KR100483863B1 - 고체분말을 이용한 3차원 세포 배양방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생체에 이식이 가능한 고체 소재를 분말 화하여 주사가 가능하도록하고 여기에 세포를 배양, 부착하여 주사제로서 생체 주입이 가능하도록 구성한 것에 관한 것으로 세포배양 후 생체 주사 이식 체로서 크기가 20-500 ㎛인 기포 없는 고체 분말을 이용하는 것을 특징으로 하는 세포배양 후 생체 주사 이식 체로서 고체분말을 이용하는 방법이다.

Description

고체분말을 이용한 3차원 세포 배양방법{Three dimensional cell culturing methods using injectable solid particles }

본 발명은 지방 전구세포, 연골모세포, 골모세포의 주사이식에 필요한 전단계로서 주사가능한 스폰지 구조가 아닌 고체 분말을 이용한 3차원 세포 배양 방법에 관한 것이다.

본 발명은 기존의 생체 부피 대체 효과나 주름제거를 위해 사용해 왔던 동종조직이나 고체분말가루에 원하는 조직의 세포를 배양 혼합하여 인체에 주입할 수 있는 단계로 세포를 배양하는 방법에 관한 것으로 소재 공급이 원활하고 경제적으로 배양 가능하도록 함으로서 인체내 원하는 조직의 부피 대체 시술을 경제적으로 실시할 수 있도록 함에 있다.

생체의 부피 대체효과를 위해 스펀지 구조의 고체입자를 세포 배양하여 주사제로 이용하는 방법 및 기술에 관련하여 대한민국 특허출원10-2002-0025375,10-2002-0061701,10-2002-0064189에 의해 기 제시된바 있다.

기 제시한 방법은 고체 스폰지 가루들을 이용한 세포배양과 주사이식에 관련된 기술로서 스폰지가루를 사용함으로서 세포배양의 용이성과 효율에서 매우 유리한 측면이 있었다.

그러나 스폰지가루, 즉, 미세기포를 갖는 스폰지 미세 입자를 제조하는데 있어서 많은 노력과 비용이 소모될 수 있고 미세기포를 갖기 어려운 소재에서는 사용이 불가능하다는 점에서 사용이 제한되는 단점이 있다.

그럼에도 불구하고, 기존의 고체에서의 3차원 세포 배양이 스폰지구조에서만 가능하였던 것은 분말이 아닌 큰 덩어리의 고체는 스폰지구조가 아니면 배양약이 침투 될 수 없고, 3차원 배양의 경우 스폰지구조이어야 한다는 고정 관념에 기인되는 것으로 이러한 고정관념은 세포배양의 효율성을 지나치게 강조한 바에 기인된 측면이 있었다.

또한, 세포 배양과정에서 사용되는 배양액은 소의 혈장액(bovine serum)과 같이 인체내에 들어가서는 안돼는 성분이 포함되어 있어 인체주입 전에 세척하여 제거하는 과정을 거치는데 스폰지 분말구조에서는 스폰지의 미세구멍 사이사이에 배양액이 잔류될 가능성이 높다.

배양액속의 bovine serum은 인체와 다른 단백질 구성성분이므로 인체에 주입되면 면역반응을 일으킬 수 있어 가능한 한 완전한 제거가 필요하다.

배양액의 세척은 인체에 무해한 PBS(posphate buffer saline)으로 세포가 떨어지지 않도록 천천히 세척해야 하는데 스폰지 구조에서는 7 회 이상의 세척과정이 필수적이며 세척 횟수가 증가하면 아무리 서서히 세척하더라도 이 과정 중에서 증식 부착되어 있던 지방전구세포의 손실이 있게 된다.

본 발명은 기존에 제시하였던 스폰지구조를 사용하는 세포 배양 및 주사법의 단점을 보완하는 방법으로서 세포배양목적이 아닌 단순한 부피 대체용 소재들(예를 들어 동종 근막조직, 동종 진피조직, 고어텍스, PLGA등)도 전자현미경으로 본 결과 세포가 부착할 수 있는 요철과 융기구조를 가지고 있다는 것에 착안하여 보다 경제적이고 현실적용이 가능한 방법을 제시함에 있다.

