細胞及び組織は、受容者と同一種の供給者と ともに生じるものであるか、又はそれから得られるものである。自己由来細胞又 は組織は、受容者とともに生じるか、又は受容者から得られるものである。 物理学的力、例えば細胞内氷の形成を用いて、移植片組織を脱細胞化し得る。 例えば、無傷心臓弁の気相冷凍（遅い速度の温度下降）は、液相冷凍（急速）と 比較して、心臓弁小葉の細胞充実性を低減し得る。しかし、凍結保存剤の非存在 下での緩徐冷凍工程は、心臓弁導管のクラッキングのような組織破裂を引き起こ し得る。コロイド形成物質を凍結−解氷周期中に付加して、組織内の氷形成様式 を変える。ポリビニルピロリドン（10 % w/v）及び透析化ヒドロキシエチルデ ンプン（10 % w/v）を標準凍結保存溶液（ＤＭＥＭ，10% ＤＭＳＯ，10% ウシ 胎仔血清）に付加して、細胞内氷を形成させながら、細胞外氷形成を低減する。 これにより、コラゲナーゼ組織基質を氷による損傷から保護しながら脱細胞化を 測定できる。さらに、組織、特に心臓弁導管は、凍結保存剤の存在にかかわりな く、急速に冷凍されるとひびが入るということが注目される。 あるいは、生育可能な本来の細胞を移植片組織又は器官から除去するために種 々の酵素又は他の化学処理を用い得る。例えば、トリプシンのようなプロテアー ゼに細胞を長時間曝露すると、細胞死が引き起こされる。しかし、少なくとも一 部のＩ型コラーゲン分子がトリプシンを含めた種々のプロテアーゼに感受性であ るため、これは高機械的応力位置での移植片と意図されたコラーゲン性移植皮片 に対する選択のアプローチたり得ない。 異なる種類の洗剤、例えば非イオン洗剤、Triton X-100、及び陰イオン洗剤、 ドデシル硫酸ナトリウムの組合せは細胞膜を破裂させ、組織からの細胞屑の除去 を促進する。しかし、生育可能細胞による組織基質のその後の再集団形成が妨害 されないよう、組織基質中のあらゆる残留洗剤レベルを除去する工程がとられる べきである。 移植片組織の脱細胞化は、好ましくは移植片組織中の本来の細胞を溶解するの に有効な溶液の投与によって達成される。好ましくは、溶液は、本来の組織細胞 を有効に溶解するよう処方された水性低張又は低イオン強度溶液である。このよ うな水性低張溶液は、脱イオン化水又は水性低張緩衝液である。好ましくは水性 低張緩衝液は、細胞溶解の結果放出される選択プロテアーゼ、例えばコラゲナー ゼの活性に次善の条件を提供する添加剤を含有し得る。金属イオンキレート化剤 、例えば１，１０−フェナントロリン及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ） のような添加剤は多数のタンパク質分解酵素に好ましくない環境を作り出す。コ ラゲナーゼのようなプロテアーゼに次善の環境を提供することは、溶解工程中の 分解から組織基質を保護する助けとなる。特に、プロテアーゼに関する次善の条 件は、低張溶解溶液を処方して溶液中の利用可能なカルシウム及び亜鉛イオンを 除去するかその量を限定することにより達成し得る。多数のプロテアーゼはカル シウム及び亜鉛イオンの存在下で活性で、カルシウム及び亜鉛イオンを含まない 環境下ではその活性の大半を失う。 好ましくは、低張溶解液が本来の細胞を最適に溶解するがしかし下層にある組 織基質を悪タンパク質分解から保護するよう、pH、カルシウム及び亜鉛イオンの 利用可能性低減、金属イオンキレート化剤の存在及びコラゲナーゼに特異的なタ ンパク質分解性阻害剤、例 えばβ₁−抗コラゲナーゼの使用、の条件を選択して低張溶解溶液を調製する。 例えば、低張溶解液としては、カルシウム及び亜鉛イオンを含まない、そしてＥ ＤＴＡのような金属イオンキレート化剤を含有するpH 5.5〜8、好ましくはpH 7 〜8の水の緩衝化液が挙げられる。さらに、低張溶解液による組織基質の処理中 の温度及び時間パラメーターの制御を用いてプロテアーゼの活性を制限してもよ い。 組織基質の脱細胞化処理はさらに新規の免疫学的部位の生成を制限するのが好 ましい。コラーゲンは典型的には実質的に非免疫原性であるが、しかしコラーゲ ンの部分的酵素分解により免疫原性が増大され得る。したがって、本方法の好ま しい工程は、下層にあるコラーゲン基質を分解することなく細胞代謝、タンパク 質産生及び細胞***を阻害するのに有効な酵素、例えばヌクレアーゼによる組織 の処理を含む。本来の細胞ＤＮＡ及びＲＮＡの消化に用い得るヌクレアーゼとし ては、エキソヌクレアーゼとエンドヌクレアーゼとが挙げられる。本方法のこの 工程に用いるのに適した種々のものが市販されている。例えば細胞活性を有効に 阻害するエキソヌクレアーゼとしては、ＤＮＡアーゼ Ｉ（Sigma Chemical Com pany，St．Louis，MO）及びＲＮＡアーゼ Ａ（Sigma Chemical Company，St．L ouis，MO）が挙げられるし、細胞活性を有効に阻害するエンドヌクレアーゼとし ては、ＥｃｏＲ Ｉ（Sigma Chemical Company，St．Louis，MO）及びＨｉｎｄ ＩＩＩ（Sigma Chemical Company，St．Louis，MO）が挙げられる。 選択されるヌクレアーゼはヌクレアーゼの活性に最適なイオン、例えばマグネ シウム及びカルシウム塩を含有する生理学的緩衝液中に適用されるのが好ましい 。さらに、緩衝液のイオン濃度、処理温度及び処理時間は、所望のレベルの有効 ヌクレアーゼ活性を保証す るように選択されるのが好ましい。緩衝液は、好ましくは細胞内へのヌクレアー ゼの立ち入りを促進するために低張である。非ヒト心臓弁組織、特にブタ又はウ シ起源の弁の内因性内皮細胞の処理のためには、好ましくは組織をヌクレアーゼ ＤＮＡアーゼ Ｉ及びＲＮＡアーゼ Ａから成る生理学的緩衝液で処理する。好 ましくは、ヌクレアーゼ分解溶液は約0.1 μg／ml〜50μg／ml、好ましくは10μ g／mlのヌクレアーゼＤＮＡアーゼ Ｉ及び0.1 μg／ml〜10μｇ／ml、好ましく は1.0 μg／mlのＲＮＡアーゼ Ａを含有する。約20℃〜38℃、好ましくは約37 ℃の温度で約30分〜6時間、前述の適用により組織を脱細胞化するが、しかし同 時に、コラーゲン分解の結果としての新規の免疫学的部位の生成は制限する。 その他の酵素による消化も本明細書に用いるのに適しており、例えば移植組織 中の本来の細胞の機能を途絶させる酵素を用い得る。例えば、緩衝液中のホスホ リパーゼ、特にホスホリパーゼＡ又はＣを用いて、内因性細胞の細胞膜を粉砕す ることにより細胞機能を阻害し得る。好ましくは、使用する酵素は組織基質タン パク質に及ぼす有害な作用を有するべきでない。使用に適した酵素は細胞完全性 の阻害に関して選択され、その例としては細胞タンパク質産生を妨げる酵素が挙 げられる。ビヒクルのpH並びにビヒクルの組成は、使用するために選択される酵 素のpH活性プロフィールに関して調整される。