JPH1175839A - モノクローナル抗体、細胞株及びｎ１，ｎ１２−ジアセチルスペルミンの測定法 - Google Patents
モノクローナル抗体、細胞株及びｎ１，ｎ１２−ジアセチルスペルミンの測定法Info
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- JPH1175839A JPH1175839A JP10174361A JP17436198A JPH1175839A JP H1175839 A JPH1175839 A JP H1175839A JP 10174361 A JP10174361 A JP 10174361A JP 17436198 A JP17436198 A JP 17436198A JP H1175839 A JPH1175839 A JP H1175839A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】腫瘍マーカーとして期待されるＮ1,Ｎ12−ジア
セチルスペルミンの測定法を提供すること。 【解決手段】固相化若しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−ジアセチ
ルスペルミン又は固相化若しくは標識化Ｎ1−アセチル
スペルミンと抗ＮＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノ
クローナル抗体の免疫反応を利用して検体中のＮ1,Ｎ12
−ジアセチルスペルミンを測定する。その際、測定条件
におけるＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンによる該免疫
反応の阻害活性がＮ1−アセチルスペルミジンによる該
免疫反応の阻害活性の２０倍以上となる抗ＮＮ1,Ｎ12−
ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体を用いる測定
法を見出した。
セチルスペルミンの測定法を提供すること。 【解決手段】固相化若しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−ジアセチ
ルスペルミン又は固相化若しくは標識化Ｎ1−アセチル
スペルミンと抗ＮＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノ
クローナル抗体の免疫反応を利用して検体中のＮ1,Ｎ12
−ジアセチルスペルミンを測定する。その際、測定条件
におけるＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンによる該免疫
反応の阻害活性がＮ1−アセチルスペルミジンによる該
免疫反応の阻害活性の２０倍以上となる抗ＮＮ1,Ｎ12−
ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体を用いる測定
法を見出した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、抗Ｎ1,Ｎ12−ジア
セチルスペルミンモノクローナル抗体、抗Ｎ1,Ｎ 12−ジ
アセチルスペルミンモノクローナル抗体産生細胞株およ
び該抗体を用いるＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンの測
定法に関するものである。
セチルスペルミンモノクローナル抗体、抗Ｎ1,Ｎ 12−ジ
アセチルスペルミンモノクローナル抗体産生細胞株およ
び該抗体を用いるＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンの測
定法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ポリアミンは、プトレッシン（Ｐｕ
ｔ）、カダベリン（Ｃａｄ）、スペルミジン（Ｓｐ
ｄ）、スペルミン（Ｓｐｍ）及びそれら誘導体等の総称
で、生体内に広く分布する生理活性物質である。癌細胞
を含む増殖の盛んな細胞でかなりの量が合成され、これ
らの細胞に局在し、細胞の増殖を促進する因子として作
用することから注目されている（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．５３ ｐ７４９−７９０（１９８
４））。
ｔ）、カダベリン（Ｃａｄ）、スペルミジン（Ｓｐ
ｄ）、スペルミン（Ｓｐｍ）及びそれら誘導体等の総称
で、生体内に広く分布する生理活性物質である。癌細胞
を含む増殖の盛んな細胞でかなりの量が合成され、これ
らの細胞に局在し、細胞の増殖を促進する因子として作
用することから注目されている（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．５３ ｐ７４９−７９０（１９８
４））。
【０００３】１９７１年、Ｒｕｓｓｅｌｌ等は、癌患者
の尿中にポリアミンが増加することを見出し（Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ．３１ ｐ１５５５（１９７１））、尿中
ポリアミンは、現在、腫瘍マーカーとして用いられてい
る。しかしながら、これまでの「ポリアミン全体」を測
定することの意義に対して、限界も見えてきた（Ｐｒｏ
ｇ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．３９ ｐ９−３３（１９９
２））。
の尿中にポリアミンが増加することを見出し（Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ．３１ ｐ１５５５（１９７１））、尿中
ポリアミンは、現在、腫瘍マーカーとして用いられてい
る。しかしながら、これまでの「ポリアミン全体」を測
定することの意義に対して、限界も見えてきた（Ｐｒｏ
ｇ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．３９ ｐ９−３３（１９９