기존의 주사용 소재들은 인체내 주사시 섬유 조직으로만 대치되거나 단단한 특성을 지녀 인체의 여러 조직의 탄성을 가질 수 없었지만 원하는 세포를 부착함으로써 인체의 조직 탄성과 같은 탄성을 생성할 수 있다는 점에서 매우 유용한 장점이 있다.

또한, 부피 대체 효과 역시 세포 부착 없이 주입하는 것보다는 많은 부피효과를 줄 수 있다는 이득도 얻을 수 있다. 실 예로 기존의 주름제거용으로 동종진피가루나 동종 근막 가루, 키토산등을 주입하는 경우 동종진피가루는 일부가 잔류하고 일부는 섬유조직으로 대치되어 피부의 탄성과는 달리 딱딱한 느낌을 주게 되는 단점이 있으며 동종 근막조직은 거의 대부분이 섬유조직으로 대치되며 초기의 부피효과는 감소하게 된다. 이러한 경우에 지방전구세포를 배양 부착하여 주입하게 되면 동종진피가루 사이사이에 지방 세포가 존재하게 되어 부피대체의 효과를 극대화 할 수 있고 지방전구세포가 삼차원 성장하면서 인체의 연부조직과 같은 탄성을 갖는 특성을 가질 수 있게 되는데 이때 세포와 같이 주입된 소재는 인체내에서 부착된 세포의 삼차원 성장이 가능한 공간을 제공하게 된다.

기 제시된 유사한 개념으로서 스폰지구조를 갖는 가루의 사용은 스폰지구조를 제조할 수 있는 소재가 제한되어 현실 구현이 어려울 가능성이 높고 스폰지구조가 아닌 고체분말도 세포 배양 및 생체 주사제로 유용하고 효과적으로 사용할 수 있음을 밝혀 세포배양의 효율성이라는 측면을 배제할 경우 경제적이고 간편하게 취득 활용할 수 있는 고체분말을 이용한 세포배양법을 제공할 목적을 갖는다.

이를 위하여 본 발명은 지방전구세포(preadipocyte), 연골모세포(chondroblast), 골모세포(osteoblast)와 같은 계대배양된 배양체를 트립신(trypsin)으로 처리하여 세포들을 하나씩 분리시키고, 상기한 세포를 크기가 20-500 ㎛인 기포 없는 고체 분말로 이루어진 배양소재와 함께 배양액에 부유시키는 방법으로 고체분말과 배양소재를 혼합하며, 이후 이를 3~10 시간 배양하여 고체분말과 배양소재가 부착되도록 하는 것을 특징으로 하는 고체분말을 이용한 3차원 세포 배양방법을 제시한다.

상기에서 고체 분말은 체내 주입 가능한 물질로서 기포가 없는 미세입자라 하더라도 입자와 입자 사이의 공간이 기포로서 작용하여 배양액의 침투가 가능하고 기포는 없지만 고배율 확대사진에서 보면 세포가 붙을 수 있는 융기들이 있어 세포의 부착이 가능한 점에 착안 한 것이다.

적용되는 고체분말은 체내주입가능 물질로서 충분히 안정되고, 안전성이 입증되며, 쉽고 간편하게 획득 가능한 물질로서 인체 진피 조직을 처리하여 스폰지구조가 아닌 가루로 만든 상품인 Alloderm(미국 Life Cell사) 또는 Sheva(한국 한스바이오 메드사), Fascian(Fascia biosystem), 미세기포를 갖지 않는 키토산 가루, 고어텍스(PTFE)가루 또는 PLGA가 있다. 또한, 미세기포를 갖지 않는 hydroxyapatite가루,미세기포를 갖지 않는 methacrylate,미세기포를 갖지 않는 고체 실리콘가루가 사용될 수 있다.

