ES2219660T3 - Metodos de preparacion de tejidos para implantacion. - Google Patents
Metodos de preparacion de tejidos para implantacion.Info
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Abstract
ESTA MEMORIA DESCRIPTIVA INCLUYE UN PROCEDIMIENTO PARA GENERAR UNA BIOPROTESIS HIBRIDA FUNCIONAL. SE TRATA TEJIDO FORMADO DE MANERA NATURAL A PARTIR DE COLAGENOS INTERSTICIALES PARA DESTRUIR LAS CELULAS NATIVAS, Y PARA ELIMINAR LAS MOLECULAS SOLUBLES POTENCIALMENTE ACTIVAS DESDE EL PUNTO DE VISTA INMUNOLOGICO. ENTONCES PUEDE TRATARSE SECUENCIALMENTE CON UN FACTOR DE ADHESION DE MATRIZ EXTRACELULAR, EL GLUCOSAMINOGLUCANO DE MATRIZ EXTRACELULAR, Y UN FACTOR DE CRECIMIENTO APROPIADO AL TIPO CELULAR QUE RESULTA NECESARIO QUE FUNCIONE DENTRO DE LA MATRIZ, E INCUBARSE LA MATRIZ DEL TEJIDO DE TRANSPLANTE CON CELULAS QUE SON ALOGENICAS O AUTOLOGAS PARA EL RECEPTOR, IMPARTIENDO CON ELLO A LA MATRIZ LAS CARACTERISTICAS DEL TIPO CELULAR Y DEL TEJIDO SELECCIONADOS. POR TANTO PUEDEN FORMARSE IN VITRO TEJIDOS CON UNA DIVERSIDAD DE BIOACTIVIDADES FUNCIONALES, ANTES DEL IMPLANTE O EL TRANSPLANTE DE UN INJERTO, QUE MOSTRARAN UNA ESTIMULACION REDUCIDA O NO MOSTRARAN ESTIMULACION DE LAS RESPUESTAS INMUNOLOGICAS EN EL RECEPTOR.
Description
Métodos de preparación de tejidos para
implantación.
La implantación quirúrgica de una válvula
cardíaca puede implicar la implantación de uno de tres tipos
distintos de prótesis: mecánica (sintética), bioprótesis (válvula
porcina o pericardio seroso bovino, fijado por enlaces químicos) o
aloinjerto humano. Estas prótesis proporcionan una mejora
hemodinámica eficaz para la implantación de válvulas aórticas
naturales que bien son deformidades congénitas o se han dañado por
cambios o enfermedad, degenerativos, dando como resultado bien
insuficiencia aórtica o estenosis valvular aórtica. De los
aproximadamente 55.000 implantes de válvula aórtica anuales en los
EE.UU., 75% son válvulas mecánicas. El resto de las implantaciones
son de tejidos trasplantados. De éstos, más del 80% son bioprótesis
porcinas, el número relativamente pequeño de aloinjertos (2.500 al
año) se debe principalmente a su limitada disponibilidad.
Los criterios para una prótesis ideal incluirían:
hemodinámica natural, durabilidad a largo plazo, baja frecuencia de
complicaciones tromboembólicas, libre de calcificación, ausencia
demostrada de capacidad inmunógena y sin respuestas hiperplásicas
inapropiadas siguiendo a la implantación. Incluso en situaciones de
autotrasplante, la manipulación quirúrgica del tejido, tales como
injertos de vena, puede ser por sí misma un estímulo para la
hiperplasia del tejido y posterior fracaso del injerto.
De acuerdo con esta invención, se pueden preparar
válvulas cardíacas, pulmonares y aórticas, con propiedades
ventajosas con respecto a desgaste, tendencia a calcificarse,
estimulación de respuestas inmunitarias y dificultad reducida en la
adquisición. También es aplicable a otras formas de tejidos, en
particular los que constan de colágenos intersticiales
estructurales.
Se han desarrollado diversos injertos sintéticos
y órganos mecánicos y están en uso en la actualidad. Sin embargo,
se sabe que estas implantaciones sintéticas están sujetas a
complicaciones embólicas o disminuciones de la resistencia del
material durante periodos prolongados de implantación. Aunque se
han mejorado las modificaciones estructurales en prótesis mecánicas
tales como válvulas cardíacas, con respecto a sus características
de desgaste, permanecen sujetas a disfunción valvular, que puede
tener lugar de pronto y sin aviso, dando como resultado situaciones
de emergencia que requieren intervención quirúrgica e implantación
del dispositivo protésico artificial. Debido a las propiedades
superficiales de las prótesis sintéticas/mecánicas usadas en el
sistema vascular, la adherencia plaquetaria aumenta la probabilidad
de formación de trombo y se tiene que proporcionar terapia
anticoagulante para la vida del implante y se hacen no deseables
tales implantes para ciertos grupos de receptores potenciales (por
ejemplo, mujeres en años de cría).
Se prepara una alternativa, válvulas cardíacas
bioprotésicas, a partir de tejidos valvulares de origen porcino o
bovino. Debido a que éstas son especies inmunológicamente
discordantes del hombre, se rechazan rápidamente por el receptor
del implante a pesar del uso de tratamiento farmacológico de
inmunodepresión que de otro modo mantendría un aloinjerto.
Significativamente, estos tejidos están sujetos a rechazo
hiperagudo por el receptor debido a la presencia en el receptor de
anticuerpos naturales formados previamente, que reconocen antígenos
en la superficie de células extrañas, en particular las del
recubrimiento endotelial de las válvulas cardíacas y los vasos
sanguíneos. Aunque los tejidos valvulares bovinos o porcinos son
apropiados estructuralmente y biomecánicamente para uso en seres
humanos, el potencial de tal tejido extraño para estimular el
rechazo inmunitario en el receptor ha dictado en el pasado
tratamientos con agentes de reticulación química tales como
glutaraldehído. Tal tratamiento del tejido reduce la estimulación de
una respuesta inmunológica por el receptor al tejido extraño y
también estabiliza la proteína de colágeno del tejido valvular no
viable, resultante, haciéndolo más resistente a la degradación por
peptidasas. Sin embargo, debido a que estos injertos de tejido no
son viables, no hay mecanismo biosintético para reparar las
proteínas estructurales descompuestas durante la operación del
tejido en el receptor. Tales injertos de tejido tienden a
calcificarse con el tiempo, aumentando el riesgo de daño
estructural y del consiguiente fracaso. Aunque tiene lugar con menos
frecuencia en relación con injertos mecánicos, la tromboembolia
también es una cuestión de tratamiento del paciente para los
receptores de estos injertos.
Similarmente, se han trasplantado alogénicamente
órganos tales como riñones de un hermano a otro, en un esfuerzo por
minimizar reacciones que intervienen de manera inmunológica en el
receptor del trasplante, que daría como resultado un rechazo del
órgano. A estos pacientes, así como a los pacientes que reciben
órganos para trasplante de donadores distintos de un hermano, con
frecuencia se les administra fármacos para suprimir su sistema
inmunitario. Aunque se puede suprimir la respuesta inmunológica a
tejido u órganos trasplantados por el uso de fármacos
inmunodepresores para minimizar el rechazo, la terapia
inmunodepresora es general por naturaleza. Por lo tanto, los
fármacos inmunodepresores también tienden a suprimir la respuesta
inmunitaria en general, que reduce la capacidad del receptor del
trasplante para combatir la infección.
Se han descrito procedimientos más recientemente
para generar bioprótesis mejorada para implante en el ser humano o
en mamífero, por tratamiento de tejido no humano. Véase, Orton, E.
Christopher, patente de EE.UU. 5.192.312. Orton describe la
generación de tejido para implante por eliminación de células
naturales del tejido de, por ejemplo, origen porcino; y después,
repoblar el tejido con células nuevas en presencia de factor de
crecimiento. Las células de repoblación son inmunológicamente
compatibles con el receptor del implante deseado. Los bioinjertos
producidos por este procedimiento no presentan muchas de las
desventajas de otras bioprótesis de la técnica anterior.
Esta invención proporciona procedimientos nuevos
y ventajosos para generar tejido para implante, adecuado para
implante en seres humanos o en otros mamíferos. El procedimiento de
esta invención se refiere, en general, a tratamiento de tejido
xenogénico o alogénico para generar una bioprótesis viable que no
produzca una respuesta inmunitaria adversa por el receptor en el
implante y posea las capacidades regeneradoras de los aloinjertos,
al tiempo que exhiba sólo propensión limitada a calcificarse y poca
estimulación de tromboembolia.
De acuerdo con lo anterior, el procedimiento de
esta invención incluye las etapas de: preparar una matriz de tejido
xenogénico (o alogénico) para tratamiento adicional por eliminación
de células naturales y otros antígenos y partículas celulares de la
matriz de tejido, descelularizada, y tratar la matriz para inhibir
la generación de nuevos sitios inmunológicos. Esta matriz de tejido
se trata después con los factores de adherencia celular descritos a
continuación, para exaltar la unión de células a la matriz durante
el procedimiento de repoblación de la matriz de tejido con tales
células nuevas.
Dependiendo de las células usadas para repoblar
las matrices de tejido natural, se pueden obtener diferentes
propiedades de las bioprótesis de especies híbridas, tales como la
capacidad para sintetizar proteínas de otro modo atípicas para el
tejido natural en el sitio de implantación o únicas para ciertos
grupos de edad. Estos injertos híbridos combinarían las ventajas
estructurales de injertos bioprotésicos con las capacidades
funcionales y regeneradoras de los aloinjertos así como indicarían
una respuesta atenuada o no inmunitaria, propensión limitada a
calcificarse y poca estimulación de tromboembolia. Como con todos
los injertos bioprotésicos en uso en la actualidad, estos tejidos
modificados no se suministrarían limitados y permitirían la
funcionalidad del injerto a más receptores. Además, estos injertos
no se alterarían necesariamente por enlaces químicos para hacerlos
estables al sistema inmunitario del receptor; por lo tanto, tales
materiales indicarían propiedades biomecánicas más parecidas a las
del tejido que se está usando para sustituir.
