JPH09507754A - 哺乳類悪性細胞の選択的メチオニン飢餓方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 メチオニンに対して絶対的要求をもちながらメチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡｓｅ）を欠く哺乳類悪性細胞の化学療法の改良方法。本方法は、哺乳類におけるＭＴＡｓｅ陰性細胞の検出、哺乳類におけるＭＴＡｓｅ陰性細胞の体積を減少させるために十分な量のメチオニンγ−リアーゼの投与、および哺乳類の非悪性細胞のメチオニン持続利用を保証するために十分な量のメチルチオアデノシンの同時投与を含む。ＭＴＡｓｅ陰性細胞の複数の検出手段が提供される。組み換え化学療法薬剤の作製手段およびその使用もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳類悪性細胞の選択的メチオニン飢餓方法 発明の背景 １．発明の分野 本発明は、悪性(malignant)細胞と非悪性（すなわち“正常”）細胞との間の 代謝的な相違に基づいて、哺乳類で悪性細胞を選択的に有意破壊する方法に関す る。より具体的には、本発明は、血漿メチオニンおよびホモシステインの分解に よってメチルチオアデノシンをメチオニンに変換するために必要な酵素を欠く悪 性細胞の飢餓に関する。 ２．発明の由来 アミノ酸メチオニン（ＭＥＴ）は正常および悪性細胞の増殖に必要である。あ る種の悪性細胞ではこの要求は絶対的である、すなわち、ＭＥＴの適切な供給が なければ細胞は死滅する。 哺乳類の細胞では、ＭＥＴは３つの供給源から得られる。それは、食事または Ｌ−ホモシステイン（ホモシステイン）もしくはメチルチオアデノシン（ＭＴＡ ）（ポリアミン生合成経路の生成物）からのＭＥＴの生化学合成によって得られ る。後者の場合、ＭＴＡはメチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡｓｅ） によってＭＥＴに変換される。 ここ１０年間で、ＭＴＡｓｅを欠き、したがってＭＴＡをＭＥＴに変換できな い多くの悪性細胞株が同定された。例えば、カタマリら（Katamariら、Proc．Na tl．Acad．Sci．USA，78:1219-1223(1981)）は、３例のヒト悪性腫瘍株の２３％ は検出可能なＭＴＡｓｅを欠き、一方、調べた１６の非悪性細胞株の各々にはＭ ＴＡｓｅ活性が存在していることを報告した。ＭＴＡｓｅ陰性細胞株は、ＭＥＴ についての要求を主にホモシステインの変換によって満たしている。しかしなが らホモシステインが利用できない場合その細胞は一般には死滅する。 Ｌ−メチオニン−Ｌ−デアミノ−ｙ−メルカプトメタンリアーゼ（ＥＤ４．４ ．１．１１；ＭＥＴａｓｅ）はＭＥＴだけでなくホモシステインもまた分解する こ とが分かっている。したがって、ＭＥＴａｓｅで血漿ＭＥＴおよびホモシステイ ンを分解することによって、ＭＴＡｓｅを欠く悪性細胞（すなわちＭＴＡｓｅ陰 性細胞）に飢餓をもたらすことが理論的には可能である。正常なＭＴＡｓｅ陽性 細胞は、そのＭＥＴ要求をＭＴＡからＭＥＴへの継続的変換によって満たすと予 想されるであろう。 このアプローチの基礎版はまず１９７２年にクレイスによって提唱された（Kr eis，Cancer Treat．Rprts.，63:1069-1072(1972)）。ＭＥＴ非含有培地で１１ の悪性細胞株を用いて、クレイスは培養にＭＥＴａｓｅを用いることによってあ る種の悪性細胞の増殖を抑制することができた。クレイスはまた、ホモシステイ ンを培養液に加えた場合、２つの正常細胞株がＭＥＴ飢餓の影響から部分的に“ 救済”されることを観察した。しかしながら、これらインビトロの実験が有望で ある一方、クレイスはまた化学療法におけるＭＥＴａｓｅのインビボ使用の成功 を妨げるいくつかの障害を記載した。この障害には、インビボでの正常細胞の生 存を保証する手段が無いこと、精製または部分精製酵素の潜在的な免疫原性、お よび該酵素がタンパク質分解酵素によるインビボでの分解に対して耐性を有する 必要性が含まれる（Kreis,化学療法(Chemotherapy)、F.M．Muggia編、219-248ペ ージ(ハーグ、ボストン、ロンドン：Martinus-Nijihoff，1983)）。 悪性細胞のＭＥＴ飢餓法を成功させるためのまた別の障害は、いずれの悪性疾 患がこの治療の適切な標的であるか、すなわちいずれの悪性疾患がＭＴＡｓｅ陰 性であるかを同定する必要性であった。最終的には、何らかの触媒活性が細胞培 養に存在しているか否かを決定することによって、悪性疾患がＭＴＡｓｅ陰性で あるか否かを予想するアッセイが開発された（Seidenfeldら、Biochem．Biophys ．Res．Commun.，95:1861-1866(1980)）。しかしながら、活性アッセイに必要な 放射性化学基質が市販されていないために日常的検査でそれを使用することは現 在のところ容易ではない。さらにまた、アッセイ時に該酵素が触媒活性を有する 否かに関係なく細胞培養中に酵素が存在しているか否かを検出することによって は、インビトロのＭＴＡｓｅの触媒的な不安定さを説明することはできない。 この活性アッセイの限界は、比較的微量の酵素を検出するために十分鋭敏な免 疫アッセイを開発することによって回避することができる。しかしながら、ＭＴ Ａｓｅの免疫学的検出で使用する抗体を作製するための天然起源のＭＴＡｓｅ酵 素の精製は、比較的収量の少ない困難な工程であることが分かった(Rangioneら 、J．Biol．Chem.，261:12324-12329(1986))。 ＭＴＡｓｅ陰性細胞を検出するために適切な手段が開発されたとしても、天然 起源のＭＥＴａｓｅを適切な供給量で製造することはＭＴＡｓｅの製造と同様に 困難であった。天然の酵素の精製以外の手段でＭＥＴａｓｅを製造することは未 だ達成されていない。これは部分的にＭＥＴａｓｅのための遺伝子が部分的にし か配列決定されていないという理由のためである（Nakayamaら、Biochem.，27:1 587-1591(1988)）。 これら理由の全てのために、ＭＴＡｓｅ悪性細胞のインビボＭＥＴ飢餓に対す る有効なアプローチをつかめないままでいる。本発明はこの要求に向けられてい る。 発明の概要 本発明は、ＭＴＡｓｅ陰性細胞を検出する手段と合わせて、ＭＴＡｓｅ陰性細 胞の選択的飢餓のための改良方法を含む。