이들 소재는 인체 전구세포들의 부착과 배양이 가능하고 주사로서 이식할 수 있는 20-500 ㎛의 크기를 갖는다.

기 제시된 스펀지구조의 경우 입자내부의 기포 사이에 세포배양이 이루어지고 배양액이 스폰지구조 깊숙이 침투되므로 완전한 배양액의 세척을 위해서는 입자의 크기가 20-250 ㎛로 제한하는 것이 유리하나 기포가 없는 고체 분말의 경우에는 그 크기가 20-500 ㎛ 로 확대될 수 있다.

이는 또한 고체분말을 적용하는 경우에는 스폰지구조와 달리 입자 사이사이의 공간을 활용하므로 큰 주사바늘을 사용해야 하지만 입자의 크기가 큰 것이 유실 확률을 줄여주고, 단일 입자에서의 부착면이 커서 상대적 위치 변화의 가능성이 적은 이점을 제공케 하는 의도를 갖는다.

또한, 이와 같이 함으로서 제조 공정에서 크기 선별의 노력도 줄일 수 있고, 비용감소와 공정의 단순화 목적과 작업 효율을 높일 수 있는 이점을 갖는다.

기포 없는 고체 분말을 세포배양에 이용함으로써 세포배양의 효율성은 약간 감소할 수 있지만 배양소재의 제조 가격을 낮추고 공정을 단축하며 적용범위를 확대할 수 있고 소재의 선택이 자유로우며 동시에 고체 스폰지가루를 이용한 경우와 같이 배양 후 주사 이식에 의해 체내 주입이 가능한 세포배양 소재의 역할을 할 수 있다.

이는 기존의 스폰지가루를 이용한 방법 외에 주사가능한 세포 배양과 주사 이식이 가능한 소재로서는 최초의 시도이며 스폰지가루에 비해 세포 배양효율에서는 약간의 손실이 있을 수도 있으나 소재의 종류에 따라 차이가 없을 수도 있으며 소재의 종류를 다양하게 하고 제작이 간편하다는 점에서 특징을 갖는 것이다.

상기한 고체분말은 도1 내지 도 4에 도시된 바와 같이 세포 배양이 가능한 배양 소재(scaffold)의 조건, 즉, 세포가 붙을 수 있는 입체 구조와 세포가 자랄 수 있는 공간, 배양액의 자유로운 침투, 친수성 소재 등을 구비하고 있다.

본 발명은 이들 중 세포가 붙을 수 있는 조건에서 격벽이나 복잡한 입체구조가 아니더라도 세포와 접하는 면이 있으면 세포 부착이 가능하며, 이들 역시 고배율 확대사진에서 보면 요철을 가진 구조로서 세포 부착이 가능하다.

미세 입자 사이의 공간들은 배양액이 모세관 현상에 의해 침투되는 공간이면서 동시에 세포가 자랄 수 있는 공간으로서 기포와 유사한 기능을 한다.

이는 주사에 필요한 과정 중에 입자들의 상대적 위치가 변하게 되면 입자마다 상대적 위치가 변하지 않는 공간들을 갖는 스폰지구조에 비해 세포가 자라던 공간이 변형되어 세포가 유실될 가능성이 높다는 점이 단점으로 제기될 수 있으나 수많은 입자 중에 상대적 위치가 변하지 않는 입자들도 많으므로 단지 확률적 상승이라는 것과 설사 부착이 떨어졌다 해도 주사이식 후 재 부착의 가능성이 있기 때문에 크게 문제되지 않는다.

상기한 방법은 배양소재와 배양된 전구세포의 주사이식에 필요한 매우 용이한 방법을 제공하는 점에 특징을 갖는 것이며, 이제껏 한번도 시도된 적이 없는 동종 진피 조직가루나 동종 근막가루를 이와 같은 방법에 이용한다는 점에 있어서 특징을 갖는다.