さらに、組織への酵素の適用中の 温度は、酵素活性を最適にするために調整されるべきである。 選択された脱細胞化処理の後、その結果生じた組織基質を洗浄して細胞タンパ ク質、細胞脂質及び細胞核酸等の細胞屑、並びに細胞外屑、例えば細胞外可溶性 タンパク質、脂質及びプロテオグリカンを確実に除去した。この細胞性及び外細 胞性屑の除去により、移植時に移植片組織基質が受容者から悪免疫反応を引き出 す可能性が低 減される。例えば、ハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）のような平衡塩類溶液 中で組織をインキュベートし得る。平衡塩類洗浄液の組成、及びそれを移植片組 織基質に適用する条件は、脱細胞化工程中に用いられるヌクレアーゼ又は他の酵 素の活性を縮小又は除去するように選択される。このような平衡塩類洗浄液は、 好ましくはマグネシウム及びカルシウム塩を含有せず、洗浄工程は約２℃〜42℃ 、最も好ましくは４℃の温度でのインキュベーションを含む。移植片組織基質を 平衡塩類洗浄液中で10〜12日までの間インキュベートし、２又は３日目毎に洗浄 液を取り替える。任意に、抗細菌剤、抗真菌剤又は滅菌剤、あるいはその組合せ を平衡塩類洗浄液中に含入して環境病原体による汚染から移植片組織基質を保護 し得る。 本発明の方法により移植のために調製される組織が皮膚である場合、その後の in vitro細胞再集団形成の工程なしで脱細胞化組織基質を用い得る。脱細胞化さ れた及び実質的に非免疫原性の組織基質は、受容者への移植に適している。皮膚 組織基質の免疫原性低減は、受容者の免疫系による移植皮膚の耐容性を増大する 。次に、移植片受容者自身の細胞により移植片をin vivo再集団形成させる。皮 膚移植片として用いる前に、皮膚基質を処理して受容者自身の皮膚細胞の内方成 長及び付着を増強し得る。例えば、基質を付着因子又は成長因子、例えばケラチ ノサイト成長因子、あるいはその両方で処理して、ケラチノサイトの注入を増強 し得る。 上記にしたがって調製される組織基質はその本来の細胞を含有せず、さらに細 胞及び細胞外抗原成分は組織基質から洗い出されている。好ましくは、組織基質 は、コラーゲン基質における新規の免疫学的部位の生成を制限する方法で処理さ れている。しかしながら、組織基質は基質をさらに処理加工するための枠組みを 提供するのに必要な必須生体力学的強度を保持する。 本発明にしたがって処理加工される組織基質は、その後の使用のために凍結保 存される。脱細胞化移植片組織の凍結保存は、解氷時に本発明のその後の工程に よるさらなる処理の用意がなされているか、又は移植片組織生成物を提供するよ うに所望の場合にさらに処理加工される実質的に非免疫原性の組織基質の供給又 は目録を確保する。例えば、再集団形成中に用いられる特定の細胞が同定される 時まで、組織基質は目録に記入される。組織基質が、受容者由来の細胞又は特定 の受容者とのその免疫学的適合性に基づいて用いるために選択される他の細胞に より再集団形成されるものである場合には、これは特別な用途を有する。 本発明のあらゆる方法を施す前に、本来の移植片細胞を凍結保存し得ると考え られる。脱細胞化されない組織は、コラーゲン組織基質とともにその本来の細胞 を保持する。解氷時に、これらの組織をさらに処理加工し得る。無傷移植片組織 の凍結保存が、凍結保存により引き起こされる細胞死の結果としての組織の脱集 団形成の助けにもなるので有益である。 組織の凍結保存技術は、当業界で十分公知である。Brockbank，K.G.M．（Basi c Principles of Viable Tissue Preservation．「Transplantation Techniques and Use of Cryopreserved Allograft Cardiac Valves and Vascular Tissue」 D.R．Clarke(ed.)，Adams Publishing Group，Ltd.，Boston．pp 9-23）は組織 及び器官の凍結保存を考察している（この記載内容は参照により本明細書中に含 まれる）。 組織基質は、凍結保存されたか否かにかかわらず、次に同種異系又は自己由来 細胞の付着及び内方移動を増強するようin vitroで処理され、これを用いて移植 片組織を再集団形成する。 細胞付着 理論に縛られたくはないが、組織への細胞の付着を生じさせると考えられるい くつかの因子がある。例えば、繊維芽細胞の組織への付着は、本来の組織の細胞 膜と細胞外基質成分、例えば原繊維性及びシート形成コラーゲン、プロテオグリ カン、並びに糖タンパク質との間の相互作用を伴う。血清を用いずに培養したin vitro皮膚繊維芽細胞は、迅速に且つＩ及びＩＶ型コラーゲンと同様に付着する 。付着の程度は、培地への血清（ヒト又はウシ胎仔。１% 血清で最大結合）の添 加により、そして精製フィブロネクチンにより増大する。フィブロネクチンの２ つの相同サブユニットの各々は２つの細胞認識領域を有し、このうち最も重要な ものは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を有する。グリコサミノグリカ ンを結合する第二の部位は共働的に作用し、ＲＧＤ配列により媒介されるフィブ ロネクチン−細胞相互作用を安定化すると考えられる。ヘパリン硫酸はコンドロ イチン硫酸とともに、細胞表面で同定される２つのグリコサミノグリカンである 。ヘパリン硫酸は、内在性であるか又は膜に掛かっているコアタンパク質（シン デカン又はヒアルロネクチン）と結合する。細胞外基質糖タンパク質に関する細 胞結合部位はインテグリンと呼ばれ、これらは細胞と付着因子とのしっかりした 結合を媒介する。各付着因子は特殊化したインテグリンを有すると思われるが、 しかし単一のインテグリンはいくつかの細胞外基質因子と結合し得る。繊維芽細 胞は、無傷フィブロネクチン（細胞及びヘパリン結合ドメイン）と付着性である 場合、限局性付着を伴う収縮形態を示す。ヘパリン結合ドメインがない場合、繊 維芽細胞は拡がるが、限局性付着を発現できない。 したがって、因子の組合せが細胞が組織表面に結合できる割合を決定し得る。 これらの多数は繊維芽細胞生成物であるが、フィブロネクチンのようにいくつか は血清補充から得られる。これらの因子 が細胞に発現され、分泌される割合は、表面への細胞の付着に影響を及ぼし、繊 維芽細胞成長因子及び形質転換成長因子−βのようなサイトカインは、繊維芽細 胞コラーゲン及びフィブロネクチン産生の正の調節剤である。 細胞の組織への有効な付着は、細胞膜と対応する移植片組織に関連した細胞外 成分との相互作用により促進される、と考えられる。