２））。
【０００４】ポリアミンは、そのまま遊離型として存在
する他、アセチル化されたり、結合型としても存在して
いる。Ａｂｄｅｌ−Ｍｏｎｅｍ等は、尿中に***される
ポリアミンは、主としてモノアセチル体のＮ1−アセチ
ルスペルミジン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ）、アセチルプト
レッシン（Ａｃ−Ｐｕｔ）、Ｎ8−アセチルスペルミジ
ン（Ｎ8−Ａｃ−Ｓｐｄ）として存在しており、これら
成分の増加や成分比の変動がさらによい腫瘍マーカーと
なることを報告している（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６
７ ｐ１６７１−１６７３（１９７８），Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．４２ｐ２０９７−２０９８（１９８２））
が、これには異論もある（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８
ｐ１２１１−１２１５（１９９５））。
する他、アセチル化されたり、結合型としても存在して
いる。Ａｂｄｅｌ−Ｍｏｎｅｍ等は、尿中に***される
ポリアミンは、主としてモノアセチル体のＮ1−アセチ
ルスペルミジン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ）、アセチルプト
レッシン（Ａｃ−Ｐｕｔ）、Ｎ8−アセチルスペルミジ
ン（Ｎ8−Ａｃ−Ｓｐｄ）として存在しており、これら
成分の増加や成分比の変動がさらによい腫瘍マーカーと
なることを報告している（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６
７ ｐ１６７１−１６７３（１９７８），Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．４２ｐ２０９７−２０９８（１９８２））
が、これには異論もある（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８
ｐ１２１１−１２１５（１９９５））。
【０００５】最近、平松等は、尿中にポリアミンのジア
セチル体のＮ1,Ｎ8−ジアセチルスペルミジン（Ｎ1,Ｎ8
−２Ａｃ−Ｓｐｄ）、Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン
（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ）が存在することを見出し
（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７ ｐ１０７−１１２（１
９９５））、これらが、泌尿器系の腫瘍で著しく増加
し、従来のポリアミンやポリアミンのモノアセチル体の
変動を凌いでいたことから、新しい腫瘍マーカーとして
期待されている（Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２１ ｐ３１７−３１９（１９９
５））。
セチル体のＮ1,Ｎ8−ジアセチルスペルミジン（Ｎ1,Ｎ8
−２Ａｃ−Ｓｐｄ）、Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン
（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ）が存在することを見出し
（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７ ｐ１０７−１１２（１
９９５））、これらが、泌尿器系の腫瘍で著しく増加
し、従来のポリアミンやポリアミンのモノアセチル体の
変動を凌いでいたことから、新しい腫瘍マーカーとして
期待されている（Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２１ ｐ３１７−３１９（１９９
５））。
【０００６】従来、これらジアセチル体のＮ1,Ｎ8−２
Ａｃ−Ｓｐｄ、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの測定は、キ
ャピラリー・ガスクロマトグラフィ法（Ｃｌｉｎ．Ｃｈ
ｅｍ．３２ ｐ１９３０−１９３７（１９８６））や液
体クロマトグラフィ法（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７
ｐ１０７−１１２（１９９５））で行われてきた。
Ａｃ−Ｓｐｄ、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの測定は、キ
ャピラリー・ガスクロマトグラフィ法（Ｃｌｉｎ．Ｃｈ
ｅｍ．３２ ｐ１９３０−１９３７（１９８６））や液
体クロマトグラフィ法（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７
ｐ１０７−１１２（１９９５））で行われてきた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ジアセ
チル体のＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍを測定するキャピラ
リー・ガスクロマトグラフィ法や液体クロマトグラフィ
法では、煩雑な検体の前処理操作や、装置のメンテナン
ス技術を必要とするなど、かなりの熟練が要求される。
また、煩雑さのため、測定には時間がかかり、臨床的な
測定法としては、とても受け入れられるものではない。
そこで、臨床的に使用し得る簡便な測定法の開発を目指
し、抗体を用いる免疫的な測定法が検討された。藤原等
は、Ｓｐｍのアルブミン複合体を免疫してＮ1,Ｎ12−２
Ａｃ−Ｓｐｍに反応するモノクローナル抗体を作成した