La invención descrita en la presente memoria es
útil para generar xenoinjertos bioprotésicos adecuados para
implantación en seres humanos. Es particularmente muy adecuada para
generar xenoinjertos en que el componente estructural principal es
matriz de tejido conjuntivo, tales como válvulas cardíacas, en
particular válvulas cardíacas de origen porcino o bovino. Ejemplos
de otros tejidos adecuados para uso en esta invención pueden ser,
pero no se limitan a, válvulas cardíacas aórticas, válvulas
cardíacas pulmonares, fascia lata, duramadre, pericardio seroso,
menisco, piel, ligamento, tendón y otras estructuras de tejido
conjuntivo.
Figura 1. Fotomicrografía de una hoja de válvula
aórtica fresca.
Figura 2a. Fotomicrografía que muestra conducto
de válvula pulmonar después de descelularización.
Figura 2b. Fotomicrografía que muestra miocardio
después de descelularización.
Figura 3a. Fotomicrografía de hoja de válvula
aórtica descelularizada.
Figura 3b. Fotomicrografía de hoja de válvula
aórtica repoblada.
Figura 4. Síntesis de Proteína de Colágeno y No
Colágeno en Hojas de Válvula Cardíaca Aórtica Porcina.
Figura 5. Reactividad de Antisueros de Conejo
Producida en Extractos de Hojas de Válvula Cardíaca, Porcina,
Crioconservada o Despoblada - Captura de Anticuerpos.
Figura 6a. Fotomicrografía que muestra la
respuesta celular mínima provocada por descelularización de hojas de
válvulas cardíacas porcinas después de implantación.
Figura 6b. Fotomicrografía que muestra respuesta
celular provocada por hoja de válvula aórtica, porcina,
crioconservada, después de implantación.
Figura 7a. Fotomicrografía de hoja de válvula
aórtica, porcina, fresca, en que se ensaya antígeno asociado con
célula de cerdo.
Figura 7b. Fotomicrografía de hoja de válvula
aórtica, porcina, descelularizada, en que se ensaya antígeno
asociado con célula de cerdo.
Figura 8. Relaciones
Tensión-Deformación de Hojas de Válvula Aórtica,
Porcina.
Figura 9. Curvas de Relajación de Tensión de
Hojas Aórticas, Porcinas, Después de Preacondicionamiento.
Figura 10. Datos de Falta de Tracción para Hojas
de Válvulas Aórticas, Porcinas.
Dependiendo del tipo de trasplante deseado, si el
receptor es un ser humano, el tejido u órgano para trasplante
inicial puede ser de origen no humano. Estos tejidos u órganos se
pueden obtener en mataderos homologados de animales proveídos para
consumo humano o de manadas de animales domesticados mantenidos por
el propósito de proporcionar estos tejidos u órganos. Los tejidos u
órganos se manipulan de una manera estéril y cualquier disección
adicional del tejido u órganos se lleva a cabo en condiciones
asépticas.
El tejido para trasplante que se origina a partir
de fuentes no humanas y deseado para uso en un receptor humano, se
puede tratar para generar un xenoinjerto híbrido o tejido para
implante xenogénico, que se forma a partir de una matriz de tejido
no humano, sin células naturales y otros componentes antigénicos y
que está poblada con células humanas viables. Las etapas del
procedimiento para generar tales implantes inmunológicamente
tolerables, se describen a continuación.
Después de la recogida y disección, se puede
esterilizar el tejido para trasplante por su incubación en una
solución nutritiva, amortiguada, estéril, que contenga agentes
antimicrobianos, por ejemplo un agente antibacteriano, un agente
antifúngico o un agente de esterilización compatible con el tejido
para trasplante.
El tejido para trasplante, esterilizado, se puede
crioconservar después para tratamiento adicional un tiempo más
tarde o se puede tratar adicionalmente, inmediatamente, de acuerdo
con las siguientes etapas de este procedimiento, que incluyen una
crioconservación posterior de la matriz de tejido u otros productos
de tejido del procedimiento.
Una etapa preliminar de esta invención requiere
la eliminación de células viables naturales, así como otras
estructuras o componentes celulares y acelulares que pueden
provocar una respuesta inmunitaria adversa por el receptor del
implante.
Se conocen diversos medios de reducción de la
viabilidad de células naturales en tejidos y órganos, incluyendo
métodos físicos, químicos y bioquímicos. Véase, p.e., la patente de
EE.UU. Nº 5.192.312. Tales métodos se pueden emplear de acuerdo con
el procedimiento descrito en la presente memoria. Sin embargo, la
técnica de descelularización empleada no debería dar como resultado
rotura molecular intolerable de la anatomía del tejido para
trasplante o alterar sustancialmente las propiedades biomecánicas
de sus elementos estructurales. El tratamiento del tejido para
producir una matriz de tejido descelularizada tampoco debería dejar
un entorno citotóxico que mitigue la repoblación posterior de la
matriz con células alogénicas o autógenas con respecto al receptor.
Las células y tejidos que son alogénicos para el receptor son los
que se originan con o proceden de, un donador de la misma especie
que el receptor. Las células o tejidos autógenos son los que se
originan con o proceden del receptor.
Se pueden usar fuerzas físicas, por ejemplo, la
formación de hielo intracelular, para descelularizar tejidos para
trasplante. Por ejemplo, la congelación en fase vapor (velocidad
lenta de descenso de temperatura) de válvulas cardíacas intactas
puede reducir la celularidad de las hojas de válvulas cardíacas
cuando se compara con la congelación en fase líquida (rápida). Sin
embargo, los procedimientos de congelación lenta, en ausencia de
sustancia crioprotectora, puede dar como resultado la ruptura del
tejido, tal como el agrietamiento de conductos de la válvula
cardíaca. Se pueden añadir materiales formadores de coloides durante
los ciclos de congelación-descongelación para
alterar los patrones de formación de hielo en el tejido. Se puede
añadir polivinilpirrolidona (10% p/v) e hidroxietilalmidón
dializado (10% p/v), a soluciones de crioconservación clásicas
(DMEM, DMSO al 10%, suero bovino fetal al 10%) para reducir la
formación de hielo extracelular al tiempo que se permite la
formación de hielo intracelular. Esto permite una medición de la
descelularización al tiempo que se permite alguna protección a la
matriz de tejido de colagenasa frente al daño por hielo.
Adicionalmente, se observa que los tejidos, en particular los
conductos de válvulas cardíacas, se agrietarán si se congelan
rápidamente con independencia de la presencia de sustancia
crioprotectora.
Alternativamente, se pueden usar diversos
tratamientos enzimáticos u otros químicos para eliminar células
naturales viables de tejidos u órganos para implante. Por ejemplo,
la exposición prolongada de células a proteasas tales como
tripsina, da como resultado muerte celular. Sin embargo, debido a
que al menos una porción de la molécula de colágeno de tipo I, es
sensible a una variedad de proteasas, incluyendo tripsina, esto no
puede ser el criterio de elección para injertos de colágeno
deseados para implante en posiciones de alta tensión mecánica.
Las combinaciones de diferentes clases de
detergentes, por ejemplo, un detergente no iónico, Tritón
X-100, y un detergente aniónico, dodecilsulfato de
sodio, pueden romper las membranas celulares y ayudar en la
eliminación de partículas celulares del tejido. Sin embargo, se
deberían tomar etapas para eliminar cualquier nivel de detergente
residual en la matriz de tejido, de manera que se evite
interferencia con la posterior repoblación de la matriz de tejido
con células viables.
La descelularización del tejido para trasplante
se lleva a cabo preferiblemente por la administración de una
solución eficaz para producir la lisis de células naturales en el
tejido para trasplante. Preferiblemente, la solución puede ser una
solución hipotónica o de fuerza iónica baja, acuosa, formulada para
producir eficazmente la lisis de las células de tejido natural. Tal
solución hipotónica, acuosa, puede ser agua desionizada o un
amortiguador hipotónico, acuoso. Preferiblemente, el amortiguador
hipotónico, acuoso, puede contener aditivos que proporcionen
condiciones subóptimas para la actividad de proteasas
seleccionadas, por ejemplo colagenasa, que se puede liberar como
resultado de lisis celular. Aditivos tales como quelantes de iones
metálicos, por ejemplo, 1,10-fenantrolina y ácido
etilendiaminotetracético (AEDT), crean un entorno desfavorable para
muchas peptidasas. Proporcionar condiciones subóptimas para
proteasas tales como colagenasa, puede favorecer la protección de
la matriz de tejido de la degradación durante la etapa de lisis. En
particular, se pueden conseguir condiciones subóptimas para
proteasas por la formulación de la solución para producir la lisis,
hipotónica, para eliminar o limitar la cantidad de iones calcio y
cinc disponibles en solución. Muchas proteasas son activas en
presencia de iones calcio y cinc y pierden mucho de su actividad en
entornos sin iones calcio y cinc.
Preferiblemente, la solución para producir la
lisis, hipotónica, se preparará seleccionando condiciones de: pH,
disponibilidad reducida de iones calcio y cinc, presencia de
quelantes de iones metálicos y el uso de inhibidores proteolíticos
específicos para colagenasa, tal como
\beta_{1}-anticolagenasa, de manera que la
solución producirá la lisis, de manera óptima, de las células
naturales al tiempo que protegerá la matriz de tejido subyacente de
degradación proteolítica adversa. Por ejemplo, una solución para
producir la lisis, hipotónica, puede incluir una solución
amortiguada de agua, pH 5,5 a 8, preferiblemente pH 7 a 8, sin iones
calcio y cinc e incluyendo un agente quelante de iones metálicos
tal como AEDT. Adicionalmente, también se puede emplear control de
los parámetros temperatura y tiempo durante el tratamiento de la
matriz de tejido con la solución para producir la lisis,
hipotónica, para limitar la actividad de las proteasas.