したがって、既定の細胞型 、及び使用するために選択される組織型に関しては、脱細胞化組織基質への細胞 付着を促す適切な処理としては、脱細胞化組織基質への細胞の付着を促すのに有 効な細胞外組織成分、特に細胞外タンパク質、例えば糖タンパク質及び／又はプ ロテオグリカン又はグリコサミノグリカンによる処理が挙げられる。したがって 、細胞による組織基質の再集団形成化に好ましい方法は、先ず、脱細胞化基質へ の再集団形成細胞の付着を促すのに有効な細胞付着因子で脱細胞化組織基質を処 理することにより実施する。 例えば、細胞外基質タンパク質、例えばフィブロネクチン及びグルコサミノグ リカンを含有する栄養溶液中で、再集団形成される移植片組織基質の表面へのフ ィブロネクチンの結合に有効な期間、脱細胞化組織基質をインキュベートする。 フィブロネクチン／グルコサミノグリカンとともに用いるのに好ましい緩衝液と しては、リン酸ナトリウム／グリセリン／ウシ血清アルブミン（ウシ胎仔血清， ＢＩＯ−ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）及びダルベッコの変法によるイーグル培地（ＤＭ ＥＭ），（GIBCO）が挙げられる。これらの緩衝液は、典型的には、約7.0〜7.6 の生理学的に許容可能なpHを提供するために使用する。細胞外基質タンパク質の 存在は、基質を再集団形成するために選択された細胞が付着する組織基質上の表 面を確立する。細胞外基質タンパク質を刺激すると、移植片における細胞再集 団形成が促される。 本明細書中で用いるのに好ましい細胞外基質タンパク質は、無傷分子形態のフ ィブロネクチン（ヒト血漿フィブロネクチン，UPSTATE Biotechnology，Inc．） である。この異種機能性糖タンパク質は、細胞外基質タンパク質、プロテオグリ カン及びある種の細胞型に対する親和性を有する。フィブロネクチン処理溶液は 、好ましくはグリコサミノグリカンヘパリン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン、 コンドロイチン硫酸、デルマチン、又はデルマチン硫酸のうちの１つであるプロ テオグリカンも含有する。グリコサミノグリカンはフィブロネクチンと組織基質 関連コラーゲンとの結合を促進し、安定化する、と考えられる。基質は、化学的 に架橋されないため、フィブロネクチンと相互作用し得るのが有益である。 フィブロネクチンの供給源は、ウイルスによる汚染を制限するために処理加工 されたヒト血液からである。好ましいグリコサミノグリカンはヘパリンである。 組織基質を処理するための付着因子として用いる糖タンパク質の濃度は、約１〜 100 μg／mlの範囲で、フィブロネクチン濃度は10μg／mlであるのが好ましい。 フィブロネクチン対ヘパリンの好ましい重量比は、フィブロネクチン約10部対グ リコサミノグリカン、例えばヘパリン約１部である。これはブタ心臓弁小葉の再 集団形成に最適であるが、しかし使用組織により約0.1：１〜約10：0.1の範囲で あってもよい。 好ましくは、溶液が、移植片組織基質がインキュベートされている栄養培地に 後に添加される成長因子と適合性であるように付着因子を含有する栄養溶液の成 分を選択する。これらの成長因子を用いて、細胞増殖及び組織基質の再集団形成 を促す。 細胞再集団形成（Cell Repoulation） 本発明の重要な一面は、脱細胞化移植片組織基質をin vitroで細 胞で再集団形成し得ることである。脱細胞化基質を再集団形成させるのに用いる 細胞は、意図された移植片受容者と同一種から培養された同種異系細胞であるか 、又は移植片受容者から培養された自己由来細胞である。いずれの場合も、異種 移植片又はキメラ移植片として公知の再集団形成化組織基質中の自己由来又は同 種異系細胞は、誘発する悪免疫反応が未処理加工異種移植片組織より少ない。 さらに、脱細胞化基質を再集団形成するのに用いる細胞は、特異的タンパク質 の産生を増強するよう遺伝子操作された細胞である、と考えられる。多数の組換 え体ＤＮＡ技術が、細胞代謝の変更、増強及び修正に関する業界で公知である。 再集団形成は、細胞増殖を、したがって組織基質の再集団形成を促すのに活性 な細胞及び成長因子を含有する栄養培地中で細胞付着因子で処理した組織基質を インキュベートすることにより達成し得る。本明細書中で用いるのに好ましい種 類の細胞は、繊維芽細胞である。 種々の物質を用いて細胞走化性を増強して、溶液中の物質の濃度勾配に沿って 指向性運動の速度を増大し得る。繊維芽細胞に関しては、繊維芽細胞成長因子、 血小板由来成長因子、形質転換成長因子−β、及び基質付着分子、原繊維性コラ ーゲン、コラーゲン断片並びにフィブロネクチンか繊維芽細胞にとって走化性で ある。細胞付着と対比して、繊維芽細胞移動は新規タンパク質合成を必要とする 。正常繊維芽細胞におけるタンパク質合成は、フィブロネクチンへの細胞の付着 により刺激され、したがって再集団形成中の細胞付着及び細胞移動の工程は相関 すると考えられる。 細胞移動は、組織基質を再集団形成する内部間隙性空間、並びに組織移植片基 質の表面を通って細胞を移動させる。 特定の移植片組織基質を完全に再集団形成するのに要する細胞の 数は、使用する組織の容積及び提供される細胞の種類に依る。しかしながら、繊 維芽細胞20,000〜125,000個／mlの濃度が、心臓弁小葉及び大動脈導管組織の適 切な適用範囲を提供し得る。 細胞増殖 組織基質の細胞再集団形成の工程は、好ましくは基質を再集団形成するのに用 いる培養細胞の増殖を促進するのに有効な成長因子の存在下で実施する。例えば 、繊維芽細胞を用いる場合、本明細書中で使用する成長因子は繊維芽細胞成長因 子（ＦＧＦ）であり、最も好ましくは塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（ ヒト組換え体ｂＦＧＦ，UPSTATE Biotechnology，Inc．）である。 繊維芽細胞成長因子（ヘパリン結合）は、間葉細胞で活性なマイトジェンの一 族である。ＦＧＦは状態調節培地中に無いことは検出されないが、その代わり、 ＦＧＦはヘパリン硫酸に関連して細胞外基質中に見出され、移植片組織基質と予 め結合したフィブロネクチン−ヘパリン層中に局在する。グリコサミノグリカン はＦＧＦ活性を安定化し、オートクリン／パラクリン成長を刺激する場合に細胞 表面受容体と結合するＦＧＦにとって必要である。 基質及び細胞は、好ましくは、正常弁機能に必要とされるように、再集団形成 工程中は継続的にｂＦＧＦに曝露されて、細胞複製及びコラーゲンタンパク質合 成の発現の刺激を提供する。成長因子を伴う基質の培養時間は、10〜21日の範囲 である。組織基質を処理するのに用いる成長因子の濃度は、100 ng/ml〜10μｇ/ mlの範囲であり、ｂＦＧＦに関する成長因子濃度は2.5μｇ/mlが好ましい。 移植片再集団形成細胞として繊維芽細胞を用いる場合、培地としては５〜15% の血清を添加したダルベッコの変法によるイーグル培地（GIBCO）が挙げられる 。