この方法にしたがいＭＴＡｓｅ陰性と 判定された悪性疾患が、治療的に有効量のＭＥＴａｓｅ、好ましくは組換えＭＥ Ｔａｓｅ、最も好ましくはポリエチレングリコールまたはそれと同等な分子に共 役された組換えＭＥＴａｓｅで処置される。より具体的には、ＭＥＴａｓｅは、 ＭＴＡｓｅ陰性細胞にＭＥＴ飢餓を起こすに十分な程度まで血漿ＭＥＴレベルを 低下させる（一般には処置前メチオニンレベルの約１０％以下で生じる）投与量 で哺乳類（好ましくはヒト）に投与される。正常な（ＭＴＡｓｅ陽性）細胞には 、ＭＴＡの実質的同時投与によってＭＥＴが供給される。 本発明は一つにはまた悪性疾患のＭＴＡｓｅ陰性細胞の検出方法を含む。より 具体的には、本発明は、ある態様において抗ＭＴＡｓｅ抗体（モノクローナル抗 体を含む）の作製およびＭＴＡｓｅ免疫アッセイにおけるそれらの使用を含む。 また別の態様では、本発明は、核酸増幅技術、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ Ｒ）を基にしたアッセイを用いることによってＭＴＡｓｅをコードする遺伝子の 存在を検出することを含む。 本発明はまた、ＭＥＴａｓｅをコードする遺伝子の単離およびクローニングか ら作製した組み換えＭＥＴａｓｅを含み、したがって本発明の方法で使用する実 質的な量のＭＥＴａｓｅの製造が可能になる。 図面の簡単な説明 図１は、ポリアミン合成およびＭＴＡｓｅによるＭＴＡの還元の代謝経路の模 式図である。 図２は、免疫ブロット分析によって検出されたＭＴＡｓｅ陽性およびＭＴＡｓ ｅ陰性のヒトおよび非ヒト細胞株の比較である。 図３は、免疫ブロット分析によって検出されたＭＴＡｓｅ陽性およびＭＴＡｓ ｅ陰性のヒト細胞株および原発性腫瘍の比較である。 図４は、ＭＥＴａｓｅで処理されたＭＴＡｓｅ陰性ヒト細胞とメチオニンが豊 富な環境で増殖させたそれらの細胞との増殖の比較である。 発明の詳細な説明 １．ＭＴＡｓｅ陰性細胞の検出方法 図１は、ＭＴＡからＭＥＴのインビボ合成代謝経路およびＭＥＴａｓｅによる ＭＥＴの分解代謝経路を模式的に示す。上記に示したように、メチオニン飢餓に よる癌療法の完璧な利点を得るためには、ＭＴＡｓｅ陰性細胞が標的悪性疾患に おいて検出されねばならない。最終的には、本発明の方法で使用するに適したＭ ＴＡｓｅを検出する代替手段も下記に記載する。 Ａ．ＭＴＡｓｅの免疫アッセイ １．抗原性ＭＴＡｓｅおよびＭＴＡｓｅペプチドの製造 ＭＴＡｓｅに特異的な抗体は、抗原性ＭＴＡｓｅまたはＭＴＡｓｅペプチドで 非ヒトを免疫することによって製造される。一般的には、抗原性ＭＴＡｓｅペプ チドは、ラグニオンらの記載した方法(Ragnioneら、J．Biol．Chem.，265:6241- 6246(1990))にしたがって哺乳類組織から単離および精製できる。この方法を実 施するための例は下記の実施例で提供される。参考として、完全な長さのＭＴＡ のアミノ酸配列が配列番号：１として本明細書に含まれる。 ２．抗ＭＴＡｓｅ抗体製造のための抗原性ＭＴＡｓｅペプチドによる免疫 抗原性ＭＴＡｓｅまたはＭＴＡｓｅペプチドが一旦得られたら、該免疫ペプチ ドに対する抗体は、哺乳類（例えばウサギ、マウスまたはラット）にペプチドを 導入することによって作製される。説明のために、２つの抗原性ＭＴＡｓｅペプ チドのアミノ酸配列が、本明細書に添付した配列表に配列番号：２および３とし て提供される。これらのペプチドで免疫されたウサギによって産生された抗体は 、精製ＭＴＡｓｅに対してそれぞれ１：１５００および１：４０００の希釈で５ ０％最大反応を示した。 抗原性ＭＴＡｓｅペプチドで動物を免疫する場合には、多重注射免疫プロトコ ルを使用するのが好ましい(Langoneら編、“小投与量の免疫原による抗血清の産 生: 多重皮内注射”(Production of Antisera with Small Doses of Immunogen: Multiple Intradermal Injections)、Methods of Enzymology（Acad．Press，1 981）を参照のこと)。例えば、良好な抗体応答は、フロイントの(Freund's)完全 アジュバント中に乳化させた抗原性ＭＴＡｓｅペプチド１ｍｇを皮内注射し、そ の数週間後にフロイントの不完全アジュバント中の同じ抗原を１回または２回以 上追加免疫(boost)することによってウサギで得られる。 所望の場合には、この免疫ペプチドは、当該技術分野で周知の方法を用いる共 役によって担体タンパク質に連結させてもよい。このペプチドに化学的に共役で きる通常用いられる担体には、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、 チログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および破傷風類毒素が含まれる 。続いてこの共役ペプチドを動物（例えばマウスまたはウサギ）の免疫に用いる 。現在、ＭＴＡｓｅは哺乳類種間で保存されていると考えられているので、ＭＴ Ａｓｅタンパク質の免疫誘発性を高めるため担体タンパク質を使用することは好 ましい。 免疫動物によって産生されたポリクローナル抗体はさらに、例えば抗体を生じ たペプチドを結合させたマトリックスに結合させ、さらに溶出させて精製できる 。当業者には、ポリクローナル抗体の精製および／または濃縮についての免疫学 的分野における種々の技術についてモノクローナル抗体同様既知であろう（例え ば、コリガンらの文献を参照のこと:Coliganら、免疫学の最新プロトコル(Curre nt P rotocols in Immunology)，Unit 9，Wiley Interscience，1991)）。 それらの特異性および製造の容易さのゆえに、ＭＴＡｓｅ陰性細胞の検出にモ ノクローナル抗体を用いるのが好ましい。モノクローナル抗体の調製のためには マウスまたはラットを免疫するのが好ましい。本発明で用いられる“抗体”とい う用語は、完全な分子だけでなくそのフラグメント、例えばＦａｂおよびＦ(ａ ｂ')₂（これらはエピトープ決定基と結合することができる）もまた含む。また 本明細書では、“本発明のｍＡｂ’ｓ”という用語は、ＭＴＡｓｅに対して特異 性を有するモノクローナル抗体を指す。 モノクローナル抗体（“ｍＡｂ”）を分泌するハイブリドーマの作製に用いら れる一般的な方法は周知である(Kohler & Milstein，Nature 256:495(1975))。 