Se prefiere que el tratamiento de
descelularización de la matriz de tejido también limite la
generación de nuevos sitios inmunológicos. Aunque el colágeno no es
típicamente sustancialmente inmunógeno, la degradación enzimática
parcial de colágeno puede conducir a capacidad inmunógena
fortalecida. De acuerdo con esto, una etapa preferible de este
procedimiento incluye el tratamiento del tejido con enzimas, tales
como nucleasas, eficaces para inhibir el metabolismo celular, la
producción de proteínas y la división celular sin degradación de la
matriz de colágeno subyacente. Las nucleasas que se pueden usar para
digestión de ADN y ARN celular, natural, incluyen tanto
exonucleasas como endonucleasas. Una amplia variedad de las cuales
son adecuadas para uso en esta etapa del procedimiento y están
comercialmente disponibles. Por ejemplo, las exonucleasas que
inhiben eficazmente la actividad celular incluyen ADNasa I (SIGMA
Chemical Company, St. Louis, MO.) y ARNasa A (SIGMA Chemical
Company, St. Louis, MO) y las endonucleasas que inhiben eficazmente
la actividad celular incluyen EcoR I (SIGMA Chemical Company, St.
Louis, MO) y Hind III (SIGMA Chemical Company, St. Louis, MO).
Es preferible que se apliquen las nucleasas
seleccionadas en una solución amortiguadora fisiológica que contenga
iones que sean óptimos para la actividad de la nucleasa, tales
iones incluyen sales de magnesio y de calcio. También se prefiere
que se seleccionen: la concentración iónica de la solución
amortiguada, la temperatura de tratamiento y la extensión del
tratamiento, para asegurar el nivel deseado de actividad eficaz de
la nucleasa. El amortiguador es preferiblemente hipotónico para
fomentar el acceso de las nucleasas a los interiores de las
células. Para tratamiento de células endoteliales endógenas de
tejido valvular cardíaco, no humano, en particular válvulas de
origen porcino o bovino, el tejido se trata preferiblemente con un
medio amortiguado fisiológicamente constituido por nucleasas ADNasa
I y ARNasa A. Preferiblemente, la solución de degradación de
nucleasa contiene aproximadamente 0,1 \mug/ml a 50 \mug/ml,
preferiblemente 10 \mug/ml de la nucleasa ADNasa I y 0,1
\mug/ml a 10 \mug/ml, preferiblemente 1,0 \mug/ml de ARNasa A.
El tejido se puede descelularizar por aplicación de lo anterior, a
una temperatura de aproximadamente 20ºC a 38ºC, preferiblemente a
aproximadamente 37ºC, durante aproximadamente 30 minutos a 6 horas,
mientras que al mismo tiempo se limita la generación de nuevos
sitios inmunológicos como resultado de la degradación de
colágeno.
Pueden ser adecuadas otras digestiones
enzimáticas para uso en la presente memoria, por ejemplo, se pueden
usar enzimas que romperán la función de las células naturales en un
tejido para trasplante. Por ejemplo, se puede usar fosfolipasa, en
particular fosfolipasas A o C, en una solución amortiguada, para
inhibir la función celular por ruptura de membranas celulares de
células endógenas. Preferiblemente, la enzima empleada no debería
tener un efecto perjudicial sobre la proteína de la matriz del
tejido. También se pueden seleccionar las enzimas adecuadas para
uso con respecto a la inhibición de la integridad celular y también
incluyen enzimas que pueden interferir con la producción de
proteína celular. También se ajustará el pH del vehículo, así como
la composición del vehículo, con respecto al perfil de actividad del
pH de la enzima elegida para uso. Por otra parte, se debería
ajustar la temperatura aplicada durante la aplicación de la enzima
al tejido, para optimizar la actividad enzimática.
Con posterioridad al tratamiento de
descelularización elegido, se lava la matriz de tejido para
trasplante, resultante, para asegurar la eliminación de las
partículas celulares que pueden incluir: proteína celular, lípidos
celulares y ácido nucleico celular así como cualquier partícula
extracelular tales como proteínas solubles extracelulares, lípidos
y proteoglucanos. La eliminación de estas partículas celulares y
extracelulares reduce la probabilidad de que la matriz de tejido
para trasplante provoque una respuesta inmunitaria adversa del
receptor en el implante. Por ejemplo, se puede incubar el tejido en
una solución de sal equilibrada tal como Solución de Sal
Equilibrada de Hanks (SSEH). Se puede seleccionar la composición
del lavado con solución de sal equilibrada y las condiciones bajo
las que se aplica a la matriz de tejido para trasplante, para
disminuir o eliminar la actividad de la nucleasa u otra enzima
utilizada durante el procedimiento de descelularización. Tal
solución de lavado de sal equilibrada no contendría preferiblemente
sales de magnesio o de calcio y el procedimiento de lavado puede
incluir incubación a una temperatura de, entre aproximadamente 2ºC
y 42ºC, lo más preferible con 4ºC. Se puede incubar la matriz de
tejido para trasplante en la solución de lavado de sal equilibrada
durante, hasta 10 a 12 días, con cambios en la solución de lavado
cada segundo o tercer día. Opcionalmente, se puede incluir un
agente antibacteriano, un agente antifúngico o un agente de
esterilización o una combinación de los mismos, en la solución de
lavado de sal equilibrada para proteger la matriz de tejido para
trasplante de contaminación con patógenos del entorno.
La matriz de tejido preparada de acuerdo con lo
anterior, está sin sus células naturales y adicionalmente se han
lavado componentes de antígenos celulares y extracelulares de la
matriz de tejido. Preferiblemente, la matriz de tejido se ha
tratado de una manera que limita la generación de los nuevos sitios
inmunológicos en la matriz de colágeno. La matriz de tejido, sin
embargo, conserva la resistencia biomecánica esencial necesaria
para proporcionar la estructura para tratamiento adicional de la
matriz.
La matriz de tejido tratada de acuerdo con esta
invención, se puede crioconservar para uso posterior. La
crioconservación de tejido para trasplante descelularizado
aseguraría un suministro o repertorio de matrices de tejido
sustancialmente no inmunógenas que, en la descongelación, estarían
listas para tratamiento adicional de acuerdo con las etapas
posteriores de esta invención o tratamiento adicional como se
desee, para proporcionar un tejido producto para implante. Por
ejemplo, se pueden inventariar matrices de tejido hasta el tiempo
en que estén identificadas las células particulares que se tienen
que emplear durante la repoblación. Esto puede ser de utilidad
particular cuando se tiene que repoblar la matriz de tejido con
células procedentes del receptor u otras células seleccionadas para
uso basadas en su compatibilidad inmunológica con un receptor
específico.
También se prevé que se pueda crioconservar el
tejido para trasplante natural previamente a la experimentación de
cualquiera de los procedimientos de esta invención. Los tejidos que
no se descelularizan conservan sus células naturales junto con la
matriz de tejido conjuntivo. En la descongelación, estos tejidos se
pueden tratar además. Beneficiosamente, la crioconservación de
tejido para trasplante intacto también puede ayudar en la
despoblación del tejido como resultado de muerte celular causada
por la crioconservación.
Las técnicas de crioconservación de tejido se
conocen bien en la técnica. Brockbank, K. G. M. Basic Principles
of Viable Tissue Preservation. En: Transplantation
Techniques and Use of Cryopreserved Allograft Cardiac Valves and
Vasular Tissue. D. R. Clarke (ed.) Adams Publishing Group, Ltd.,
Boston, págs. 9-23, se discute la crioconservación
de tejidos y órganos.
La matriz de tejido, se haya crioconservado o no,
se puede tratar a continuación para exaltar la adherencia y la
migración hacia el interior de las células alogénicas o autógenas,
in vitro, que se usarán para repoblar el tejido para
trasplante.
Aunque no se desee estar limitados por la teoría,
se cree que hay diversos factores que efectúan la unión de células
al tejido. Por ejemplo, la adherencia de fibroblastos a superficies
del tejido implica interacciones entre los componentes de la
membrana celular y la matriz extracelular de tejido natural tal
como colágeno fibrilar y formador de láminas, proteoglucanos y
glucoproteínas. In vitro, los fibroblastos dérmicos
cultivados sin suero se unen rápidamente e igualmente a colágeno de
los tipos I y IV. La extensión de la unión se aumenta por la
adición de suero (humano o bovino fetal, unión máxima con suero al
1%) y por fibronectina purificada al medio de cultivo. Cada una de
las dos subunidades homólogas de fibronectina tiene dos regiones de
reconocimiento celular, la más importante de las cuales tiene la
secuencia Arg-Gly-Asp (RGD). Un
segundo sitio, que une glucosaminoglucanos, actúa sinérgicamente y
parece que estabiliza las interacciones
fibronectina-célula en que interviene la secuencia
RGD. El sulfato de heparina junto con sulfato de condroitina son los
dos glucosaiminoglucanos identificados sobre superficies celulares.
El sulfato de heparina está unido a proteínas del núcleo (sindecán
o hialuronectina) que pueden ser de expansión bien integral o de
membrana. Los sitios de unión celular para glucoproteínas de matriz
extracelular se denominan integrinas y éstas intervienen en la
unión estrecha de las células a los factores de adherencia. Cada
factor de adherencia parece que tiene una integrina especializada
aunque se puede unir una única integrina a diversos factores de
matriz extracelular. Los fibroblastos, cuando se adhieren a
fibronectina intacta (dominios de unión de célula y heparina)
indican una morfología contraída con adherencias focales. Sin el
dominio de unión de heparina, los fibroblastos se esparcirán pero
fracasarán en el desarrollo de adherencias focales.
Por lo tanto, una combinación de factores puede
determinar la velocidad a la que las células se pueden unir a una
superficie de tejido. Muchos de éstos son productos de tipo
fibroblasto, aunque algunos como fibronectina pueden proceder de
enriquecimiento de suero también. La velocidad a la que se expresan
estos factores y se segregan por las células afectará a la unión de
las células a superficies y citocinas tales como factor de
crecimiento de fibroblastos y
\hbox{factor- \beta }de crecimiento transformante son reguladores positivos de la producción de colágeno de fibroblastos y fibronectina.
