JPH02497A - ヒト前立腺特異性抗原に対する抗体組成物 - Google Patents
ヒト前立腺特異性抗原に対する抗体組成物Info
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Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001193—Prostate associated antigens e.g. Prostate stem cell antigen [PSCA]; Prostate carcinoma tumor antigen [PCTA]; PAP or PSGR
- A61K39/001194—Prostate specific antigen [PSA]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3038—Kidney, bladder
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本出願は1979年12月28日に出願された、継続中
の共通に譲渡されたアメリカ合衆国特許出願第108,
217号の一部継続出願であり、該出願の内容をこ−に
参照として取り入れる。本発明はアメリカ合衆国公衆衛
生局国立ガン研究所から、交附金番号CA−15126
およびCA−15437により一部援助されたものであ
る。
の共通に譲渡されたアメリカ合衆国特許出願第108,
217号の一部継続出願であり、該出願の内容をこ−に
参照として取り入れる。本発明はアメリカ合衆国公衆衛
生局国立ガン研究所から、交附金番号CA−15126
およびCA−15437により一部援助されたものであ
る。
本分凱至茨五分互
本発明は、前立腺酸性フォスファターゼとは明確に異な
るヒト前立腺抗原の免疫学的検出のための診断試薬およ
び方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、実験室的
方法で前立腺ガン検出に使用するのに通した新規なヒト
前立腺抗原およびそれに対し特異的な抗体に関する。
るヒト前立腺抗原の免疫学的検出のための診断試薬およ
び方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、実験室的
方法で前立腺ガン検出に使用するのに通した新規なヒト
前立腺抗原およびそれに対し特異的な抗体に関する。
丘旦肢歪
前立腺ガンは老年に非常に多く、70才以上の男性の約
半分は前立腺ガンの発生を見ている。この前立腺ガンの
高い発生率はその検出に用いることのできるマーカーの
探索へと導いた。転移した前立腺ガンを有する患者にお
ける血漿酸性フォスファターゼ活性の上昇が最初にGu
tn+an eL al によりJ、 Cl1n、
Invest、 17:473 (1938)に報告
された。前立腺ガンにおいて、前立腺酸性フォスファタ
ーゼがガン組織から血液中へ放出され、総血漿酸性フォ
スファターゼ濃度が正常値より大きく上昇する結果を伴
なう。その時からこの酵素およびその前立腺ガンとの関
係に関する多数の研究がなされた。YamによるAme
r、 J、 Med、 56 :604 (1974)
の総説を参照。しかしながら慣用の分光分析学的方法に
よる血漿酸性フォスファターゼの測定は、早期における
前立腺ガンの発見にしばしば失敗する。一般に、血漿フ
ォスファターゼ活性は、骨転移を有する前立腺ガンを有
する患者の約65ないし90%、骨転移のレントゲン的
証拠のない患者の約30%、および臨床的に示し得る転
移を欠く患者のたった約5ないし10%において上昇す
るに過ぎない。
半分は前立腺ガンの発生を見ている。この前立腺ガンの
高い発生率はその検出に用いることのできるマーカーの
探索へと導いた。転移した前立腺ガンを有する患者にお
ける血漿酸性フォスファターゼ活性の上昇が最初にGu
tn+an eL al によりJ、 Cl1n、
Invest、 17:473 (1938)に報告
された。前立腺ガンにおいて、前立腺酸性フォスファタ
ーゼがガン組織から血液中へ放出され、総血漿酸性フォ
スファターゼ濃度が正常値より大きく上昇する結果を伴
なう。その時からこの酵素およびその前立腺ガンとの関
係に関する多数の研究がなされた。YamによるAme
r、 J、 Med、 56 :604 (1974)
の総説を参照。しかしながら慣用の分光分析学的方法に
よる血漿酸性フォスファターゼの測定は、早期における
前立腺ガンの発見にしばしば失敗する。一般に、血漿フ
ォスファターゼ活性は、骨転移を有する前立腺ガンを有
する患者の約65ないし90%、骨転移のレントゲン的
証拠のない患者の約30%、および臨床的に示し得る転
移を欠く患者のたった約5ないし10%において上昇す
るに過ぎない。
前立腺酸性フォスファターゼの特異的テストを開発する
ための先行技術の努力は、いわゆる特異的基質に対する
酵素活性に依存する手法では前立腺起源の酵素活性に関
係のない多数の酸性フォスファターゼ間の他の生化学的
および免疫学的違いを考慮できないため、限られた成功
度しかなかった。イソ酵素、すなわち同じ特性酵素活性
および類似の分子構造を持つが、アミノ酸配列および/
または内容において異なり、従って免疫化学的に区別し
得る遺伝子的に洗練された酵素の場合、単に特定の基質
の選択だけで異なるイソ酵素形を区別することは本来不
可能に思われる。そのためこれら先行技術の方法のどれ
一つも前立腺酸性フォスファターゼ活性の直接の測定に
高度に特異でないことは驚くに値しない。例えばCan
cer 5: 236(1952); J、 La
b、 Cl1n、 Wed、 82:486(1
913>:C11n。
ための先行技術の努力は、いわゆる特異的基質に対する
酵素活性に依存する手法では前立腺起源の酵素活性に関
係のない多数の酸性フォスファターゼ間の他の生化学的
および免疫学的違いを考慮できないため、限られた成功
度しかなかった。イソ酵素、すなわち同じ特性酵素活性
および類似の分子構造を持つが、アミノ酸配列および/
または内容において異なり、従って免疫化学的に区別し
得る遺伝子的に洗練された酵素の場合、単に特定の基質
の選択だけで異なるイソ酵素形を区別することは本来不
可能に思われる。そのためこれら先行技術の方法のどれ
一つも前立腺酸性フォスファターゼ活性の直接の測定に
高度に特異でないことは驚くに値しない。例えばCan
cer 5: 236(1952); J、 La
b、 Cl1n、 Wed、 82:486(1
913>:C11n。
Chew、 Acta、旦;21(1973); J、
Ph1sio1. Chem、356;1775(1
975)参照。
Ph1sio1. Chem、356;1775(1
975)参照。
前立腺酸性フォスファターゼの検出のために用いられる
先行技術試薬の多くには本来存在するように見える非常
特異性の前述の問題に加えて、他の病気に伴う血漿酸性
フォスファターゼの上昇の報告があり、それが前立腺ガ
ンの正確な臨床学的診断を得る問題を益々複雑にしてい
る。例えばTuckman et alはAm、 J、
Med、27:959(1959)において、ゴーシ
ュー病患者に血漿酸性フォスファターゼ濃度の上昇が見
られることを記している。
先行技術試薬の多くには本来存在するように見える非常
特異性の前述の問題に加えて、他の病気に伴う血漿酸性
フォスファターゼの上昇の報告があり、それが前立腺ガ
ンの正確な臨床学的診断を得る問題を益々複雑にしてい
る。例えばTuckman et alはAm、 J、
Med、27:959(1959)において、ゴーシ
ュー病患者に血漿酸性フォスファターゼ濃度の上昇が見
られることを記している。
前立腺酸性フォスファターゼに対する特異的基質の開発
における本質的な困難のため、ある研究者は前立腺酸性
フォスファターゼの免疫学的検出法を開発した。しかし
ながら以前報告された免疫化学的方法はそれ自体それら
の広範囲普及受は入れをはばむ欠点を持っている。例え
ばSchuImanet alはImmunolog3
’ 93:474(1964)においてヒト前立腺酸性
フォスファターゼの検出のための免疫拡散試験を記載し
た。前立腺病を有する患者から直腸マツサージによって
得られた前立胆液抗原から製造された抗血清を使用し、
二重拡散法において正常な腎臓、こう丸、肝臓および肺
臓の抽出液に対し、交差反応性沈降素ラインが観察され
なかった。しかしながらこの方法は多量の抗原を使って
さえも限られた怒度、および前立腺液中に存在する他の
抗原的には関係のない血清タンパク成分と交差反応し得
る抗血清を使用する欠点を有する国際特許出願公告Nα
WO79100475において(その内容はこ\に参考
として取り入れる)Chu et alに上述の欠点の
多くを排除する、前立腺ガンに関連する前立腺酸性フォ
スファターゼイソ酵素パターンの検出のための新しい方
法を記載する。
における本質的な困難のため、ある研究者は前立腺酸性
フォスファターゼの免疫学的検出法を開発した。しかし
ながら以前報告された免疫化学的方法はそれ自体それら
の広範囲普及受は入れをはばむ欠点を持っている。例え
ばSchuImanet alはImmunolog3
’ 93:474(1964)においてヒト前立腺酸性
フォスファターゼの検出のための免疫拡散試験を記載し
た。前立腺病を有する患者から直腸マツサージによって
得られた前立胆液抗原から製造された抗血清を使用し、
二重拡散法において正常な腎臓、こう丸、肝臓および肺
臓の抽出液に対し、交差反応性沈降素ラインが観察され
なかった。しかしながらこの方法は多量の抗原を使って
さえも限られた怒度、および前立腺液中に存在する他の
抗原的には関係のない血清タンパク成分と交差反応し得
る抗血清を使用する欠点を有する国際特許出願公告Nα
WO79100475において(その内容はこ\に参考
として取り入れる)Chu et alに上述の欠点の
多くを排除する、前立腺ガンに関連する前立腺酸性フォ
スファターゼイソ酵素パターンの検出のための新しい方
法を記載する。
しかしながら前立腺ガンに関連する診断学的に適切な前
立腺酸性フォスファターゼイソ酵素パターンは、それに
対する抗体の製造のためにそれから抽出されるガン性前
立111!faのソースを必要とすることによって実施
上の問題を生ずる。
立腺酸性フォスファターゼイソ酵素パターンは、それに
対する抗体の製造のためにそれから抽出されるガン性前
立111!faのソースを必要とすることによって実施
上の問題を生ずる。
近年特異的診断試薬の開発を目指し、種々のタイプのガ
ンのための酵素または抗原マーカーを同定するために多
大の努力が費やされた。理想的な悪性しゅ瘍マーカーは
、他の特性の中でも、組織または細胞タイプ特異性を発
揮し、そして循環系または個人から容易に得ることので
きる他の生物学的環境中に放出されるものであろう。以
前の研究者はヒト前立腺組織特異性抗原の存在を証明し
た。例えばR,H,Flocks et al、、l
J、 Urol、84;134 ’ (1960)はB
PH(良性前立腺肥大)前立腺組織の抽出物でウサギを
免疫し、そしてゲル拡散法によって組織特異性抗前立腺
抗体の存在を証明した。しかしながら彼らは、反応性抗
原の性状を示すためのデータを全く提出しなかった。抗
血清および前立腺抽出物によって生成した沈デン線は、
前立腺酸性フォスファターゼとその抗体との反応による
ものと考えられる。
ンのための酵素または抗原マーカーを同定するために多
大の努力が費やされた。理想的な悪性しゅ瘍マーカーは
、他の特性の中でも、組織または細胞タイプ特異性を発
揮し、そして循環系または個人から容易に得ることので
きる他の生物学的環境中に放出されるものであろう。以
前の研究者はヒト前立腺組織特異性抗原の存在を証明し
た。例えばR,H,Flocks et al、、l
J、 Urol、84;134 ’ (1960)はB
PH(良性前立腺肥大)前立腺組織の抽出物でウサギを
免疫し、そしてゲル拡散法によって組織特異性抗前立腺
抗体の存在を証明した。しかしながら彼らは、反応性抗
原の性状を示すためのデータを全く提出しなかった。抗
血清および前立腺抽出物によって生成した沈デン線は、
前立腺酸性フォスファターゼとその抗体との反応による
ものと考えられる。
R,J、 Ablin et al、、J、Immun
ol、104:1329(1970)およびR,J、
Ablin、 Cancer 29:1570(197
2)はまたヒト前立腺組織特異性抗原の存在を示した。
ol、104:1329(1970)およびR,J、
Ablin、 Cancer 29:1570(197
2)はまたヒト前立腺組織特異性抗原の存在を示した。
正常な前立腺抽出物で免疫化したウサギから得られた抗
血清を使用し、Ablin et al はヒト前立腺
中に二つの抗原性成分を示した。それらの一つは前立膝
酸性フォスファターゼと同定されたが、他方の特異性は
非前立腺組織抗原であることが示された。第二の抗原に
対し反応性の異抗体は、抗血清をヒト前立腺液で処理す
ることにより消失することができなかった。さらにこの
抗原は良性および悪性前立腺組繊中に欠いていることが
示された。
血清を使用し、Ablin et al はヒト前立腺
中に二つの抗原性成分を示した。それらの一つは前立膝
酸性フォスファターゼと同定されたが、他方の特異性は
非前立腺組織抗原であることが示された。第二の抗原に
対し反応性の異抗体は、抗血清をヒト前立腺液で処理す
ることにより消失することができなかった。さらにこの
抗原は良性および悪性前立腺組繊中に欠いていることが
示された。
これに対し、本発明の前立腺抗原はすべての前立腺組織
中に(正常、良性または悪性)殆んど同し量で存在する
。さらに、それは前立腺液により、培養したヒト前立腺
ガン細胞およびその培地により同様に検出可能である。
中に(正常、良性または悪性)殆んど同し量で存在する
。さらに、それは前立腺液により、培養したヒト前立腺
ガン細胞およびその培地により同様に検出可能である。
Ablinの論文はそこに記載する抗原に対する抗血清
を前立腺液で吸収し、その後で沈降素ラインがなお検出
されたことを記載する。
を前立腺液で吸収し、その後で沈降素ラインがなお検出
されたことを記載する。
本発明の抗原に対する抗体の前立腺液による吸収は沈降
素ラインを与えず、この抗原は、^blinet al
の抗原ではそうでないが、前立腺液中に存在することを
示している。
素ラインを与えず、この抗原は、^blinet al
の抗原ではそうでないが、前立腺液中に存在することを
示している。
C,W、Moncure et al、+ Cance
r Che+l1other、Rep。
r Che+l1other、Rep。
59:105(1975)は、本発明の抗原では結合す
るが、p H8,0においてDEAEセファローズへ結
合しないヒト前立腺&l1w&特異性抗原剤の存在を示
した。
るが、p H8,0においてDEAEセファローズへ結
合しないヒト前立腺&l1w&特異性抗原剤の存在を示
した。
この特徴は本タンパクとMoncure et alの
間の有意な構造上の違いを最も確実に示している。
間の有意な構造上の違いを最も確実に示している。
このように許容できる精度をもって、そして先行技術の
前述の困難なしに、前立腺ガンを検出するための簡単な
、信頼性ある、感受性のそして特異的試薬および手法に
対してなお需要が存在する。
前述の困難なしに、前立腺ガンを検出するための簡単な
、信頼性ある、感受性のそして特異的試薬および手法に
対してなお需要が存在する。
本発明はこのような需要を満たす。
本発凱■皿丞
本発明の一般的目的は、血液、尿または他の体液中に循
環しているヒト前立腺抗原の免疫学的に特異的な検出に
適した改良された診断試薬の製造に有用な精製したヒト
前立腺抗原を提供することである。
環しているヒト前立腺抗原の免疫学的に特異的な検出に
適した改良された診断試薬の製造に有用な精製したヒト
前立腺抗原を提供することである。
本発明の他の目的は、前立腺ガンの早期発見に有用な、
急速で簡単で、しかし高度に特異的でそして感受性の、
免疫学的手法を提供することである。
急速で簡単で、しかし高度に特異的でそして感受性の、
免疫学的手法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、前立腺ガンおよびその治療
法の有効性を監視するための新しいマーカーを提供する
ことである。
法の有効性を監視するための新しいマーカーを提供する
ことである。
本発明の他の目的は、ヒト前立腺抗原に対する有用な単
クローン性抗体を提供することである。
クローン性抗体を提供することである。
本明細書および請求の範囲を検討するとき、本発明のそ
れ以上の目的、特徴および利益が本発明が関係する技j
ネi分野における当業者にはもっと完全に明らかになる
であろう。
れ以上の目的、特徴および利益が本発明が関係する技j
ネi分野における当業者にはもっと完全に明らかになる
であろう。
、[I の の 31
概略すれば、本発明の上述および他の目的、特徴および
利益は、その第一の局面において、前立腺酸性フォスフ
ァターゼとは区別される精製したヒト前立腺抗原を提供
することによって達成される。
利益は、その第一の局面において、前立腺酸性フォスフ
ァターゼとは区別される精製したヒト前立腺抗原を提供
することによって達成される。
第二の局面において、本発明は精製したヒト前立腺抗原
に高度に特異的であり、そして前立腺酸性フォスファタ
ーゼまたは他の組織を起源とする酸性フォスファターゼ
と交差反応しない抗血清を提供する。
に高度に特異的であり、そして前立腺酸性フォスファタ
ーゼまたは他の組織を起源とする酸性フォスファターゼ
と交差反応しない抗血清を提供する。
本発明の第三の局面において、高い感度と、良好な特異
性とを示し、そして前立腺以外の悪性しゅ瘍に対しては
実質土偶の陽性結果を示さない前立腺ガンの検出のため
の免疫化学的方法が提供される。
性とを示し、そして前立腺以外の悪性しゅ瘍に対しては
実質土偶の陽性結果を示さない前立腺ガンの検出のため
の免疫化学的方法が提供される。
第四の局面において、本発明は例えば前立腺ガンの試験
管内ラジオイムノ検出および前立腺ガンの免疫特異的化
学療法のキャリアーとして有用な、ヒト前立腺抗原に対
する特異的マーカーを提供する。
管内ラジオイムノ検出および前立腺ガンの免疫特異的化
学療法のキャリアーとして有用な、ヒト前立腺抗原に対
する特異的マーカーを提供する。
本発明によれば、正常またはガン性ヒト前立腺組織、前
立腺液、培養したヒト前立腺ガン細胞、またはその培地
からの抗原性製剤は、前立腺酸性フォスファターゼを含
まないヒト前立腺抗原より実質的になる製剤を得るよう
に精製される。これらの抗原性製剤は免疫学的ワクチン
注射および診断操作、特に免疫沈降素試験に使用される
。
立腺液、培養したヒト前立腺ガン細胞、またはその培地
からの抗原性製剤は、前立腺酸性フォスファターゼを含
まないヒト前立腺抗原より実質的になる製剤を得るよう
に精製される。これらの抗原性製剤は免疫学的ワクチン
注射および診断操作、特に免疫沈降素試験に使用される
。
免疫学的研究により、この抗原は正常、良性の肥大およ
びガン性前立腺に存在することを示すので、各種の前立
腺組織のプールを後での精製のための出発原料として使
用することができる。概略的には、而立腺′M1礒は4
°Cにおいて水性媒体中に最初抽出される。EDTA−
PBS溶液が便利に使用されるが、食塩水、3MKCl
または0.01%(v/v) Tween 80 (L
かし1M過塩素酸なし)も前立腺抗原の抽出に使用する
ことができる。この抗原はこのようにその過塩素酸に対
する感受性によってCEA (ガン胎児性抗原)から区
別される。
びガン性前立腺に存在することを示すので、各種の前立
腺組織のプールを後での精製のための出発原料として使
用することができる。概略的には、而立腺′M1礒は4
°Cにおいて水性媒体中に最初抽出される。EDTA−
PBS溶液が便利に使用されるが、食塩水、3MKCl
または0.01%(v/v) Tween 80 (L
かし1M過塩素酸なし)も前立腺抗原の抽出に使用する
ことができる。この抗原はこのようにその過塩素酸に対
する感受性によってCEA (ガン胎児性抗原)から区
別される。
遠心および口過によりホモジネートを清澄化した後、粗
抽出液からの上清を硫安分画にかける。
抽出液からの上清を硫安分画にかける。
20ないし80%飽和の硫安濃度がEDTA−PBS抽
出液から前立腺抗原を殆んど定量的に回収し、最高収率
は45ないし50%飽和である。他のタンパクの汚染を
できるだけ避けるため、好ましくは硫安の35ないし5
5%飽和度で沈澱を集めると、該沈澱は粗抽出液中の総
前立腺抗原の約70%を含有する。
出液から前立腺抗原を殆んど定量的に回収し、最高収率
は45ないし50%飽和である。他のタンパクの汚染を
できるだけ避けるため、好ましくは硫安の35ないし5
5%飽和度で沈澱を集めると、該沈澱は粗抽出液中の総
前立腺抗原の約70%を含有する。
ヒト***漿はある抗原を含み、二重免疫拡散法でウサギ