が、モノアセチル体のＮ1−Ａｃ−ＳｐｄとＮ1−アセチ
ルスペルミン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ）とも強く反応し、
結果的には、これら３成分の中で最も尿中での存在量の
多い、Ｎ 1−Ａｃ−Ｓｐｄを反映する測定法しかできな
かった（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８ ｐ１２１１−１
２１５（１９９５））。従って、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓ
ｐｍを測定できる免疫測定法は、今だに完成していな
い。
チル体のＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍを測定するキャピラ
リー・ガスクロマトグラフィ法や液体クロマトグラフィ
法では、煩雑な検体の前処理操作や、装置のメンテナン
ス技術を必要とするなど、かなりの熟練が要求される。
また、煩雑さのため、測定には時間がかかり、臨床的な
測定法としては、とても受け入れられるものではない。
そこで、臨床的に使用し得る簡便な測定法の開発を目指
し、抗体を用いる免疫的な測定法が検討された。藤原等
は、Ｓｐｍのアルブミン複合体を免疫してＮ1,Ｎ12−２
Ａｃ−Ｓｐｍに反応するモノクローナル抗体を作成した
が、モノアセチル体のＮ1−Ａｃ−ＳｐｄとＮ1−アセチ
ルスペルミン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ）とも強く反応し、
結果的には、これら３成分の中で最も尿中での存在量の
多い、Ｎ 1−Ａｃ−Ｓｐｄを反映する測定法しかできな
かった（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８ ｐ１２１１−１
２１５（１９９５））。従って、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓ
ｐｍを測定できる免疫測定法は、今だに完成していな
い。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記した
ような問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、Ｎ 1
−Ａｃ−Ｓｐｍのアルブミン複合体で免疫し、実質的に
尿中Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの測定に使用し得るモノ
クローナル抗体を作成し、その抗体を用いる測定法を見
いだして本発明に至ったものである。
ような問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、Ｎ 1
−Ａｃ−Ｓｐｍのアルブミン複合体で免疫し、実質的に
尿中Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの測定に使用し得るモノ
クローナル抗体を作成し、その抗体を用いる測定法を見
いだして本発明に至ったものである。
【０００９】即ち、本発明は、（１）固相化若しくは標
識化Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン（Ｎ1,Ｎ12−２Ａ
ｃ−Ｓｐｍ）又は固相化若しくは標識化Ｎ1−アセチル
スペルミン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ）と抗Ｎ1,Ｎ12−ジア
セチルスペルミンモノクローナル抗体の免疫反応を利用
した検体中のＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンの測定系
を組んだ場合に、Ｎ 1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンによ
る該免疫反応の阻害活性がＮ1−アセチルスペルミジン
（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ）による該免疫反応の阻害活性の
２０倍以上、好ましくは３０倍以上、より好ましくは４
０倍以上となる測定条件を選択することが可能になる抗
Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体、
（２）固相化若しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペ
ルミン又は固相化若しくは標識化Ｎ1−アセチルスペル
ミンとの免疫反応が５０％阻害されるＮ1,Ｎ12−ジアセ
チルスペルミンの濃度が２０μＭ以下、好ましくは１５
μＭ以下、より好ましくは１μＭ以下となる測定条件を
選択することが可能になる上記（１）記載のモノクロー
ナル抗体、（３）検体が尿検体である上記（１）又は
（２）記載のモノクローナル抗体、（４）モノクローナ
ル抗体０５２０，４９１４又は８６２４、（５）上記
（１）、（２）、（３）又は（４）記載のモノクローナ
ル抗体を産生する細胞株、（６）固相化若しくは標識化
Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン又は固相化若しくは標
識化Ｎ1−アセチルスペルミンと抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチ
ルスペルミンモノクローナル抗体の免疫反応を利用して
検体中のＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンを測定する際
に、その測定条件におけるＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペル
ミンによる該免疫反応の阻害活性がＮ1−アセチルスペ
ルミジンによる該免疫反応の阻害活性の２０倍以上、好