Se cree que se fomenta la unión eficaz de células
a la matriz de tejido, por la interacción entre la membrana celular
y los componentes extracelulares asociados con el correspondiente
tejido para implante. De acuerdo con esto, para un tipo de célula
dado y tipo de tejido elegido para uso, los tratamientos apropiados
que fomentan la unión celular a la matriz de tejido,
descelularizada, incluyen el tratamiento con componentes de tejido
extracelular y, en particular, proteínas extracelulares tales como
glucoproteínas y/o proteoglucanos o glucosaminoglucanos que sean
eficaces para fomentar la unión de las células a la matriz de tejido
descelularizada. La técnica para repoblar la matriz de tejido con
células se lleva a cabo tratando primero la matriz de tejido,
descelularizada, con factor de unión celular eficaz para fomentar la
unión de las células de repoblación a la matriz
descelularizada.
Por ejemplo, se puede incubar la matriz de
tejido, descelularizada, en solución nutritiva que contenga
proteína de matriz extracelular, tal como fibronectina y un
glucosaminoglucano, durante un periodo eficaz para la unión de la
fibronectina a superficies de la matriz de tejido para trasplante
que se tiene que repoblar. Los amortiguadores preferidos para uso
con fibronectina/glucosaminoglucano incluyen fosfato de
sodio/glicerina/albúmina de suero bovino (Suero Bovino Fetal,
BIO-WHITTAKER) y Medio de Eagle Modificado de
Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés), (GIBCO). Estos
amortiguadores se usan típicamente para proporcionar un pH
fisiológicamente aceptable de aproximadamente 7,0 a 7,6. La
presencia de las proteínas de matriz extracelulares establece una
superficie en la matriz del tejido a la que se unen las células que
se han elegido para repoblar la matriz. El estímulo de la proteína
de la matriz extracelular fomenta la repoblación celular en el
injerto.
La proteína de matriz extracelular, preferida
para uso en la presente memoria, es la forma molecular intacta de
fibronectina (Fibronectina de Plasma Humano, UPSTATE Biotechnology,
Inc.). Esta glucoproteína heterofuncional tiene afinidad por
proteínas de matriz extracelulares, proteoglucanos y ciertos tipos
de células. La solución de tratamiento de fibronectina también
contiene preferiblemente un proteoglucano que puede ser que puede
ser uno de los glucosaminoglucanos: heparina, sulfato de heparina,
condroitina, sulfato de condroitina, dermatina o sulfato de
dermatina. Se cree que el glucosaminoglucano fomenta y estabiliza
la unión entre fibronectina y la matriz de tejido asociada a
colágeno. La matriz es capaz ventajosamente de interacción con
fibronectina debido a que no está reticulada por enlaces
químicos.
Una fuente de fibronectina es a partir de sangre
humana, tratada para limitar la contaminación con virus. El
glucosaminoglucano preferido es heparina. La concentración de
glucoproteina usada como el factor de adherencia para tratar la
matriz de tejido puede oscilar de aproximadamente 1 a
aproximadamente 100 \mug/ml, siendo preferida con una
concentración de fibronectina de 10 \mug/ml. La relación en peso
preferida de fibronectina a heparina es aproximadamente 10 partes
de fibronectina a aproximadamente 1 parte de glucosaminoglucano,
p.e. heparina. Esto es óptimo para la repoblación de hojas de
válvulas cardíacas porcinas, pero puede oscilar de aproximadamente
0,1:1 a aproximadamente 10:0,1 dependiendo del tejido usado.
Preferiblemente los componentes de la solución
nutritiva que contiene los factores de adherencia se seleccionan de
manera que la solución sea compatible con factores de crecimiento
que se añaden posteriormente al medio nutritivo en que se está
incubando la matriz de tejido para trasplante. Estos factores de
crecimiento se emplean para facilitar el crecimiento celular y la
repoblación de la matriz de tejido.
Un aspecto importante de esta invención es que se
repobla la matriz de tejido para trasplante, descelularizada, con
células in vitro. Las células empleadas para repoblar la
matriz descelularizada pueden ser células alogénicas, cultivadas a
partir de la misma especie que el receptor del implante deseado o
pueden ser células autógenas, cultivadas a partir del receptor del
implante. En cualquier caso, las células autógenas o alogénicas en
la matriz de tejido repoblada, conocidas como xenoinjerto o injerto
quimérico provocarán menos de una respuesta inmunitaria adversa que
un tejido para trasplante xenogénico no tratado.
También se prevé que las células empleadas para
repoblar la matriz descelularizada puedan ser células que se hayan
manipulado genéticamente para exaltar la producción de proteínas
específicas. Se conocen numerosas tecnologías de ADN recombinante,
en la técnica, para alterar, exaltar y modificar el metabolismo
celular.
La repoblación se puede llevar a cabo por
incubación de la matriz de tejido, tratada con factores de
adherencia celular, en un medio nutritivo que contenga las células
y factores de crecimiento activos para fomentar la proliferación
celular y, por lo tanto, la repoblación de la matriz de tejido. Un
tipo de célula preferido para uso en la presente memoria son
células de tipo fibroblasto.
Se puede emplear una variedad de sustancias para
exaltar la quimiotaxia celular, aumentando la velocidad de
movimiento direccional a lo largo de un gradiente de concentración
de la sustancia en solución. Con respecto a células de tipo
fibroblasto, factor de crecimiento de fibroblasto, factor de
crecimiento derivado de plaquetas, factor-\beta
de crecimiento transformante y las moléculas de adherencia al
substrato, colágenos fibrilares, fragmentos de colágeno y
fibronectina, son quimiotácticos para fibroblastos. A diferencia de
la adherencia celular, la migración de fibroblastos requiere
síntesis de novo de proteínas; se estimula la síntesis de
proteínas en células fibroblásticas normales por la adherencia de
células a fibronectina, de manera que se cree que están
interrelacionados los procedimientos de adherencia celular y
migración celular durante la repoblación.
La migración celular también permite que las
células se muevan por la matriz de tejido que está repoblando los
espacios intersticiales interiores así como las superficies de la
matriz para trasplante de tejido.
El número de células requerido para repoblar
totalmente matrices de tejido para trasplante, particulares,
depende del volumen de tejido usado y de los tipos de células
proporcionadas. Sin embargo, las concentraciones de 20.000 a
125.000 fibroblastos por mililitro pueden proporcionar revestimiento
adecuado de la hoja de válvula cardíaca y del tejido del conducto
aórtico.
Las etapas de repoblación celular de la matriz de
tejido se conducen preferiblemente en presencia de factores de
crecimiento eficaces para fomentar la proliferación de las células
cultivadas empleadas para repoblar la matriz. Por ejemplo, cuando
se emplean células de tipo fibroblasto, un factor de crecimiento
para uso en la presente memoria puede ser factor de crecimiento de
fibroblastos (FCF), lo más preferiblemente factor de crecimiento de
fibroblastos básico (bFCF) (bFCF Recombinante Humano, UPSTATE
Biotechnology, Inc.).
Los factores de crecimiento de fibroblastos
(unión de heparina) son una familia de mitógenos activos en células
mesenquimatosas. No se detectan FCFs libres en medio condicionado,
en su lugar los FCFs se encuentran en la matriz extracelular
conjuntamente con sulfato de heparina, localizándose en la capa
fibronectina-heparina unida previamente a la matriz
de tejido para trasplante. Los glucosaminoglucanos estabilizan la
actividad de los FCF y se requieren para la unión de FCF a
receptores de la superficie celular en que estimulan el crecimiento
autocrino/paracrino.
La matriz y las células se exponen
preferiblemente a bFCF de manera continua, durante la etapa de
repoblación, para proporcionar estimulación de la replicación
celular y la expresión de síntesis de proteína de colágeno, según se
requiere para la función de la válvula normal. Los tiempos de
cultivo de la matriz con factor de crecimiento oscilan de 10 a 21
días. La concentración de factor de crecimiento usada para tratar
la matriz de tejido puede oscilar de 100 ng/ml a 10 \mug/ml,
siendo preferido con una concentración de factor de crecimiento
para bFCF de 2,5 \mug/ml.
Cuando se usan fibroblastos como células de
repoblación del injerto, el medio de cultivo puede incluir Medio de
Eagle Modificado de Dulbecco (GIBCO) con 5-15%
añadido de suero. Se prefiere suero de receptor autógeno pero la
experiencia con implantación de válvulas cardíacas de aloinjertos
sugiere que se puede utilizar suero bovino en el medio de
crecimiento sin consecuencias inmunológicas adversas para el
receptor del implante. La estimulación continua de las células con
suero y medio condicionados por la repoblación de células, puede
provocar una repoblación celular más rápida de la matriz de tejido.
La matriz, las células y los factores de crecimiento se pueden
incubar en una atmósfera humidificada, a 37ºC, provista de una
mezcla de aire al 95% y CO_{2} al 5% durante todo el periodo de
cultivo.
La matriz de tejido para trasplante se cultiva
durante un tiempo suficiente para producir un injerto repoblado con
histología intersticial similar a la del tejido fresco. En la
conclusión del procedimiento de repoblación celular, el tejido
también indicará preferiblemente parámetros metabólicos similares a
los del tejido fresco.
Un aspecto importante de esta invención es que
los tejidos para trasplante repoblados están funcionando y son
viables previamente a la implantación además de ser
inmunológicamente aceptables para el receptor del implante o
sustancialmente no inmunógenos. Existen diversos ensayos para medir
la actividad celular y la aplicación de estos ensayos a los tejidos
para implante de este procedimiento proporciona un método para
controlar y cuantificar la viabilidad de las células que repoblan
el tejido para implante.
Es preferible que se seleccione un ensayo que
mida una actividad celular que soporte una relación con la función
deseada del tejido para trasplante. Por ejemplo, la producción de
colágeno es importante para mantener una válvula cardíaca en
funcionamiento. En hojas de válvula cardiaca, 5 a 15% de la proteína
total producida es colágeno. De eso, al menos 75% será colágeno de
tipo I. Por lo tanto, en el ensayo de una válvula cardíaca
repoblada, es preferible ensayar colágeno total producido por las
células de repoblación como una medición precisa de viabilidad
celular. El ensayo de la actividad celular por medición de la
producción de colágeno se conoce bien en la técnica. Son ejemplos de
referencias que discuten ensayos para la producción de colágeno
celular: Buckley, A. et al., 1.980 Collagen
Metabolism, Methods of Enzymology,
163:674-69 y Hayashi, T. y Nagal, Y. 1.979.