自己由来受容者血清が好ましいが、しかし同種異系移植片心臓弁の移植の経験 からは、成長培地中にウシ 血清を用いると移植片受容者に悪い免疫学的結果を与えないことが示唆される。 血清及び再集団形成化細胞により状態調節した培地で細胞を連続刺激すると、組 織基質のより迅速な細胞再集団形成が引き起こされる。基質、細胞及び成長因子 を湿潤大気中で37℃でインキュベートするが、培養期間中は95% 空気及び５% Ｃ Ｏ₂ の混合物を用いる。 新鮮な組織と同様の間隙性組織知見を有する再集団形成化移植片を生成するの に十分な時間、移植片組織基質を培養する。細胞再集団形成過程の終了時、組織 は好ましくは新鮮な組織と同様の代謝パラメーターを示す。 細胞生存度 本発明の重要な一面は、移植片受容者に免疫学的に許容可能であるか又は実質 的に非免疫原性である他に、再集団形成化移植片組織が移植前に機能し、生育可 能であることである。細胞活性を測定するために種々の検定が存在し、本方法の 移植片組織にこれらの検定を適用すると、移植片組織を再集団形成化する細胞の 生存度をモニタリングし、定量化する方法が提供される。 移植片組織の意図された機能との関連を有する細胞活性を測定する検定を選択 するのが好ましい。例えば、コラーゲンの産生は、機能中の心臓弁を保持するに 際して重要である。心臓弁小葉では、産生される全タンパク質の５〜15%がコラ ーゲンである。そのうち、少なくとも75 %がＩ型コラーゲンである。したがって 、再集団形成化心臓弁の検定に際しては、細胞生存度の正確な測定値として再集 団形成細胞により産生された全コラーゲンに関して検定するのが好ましい。コラ ーゲン産生を測定することによる細胞活性の検定は、当業界では十分公知である 。細胞コラーゲン産生に関する検定を考察する参考文献の例としては、Buckley ，A．他.，1980 Collagen Metabolism.，「Methods of Enzymology」 163:674-69及びHayashi，T.及びNag ai，Y．1979．Separation of the α chains of Type I and III Collagens b y SDS-polyacrylamide Gel Electrophoresis，「Journal of Biochemistry」 8 6: 453-459が挙げられる（これらの記載内容は参照により本明細書中に含まれる ）。 細胞生存度を測定し得る他の検定が、本発明に用いるために意図される。〔³ Ｈ〕プロリンの取込みにより測定した場合の全タンパク質合成は、このような一 検定である。細胞生存度を測定するのに有用である別の検定としては、グルコー スの代謝に関する検定及びミトコンドリア活性に向けられる種々の検定が挙げら れる。 生育可能細胞を示す細胞機能を定量的に測定する検定を用いることが考えられ る。 機能分化 繊維芽細胞はほとんどの結合組織成分の産生に関与する。それらは異なる種類 のコラーゲンを合成し、表現型は特定の組織環境により課せられると思われる。 即ち、培養繊維芽細胞はそれらの元の部位によりコラーゲン型を合成する。繊維 芽細胞はさらに、種々のグルコサミノグリカン及びフィブロネクチン並びに成長 因子を産生する。それは、それらを、移植片組織基質を再集団形成化し、本明細 書に記載の雑種移植片を生成するための適切な細胞にする心臓弁小葉の基質中に 存在する割合でＩ、ＩＩＩ及びＶ型コラーゲンを合成する皮膚繊維芽細胞の能力 である。 特定の移植片を再集団形成するのに用いる細胞は広い限界内で変化し得るし、 移植片の機能、置換又は増大される組織の性質、受容者のアレルギー感受性、並 びにその他の因子に依って、異なる環境においては異なる種類の細胞を用い得る 。 本発明の好ましい実施態様は、本明細書中に記載の方法に自己由 来細胞を使用する。組織標本は、移植手術前に受容者から採取する。組織を以下 の明細書中に記載の方法にしたがって処理して、繊維芽細胞又は他の細胞を生成 し、次にこれを用いて、本方法にしたがって同種異系又は異種移植組織基質を再 集団形成する。受容者から採取した切除組織から得られる細胞で予め調製した脱 細胞化及び処理済移植片組織基質を再集団形成することにより、悪免疫系反応及 び最後に移植片拒絶の可能性を最小にするか又は回避し得る。 細胞供給源は、移植される組織に適合するよう選択し得る。例えば、血管が移 植されるものである場合、細胞は受容者の健常血管から採取し、移植片再集団形 成のための細胞の供給源として用い得る。この方法で、健常移植片は非常にぴっ たりと受容者の罹患組織に適合し得る。 本発明のこの一面は、例えば移植可能な血管に関して移植片受容者が高アレル ギー性であるか、又は組織が高免疫原性である場合には、特に有用である。 あるいは、移植片に及ぼす許容不可能な免疫反応を引き起こすとは思えない同 種異系細胞株を用いて組織基質を再集団形成し得る。弱い又は耐容性のアレルギ ー反応を示すだけの細胞を用いて実質的に非免疫原性の移植片を提供し得る。こ れらの細胞は天然弱免疫原性であるか、又は組換え体細胞技術により弱免疫原性 であるよう意図され得る。 繊維芽細胞の単離方法 繊維芽細胞リンク、例えば皮膚（臀部、大腿又は背中）、又は心臓弁小葉を提 供するために用いられる組織を滅菌的に回収し、緩衝栄養培地中で処理装置に提 供する。滅菌解剖技術を用いて組織を１mm³ 片に切断する。次いで10片の群を、 組織を湿らせるには十分であるが片を浮かせない限定量の培地（ＤＭＥＭ＋10% ウシ胎仔血清 ）を入れた35mm組織培養皿に入れる。５ %ＣＯ₂を含む大気中の湿潤培養インキ ュベーター中で37℃で１週間インキュベートする。インキュベーション１週間後 に、組織の各片を繊維芽細胞が密に自然に成長して取り囲む。上皮細胞も存在し 得るが、その後の細胞培養中には失われる。細胞をカルシウム及びマグネシウム 無含有滅菌緩衝塩溶液で洗浄後に標準トリプシン消化により繊維芽細胞を取り出 し、新鮮な培地を含入する大型細胞培養容器に入れた。細胞培養をこの方法で拡 大し得る。一フラスコの内容物を分けて、３つの大型容器中に入れ、この工程を 週に約１回繰り返す。これらのフラスコから回収した細胞を、再集団形成細胞の 供給源として用い得る。この方法で得られる細胞は、ほとんどの細胞株が表現型 的に変えられて、成長調節剤（例えばｂＦＧＦ）に対して正常の方法ではもはや 反応しないため、市販細胞株よりはましである。さらにほとんどの市販細胞株は 天然の量及び割合の重要タンパク質生成物（例えばコラーゲン）を産生しない。 本発明の好ましい実施態様は、本来の細胞及び可溶性タンパク質を除去するた めに処理される異種移植片を包含し、異種移植片を再集団形成するのに用いられ る細胞に対して非毒性であるよう、そして最終的異種移植片組織基質を生体力学 的に健全且つ無傷にさせるよう条件を選択する。