簡単に記せば、コーラーとミルシュタインが記載したように、当該技術は、メラ ノーマ、奇形癌または、子宮頸部、神経膠腫もしくは肺の癌のいずれかをもつ５ 人の別々の癌患者の局部消耗リンパ節のリンパ球の単離を含んでいた。このリン パ球は外科検体から得られ、これらを集めて続いてＳＨＦＰ−１で融合させた。 ハイブリドーマは癌細胞株に結合する抗体の産生についてスクリーニングされた 。同等な技術をＭＴＡｓｅについて特異性を有するｍＡｂの産生および同定のた めに用いることができる。 本発明のｍＡｂ間のＭＴＡｓｅ特異性の確認は、比較的日常的なスクリーニン グ法（例えば酵素連結免疫吸着アッセイ即ち“ＥＬＩＳＡ”）を用いて達成し、 対象のｍＡｂの基本的な反応パターンを測定できる。 また、被験ｍＡｂが本発明のｍＡｂのＭＴＡｓｅ結合を防ぐことができるかど うかを決定することによって、過度の実験を行うことなく当該ｍＡｂが本発明の ｍＡｂと同じ特性を有するか否かを調べることが可能である。被験ｍＡｂが本発 明のｍＡｂと競合する場合、これは本発明のｍＡｂによる結合が低下することに よって示されるが、これは、おそらくこの２つのモノクローナル抗体が同じ、ま たは近縁のエピトープに結合すると考えられる。 ｍＡｂが本発明のｍＡｂの特異性を有しているか否かを決定するまた別の方法 は、本発明のｍＡｂと通常では反応性を有する抗原とともに本発明のｍＡｂを予 めインキュベートし、被験ｍＡｂが該抗原との結合能において抑制されるか否か を決定するものである。そして被験ｍＡｂの抑制がある場合、おそらく該ｍＡｂ は本発明のｍＡｂと同じまたは近縁のエピトープ特異性を有するであろう。 ３．ＭＴＡｓｅ陰性細胞の検出のための免疫アッセイプロトコル 上記のように一旦適切な抗体が得られれば、それらは悪性疾患におけるＭＴＡ ｓｅの検出に用いられる。この目的に適した免疫アッセイの例（すなわち免疫ブ ロット法）は下記実施例Ｉでさらに詳述される。しかしながら、免疫学分野で習 熟した者には、上述の抗体を用いて液相または固相（担体に結合させる場合）の いずれかの他の免疫アッセイ様式でＭＴＡｓｅを検出することができることは理 解されるところである。 抗ＭＴＡｓｅ抗体を用いたＭＴＡｓｅの検出は免疫アッセイを用いて実施でき る。このアッセイは、順方向モード、逆方向または同時モードで実施でき、生理 学的サンプルを用いる免疫組織化学アッセイを含む。適切な免疫アッセイプロト コルには、直接または間接形式で実施される競合、および非競合プロトコルが含 まれる。そのような免疫アッセイの例は放射能免疫アッセイ（ＲＩＡ）およびサ ンドイッチ（免疫測定）アッセイである。当業者は、過度の実験を実施すること なく他の免疫アッセイを理解し、また容易に知り得るであろう。 さらに、免疫アッセイで用いられる抗体は検出可能に標識してもよい。標識は 、核酸プローブに共有結合させることができるか、または堅固に結合させること ができる物質で、これによって該プローブを検出する能力が生じる。例えば、標 識は放射性同位元素、酵素基質または抑制物質、酵素、放射線不透過性物質（コ ロイド性金属を含む）、蛍光物質、化学発光分子、上記の標識のいずれかを含む リポソーム、または特異的な結合対の１つでもよい。適切な標識は増幅中に検出 能力の基となる特性を損なわないものである。 診断の分野で熟練した者は、インビトロでの検出アッセイに使用する適切な検 出可能標識に精通しているであろう。例えば、適切な放射性同位元素には、³Ｈ 、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³²Ｐ、¹⁴Ｃ、³⁵Ｓが含まれる。放射性同位元素で標識される増 幅フラグメントは、γ線カウンターまたはオートラジオグラフの密度測定によっ て、密度測定と組み合わせた増幅フラグメントのサザンブロットによって直接検 出してもよい。適切な化学発光分子の例はアクリジンまたはルミノールである。 アク リジウムエステルで誘導されたプローブとハイブリダイズした標的配列はインタ ーカレーション(intercalation)によって加水分解から保護される。適切な蛍光 物質の例はフルオレセイン、フィコビリタンパク質、希土類キレート、ダンシル またはローダミンである。 適切な酵素基質または抑制物質の例は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、グ ルコースオキシダーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、β− ガラクトシダーゼ、ピルベートキナーゼまたはアルカリホスファターゼアセチル コリンエステラーゼと特異的に結合する化合物である。放射線不透過性物質の例 はコロイド性金粒子または磁性粒子である。 特異的結合対は２つの異なる分子を含み、その場合、該分子の１つはその表面 上にもしくは空洞内に、他の分子の特定の空間的および極性的構造と特異的に結 合する領域を有する。この特異的結合対の構成分子はしばしば、リガンドとレセ プター、またはリガンドと抗リガンドと呼ばれる。例えば、レセプターが抗体で ある場合はこのリガンドは対応する抗原である。他の特異的な結合対には、ホル モン−レセプター対、酵素基質対、ビオチン−アビジン対および糖タンパク質− レセプター対が含まれる。例えば免疫グロブリンのフラグメントのような、結合 特異性を保持している特異的結合対のフラグメントおよび部分が含まれ、これに はＦａｂフラグメントなどが含まれる。抗体はモノクローナルでもポリクローナ ルでもいずれでもよい。特異的結合対の一方が標識として用いられる場合は、好 ましい分離工程はアフィニティクロマトグラフィーを含むであろう。 抗体は担体に結合させてもよい。周知の担体の例には、ガラス、ポリエステル 、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然 もしくは修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱が含ま れる。本発明の目的のためには担体の性状は可溶性でも不溶性でもよい。当業者 は抗体に結合する他の適切な担体について知っているであろうし、また日常的な 実験を用いてそのようなものを知り得るであろう。 Ｂ．