抗PA(前立腺抗原)血清と反応し、前立腺組織の粗抽
出液のそれと融合した免疫沈降素ラインを形成すること
が判明した。この結果は、***漿中にヒト前立腺抗原(
PA)と免疫学的に同一のタンパクが存在することを明
らかにした。
抗PA(前立腺抗原)血清と反応し、前立腺組織の粗抽
出液のそれと融合した免疫沈降素ラインを形成すること
が判明した。この結果は、***漿中にヒト前立腺抗原(
PA)と免疫学的に同一のタンパクが存在することを明
らかにした。
その後の研究は、検査したすべての***漿見本は0.4
ないし1.8 mg/mll (n = 9 、平均値
上標準偏差=0.71±0.42 )の範囲でPAの実
質量を含むことを示した。***漿20ないし30m!中
のPA含量は、100gの前立腺組織中のそれに等しい
ことが推定される。クロマトグラフィーにおいてPAの
溶離態様は、抗原のソースとして前立腺組織を使用した
それと類似である。***漿からそして前立腺組織から精
製したFAは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および
等電集束法によってそれぞれ示されるように、同一の移
動度および等電点(PF3.87±0.09 )を有す
る。両方の精製FAは、セファデックスG−75ゲルロ
過法によって示されるように、33.000−34,0
00の分子量を示す。そのほかに、精製したPA調製剤
抗PA血清と反応させるとき、同一性の一本の線が免疫
拡散において得られた。
ないし1.8 mg/mll (n = 9 、平均値
上標準偏差=0.71±0.42 )の範囲でPAの実
質量を含むことを示した。***漿20ないし30m!中
のPA含量は、100gの前立腺組織中のそれに等しい
ことが推定される。クロマトグラフィーにおいてPAの
溶離態様は、抗原のソースとして前立腺組織を使用した
それと類似である。***漿からそして前立腺組織から精
製したFAは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および
等電集束法によってそれぞれ示されるように、同一の移
動度および等電点(PF3.87±0.09 )を有す
る。両方の精製FAは、セファデックスG−75ゲルロ
過法によって示されるように、33.000−34,0
00の分子量を示す。そのほかに、精製したPA調製剤
抗PA血清と反応させるとき、同一性の一本の線が免疫
拡散において得られた。
***漿は前立腺組織よりもたやすく入手し得て、そして
多量のPAを含有するので、それはPAを単離する理想
的なソースに見える。PA単離源として***漿を使用す
ることはまた、前立腺組織の使用を上廻る利益を有する
ように見える。第一に、少なくとも4時間を要する当初
の抽出工程が省かれる。第二に、***漿20ないし30
−はPA含量に関して組織の100gと等しいので、精
製の最初の段階において多量の組繊抽出液の取り扱いが
避けられる。第三に、***漿はより少ない夾雑タンパク
を含有し、そして精製を容易にする。例えば、組織抽出
液中のヘモグロビンは、50%飽和度以上の濃度で硫安
によりPAと同時に沈澱し、精製の後工程においてこの
ヘモグロビンの除去は最終的に精製したPAの収率の低
下をもたらす。
多量のPAを含有するので、それはPAを単離する理想
的なソースに見える。PA単離源として***漿を使用す
ることはまた、前立腺組織の使用を上廻る利益を有する
ように見える。第一に、少なくとも4時間を要する当初
の抽出工程が省かれる。第二に、***漿20ないし30
−はPA含量に関して組織の100gと等しいので、精
製の最初の段階において多量の組繊抽出液の取り扱いが
避けられる。第三に、***漿はより少ない夾雑タンパク
を含有し、そして精製を容易にする。例えば、組織抽出
液中のヘモグロビンは、50%飽和度以上の濃度で硫安
によりPAと同時に沈澱し、精製の後工程においてこの
ヘモグロビンの除去は最終的に精製したPAの収率の低
下をもたらす。
***漿はより少量の汚染タンパクを含有するので、分画
沈澱工程中硫安濃度の上限カットオフ点を75%飽和度
まで上げることにより、PAのより多量を回収すること
が可能である。精製した形のPAのより良い回収は***
漿から達成される。
沈澱工程中硫安濃度の上限カットオフ点を75%飽和度
まで上げることにより、PAのより多量を回収すること
が可能である。精製した形のPAのより良い回収は***
漿から達成される。
D E A E −BioGel A陰イオン交換カ
ラムは、前立腺抗体を効果的に保留し、そしてp H8
,0におけるトリス−HCl緩衝液による該カラムの洗
浄は該抗原のカラムから溶離しない。該抗原の溶離は同
じ緩衝液中18ないし78mM NaC+により、そ
して続いてゲルクロマトグラフィーによるその後の精製
によって達成することができる。DEAEカラムから溶
離したPA製剤中の夾雑タンパクのバルクは45,00
0以上の分子量を有し、従ってセファデックスG−10
0カラム上のゲル口過によりPA(分子量33,000
ないし34゜000)から分離することができる。
ラムは、前立腺抗体を効果的に保留し、そしてp H8
,0におけるトリス−HCl緩衝液による該カラムの洗
浄は該抗原のカラムから溶離しない。該抗原の溶離は同
じ緩衝液中18ないし78mM NaC+により、そ
して続いてゲルクロマトグラフィーによるその後の精製
によって達成することができる。DEAEカラムから溶
離したPA製剤中の夾雑タンパクのバルクは45,00
0以上の分子量を有し、従ってセファデックスG−10
0カラム上のゲル口過によりPA(分子量33,000
ないし34゜000)から分離することができる。
溶離液としてpH勾配溶液を使用するDEAEカラム上
の陰イオン交換クロマトグラフィーにより、追加の工程
を実施することができる。7.6ないし6.7のpH範
囲における分画量に、PAを含有することを示した二つ
のタンパクピークが検出された。ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動において、最初のピーク分画にはタンパク不
均一性が見られたが、第2のピーク分画は単一のタンパ
クバンドを与えた。従って均一なPAを得るため、第2
のピーク分画だけを集めた。この溶離の終点において、
クロマトグラフィーにかけた全PAの約20%がなおり
EAEカラムに結合していた。これは0.08M N
aClで溶離することにより定量的に回収することがで
きるが、しかし溶離したPA製剤中にタンパク不均一性
が観察された。
の陰イオン交換クロマトグラフィーにより、追加の工程
を実施することができる。7.6ないし6.7のpH範
囲における分画量に、PAを含有することを示した二つ
のタンパクピークが検出された。ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動において、最初のピーク分画にはタンパク不
均一性が見られたが、第2のピーク分画は単一のタンパ
クバンドを与えた。従って均一なPAを得るため、第2
のピーク分画だけを集めた。この溶離の終点において、
クロマトグラフィーにかけた全PAの約20%がなおり
EAEカラムに結合していた。これは0.08M N
aClで溶離することにより定量的に回収することがで
きるが、しかし溶離したPA製剤中にタンパク不均一性
が観察された。
上述のPA精製過程において興味ある観察がなされた。
第1のピーク分画は、第2のピーク分画からの精製PA
のそれとは異なるpIを存するPAを含有していた。ま
た、pH勾配溶離の終点においてDEAEカラムによっ
て保有されているPAも異なるplを示した。同様な観
察は***漿からのPA精製にもなされ、そしてノイラミ
ニダーゼによる処理は、これらPA異性体のpIを高p
H域へ上昇させた。このように本発明のヒト前立腺抗原
は多くの異なる異性体の形で存在するようである。
のそれとは異なるpIを存するPAを含有していた。ま
た、pH勾配溶離の終点においてDEAEカラムによっ
て保有されているPAも異なるplを示した。同様な観
察は***漿からのPA精製にもなされ、そしてノイラミ
ニダーゼによる処理は、これらPA異性体のpIを高p
H域へ上昇させた。このように本発明のヒト前立腺抗原
は多くの異なる異性体の形で存在するようである。
部分的に精製した抗原の調製的ポリアクリルアミドゲル
電気泳動は純粋な抗原製剤を得るのに有効である。この
精製した抗原はドデシル硫酸ナトリウムの添加および添
加なしで、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により均一
であることを示す。
電気泳動は純粋な抗原製剤を得るのに有効である。この
精製した抗原はドデシル硫酸ナトリウムの添加および添
加なしで、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により均一
であることを示す。
これは下部単位なしで分子933,000ないし34.
000を有し、そして単一のpI6.9を示す。
000を有し、そして単一のpI6.9を示す。
免疫沈澱および免疫細胞化学的手法を使用し、PAは前
立腺上皮マーカータンパクであることが示された。PA
は前立腺および前立腺管の上皮層と、前立腺分泌液およ
び結石中に局在するが、しかし尿道周囲線、精のう、輸
精管、ぼうこう移行性上皮、前立腺尿道、フオンブルン
巣の腺内膜、またはこう丸中には存在しない。これらの
観察は***葉中のPAは前立腺起源のものであることを
示唆する。
立腺上皮マーカータンパクであることが示された。PA
は前立腺および前立腺管の上皮層と、前立腺分泌液およ
び結石中に局在するが、しかし尿道周囲線、精のう、輸
精管、ぼうこう移行性上皮、前立腺尿道、フオンブルン
巣の腺内膜、またはこう丸中には存在しない。これらの
観察は***葉中のPAは前立腺起源のものであることを
示唆する。
PAの前立腺ガンにおける可能性ある臨床上の応用を示
すデータがこ−に提供される。O,1mg/dの感度を
もって循環するPAの定量は、酵素イムノアッセイ法に
よって達成された。PAは正常な女性および女性ガン患
者からの血清中には検出されないが、非前立腺ガンの男
性患者からの血清は正常な男性と同範囲のPAを含有す
る。前立腺病の患者は循環PAの上昇したレベルを有す
ることを示した。良性前立腺肥大患者と、A段階の前立
腺ガン患者との間に、PAレベルに定量的な差は見出せ
ないが、他の段階の前立腺ガン患者は、定量的および定
性的に著しく上昇したPAレベルを示す。免疫細胞学的
操作をもって、検討したすべての一次的および二次的前
立腺しゆ瘍は抗PA血清と陽性に反応したが、しかし非
前立腺起源のしゅ瘍は反応しなかった。従ってこれらの
結果は、前立腺ガンを診断し、そしてその処置の効果を
監視するための追加手段を示唆する。他の可能性ある応
用は、例えばり、 Pressman、 Cancer
Re5earch但: 2960 (1980)記載
の方法による、前立腺ガン、特に段階分けおよび処置が
非常に臨界的なミクロ転移の生体内ラジオイムノ検出に
特異的抗PA抗体を使用することである。免疫特異療法
も可能性ある分野であり、そこではPA免疫試薬の入手
可能性により多くの研究が今や可能である。例えばT、
Ghose et al、、J、 Nat、 C
ancer In5t、 6旦657(1978)参
照。さらに、前立腺上皮に対するこの新しいマーカーの
助けにより、前立腺の生理を研究することができる。
すデータがこ−に提供される。O,1mg/dの感度を
もって循環するPAの定量は、酵素イムノアッセイ法に
よって達成された。PAは正常な女性および女性ガン患
者からの血清中には検出されないが、非前立腺ガンの男
性患者からの血清は正常な男性と同範囲のPAを含有す
る。前立腺病の患者は循環PAの上昇したレベルを有す
ることを示した。良性前立腺肥大患者と、A段階の前立
腺ガン患者との間に、PAレベルに定量的な差は見出せ
ないが、他の段階の前立腺ガン患者は、定量的および定
性的に著しく上昇したPAレベルを示す。免疫細胞学的
操作をもって、検討したすべての一次的および二次的前
立腺しゆ瘍は抗PA血清と陽性に反応したが、しかし非
前立腺起源のしゅ瘍は反応しなかった。従ってこれらの
結果は、前立腺ガンを診断し、そしてその処置の効果を
監視するための追加手段を示唆する。他の可能性ある応
用は、例えばり、 Pressman、 Cancer
Re5earch但: 2960 (1980)記載
の方法による、前立腺ガン、特に段階分けおよび処置が
非常に臨界的なミクロ転移の生体内ラジオイムノ検出に
特異的抗PA抗体を使用することである。免疫特異療法
も可能性ある分野であり、そこではPA免疫試薬の入手
可能性により多くの研究が今や可能である。例えばT、
Ghose et al、、J、 Nat、 C
ancer In5t、 6旦657(1978)参
照。さらに、前立腺上皮に対するこの新しいマーカーの
助けにより、前立腺の生理を研究することができる。
前立腺組織および液中の酸性フォスファターゼ以外の抗
原の検出に使用できる抗血清を製造するため、雌ウサギ
に前立腺組織から単離された精製した前立腺抗原が注射
された。血清を集め、熱で不活性化し、そして使用まで
−20’Cで貯蔵する。
原の検出に使用できる抗血清を製造するため、雌ウサギ
に前立腺組織から単離された精製した前立腺抗原が注射
された。血清を集め、熱で不活性化し、そして使用まで
−20’Cで貯蔵する。
不溶化した正常血漿タンパクで処理後(正常な血漿成分
に対する抗体を、該抗血清を正常な男性および女性大人
から得られたグルタルアルデヒドで不溶化した正常血漿
で処理して除去する)、該抗血清を二重免疫拡散法およ
びロケット免疫電気泳動技術を使用して特異的に前立腺
組織抽出液(43/43)と反応させる。前立腺以外の
組織から調製した抽出液の電池に対しては免疫反応性が
観察されなかった。前立腺抽出液からの前立腺抗原は、
ゲル口過クロマトグラフィー(分子量30゜000−4
0,000)、等電集束(pI6.9)およびアガロー
ス電気泳動(MRo、2.ウシ血清アルブミンに対して
)によって特徴付けられる。
に対する抗体を、該抗血清を正常な男性および女性大人
から得られたグルタルアルデヒドで不溶化した正常血漿
で処理して除去する)、該抗血清を二重免疫拡散法およ
びロケット免疫電気泳動技術を使用して特異的に前立腺
組織抽出液(43/43)と反応させる。前立腺以外の
組織から調製した抽出液の電池に対しては免疫反応性が
観察されなかった。前立腺抽出液からの前立腺抗原は、
ゲル口過クロマトグラフィー(分子量30゜000−4
0,000)、等電集束(pI6.9)およびアガロー
ス電気泳動(MRo、2.ウシ血清アルブミンに対して
)によって特徴付けられる。
前立腺抗原の濃度は、正常、良性肥大および悪性前立腺
&11taから調製した抽出液間で著しく相違せず、そ
して該抗原は細胞化学的染色法により決定するとき、酸
性フォスファターゼ活性を示さなかった。さらにその大
概の分子ff1(30,00040,000)は、前立
腺酸性フォスファターゼの分子u(loo、000)と
著しく異なる。
&11taから調製した抽出液間で著しく相違せず、そ
して該抗原は細胞化学的染色法により決定するとき、酸
性フォスファターゼ活性を示さなかった。さらにその大
概の分子ff1(30,00040,000)は、前立
腺酸性フォスファターゼの分子u(loo、000)と
著しく異なる。
血清中に検出された抗原は大きい見掛は分子量(80,
000−100,000)を持っていたが、抗原混合お
よびピーク増強実験は、環境中の前立腺抗原が前立腺組
織および前立Ill液中のヒト前立腺抗原と免疫学的に
同一であることを示す。
000−100,000)を持っていたが、抗原混合お
よびピーク増強実験は、環境中の前立腺抗原が前立腺組
織および前立Ill液中のヒト前立腺抗原と免疫学的に
同一であることを示す。
血清由来抗原は血漿タンパクと結合し得る。各種の抗原
およびホルモン様物質と血漿タンパクのこのような結合
は良く知られており、そしてT、PetersJr、に
よって”Serum AlbulIlin” In:
F、 W、 Putman(ed、)、 The Pl
asma Proteins、 Vol、 l : p
p、133−135+ New York、 N、Y、
Academic Press+ t975によって
報告されている。しかしながらPPD−PAGEは、前
立腺組織および***葉中のものと同様に36,000の
分子量を明らかにした。
およびホルモン様物質と血漿タンパクのこのような結合
は良く知られており、そしてT、PetersJr、に
よって”Serum AlbulIlin” In:
F、 W、 Putman(ed、)、 The Pl
asma Proteins、 Vol、 l : p
p、133−135+ New York、 N、Y、
Academic Press+ t975によって
報告されている。しかしながらPPD−PAGEは、前
立腺組織および***葉中のものと同様に36,000の
分子量を明らかにした。
実験室内において農場動物から抗体を調製する慣用方法
の代りに、PAに対する単クローン性抗体は公知のハイ
ブリドーマ細胞培養法を使用して調製することができる
。一般に、この方法は抗体産生融合細胞線、例えば骨l
腫細胞の共存し得る連続線と融合した一次牌臓細胞をつ
くり、そして融合した細胞を大量培養により、または骨
髄腫細胞線がそれから誘導されたか、もしくはそれと共
存し得る動物種で成育させることを含む。このような抗
体は、高度に特異性で、そして感受性で、さらに免疫学
的に純粋であるので、動物の免疫化によって調製したも
のと比較して多くの利益を提供する。
の代りに、PAに対する単クローン性抗体は公知のハイ
ブリドーマ細胞培養法を使用して調製することができる
。一般に、この方法は抗体産生融合細胞線、例えば骨l
腫細胞の共存し得る連続線と融合した一次牌臓細胞をつ
くり、そして融合した細胞を大量培養により、または骨
髄腫細胞線がそれから誘導されたか、もしくはそれと共
存し得る動物種で成育させることを含む。このような抗
体は、高度に特異性で、そして感受性で、さらに免疫学
的に純粋であるので、動物の免疫化によって調製したも
のと比較して多くの利益を提供する。
現在この前立腺抗原の臨床応用の可能性は、それが腫瘍
特異性または病理学的連合を示さないのですべて知られ
ている訳ではない。しかしながらすべての前立腺lIi
織中に存在する酸性フォスファターゼの場合のように、
この前立腺抗原は血清監視に際して存用な臨床上の情報
を提供する。われわれの研究室における最近の実験は、
ロケンt−免疫電気泳動および酵素結合イムノアッセイ
法により、ある前立腺ガン患者の血清中にこの前立腺抗
原が検出されるが、しかし正常な健康人または他のガン
患者の血清には検出されないことを示した。
特異性または病理学的連合を示さないのですべて知られ
ている訳ではない。しかしながらすべての前立腺lIi
織中に存在する酸性フォスファターゼの場合のように、
この前立腺抗原は血清監視に際して存用な臨床上の情報
を提供する。われわれの研究室における最近の実験は、
ロケンt−免疫電気泳動および酵素結合イムノアッセイ
法により、ある前立腺ガン患者の血清中にこの前立腺抗
原が検出されるが、しかし正常な健康人または他のガン
患者の血清には検出されないことを示した。
その後の実験は、PAは前立腺組織および前立腺起源の
確立した連続組織培養線の両方に組織学的に検出可能で
あり、そして生体内および試験管内の両方で前立腺腫瘍
細胞によって放出されることが示された。さらに前立腺
ガンに冒されている患者の血清中のPAレベルは前立腺
酸性フォスファターゼの血清レベルと関連がなく、その
ため循環するPAと循環する酸性フォスファターゼの同
時定型は、前立腺ガンの改良された診断手段をよく提供
し得ることが示された。ヒト前立腺抗原は前立腺の正常
成分の一つであるが、このように前立腺ガンの発見に大
きな役割を果たすことができる。
確立した連続組織培養線の両方に組織学的に検出可能で
あり、そして生体内および試験管内の両方で前立腺腫瘍
細胞によって放出されることが示された。さらに前立腺
ガンに冒されている患者の血清中のPAレベルは前立腺
酸性フォスファターゼの血清レベルと関連がなく、その
ため循環するPAと循環する酸性フォスファターゼの同
時定型は、前立腺ガンの改良された診断手段をよく提供
し得ることが示された。ヒト前立腺抗原は前立腺の正常
成分の一つであるが、このように前立腺ガンの発見に大
きな役割を果たすことができる。
ヒト前立腺抗原に対する診断用抗体の製造に適当な免疫
原の調製のため、慣用のワクチン製造技術を使用するこ
とができる。好ましくは非抗原性のアジュバント、例え
ば明ばん、フロイントの完全アジュバント、サポニン、
第4級アンモニウム界面活性剤、アルキルアミン等が適
当な免疫学的に許容できる非抗原性の担体中で精製した
前立腺抗原と混合され、そして得られる混合物は、例え
ば口過によって滅菌することができる。