또한, 생체 조직 부피 대체를 위한 주사용 소재로서 자가 세포를 배양한 PLGA분말을 최초로 이용하되 현재 제조가 쉽고 구하기 쉬운 상태라는 것과 흔히 구할 수 있는 키토산 분말을 이용한다는 것등 생체 세포의 주사이식을 위한 소재에서 일련의 발전을 의미한다.

고어텍스 역시 가루로 만들었을 때 주사 소재로서 활용이 가능한데 이때 같은 목적으로서 사용할 수 있을 것이다.

기존의 고체에서의 3차원 세포 배양이 스폰지구조에서만 가능하였던 것은 분말이 아닌 큰 덩어리의 고체는 스폰지구조가 아니면 배양약이 침투 될 수 없기 때문이었으나 Alloderm 또는 Sheva, Facian, 고어텍스, 미세기포를 갖지 않는 키토산 가루, 또는 PLGA는 스펀지 구조가 아니더라도 배양액이 자유롭게 침투되어 3차원배양이 가능하게 되는 것이다.

본 발명의 유용한 실시형태는 다음과 같다.

실시례 1 ( 얼굴 중 볼의 20cc 부피 대체목적의 수술에 적용하기 위한 세포의 배양)

환자의 피하에서 지방흡입으로 약 3cc 정도의 지방조직을 얻은 후에 이를 콜라겐아제(collagenase)로 처리하여 지방전구세포(preadipocyte)를 분리한 후 4-6차례의 계대배양을 거친다. 계대 배양되어 숫자가 늘어난 세포들을 트립신(trypsin)으로 처리하여 세포들을 하나씩 분리시키고 충분한 양의 배양액에 부유시킨다. 여기에 동종 진피조직 가루를 함께 부유시켜 혼합한 후 골고루 혼합되었을 때 과도한 배양액을 적정량까지 제거한다. 이후 3-10시간 배양기에서 배양하여 동종 진피조직가루에 지방전구세포가 부착 할 수 있도록 하고 PBS로 2-3차례 배양액을 세척(washing)한 후에 인체에서 추출한 장액에 혼합하여 지방전구세포가 부착된 동종진피조직가루를 부피 대체용으로 주사기로 주입한다.

실시례 2 ( 미용목적의 코수술로 코증대술 및 코끝 교정술을 위한 세포배양-약 10 g 가량의 연골조직이 필요함)

환자의 귀에서 200mg 가량의 연골조직을 채취하여 이를 collagenase로 처리하여 연골모세포(Chondroblast)를 분리한 후 4-6차례의 계대배양을 거친다. 계대배양되어 숫자가 늘어난 세포들을 trypsin으로 처리하여 세포들을 하나씩 분리시키고 충분한 양의 배양액에 부유시킨다. 여기에 동종 근막조직 가루를 함께 부유시켜 혼합한 후 골고루 혼합되었을 때 과도한 배양액을 적정량까지 제거한다. 이후 3-10시간 배양기에서 배양하여 동종 근막조직가루에 지방전구세포가 부착 할 수 있도록하고 PBS로 2-3차례 배양액을 세척(washing)한 후에 인체에서 추출한 장액 혼합하여 부피 대체용으로 주사기로 주입한다.

상기한 각 실시례에 의하면, 주입 전 혼합액으로서 인체에서 채취한 장액(serum)을 사용할 수 있고, 계대 배양체로서 지방전구세포(preadipocyte), 연골모세포(chondroblast), 골모세포(osteoblast)가 유용하게 실시될 수 있으며, 배양 소재로서 동종진피조직가루, 키토산 가루, PLGA 가루, 동종 근막가루, 고어텍스 가루가 유용하게 사용될 수 있음을 보인 것이다.