ましくは３０倍以上、より好ましくは４０倍以上となる
抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体
を用いることを特徴とするＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペル
ミンの測定法、（７）抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミ
ンモノクローナル抗体が、測定条件において固相化若し
くは標識化Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン又は固相化
若しくは標識化Ｎ1−アセチルスペルミンとの免疫反応
が５０％阻害するＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンの濃
度が２０μＭ以下、好ましくは１５μＭ以下、より好ま
しくは１μＭ以下となる抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペル
ミンモノクローナル抗体である上記（６）記載の測定
法、（８）抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクロ
ーナル抗体がモノクローナル抗体０５２０，４９１４又
は８６２４である上記（７）記載の測定法、（９）検体
が尿検体である上記（６）、（７）又は（８）記載の測
定法、に関する。
識化Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン（Ｎ1,Ｎ12−２Ａ
ｃ−Ｓｐｍ）又は固相化若しくは標識化Ｎ1−アセチル
スペルミン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ）と抗Ｎ1,Ｎ12−ジア
セチルスペルミンモノクローナル抗体の免疫反応を利用
した検体中のＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンの測定系
を組んだ場合に、Ｎ 1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンによ
る該免疫反応の阻害活性がＮ1−アセチルスペルミジン
（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ）による該免疫反応の阻害活性の
２０倍以上、好ましくは３０倍以上、より好ましくは４
０倍以上となる測定条件を選択することが可能になる抗
Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体、
（２）固相化若しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペ
ルミン又は固相化若しくは標識化Ｎ1−アセチルスペル
ミンとの免疫反応が５０％阻害されるＮ1,Ｎ12−ジアセ
チルスペルミンの濃度が２０μＭ以下、好ましくは１５
μＭ以下、より好ましくは１μＭ以下となる測定条件を
選択することが可能になる上記（１）記載のモノクロー
ナル抗体、（３）検体が尿検体である上記（１）又は
（２）記載のモノクローナル抗体、（４）モノクローナ
ル抗体０５２０，４９１４又は８６２４、（５）上記
（１）、（２）、（３）又は（４）記載のモノクローナ
ル抗体を産生する細胞株、（６）固相化若しくは標識化
Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン又は固相化若しくは標
識化Ｎ1−アセチルスペルミンと抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチ
ルスペルミンモノクローナル抗体の免疫反応を利用して
検体中のＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンを測定する際
に、その測定条件におけるＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペル
ミンによる該免疫反応の阻害活性がＮ1−アセチルスペ
ルミジンによる該免疫反応の阻害活性の２０倍以上、好
ましくは３０倍以上、より好ましくは４０倍以上となる
抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体
を用いることを特徴とするＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペル
ミンの測定法、（７）抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミ
ンモノクローナル抗体が、測定条件において固相化若し
くは標識化Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン又は固相化
若しくは標識化Ｎ1−アセチルスペルミンとの免疫反応
が５０％阻害するＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンの濃
度が２０μＭ以下、好ましくは１５μＭ以下、より好ま
しくは１μＭ以下となる抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペル
ミンモノクローナル抗体である上記（６）記載の測定
法、（８）抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクロ
ーナル抗体がモノクローナル抗体０５２０，４９１４又
は８６２４である上記（７）記載の測定法、（９）検体
が尿検体である上記（６）、（７）又は（８）記載の測
定法、に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
固相化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は固相化Ｎ1−Ａｃ