原の調製のため、慣用のワクチン製造技術を使用するこ
とができる。好ましくは非抗原性のアジュバント、例え
ば明ばん、フロイントの完全アジュバント、サポニン、
第4級アンモニウム界面活性剤、アルキルアミン等が適
当な免疫学的に許容できる非抗原性の担体中で精製した
前立腺抗原と混合され、そして得られる混合物は、例え
ば口過によって滅菌することができる。
このワクチンは免疫沈澱性の抗体の産生を促進する他の
タンパクをもって免疫化するために既知の方法に従って
非経口的に投与することができ、好ましくは一次投与は
少なくとも一回の1ないし10週間後の追加注射によっ
て補完される。良い成績はウサギに一次免疫の1ケ月後
2週間隔で4回の補完投与を使用して得られた。ウサギ
、ヤギおよび他の哺乳頚動物中の注射回数当りのタンパ
ク含量は変化し得るが、しかし一般に体重1 kg当り
タンパク約マイクログラムである。抗体は免疫化学の当
業者に良く知られた方法で採取し、処理することができ
、そして種々の免疫化学概作、例えば免疫沈澱法、螢光
抗体法、血清中和法などにおいて前立腺特異抗原の免疫
学的検出に有用な試薬を提供する。このような抗体は後
で詳述する前立腺ガンの診断試験において対照試薬とし
て有用である。
タンパクをもって免疫化するために既知の方法に従って
非経口的に投与することができ、好ましくは一次投与は
少なくとも一回の1ないし10週間後の追加注射によっ
て補完される。良い成績はウサギに一次免疫の1ケ月後
2週間隔で4回の補完投与を使用して得られた。ウサギ
、ヤギおよび他の哺乳頚動物中の注射回数当りのタンパ
ク含量は変化し得るが、しかし一般に体重1 kg当り
タンパク約マイクログラムである。抗体は免疫化学の当
業者に良く知られた方法で採取し、処理することができ
、そして種々の免疫化学概作、例えば免疫沈澱法、螢光
抗体法、血清中和法などにおいて前立腺特異抗原の免疫
学的検出に有用な試薬を提供する。このような抗体は後
で詳述する前立腺ガンの診断試験において対照試薬とし
て有用である。
もっとも簡単な免疫沈降試験は、別々の抗体および抗原
溶液が毛細管中の共通の界面で反応することが許され、
そして該界面に沈澱の生成により陽性反応が示される、
毛細管沈降素試験を包含する。この方法は、界面を越え
て二つの溶液の避けられない拡散のため、比較的不感受
性で不正確であり、そしてさらに最終結果が保存できな
い。
溶液が毛細管中の共通の界面で反応することが許され、
そして該界面に沈澱の生成により陽性反応が示される、
毛細管沈降素試験を包含する。この方法は、界面を越え
て二つの溶液の避けられない拡散のため、比較的不感受
性で不正確であり、そしてさらに最終結果が保存できな
い。
寒天ゲル拡散はこれら欠点を避けるもっとも簡単な方法
である。抗原溶液(または血清サンプル)が連続する寒
天ゲルにバンチされた中央凹み中に置かれ、そしてそれ
に対する抗体(または対応して抗原)を含む血清の適当
な希釈液が中央凹みを同心的に囲む凹み中に入れられる
。陽性反応は一つまたはそれ以上の同心凹みと中央くぼ
みとの間の沈降素線によって記録される。この方法は比
較的不感受性で、かなりおそく、試験結果を読み取るの
に1ないし4日を要する。
である。抗原溶液(または血清サンプル)が連続する寒
天ゲルにバンチされた中央凹み中に置かれ、そしてそれ
に対する抗体(または対応して抗原)を含む血清の適当
な希釈液が中央凹みを同心的に囲む凹み中に入れられる
。陽性反応は一つまたはそれ以上の同心凹みと中央くぼ
みとの間の沈降素線によって記録される。この方法は比
較的不感受性で、かなりおそく、試験結果を読み取るの
に1ないし4日を要する。
ラジオイムノアッセイ(RI A) 、例えばラジオイ
ムノ沈降素試験は極めて感受性であるが(古い方法の数
倍のオーダー)、シかし実施に数日を要し、そして複雑
な設備を必ずしも広く得られない高度に訓練した人員を
必要とする。
ムノ沈降素試験は極めて感受性であるが(古い方法の数
倍のオーダー)、シかし実施に数日を要し、そして複雑
な設備を必ずしも広く得られない高度に訓練した人員を
必要とする。
向流免疫電気泳動(CIEP)は、実施にわずか約1時
間はどを要し、そして寒天ゲル拡散法よりもかなり怒受
性の広く使用される免疫沈降素法である。反応成分は寒
天ゲル中にカットされた対立する凹み中に入れられ、小
さい電流がそれへ加えられ、抗原と抗体の両方が相手に
向って移動する。陽性反応は抗原−抗体界面において沈
降素の生成によって指示される。この試験法は合理的に
信頬でき、容易に実施でき、そして安価であるので、こ
れは本発明のこの局面の好ましい具体例を代表する。
間はどを要し、そして寒天ゲル拡散法よりもかなり怒受
性の広く使用される免疫沈降素法である。反応成分は寒
天ゲル中にカットされた対立する凹み中に入れられ、小
さい電流がそれへ加えられ、抗原と抗体の両方が相手に
向って移動する。陽性反応は抗原−抗体界面において沈
降素の生成によって指示される。この試験法は合理的に
信頬でき、容易に実施でき、そして安価であるので、こ
れは本発明のこの局面の好ましい具体例を代表する。
免疫電気泳動試験の目的のため、本発明の診断用抗体製
剤は、精製することなく使用するときはその抗体力価に
応じ、体積比で1:10ないし1: 500でリン酸緩
衝食塩水によって一般に希釈される。この範囲の下限の
制限要因は、存在する総タンパク中の抗体含量の関数で
ある。沈降線中に達成される区別の程度である。精製し
た抗体製剤は勿論低い総タンパク濃度を有し、そして未
精製製剤さえもそのタンパク含量は使用する特定の免疫
化学的試験法に適合するように変えることができ、最i
I!i量は例えば簡単な連続的希釈液を試験して決定さ
れる。
剤は、精製することなく使用するときはその抗体力価に
応じ、体積比で1:10ないし1: 500でリン酸緩
衝食塩水によって一般に希釈される。この範囲の下限の
制限要因は、存在する総タンパク中の抗体含量の関数で
ある。沈降線中に達成される区別の程度である。精製し
た抗体製剤は勿論低い総タンパク濃度を有し、そして未
精製製剤さえもそのタンパク含量は使用する特定の免疫
化学的試験法に適合するように変えることができ、最i
I!i量は例えば簡単な連続的希釈液を試験して決定さ
れる。
本発明の好ましい別の局面において、循環するヒト前立
腺抗原は今や免疫化学的手法により、好ましくは抗体−
抗原沈降素複合体のタンパク染色によって検出すること
ができる。前述の特W的抗血清を使用し、それに慣用の
抗原−抗体複合体検出方法を組み合わせることにより今
や血清サンプルから特異的ヒト前立腺抗原を免疫化学的
に分離することが可能である。
腺抗原は今や免疫化学的手法により、好ましくは抗体−
抗原沈降素複合体のタンパク染色によって検出すること
ができる。前述の特W的抗血清を使用し、それに慣用の
抗原−抗体複合体検出方法を組み合わせることにより今
や血清サンプルから特異的ヒト前立腺抗原を免疫化学的
に分離することが可能である。
この抗原−抗体複合体は、この方法の感度を上昇するた
め多数の公知の組織化学的染色法により、例えば螢光抗
体等により染色することができる。
め多数の公知の組織化学的染色法により、例えば螢光抗
体等により染色することができる。
その代り、定量のため放射性抗体を使用することができ
、それはより良い定量値を与えるばかりでなく、定量の
感度を上昇する。所望ならば、酵素結合イムノアッセイ
に使用するため、加藤らのJ、 Tmmunol、■虹
1554 (1976)記載の方法(その内容を参照と
じてこ−に取り入れる)に類似の方法を使用して、酵素
、例えばβ−ガラクトシグーゼまたはペルオキシダーゼ
を精製した抗体に結合することができる。特に好ましい
方法は栗山らのCancer I?es、 40;46
58(1980)であり、その内容を参照としてニーに
取り入れる。
、それはより良い定量値を与えるばかりでなく、定量の
感度を上昇する。所望ならば、酵素結合イムノアッセイ
に使用するため、加藤らのJ、 Tmmunol、■虹
1554 (1976)記載の方法(その内容を参照と
じてこ−に取り入れる)に類似の方法を使用して、酵素
、例えばβ−ガラクトシグーゼまたはペルオキシダーゼ
を精製した抗体に結合することができる。特に好ましい
方法は栗山らのCancer I?es、 40;46
58(1980)であり、その内容を参照としてニーに
取り入れる。
これら抗体は酵素定量のため水不溶性支持体上に結合す
ることが好ましい。多数のそのような支持体およびそれ
へタンパクを結合する方法はこの分野で良く知られ、そ
して無機およびを機支持体を含む。目下好ましいのは、
例えばAxen et alの米国特許第3,645,
852号が教えるように、それへ抗体を共有結合する前
にハロゲン化シアン、好ましくは臭化シアンで活性化す
ることのできる水不溶性支持体である。該特許を参照と
してこ\に取り入れる。このような支持体は市販されて
おり、例えばBio−Rad I、abiratori
esよりのEnzyraobeadsがある。
ることが好ましい。多数のそのような支持体およびそれ
へタンパクを結合する方法はこの分野で良く知られ、そ
して無機およびを機支持体を含む。目下好ましいのは、
例えばAxen et alの米国特許第3,645,
852号が教えるように、それへ抗体を共有結合する前
にハロゲン化シアン、好ましくは臭化シアンで活性化す
ることのできる水不溶性支持体である。該特許を参照と
してこ\に取り入れる。このような支持体は市販されて
おり、例えばBio−Rad I、abiratori
esよりのEnzyraobeadsがある。
さらに骨折りなしに、当業者はこれまでの説明を使用し
て、本発明をその全範囲にわたって使用することができ
るものと信じられる。以下の好ましい特定の具体例は、
そのため単に例示であり、開示の残部を少しも制限する
ものでないと解すべきである。以下の実施例において、
温度はことわりのない限り未補正の°Cであり、すべて
の部およびパーセントは重量による。
て、本発明をその全範囲にわたって使用することができ
るものと信じられる。以下の好ましい特定の具体例は、
そのため単に例示であり、開示の残部を少しも制限する
ものでないと解すべきである。以下の実施例において、
温度はことわりのない限り未補正の°Cであり、すべて
の部およびパーセントは重量による。
タンパク濃度は、標準としてウシ血清アルブミンを使用
し、J、Biol、 CherIl、 193 :26
5(1951)に記載のLowry et alの方法
によって測定した。酸性フォスファターゼ活性は、基質
としてα−ナフチルホスフェートを使用するBabso
nおよびPh1llips法で測定した。
し、J、Biol、 CherIl、 193 :26
5(1951)に記載のLowry et alの方法
によって測定した。酸性フォスファターゼ活性は、基質
としてα−ナフチルホスフェートを使用するBabso
nおよびPh1llips法で測定した。
免疫沈澱法は、B、 heeke、 5cand、J、
Imrsunol。
Imrsunol。
(SuppleIIlentl) 2:37−46(1
973)から改良した。ロケット−IEPはセルロース
アセテート膜上で、1、3 m M乳酸カルシウムおよ
び0,02%アジ化ナトリウムを含む。0.08 M
l−リス−0,024Mトリシン−0,024Mパルビ
タールナトリウム(TTB級衝液)中の0.83%アガ
ロース(Sigmalow electro−endo
−osmosis)を使用して実施した。
973)から改良した。ロケット−IEPはセルロース
アセテート膜上で、1、3 m M乳酸カルシウムおよ
び0,02%アジ化ナトリウムを含む。0.08 M
l−リス−0,024Mトリシン−0,024Mパルビ
タールナトリウム(TTB級衝液)中の0.83%アガ
ロース(Sigmalow electro−endo
−osmosis)を使用して実施した。
各種最終濃度(0,5−2,0%)において抗血清をプ
レートへ流す前に55゛Cでアガロース中へ加えた。ロ
ケット−JEPサンプルを円形くぼみ(5゜Omm)へ
入れ、そしてTTBランニングl1m液を用いて4°C
で一夜5ボルト/cmで電気泳動した。
レートへ流す前に55゛Cでアガロース中へ加えた。ロ
ケット−JEPサンプルを円形くぼみ(5゜Omm)へ
入れ、そしてTTBランニングl1m液を用いて4°C
で一夜5ボルト/cmで電気泳動した。
交差免疫電気集束は、ロケッl−−rEPと同様に、第
二の寸法で実施した。等集束したアクリルアミドゲル(
5X100mm)をJ、 Soderholm eta
l、、5candj、Immunol、(Supplm
enL 2)4:107−113(1975)から変法
した免疫電気泳動の前に、抗体−アガロース中へ成形し
た。第一寸法の等集束は、2%両性電解質を含む7.5
%ポリアクリルアミド中、p H範囲4−8,200ボ
ルトで一夜4 ”Cで実施した。いくつかの実験では等
集束したゲルは酢酸セルロース膜の上に置き、1%アガ
ロースでカバーした。埋め込んだアクリルアミドゲルに
接近したみぞを切り、平行なみぞの中へ入れた抗血清を
25°Cで24−48時間拡散することを許容し、そし
て得られる免疫沈降素を記録した。
二の寸法で実施した。等集束したアクリルアミドゲル(
5X100mm)をJ、 Soderholm eta
l、、5candj、Immunol、(Supplm
enL 2)4:107−113(1975)から変法
した免疫電気泳動の前に、抗体−アガロース中へ成形し
た。第一寸法の等集束は、2%両性電解質を含む7.5
%ポリアクリルアミド中、p H範囲4−8,200ボ
ルトで一夜4 ”Cで実施した。いくつかの実験では等
集束したゲルは酢酸セルロース膜の上に置き、1%アガ
ロースでカバーした。埋め込んだアクリルアミドゲルに
接近したみぞを切り、平行なみぞの中へ入れた抗血清を
25°Cで24−48時間拡散することを許容し、そし
て得られる免疫沈降素を記録した。
交差免疫電気泳動(交差−IEP)はロケット−IEP
と同様に第二の寸法で実施した。第一寸法の電気泳動は
1%アガロースで実施し、そしてサンプル(四角形くぼ
み中75μl)は15ボルト/ cn+で2時間4℃で
電気泳動した。移動をブロムフェノールブルー染料で監
視した。
と同様に第二の寸法で実施した。第一寸法の電気泳動は
1%アガロースで実施し、そしてサンプル(四角形くぼ
み中75μl)は15ボルト/ cn+で2時間4℃で
電気泳動した。移動をブロムフェノールブルー染料で監
視した。
使用した略号は以下のとおり。
PB−NaCI、0.15M NaCl 含量0,
05Mリン酸緩衝液pH7,2;IEP、免疫電気泳動
;TTB、0.3mM 乳酸カルシウムと0.02%
アジ化ナトリウム含有トリスートリシンーバルビタール
(0,08M、 0.042M、 0.024 M
)緩衝液;MR,相対電気泳動移動度;p11等電点;
m0w、 、分子量 実施例1 皿濁びl1■ ヒト前立腺組織(正常、良性肥大、ガン)および他のヒ
ト組織を剖検および外科手術中に得た。
05Mリン酸緩衝液pH7,2;IEP、免疫電気泳動
;TTB、0.3mM 乳酸カルシウムと0.02%
アジ化ナトリウム含有トリスートリシンーバルビタール
(0,08M、 0.042M、 0.024 M
)緩衝液;MR,相対電気泳動移動度;p11等電点;
m0w、 、分子量 実施例1 皿濁びl1■ ヒト前立腺組織(正常、良性肥大、ガン)および他のヒ
ト組織を剖検および外科手術中に得た。
各組織の組織学を病理学者によって確認した。約log
の組織をミンチし、生理食塩水30m1で3回洗い、そ
して0.02%(w/v)EDTAジナトリウム塩−0
,1Mリン酸緩衝食塩水(PBS)。
の組織をミンチし、生理食塩水30m1で3回洗い、そ
して0.02%(w/v)EDTAジナトリウム塩−0
,1Mリン酸緩衝食塩水(PBS)。
p H6,8と混合した。混合物を5orvall O
mnimixcrの氷水冷却混合室に入れ、そして間歇
的な冷却時間3分をもって羽根速度25,000rpm
で5分間ブレンドした。ホモジネートを4°Cで一夜か
きまぜ、そして25,000gで30分間遠心した。
mnimixcrの氷水冷却混合室に入れ、そして間歇
的な冷却時間3分をもって羽根速度25,000rpm
で5分間ブレンドした。ホモジネートを4°Cで一夜か
きまぜ、そして25,000gで30分間遠心した。
生成する上清は粒組織抽出液を構成した。
実施例2
U支分■
プールした前立腺組織100gを、前記のように300
mlのEDTA−PBSで抽出した。硫安(60g)
を粗抽出液285Idへ加え(35%飽和)、30分間
混合し、遠心(26,000g30分)した。得られた
上清295 mlへ硫安38gを加え(55%飽和)、
30分間混合し、遠心した。沈澱を55%飽和硫安溶液
へ分散し、遠心した。沈澱の洗浄を2回繰り返し、次に
沈澱を2Q mllのトリス−HCl緩衝液、pH8,
0へ溶解した。残りの硫安を42のトリス−HCl緩衝
液に対し48時間透析し、緩衝液を透析中1回取り替え
て除去した。透析した溶液は透析中止じた沈澱を除去す
るため46,000gで30分間遠心した。
mlのEDTA−PBSで抽出した。硫安(60g)
を粗抽出液285Idへ加え(35%飽和)、30分間
混合し、遠心(26,000g30分)した。得られた
上清295 mlへ硫安38gを加え(55%飽和)、
30分間混合し、遠心した。沈澱を55%飽和硫安溶液
へ分散し、遠心した。沈澱の洗浄を2回繰り返し、次に
沈澱を2Q mllのトリス−HCl緩衝液、pH8,
0へ溶解した。残りの硫安を42のトリス−HCl緩衝
液に対し48時間透析し、緩衝液を透析中1回取り替え
て除去した。透析した溶液は透析中止じた沈澱を除去す
るため46,000gで30分間遠心した。
実施例3
のイオン六 クロマトグラフィー
実施例2からの上清28m2を、あらかじめ0.OIM
I−リス−HCl緩衝液、p H8,0で平衡化したD
E A E −BioGel Aカラム(2,5X
93cm)に適用した。カラムを最初420 ttdl
の緩衝液で洗い、次にO−0,2M N a CI
6度勾配(ミキサー中0.OIMトリスーHCl緩衝
液、pH8,0゜If容器中0.2M NaCl
0.OIM トリス−HCl、pH8,0,If)を
もって6.5mfl/h r / c+aの流星におい
て溶出した。流出液を集め(10+yj!/分画)、そ
して前立腺抗原について監視した。各種のクロマトグラ
フィー分画中の前立腺抗原の存在の測定には、T、M、
Chu et al、 CancerTreat、 R
eports 61 :193(1977)の方法を
使用した。全操作は4 ’Cてだ行った。前立腺抗原含
有分画をプールし、そしてUM2限外口過膜を用いたア
ミコン濃縮器を用いて4.5 dに濃縮した。
I−リス−HCl緩衝液、p H8,0で平衡化したD
E A E −BioGel Aカラム(2,5X
93cm)に適用した。カラムを最初420 ttdl
の緩衝液で洗い、次にO−0,2M N a CI
6度勾配(ミキサー中0.OIMトリスーHCl緩衝
液、pH8,0゜If容器中0.2M NaCl
0.OIM トリス−HCl、pH8,0,If)を
もって6.5mfl/h r / c+aの流星におい
て溶出した。流出液を集め(10+yj!/分画)、そ
して前立腺抗原について監視した。各種のクロマトグラ
フィー分画中の前立腺抗原の存在の測定には、T、M、
Chu et al、 CancerTreat、 R
eports 61 :193(1977)の方法を
使用した。全操作は4 ’Cてだ行った。前立腺抗原含
有分画をプールし、そしてUM2限外口過膜を用いたア
ミコン濃縮器を用いて4.5 dに濃縮した。
実施例4
前立腺択互少ヱ止旦遇
濃縮溶液の一部<4.31d)をあらかじめ0.01M
トリス−HCl緩衝液、pH8,0で平衡化したセファ
デックスG−100カラム(2,5X110CIO)に
適用し、同じ緩衝液で3.5 rtti/ h r /
Cl1lの流量で溶出した。前立腺抗原を含有するプー
ルしたDAEA−BioGel A分画100−15
0は、セファデックスG−100クロマトグラフイーに
かけるとき、いくつかのタンパクピークに分割された。
トリス−HCl緩衝液、pH8,0で平衡化したセファ
デックスG−100カラム(2,5X110CIO)に
適用し、同じ緩衝液で3.5 rtti/ h r /
Cl1lの流量で溶出した。前立腺抗原を含有するプー
ルしたDAEA−BioGel A分画100−15
0は、セファデックスG−100クロマトグラフイーに
かけるとき、いくつかのタンパクピークに分割された。
前立腺抗原は分画46−56中に発見された。再び前立
腺抗原反応性を示す分画はプールされ、そして3.8
mlに濃縮された。
腺抗原反応性を示す分画はプールされ、そして3.8
mlに濃縮された。
実施例5
ゴ鬼 ・−7のそれp上の 、I+
前立腺抗原を含有する上の分画は、あらかじめトリス−
HClで平衡化されたセファデックスG−75カラム(
2,5X 113cm)上に適用され、該カラムは5.