ＰＣＲ基本アッセイを用いたＭＴＡｓｅ陰性細胞の検出 本明細書で述べるＭＴＡｓｅ特異的抗体を用いる免疫アッセイが提供する比較 的容易で迅速な検出ゆえに、この免疫アッセイはＭＴＡｓｅ陰性細胞の検出にと って好ましい手段である。しかしながら、当業者にはまた、悪性疾患中において ＭＴＡｓｅ陰性細胞の存在を検出する他の検出手段も理解されるところであろう 。例えば、配列番号：１の核酸配列の記載を用いて、当業者ならば細胞サンプル 中に存在するＭＴＡｓｅＤＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプロー ブを構築することができるであろう。逆に、ＭＥＴａｓｅ欠乏がＭＴＡｓｅをコ ードする遺伝子の遺伝的欠失から生じると考えられているので、ＭＴＡｓｅをコ ードする遺伝子が細胞サンプル中に検出されない場合は、該細胞はＭＴＡｓｅ陰 性であると考えることができるであろう。 ＭＴＡｓｅ遺伝子の増幅および検出のための詳細なプロトコルの説明は、同時 係属米国特許出願第０８／１７６，８５５号（1993年12月29日出願）に提供され ている。このプロトコルに関連する同時係属出願第０８／１７６，８５５号の開 示は援用されて本明細書の一部とされる。 Ｃ．ＭＴＡｓｅ飢餓療法のためのＭＴＡｓｅ陰性疾患候補 本発明の療法（すなわちＭＥＴ飢餓療法）のための推奨疾患である悪性疾患は 、ＭＴＡｓｅタンパク質（触媒的に活性であろうと不活性であろうと）の存在が 検出されない疾患である。今日まで調べられてきた全ての悪性細胞株において、 ＭＴＡｓｅ陰性の性質（そういうものが存在するとして）は細胞集団全体の不変 の特性である。換言すれば、悪性疾患のいくつかの細胞がＭＴＡｓｅ陰性のとき 、該悪性疾患の全細胞がＭＴＡｓｅ陰性と予想できる。このことは、ＭＴＡｓｅ 欠乏は変異というよりはむしろ遺伝子欠失の結果であるという、当学術分野で現 在信じられている考えと一致する。ＭＴＡｓｅ陰性についての悪性疾患の均質性 は、不均質な特性（例えばモノクローナル抗体療法における標的腫瘍抗原）に対 する療法と較べて癌療法としてのＭＥＴ飢餓の有効性を極めて増強するはずであ る。しかしながら、本発明の目的のためには、該悪性疾患がＭＴＡｓｅについて “実質的に欠乏している”ということ、すなわちそれらが検出可能量のＭＴＡｓ ｅタンパク質を含まないということで十分である。 ＭＴＡｓｅが実質的に欠乏していると現在考えられているヒトの悪性疾患には 以下が含まれる。 本明細書に記載した検出技術を用いて、当業者は過度の実験を実施することな くその他の悪性疾患においてＭＴＡｓｅ欠乏を検出することができるであろう。 ＩＩ．ＭＥＴ飢餓療法 Ａ．ＭＥＴａｓｅの製造 本発明の方法で使用するために、ＭＴＡおよびＭＥＴａｓｅの両方の供給源が 要求される。ＭＴＡを入手する手段は上記に記載されている。本発明の方法で使 用するために、ＭＥＴａｓｅは膣トリコモナス(Trichomonas vaginalis)(Lockwo odら、J．Biochem．279:675-682(1991))、スポロゲネス菌(Clostridium sporoge nes)(Kreisら、上掲書(1867)参照; EC4.4.1.11)、シュードモナス・プチダ(Pseu domonas putida)(Nakayamaら、Biochem．27:1587-1591(1988))を含む微生物から 精製された。 Ｐ．プチダから構築したｃＤＮＡライブラリーを用いて、ＭＥＴａｓｅの完全 な長さのヌクレオチド配列を同定した。これは本明細書に添付した配列表に配列 番号：４として含まれている。そのアミノ酸配列は配列番号：５に含まれている 。 この情報を用いてＭＴＡｓｅに関して上記に記載した周知の技術を用いてＭＥ Ｔａｓｅを容易に合成し、またＤＮＡクローンから発現させることができる。ど のようにＭＥＴａｓｅをクローニングし、さらに大腸菌(E.coli)で発現させるこ とができるかについての詳細な実施例は下記実施例ＩＩおよびＩＩＩで提供され る。 精製、部分精製、合成または組み換えＭＥＴａｓｅが本発明の治療方法で用い られ得るが、組み換えＭＥＴａｓｅがその製造の容易さと比較的低い免疫原性の ために好ましい。この酵素の免疫原性は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ま たはそれに匹敵する生物学的に適合性を有する分子と共役させることによってさ らに低下させることができ、また低下させることが好ましい。ＰＥＧへの共役は また、インビボにおけるＭＥＴａｓｅ共役物の半減期を減少させると予想される 。 ＰＥＧ−ＭＥＴａｓｅ複合物は、Ｌ−アスパラギンについて記載されたように 、酵素にＰＥＧを共有結合させることによって形成することができる（Benedich ら、Clin．Exp．Immunol．48:273-278(1982)参照）。タンパク質にＰＥＧを共役 させる方法は当技術分野で周知で、したがってここではこれ以上詳細には記載し ない。 ＰＥＧ共役Ｌ−アスパラギナーゼによる非ホジキンリンパ腫の治療についてのヒ トの臨床試験で認められた結果によれば、ＰＥＧへのＭＥＴａｓｅの共役によっ てインビボにおけるその活性は顕著には減少しないと予想される（ＰＥＧ−Ｌア スパラギナーゼで得られた結果に関してはMussら、Invest．New Drugs 8:125-13 0(1990)を参照のこと）。しかしながら、当業者にはタンパク質の半減期をイン ビボで延長させる他の手段は既知であり、それらはＭＥＴａｓｅとともに使用す るに適しているかもしれず、これには糖付加およびスクシニル付加を含むが、こ れらに限られるものではないということは理解されよう。 Ｂ．治療方法 実質的にＭＴＡｓｅが欠乏している悪性疾患は、本発明にしたがいＭＥＴａｓ ｅの投与によって部分的に治療されるであろう。好ましくは、これらの悪性疾患 は局部的な化学療法によって治療することができる疾患であろう。すなわちこの 場合、該悪性疾患は局在していて、該悪性疾患の場所に直接的にＭＥＴａｓｅを 投与するために動脈内輸液または、局所的、経皮的にもしくはそれらに匹敵する 経路で導入することによってアクセスすることが可能な身体領域に含まれている 。局部的化学療法によって影響を受けやすい悪性疾患の例は、メラノーマ、卵巣 癌（腹腔内カテーテルによって）、および膀胱癌（尿道カテーテルによって）で ある。ＭＴＡｓｅが陰性であるならば、本発明にしたがって局部的化学療法で治 療される他の悪性疾患は、腫瘍学に習熟した者には理解されるところであろう。 