Separation of the \alpha Chains of Type I and III Collagens by
SDS-polyacrylamide Gel Electrophoresis,
Journal of Biochemistry, 86:453-459.
Se prevén otros ensayos que pueden medir la
viabilidad celular para uso en esta invención. La síntesis de
proteína total cuando se mide por la incorporación de
[^{3}H]prolina es uno de tales ensayos. Ensayos adicionales
que pueden ser útiles en la medición de la viabilidad celular
incluyen ensayos para la metabolización de glucosa y una variedad
de ensayos dirigidos hacia la actividad mitocondrial.
Se prevé que se pueda usar cualquier ensayo que
mida cuantificablemente una función celular indicativa de células
viables.
Las células de tipo fibroblasto son responsables
de la producción de la mayoría de los componentes de tejido
conjuntivo. Sintetizan diferentes tipos de colágeno y parece que el
fenotipo está impuesto por entornos de tejido específicos; es
decir, los fibroblastos cultivados sintetizan tipos de colágeno de
acuerdo con su sitio de origen. Los fibroblastos también producen
diversos glucosaminoglucanos y fibronectina y factores de
crecimiento. Es la capacidad de los fibroblastos dérmicos para
sintetizar colágenos de los tipos I, III y V en la proporción
presente en la matriz de la hoja de válvula cardíaca, que las hace
células apropiadas para repoblar la matriz de tejido para trasplante
y formar el injerto híbrido descrito en la presente memoria.
Las células que se usan para repoblar el injerto
particular se pueden variar dentro de límites amplios y se pueden
usar diferentes tipos de células en diferentes circunstancias,
dependiendo de la función del trasplante, la naturaleza del tejido
que se está reemplazando o aumentando, la sensibilidad alérgica del
receptor además de otros factores.
Una realización preferida de la invención usa
células autógenas en el procedimiento descrito en la presente
memoria. Se toma una muestra de tejido del receptor previamente al
tratamiento quirúrgico de trasplante o implante. El tejido se
trata, de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria a
continuación, para producir fibroblastos u otras células que se
usan después para repoblar la matriz de tejido, alogénica o
xenogénica, de acuerdo con este procedimiento. Por la repoblación
de la matriz de tejido para trasplante, descelularizada y tratada,
preparada previamente, con células procedentes del tejido resecado
tomado del receptor, se puede minimizar o evitar la probabilidad de
una respuesta adversa del sistema inmunitario y rechazo del injerto
por último.
La fuente celular se puede seleccionar para que
sea compatible con el tejido que se tiene que trasplantar. Por
ejemplo, si se tiene que trasplantar un vaso sanguíneo, se pueden
tomar células de un vaso sanguíneo sano del receptor y usarlo como
fuente de células para la repoblación del injerto. De esta manera,
el injerto sano puede estar muy cerca de ser compatible con el
tejido enfermo del receptor.
Este aspecto de la invención es particularmente
útil cuando el receptor del trasplante es altamente alérgico o si
el tejido es altamente inmunógeno, tal como con respecto a los
vasos sanguíneos trasplantables.
Alternativamente, se pueden usar estirpes
celulares alogénicas que no es probable que causen una respuesta
inmunitaria inaceptable en el implante, para repoblar la matriz de
tejido. Se pueden usar células con no más que una respuesta
alérgica débil o tolerable, para repoblar la matriz de tejido para
proporcionar un implante sustancialmente no inmunógeno. Estas
células pueden ser por naturaleza débilmente inmunógenas o
diseñarse en virtud de la tecnología celular recombinante para que
sean débilmente inmunógenas.
El tejido usado para proporcionar la unión de
células de tipo fibroblasto, por ejemplo, piel (nalgas, muslo o
dorso) u hojas de válvulas cardíacas, se recupera de manera estéril
y se proporciona a un tratador en medio nutritivo amortiguado. El
tejido se corta en trozos de 1 mm^{3} usando una técnica de
disección estéril. Se ponen después grupos de 10 trozos en placas
de cultivo de tejido, de 35 mm, con una cantidad limitada de medio
de cultivo (DMEM además de suero bovino fetal al 10%) suficiente
para humedecer el tejido pero que no floten los trozos. Se incuban
durante una semana, a 37ºC, en una incubadora de cultivo
humidificado, en una atmósfera de CO_{2} al 5%, en aire. Después
de una semana de incubación, cada trozo de tejido está rodeado por
una excrecencia densa de fibroblastos. También pueden estar
presentes células epiteliales pero se pierden durante el cultivo
celular posterior. Los fibroblastos se eliminan por digestión de
tripsina, clásica, después de enjuagar las células con una solución
de sal amortiguada, estéril, sin calcio y magnesio y se ponen en
recipientes de cultivo celular más grandes con medio de cultivo
fresco. Los cultivos celulares se pueden extender de esta manera.
El contenido de un matraz se puede dividir y poner en tres
recipientes más grandes y este procedimiento se puede repetir
aproximadamente una vez a la semana. Las células recuperadas de
estos matraces se usan como fuente de células de repoblación. Las
células obtenidas de esta manera son preferibles a estirpes
celulares comercialmente disponibles, debido a que la mayoría de
las estirpes celulares se alteran fenotípicamente y ya no son
sensibles de una manera normal a reguladores de crecimiento (tal
como bFCF). Adicionalmente, la mayoría de las estirpes celulares
comercialmente disponibles, no producen cantidades y proporciones
naturales de proteínas producto, importantes (tal como
colágeno).
Una realización preferida de la invención incluye
un xenoinjerto tratado para eliminar células naturales y proteínas
solubles, las condiciones se eligen para que no sean tóxicas para
las células usadas para repoblar el xenoinjerto y se eligen para
hacer la matriz de tejido de xenoinjerto, final, biomecánicamente
adecuada e intacta. La matriz de tejido de xenoinjerto, despoblada,
se trata después con factor de glucoproteína de matriz extracelular
y glucosaminoglucano. El xenoinjerto se trata después con un factor
de crecimiento y glucosaminoglucano y se incuba con células
exógenas que se adhieren al injerto. Estas células exógenas migran
en el injerto, proliferan dentro del injerto y expresan proteínas
esenciales y otros factores críticos para la función del injerto.
El xenoinjerto repoblado se hace biológicamente funcional por las
células de repoblación e indica capacidad inmunógena reducida o
mínima cuando se compara bien con xenoinjerto no tratado o con
xenoinjerto fijado por enlaces químicos. La antigenicidad reducida
es una consecuencia de la eliminación de xenoantígenos o
aloantígenos durante la despoblación inicial del tejido y por la
presencia de células de repoblación que no se reconocen como
extrañas por el receptor. Estos injertos quiméricos también
indicarían una tendencia reducida a la calcificación debido a que
las partículas celulares, que se forman bien como resultado de
muerte celular durante la obtención de tejido o durante la
descelularización del tejido, se eliminan por el tratamiento de
lavado. Debido a que estos injertos quiméricos conservan una capa de
revestimiento de células como resultado del procedimiento descrito
anteriormente, la tendencia a que se formen trombos y microémbolos
también se debería reducir cuando se compara con estructuras
mecánicas, estructuras hechas de moléculas biológicas purificadas y
tejidos bioprotésicos fijados por enlaces químicos.
Se obtuvieron corazones de cerdo dentro de dos
horas del sacrificio, para limitar los efectos de degradación
celular no controlada en estructura de tejido y se devolvieron al
centro de tratamiento, a 4ºC, en una solución estéril de DMEM. Se
tomaron por excisión válvulas cardíacas aórticas, en condiciones
estériles, se incubaron en mezcla de antibiótico, durante 16 h, a
37ºC, en medio nutritivo, en atmósfera de CO_{2} al 5% y se
crioconservaron (velocidad de enfriamiento = -1ºC/min.) en DMEM que
contenía DMSO al 10% y suero bovino fetal al 10%. Después de
almacenamiento a -179ºC, las válvulas se descongelaron rápidamente
a 37ºC. Se cortaron las hojas, el conducto aórtico y el miocardio a
partir de la válvula y bien se pusieron porciones divididas de cada
tipo de tejido directamente en formalina amortiguada al 10%, para
análisis histológico posterior o se trataron para despoblación.
Después de lavado en solución de dextrosa al 5%-Ringers de lactato,
tres veces, durante 15 min. cada una, a temperatura ambiente, se
incubaron los tejidos en agua de 18 M\Omega, durante 2 h, a
temperatura ambiente, seguido por digestión en 10 \mug/ml de
ADNasa I y 1 \mug/ml de ARNasa A en Tris-Cl 10
Mm, pH 7,6, que contenía sales de magnesio 3 mM y de calcio 1 mM, a
37ºC, durante 120 min.
Después de los tratamientos líticos, se incubaron
los tejidos, durante 8 días, en DMEM-FBS al 5%. En
este momento, los tejidos tratados se fijaron en formalina. Todos
los tejidos fijados se montaron en parafina, se seccionaron y se
mancharon con hematoxilina y eosina para visualizar las células. Una
micrografía representativa en la Figura 1 muestra el modelo de
celularidad de una hoja de válvula aórtica fresca con una capa
endotelial sobre las superficies tanto fibrosa como ventricular y
fibroblastos por todo el espesor completo del tejido. Las Figuras
2a y 2b muestran micrografías de conducto de válvula pulmonar y
miocardio, respectivamente, después de la despoblación, con aspecto
esencialmente acelular.