5 mll h r /crlの流量で溶出された。
HClで平衡化されたセファデックスG−75カラム(
2,5X 113cm)上に適用され、該カラムは5.
5 mll h r /crlの流量で溶出された。
これは前立腺抗原反応性に関係する大きな対称タンパク
ピーク−つと、二つの小さいタンパクピークとを与えた
。前立腺抗原を含有する分画を同じカラムで再度クロマ
トグラフすると、同じ対称タンパクビークが得られ、そ
して小さいタンパクピークは消失した。α−ナフチルホ
スフェートを基質として使用し、Babson et
al、、Cl1n、 Chim。
ピーク−つと、二つの小さいタンパクピークとを与えた
。前立腺抗原を含有する分画を同じカラムで再度クロマ
トグラフすると、同じ対称タンパクビークが得られ、そ
して小さいタンパクピークは消失した。α−ナフチルホ
スフェートを基質として使用し、Babson et
al、、Cl1n、 Chim。
Acta 1と264−266(1966)の方法によ
って酸性フォスファターゼ活性を比色法および組織化学
的に測定した。このタンパクピークのクロマトグラフィ
ー分画には前立腺酸性フォスファターゼは検出されなか
った。
って酸性フォスファターゼ活性を比色法および組織化学
的に測定した。このタンパクピークのクロマトグラフィ
ー分画には前立腺酸性フォスファターゼは検出されなか
った。
実施例6
ポリアクリルアミド″〜゛
アクリルアミドゲル(7,5%)カラム(50×60園
)を会社の指示マニュアル(Shandon Sout
heInstruments、 Ltd、、Chamb
erley、 5urrey、 Englandに従っ
てjJl %し、50μlのサンプルョ垢?容液中タン
パク10−40dg)を各ゲルカラムへ適用した。次に
10%ショ糖溶液をサンプル溶液の上に注意深く層とし
て重ね、ゲルを含有するチューブの頂部へ0. 0 5
M )リス−グリシン緩衝液,pH8.5を重ねた。
)を会社の指示マニュアル(Shandon Sout
heInstruments、 Ltd、、Chamb
erley、 5urrey、 Englandに従っ
てjJl %し、50μlのサンプルョ垢?容液中タン
パク10−40dg)を各ゲルカラムへ適用した。次に
10%ショ糖溶液をサンプル溶液の上に注意深く層とし
て重ね、ゲルを含有するチューブの頂部へ0. 0 5
M )リス−グリシン緩衝液,pH8.5を重ねた。
トリス−グリシン緩衝液はショ糖溶液の調製に使用し、
また電解質として使用した。チューブ当り5mAの一定
電流をもって40分間電気泳動した後、ゲルをCoom
assiebrilliant blue G−250
−過塩素酸溶液をもってタンパクを染色した。
また電解質として使用した。チューブ当り5mAの一定
電流をもって40分間電気泳動した後、ゲルをCoom
assiebrilliant blue G−250
−過塩素酸溶液をもってタンパクを染色した。
実施例7
ドデシル ナトリウム SDS ポリアクリル、
S」」シΩ虹軌 この方法は実質上Weber and Osborn,
J.Biol。
S」」シΩ虹軌 この方法は実質上Weber and Osborn,
J.Biol。
Chen+. 皿4406(1969)の方法である。
250Iffi宛のSDSおよび2−メルカプトエタノ
ールを含む0.05 M )リス−HCl緩衝液、pH
8,5,50ml中のサンプル(クンバク1010−2
0ttを37℃で2時間インキュベートした。インキュ
ベート後、サンプルを同容積の50%ショ娠と混合し、
そして50μ!を、前に記載したようにポリアクリルア
ミドゲル(0,1%SDS含有)電気泳動にかけた。電
気泳動後、ゲルをエタノール−酢酸−水(45: lo
:45v/v)中の0.5%(w / v ) Coo
massie brilliar+L blue G−
250でタンパクを染色した。
ールを含む0.05 M )リス−HCl緩衝液、pH
8,5,50ml中のサンプル(クンバク1010−2
0ttを37℃で2時間インキュベートした。インキュ
ベート後、サンプルを同容積の50%ショ娠と混合し、
そして50μ!を、前に記載したようにポリアクリルア
ミドゲル(0,1%SDS含有)電気泳動にかけた。電
気泳動後、ゲルをエタノール−酢酸−水(45: lo
:45v/v)中の0.5%(w / v ) Coo
massie brilliar+L blue G−
250でタンパクを染色した。
実施例8
ポリアク1ルアミド゛ル″″
セファデックスG−75クロマトグラフイーは前立腺抗
原の免疫学的反応性を示す対称タンパクピークを生成し
たが、実施例6および7の分析的ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動はこの製剤中にいくつかのタンパク成分を明
らかGこした。従って調製的ポリアクリルアミド電気泳
動(PAGE)を前立腺抗原の精製にさらに用いた。
原の免疫学的反応性を示す対称タンパクピークを生成し
たが、実施例6および7の分析的ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動はこの製剤中にいくつかのタンパク成分を明
らかGこした。従って調製的ポリアクリルアミド電気泳
動(PAGE)を前立腺抗原の精製にさらに用いた。
標本1d(タンパク4.5■)を50%(W/V)シー
Iυ9溶液と混合し、そして環状の7.5%ゲルカラム
(ゲルの断面積4.4c+il、高さ9.2 cm )
に適用し、その後10%ショtJ! 2 dおよび0.
05 M l−リスーグ’) シンmj3V7rf7.
. p H8,5ヲl+lf(次ffiネタ。30m
Aの一定電流を最初1時間逆電し、その後80mAとし
た。トリス−グリシン緩衝液を14−15 ml/ h
r /cn!の流星のカラムの底に位置する溶出プレ
ートの中へ連続的にポンプ送りし、カラムから出る物質
を分画コレクター中へ運んだ。最終精製した製剤である
前立腺抗原を含有する分画をプールし、0.5 dへ濃
縮した。前立腺抗原は分画28−62 (電気泳動後4
−9時間の間に得られる溶離液)中に発見された。これ
らの分画をプールし、分析的ポリアクリルアミドゲル電
気泳動にかけるとき、多数のタンパクバンドがなお存在
した。しかしながら分ii!1i56−62(電気泳動
の8、1−9.2時間の間)のプールすることにより、
分析的ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびSDSポ
リアクリルアミド電気泳動において単一クンバクバンド
が得られた。
Iυ9溶液と混合し、そして環状の7.5%ゲルカラム
(ゲルの断面積4.4c+il、高さ9.2 cm )
に適用し、その後10%ショtJ! 2 dおよび0.
05 M l−リスーグ’) シンmj3V7rf7.
. p H8,5ヲl+lf(次ffiネタ。30m
Aの一定電流を最初1時間逆電し、その後80mAとし
た。トリス−グリシン緩衝液を14−15 ml/ h
r /cn!の流星のカラムの底に位置する溶出プレ
ートの中へ連続的にポンプ送りし、カラムから出る物質
を分画コレクター中へ運んだ。最終精製した製剤である
前立腺抗原を含有する分画をプールし、0.5 dへ濃
縮した。前立腺抗原は分画28−62 (電気泳動後4
−9時間の間に得られる溶離液)中に発見された。これ
らの分画をプールし、分析的ポリアクリルアミドゲル電
気泳動にかけるとき、多数のタンパクバンドがなお存在
した。しかしながら分ii!1i56−62(電気泳動
の8、1−9.2時間の間)のプールすることにより、
分析的ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびSDSポ
リアクリルアミド電気泳動において単一クンバクバンド
が得られた。
最終前立腺抗原製剤が純粋であることは、ドデシル硫酸
ナトリウムの存在および不存在下のポリアクリルアミド
ゲル電気泳動において夾雑タンパクがない単一のタンパ
クバンドによって指示された。精製した前立腺抗原は、
下単位成分なしで、セファデックスG−75ゲルロ適法
で33,000、そしてドデシル硫酸ナトリウムポリア
クリルアミドゲル電気泳動法で34,000の分子量を
持つことが示された。等集束法は等電点6.9を明らか
にした。
ナトリウムの存在および不存在下のポリアクリルアミド
ゲル電気泳動において夾雑タンパクがない単一のタンパ
クバンドによって指示された。精製した前立腺抗原は、
下単位成分なしで、セファデックスG−75ゲルロ適法
で33,000、そしてドデシル硫酸ナトリウムポリア
クリルアミドゲル電気泳動法で34,000の分子量を
持つことが示された。等集束法は等電点6.9を明らか
にした。
実施例9
)らの′″2、の ゛−夏法
前出実施例で報告したPAの精製操作は少なくとも2週
間か\す、そして前立腺組織100g当り精製P A
O,5mg以下を得る。さらに精製の最終工程のために
、ポリアクリルアミドゲルカラムの苦心を要する製作お
よび特別の電気泳動装置が必要であり、そU7て操作中
溶出路のつまりのような問題がしばしば発生する。この
n4易化された操作では、セファデックスG−75クロ
マトグラフィーおよび短かいDEAEカラムへの通用の
省略のほかに、退屈な調製的ゲル電気泳動は簡単なりE
AEカラムのpH勾配溶出によって置き換えられた。精
製したPAの収率は前立腺U織100g当り1ないし2
mgへ増加し、そして全体の操作は8ないし9日へ短縮
された。
間か\す、そして前立腺組織100g当り精製P A
O,5mg以下を得る。さらに精製の最終工程のために
、ポリアクリルアミドゲルカラムの苦心を要する製作お
よび特別の電気泳動装置が必要であり、そU7て操作中
溶出路のつまりのような問題がしばしば発生する。この
n4易化された操作では、セファデックスG−75クロ
マトグラフィーおよび短かいDEAEカラムへの通用の
省略のほかに、退屈な調製的ゲル電気泳動は簡単なりE
AEカラムのpH勾配溶出によって置き換えられた。精
製したPAの収率は前立腺U織100g当り1ないし2
mgへ増加し、そして全体の操作は8ないし9日へ短縮
された。
良性肥大前立腺組織(約100g>を、ホモジネートを
一夜でなくたった2時間かきまぜることを除いて実施例
I記載のようにEDTAジナトリウム−リン酸緩衝食塩
水で抽出した。粗抽出液を次に硫安(30ないし50%
飽和)による分画沈澱にかけた。沈澱を0.OIMl−
リス−HCl緩衝?(R,pH7,8のIOないし15
dに溶解し、同じ緩衝液4 mlに対し、緩衝液を一回
交換して48時間透析した。透析した物質を遠心しく4
6,000g、30分)、そして上清(12ないし18
mf)をあらかじめ0.OIM)リス−HCl緩衝液、
pH7,8で平衡化した2、 5 X l 5 cmの
DEA巳−BroGel Aカラムに通用した。カラ
ムを同じ緩衝液のj”7300 mlで洗い、続いて0
.08M NaCI−0,01Mトリス−HCl緩j
ji液、pH1,8で溶出した。PAを含有する分画を
プールし、濃縮しく5ないし5.5mN)、そしてあら
かじめO,OI Mトリス−f(CI緩衝液、pH1,
8で平衡化した2゜5X100cmセファデンクスG−
100カラムにJ川し、次に同じ緩衝液で5 ml/
h r /crlの流量において溶出した。PAを含有
する26,000ないし37,000の分子量域をカバ
ーする分画をプールし、濃縮しく5IIdり、そしてあ
らかじめ0、OIM)リス−HCI lfi衝液、pH
7,8で平衡化した2、 5 X 20co+D EA
巳カラムへ通用した。
一夜でなくたった2時間かきまぜることを除いて実施例
I記載のようにEDTAジナトリウム−リン酸緩衝食塩
水で抽出した。粗抽出液を次に硫安(30ないし50%
飽和)による分画沈澱にかけた。沈澱を0.OIMl−
リス−HCl緩衝?(R,pH7,8のIOないし15
dに溶解し、同じ緩衝液4 mlに対し、緩衝液を一回
交換して48時間透析した。透析した物質を遠心しく4
6,000g、30分)、そして上清(12ないし18
mf)をあらかじめ0.OIM)リス−HCl緩衝液、
pH7,8で平衡化した2、 5 X l 5 cmの
DEA巳−BroGel Aカラムに通用した。カラ
ムを同じ緩衝液のj”7300 mlで洗い、続いて0
.08M NaCI−0,01Mトリス−HCl緩j
ji液、pH1,8で溶出した。PAを含有する分画を
プールし、濃縮しく5ないし5.5mN)、そしてあら
かじめO,OI Mトリス−f(CI緩衝液、pH1,
8で平衡化した2゜5X100cmセファデンクスG−
100カラムにJ川し、次に同じ緩衝液で5 ml/
h r /crlの流量において溶出した。PAを含有
する26,000ないし37,000の分子量域をカバ
ーする分画をプールし、濃縮しく5IIdり、そしてあ
らかじめ0、OIM)リス−HCI lfi衝液、pH
7,8で平衡化した2、 5 X 20co+D EA
巳カラムへ通用した。
該カラムを同じ緩衝液10滅で洗い、pH勾配溶ン疫(
ミキサー:0.OIM)リス−HCl、p)r7゜0.
300d、容器:O,OIMl−リス−HCIpJ(6
,0,500IIIl)により、5 rrdl/ h
r /cnlの流量において溶出した。2番目のピーク
の分画がPAを含有し、それをプールし、:a縮した。
ミキサー:0.OIM)リス−HCl、p)r7゜0.
300d、容器:O,OIMl−リス−HCIpJ(6
,0,500IIIl)により、5 rrdl/ h
r /cnlの流量において溶出した。2番目のピーク
の分画がPAを含有し、それをプールし、:a縮した。
表1はこの簡略化操作による前立腺組織からのPAの典
型的精製の結果を要約する。硫安沈澱工犯ツマ七I+1
カ亦1+ M−1,N D^面菅泣八へ1.N99表(
ヘエグロビンのような夾雑タンパクの大量が除去され、
それによりPAのその後の精製を容易化した。この研究
に使用した放射状免疫拡散は、改変したMancini
eL at、 rmmunochem、 2:235
−254(1965)の方法であった。抗PA血清(1
00μ2)を1%アガロース溶液(0,154M N
aCl−0,017Mリン酸ナトリウム、pH7,0中
)lOij!と55°Cで混合し、ペトリ皿(直径8.