本発明の治療用組成物はまた全身的に投与することも可能であることは当業者 には理解されよう。しかしながら、組成物の排除と正常細胞に対する潜在的毒性 が相殺するように投薬を調節する必要があるであろう。特に、正常細胞のメチオ ニン飢餓の臨床所見は念入りにモニターする必要があり、さらに必要ならば追加 のＭＴＡを投与することによって代償しなければならない。 実質的にＭＴＡｓｅが欠乏している悪性疾患は好ましくは下記のように治療さ れる。 ＭＥＴａｓｅは、非経口的に、好ましくは動脈内輸液となる投与経路で、哺乳 類（好ましくはヒト）に投与されるであろう。このＭＥＴａｓｅは医薬的に許容 できる担体とともに投与され、担体には非水性溶液、懸濁液および乳濁液の滅菌 液が含まれる。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコー ル、植物油、例えばオリーブ油、および注射可能有機エステル、例えばオレイン 酸エチルである。水性担体には、水、アルコール／水溶液、乳濁液または懸濁液 が含まれ、これには食塩水および緩衝媒体が含まれる。上記に記載したように、 ＭＥＴａｓｅは好ましくはＰＥＧに共役され、その免疫原性は減少させられる。 非経口的ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキ ストロースおよび塩化ナトリウム、乳化リンゲル液または固定油が含まれる。静 脈内用ビヒクルには、体液、水分栄養物補給液、電解質補給液（例えばリンゲル デキストロースをベースにしたもの）などが含まれる。保存剤および他の添加物 も付加してもよく、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなど である。 ＭＥＴａｓｅの投与量は、１日または数日間、毎週１回もしくは２回以上の定 量投与で約１０ユニット／ｍ²から２０，０００ユニット／ｍ²、好ましくは約５ ０００から６０００ユニット／ｍ²（動脈内輸液の場合はもっと少量）まで変動 させることができる。一般にＭＥＴａｓｅは、哺乳類では投与後約２４時間で排 除されると予想される；酵素の半減期を延長させる手段（例えばＰＥＧ共役）を 用いて、この半減期は数時間から数日間延長させることができる。したがって、 哺乳類の血漿メチオニンレベルをモニターし、治療的に有意な哺乳類の血漿メチ オニン濃度の低下を達成するために必要に応じて追加量のメチオニンが投与され ねばならない。これは、ＭＴＡｓｅ陰性細胞体積の検出可能な減少、すなわち哺 乳類における悪性細胞の体積または腫瘍量の減少を誘発するために十分な低下で あろう。このような結果を達成する投与量は“治療的に有効な”投与量と考えら れるであろう。部分精製ＭＥＴａｓｅを用いたげっ歯類のインビボ実験を基に、 治療的に有効な投与量は、一般に患者の血漿メチオニンレベルをその治療前のレ ベルの約≦１０％まで低下させるものと予想され得る。 血漿メチオニンレベル（およびその中での変化）は、その投与過程の間ＭＥＴ ａｓｅを与えられている患者から得た血液サンプルの周期的な（好ましくは毎日 ）インビトロアッセイによってモニターできる。一般に、げっ歯類で実施された 実験に基づいて、血漿メチオニンレベルは、ＭＥＴａｓｅの投与後約１時間以内 で 治療前のレベルの≦１０％まで低下するであろうと予想できる。血漿メチオニン のアッセイは当該技術分野で周知である。例えば、血液サンプル中のメチオニン 濃度は、エステル化アミノ酸（ｎ−ブチルエステル）のガス液体クロマトグラフ ィー法を用いて測定でき、これはRoachら、J．Chromotog．44:269-278(1969)に 記載されている。血漿中のメチオニンを検出する他の同等な方法は知られており 、また当業者には容易に知り得るところである。 ＭＥＴａｓｅが細胞内メチオニンを分解することができないということは言及 されるべきであろう。したがって、細胞内メチオニン形成のためにＭＴＡを適切 に供給すれば、一般にＭＴＡｓｅ陽性細胞は、ＭＥＴａｓｅによる外因性メチオ ニンの低下に耐えることができる。しかしながら、外因性メチオニン（またはメ チオニンのためのＬ−ホモシステイン基質、これもまたＭＥＴａｓｅによって分 解される）の供給がなければメチオニンに対して絶対的要求をもつＭＴＡｓｅ陰 性細胞は一般に血漿メチオニンの消失に耐えることができない。 治療の有効性は、悪性疾患の細胞体積の低下（当該技術分野で周知の手段によ って決定される）を示す臨床所見のいずれかによって、および／または本明細書 で述べる検出手段を用いた悪性疾患におけるＭＴＡｓｅ陰性細胞の体積の周期的 検出によって確認およびモニターすることができる。Ｌ−アスパラギナーゼ療法 のヒトでの使用に関する臨床データに基に、ＭＥＴａｓｅ療法の毒性はそこそこ に小さなものであり、この毒性は、基本的には、臨床分野で習熟した者にとって 周知の手段（例えばエピネフリンの投与）によって治療が可能なアレルギー反応 からなるであろうということが予想される。 したがって、ＭＴＡはＭＥＴａｓｅと実質的に同時に哺乳類に投与される。好 ましくは、ＭＴＡおよびＭＥＴａｓｅは同時に投与される。ＭＴＡはＭＥＴａｓ ｅの基質として作用しないので、この２つは医薬的に許容できる担体に一緒に結 合させることができる。或いは、ＭＴＡはＭＥＴａｓｅ投与の約２４時間以内（ 好ましくはもっと早く）に投与し、メチオニンの内因性供給が枯渇しているＭＴ Ａｓｅ陽性細胞を“救済”することができる。 正常細胞を救済するために必要なＭＴＡ用量は、多くの臨床因子にしたがって 変動するであろう。このような因子には悪性疾患の位置、悪性疾患のＭＴＡｓｅ 陰性細胞の体積、ＭＥＴａｓｅ療法の期間および食事性ＭＥＴを患者が利用可能 であるか否かが含まれる。しかしながら、一般にはＭＴＡは約１−１０μＭの血 漿メチオニンレベルを維持するために十分な投薬量で与えられるであろう。 本発明は既に十分に詳述したが、その実施のための例を下記に記載する。しか しながら、これらの実施例は、添付の請求の範囲によってその範囲が明らかにさ れている本発明を制限するためのものではない。 実施例において、略語、“ｍｉｎ”は分を意味し、“ｈｒｓ”および“ｈ”は 時間を意味し、測定単位（例えば“ｍｌ”）は標準的な略語で表される。 実施例Ｉ ＭＴＡｓｅの免疫アッセイ Ａ．ＭＴＡｓｅ抗体の作製 ＭＴＡｓｅはランギオンら（Rangioneら、上掲書）の記載にしたがってウシの 肝臓から精製した。