−Ｓｐｍとしては、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又はＮ1
−Ａｃ−Ｓｐｍを、スペーサーを介して、不溶性物質の
表面上に繋ぎ止めたものが挙げられる。スペーサーの結
合位置は、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの場合はその末端
であってもその両末端の間のいずれの位置であってもよ
いが、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍの場合はその末端アミノ基に
結合させるのが望ましい。スペーサーの種類と導入方法
については多くの方法が知られているが、これらのいず
れであっても良い。例えば、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ
のいずれかの位置に、末端に反応基を有するスペーサー
を導入し（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍのアセチル基から
スペーサーを誘導する場合は、Ｎ1−Ａｃ−ＳｐｍのＮ
12−アミノ基に導入したアシル基がスペーサーとな
る）、この反応基を介して蛋白質や合成高分子などに結
合し、生成したＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍと蛋白質や合
成高分子の複合体を、免疫反応の場となる固相担体上に
吸着させる方法、予め化学的に活性化されたスペーサー
を持つ固相担体上に、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍそのも
の、もしくは、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍの末端アミノ基を反
応させる方法などがあるが、これらに限定されるもので
はない。Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又はＮ1−Ａｃ−Ｓ
ｐｍのいずれの位置に、どのようなスペーサーを導入す
るかは、用いる抗体の性質によって適宜選択すればよ
い。
固相化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は固相化Ｎ1−Ａｃ
−Ｓｐｍとしては、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又はＮ1
−Ａｃ−Ｓｐｍを、スペーサーを介して、不溶性物質の
表面上に繋ぎ止めたものが挙げられる。スペーサーの結
合位置は、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの場合はその末端
であってもその両末端の間のいずれの位置であってもよ
いが、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍの場合はその末端アミノ基に
結合させるのが望ましい。スペーサーの種類と導入方法
については多くの方法が知られているが、これらのいず
れであっても良い。例えば、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ
のいずれかの位置に、末端に反応基を有するスペーサー
を導入し（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍのアセチル基から
スペーサーを誘導する場合は、Ｎ1−Ａｃ−ＳｐｍのＮ
12−アミノ基に導入したアシル基がスペーサーとな
る）、この反応基を介して蛋白質や合成高分子などに結
合し、生成したＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍと蛋白質や合
成高分子の複合体を、免疫反応の場となる固相担体上に
吸着させる方法、予め化学的に活性化されたスペーサー
を持つ固相担体上に、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍそのも
の、もしくは、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍの末端アミノ基を反
応させる方法などがあるが、これらに限定されるもので
はない。Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又はＮ1−Ａｃ−Ｓ
ｐｍのいずれの位置に、どのようなスペーサーを導入す
るかは、用いる抗体の性質によって適宜選択すればよ
い。
【００１１】スペーサーとしては、例えばグルタルアル
デヒド（ＧＡ）を用いた場合はホルミルブチリル鎖が、
Ｎ−（４−マレイミドブチルオキシ）コハク酸イミド
（ＧＭＢＳ）を用いた場合はマレイミドブチリル鎖が、
無水コハク酸を用いた場合は、カルボキシプロピオニル
鎖等が挙げられるが、公知のものはいずれも使用でき
る。又、蛋白質や合成高分子としては、例えば、アルブ
ミンやポリリジン等が挙げられるが、これらに限定され
るものでなはい。固相担体としては、例えば、９６穴等
のマイクロタイタープレート、ポリスチレンビーズ、各
種ラテックス粒子、ニトロセルロース膜等が挙げられる
が、これらに限定されるものではない。
デヒド（ＧＡ）を用いた場合はホルミルブチリル鎖が、
Ｎ−（４−マレイミドブチルオキシ）コハク酸イミド
（ＧＭＢＳ）を用いた場合はマレイミドブチリル鎖が、
無水コハク酸を用いた場合は、カルボキシプロピオニル
鎖等が挙げられるが、公知のものはいずれも使用でき
る。又、蛋白質や合成高分子としては、例えば、アルブ
ミンやポリリジン等が挙げられるが、これらに限定され
るものでなはい。固相担体としては、例えば、９６穴等
のマイクロタイタープレート、ポリスチレンビーズ、各
種ラテックス粒子、ニトロセルロース膜等が挙げられる