3 cm )中へ注いだ。次にアガロースゲル中にくぼ
み(直径2 cm )をつくり、各くぼみへサンプル1
0μlを加えた。
型的精製の結果を要約する。硫安沈澱工犯ツマ七I+1
カ亦1+ M−1,N D^面菅泣八へ1.N99表(
ヘエグロビンのような夾雑タンパクの大量が除去され、
それによりPAのその後の精製を容易化した。この研究
に使用した放射状免疫拡散は、改変したMancini
eL at、 rmmunochem、 2:235
−254(1965)の方法であった。抗PA血清(1
00μ2)を1%アガロース溶液(0,154M N
aCl−0,017Mリン酸ナトリウム、pH7,0中
)lOij!と55°Cで混合し、ペトリ皿(直径8.
3 cm )中へ注いだ。次にアガロースゲル中にくぼ
み(直径2 cm )をつくり、各くぼみへサンプル1
0μlを加えた。
クロマトグラフィー分画中のPAを監視するため、−夜
の拡散が沈降素を明らかにするためには充分であり、P
Aの定量には、拡散を48時間継続させ、次いでゲルを
0.154 M食塩水で2日間洗い、そしてCooma
ssie Bri目1antBlue G−250で染
色した。
の拡散が沈降素を明らかにするためには充分であり、P
Aの定量には、拡散を48時間継続させ、次いでゲルを
0.154 M食塩水で2日間洗い、そしてCooma
ssie Bri目1antBlue G−250で染
色した。
(以下余白)
表」ニー見」−口 七°からのn、の 1「工程
総体積 総17R9総”° 精製 回収率(ml )
(mg ) (mg ) 倍数 (%)
(a) 粗抽出液 258.0 1?54.4 20.6
1 100硫安 13.8 278.810.0
3.1 48.5(30−50χ) 1回目 DEAE 5.5 80.9 7.
9 8.3 38.3セフアゾ・ンクス 5.0
9.3 4.3 39.4 20.9G−10
0 2回目 DEAE 5.0 1.5 1.5
85.2 7.3(a) 良性肥大前立腺組織1
18gより実施例1O ン ゛からの一原の 11 抽出工程を省略し、そして第二工程においてPAを30
ないし75%飽和の濃度において硫安で沈澱したことを
除き、実施例9の操作によってPAを20m1の***漿
から精製した。結果を第2表に示す。
総体積 総17R9総”° 精製 回収率(ml )
(mg ) (mg ) 倍数 (%)
(a) 粗抽出液 258.0 1?54.4 20.6
1 100硫安 13.8 278.810.0
3.1 48.5(30−50χ) 1回目 DEAE 5.5 80.9 7.
9 8.3 38.3セフアゾ・ンクス 5.0
9.3 4.3 39.4 20.9G−10
0 2回目 DEAE 5.0 1.5 1.5
85.2 7.3(a) 良性肥大前立腺組織1
18gより実施例1O ン ゛からの一原の 11 抽出工程を省略し、そして第二工程においてPAを30
ないし75%飽和の濃度において硫安で沈澱したことを
除き、実施例9の操作によってPAを20m1の***漿
から精製した。結果を第2表に示す。
−2ヒト ン將か゛の11−原の −′1工程 総
体積 総夕″゛′ 総′° 精製 回収率(d )
(mg ) (mg ) 倍数 (%)精
液漿 16.2595.2 8.8 1 100硫安
20.0266.2 7.4 1.9 84.1(3
0−75χ) 1回目DEAE5.3 61.0 5.7 6
.3 64.8セフアデツクス6.4 12.8
4.5 23.8 511−100 2回目DEAE 4.5 1.5 1.5
67.6 17.0実施例11 光ヱ旦夾定 粗前立腺抽出液および抗原に陽性の患者の血清中の前立
腺抗原の大体の分子量を得るため、これらのサンプルを
セファデックスG−200ゲルロ過クロマトグラフイー
へかけた。ロケット−rEPによって前立腺抗原陽性を
もって示した血清サンプル(0,5td)、または前立
腺組繊抽出液(タンパク8 mgを含む0.5 ml
)をPB−NaC1中のセフアゾ・ンクスC−200ゲ
ルを充填したカラム(0,9X60cm)へ適用した。
体積 総夕″゛′ 総′° 精製 回収率(d )
(mg ) (mg ) 倍数 (%)精
液漿 16.2595.2 8.8 1 100硫安
20.0266.2 7.4 1.9 84.1(3
0−75χ) 1回目DEAE5.3 61.0 5.7 6
.3 64.8セフアデツクス6.4 12.8
4.5 23.8 511−100 2回目DEAE 4.5 1.5 1.5
67.6 17.0実施例11 光ヱ旦夾定 粗前立腺抽出液および抗原に陽性の患者の血清中の前立
腺抗原の大体の分子量を得るため、これらのサンプルを
セファデックスG−200ゲルロ過クロマトグラフイー
へかけた。ロケット−rEPによって前立腺抗原陽性を
もって示した血清サンプル(0,5td)、または前立
腺組繊抽出液(タンパク8 mgを含む0.5 ml
)をPB−NaC1中のセフアゾ・ンクスC−200ゲ
ルを充填したカラム(0,9X60cm)へ適用した。
溶出したサンプルを280nmにおける吸収について分
析し、そして前立腺抗原レベルをロケット−IEPによ
り、サンプルサイズ: 0.8 ml ; 溶出速度:
10m1/hr平衡化緩衝液:PB−NaC1(pH7
,2);分画サイズ: Q、 8mlを使用して測定し
た。前立腺組織抽出液中に示されたピークの抗原活性は
、30000−40,000分子量の間に溶出された。
析し、そして前立腺抗原レベルをロケット−IEPによ
り、サンプルサイズ: 0.8 ml ; 溶出速度:
10m1/hr平衡化緩衝液:PB−NaC1(pH7
,2);分画サイズ: Q、 8mlを使用して測定し
た。前立腺組織抽出液中に示されたピークの抗原活性は
、30000−40,000分子量の間に溶出された。
分子量参照マーカーは、ヒトイムノグロブリンG(16
0,000)、 ウシ血清アルブミン(68000)、
卵アルブミン(43,000)、 キモトリプシノーゲ
ンA(25,000)およびリボヌクレアーゼA(13
,700)を含んでいた。
0,000)、 ウシ血清アルブミン(68000)、
卵アルブミン(43,000)、 キモトリプシノーゲ
ンA(25,000)およびリボヌクレアーゼA(13
,700)を含んでいた。
ゲルロ適法で検討した抗原陽性患者血清においては、前
立腺抗原は80,000−100,000分子足の間に
単一の対称ピークとして溶出された実施例12 バ血盪勿袈遣 雌ウサギを前に記載したように、T、M、Chu et
al、、lnvestigative IJrolog
y 15:319−323(197B)の方法によって
、正常人前立腺組織の粗抽出液(抗血清P、のため)、
または上に記載したセファデンクスG−75工程で得ら
れた精製前立腺抗原(抗血清PITのため)をもって免
疫化した。血清を採集し、熱不活性化し、そして使用す
るまで一20゛Cで貯蔵した。正常雌血清(N F S
)または組織抽出液(タンパク10mg/yQ)によ
る抗血清の吸収をT、M、Chu et al、、Ca
ncer Treatment Reports61
: 193−200 (1977)記載のように実施し
た。
立腺抗原は80,000−100,000分子足の間に
単一の対称ピークとして溶出された実施例12 バ血盪勿袈遣 雌ウサギを前に記載したように、T、M、Chu et
al、、lnvestigative IJrolog
y 15:319−323(197B)の方法によって
、正常人前立腺組織の粗抽出液(抗血清P、のため)、
または上に記載したセファデンクスG−75工程で得ら
れた精製前立腺抗原(抗血清PITのため)をもって免
疫化した。血清を採集し、熱不活性化し、そして使用す
るまで一20゛Cで貯蔵した。正常雌血清(N F S
)または組織抽出液(タンパク10mg/yQ)によ
る抗血清の吸収をT、M、Chu et al、、Ca
ncer Treatment Reports61
: 193−200 (1977)記載のように実施し
た。
実施例13
に して上 せた ゛の
牲
免疫電気泳動を9.5 X 10.2 cmアガO−ス
(O。
(O。
65%、W/V)プレート上で実施した。バルビタール
緩衝液(pH8,2,イオン強度0.04 )を電解質
として用い、そして一定した90ボルトの電圧を1時間
通用した。電気泳動およびゲル拡散(20時間)の後、
プレートを0.154 M食塩水をもって2日間洗い、
そして最初酸性フォスファターゼに対して0.1 M酢
酸アンモニウム中のα−ナフチルホスフェートーfas
t garneL GBC塩溶液により、次にタンパク
についてCoomassaie brilliantb
lue G−250−過塩素酸溶液により染色した。
緩衝液(pH8,2,イオン強度0.04 )を電解質
として用い、そして一定した90ボルトの電圧を1時間
通用した。電気泳動およびゲル拡散(20時間)の後、
プレートを0.154 M食塩水をもって2日間洗い、
そして最初酸性フォスファターゼに対して0.1 M酢
酸アンモニウム中のα−ナフチルホスフェートーfas
t garneL GBC塩溶液により、次にタンパク
についてCoomassaie brilliantb
lue G−250−過塩素酸溶液により染色した。
正常な前立腺組織から調製した粗抽出液と、該正常前立
腺の粗抽出液に対して上昇させた抗血清、抗血清PIl
の免疫電気泳動は、3本の沈降素アークを生じた。これ
らのアークの一つは、該抗血清を正常雌血゛漬(NFS
−P@)で吸収した後は消失するので、正常なヒト血清
成分によって生成したものである。各種の正常なヒト組
織抽出液(尿道、ぼうこう、心臓、肺臓、すい臓、骨、
腎臓、腸、肝臓およびひ臓、各10−20111g/d
)により抗血清NFS−Pl+の吸収は、残りの2本の
沈降素アークの除去に失敗し、そのうちの一つは、それ
がα−ナフチルホスフェートfast garnet
GBC塩溶液によって染色されたので、前立腺酸性フォ
スファターゼであると同定された。他方の沈降素アーク
は酸性フォスファターゼ活性について染色されず、タン
パクであることが同定された前立腺)Jl繊織特異抗原
であることが示され、それはIEP分析においてβ−移
動度をもって移動した。正常ヒト前立腺の抽出液による
吸収は抗血清NFSPaから反応性の抗体を除去し、そ
して両方の沈降素アークを消失した。さらにこの抗原は
正常前立腺20検体中20すべてに示され、そして同じ
結果は良性肥大組織抽出液(15/15)およびガン性
前立腺組織抽出液(8/8)についても得られた。これ
らのデータは、正常、良性肥大およびガン性前立腺は、
前立腺酸性フォスファターゼのほかに、前立腺組織特異
性抗原を含有することを示した。
腺の粗抽出液に対して上昇させた抗血清、抗血清PIl
の免疫電気泳動は、3本の沈降素アークを生じた。これ
らのアークの一つは、該抗血清を正常雌血゛漬(NFS
−P@)で吸収した後は消失するので、正常なヒト血清
成分によって生成したものである。各種の正常なヒト組
織抽出液(尿道、ぼうこう、心臓、肺臓、すい臓、骨、
腎臓、腸、肝臓およびひ臓、各10−20111g/d
)により抗血清NFS−Pl+の吸収は、残りの2本の
沈降素アークの除去に失敗し、そのうちの一つは、それ
がα−ナフチルホスフェートfast garnet
GBC塩溶液によって染色されたので、前立腺酸性フォ
スファターゼであると同定された。他方の沈降素アーク
は酸性フォスファターゼ活性について染色されず、タン
パクであることが同定された前立腺)Jl繊織特異抗原
であることが示され、それはIEP分析においてβ−移
動度をもって移動した。正常ヒト前立腺の抽出液による
吸収は抗血清NFSPaから反応性の抗体を除去し、そ
して両方の沈降素アークを消失した。さらにこの抗原は
正常前立腺20検体中20すべてに示され、そして同じ
結果は良性肥大組織抽出液(15/15)およびガン性
前立腺組織抽出液(8/8)についても得られた。これ
らのデータは、正常、良性肥大およびガン性前立腺は、
前立腺酸性フォスファターゼのほかに、前立腺組織特異
性抗原を含有することを示した。
実施例14
した ) に して上 せた ゛の称異件
実施例11の操作に従って、前立腺酸性フォスファター
ゼを欠いている精製した前立腺抗原製剤に対し上界させ
た抗血清PI7を使用し、追加の確認が提供された。正
常な大人男性および女性血清で吸収した抗血清Pl’l
を使用するゲル拡fitおよび免疫電気泳動の両者は、
前立腺抗原の単一の免疫沈澱を生じた。前立腺以外の組
織から調製した抽出液は、正常な女性血清で吸収した抗
血清PI?と反応しなかった。
ゼを欠いている精製した前立腺抗原製剤に対し上界させ
た抗血清PI7を使用し、追加の確認が提供された。正
常な大人男性および女性血清で吸収した抗血清Pl’l
を使用するゲル拡fitおよび免疫電気泳動の両者は、
前立腺抗原の単一の免疫沈澱を生じた。前立腺以外の組
織から調製した抽出液は、正常な女性血清で吸収した抗
血清PI?と反応しなかった。
実施例I5
および ゛ ) の −血清起源抗原
が前立腺組織抽出液中に検出された抗原と免疫学的また
は生化学的特徴を共通にするかどうか決定するため、以
下の実験を実施した血清および前立腺組織抽出液のサン
プルを個々にそして両抗原ソースを合体直後にロケッ)
IEPにかけた。各実験において、サンプルは緩衝液希
釈を使用して同じ最終タンパク濃度に調節した。
が前立腺組織抽出液中に検出された抗原と免疫学的また
は生化学的特徴を共通にするかどうか決定するため、以
下の実験を実施した血清および前立腺組織抽出液のサン
プルを個々にそして両抗原ソースを合体直後にロケッ)
IEPにかけた。各実験において、サンプルは緩衝液希
釈を使用して同じ最終タンパク濃度に調節した。
典型的な実験は、患者の血清を収容する2個のサンプル
のくぼみ、前立腺組織抽出液を収容する2個のサンプル
のくぼみ、そしてピークの増強を示すための患者血清お
よび組織抽出液混合液を収容する2個のサンプルのくぼ
みを使用した。血清および組織抽出液は適当量の希釈用
緩衝液(PB−NaCI)の使用により同一最終タンパ
ク濃度であった。すべてのサンプルは25μ!で、0,
83%アガロース中抗体重%、5ボルト/cm、4″C
において2時間実施した。すべてのサンプルは個々に検
査するとき単一の免疫沈澱を生じた。ピーク増強実験に
おける混合サンプルは、個々のサンプルのそれよりも大
きい高さの単一の反応を生成した。抗原陽性血清サンプ
ルおよび前立腺組繊抽出液を混合し、そして直ちに交差
−rEPにかけるとき、融合した免疫沈澱ピークが生じ
た。ピーク増強および免疫沈澱融合を示す定量的免疫電
気泳動の二つの方法は、N、H,AxeIson et
al、 5cand。
のくぼみ、前立腺組織抽出液を収容する2個のサンプル
のくぼみ、そしてピークの増強を示すための患者血清お
よび組織抽出液混合液を収容する2個のサンプルのくぼ
みを使用した。血清および組織抽出液は適当量の希釈用
緩衝液(PB−NaCI)の使用により同一最終タンパ
ク濃度であった。すべてのサンプルは25μ!で、0,
83%アガロース中抗体重%、5ボルト/cm、4″C
において2時間実施した。すべてのサンプルは個々に検
査するとき単一の免疫沈澱を生じた。ピーク増強実験に
おける混合サンプルは、個々のサンプルのそれよりも大
きい高さの単一の反応を生成した。抗原陽性血清サンプ
ルおよび前立腺組繊抽出液を混合し、そして直ちに交差
−rEPにかけるとき、融合した免疫沈澱ピークが生じ
た。ピーク増強および免疫沈澱融合を示す定量的免疫電
気泳動の二つの方法は、N、H,AxeIson et
al、 5cand。
J、Immunol、 (Supplen+ent 1
)2:9l−94(1973)の方法により、それが組
織および血清中に存在するものとして、前立腺抗原の免
疫学的同一性を確認した。
)2:9l−94(1973)の方法により、それが組
織および血清中に存在するものとして、前立腺抗原の免
疫学的同一性を確認した。
組繊中に検出された前立腺抗血に関する結果は、正常、
良性肥大および悪性前立腺標本から調製した抽出液にも
当てはまり、前立腺抗原についてこれら抗原ソース間に
物理的相違(すなわちMR。
良性肥大および悪性前立腺標本から調製した抽出液にも
当てはまり、前立腺抗原についてこれら抗原ソース間に
物理的相違(すなわちMR。
pHまたはm、 w、 )は観察されず、そして良性お
よび悪性前立腺標本から調製した抽出液は、二重免疫拡
散法により抗前立豚抗原抗血清に対して試験するとき、
正常な前立腺と同一の免疫沈澱線を示すことを注意すべ
きである。ロケット−rEP(表3)によって測定する
とき、これら抗原ソース間に抗原レベルの統計学的に有
意差が認められず、そして抗原レベルの広い変動(計算
した大きい標準差によって指示される)が試験した各カ
テゴリーのMi織抽出液におこることが認められた。
よび悪性前立腺標本から調製した抽出液は、二重免疫拡
散法により抗前立豚抗原抗血清に対して試験するとき、
正常な前立腺と同一の免疫沈澱線を示すことを注意すべ
きである。ロケット−rEP(表3)によって測定する
とき、これら抗原ソース間に抗原レベルの統計学的に有
意差が認められず、そして抗原レベルの広い変動(計算
した大きい標準差によって指示される)が試験した各カ
テゴリーのMi織抽出液におこることが認められた。
a)
一ミ3 口11自 1ン の1立 −レベルb)
JlLJ比 触麗■色芹+S D。
正 常(4) 14.3単位 (±8.