次いで、脱集団形成化異種移植 片組織基質を細胞外基質糖タンパク質因子及びグリコサミノグリカンで処理する 。その後、異種移植片を成長因子及びグリコサミノグリカンで処理して、移植片 に付着する外因性細胞とともにインキュベートする。これらの外因性細胞は移植 片中に移動し、移植片内で増殖して、必須タンパク質及び移植片の機能にとって 重要な他の因子を発現する。再集団形成異種移植片は再集団形成細胞により生物 学的に機能的にさせると、未処理異種移植片又は化学的固定異種移植片と比較し て、免疫原性の低減又は最小免疫原性を示す。抗原性低減は、組織の初期脱集団 形成中の異種抗原又は同種異系抗原の除去の結果であり、受容者に異物と認識さ れない再集団形成細胞の存在による。これらのキメラ移植片は、組織の獲得中の 又は組織の脱細胞化中の細胞死の結果形成される細胞屑が洗浄レジメンにより除 去されるため、石灰化傾向の低減を示すべきである。これらのキメラ移植片は上 記手順の結果として細胞の裏打ち層を保持するため、血栓及び微小塞栓の形成傾 向も、機械的構造物、精製生物学的分子から作られる構造物及び化学的固定化生 体プロテーゼ組織と比較して、低減されるべきである。例 例１．低張溶解／ヌクレアーゼ消化手法によるブタ大動脈弁小葉、大動脈導管 及び関連心筋の脱集団形成化 組織構造に及ぼす非制御性細胞分解の作用を限定するために、屠殺の２時間以 内にブタ心臓を採取して、ＤＭＥＭの滅菌溶液中で４℃で処理加工施設に戻した 。大動脈心臓弁を滅菌条件下で切除し、５% ＣＯ₂ 大気中で栄養培地中で37℃で 16時間、抗生物質混合物中でインキュベートし、10% ＤＭＳＯ及び10%ウ シ胎仔 血清を含有するＤＭＥＭ中で凍結保存（冷却速度＝−１℃／分）した。−179℃ で保存後、弁を37℃で急速解氷した。小葉、大動脈導管及び心筋を弁から切り離 し、細分した各種類の組織を後の組織学的分析用に10% ホルマリン緩衝液中に直 接入れるか、又は脱集団形成用に処理加工した。室温で各々15分間３回、乳酸化 リンガー−５% デキストロース溶液中で洗浄後、組織を18 MQ 水中で室温で２時 間インキュベートし、その後、３mMマグネシウム及び１mMカルシウム塩を含有す る10mM Tris-Cl，pH7.6に溶解した10μg／ml ＤＮＡアーゼ Ｉ及び１μg／ml ＲＮＡアーゼ Ａ中で37℃で120分間消化した。 溶解処理後、組織をＤＭＥＭ−５% ＦＢＳ中で８日間インキュベートした。こ の時点で、処理組織をホルマリン中で固定した。全固定組織をパラフィンに封入 して、切片を作製し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色して、細胞を目に見え るようにした。図１の代表的顕微鏡写真は、繊維性及び心室表面の内皮層並びに 組織全体に認められる繊維芽細胞を有する新鮮な大動脈小葉の細胞充実性を示す 。図２ａ及び２ｂは、本質的に無細胞外見を有する脱集団形成後のそれぞれ肺動 脈弁導管及び心筋の顕微鏡写真を示す。 例２．ウシ皮膚繊維芽細胞による脱集団形成化ブタ大動脈弁小葉の再集団形成 ブタ大動脈小葉を回収し、例１に記載したように脱集団形成した。ＮａＨ₂Ｐ Ｏ₄／グリセリン／ＢＳＡ緩衝液 ５ml中で37℃で、小葉をインキュベートした 。１μg／mlヘパリンとともに16時間、ヒト血漿フィブロネクチンを緩衝液に添 加して10μg／mlの濃度とし、その後、0.83μg／mlヘパリンとともにさらに６時 間、ヒト組換え体ｂＦＧＦを添加して濃度を2.5μg／mlとした。このインキュベ ーション後、標準外植片培養技術により予め単離したウシ皮膚繊維芽細胞を２x 10⁴細胞／mlで心臓弁小葉に添加した。小葉及び細胞を11日間インキュベートし た。インキュベーション後、組織学的分析のために弁切片をホルマリン中に入れ た。図３ａは、脱細胞化大動脈小葉の代表的顕微鏡写真である。図３ｂは、フィ ブロネクチンとｂＦＧＦで処理した脱細胞化大動脈小葉の代表的顕微鏡写真で、 外因性繊維芽細胞による再集団形成を示す。 例３．新鮮組織及び脱集団形成化組織と比較した場合の再集団形成化組織にお ける繊維芽細胞の生化学的活性 例１と同様にブタ大動脈心臓弁小葉を脱集団形成し、例２の技法にしたがって ヒツジ皮膚繊維芽細胞の２つの異なる単離物で再集団形成した。再集団形成後10 日目に、小葉を新鮮な容器に移して、ゲンタミシンを含有するＤＭＥＭに溶解し た1.0 μCi/ml〔³ Ｈ〕プロリン、及び50μg／mlアスコルビン酸、50μg／ml β−アミノプロピオニトリル中で48時間インキュベートした。合成された全タン パク質を10% トリクロロ酢酸により測定し、培地から沈降放射能を回収し、組織 抽出物をＮ−エチルマレイミド中に10mM、ＥＤＴＡ中に25mM、フッ化フェニルメ チルスルホニル中に10mMにして、タンパク質分解を防止し、非特異的プロテアー ゼ活性を有さないクロストリジウム属のコラゲナーゼで消化することにより沈降 タンパク質をさらに分析して、コラーゲン含量を明示した。図４に示されたよう に、脱集団形成された組織の活性はゼロであった。再集団形成後、〔³ Ｈ〕プロ リン取込みにより、有意のタンパク質合成を検出した。これは新鮮なブタ組織中 で確定されたものと同率で合成された。コラーゲンは全タンパク質合成の3.6%を 示し、このほとんどが培地中に分泌された。これらの結果は、本発明の好ましい 実施態様に記載の脱集団形成手法により処理されるようにしたブタ小葉が概して タンパク質合成能力を示さず、特にコラーゲン合成を示さないことを示す。再集 団形成手法が首尾よく使えたことは、再集団形成中の外因性繊維芽細胞を提供す ることによりタンパク質合成の細胞機能を脱集団形成化小葉に付与する能力によ って示される。 例４．ウサギに注入した脱集団形成化ブタ小葉抽出物の体液性免疫反応低減の 実例 例１に記載の手法により、細胞及び可溶性タンパク質の除去をおこなった。凍 結保存した生育可能小葉と比較して、脱集団形成化小葉の免疫学的結果を調べた 。体液性免疫反応試験の結果を図５に示 す。抗体捕獲法を用いて体液性免疫反応を検定した。この場合、未修飾凍結保存 小葉の0.1M ＮａＣｌに溶解した抗原抽出物を用いて、修飾細胞脱集団形成化小 葉又は対照小葉のＮａＣｌ抽出物で免疫化したウサギからの血清をスクリーニン グした。50 %（v/v）完全フロイントアジュバント中にこのような抽出物の乳濁 液を作った。これらの乳濁液の0.1ml部分を、別々のニュージーランドホワイト ウサギの雄の背中に沿った10箇所の皮内部位に入れた。２週間後、不完全フロイ ントアジュバント中に乳濁させた凍結保存又は脱集団形成化小葉の別の抽出物で 動物を再試験した。1.5 ヶ月後、動物を採血した。免疫血清を調製し、アルカリ 性ホスファターゼと抱合させたヤギ抗ウサギＩg Ｇ及びヤギ抗ウサギＩg Ｍ抗血 清を用いてＩg Ｇ及びＩg Ｍ抗体の両方に関してスクリーニングした。