が、これらに限定されるものではない。
【００１２】また、標識化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又
は標識化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍとしては、放射性同位元素
を導入してＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又はＮ1−Ａｃ−
Ｓｐｍそのものを標識したり、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐ
ｍ又はＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍに、放射性元素の入った化合
物、ユーロピウム等の遅延蛍光性のある元素を保持でき
る化合物、ルテニウム等の電気化学発光の触媒となる元
素を保持できる化合物、蛍光物質等を結合させて標識し
たり、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又はＮ1−Ａｃ−Ｓｐ
ｍに、前記のようなスペーサーを介して酵素標識した
り、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又はＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍ
をビオチンで標識し、免疫反応後にアビジンの酵素標識
体と反応させ、ビオチン−アビジン複合体として間接的
に検出できるようにしたもの等が挙げられる。
は標識化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍとしては、放射性同位元素
を導入してＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又はＮ1−Ａｃ−
Ｓｐｍそのものを標識したり、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐ
ｍ又はＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍに、放射性元素の入った化合
物、ユーロピウム等の遅延蛍光性のある元素を保持でき
る化合物、ルテニウム等の電気化学発光の触媒となる元
素を保持できる化合物、蛍光物質等を結合させて標識し
たり、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又はＮ1−Ａｃ−Ｓｐ
ｍに、前記のようなスペーサーを介して酵素標識した
り、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又はＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍ
をビオチンで標識し、免疫反応後にアビジンの酵素標識
体と反応させ、ビオチン−アビジン複合体として間接的
に検出できるようにしたもの等が挙げられる。
【００１３】本発明のモノクローナル抗体は、クローン
化されたイムノグロブリン抗体であれば何であってもよ
く、抗体の由来する動物種、イムノグロブリンのタイプ
やサブタイプ、抗体の産生方法は問わない。また、抗体
を断片化して免疫反応部位を残したもの、それら断片の
修飾物、抗体そのものの修飾物、２種類の抗体を結合さ
せたキメラ抗体等も包含する。本発明のモノクローナル
抗体は、抗体産生株の組織培養法や、抗体のアミノ酸配
列から予想されるＤＮＡを用いて、遺伝子工学を用いる
製造法等によって製造することができる。
化されたイムノグロブリン抗体であれば何であってもよ
く、抗体の由来する動物種、イムノグロブリンのタイプ
やサブタイプ、抗体の産生方法は問わない。また、抗体
を断片化して免疫反応部位を残したもの、それら断片の
修飾物、抗体そのものの修飾物、２種類の抗体を結合さ
せたキメラ抗体等も包含する。本発明のモノクローナル
抗体は、抗体産生株の組織培養法や、抗体のアミノ酸配
列から予想されるＤＮＡを用いて、遺伝子工学を用いる
製造法等によって製造することができる。
【００１４】本発明のモノクローナル抗体を産生する抗
体産生株は、公知の方法に準じた方法、即ち、マウス、
ラット等の動物を免疫原で免疫し、次いで免疫した動物
のＢ細胞とミエローマ細胞を融合し、得られたハイブリ
ドーマの中から本発明のモノクローナル抗体を産生する
細胞株を選択することにより得ることができる。
体産生株は、公知の方法に準じた方法、即ち、マウス、
ラット等の動物を免疫原で免疫し、次いで免疫した動物
のＢ細胞とミエローマ細胞を融合し、得られたハイブリ
ドーマの中から本発明のモノクローナル抗体を産生する
細胞株を選択することにより得ることができる。
【００１５】免疫原には、ハプテン（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ
−Ｓｐｍ又はＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍ）とキャリア物質（蛋
白質又は合成高分子）の複合体が使用でき、これは、固
相化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は固相化Ｎ1−Ａｃ−
Ｓｐｍの作成法で述べた方法と同様にして製造すること
ができる。本発明のモノクローナル抗体としては、例え
ばモノクローナル抗体０５２０，４９１４及び８６２４
が挙げられ、これらはそれぞれＡＣＳＰＭ−１（工業技
術院生命工学工業技術研究所寄託番号、ＦＥＲＭ Ｐ−
１６２９７）、ＡＣＳＰＭ−２（工業技術院生命工学工
業技術研究所寄託番号、ＦＥＲＭ Ｐ−１６２９８）及
びＡＣＳＰＭ−３（工業技術院生命工学工業技術研究所
寄託番号、ＦＥＲＭＰ−１６２９９）と名付けられた細
胞株を培養することにより得ることができる。