単離酵素の数個のトリプシン消化ペプチドを通常の技術を用 いて配列決定した。得られた配列を基にして、ペプチド４０（アミノ酸が１８個 の長さ；配列番号：２参照）およびペプチド５１（アミノ酸が１４個の長さ；配 列番号：３参照）を周知のメリーフィールド（Merrifield）固相法（例えばChen ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，81:1784-1788(1984)参照）を改変して合成し た。全てのペプチドがカルボキシ末端にシステイン残基を含み、ｍ−マレイミド ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシミドエステルによる担体タンパク質、ＫＬＨ への化学的共役を促進した。 ニュージーランド白色ウサギ（１ペプチドに２匹のウサギ）をペプチド−ＫＬ Ｈ共役物で二箇月毎に免疫した。最初の注射は、フロイントの完全アジュバント 中に乳化させた１ｍｇの合成ペプチド−ＫＬＨ共役物を含んでいた。追加免疫注 射は１ｍｇの抗原をフロイントの不完全アジュバント中に含んでいた。３−４回 の注射の後、５０％飽和硫酸アンモニウムで血清を部分精製し、ＥＬＩＳＡによ って抗ペプチド活性および抗ＭＴＡｓｅ活性についてスクリーニングした。 より具体的には、ペプチドまたはＭＴＡｓｅをＢＢＳ（０．２Ｍのホウ酸ナト リウム−０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５）中に１０μｇ／ｍｌで４℃一晩、 前もってマイクロタイタープレートを被覆した。このプレートを０．０５％のト ゥイーン２０を含むＢＢＳで１度洗浄し、続いて１％ウシ血清アルブミン含有Ｂ ＢＳで４時間インキュベートして非特異的結合部位を遮断した。コントロール血 清またはペプチド誘発血清の数希釈を続いて０．１ｍｌずつ添加し一晩インキュ ベートした。プレートを０．０５％トゥイーン２０を含むＢＢＳで２度洗浄し、 続いてＢＢＳ中１：１０００の希釈でアルカリホスファターゼ標識ヤギＦ(ａｂ' )₂抗ウサギ免疫グロブリン（Jackson Laboratories，Inc.，ウェストグローブ、 ペンシルバニア）に１時間曝した。プレートを洗浄した後、０．１ＭのＮａＨＣ Ｏ₃中−．１Ｍのｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム（ｐＨ９．０）０．２ ｍｌを各ウェルに加えた。４０５ｎｍでの吸収を３０分後に測定した。 Ｂ．免疫反応性ＭＴＡｓｅの免疫ブロット分析用プロトコル いくつかのヒト細胞株と腫瘍の生検材料をＭＴＡｓｅ陰性細胞の存在について 調べた（ＭＴＡｓｅ陰性細胞に関しては表Ｉの“免疫アッセイ”と記した項目を 参照のこと）。ＭＴＡｓｅ陽性を検査した他のサンプルはＢＶ−１７３(慢性骨 髄性白血病、“ＣＭＬ”)、Ｍｏｌｔ−１６(急性リンパ球性白血病、“ＡＬＬ” )、Ｍｏｌｔ−４（ＡＬＬ）、Ｕ３９７（組織球性リンパ腫）、ＳＵＰ−Ｔ８（ ＡＬＬ）、Ｕ−３７３ＭＧ（神経膠芽腫）、およびＴ９８Ｇ（神経膠芽腫）であ った。 酵素陽性細胞から調製した細胞抽出物は、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム を含む１２．５％のポリアクリルアミドゲル上で、上記のようにウシ肝臓から精 製された種々の量のＭＴＡｓｅとともに電気泳動した。 より具体的には、粗細胞抽出物（１０−１５０μｇ／レーン）を０．１％のド デシル硫酸ナトリウムを含む１２．５％のポリアクリルアミドゲルで電気泳動し て分離した。ニトロセルロースメンブレン（０．４５ｍｍ、Bio-Rad、リッチモ ンド、カリフォルニア州）に電気的に移し、非特異的結合部位はＢＢＳ中３％の 粉乳で遮断した。続いて３％粉乳含有ＢＢＳで１：５００に希釈した抗血清でタ ンパク質を室温で１６時間プローブ処理した。タンパク質をＢＢＳで充分に洗浄 し、反応バンドを¹²⁵Ｉ−プロテインＡ（ICN Radiochemicals、アービン、カリ フォルニア州）で１時間結合させて検出した。メンブレンを洗浄しペーパータオ ルで液を吸い取り、−７０℃でコダックＸＡＲ−５（ｔｍ）フィルムに露光した 。 オートラジオグラフのバンドをデンシトメーター(Bio-Rad)で走査し、精製酵 素の免疫反応バンドから作製した検量線を用いて定量した。 Ｃ．結果 非肺細胞および生検材料（すなわち神経膠腫）では、６７％（６例のうち４例 ）が免疫反応性酵素を完全に欠いていた（図２）。ヒト神経膠腫の６個の連続生 検標本は異なる組織学的特徴を有する（表Ｉ）が、このうち５個は完全に欠いて いた（図３）。コントロール実験は、正常なヒトの脳は豊富なＭＴＡｓｅ活性を 有することを示した（図３、レーン７）。したがって、完全なＭＴＡｓｅ欠乏は ヒト神経膠腫で共通した特異的な代謝異常である。 検査した１９例の非小形細胞肺癌細胞株のうち、６細胞株でＭＴＡｓｅは完全 に失われていた（表Ｉおよび図４参照）。 実施例ＩＩ シュードモナス・プチダのＭＥＴａｓｅのクローニング ワカヤマら、Biochem．27:1587-1591(1988)により発表されたＭＥＴａｓｅの 部分的アミノ酸配列を参考に、縮重オリゴヌクレオチドプライマーをデザイン、 ＭＥＴａｓｅ遺伝子のためのＰＣＲアッセイで用いた。 このＰＣＲアッセイは約３００ｂｐのフラグメントを増幅した。この３００ｂ ｐのＰＣＲ生成物をプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（Stratagene， サンディエゴ）でサブクローニングした。ＰＣＲ生成物に対する内部オリゴヌク レオチドプローブを使用し、このサブクローン化ＰＣＲ生成物のサザンブロット 分析によって、このフラグメントがＭＥＴａｓｅ遺伝子と同一であることが証明 された。さらなるサザンブロット分析は、このＰＣＲ生成フラグメントがシュー ドモナス・プチダＤＮＡの５．０ｋｂのＢｇｌＩＩフラグメントとハイブリダイ ズすることを示した。 これらの結果を基に、シュードモナス・プチダのゲノムＤＮＡを含むバクテリ オファージのゲノムＤＮＡライブラリーを構築した。ＢｇｌＩＩ消化シュードモ ナス・プチダを０．８％の低融点アガロースゲルで電気泳動した。サイズが４／ ｋｂから６／ｋｂの範囲のＢｇｌＩＩフラグメントをゲルから切り出し精製した 。クレノーフラグメントを用いて、これらＢｇｌＩＩフラグメントを部分的に充 填 し、バクテリオファージベクター、γＦｉｘＩＩでサブクローニングした。