図５では 、脱集団形成化組織受容者からの血清は、凍結保存小葉抽出物で免疫化したウサ ギで観察された反応の−50% のイムノグロブリンＧ反応及び＜５% のＩg Ｍ反応 を示した。これらの知見は、本発明の好ましい実施態様に記載の技法により脱集 団形成した組織に対する体液性免疫反応の減衰を示す。 例５．ウサギに移植した脱集団形成化ブタ小葉に対する細胞免疫及び炎症反応 低減の実例 例１に記載の手法により、細胞及び可溶性タンパク質の除去をおこなった。脱 集団形成化（無細胞性）及び凍結保存（細胞性）ブタ大動脈弁小葉の細分片を、 ニュージーランドホワイトウサギの雄の背部肘下に形成された嚢に挿入した。嚢 を閉じて、２週間後に移植片及び周囲組織（皮膚〜筋肉）を外科的に回収し、ヘ マトキシリン及びエオシンでパラフィン包埋切片を染色後に組織病理学的分析用 にホルマリン中に固定した。図６は、脱集団形成化小葉が凍結保存対照と比較し て最小細胞反応を引き起こしたことを示す。内皮細胞 層並びに繊維芽細胞の両方を含有する凍結保存組織は、移植片領域並びに移植片 それ自体の内部での多数の異種親和球、リンパ球及び形質細胞との有意の免疫及 び炎症細胞反応を刺激した。脱集団形成化組織移植片では、炎症及び免疫細胞は 少数で、分布が限定されていた。 例６．ヒト受容者におけるブタ組織の超過敏性拒絶に関与する抗原の除去の実 例 例１に記載の手法により、ブタ大動脈心臓弁小葉及び大動脈導管からの細胞及 び可溶性タンパク質の除去をおこなった。これらの組織、並びに新鮮な及び凍結 保存したブタ大動脈心臓弁からのその等価物を凍結切片封入液中の液体窒素中で 新鮮凍結させ、８〜10μｍの切片に切断し、電荷修飾ガラススライド上に載せた 。４℃アセトン中で固定後、ブタ細胞の膜上に見出される特異的ガラクトース− α１，３−ガラクトース修飾タンパク質と結合するビオチン−抱合Bandeiraea s implicifoliaレクチン−Ｉで組織をプローブした。これらの修飾タンパク質は、 霊長類（ヒトを含む）におけるブタ組織の超過敏拒絶反応を起こす予め形成され た天然抗ブタ抗体の結合部位である。その後、切片をビオチン抱合ホースラディ シュペルオキシダーゼーアビジン混合物、過酸化水素及び３，３’−ジアミノベ ンジジンと反応させて、このレクチンを結合するタンパク質を検出した。ブタ抗 原の存在は、発色により検出した。図７ａでは、切片の顕微鏡写真分析から、凍 結保存大動脈小葉中の細胞関連抗原が立証される。図７ｂは、大動脈小葉の脱細 胞化後の抗原結合の顕著な減少を示す。この試験は、本発明の好ましい実施態様 に示したような脱集団形成手法がヒト受容者によるブタ移植片の拒絶を引き起こ すと思われる重要な抗原を低減することを示す。 例７．脱集団形成化ブタ大動脈心臓弁小葉の生体力学的特性−応 力−歪み分析 新鮮な状態で採取したブタ大動脈心臓弁を抗生物質混合物で滅菌し、細胞生育 可能性を保持する条件下で凍結保存した。脱集団形成のために、大動脈弁を37℃ で急速解氷し、次いで低張溶液、ヌクレアーゼ及び平衡塩類溶液で10日間処理し た。生体力学試験のために、小葉を円周又は放射状ストリップに切り出し、較正 クランプ圧下でInstron 1011型 Materials Tester上に載せた。試験中、組織は 37℃又は４℃のハンクスの平衡塩類溶液中に浸した。標準寸法を測定し、20回の 予備条件調節周期（円周ストリップに関しては100 g負荷、放射ストリップに関 しては180 g）を経た後、各検体を以下のように試験した： １）１回負荷対延長試験。その結果を図８に示す。放射ストリップは、全条件 下で円周ストリップより伸展性であった。組織係数はいかなる処理の影響も受け なかったが、脱集団形成化放射ストリップは新鮮組織より有意に伸展性であった （113 ±11.8 対 85.9 ±8.6mm/mm）； ２）応力緩和試験。この結果は図９に示す。円周及び放射ストリップに関して は、元の応力の約10% が最初の10秒で消失する。全体的に、応力損失速度は、概 して放射ストリップで大きく、凍結保存放射ストリップで最も速かった。試験終 了時に、37℃脱集団形成化円周ストリップに残存する応力は、新鮮組織よりも有 意に大きかった。放射ストリップにおいては有意差は認められなかった； ３）引っ張り失敗試験。この結果は図１０に示す。各条件に関して、放射スト リップより円周ストリップが強く、堅く、且つ頑丈であった。凍結保存及び脱集 団形成は、円周方向に測定したこれらのパラメーターに影響を及ぼさなかった。 どちらかの温度で脱集団形成された組織から切り出した放射ストリップは、新鮮 組織と比較し てより頑丈であることを示した。 本明細書に含まれた説明は、本発明の好ましい実施態様を含有する。しかし、 多数の代替的実施態様が本発明の範囲内に含まれるものとする。教示及び例によ り、本発明の重要な特徴が実証される：即ち、１）ヒトにおける移植可能な移植 片として有用だと思われる組織からの異種移植細胞及び細胞膜の除去（組織学的 及び生化学的分析により示される）；２）細胞外基質糖タンパク質、グリコサミ ノグリカン及び成長因子の影響下で、移植片の受容者から得られる可能性のある 無細胞組織を外因性細胞で再集団形成し得る；３）安定移植片物質としてそれ自 体用いられる凍結保存組織と同様の生体力学的特性の保持；４）脱集団形成手法 の結果、受容者における炎症並びに細胞性及び体液性免疫反応を刺激する脱集団 形成化組織の傾向が低減される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ， ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．移植片組織の生成方法であって、 Ａ．組織から本来の細胞及び他の細胞外組織成分を除去して組織基質を提供し ； Ｂ．組織基質を細胞付着因子で処理して組織基質の表面への培養同種異系又は 自己由来細胞のその後の付着を促進し；及び Ｃ．培養同種異系又は自己由来細胞により組織基質を再集団形成する 工程を含んでなる方法。 ２．移植変組織が天然コラーゲン組織、心臓弁組織、結合組織又は血管から生 成される請求項１記載の方法。 ３．心臓弁組織が肺動脈又は大動脈心臓弁組織である請求項２記載の方法。 ４．移植片が非ヒト起源の組織を処理することにより生成される請求項１記載 の方法であって、組織基質を再集団形成するために用いる細胞がヒト起源のもの であり、生成される組織が移植時に実質的に非免疫原性である方法。 ５．繊維芽細胞及び繊維芽細胞成長因子の存在下で組織基質をインキュベート することにより組織が再集団形成される請求項４記載の方法。 ６．繊維芽細胞が同種異系細胞である請求項５記載の方法。 ７．繊維芽細胞が安定な細胞系統から得られる請求項５記載の方法。 ８．