Se recuperaron hojas aórticas porcinas y se
despoblaron según se define en el EJEMPLO 1. Las hojas se incubaron
en 5 ml de aH_{2}PO_{4}/glicerina/amortiguador BSA (por sus
siglas en inglés), a 37ºC. Se añadió fibronectina de plasma humano
al amortiguador a una concentración de 10 \mug/ml junto con 1
\mug/ml de heparina, durante 16 h, seguido por la adición de bFCF
recombinante humano a una concentración de 2,5 \mug/ml junto con
0,83 \mug/ml de heparina, durante 6 h adicionales. Después de
esta incubación, se añadieron fibroblastos dérmicos bovinos,
previamente aislados por técnicas de cultivo de explante clásicas, a
las hojas de válvulas cardíacas, a 2x10^{4} células/ml. Las hojas
y las células se incubaron durante 11 días. Siguiendo a la
incubación, se pusieron secciones valvulares en formal para
análisis histológico. La Figura 3a es una micrografía
representativa de una hoja de válvula aórtica descelularizada. La
Figura 3b es una micrografía representativa de una hoja aórtica
descelularizada tratada con, tanto fibronectina como bFCF, que
mostraba repoblación con fibroblastos exógenos.
Se despoblaron hojas de válvulas cardíacas,
aórticas, porcinas, como en el Ejemplo 1 y se repoblaron con dos
cepas clínicas diferentes de fibroblastos dérmicos de oveja, de
acuerdo con la técnica en el Ejemplo 2. Después de 10 días de
repoblación, las hojas se trasladaron a recipientes frescos y se
incubaron, durante 48 h, en 1,0 \muCi/ml de
[^{3}H]prolina en DMEM que contenía gentamicina y 50
\mug/ml de ácido ascórbico, 50 \mug/ml de
\beta-aminopropionitrilo. Se determinaron
proteínas totales sintetizadas por radioactividad precipitada de
ácido tricloroacético al 10%, recuperada del medio y extractos de
tejido hechos 10 mM en N-etilmaleimida, 25 mM en
AEDT y 10 mM en fluoruro de fenilmetilsulfonilo para evitar la
proteolisis; se analizó adicionalmente proteína precipitada por
digestión con colagenasa Clostridial sin actividad de
proteasa no específica para definir el contenido en colágeno. Como
se muestra en la Figura 4, la actividad sintética de proteína de
tejido despoblado fue cero. Siguiendo a la repoblación, se detectó
síntesis de proteína significativa por incorporación de
[^{3}H]prolina que se sintetizó a la misma velocidad que
se determinó en tejido porcino fresco; el colágeno representaba
3,6% de la síntesis de proteína total y la mayoría de esto se
segregó en el medio. Estos resultados indican que las hojas porcinas
hechas tratadas por los procedimientos de despoblación descritos en
la realización preferida de la invención, no indican capacidad
sintética de proteínas en general ni síntesis de colágeno en
particular. La aplicación con éxito de procedimientos de repoblación
se indica por la capacidad para impartir la función celular de
síntesis de proteínas a la hoja despoblada por el suministro de
fibroblastos exógenos durante el procedimiento de repoblación.
Se consiguió la eliminación de células y
proteínas solubles por procedimientos descritos en el Ejemplo 1. Se
investigaron las consecuencias inmunológicas de la despoblación de
hojas por comparación con hojas viables crioconservadas. Los
resultados de estudios sobre la respuesta inmunitaria humoral se
presentan en la Figura 5. La respuesta inmunitaria humoral se
evaluó usando una técnica de captura de anticuerpos en que se
usaron extractos de antígeno en NaCl 0,1 M de hojas crioconservadas
no modificadas, para investigar sueros de conejos inmunizados con
extractos de NaCl de, bien hojas despobladas de células modificadas
u hojas de control. Las emulsiones de tales extractos se hicieron en
adyuvante completo de Freund al 50% (v/v); se pusieron porciones de
0,1 ml de estas emulsiones en diez sitios intradérmicos a lo largo
de los dorsos de conejos macho, blancos, de Nueva Zelanda,
separados. Después de dos semanas, se volvió a exponer a los
animales a extractos adicionales de hojas crioconservadas o
despobladas, emulsionadas en adyuvante incompleto de Freund.
Después de 1,5 meses, los animales se sangraron. Se prepararon
sueros inmunitarios y se investigaron anticuerpos tanto IgG como
IgM usando antisueros de IgG anticonejo de cabra e IgM anticonejo
de cabra, conjugados a fosfatasa alcalina. En la Figura 5, el suero
de receptores de tejido despoblado mostró -50% de respuesta de IgG
y <5% de la respuesta de IgM observada en conejos inmunizados
con extractos de hoja crioconservada. Estas observaciones indican
atenuación de la respuesta inmunitaria humoral a tejido despoblado
por las técnicas descritas en la realización preferida de la
invención.
Se consiguió la eliminación de células y
proteínas solubles por procedimientos descritos en el Ejemplo 1. Se
insertaron trozos divididos de hojas de válvulas aórticas,
porcinas, despobladas (acelulares) y crioconservadas (celulares), en
bolsas formadas en los subcúbitos dorsales de conejos macho,
blancos, de Nueva Zelanda. Las bolsas se cerraron y después de dos
semanas, se recuperaron quirúrgicamente los implantes y tejidos
circundantes (piel a músculo) y se fijaron en formalina para
análisis histopatológico después de manchar secciones embebidas en
parafina con hematoxilina y eosina. La Figura 6 muestra que las
hojas despobladas motivaron respuestas celulares mínimas en
comparación con controles crioconservados. El tejido crioconservado
que contenía tanto una capa celular endotelial así como fibroblastos
estimuló respuesta celular inmunitaria e inflamatoria,
significativa, con gran número de heterófilos y linfocitos y
células del plasma en el área del implante así como dentro de los
implantes mismos. En implantes de tejido despoblado, eran pocas
células tanto inflamatorias como inmunitarias, en número y más
limitadas en distribución.
La eliminación de células y proteínas solubles de
hojas de válvulas cardíacas aórticas, porcinas y conducto aórtico,
se consiguió por procedimientos descritos en el Ejemplo 1. Trozos
divididos de estos tejidos y sus contrapartidas de válvulas
cardíacas aórticas, porcinas, frescas y crioconservadas, se
congelaron frescas en nitrógeno líquido, en medio de montaje en
criosección, se cortaron en secciones de 8-10
\mum, se montaron en portaobjetos de vidrio de carga modificada.
Después de fijación en acetona, a 4ºC, se investigaron los tejidos
con una lectina-I Bandeiraea simplicifolia conjugada
con biotina que se une a proteínas modificadas de
galactosa-\alpha-1,3-galactosa,
específicas, encontradas en las membranas de células porcinas.
Estas proteínas modificadas son los sitios de unión de anticuerpos
anti-porcino, naturales, formados previamente, que
inician respuestas de rechazo hiperagudo de tejidos porcinos en
primates (incluyendo el hombre). Se detectaron proteínas que se unen
a esta lectina haciendo reaccionar después las secciones con mezcla
de peroxidasa de rábano conjugada a
biotina-avidina, peróxido de hidrógeno y
3,3'-diaminobencidina. La presencia de antígenos
porcinos se detectó por desarrollo de color. En la Figura 7a, el
análisis microscópico de secciones mostró antígeno asociado a
células en hoja aórtica crioconservada. La Figura 7b demuestra unión
de antígeno fuertemente disminuida después de la descelularización
de la hoja aórtica. Este estudio muestra que el procedimiento de
despoblación como se presenta en la realización preferida de la
invención, reduce los antígenos críticos que probablemente causan
rechazo de un injerto porcino por un receptor humano.
Se esterilizaron válvulas cardíacas, aórticas,
porcinas, recién obtenidas, con mezcla antibiótica y se
crioconservaron en condiciones que mantenían la viabilidad celular.
Para la despoblación, se descongelaron válvulas aórticas
rápidamente, a 37ºC, después se trataron con solución de
hipotonicidad baja, nucleasas y solución de sal equilibrada,
durante 10 días. Para ensayo biomecánico, se cortaron hojas en
tiras circunferenciales o radiales, montadas sobre un Máquina para
Ensayos de Materiales, Modelo 1.011 de Instron, bajo presión de
cierre calibrada. El tejido se bañó en solución de sal equilibrada
de Hanks, a 37ºC o 4ºC, durante el ensayo. Después de la
determinación de la longitud entre puntos y 20 ciclos de
preacondicionamiento (carga de 100 g para tiras circunferenciales y
180 g para tiras radiales), cada muestra se ensayó como sigue:
- 1) Una única carga frente a ensayo de elongación, cuyos resultados se muestran en la Figura 8. Las tiras radiales eran más ensanchables que las circunferenciales en todas las condiciones. El módulo del tejido no se vio afectado por ningún tratamiento, pero las tiras radiales despobladas eran significativamente más ensanchables que el tejido fresco (113 \pm 11,8 frente a 85,9 \pm 8,6 mm/mm);
- 2) Un ensayo de relajación de tensión, cuyos resultados se muestran en la Figura 9. Para tiras circunferenciales y radiales, se disipó aproximadamente 10% de la tensión original en los primeros 10 s. En conjunto, la velocidad de pérdida de tensión pareció mayor en tiras radiales en general y fue más rápida en tiras radiales crioconservadas. A la terminación del ensayo, la tensión restante en tiras circunferenciales, despobladas, a 37ºC, fue significativamente mayor que en tejido fresco; no había diferencias significativas en las tiras radiales; y
- 3) Un ensayo de falta de tracción, cuyos resultados se muestran en la Figura 10. Para cada condición, las tiras circunferenciales fueron más fuertes, más rígidas y más tenaces que las tiras radiales. La crioconservación y la despoblación no afectó a estos parámetros medidos en la dirección circunferencial. Las tiras radiales cortadas, de tejido despoblado, a cualquier temperatura, mostraron mayor tenacidad cuando se compara con frescas.