또한, 기존의 3차원 배양을 위해서는 배양액이 포함된 스폰지 덩어리 내부에 세포들을 침투시키기 위해 주사기로 스폰지내에 주사하였는데 이는 균일한 세포 분포을 맞추기 어렵고 주사 압력과 주사시 마찰에 의해 세포의 유실도 있을 수 있는 단점이 있었는데 가루를 이용하고, 압력에 의한 삼투압 현상을 이용함으로서 이러한 단점을 극복할 수 있게 된다.

상기 실시례에서 배양된 세포들은 배양소재와 함께 주사기에 넣어 주사로서 신체의 부피 대체 부위에 진입시킴으로서 주사이식이 이루어지게 된다.

상기한 고체분말의 경우에는 스펀지 구조에서 배양액의 세척과 관련된 문제, 즉, 인체에 무해한 PBS(posphate buffer saline)으로 세포가 떨어지지 않도록 천천히 세척해야 하는데 스폰지구조에서는 7 회 이상의 세척과정이 필수적이며 세척 횟수가 증가하면 아무리 서서히 세척하더라도 이 과정 중에서 증식 부착되어 있던 지방전구세포의 손실이 있게 된다.

그러나 고체 분말의 경우에는 고체 분말 자체에 배양액이 잔류할 가능성이 적어 인체 주입 전 posphate buffer saline로 2회의 세척만으로도 배양액의 함유량을 안전한 수준까지 낮출 수 있다.

따라서 기포구조가 없는 고체 분말은 인체에 주입시 이종 단백질에 의한 면역반응의 위험성이 적으며 세척 공정이 단순화되며 동시에 세포 유실의 가능성이 적다는 장점이 있다.

이러한 이유로 스폰지구조의 분말을 사용하는 경우에 비해서도 세포 배양 효율이 크게 차이나지 않으므로 효율의 저하가 문제되지 않는다.

본 발명은 크기가 20-500 ㎛인 기포 없는 고체 분말을 세포배양에 이용함으로써 배양소재의 제조 가격을 낮추고 공정을 단축하며 적용범위를 확대할 수 있으며 동시에 고체 스폰지가루를 이용한 경우에 유사하게 주사 이식이 가능한 세포배양 소재의 역할을 할 수 있다.

이는 기존의 스폰지가루를 이용한 방법 외에 주사가능한 세포 배양과 주사 이식이 가능한 소재로서는 최초의 시도이며 스폰지가루에 비해 세포 배양효율에서는 약간의 손실이 있을 수 있으나 소재의 종류를 다양하게 하고 제작이 간편하며 인체에 보다 안전하다는 점에서 의의가 있다.

도1 및 도2는 요철구조를 갖는 Sheva의 확대 사진

도3 및 도4는 요철구조를 갖는 키토산의 확대 사진 도5는 키토산의 극 배율 확대 사진

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Claims (10)

1. 지방전구세포(preadipocyte), 연골모세포(chondroblast), 골모세포(osteoblast)와 같은 계대배양된 배양체 세포들을 크기가 20-500 ㎛인 기포 없는 고체 분말로 이루어진 배양소재와 함께 배양액에 부유시키는 방법으로 고체분말과 배양소재를 혼합하고 이를 배양기에 넣고 배양하여 고체분말과 배양소재가 부착되도록 하는 것을 특징으로 하는 고체분말을 이용한 3차원 세포 배양방법.
2. 제1항에 있어서, 고체 분말은 인체로부터 얻어진 동종진피가루인 것을 특징으로 고체분말을 이용한 3차원 세포 배양방법.
3. 제1항에 있어서, 고체 분말은 미세기포를 갖지 않는 키토산인 것을 특징으로 하는 고체분말을 이용한 3차원 세포 배양방법.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 고체 분말은 인체 근막조직 가루인 것을 특징으로 하는 고체분말을 이용한 3차원 세포 배양방법.
6. 제1항에 있어서, 고체 분말은 미세기포를 갖지 않는 고어텍스(PTFE) 가루인 것을 특징으로 고체분말을 이용한 3차원 세포 배양방법.
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