繊維芽細胞が外因性遺伝物質を用いた安定トランスフェクションの技術に より遺伝子的に修飾される請求項５記載の方法。 ９．繊維芽細胞がヒト起源のものであって、組織移植片の受容者 に対して実質的に非免疫原性であるように修飾される請求項５記載の方法。 10．繊維芽細胞がヒト起源のものであって、特定のタンパク質を発現するよう 修飾される請求項５記載の方法。 11．細胞を溶解するのに有効な溶液で組織を処理することにより本来の細胞が 除去される請求項１記載の方法。 12．組織基質を脱細胞化し、限定的免疫原性を有する組織基質を提供するのに 有効な酵素ヌクレアーゼでの組織の処理をさらに包含する請求項１１記載の方法 。 13．ＲＮＡアーゼ Ａ、ＤＮＡアーゼ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩ から成る群から選択されるヌクレアーゼで組織を処理する請求項１２記載の方法 。 14．工程（Ａ）が本来の細胞を除去し、限定的免疫原性を有する組織基質を提 供するのに有効な低イオン強度溶液並びにＤＮＡアーゼ Ｉ及びＲＮＡアーゼ Ａで組織を処理することを包含し、細胞屑、可溶性タンパク質及びその他の物質 が組織を洗浄することにより除去されて移植片受容者に関して抗原性である本来 の組織成分を実質的に含まない組織基質を提供する請求項１記載の方法。 15．組織基質を細胞再集団形成工程中の組織基質への細胞の付着を促進するの に有効な糖タンパク質及びグリコサミノグリカンを含む細胞付着因子で処理する 請求項１記載の方法。 16.再集団形成工程（Ｃ）中の組織基質への細胞付着を促進するのに有効な本 来の組織と通常は関連する１つ又はそれ以上の細胞外タンパク質を含む細胞付着 因子で組織基質を処理する請求項１記載の方法。 17．グリコサミノグリカンがヘパリン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン、コン ドロイチン硫酸、デルマチン又はデルマチン硫酸であ り、そして糖タンパク質がフィブロネクチンである請求項１５記載の方法。 18．本来の組織がブタ起源の心臓弁組織である請求項１６記載の方法。 19．同種異系又は自己由来繊維芽細胞及び繊維芽細胞成長因子の存在下で工程 （Ｂ）にしたがって処理された組織基質をインキュベートして弁組織基質を再集 団形成して、上記繊維芽細胞により再集団形成化され且つ再活力付与され、移植 時に実質的に非免疫原性である異種弁移植片を提供する請求項１８記載の方法。 20．本来の組織細胞を除去し、酵素、ヌクレアーゼ又はヌクレアーゼＤＮＡア ーゼ Ｉ及びＲＮＡアーゼ Ａで処理することにより弁組織基質を調製して組織 基質を提供する請求項１９記載の方法。 21．移植片組織が同種異系又は異種移植片組織である請求項１記載の方法。 22．本来の組織の供給源の種とは異なる種の移植片受容者の免疫系とのその適 合性を改良するための異種移植組織の処理方法であって、組織基質への培養細胞 のその後の付着を促進するのに有効な多量の細胞接着因子、ここで、細胞付着因 子は液体ビヒクル中に本来の組織と通常は関連する１つ又はそれ以上の細胞外タ ンパク質を包含する、を脱細胞化組織基質に適用し、次いで自原性又は同種異系 細胞で組織基質を再集団形成して細胞再集団形成により生命力を付与され、対応 する天然組織と組織学的及び生化学的に同様である実質的に非免疫原性且つ生体 力学的に許容可能な移植片又は移植皮片を提供する工程から成る方法。 23．処理した本来の組織が結合組織、心臓組織あるいはコラーゲン性又は血管 性組織である請求項２２記載の方法。 24．付着因子が糖タンパク質及びグリコサミノグリカンを包含す る請求項２３記載の方法。 25．組織基質が移植片受容者と免疫学的に適合性である繊維芽細胞で再集団形 成される請求項２４記載の方法。 26．繊維芽細胞が外因性遺伝物質を用いた安定トランスフェクションの技術に より遺伝子的に修飾される請求項２４記載の方法。 27．繊維芽細胞がヒト起源のものであって、移植時に実質的に非免疫原性であ るよう修飾される請求項２４記載の方法。 28．繊維芽細胞がヒト起源のものであって、特定のタンパク質を発現するよう に修飾される請求項２４記載の方法。 29．付着因子がフィブロネクチン、並びにデルマチン、デルマチン硫酸、コン ドロイチン、コンドロイチン硫酸、ヘパリン硫酸及びヘパリンから成る群から選 択されるグルコサミノグリカンで構成される請求項２５記載の方法。 30．本来の組織がブタ心臓弁組織であって、細胞再集団形成工程が栄養分を含 む環境下で繊維芽細胞及び有効量の繊維芽細胞成長因子の存在下で組織基質をイ ンキュベートすることにより実施される請求項２９記載の方法。 31．非ヒトコラーゲン組織、結合組織又は血管組織からの異種移植片又は移植 皮片の生成方法であって、天然組織が脱細胞化され、細胞及び／又は細胞外抗原 を除去するために洗浄されて、その後移植片又は移植皮片受容者に免疫学的に許 容可能な繊維芽細胞のそれへの付着を促進するのに有効なフィブロネクチン及び ヘパリンから成る付着因子で組織基質を処理する方法であり、このような細胞再 集団形成が対応する天然組織と組織学的に同様の生命力を付与された組織を提供 するまで付着因子で処理した組織基質を繊維芽細胞及び繊維芽細胞成長因子の存 在下で基質をインキュベートすることにより再集団形成させ、生成した移植片組 織が機械的、生化学的及び 免疫学的に移植に適している方法。 32．フィブロネクチンがヒト血漿フィブロネクチン又はヒト組織フィブロネク チンを包含する請求項３１記載の方法。 33．組織がコラーゲン組織である請求項３２記載の方法。 34．組織が結合組織である請求項３２記載の方法。 35．繊維芽細胞が培養ヒト繊維芽細胞である請求項３３記載の方法。 36．本来の組織が心臓弁組織であって、再集団化細胞がヒト繊維芽細胞である 請求項３５記載の方法。 37．細胞再集団形成工程の前の段階で組織基質を凍結保存する工程をさらに包 含する請求項３１記載の方法。 38．新規の免疫学的部位の生成を制限するようにヌクレアーゼでの処理を含む 処理により本来の組織が脱細胞化される請求項３４記載の方法。 39．ヘパリンが組織基質の位置にフィブロネクチンを付着させ、塩基性ヒト組 換え体繊維芽細胞成長因子が用いられる請求項３１記載の方法。 40．組織基質が大動脈又は肺動脈心臓弁組織である請求項３９記載の方法。 41．繊維芽細胞が自原性細胞である請求項３１記載の方法。 42．繊維芽細胞が同種異系細胞である請求項３１記載の方法。 43．繊維芽細胞が安定細胞系統から得られる請求項３１記載の方法。 44．繊維芽細胞が外因性遺伝物質を用いた安定トランスフェクションの技術に より遺伝子的に修飾される請求項３１記載の方法。 45．繊維芽細胞がヒト起源のものであって、移植時に実質的に非免疫原性であ るよう修飾される請求項３１記載の方法。 46．