7)C) 良性肥大(8) 18.4単位 (±21
.3)c) d) 一次力ルチノーマ(8) 13.0単位 (±1
3.8 )a)各組織抽出液はロケット免疫電気泳動に
よる前立原線抗原の分析前に、タンパクLmg//I1
1へ調節した。
7)C) 良性肥大(8) 18.4単位 (±21
.3)c) d) 一次力ルチノーマ(8) 13.0単位 (±1
3.8 )a)各組織抽出液はロケット免疫電気泳動に
よる前立原線抗原の分析前に、タンパクLmg//I1
1へ調節した。
b)すべての組織標本は組繊化学的に確認した。
C)この実験においては、参照前立腺抽出液の抗原レベ
ルの1%を表わすように1単位を任意に選定した。参照
抽出液は希釈系列で定量し、そして実験的抽出液として
同じプレート上で使用した。
ルの1%を表わすように1単位を任意に選定した。参照
抽出液は希釈系列で定量し、そして実験的抽出液として
同じプレート上で使用した。
d ) 5tudentのL−テストを使用して解析す
るとき、統計学的に有意差はこの群間て認められなかっ
た。
るとき、統計学的に有意差はこの群間て認められなかっ
た。
実施例17
および ゛ 1 の −前立腺酸性フ
ォスファターゼは前立腺組織および***中の両方に報告
されているので、われわれはPAが***中にも存在する
かどうかを決定することを意図した。前立腺組織から単
離したPAに対し上界させた抗PA血清を、前立腺組織
の粗抽出液と、そして***漿とに免疫拡散で反応させ、
前立腺組織中のPAと***葉中のそれとの免疫学的同一
性を指示する融合した線を形成した。
ォスファターゼは前立腺組織および***中の両方に報告
されているので、われわれはPAが***中にも存在する
かどうかを決定することを意図した。前立腺組織から単
離したPAに対し上界させた抗PA血清を、前立腺組織
の粗抽出液と、そして***漿とに免疫拡散で反応させ、
前立腺組織中のPAと***葉中のそれとの免疫学的同一
性を指示する融合した線を形成した。
前に記載した放射状免疫拡散操作により、***葉中のP
A濃度は0.4ないし1.8mg/mであることが認め
られ、他方前立膝組!81gは、EDTAジナトリウム
−リン酸緩衝食塩水(EDTA−PBS)で抽出し得る
PAを0.15ないし0.45 mg含存していた。
A濃度は0.4ないし1.8mg/mであることが認め
られ、他方前立膝組!81gは、EDTAジナトリウム
−リン酸緩衝食塩水(EDTA−PBS)で抽出し得る
PAを0.15ないし0.45 mg含存していた。
実施例I8
肛立腺違凰夏排撮学煎旦血止
前立腺中のPAの局在化およびPAの特異性は、11e
yderman and Neville、 J、 C
l1n、 Path、 30:138143(1977
)のイムノペルオキシダーゼが染色法によって検定され
た。新たに固定された前立腺組織の切片はキジロールの
2個交換によって脱パラフイン化され、エタノールの段
階系列によって再水和され、そして蒸留水で洗浄された
。7.5%H= 02による外因性ペルオキシダーゼの
阻害に続いて、抗PAの反応性をウサギ抗PA血清をせ
って評価した。インキュベーションおよび洗浄後、組繊
片をペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギT−グロブリン
でさらにインキユヘートした。過剰の酵素標識第2抗体
を次に洗浄により除去し、Ml織片をペルオキシダーゼ
活性について染色−した。対照として、基質単独、基質
プラス複合体、あらかじめ免疫したウサギ血清、および
あらかじめ特異抗原で吸収した抗PAを使用した。
yderman and Neville、 J、 C
l1n、 Path、 30:138143(1977
)のイムノペルオキシダーゼが染色法によって検定され
た。新たに固定された前立腺組織の切片はキジロールの
2個交換によって脱パラフイン化され、エタノールの段
階系列によって再水和され、そして蒸留水で洗浄された
。7.5%H= 02による外因性ペルオキシダーゼの
阻害に続いて、抗PAの反応性をウサギ抗PA血清をせ
って評価した。インキュベーションおよび洗浄後、組繊
片をペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギT−グロブリン
でさらにインキユヘートした。過剰の酵素標識第2抗体
を次に洗浄により除去し、Ml織片をペルオキシダーゼ
活性について染色−した。対照として、基質単独、基質
プラス複合体、あらかじめ免疫したウサギ血清、および
あらかじめ特異抗原で吸収した抗PAを使用した。
染色は前立腺管エレメントよりなる上皮細胞中に限られ
ることが認められた。強い染色はこれら細胞の頂端細胞
質に認められたが、しかし細胞核には染色が見られなか
った。いくつかの管エレメント中に、陽性に染色する物
質が検査した切片中に観察された。特異性染色は支質お
よび脈管エレメントを含む他の細胞エレメントには観察
されなかった。同じ手法を用い、PAはすい臓、結腸、
胃、肝臓、精のう、こう丸を含む他の臓’J5 Mi
taから得られた切片中には検出することができなかっ
た。同様な免疫組織化学的手法を用い、PAは試験した
すべての一次的および転移前立腺しゅ瘍には認められた
が、しかし非前立腺ガンMi繊中には認められなかった
。
ることが認められた。強い染色はこれら細胞の頂端細胞
質に認められたが、しかし細胞核には染色が見られなか
った。いくつかの管エレメント中に、陽性に染色する物
質が検査した切片中に観察された。特異性染色は支質お
よび脈管エレメントを含む他の細胞エレメントには観察
されなかった。同じ手法を用い、PAはすい臓、結腸、
胃、肝臓、精のう、こう丸を含む他の臓’J5 Mi
taから得られた切片中には検出することができなかっ
た。同様な免疫組織化学的手法を用い、PAは試験した
すべての一次的および転移前立腺しゅ瘍には認められた
が、しかし非前立腺ガンMi繊中には認められなかった
。
実施例19
れた の 1 ″ の悪性しゅ癌細胞
が長期間培養においてPAの表明を保有しているかどう
かを決定するため、3種の確立された前立腺細胞株(L
NCaP、PC3およびDu−145)をしらべた。こ
れらの細胞および他の非前立腺起源の培養細胞の抽出液
を1ngPA/mを検出することのできる前に述べた酵
素イムノアッセイ(EIA)法によってPAの存在につ
いて分析した。
が長期間培養においてPAの表明を保有しているかどう
かを決定するため、3種の確立された前立腺細胞株(L
NCaP、PC3およびDu−145)をしらべた。こ
れらの細胞および他の非前立腺起源の培養細胞の抽出液
を1ngPA/mを検出することのできる前に述べた酵
素イムノアッセイ(EIA)法によってPAの存在につ
いて分析した。
不動化面PAはCNB r−活性化セファローズl B
(Pharmacia Fine Chemical
s)を用いて調製した。反応混合物は5gのCNB r
−活性化セファローズおよび0.5M NaClを含
む0.1Mホウ酸緩衝液(pH8,5)中のIgG(抗
PA)130mgからなっていた。4°Cで18時間イ
ンキュベーション後、粒子をホウ酸緩衝液で洗い、そし
て未反応基をブロックするため1Mエタノールアミン溶
液(pH9,0)で後処理した。共有結合した粒子はさ
らに洗浄し、PBS中4°Cで貯蔵するEIAのため、
抗原サンプルの100μ2を50倍希釈不動化抗体の3
00ufと混合し、室温で3時間インキュベートした。
(Pharmacia Fine Chemical
s)を用いて調製した。反応混合物は5gのCNB r
−活性化セファローズおよび0.5M NaClを含
む0.1Mホウ酸緩衝液(pH8,5)中のIgG(抗
PA)130mgからなっていた。4°Cで18時間イ
ンキュベーション後、粒子をホウ酸緩衝液で洗い、そし
て未反応基をブロックするため1Mエタノールアミン溶
液(pH9,0)で後処理した。共有結合した粒子はさ
らに洗浄し、PBS中4°Cで貯蔵するEIAのため、
抗原サンプルの100μ2を50倍希釈不動化抗体の3
00ufと混合し、室温で3時間インキュベートした。
定量緩衝液(BSA1%含有PBS)1mjiを加えた
後、混合物を粒子の洗浄のため1.000gで遠心した
。この操作を2回繰り返した。洗浄した粒子へ定量緩衝
液中のペルオキシダーゼIgG(抗PA)複合体100
μlを加えた。さらに室温で18時間インキュベートし
た後、粒子を再び前述のように洗浄しそして存在する結
合ペルオキシダーゼ活性について定量した。反応混合物
は0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH6,0)中
ジアニシジン0.08%およびH20□0.003%を
含有し、そして粒子と90分間反応することを許された
。次に酵素反応をIN MCI 100μ!で止め
、そして403nmにおける吸収を測定した。各実験は
既知前立腺抗原濃度の標準液を含んでいた。この定量操
作を使用し、■ないし20ngPA/mlの間で投与量
応答曲線の平行性が得られた。再試験する前、高レベル
の抗原を含有するサンプルを定ff1il衝液で系列的
に希釈した。結果は前立腺ガンの2系統、LNCaPお
よびPC−3がDu−145および他の検査した細胞系
統中のそれ(4n g/ml以下)に比較して有意なP
Aレベル(50−700ng/Infl)を含有してい
ることを示した。PAは該抗原を産生ずる前立腺培養物
から誘導した調製した使用済培地にも存在した。
後、混合物を粒子の洗浄のため1.000gで遠心した
。この操作を2回繰り返した。洗浄した粒子へ定量緩衝
液中のペルオキシダーゼIgG(抗PA)複合体100
μlを加えた。さらに室温で18時間インキュベートし
た後、粒子を再び前述のように洗浄しそして存在する結
合ペルオキシダーゼ活性について定量した。反応混合物
は0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH6,0)中
ジアニシジン0.08%およびH20□0.003%を
含有し、そして粒子と90分間反応することを許された
。次に酵素反応をIN MCI 100μ!で止め
、そして403nmにおける吸収を測定した。各実験は
既知前立腺抗原濃度の標準液を含んでいた。この定量操
作を使用し、■ないし20ngPA/mlの間で投与量
応答曲線の平行性が得られた。再試験する前、高レベル
の抗原を含有するサンプルを定ff1il衝液で系列的
に希釈した。結果は前立腺ガンの2系統、LNCaPお
よびPC−3がDu−145および他の検査した細胞系
統中のそれ(4n g/ml以下)に比較して有意なP
Aレベル(50−700ng/Infl)を含有してい
ることを示した。PAは該抗原を産生ずる前立腺培養物
から誘導した調製した使用済培地にも存在した。
実施例20
グロブリン に する した
弾止
抗体特異性をさらに評価するため、われわれは培養した
細胞についてそれらの放射標識した抗体断片を特異性に
付着する能力を調べた。これらの実験には、前立腺(L
NCa P)、結腸(HT29)および胸(MCF−7
)から誘導された細胞が含まれていた。免疫グロブリン
断片のJ 型のため、rgc、抗PAおよびウサギのあ
らかじめ免疫した血清のサンプルを0.1 M酢酸ナト
リウム緩衝液(pH4,0)中に溶解した。[g050
mg毎に、結晶ペプシン1■を加え、そして反応混合物
を37°Cで一夜インキユベートした。F(ab’断片
をPBS緩衝液で平衡化した5ephacryl S−
3005−300(Far Fine Chemica
l)上のゲル口過により、未反応IgGおよび小さいペ
プチドから分離した。
細胞についてそれらの放射標識した抗体断片を特異性に
付着する能力を調べた。これらの実験には、前立腺(L
NCa P)、結腸(HT29)および胸(MCF−7
)から誘導された細胞が含まれていた。免疫グロブリン
断片のJ 型のため、rgc、抗PAおよびウサギのあ
らかじめ免疫した血清のサンプルを0.1 M酢酸ナト
リウム緩衝液(pH4,0)中に溶解した。[g050
mg毎に、結晶ペプシン1■を加え、そして反応混合物
を37°Cで一夜インキユベートした。F(ab’断片
をPBS緩衝液で平衡化した5ephacryl S−
3005−300(Far Fine Chemica
l)上のゲル口過により、未反応IgGおよび小さいペ
プチドから分離した。
カラム(2,6X 70cm)をIgG、BSAおよび
卵アルブミンからなる分子量標準品のクロマトグラフィ
ーによって較正した。単離したF(ab’)断片はAm
1con P M 10膜および陽圧を使用する限
外口過によって濃縮した。
卵アルブミンからなる分子量標準品のクロマトグラフィ
ーによって較正した。単離したF(ab’)断片はAm
1con P M 10膜および陽圧を使用する限
外口過によって濃縮した。
F(ab’)zUr片のトレース標準化は固相ラクトペ
ルオキシダーゼグルコースオキシダーゼ(εnzymo
beads、 Bio−Rad Laboratori
es)を使用して実施した。I mgのF (a b
’ ) 2へEnzymobeads50μ1.B−D
−グルコース1%、0.2Mリン酸ナトリウム(pH7
,0)200μ!、および担体不含有+317または”
J lmC1を加えた。
ルオキシダーゼグルコースオキシダーゼ(εnzymo
beads、 Bio−Rad Laboratori
es)を使用して実施した。I mgのF (a b
’ ) 2へEnzymobeads50μ1.B−D
−グルコース1%、0.2Mリン酸ナトリウム(pH7
,0)200μ!、および担体不含有+317または”
J lmC1を加えた。
反応は室温で30分間進行させた。未反応ヨー化物はセ
ファデックスG−25上のゲル口過により標識したタン
パクから分離した。トレース標識したF(ab”)2調
製物の比活性は0.6ないし0゜8μCi/μgの範囲
であった。
ファデックスG−25上のゲル口過により標識したタン
パクから分離した。トレース標識したF(ab”)2調
製物の比活性は0.6ないし0゜8μCi/μgの範囲
であった。
各くぼみが1.5XIO6の細胞を収容する24個のく
ぼみを有する培養皿に生育させた細胞を新しい培地中で
Izs(45識F(ab’)2(抗PA)およびLff
l l標識F(ab’)z(あらかじめ免疫)の対にな
った放射能標識混合物とインキュベートした。この混合
物は各核種について]、5XIO5cpmを含有し、そ
して標準条件下で一夜培養した付着する細胞と反応を許
された。放射性摂取を測定するため、細胞を(ぼみから
かき取り、各放射性核種についてPackard自動T
−シン自動−シゴンカウンターでカウントする前に、P
BS中で3回洗浄した。特定の放射性核種の優先的摂取
を局在比= (細胞結合12s[細胞結合+111)
、 (添加IZsJ添加1:1II)として計算し
た。各細胞タイプについて特定局在比を計算し、そして
結果はHT−29またはMCF−7細胞に対してよりも
LNCaPNCa上る著しく高い抗体摂取を示した。
ぼみを有する培養皿に生育させた細胞を新しい培地中で
Izs(45識F(ab’)2(抗PA)およびLff
l l標識F(ab’)z(あらかじめ免疫)の対にな
った放射能標識混合物とインキュベートした。この混合
物は各核種について]、5XIO5cpmを含有し、そ
して標準条件下で一夜培養した付着する細胞と反応を許
された。放射性摂取を測定するため、細胞を(ぼみから
かき取り、各放射性核種についてPackard自動T
−シン自動−シゴンカウンターでカウントする前に、P
BS中で3回洗浄した。特定の放射性核種の優先的摂取
を局在比= (細胞結合12s[細胞結合+111)
、 (添加IZsJ添加1:1II)として計算し
た。各細胞タイプについて特定局在比を計算し、そして
結果はHT−29またはMCF−7細胞に対してよりも
LNCaPNCa上る著しく高い抗体摂取を示した。
実施例21
し による 鬼 の
無毛マウスに悪性しゅ瘍細胞の外からの移植が確立した
ときに、LNCaPNCa上れら動物の循環系中に検出
し得るレヘルのPAを放出した。
ときに、LNCaPNCa上れら動物の循環系中に検出
し得るレヘルのPAを放出した。
n u / n u対立形質のため同形接合性の先天性
無町腺無毛マウスをRoswell Park Mem
orial In5tituteにおいて、BABL/
Cnu/nu同形接合性誰と、BALB/Ct/nu異
形接異形接合***配して繁殖させた。
無町腺無毛マウスをRoswell Park Mem
orial In5tituteにおいて、BABL/
Cnu/nu同形接合性誰と、BALB/Ct/nu異
形接異形接合***配して繁殖させた。
PA分析のため血清を得る前に、培養した細胞懸濁液を
注射することにより、ヒトしゅ瘍を無毛マウスに皮下的
に確立させた。このため細胞のPBSで洗浄し、生育性
をカウントし、そして0.9%無菌NaCl溶液中所望
濃度へ調節した。小形節形成後、無毛マウスの血清を後
眼球孔叢を切断することによって収集し、そして−20
゛Cで貯蔵した。ヒトしゅ瘍移植の確立に使用した細胞
培養Thハ、LNCaP(前立腺のアデノカルチノーマ
)RT−4(ぼうこうの移行性細胞カル千ノーマ)。
注射することにより、ヒトしゅ瘍を無毛マウスに皮下的
に確立させた。このため細胞のPBSで洗浄し、生育性
をカウントし、そして0.9%無菌NaCl溶液中所望
濃度へ調節した。小形節形成後、無毛マウスの血清を後
眼球孔叢を切断することによって収集し、そして−20
゛Cで貯蔵した。ヒトしゅ瘍移植の確立に使用した細胞
培養Thハ、LNCaP(前立腺のアデノカルチノーマ
)RT−4(ぼうこうの移行性細胞カル千ノーマ)。
Palarmo(悪性黒色しュ)、およびAsPC−1
(すい臓力ルチノーマ)を含んでいた。
(すい臓力ルチノーマ)を含んでいた。
調べたヒトしゅ瘍のうち、LNCaPNCa系統だけが
PAを循環系中に放出し、これは培養した細胞の定量か
ら得た結果と相関している。あらかじめRT−4$lJ
胞、Palarmo III胞、またはAsPC−1細
胞を移植された対照マウスはそれらの循環系中に検出し
得るPAを示さなかった。目下のところ血清抗原レベル
がしゅ瘍負荷と比例するかどうかは評価されていない。
PAを循環系中に放出し、これは培養した細胞の定量か
ら得た結果と相関している。あらかじめRT−4$lJ
胞、Palarmo III胞、またはAsPC−1細
胞を移植された対照マウスはそれらの循環系中に検出し
得るPAを示さなかった。目下のところ血清抗原レベル
がしゅ瘍負荷と比例するかどうかは評価されていない。
この現象はヒト外来移植により放出される乳酸デヒドロ
ゲナーゼ酵素について、ε、 J、 Pe5ce et
alによりCancer Res。
ゲナーゼ酵素について、ε、 J、 Pe5ce et
alによりCancer Res。
37 :1998−2003 (1977)に報告され
ている。もしそうであれば、ヒト前立腺しゅ瘍−無毛マ
ウス系は、PAの検出と組み合わせて抗しゅ癌治療法の
効果およびヒト前立腺ガンのための生物学的反応改変剤
の効果を監視するための価値ある臨床的モデルを提供す
る。
ている。もしそうであれば、ヒト前立腺しゅ瘍−無毛マ
ウス系は、PAの検出と組み合わせて抗しゅ癌治療法の
効果およびヒト前立腺ガンのための生物学的反応改変剤
の効果を監視するための価値ある臨床的モデルを提供す
る。
実施例22
扱査拵称異件
ロケッl−−I EP操作に必要な吸収された抗血清の
Q通濃度は、変化する濃度の抗前立腺抗原抗血清を含有
するゲル中における前立腺抗原の移動を調べることによ
って決定された。各種の組繊の反応性はロケッ)IEP
によって試験された。表4に示すように、正常な前立腺
、良性肥大および悪性前立腺組織から調製した抽出液は
反応性を示し、単一の免疫沈降反応を生成した。非前立
腺組織は、その性質が正常であろうと悪性であろうと、
免疫学的反応性を与えなかった。
Q通濃度は、変化する濃度の抗前立腺抗原抗血清を含有
するゲル中における前立腺抗原の移動を調べることによ
って決定された。各種の組繊の反応性はロケッ)IEP
によって試験された。表4に示すように、正常な前立腺
、良性肥大および悪性前立腺組織から調製した抽出液は
反応性を示し、単一の免疫沈降反応を生成した。非前立
腺組織は、その性質が正常であろうと悪性であろうと、
免疫学的反応性を与えなかった。
(a)