この ベクターをＸｈｏＩで消化し、クレノーで部分的に充填した。Stratagene製のギ ガパックパッケージング抽出物を用いてこのライブラリーをバクテリオファージ 粒子中に封入（Packaged）した。封入後、このライブラリーを増幅し力価を測定 した。 完全なＭＥＴａｓｅ遺伝子を単離するために、このライブラリーをＰＣＲ生成 フラグメントを用いてスクリーニングした。２０００００クローンをスクリーニ ングした後、８個のそれぞれ別個の初代クローンを単離した。これら８個のクロ ーンのうち、２個のクローンのみが完全に陽性で固有であった。１つのクローン は５．１ｋｂの挿入物を含み、他は５．９ｋｂの挿入物を含んでいた。これらの 挿入物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳでサブクローニングし、続いてマッピ ングし配列を決定した。ＭＥＴａｓｅ遺伝子のためのこの配列は１６１５ｂｐで あると結論した（配列番号：４参照）。 実施例ＩＩＩ 組み換えＭＥＴａｓｅの発現 組み換えＭＥＴａｓｅ遺伝子をＣ５ベクターで発現させた。これはＭＴＡｓｅ の発現に用いたベクターと同じである（同時係属米国特許出願第０８／１７６８ ５５号、1993年12月29日出願、の実施例ＶＩＩ参照）。５０ｍｌの培養に接種す るためにＣ５組換え体クローン化大腸菌の単一コロニーを用いた。５０μｇ／ｍ ｌのアンピシリンを補充した標準ＬＢ培地を５０ｍｌ培養と大規模細菌培養の両 方に用いた。接種した５０ｍｌ培養を３７℃で一晩インキュベートした。一晩培 養物を新しいＬＢ培地に１００倍希釈した。激しく震盪させながら３７℃で細胞 を大型培養で１．５時間増殖させた（１１）。ＭＥＴａｓｅ発現を誘発させるた めに、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド〔ＩＰＴＧ〕を最終濃度０．０ １、０．１および１ｍＭで大型培養に加え、さらに４時間インキュベートした。 タンパク質発現のための最適ＩＰＴＧ濃度は１ｍＭであることが分かった。 ＩＰＴＧを添加してから４時間後、細胞を採集し４℃で１９０００×ｇ１０分 遠心して細胞を回収した。上清を取り除き、沈殿物を懸濁し、冷食塩水で洗浄し てから再度遠心した。１５μＭの２−メルカプトエタノールを含む１００から２ ００ｍｌの２０ｍＭのリン酸カリウムバファ（ｐＨ７．５）で再懸濁細胞沈殿物 を洗浄した。１ｍＭのＥＤＴＡおよび３０μＭのピリドキサール５’ホスフェー ト（バッファＡ）を加え、続いて沈殿物を再び遠心した。洗浄して再懸濁（バッ ファ中）された細胞懸濁液を細胞破壊爆弾に入れた。細胞破壊は、２０分２２０ ０ＰＳＩのＮ₂圧を用いて実施した。溶解細胞を４℃で４３０００×ｇ、２０分 遠心した。細胞抽出物の上清をさらに染料−リガンドアフィニティカラムで精製 した。 細胞抽出物（１０ｍｌ）を“ダイマトリックス(DYEMATRIX)”ゲル〔オレンジ Ａ〕（Amicon Inc.,ビバーリー、マサチューセッツ州）カラム（１２×２．６ｃ ｍ）に添加した。カラムは製造元の指示にしたがって充填し平衡化させた。サン プル添加後、５カラム容積のバッファＡで洗浄し、未結合物質を除去した。この 工程の後、結合生成物は、バッファＡ中の０−１．５Ｍの直線ＫＣｌ濃度勾配で 溶出させた。１０ｍｌ分画を採集しｙ−リアーゼ酵素アッセイに付した。メチオ ニンｙ−リアーゼ活性の主ピークを含む分画を集め、“セントリコン３０(CENTR ICON30)”(Amicon Inc.)で２−３ｍｌに濃縮した。 固形（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を濃縮分画（０．３１４ｇ／ｍｌ）に加えて最終濃度を ２．４Ｍにし、サンプルを１３０００×ｇ、１０分遠心した。上清を０．４５μ のアクロディス(acrodis)フィルター（Amicon，Inc.）でろ過してから、アルキ ル“スーパーローズ(SUPEROSE)”（アガロース）Ｈｒ５／５疎水性相互反応ＦＰ ＬＣカラム(Pharmacia)に注入した。このカラムは前工程で使用したバッファＡ 中に溶解させた２．４Ｍの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄で平衡化させた。結合タンパク質は 、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄の濃度を直線的に減少させながら溶出された（流速０．５ｍｌ ／分）。ＭＥＴａｓｅ活性を含む分画を集め、上記に記載したように濃縮した。 タンパク質濃度はブラッドフォードが記載した方法によって測定した。 酵素調製物の純度は、ＳＤＳ１０％グリセリン−トリス１ｍｍゲル（Novex,サ ンディエゴ、カリフォルニア州）で調べた。ＭＥＴａｓｅ活性は、記載（Esaki & Skoda，Meth．Enzymol．143:459-465(1987)にしたがって２−ケトブチル酸生 成を測定することによってアッセイした。この文献は援用されて本明細書に含ま れる。最終的な酵素は比活性が３００Ｕ／ｍｇで、ここで１Ｕは１分間に１μＭ の生成物を生じる。 実施例ＩＶ 非小型肺癌細胞株におけるＭＥＴａｓｅ陰性細胞の選択的飢餓 実施例Ｉで同定されたＭＴＡｓｅ陰性非小型肺癌細胞株を、本発明の治療方法 にしたがいインビトロ細胞培養でＭＥＴａｓｅおよびＭＴＡで処理した。特に、 酵素陽性（ＳＫ−ＭＥＳ−１）および陰性（Ａ−５４９）細胞株を以下の培養液 中で４日間培養した：（ａ）１０％透析ウマ血清添加メチオニン含有培養液、（ ｂ）１０％透析ウマ血清添加メチオニン枯渇培養液、（ｃ）１０％透析ウマ血清 および１６μＭのＭｅＳＡｄｏ添加メチオニン枯渇培養液。両方の細胞株、特に 酵素陰性Ａ−５４９の増殖はメチオニンを欠く培養液で顕著に遅くなった（ＳＫ −ＭＥＳ−１およびＡ−５４９細胞について各々コントロール増殖の２７％およ び３．３％）。同じ培養液にＭＴＡを添加したとき、酵素陽性ＳＫ−ＭＥＳ−１ 細胞の増殖が高まった（コントロール増殖の７７％）。しかしながら、酵素陰性 Ａ−５４９細胞の増殖はＭＴＡの存在で強化されなかった（コントロール増殖の ４．３％）（表ＩＩ）。 これらのデータはＭｅＳＡｄｏホスホリラーゼ−陰性細胞の増殖は、メチオニ ン枯渇、ＭｅＳＡｄｏ添加培養液で選択的に遮断される可能性があることを示唆 している。 