繊維芽細胞がヒト起源のものであって、特定のタンパク質を発現するよう に修飾される請求項３１記載の方法。 47．組織がブタ又はウシ起源のものであり、付着基質因子が精製フィブロネク チン及びヘパリンを包含する請求項３１記載の方法であって、再集団形成細胞が 有効量の塩基性又は酸性繊維芽細胞成長因子の存在下でのヒト繊維芽細胞であり 、生成された移植片組織がヒトへの移植時に悪免疫反応を実質的に示さない異種 移植片である方法。 48．組織基質調製工程が低イオン強度溶液及びヌクレアーゼで組織を処理する ことを包含する請求項３１記載の方法。 49．ヌクレアーゼの低イオン強度溶液がＲＮＡアーゼ Ａ、ＤＮＡアーゼ Ｉ 、ＥｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ群の少なくとも１員を含有する請求項４８ 記載の方法。 50．移植片組織が非ヒト起源のものであり、コラーゲン組織から成る群から選 択され、組織が脱細胞化され、本来の細胞を除去し、限定的免疫原性を有する組 織基質を提供するのに有効な低イオン強度溶液及びＤＮＡアーゼＩ及びＲＮＡア ーゼＡで処理され、組織基質がそこに繊維芽細胞が付着するのを促進する組織基 質と関連する部位を提供するのに有効な量の、フィブロネクチン及びヘパリン硫 酸を含有する緩衝液で処理される請求項３１記載の方法であって、細胞増殖及び 繊維芽細胞による組織基質の再集団形成を促進するのに有効な量の繊維芽細胞成 長因子の存在下でヒト起源の繊維芽細胞と一緒にインキュベートすることにより 組織基質を再集団形成する方法。 51．移植組織がブタ心臓弁組織である請求項５０記載の方法。 52．繊維芽細胞が自原性である請求項５０記載の方法。 53．繊維芽細胞が同種異系である請求項５０記載の方法。 54．本来の細胞を除去する工程を含む移植片組織へのその後の処理加工に適し た実質的に非免疫原性組織基質の生成方法であって、処理組織中でのその後の本 来の細胞の増殖を阻害するのに有効な且つ組織中の新規の免疫学的部位の生成を 制限するのに有効な酵素及びヌクレアーゼから成る群から選択される成分で組織 を処理することを包含する方法。 。 55．組織基質を脱細胞化して限定的免疫原性を有する組織基質を提供するのに 有効な低イオン強度溶液で組織を処理する請求項５４記載の方法。 56．ヌクレアーゼの低イオン強度溶液がＲＮＡアーゼ Ａ、ＤＮＡアーゼ Ｉ 、ＥｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ群の少なくとも１員を含有する請求項５５ 記載の方法。 57．使用するヌクレアーゼがリボヌクレアーゼＡ及びデオキシリボヌクレアー ゼＩである請求項５５記載の方法。 58．さらに処理加工する前に組織基質を凍結保存することをさらに包含する請 求項５４記載の方法。 59．さらに処理加工する前に組織基質を凍結保存することをさらに包含する請 求項５５記載の方法。 60．組織又は組織基質あるいは両方を滅菌することをさらに包含する請求項５ ９記載の方法。 61．請求項５３に記載の処理の前に、天然哺乳類組織を採取し、組織を凍結保 存し、次いで凍結保存から組織を取り出すことを包含する方法。 62．組織基質がブタ心臓弁起源のものである請求項６１記載の方法。 63．心臓弁が肺動脈又は大動脈心臓弁である請求項６２記載の方法。 64．上記脱細胞化が低張水性溶液での処理を包含する請求項５４記載の方法。 65．上記低張水性溶液が細胞溶解を引き起こすのに有効な水性緩衝液である請 求項６４記載の方法。 66．組織がブタ心臓弁組織である請求項６５記載の方法。 67．心臓弁が肺動脈又は大動脈心臓弁である請求項６６記載の方法。 68．生成したブタ心臓弁基質を凍結保存する工程をさらに包含する請求項６７ 記載の方法。 69．ヒト又は哺乳類受容者における移植に組織学的及び免疫学的に適したブタ 又はウシ弁組織からの異種移植心臓弁の生成方法であって、 Ａ．本来の弁組織を脱細胞化して本来の細胞抗原を実質的に有しない基質を提 供し、新規の免疫学的部位の発生を制限するよう処理し； Ｂ．繊維芽細胞の基質への付着を促進するのに有効な天然組織と通常は関連す る１つ又はそれ以上の細胞外タンパク質を含む付着因子を弁組織基質に適用し、 移植片受容者に免疫学的に許容可能な繊維芽細胞成長因子の存在下で同種異系又 は自己由来繊維芽細胞で弁組織基質を再集団形成化して生命力付与された弁組織 を提供する工程を含んで成る方法。 70．心臓弁が肺動脈又は大動脈心臓弁である請求項６９記載の方法。 71．ヒトにおける使用に適した移植皮片又は心臓弁移植片の生成方法であって 、 Ａ．本来の組織を脱細胞化し、それを組織基質を脱細胞化するのに有効な酵素 又はヌクレアーゼで処理して限定的免疫原性を有する組織基質を提供し； Ｂ．有効量のヒト血漿フィブロネクチン及びヘパリンを弁組織基質に適用して 同種異系又は自己由来繊維芽細胞の細胞付着を促進し； Ｃ．培養ヒト繊維芽細胞及びヒト組換え体繊維芽細胞成長因子を含む栄養培地 中で弁基質をインキュベートすることにより繊維芽細胞で弁組織基質を再集団形 成する 工程を含んで成る方法。 72．心臓弁が肺動脈又は大動脈心臓弁である請求項７１記載の方法。 73．工程Ａが本来の組織の溶解及びＲＮＡアーゼ Ａ及びＤＮＡアーゼ Ｉで の処理の工程を包含する請求項７１記載の方法。 74．繊維芽細胞が自己由来細胞である請求項７３記載の方法。 75．付着因子を含有する栄養培地中に組織基質を入れることにより付着因子を 適用し、その後繊維芽細胞及び繊維芽細胞成長因子を用いて、有効量でそれらを 組織基質を含有する栄養培地に添加することにより基質を再集団形成する請求項 ７３記載の方法。 76．繊維芽細胞が同種異系である請求項７３記載の方法。 77．繊維芽細胞が自己由来性である請求項７３記載の方法。 78．さらに処理加工する前に組織基質を凍結保存する工程をさらに包含する請 求項７３記載の方法。 79．繊維芽細胞が安定細胞系統から得られる請求項７１記載の方法。 80．外因性遺伝物質を用いた安定トランスフェクションの技術により繊維芽細 胞が遺伝子的に修飾される請求項７１記載の方法。 81．繊維芽細胞がヒト起源のものであって、移植時に実質的に非免疫原性であ るよう修飾される請求項７１記載の方法。 82．繊維芽細胞がヒト起源のものであって、特定のタンパク質を発現するよう 修飾される請求項７１記載の方法。 83．請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法により生成される移植片組織 生成物。 84．請求項５４〜６８のいずれか１項に記載の方法により生成される組織基質 。 85．請求項７３に記載の方法により生成される異種移植弁。 86．弁組織が心臓弁小葉、弁に関連した心筋組織、弁の下流側に延びる大動脈 導管又は心房に延びる弁の根である請求項１記載の方法。