表4 修力計P瀝1創V聾ユl」訃1点」lL r
’ ”’−”門i■肝臓 正常 0(0/2)
O(0/1)ひ臓 正常 Q(0/I)
0(0/l)肺 正常 0(0/1) O(0
/1)アデノカルチノーマ 0(0/1) 0(
0/1)骨髄 正常 0(0/1) ぼうこう 正 常 0(0/l) O
(0/1)胸 正常 0(Q/1) アデノカルチノーマ 0 (015) 腸 正常 0(0/1) O(0/1)アデノ
カルチノーマ O(0/1) O(0/l)心臓
正常 0(0/1) O(0/1)すい臓 ア
デノカルチノーマ 0(0/2) 0(0/I)
腎臓 正常 0(0/1) 0(0/1)脳皮質
正 常 0(0/1) O(0/
1)前立腺 正 常 100(4/4)
100(20/20)良性肥大 100(8/
8) 100(15/15)アデノカルチノーマ1
00(8/8) 100(8/8)a)すべての組
織抽出物は分析物10mgタンパク/ allへ調節し
た。
’ ”’−”門i■肝臓 正常 0(0/2)
O(0/1)ひ臓 正常 Q(0/I)
0(0/l)肺 正常 0(0/1) O(0
/1)アデノカルチノーマ 0(0/1) 0(
0/1)骨髄 正常 0(0/1) ぼうこう 正 常 0(0/l) O
(0/1)胸 正常 0(Q/1) アデノカルチノーマ 0 (015) 腸 正常 0(0/1) O(0/1)アデノ
カルチノーマ O(0/1) O(0/l)心臓
正常 0(0/1) O(0/1)すい臓 ア
デノカルチノーマ 0(0/2) 0(0/I)
腎臓 正常 0(0/1) 0(0/1)脳皮質
正 常 0(0/1) O(0/
1)前立腺 正 常 100(4/4)
100(20/20)良性肥大 100(8/
8) 100(15/15)アデノカルチノーマ1
00(8/8) 100(8/8)a)すべての組
織抽出物は分析物10mgタンパク/ allへ調節し
た。
実施例23
葭販肚異立
前立腺抗原の可能性さる診断的価値を調べるため、正常
血漿タンパクに対する抗体を除去するため正常なヒト血
漿で処理した抗前立腺抗原抗血清を使用し、ロケッ)−
I EP法によりその存在について血清サンプルを調べ
た(表5)。55才以上の正常な大人健康人20人と女
性ボランティア20人から得た血清サンプルは、この分
析において抗血清に対して反応性を示さなかった。また
、肺、結腸、直腸、胃、すい臓、甲状腺、胸の悪性しゅ
瘍および骨髄しゅを持った患者を含む各種の進行した悪
性しゅ瘍を持った全部で175人の患者から血清を採取
した。非前立腺悪性しゅ傷を持つ患者から得られた血清
のすべては、ロケ・ンFIEP法によって定量するとき
前立腺抗原陰性であった。しかしながら進行した前立腺
ガン患者からの検査した血清全部で219検体のうち、
17すなわち8%が循環系中に前立腺抗原の存在を示し
た。前立腺抗原陽性反応を示すすべての血清はその後同
じ定量法にかけ、そしてこの試験の再現性は100%で
あった。
血漿タンパクに対する抗体を除去するため正常なヒト血
漿で処理した抗前立腺抗原抗血清を使用し、ロケッ)−
I EP法によりその存在について血清サンプルを調べ
た(表5)。55才以上の正常な大人健康人20人と女
性ボランティア20人から得た血清サンプルは、この分
析において抗血清に対して反応性を示さなかった。また
、肺、結腸、直腸、胃、すい臓、甲状腺、胸の悪性しゅ
瘍および骨髄しゅを持った患者を含む各種の進行した悪
性しゅ瘍を持った全部で175人の患者から血清を採取
した。非前立腺悪性しゅ傷を持つ患者から得られた血清
のすべては、ロケ・ンFIEP法によって定量するとき
前立腺抗原陰性であった。しかしながら進行した前立腺
ガン患者からの検査した血清全部で219検体のうち、
17すなわち8%が循環系中に前立腺抗原の存在を示し
た。前立腺抗原陽性反応を示すすべての血清はその後同
じ定量法にかけ、そしてこの試験の再現性は100%で
あった。
a)
7°赫十m骨組訂…購1
・゛ 1 −■性反疫%−−正常な大
人(男性および女性) 0 (0/20)年令およ
び性別の一致した対称 0 (0/20)進行したガ
ン患者 肺カルチノーマ 0 (0/83)
甲状腺力ルチノーマ O(0/1)結腸−
直腸力ルチノーマ O(0/22)胃−すい臓
力ルチノーマ O(0/3/l)胸カルチノー
マ O(0/33)骨髄しゅ
O(0/2)前立腺力ルチノーマ
8(17/219)a)すべての血清は
部分標本とし、必要時まで一20°Cまたは一70°C
で貯蔵した。すべての実験にサンプル量25μlを用い
た。
人(男性および女性) 0 (0/20)年令およ
び性別の一致した対称 0 (0/20)進行したガ
ン患者 肺カルチノーマ 0 (0/83)
甲状腺力ルチノーマ O(0/1)結腸−
直腸力ルチノーマ O(0/22)胃−すい臓
力ルチノーマ O(0/3/l)胸カルチノー
マ O(0/33)骨髄しゅ
O(0/2)前立腺力ルチノーマ
8(17/219)a)すべての血清は
部分標本とし、必要時まで一20°Cまたは一70°C
で貯蔵した。すべての実験にサンプル量25μlを用い
た。
b)すべての場合病理学的に確認した。
実施例24
リンクイムノアンセイー
精製した前立腺特異抗原に対する■gC抗体、ワサビペ
ルオキシダーゼおよびCNB r活性化セファローズ4
Bを試薬として用い、前立腺抗原O1lng/l1r1
を検出することできるサンドインチ型(セファローズ4
B−抗前立腺抗原rgc:前立腺抗原:抗前立腺抗原f
gG−ペルオキシダーゼ)酵素リンクイムノアッセイを
検討した。調べた各種の正常および悪性しゅ瘍組織のう
ち、ヒト前立線Ml織だけが前立腺抗原を含有すること
を示した(正常前立腺IO±21.9μ2前立腺抗原/
mgタンパク、n=6;良性肥大18:3±29.5.
n=I2;ガン性前立腺19.1±15.3.n=13
)前立腺抗原の循環レベルを同じ定量法で定量したが正
常な女性(n=17)および女性ガン患者(n=25)
からの血清中には前立腺抗原が検出できなかった。その
ほかの結果(ng/d)は表6に示す。
ルオキシダーゼおよびCNB r活性化セファローズ4
Bを試薬として用い、前立腺抗原O1lng/l1r1
を検出することできるサンドインチ型(セファローズ4
B−抗前立腺抗原rgc:前立腺抗原:抗前立腺抗原f
gG−ペルオキシダーゼ)酵素リンクイムノアッセイを
検討した。調べた各種の正常および悪性しゅ瘍組織のう
ち、ヒト前立線Ml織だけが前立腺抗原を含有すること
を示した(正常前立腺IO±21.9μ2前立腺抗原/
mgタンパク、n=6;良性肥大18:3±29.5.
n=I2;ガン性前立腺19.1±15.3.n=13
)前立腺抗原の循環レベルを同じ定量法で定量したが正
常な女性(n=17)および女性ガン患者(n=25)
からの血清中には前立腺抗原が検出できなかった。その
ほかの結果(ng/d)は表6に示す。
表6 酵素リンクィムノアンセイ結果
工群ユ −王且−S、 D、 −1皿−ユ α2.3
゜正常女性 0.47 0.66 0.1−2.6
51 2非前立719! 0.52 0.6
2 0.1−3.0 92 3ガン女性 前立腺ガン 段階A 8.00 5.64 2.8−14
3 3段階B ?、15 3.05 46−1
1 4 4段1tl 10.52 17.0
6 0.3−100 44 31段段階 22.8
4 30.97 0.2−270 250 193N
、S。
゜正常女性 0.47 0.66 0.1−2.6
51 2非前立719! 0.52 0.6
2 0.1−3.0 92 3ガン女性 前立腺ガン 段階A 8.00 5.64 2.8−14
3 3段階B ?、15 3.05 46−1
1 4 4段1tl 10.52 17.0
6 0.3−100 44 31段段階 22.8
4 30.97 0.2−270 250 193N
、S。
0.02
o、ooi
O,001
0,001
(P対正常女性は5tudent tテストによる。N
、S=有意でない。) 前立腺ガン患者の血清からの前立腺抗原は精製し、そし
て正常な前立腺組繊からの前立腺抗原と免疫学的に同一
であることを示した。従ってこのデータは、正常前立腺
の組織タイプ特異性抗原であるけれども、こ−に記載す
る前立腺抗原は前立腺ガンの免疫学的検出に使用できる
ことを示している。
、S=有意でない。) 前立腺ガン患者の血清からの前立腺抗原は精製し、そし
て正常な前立腺組繊からの前立腺抗原と免疫学的に同一
であることを示した。従ってこのデータは、正常前立腺
の組織タイプ特異性抗原であるけれども、こ−に記載す
る前立腺抗原は前立腺ガンの免疫学的検出に使用できる
ことを示している。
実施例25
リンクイムノア セイー の
Cancer Res、40:4658(1980)に
報告された感受性酵素イムノアッセイ法を用いて、前立
腺ガン患者の循環しているPAを臨床的に評価した。病
気の進行した段階(D2)にありそして化学療法を受け
ている96人の患者には、患者の生存に関して前処理血
清PAレベルは予後価値があることが見出された。12
ケ月以上住存した患者(n=IQ)は血清PAレベル1
1.2ng/m1±12.7(平均±S、 D、 )
を有し、5ケ月以内に死亡した患者(n=59)は血清
pF(レベル28.5±31.9を示し、6−11ケ月
生存した患者には13.7±18.2のレベルが認めら
れた。これらの患者のうち19人を6ケ月以上220の
系列的FA定量により監視し、そしてPAレベルと臨床
的経過との間の臨床病理学的相関関係が14人の患者(
74%)に見られた。さらに前立腺ガンを局所化する治
療法を受けている32人の患者の別のグループでは、1
61の血清サンプルを12ないし114週(平均56週
)の期間中に分析した。これら患者のうち、5人は予後
期間中転移を発生し、そして全員病気再発の臨床的診断
の0−68週前に上昇した血清PA値を示すことが判明
した。これら結果は、PAが前立腺ガンの監視のための
有用な新いしマーカーであることを示す。
報告された感受性酵素イムノアッセイ法を用いて、前立
腺ガン患者の循環しているPAを臨床的に評価した。病
気の進行した段階(D2)にありそして化学療法を受け
ている96人の患者には、患者の生存に関して前処理血
清PAレベルは予後価値があることが見出された。12
ケ月以上住存した患者(n=IQ)は血清PAレベル1
1.2ng/m1±12.7(平均±S、 D、 )
を有し、5ケ月以内に死亡した患者(n=59)は血清
pF(レベル28.5±31.9を示し、6−11ケ月
生存した患者には13.7±18.2のレベルが認めら
れた。これらの患者のうち19人を6ケ月以上220の
系列的FA定量により監視し、そしてPAレベルと臨床
的経過との間の臨床病理学的相関関係が14人の患者(
74%)に見られた。さらに前立腺ガンを局所化する治
療法を受けている32人の患者の別のグループでは、1
61の血清サンプルを12ないし114週(平均56週
)の期間中に分析した。これら患者のうち、5人は予後
期間中転移を発生し、そして全員病気再発の臨床的診断
の0−68週前に上昇した血清PA値を示すことが判明
した。これら結果は、PAが前立腺ガンの監視のための
有用な新いしマーカーであることを示す。
実施例26
ハイブリドーマ の
J、 rmmunol、 皿1548−1550(19
79)に記載のBa1b/c起源の非分泌性骨髄しゅ細
胞系統を使用した。この系統P3x63Ag8.653
は、P3x63Ag8生産γ−IKタイプがら誘導され
る。
79)に記載のBa1b/c起源の非分泌性骨髄しゅ細
胞系統を使用した。この系統P3x63Ag8.653
は、P3x63Ag8生産γ−IKタイプがら誘導され
る。
P3X63Ag8.653細胞を15%熱不活性化胎児
ウシ血清(FBS)、2mMグルタミン、100 U/
mlペニシリン、およびI OOU/mlストレプトマ
イシンを含有するDulbeccoの改良したEagl
e培地(DMEM)中、10%CO2/空気調湿インキ
ュベーター内で37′cで保った。
ウシ血清(FBS)、2mMグルタミン、100 U/
mlペニシリン、およびI OOU/mlストレプトマ
イシンを含有するDulbeccoの改良したEagl
e培地(DMEM)中、10%CO2/空気調湿インキ
ュベーター内で37′cで保った。
雌Bblb/cマウス(8−10退会)に、前立腺抗原
(PA)をInvestgative Urology
17:159−163(1979)記載のように精製
したものを10μg1日目に腹腔的注射した。3ないし
6週間後、マウスは無菌食塩水中10μgのPAの静注
を受けた。
(PA)をInvestgative Urology
17:159−163(1979)記載のように精製
したものを10μg1日目に腹腔的注射した。3ないし
6週間後、マウスは無菌食塩水中10μgのPAの静注
を受けた。
融合実験に使用したすべてのマウスは、精製したPAに
対する二重免疫拡散法を使用して検出するとき、PAに
対する血清抗体の存在を示した。
対する二重免疫拡散法を使用して検出するとき、PAに
対する血清抗体の存在を示した。
最後の免疫化後、免疫マウスから無菌的にひ臓を除去し
、DMEM−15%FBSIO+d!中に入れ、そして
カーブしたかん子ですり潰すことにより細胞懸澗液をつ
くった。凝集塊および膜断片を沈降させ、そして得られ
た単細胞を600g、10分間の遠心によって1回洗っ
た。赤血球は0.84%NH,CIでインキュベートす
ることにより溶かし、そして細胞を洗浄し、D M E
M中2X10’細胞/−0の濃度で再懸濁した。骨髄
しゅ細胞は同(pに洗浄し、そしてDMEM中2X10
7細胞/mlに調節した。ひ臓細胞3 mflを骨髄し
ゅ細胞3 mlへ加え、そして600gT:10分間共
粒状化し、そして培地を完全に除去した。融合のため、
細胞をゆっくりDMEM中30%(W/V)のポリエチ
レングリコール(PEC;)、平均分子量1 、000
の1 rtrfl中Gこp H8,0で再懸濁した。試
験管を1分間ゆすり、そして600gで6分間遠心した
。PEGへの全露出時間8分の後、上清を除き、そして
DMEMLOmlを試験管を連続的に円形にがきまぜな
がらゆっくり加えた。細胞を次に600gにおいて10
分間遠心し、HAT選別培地(DMEM−]、]6X1
0−’MチミジンlXl0−’Mヒボキサンチン、およ
びI X 10−’Mアミノプテリン含含有1亢 した。1ml量を多数くぼみ皿に48くぼみ中に分注し
、そしてプレートを空気中lO%CO2の湿った雰囲気
中で37°Cでインキュベートした。ヒポキサンチン/
チミジン(HT)培地を添加する21日目まだ4日毎に
HAT培地を補充した。くぼみが酸性になるとき(通常
融合後8−12日)。
、DMEM−15%FBSIO+d!中に入れ、そして
カーブしたかん子ですり潰すことにより細胞懸澗液をつ
くった。凝集塊および膜断片を沈降させ、そして得られ
た単細胞を600g、10分間の遠心によって1回洗っ
た。赤血球は0.84%NH,CIでインキュベートす
ることにより溶かし、そして細胞を洗浄し、D M E
M中2X10’細胞/−0の濃度で再懸濁した。骨髄
しゅ細胞は同(pに洗浄し、そしてDMEM中2X10
7細胞/mlに調節した。ひ臓細胞3 mflを骨髄し
ゅ細胞3 mlへ加え、そして600gT:10分間共
粒状化し、そして培地を完全に除去した。融合のため、
細胞をゆっくりDMEM中30%(W/V)のポリエチ
レングリコール(PEC;)、平均分子量1 、000
の1 rtrfl中Gこp H8,0で再懸濁した。試
験管を1分間ゆすり、そして600gで6分間遠心した
。PEGへの全露出時間8分の後、上清を除き、そして
DMEMLOmlを試験管を連続的に円形にがきまぜな
がらゆっくり加えた。細胞を次に600gにおいて10
分間遠心し、HAT選別培地(DMEM−]、]6X1
0−’MチミジンlXl0−’Mヒボキサンチン、およ
びI X 10−’Mアミノプテリン含含有1亢 した。1ml量を多数くぼみ皿に48くぼみ中に分注し
、そしてプレートを空気中lO%CO2の湿った雰囲気
中で37°Cでインキュベートした。ヒポキサンチン/
チミジン(HT)培地を添加する21日目まだ4日毎に
HAT培地を補充した。くぼみが酸性になるとき(通常
融合後8−12日)。
上清を抗体活性について試験した。陽性抗体反応を示し
たくぼみからの交雑細胞のサンプルを希釈を制限するこ
とによりクローンし、そして同じくぼみからのいくらか
の細胞を2XIO−’細胞が得られたまで25c+11
のMi職培養フラスコへ移し、それを液体窒素中10%
ジメチルスルホキシド−90%FBS中に凍結した。
たくぼみからの交雑細胞のサンプルを希釈を制限するこ
とによりクローンし、そして同じくぼみからのいくらか
の細胞を2XIO−’細胞が得られたまで25c+11
のMi職培養フラスコへ移し、それを液体窒素中10%
ジメチルスルホキシド−90%FBS中に凍結した。
実施令27
、へ4 7’ IJ )’ニ1111b1則融合上清を
抗PA抗体について固相酵素イムノアッセイによってス
クリーンした。使い捨て96くぼみマイクロタイタープ
レートを固相吸収表面として使用した。くぼみをポリー
Lーリジンスクシ茅−ト(0. 2 5 mg/m1H
zo ) 1 0 0 mlでみたし、23゛Cで1
5分間インキュベートした。PB−NaCl,pH7。
抗PA抗体について固相酵素イムノアッセイによってス
クリーンした。使い捨て96くぼみマイクロタイタープ
レートを固相吸収表面として使用した。くぼみをポリー
Lーリジンスクシ茅−ト(0. 2 5 mg/m1H
zo ) 1 0 0 mlでみたし、23゛Cで1
5分間インキュベートした。PB−NaCl,pH7。
2(50mMリン酸ナトリウム:140mM塩化ナトリ
ウム)で3回洗った後精製したPAloomlをl0m
M炭酸塩緩衝液。
ウム)で3回洗った後精製したPAloomlをl0m
M炭酸塩緩衝液。
p H 9. 6中50μg / tdの濃度で加えた
。37°Cで24時間インキュベーション後、PBNa
C暖衝液中1%( w / v )のウシ血清アルブミ
ン溶液を37゛Cでさらに3時間で加えた。
。37°Cで24時間インキュベーション後、PBNa
C暖衝液中1%( w / v )のウシ血清アルブミ
ン溶液を37゛Cでさらに3時間で加えた。
抗体スクリーニングアッセイを実施する前に、マイクロ
タイターくぼみをPB−NaCI緩衝液(200μ2)
を用いて3回洗った。試験すべき培養物液(100μり
を個々のくぼみへ加え、そして37°Cで3時間インキ
ュベートし、その後PB−NaCI緩衝液で3回洗った
。その後でJ. Immunol.門Hhods 1釘
305−310(1977)に記載の方法によって調製
したペルオキシダーゼを結合したマウスIgに対する抗
血清100μlを各くぼみへ加え、そして37゛Cで3
時間インキュベートした。PB−NaCIで3回洗った
後、0−ジアニシジン0.08%:H20□O. O
O 3%ニリン酸ナトリウム0.01Mを含有する5’
l溶液,pH6。
タイターくぼみをPB−NaCI緩衝液(200μ2)
を用いて3回洗った。試験すべき培養物液(100μり
を個々のくぼみへ加え、そして37°Cで3時間インキ
ュベートし、その後PB−NaCI緩衝液で3回洗った
。その後でJ. Immunol.門Hhods 1釘
305−310(1977)に記載の方法によって調製
したペルオキシダーゼを結合したマウスIgに対する抗
血清100μlを各くぼみへ加え、そして37゛Cで3
時間インキュベートした。PB−NaCIで3回洗った
後、0−ジアニシジン0.08%:H20□O. O
O 3%ニリン酸ナトリウム0.01Mを含有する5’
l溶液,pH6。
0を使用して酵素活性を測定した。酵素反応はIN
MCI 25ulを使用して23°Cで60分後に停
止した。
MCI 25ulを使用して23°Cで60分後に停
止した。
各定量において、陽性対照サンプルが含まれ、そして精
製PAに対して上昇させた系列的に希釈した高免疫マウ
ス血清からなっていた。P3×63Ag8培養物(rl
−ガッパ)および非経口非分泌性骨髄しゅ系統からの組
繊培養上清を陰性対照として用いた。このスクリーニン
グ定量は[gG.IgMおよびIgAクラスの免疫グロ
ブリンを検出する。
製PAに対して上昇させた系列的に希釈した高免疫マウ
ス血清からなっていた。P3×63Ag8培養物(rl
−ガッパ)および非経口非分泌性骨髄しゅ系統からの組
繊培養上清を陰性対照として用いた。このスクリーニン