La descripción contenida en la presente memoria
contiene las realizaciones preferidas de la invención. Sin embargo,
se contemplan numerosas realizaciones alternativas como que están
incluidas dentro del alcance de la invención. Por las explicaciones
y por ejemplo, se demuestran las características importantes de la
invención: 1) eliminación de células xenogénicas y membranas
celulares de un tejido potencialmente útil como injerto implantable
o trasplantable en seres humanos (mostrado por análisis histológico
y bioquímico); 2) bajo la influencia de glucoproteína de matriz
extracelular, glucosaminoglucano y factor de crecimiento, el tejido
acelular se puede repoblar con células exógenas, potencialmente
procedentes del receptor de los injertos; 3) mantenimiento de
propiedades biomecánicas similares a las de tejidos crioconservados
que se utilizan ellos mismos como materiales de injerto estables; y
4) como un resultado del procedimiento de despoblación, se reduce
la propensión de tejido despoblado a estimular una respuesta
inmunitaria inflamatoria y celular y humoral en el receptor.
Claims (89)
1. Un procedimiento para generar tejido o
injertos para implante, para un receptor de implante en el que el
tejido o los injertos para implante tiene(n) compatibilidad
mejorada con el sistema inmunitario del receptor del implante, que
comprende:
- A.
- eliminar células naturales y otros componentes extracelulares de un tejido del donador para proporcionar una matriz de tejido descelularizada;
- B.
- tratar la matriz de tejido, descelularizada, con un factor de adherencia celular para fomentar la unión posterior de células alogénicas o autógenas cultivadas, dentro de la matriz de tejido, siendo dichas células alogénicas o autógenas al receptor; y
- C.
- repoblar la matriz de tejido con las células alogénicas o autógenas, cultivadas.
2. El procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el tejido para implante se genera a partir de: tejido de
colágeno natural, tejido valvular cardíaco, tejido conjuntivo o
vasos sanguíneos.
3. El procedimiento según la reivindicación 2, en
el que el tejido cardíaco es tejido valvular cardíaco pulmonar o
aórtico.
4. El procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el implante se genera por tratamiento de tejido de origen no
humano.
5. El procedimiento según la reivindicación 1, en
el que las células usadas para repoblar la matriz de tejido son de
origen humano.
6. El procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el tejido generado es sustancialmente no inmunógeno en el
implante.
7. El procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el implante se genera por tratamiento de tejido de origen no
humano, en el que las células usadas para repoblar la matriz de
tejido son de origen humano y en el que el tejido generado es
sustancialmente no inmunógeno en el implante.
8. El procedimiento según la reivindicación 7, en
el que el tejido se repobla por incubación de la matriz de tejido
en presencia de células de tipo fibroblasto y factor de crecimiento
de fibroblasto.
9. El procedimiento según la reivindicación 8, en
el que las células de tipo fibroblasto son células alogénicas.
10. El procedimiento según la reivindicación 8,
en el que las células de tipo fibroblasto proceden de estirpes
celulares estables.
11. El procedimiento según la reivindicación 8,
en el que las células de tipo fibroblasto se modifican
genéticamente por técnicas de transfección estable con material
genético exógeno.
12. El procedimiento según la reivindicación 8,
en el que las células de tipo fibroblasto son de origen humano y se
modifican para que sean sustancialmente no inmunógenas al receptor
del implante de tejido.
13. El procedimiento según la reivindicación 8,
en el que las células de tipo fibroblasto son de origen humano y se
modifican para expresar proteínas específicas.
14. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que las células naturales se eliminan por tratamiento del
tejido con una solución eficaz para producir la lisis de las
células.
15. El procedimiento según la reivindicación 14,
que además comprende: tratamiento del tejido con enzima nucleasa
eficaz para descelularizar la matriz de tejido y proporcionar una
matriz de tejido de capacidad inmunógena limitada.
16. El procedimiento según la reivindicación 15,
en el que el tejido se trata con una nucleasa, seleccionada del
grupo que comprende: ARNasa A, ADNasa I, EcoR I y Hind III.
17. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la etapa (A) comprende: tratar el tejido con solución de
fuerza iónica baja y ADNasa I y ARNasa A, eficaz para eliminar
células naturales y proporcionar una matriz de tejido de capacidad
inmunógena limitada y en el que se eliminan partículas celulares,
proteína soluble y otra materia, por lavado del tejido para
proporcionar una matriz de tejido sustancialmente sin componentes de
tejido, naturales, antigénicos, con respecto al receptor del
implante.
18. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la matriz de tejido se trata con un factor de adherencia
celular constituido por una glucoproteína y un glucosaminoglucano
eficaz para fomentar la unión de las células a la matriz de tejido
durante la etapa de repoblación celular.
19. El procedimiento según la reivindicación 18,
en el que el glucosaminoglucano es: heparina, sulfato de heparina,
condroitina, sulfato de condroitina, dermatina o sulfato de
dermatina.
20. El procedimiento según la reivindicación 18,
en el que la glucoproteína es fibronectina.
21. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que durante la etapa (B), la matriz de tejido se trata con
factor de adherencia celular constituido por una o más proteínas
extracelulares ordinariamente asociadas con el tejido natural
eficaz para fomentar la unión celular a la matriz de tejido durante
la etapa (C) de repoblación.
22. El procedimiento según la reivindicación 21,
en el que el tejido natural es tejido valvular cardíaco de origen
porcino.
23. El procedimiento según la reivindicación 22,
en el que la matriz de tejido valvular se repobla por incubación de
la matriz de tejido, tratada de acuerdo con la etapa (B), en
presencia de células de tipo fibroblasto, alogénicas o autógenas, y
factor de crecimiento de fibroblastos, para proporcionar un
implante valvular xenogénico, repoblado y revitalizado por dichas
células de tipo fibroblasto y que es sustancialmente no inmunógeno
en la implantación.
24. El procedimiento según la reivindicación 23,
en el que la matriz de tejido valvular se prepara por eliminación
de células de tejido naturales y por tratamiento con enzimas o
nucleasas para proporcionar la matriz de tejido.
25. El procedimiento según la reivindicación 24,
en el que la nucleasa es ADNasa I.
26. El procedimiento según la reivindicación 24,
en el que la nucleasa es ARNasa A.
27. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el tejido para implante es tejido para implante alogénico
o xenogénico.
28. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el tejido xenogénico se trata para mejorar su
compatibilidad con el sistema inmunitario de un receptor del
implante de una especie diferente de la especie de la fuente del
tejido natural; en el que el tejido se descelulariza durante la
etapa (A) y en el que el factor de unión celular de la etapa (B)
comprende una o más proteínas extracelulares ordinariamente
asociadas con el tejido natural en un vehículo líquido y en el que
la matriz de tejido se repobla después en la etapa (C), con células
autógenas o alogénicas al receptor del implante, para proporcionar
un implante o injerto sustancialmente no inmunógeno y
biomecánicamente aceptable que se vitaliza por la repoblación
celular y es histológicamente y bioquímicamente similar al tejido
natural correspondiente.
29. El procedimiento según la reivindicación 28,
en el que el tejido natural tratado es: tejido cardíaco, tejido
vascular, tejido conjuntivo o tejido de colágeno.
30. El procedimiento según la reivindicación 29,
en el que los factores de adherencia incluyen una glucoproteína y
un glucosaminoglucano.
31. El procedimiento según la reivindicación 30,
en el que la matriz de tejido se repobla con células de tipo
fibroblasto inmunológicamente compatibles con el receptor del
implante.
32. El procedimiento según la reivindicación 31,
en el que las células de tipo fibroblasto se modifican
genéticamente por técnicas de transfección estable con material
genético exógeno.
33. El procedimiento según la reivindicación 31,
en el que las células de tipo fibroblasto son de origen humano y se
modifican para que sean sustancialmente no inmunógenas en la
implantación.
34. El procedimiento según la reivindicación 31,
en el que las células de tipo fibroblasto son de origen humano y se
modifican para expresar proteínas específicas.
35. El procedimiento según la reivindicación 31,
en el que el factor de adherencia está constituido por fibronectina
y un glucosaminoglucano seleccionado del grupo que consta de:
dermatina, sulfato de dermatina, condroitina, sulfato de
condroitina, sulfato de heparina y heparina.
36. El procedimiento según la reivindicación 35,
en el que el tejido natural es tejido valvular cardíaco, porcino, y
en el que la etapa de repoblación celular se conduce por incubación
de la matriz de tejido en un entorno nutritivo y en presencia de
células de tipo fibroblasto y una cantidad eficaz de factor de
crecimiento de fibroblastos.
37. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que los implantes o injertos de tejido de colágeno,
conjuntivo o vascular que son xenogénicos a un receptor humano se
generan in vitro por descelularización y lavando el tejido
natural en la etapa (A), para eliminar antígenos celulares o
antígenos extracelulares, o ambos, seguido por tratamiento de la
matriz de tejido en la etapa (B), con factores de adherencia
constituidos por fibronectina y heparina, eficaz para fomentar la
unión a la misma de células de tipo fibroblasto inmunológicamente
aceptables al receptor del implante o injerto, en el que la matriz
de tejido tratada con factor de adherencia se repobla en la etapa
(C), por incubación de la matriz en presencia de las células de
tipo fibroblasto y factor de crecimiento de fibroblastos hasta que
tal repoblación celular proporciona un tejido vitalizado
histológicamente similar al correspondiente tejido natural y en el
que el tejido para implante generado es mecánicamente,
bioquímicamente e inmunológicamente adecuado para implantación.
38. El procedimiento según la reivindicación 37,
en el que la fibronectina comprende fibronectina de plasma humano o
fibronectina de tejido humano.
39. El procedimiento según la reivindicación 38,
en el que el tejido es tejido de colágeno.
40. El procedimiento según la reivindicación 38,
en el que el tejido es tejido conjuntivo.
41. El procedimiento según la reivindicación 39,
en el que las células de tipo fibroblasto son células de tipo
fibroblasto, humanas, cultivadas.
42. El procedimiento según la reivindicación 41,
en el que el tejido natural es tejido valvular cardíaco y en el que
las células de repoblación son células de tipo fibroblasto,
humanas.
43. El procedimiento según la reivindicación 37,
que además comprende la etapa de crioconservación de la matriz de
tejido en una fase previa a la etapa de repoblación celular.
44. El procedimiento según la reivindicación 40,
en el que el tejido natural se descelulariza por tratamientos que
incluyen tratamiento con nucleasas de manera que se limite la
generación de nuevos sitios inmunológicos.