実施例Ｖ 組み換えＭＥＴａｓｅ存在下でのヒト悪性細胞のメチオニン飢餓 実施例ＩＩおよびＩＩＩの記載にしたがって作製した組み換えＭＥＴａｓｅの 抗増殖作用を調べるために、ヒトＳＫ−ＭＥＳ−１およびＡ−５４９細胞ＤＭＥ Ｍを、組み換えＭＥＴａｓｅ０．０６Ｕ／ｍｌを加えた１０％透析ウシ胎児血清 含有培養液で培養した。３日後に細胞増殖を調べた。ＭＥＴａｓｅの影響は添加 酵素のない培養液での細胞増殖の％で表した。 図４に示したように、酵素陽性（ＳＫ−ＭＥＳ−１）および酵素陰性（Ａ−５ ４９）ＭＥＴａｓｅ添加培養液での細胞増殖は、それぞれ２６．６％および２． ９６％増加した。しかしながら、２０μＭのＭＴＡを細胞メチオニンの代替起源 として添加した場合、酵素陽性細胞では細胞増殖はコントロール値の６１．４％ まで回復したが、一方、酵素陰生細胞での増殖は２．０％に減少した。 配列の要約 配列番号：１は、完全な長さのＭＴＡｓｅのアミノ酸配列である。 配列番号：２は、抗原性ＭＴＡｓｅペプチドのアミノ酸配列である。 配列番号：３は、配列番号：２のペプチドとアミノ酸配列が異なる抗原性ＭＴ Ａｓｅペプチドのアミノ酸配列である。 配列番号：４は、ＭＥＴａｓｅをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド 配列である。 配列番号：５は、配列番号：４のヌクレオチド配列から予想されるＭＥＴａｓ ｅのアミノ酸配列である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/48 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/68 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＤＵ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｎ Ｌ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 カーソン、デニス エー. アメリカ合衆国 92014 カリフォルニア 州 デル マール ビスタ デル オセア ノ 14824

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＭＴＡｓｅ陰性と思われる哺乳類の細胞の選択的メチオニン飢餓方法で あって、 前記細胞のサンプル中に触媒的に活性なＭＴＡｓｅおよび触媒的に不活性なＭ ＴＡｓｅの両方の有無を決定する手段を用いて、該細胞が実質的にＭＴＡｓｅ陰 性であるか否かを決定し； 治療的に有効量のＭＥＴａｓｅを該哺乳類に投与し、さらに実質的に同じ時に 治療的に有効量のＭＴＡを該哺乳類に投与し、ここでＭＥＴａｓｅおよびＭＴＡ は各々医薬的に許容できる担体と投与される ことを含む、ＭＴＡｓｅ陰性と思われる哺乳類の細胞の選択的メチオニン飢餓 方法。 ２． 前記ＭＥＴａｓｅが、インビボで哺乳類メチオニンを特異的に分解する 組み換え微生物タンパク質である請求の範囲第１項の方法。 ３． 前記ＭＥＴａｓｅが、配列番号：５で示したものと実質的に同じアミノ 酸配列を有する請求の範囲第２項の方法。 ４． 前記ＭＥＴａｓｅが、配列番号：４で示したものと実質的に同じヌクレ オチド配列を有するポリヌクレオチドによって発現される請求の範囲第２項の方 法。 ５． 前記ＭＥＴａｓｅがポリエチレングリコールに共役される請求の範囲第 １項の方法。 ６． 前記ＭＥＴａｓｅおよびＭＴＡが同時に哺乳類に投与される請求の範囲 第１項の方法。 ７． 前記ＭＥＴａｓｅおよびＭＴＡが、医薬的に許容できる同じ担体中にと もに混合されている請求の範囲第６項の方法。 ８． 触媒的に活性なＭＴＡｓｅおよび触媒的に不活性なＭＴＡｓｅの有無を 検出する手段が免疫アッセイを含む請求の範囲第１項の方法。 ９． 触媒的に活性なＭＴＡｓｅおよび触媒的に不活性なＭＴＡｓｅの有無を 検出する手段が： （ａ）ＭＴＡｓｅ陰性であると思われる細胞のアッセイ可能なサンプル を入手すること、 （ｂ）ＭＴＡｓｅをコードする核酸と特異的にハイブリダイズするオリ ゴヌクレオチドプローブを、該プローブがサンプル中に存在するそのような核酸 のいずれとも検出可能にハイブリダイズすることができるような条件の下で該サ ンプルに添加すること、および （ｃ）サンプル中に該核酸が存在するか否かを検出すること、 を含むアッセイを含む請求の範囲第１項の方法 １０． 前記サンプルが、サンプル中に存在する一切のＭＴＡｓｅをコードす る核酸の選択的増幅を促進する条件に、さらに付される請求の範囲第９項の方法 。 １１． 前記哺乳類にＭＥＴａｓｅを投与する前および後に哺乳類の血漿メチ オニンレベルを決定することをさらに含む請求の範囲第１項の方法。 １２． ＭＥＴａｓｅの治療的に有効量が、該哺乳類で検出されるＭＴＡｓｅ 陰性細胞の数を減少させるために十分な総量で少なくとも１回で投与される１０ ユニット／ｍ²と２００００ユニット／ｍ²の間である請求の範囲第１１項の方法 。 １３． ＭＥＴａｓｅの治療的に有効な量が、哺乳類の血漿メチオニンレベル をＭＥＴａｓｅの投与前レベルの約１０％以下に減少させる量である請求の範囲 第１２項の方法。 １４． ＭＴＡの治療的有効量が、哺乳類の血漿ＭＴＡ濃度を約１−１０μＭ に維持するために十分な量である請求の範囲第１項の方法。 １５． 配列番号：４に示されたヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子。 １６． 触媒的に活性な組み換えＭＥＴａｓｅポリペプチド。 １７． 配列番号：５に示されたものと実質的に同じアミノ酸配列を有する請 求の範囲第１６項のポリペプチド。 １８． 触媒的に活性なＭＥＴａｓｅポリペプチドをコードするポリヌクレオ チド。 １９． 請求の範囲第１８項のポリヌクレオチドによって発現される触媒的に 活性なＭＥＴａｓｅポリペプチド。 ２０． 前記ポリヌクレオチドが原核生物内で発現される、請求の範囲第１９ 項の触媒的に活性なＭＥＴａｓｅポリペプチド。 ２１． 配列番号：４に示されたものと実質的に同じヌクレオチド配列を有す る請求の範囲第１８項のポリヌクレオチド。 ２２． 請求の範囲第２１項ポリヌクレオチドによって発現される触媒的に活 性なＭＥＴａｓｅポリペプチド。 ２３． 前記ポリヌクレオチドが原核生物内で発現される請求の範囲第２２項 の触媒的に活性なＭＥＴａｓｅ。