グ定量は[gG.IgMおよびIgAクラスの免疫グロ
ブリンを検出する。
実施令28
ハイプリードマ のクローニング
所望の骨髄しゅ交雑株をクローニング効率を上昇するた
め腹腔大食細胞の存在下、希釈を制限することによりク
ローンした。交雑細胞を96くぼみ培養皿に、DMEM
−15%FBS完全培地中0.5細胞/くぼみの密度で
プレートした。8−12日後激しい発育が観察され、そ
のとき上清を単一コロニーを示すくぼみから試験した。
め腹腔大食細胞の存在下、希釈を制限することによりク
ローンした。交雑細胞を96くぼみ培養皿に、DMEM
−15%FBS完全培地中0.5細胞/くぼみの密度で
プレートした。8−12日後激しい発育が観察され、そ
のとき上清を単一コロニーを示すくぼみから試験した。
抗体活性を示す培養物をこの方法で集団均一性を確かめ
るために再クローンした。
るために再クローンした。
腹腔大食細胞は、Ba1b/Cマウスの腹腔を水冷した
無菌0.34 Mショ糖5 mlで洗い流すことによっ
て調製した。大食細胞の高収率(5−15X10’/マ
ウス)を得るため、動物は細胞採取4日前に無菌チオグ
リコレート培地0.5 mの腹腔的注射を受けた。大食
細胞は600gで5分間遠心することによって1回洗浄
され、そして組織培養培地中に10”/dで再懸濁され
た。各IJIta培養くぼみは大食細胞懸濁液100μ
2を受けた。こ\に記載したハイブリドーは、アメリカ
合衆国メリーランド州20850、ロックビルのアメリ
カン、タイプ、カルチャー、コレクションに寄託され、
そしてATCCNo、I(B2O21と命名された。
無菌0.34 Mショ糖5 mlで洗い流すことによっ
て調製した。大食細胞の高収率(5−15X10’/マ
ウス)を得るため、動物は細胞採取4日前に無菌チオグ
リコレート培地0.5 mの腹腔的注射を受けた。大食
細胞は600gで5分間遠心することによって1回洗浄
され、そして組織培養培地中に10”/dで再懸濁され
た。各IJIta培養くぼみは大食細胞懸濁液100μ
2を受けた。こ\に記載したハイブリドーは、アメリカ
合衆国メリーランド州20850、ロックビルのアメリ
カン、タイプ、カルチャー、コレクションに寄託され、
そしてATCCNo、I(B2O21と命名された。
実施例29
一クローン 、−の −+1
使用済培養液からの単クローン性抗体を、ウサギ抗マウ
スfg:セフ70−ズ4Bゲルマトリックス(R−αM
1g:セファローズ)による免疫アフィニテークロマト
グラフィーを使用して精製した。R−αM1g:セファ
ローズ20Idをクロマトグラフィーカラム(1,5X
30cm)に充填し、PB−NaCI緩衝液で平衡化し
た。培養液のサンプルをカラム中をゆっくり通過させ(
5ml/hr>。
スfg:セフ70−ズ4Bゲルマトリックス(R−αM
1g:セファローズ)による免疫アフィニテークロマト
グラフィーを使用して精製した。R−αM1g:セファ
ローズ20Idをクロマトグラフィーカラム(1,5X
30cm)に充填し、PB−NaCI緩衝液で平衡化し
た。培養液のサンプルをカラム中をゆっくり通過させ(
5ml/hr>。
そして0.1 Mグリシン:IM NaC1,pH9
゜0の100dによる溶出により非特異性反応成分を除
去した。反応性タンパクを次に4M KSCN :
0. OI Mリン酸ナトリウム、pH7,2の3ベツ
ド星で溶出した。透析した物質を陽圧限外口過を用いて
濃縮した。
゜0の100dによる溶出により非特異性反応成分を除
去した。反応性タンパクを次に4M KSCN :
0. OI Mリン酸ナトリウム、pH7,2の3ベツ
ド星で溶出した。透析した物質を陽圧限外口過を用いて
濃縮した。
実施例30
したハイブリドーマ の
rg (R−αMIg)20011gを臭化シアン活1
’l 化セファローズ485gへ結合することによりア
フィニティーマトリックスを調製し、マウスI[G (
H+L)に対するウサギ、抗血清のIgG分画をJ、
rmmunol、 Methods長:305−310
(1977)記載のりパノール法によって調製した。結
合は製造者(Pharn+acia、 Piscata
way、 N、J、)から提供された指針に従い、重炭
酸塩緩衝液中p H8,0で実施した。学ばした抗PA
抗体のクラスおよびサブクラスは、ウサギ抗マウスIg
G1. 夏gG2a、1gG2b、IgG3.IgM
、抗−におよび抗−λ鎖を用い、0.6%アガロース中
の二重免疫拡散によって決定した。
’l 化セファローズ485gへ結合することによりア
フィニティーマトリックスを調製し、マウスI[G (
H+L)に対するウサギ、抗血清のIgG分画をJ、
rmmunol、 Methods長:305−310
(1977)記載のりパノール法によって調製した。結
合は製造者(Pharn+acia、 Piscata
way、 N、J、)から提供された指針に従い、重炭
酸塩緩衝液中p H8,0で実施した。学ばした抗PA
抗体のクラスおよびサブクラスは、ウサギ抗マウスIg
G1. 夏gG2a、1gG2b、IgG3.IgM
、抗−におよび抗−λ鎖を用い、0.6%アガロース中
の二重免疫拡散によって決定した。
もっとも激しい生育する培養物96からの上清を固相酵
素イムノアッセイを用いて、PAに対する抗体活性につ
いて2系列でスクリーンした。結果は、培養物の約4%
(4/96)は最初から抗体陽性であることを示した。
素イムノアッセイを用いて、PAに対する抗体活性につ
いて2系列でスクリーンした。結果は、培養物の約4%
(4/96)は最初から抗体陽性であることを示した。
これら培養物を再定澄するとき、一つのハイブリドーマ
(F5−A−1/22)は陽性を保った。この培養物を
腹腔大食細胞上で希釈を制限することによりクローンし
、そして巨視的に単一生育コロニーを示す30の培養物
を得た。陽性培養物の一つを再クローンし、そしてそれ
から誘導された培養物全部を抗体陽性であった。これら
細胞(クローンF5−A−1/22.8.13.C1,
8,13,という)を大量培養に拡大し、そして抗体含
量について調べた(表7)。この実験のための陽性対照
として、■gGIカッパ型免疫グロブリンを産生ずるこ
とが既知の、P3x63Ag8細胞からの培養液を使用
した。該P3x63Ag8株の細胞は約12μg/dの
単離された免疫グロブリンを産生じ、それはIgG1お
よびに一鎖へ特異性の抗血清に対し反応性であった。(
表8)。他のグロブリンサブクラス抗血清試薬では沈澱
が発生しなかった。
(F5−A−1/22)は陽性を保った。この培養物を
腹腔大食細胞上で希釈を制限することによりクローンし
、そして巨視的に単一生育コロニーを示す30の培養物
を得た。陽性培養物の一つを再クローンし、そしてそれ
から誘導された培養物全部を抗体陽性であった。これら
細胞(クローンF5−A−1/22.8.13.C1,
8,13,という)を大量培養に拡大し、そして抗体含
量について調べた(表7)。この実験のための陽性対照
として、■gGIカッパ型免疫グロブリンを産生ずるこ
とが既知の、P3x63Ag8細胞からの培養液を使用
した。該P3x63Ag8株の細胞は約12μg/dの
単離された免疫グロブリンを産生じ、それはIgG1お
よびに一鎖へ特異性の抗血清に対し反応性であった。(
表8)。他のグロブリンサブクラス抗血清試薬では沈澱
が発生しなかった。
抗PA活性に示すC1,8,13からの培養液は、R−
αM1g:セファローズ精製を使用する単離された物質
約10μg / mlを含有していた。この単離物はI
gM K−タイプサブクラスのマウス免疫グロブリン
であることが同定された(表8)。
αM1g:セファローズ精製を使用する単離された物質
約10μg / mlを含有していた。この単離物はI
gM K−タイプサブクラスのマウス免疫グロブリン
であることが同定された(表8)。
この製剤は抗血清の他のサブクラスに対しては沈澱せず
、単離した免疫グロブリン製剤の単クローン性を示した
。
、単離した免疫グロブリン製剤の単クローン性を示した
。
表7 R−αMA :セファローズ4Bクロマト号+
子ナテ圭件に立垂9o−7=(7)71g収量 μg1
g#+j! 吸着体へ適用し b) 賠−1−劣 た旦止孜」ぺL ユ亘り一 培悶斂−
P3 X 6a八g8 125
1.6 13F5
−八−1/22.8.13 3 0 0
3. 1 1 0a)清澄化
した培養液を記載したR−αM1g:セファローズ4B
吸着体を通した。ゲルをIMNaCI pH9,oで
280nmの吸収がヘースラインに達するまで(0,0
200,D、単位)洗った。
子ナテ圭件に立垂9o−7=(7)71g収量 μg1
g#+j! 吸着体へ適用し b) 賠−1−劣 た旦止孜」ぺL ユ亘り一 培悶斂−
P3 X 6a八g8 125
1.6 13F5
−八−1/22.8.13 3 0 0
3. 1 1 0a)清澄化
した培養液を記載したR−αM1g:セファローズ4B
吸着体を通した。ゲルをIMNaCI pH9,oで
280nmの吸収がヘースラインに達するまで(0,0
200,D、単位)洗った。
b)R−αM1g−反応性物質を4M KSCHの解
離条件下で溶出した。単離されたIgの収率は光学密度
測定によって決定し、そこではマウスrgct%(W/
V)溶液は吸光率14を示した。
離条件下で溶出した。単離されたIgの収率は光学密度
測定によって決定し、そこではマウスrgct%(W/
V)溶液は吸光率14を示した。
7° ″11劣奮冒゛(アペづ・−−・・しぢ畳t′)
7配信2′、=15′ 十 − R−α−1gCI R−αr gG2 a R−αIgG2b R−αI gG3 R−αに鎖 + +R
−αλ鎖 R−αI gM
+以上の実施例は一般的にまたは具体的に記載された
試薬および/または実施例中に具体的に用いた本発明の
作業条件で置き換えることにより、同じような成功度を
もって反復することができる。
7配信2′、=15′ 十 − R−α−1gCI R−αr gG2 a R−αIgG2b R−αI gG3 R−αに鎖 + +R
−αλ鎖 R−αI gM
+以上の実施例は一般的にまたは具体的に記載された
試薬および/または実施例中に具体的に用いた本発明の
作業条件で置き換えることにより、同じような成功度を
もって反復することができる。
以上の記載から本発明の関係する分野における熟練者は
その必須の特徴を容易に確かめることができ、そして本
発明の精神と範囲から逸脱することなく、それを各種の
用途および条件に適応させるために各種の改変および変
更を加えることができる。
その必須の特徴を容易に確かめることができ、そして本
発明の精神と範囲から逸脱することなく、それを各種の
用途および条件に適応させるために各種の改変および変
更を加えることができる。
竜】」J冴旧1庄
本明細書および実施例から理解されるように、本発明の
いくつかの局面において産業上有用である。この前立腺
抗原は正常産生物であるけれども、それは他の分別する
細胞産生物、例えば前立腺酸性フォスファターゼおよび
サイロカルシトニンのようにを用な悪性しゅ瘍マーカー
のように見える。
いくつかの局面において産業上有用である。この前立腺
抗原は正常産生物であるけれども、それは他の分別する
細胞産生物、例えば前立腺酸性フォスファターゼおよび
サイロカルシトニンのようにを用な悪性しゅ瘍マーカー
のように見える。
前立腺抗原抗血清の特異性は未知の一次起源をもった単
離した転移中の悪性しゅ瘍細胞の同定を可能にする。さ
らに腺の発達中の前立腺組織の抗原間の正常分別の表明
と、前立腺病変とにおける変動の研究は、前立腺細胞の
生育調節の現象と転移可能性の予見を特徴する
離した転移中の悪性しゅ瘍細胞の同定を可能にする。さ
らに腺の発達中の前立腺組織の抗原間の正常分別の表明
と、前立腺病変とにおける変動の研究は、前立腺細胞の
生育調節の現象と転移可能性の予見を特徴する
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、正常およびガン性前立腺組織中に発生しそして分析
的ポリアクリルアミドゲル電気泳動および等電集束にお
いて単一タンパクバンドを示すように精製されたヒト前
立腺特異性抗原に対するモノクロナール抗体の免疫化学
的に有効な濃度および量を含む試験管内組成物にして、
前記抗原はセファデックスG−75ゲルロ過により測定
するとき約34,000の分子量をサブユニットなしで
有し、そして6.9の等電点pIを有し、前記抗原はま
た過塩素酸に不溶であり、前記組成物はヒト前立腺酸性
フォスファターゼに対する抗体を含まないことを特徴と
する前記組成物。 2、前記モノクロナール抗体は、 (a)抗体産生細胞と、 (b)融合したハイブリドーマ中に免疫グロブリンの均
一集団を産生し得る骨髄しゅ細胞とより実質的に構成さ
れた融合した細胞ハイブリッドによって産生される第1
項の組成物。 3、前記融合した細胞ハイブリッドはATCC HB8
051である第2項の組成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US10821779A | 1979-12-28 | 1979-12-28 | |
US108,217 | 1979-12-28 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP81500570A Division JPS57500169A (ja) | 1979-12-28 | 1980-12-23 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02497A true JPH02497A (ja) | 1990-01-05 |
Family
ID=22320935
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP81500570A Pending JPS57500169A (ja) | 1979-12-28 | 1980-12-23 | |
JP1007524A Pending JPH02497A (ja) | 1979-12-28 | 1989-01-13 | ヒト前立腺特異性抗原に対する抗体組成物 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP81500570A Pending JPS57500169A (ja) | 1979-12-28 | 1980-12-23 |
Country Status (5)
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---|---|
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JP (2) | JPS57500169A (ja) |
CA (1) | CA1165685A (ja) |
IT (1) | IT1141155B (ja) |
WO (1) | WO1981001849A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2669566B2 (ja) * | 1990-07-23 | 1997-10-29 | リルヤ,ハンス | 遊離及び複合体形成した前立腺特異的抗原(psa)の分析 |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB2139645A (en) * | 1983-04-08 | 1984-11-14 | Kureha Chemical Ind Co Ltd | Antibody to human prostrate cancer |
US4690890A (en) * | 1984-04-04 | 1987-09-01 | Cetus Corporation | Process for simultaneously detecting multiple antigens using dual sandwich immunometric assay |
US4708930A (en) * | 1984-11-09 | 1987-11-24 | Coulter Corporation | Monoclonal antibody to a human carcinoma tumor associated antigen |
JPH05142228A (ja) * | 1992-01-17 | 1993-06-08 | Kureha Chem Ind Co Ltd | ヒト前立腺癌の分類および同定用試薬 |
US5489525A (en) * | 1992-10-08 | 1996-02-06 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Monoclonal antibodies to prostate cells |
EP0635575A1 (en) * | 1993-07-22 | 1995-01-25 | Wallac Oy | Monoclonal antibodies against epitopes found in free but not in alpha-1-antichmotrypsin complexed prostate specific antigen |
EP0725139A3 (en) * | 1995-02-03 | 1997-11-26 | Bayer Corporation | Recombinant prostate-specific antigen and its use as an immunoassay calibrator |
US5807978A (en) | 1995-06-07 | 1998-09-15 | Kokolus; William J. | Immunogenic peptides of prostate specific antigen |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4172124A (en) * | 1978-04-28 | 1979-10-23 | The Wistar Institute | Method of producing tumor antibodies |
-
1980
- 1980-12-23 JP JP81500570A patent/JPS57500169A/ja active Pending
- 1980-12-23 WO PCT/US1980/001708 patent/WO1981001849A1/en not_active Application Discontinuation
- 1980-12-23 EP EP19810900373 patent/EP0042428A4/en not_active Withdrawn
- 1980-12-29 CA CA000367643A patent/CA1165685A/en not_active Expired
- 1980-12-29 IT IT26986/80A patent/IT1141155B/it active
-
1989
- 1989-01-13 JP JP1007524A patent/JPH02497A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
INVESTIGATIVE UROLOGY=1979 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2669566B2 (ja) * | 1990-07-23 | 1997-10-29 | リルヤ,ハンス | 遊離及び複合体形成した前立腺特異的抗原(psa)の分析 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA1165685A (en) | 1984-04-17 |
EP0042428A1 (en) | 1981-12-30 |
IT8026986A0 (it) | 1980-12-29 |
JPS57500169A (ja) | 1982-01-28 |
EP0042428A4 (en) | 1982-09-03 |
IT1141155B (it) | 1986-10-01 |
WO1981001849A1 (en) | 1981-07-09 |
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