45. El procedimiento según la reivindicación 37,
en el que la heparina adhiere fibronectina a porciones de la matriz
de tejido y en el que se emplea factor de crecimiento de
fibroblastos recombinante humano, básico.
46. El procedimiento según la reivindicación 45,
en el que la matriz de tejido es tejido valvular cardíaco aórtico o
pulmonar.
47. El procedimiento según la reivindicación 37,
en el que las células de tipo fibroblasto son células
autógenas.
48. El procedimiento según la reivindicación 37,
en el que la célula de tipo fibroblasto son células alogénicas.
49. El procedimiento según la reivindicación 37,
en el que la célula de tipo fibroblasto procede de estirpes
celulares estables.
50. El procedimiento según la reivindicación 37,
en el que la célula de tipo fibroblasto se modifica genéticamente
por técnicas de transfección estable con material genético
exógeno.
51. El procedimiento según la reivindicación 37,
en el que las células de tipo fibroblasto son de origen humano y se
modifican para que sean sustancialmente no inmunógenas en la
implantación.
52. El procedimiento según la reivindicación 37,
en el que las células de tipo fibroblasto son de origen humano y se
modifican para expresar proteínas específicas.
53. El procedimiento según la reivindicación 37,
en el que el tejido es de origen porcino o bovino, el factor de
matriz de adherencia comprende fibronectina y heparina purificadas
y en el que las células de repoblación son células de tipo
fibroblasto, humanas, en presencia de cantidades eficaces de factor
de crecimiento de fibroblastos, básico o ácido, y el tejido para
implante producido es un implante xenogénico sustancialmente sin
respuesta inmunitaria adversa en la implantación en un ser
humano.
54. El procedimiento según la reivindicación 37,
en el que la etapa de descelularización comprende tratar los
tejidos con una solución de fuerza iónica baja y nucleasas.
55. El procedimiento según la reivindicación 54,
en el que la solución de fuerza iónica baja, de nucleasas, incluye
al menos un miembro seleccionado del grupo que consta de: ARNasa A,
ADNasa I, EcoR I y Hind III.
56. El procedimiento según la reivindicación 37,
en el que el tejido natural es tejido de colágeno; el tejido se
descelulariza en la etapa (A) y se trata con una solución de fuerza
iónica baja y ADNasa I y ARNasa A, eficaz para eliminar células
naturales y proporcionar una matriz de tejido de capacidad
inmunógena limitada; y la matriz de tejido se trata en la etapa
(B), con una cantidad de una solución amortiguada que contiene
fibronectina y sulfato de heparina, eficaz para proporcionar sitios
asociados con la matriz de tejido que faciliten la unión de células
de tipo fibroblasto a la misma; y en el que la matriz de tejido se
repobla en la etapa (C) por su incubación junto con células de tipo
fibroblasto, de origen humano, en presencia de una cantidad de
factor de crecimiento de fibroblastos, eficaz para facilitar
crecimiento celular y la repoblación de la matriz de tejido con
células de tipo fibroblasto.
57. El procedimiento según la reivindicación 56,
en el que el tejido para trasplante es tejido valvular cardíaco,
porcino.
58. El procedimiento según la reivindicación 56,
en el que las células de tipo fibroblasto son autógenas.
59. El procedimiento según la reivindicación 56,
en el que las células de tipo fibroblasto son alogénicas.
60. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que durante la etapa (A), se genera matriz de tejido
sustancialmente no inmunógena, que es adecuada para tratamiento
posterior en un tejido para implante, en el que las células
naturales se eliminan por tratamiento del tejido con componentes
seleccionados del grupo que consta de enzimas y nucleasas eficaces
para inhibir crecimiento celular natural posterior, en el tejido
tratado y eficaz para limitar la generación de nuevos sitios
inmunológicos en el tejido.
61. El procedimiento según la reivindicación 60,
en el que el tejido se trata con una solución de fuerza iónica
baja, de nucleasas, eficaz para descelularizar la matriz de tejido
y proporcionar una matriz de tejido de capacidad inmunógena
limitada.
62. El procedimiento según la reivindicación 61,
en el que la solución de fuerza iónica baja, de nucleasas, incluye
al menos un miembro del grupo de: ARNasa A, ADNasa I, EcoR I y Hind
III.
63. El procedimiento según la reivindicación 61,
en el que la nucleasa empleada es ribonucleasa A y
desoxirribonucleasa I.
64. El procedimiento según la reivindicación 60,
que además comprende crioconservación de la matriz de tejido
después de la etapa (A) y previamente a tratamiento adicional.
65. El procedimiento según la reivindicación 61,
que además comprende crioconservar la matriz de tejido después de
la etapa (A) y previamente a tratamiento adicional.
66. El procedimiento según la reivindicación 64,
que además comprende esterilizar el tejido o la matriz de tejido o
ambos.
67. El procedimiento según la reivindicación 60,
en el que el procedimiento comprende crioconservar tejido de un
donador mamífero natural y después eliminar el tejido de
crioconservación, previamente a tratamiento de acuerdo con la
reivindicación 53.
68. El procedimiento según la reivindicación 67,
en el que la matriz de tejido es de origen valvular cardíaco,
porcino.
69. El procedimiento según la reivindicación 68,
en el que la válvula cardíaca es una válvula cardíaca pulmonar o
una aórtica.
70. El procedimiento según la reivindicación 60,
en el que dicha descelularización comprende tratamiento con una
solución acuosa hipotónica.
71. El procedimiento según la reivindicación 70,
en el que dicha solución acuosa, hipotónica, es una solución acuosa
amortiguada eficaz para causar lisis celular.
72. El procedimiento según la reivindicación 71,
en el que el tejido es tejido valvular cardíaco, porcino.
73. El procedimiento según la reivindicación 72,
en el que la válvula cardíaca es una válvula cardíaca pulmonar o
una aórtica.
74. El procedimiento según la reivindicación 73,
que además comprende la etapa de crioconservar la matriz valvular
cardíaca, porcina, producida.
75. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que se genera la válvula cardíaca xenogénica a partir de
tejido valvular, porcino o bovino, que es histológicamente e
inmunológicamente adecuado para implantación de válvula cardíaca en
un ser humano o receptor mamífero; en el que el tejido valvular,
natural, se descelulariza en la etapa (A), para proporcionar una
matriz de tejido valvular cardíaco, descelularizada,
sustancialmente sin antígenos celulares naturales y tratada para
limitar la generación de nuevos sitios inmunológicos; y se aplican
factores de unión durante la etapa (B), a la matriz de tejido
valvular, constituida por una o más proteínas extracelulares
ordinariamente asociadas con el tejido natural, eficaz para fomentar
la unión de células de tipo fibroblasto a la matriz; y se repobla
la matriz de tejido valvular durante la etapa (C), con células de
tipo fibroblasto, alogénicas o autógenas, en presencia de factor de
crecimiento de fibroblastos inmunológicamente aceptable para el
receptor del implante, para proporcionar un tejido valvular
vitalizado.
76. El procedimiento según la reivindicación 75,
en el que la válvula cardíaca es una válvula cardíaca pulmonar o
una aórtica.
77. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que se genera un injerto o un implante valvular cardíaco,
porcino, adecuado para uso en un receptor humano por
descelularización del tejido natural durante la etapa (A), en el que
es eficaz tratar el tejido con enzimas o nucleasas para
descelularizar la matriz de tejido y proporcionar una matriz de
tejido de capacidad inmunógena limitada; y aplicar una cantidad
eficaz de fibronectina de plasma humano y heparina, durante la
etapa (B), a la matriz de tejido valvular para fomentar la unión
celular de células de tipo fibroblasto, alogénicas o autógenas, y
repoblar la matriz de tejido valvular en la etapa (C), con células
de tipo fibroblasto, por incubación de la matriz valvular en un
medio nutritivo constituido por células de tipo fibroblasto,
humanas, cultivadas, y factor de crecimiento de fibroblastos
recombinante humano.
78. El procedimiento según la reivindicación 77,
en el que la válvula cardíaca es una válvula cardíaca pulmonar o
una aórtica.
79. El procedimiento según la reivindicación 77,
en el que la etapa (A) comprende las etapas de: producir la lisis
del tejido natural y tratamiento con ARNasa A y ADNasa I.
80. El procedimiento según la reivindicación 79,
en el que las células de tipo fibroblasto son células
autógenas.
81. El procedimiento según la reivindicación 79,
en el que se aplican los factores de adherencia poniendo la matriz
de tejido en un medio nutritivo que contiene factores de adherencia
y en el que se emplean después las células de tipo fibroblasto y
factor de crecimiento de fibroblastos, para repoblar la matriz
añadiéndolos en cantidades eficaces al medio nutritivo que contiene
la matriz de tejido.
82. El procedimiento según la reivindicación 79,
en el que las células de tipo fibroblasto son alogénicas.
83. El procedimiento según la reivindicación 79,
en el que las células de tipo fibroblasto son autógenas.
84. El procedimiento según la reivindicación 79,
que además comprende la etapa de crioconservar la matriz de tejido
previamente a tratamiento adicional.
85. El procedimiento según la reivindicación 77,
en el que las células de tipo fibroblasto proceden de estirpes
celulares estables.
86. El procedimiento según la reivindicación 77,
en el que las células de tipo fibroblasto se modifican
genéticamente por técnicas de transfección estable con material
genético exógeno.
87. El procedimiento según la reivindicación 77,
en el que las células de tipo fibroblasto son de origen humano y se
modifican para que sean sustancialmente no inmunógenas en la
implantación.
88. El procedimiento según la reivindicación 77,
en el que las células de tipo fibroblasto son de origen humano y se
modifican para expresar proteínas específicas.
89. El procedimiento según la reivindicación 2,
en el que el tejido valvular son hojas de válvula cardíaca, tejido
de miocardio asociado con la válvula, conducto aórtico
ensanchándose sobre el lado del ventrículo derecho de la válvula o
el pedículo de la válvula ensanchándose a la aurícula.
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