−Ｓｐｍ又はＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍ）とキャリア物質（蛋
白質又は合成高分子）の複合体が使用でき、これは、固
相化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は固相化Ｎ1−Ａｃ−
Ｓｐｍの作成法で述べた方法と同様にして製造すること
ができる。本発明のモノクローナル抗体としては、例え
ばモノクローナル抗体０５２０，４９１４及び８６２４
が挙げられ、これらはそれぞれＡＣＳＰＭ−１（工業技
術院生命工学工業技術研究所寄託番号、ＦＥＲＭ Ｐ−
１６２９７）、ＡＣＳＰＭ−２（工業技術院生命工学工
業技術研究所寄託番号、ＦＥＲＭ Ｐ−１６２９８）及
びＡＣＳＰＭ−３（工業技術院生命工学工業技術研究所
寄託番号、ＦＥＲＭＰ−１６２９９）と名付けられた細
胞株を培養することにより得ることができる。
【００１６】本発明の測定法は、ハプテンの免疫測定法
として知らている方法のいずれの方法によっても行なう
ことができ、特に制限されない。例えば、結合阻害法の
場合、例えば、実験例２のように、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−
Ｓｐｍによる抗体と固相化ハプテンとの免疫反応の阻害
を、固相化ハプテンに結合した抗体量の減少として、色
々な手段で検出する方法、固相担体としてラテックスを
用いる例としては、ハプテンを固相化したラテックス試
薬の抗体による凝集反応をＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍに
よる阻害として検出する方法、逆に、抗体を固相化した
ラテックス試薬を用い、多エピトープ化したポリハプテ
ンの添加によるラテックス凝集反応を、Ｎ1,Ｎ12−２Ａ
ｃ−Ｓｐｍによって阻害させる方法等がある。また、競
合法の場合、固相化した抗体に対して、Ｎ1,Ｎ12−２Ａ
ｃ−Ｓｐｍと標識化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は標識
化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍとを競合反応させ、ＢＦ分離後
に、固相化した抗体に結合した標識化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ
−Ｓｐｍ又は標識化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍの標識を、それ
ぞれの方法で適宜に検出すればよい。
として知らている方法のいずれの方法によっても行なう
ことができ、特に制限されない。例えば、結合阻害法の
場合、例えば、実験例２のように、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−
Ｓｐｍによる抗体と固相化ハプテンとの免疫反応の阻害
を、固相化ハプテンに結合した抗体量の減少として、色
々な手段で検出する方法、固相担体としてラテックスを
用いる例としては、ハプテンを固相化したラテックス試
薬の抗体による凝集反応をＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍに
よる阻害として検出する方法、逆に、抗体を固相化した
ラテックス試薬を用い、多エピトープ化したポリハプテ
ンの添加によるラテックス凝集反応を、Ｎ1,Ｎ12−２Ａ
ｃ−Ｓｐｍによって阻害させる方法等がある。また、競
合法の場合、固相化した抗体に対して、Ｎ1,Ｎ12−２Ａ
ｃ−Ｓｐｍと標識化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は標識
化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍとを競合反応させ、ＢＦ分離後
に、固相化した抗体に結合した標識化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ
−Ｓｐｍ又は標識化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍの標識を、それ
ぞれの方法で適宜に検出すればよい。
【００１７】本発明の測定法を実施する測定条件は特に
限定されないが、従来知られている免疫反応を利用した
測定条件が使用できる。例えば、検体と試薬（固相化若
しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は固相化若し
くは標識化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ及び抗Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ
−Ｓｐｍモノクローナル抗体）を混合して行なう免疫反
応は通常０〜４５℃、好ましくは１０〜４０℃で行な
う。本発明の測定を実施するにあたり、抗Ｎ1,Ｎ12−２
Ａｃ−Ｓｐｍモノクローナル抗体は必要により固相化又
は標識化して使用する。
限定されないが、従来知られている免疫反応を利用した
測定条件が使用できる。例えば、検体と試薬（固相化若
しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は固相化若し
くは標識化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ及び抗Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ
−Ｓｐｍモノクローナル抗体）を混合して行なう免疫反
応は通常０〜４５℃、好ましくは１０〜４０℃で行な
う。本発明の測定を実施するにあたり、抗Ｎ1,Ｎ12−２
Ａｃ−Ｓｐｍモノクローナル抗体は必要により固相化又
は標識化して使用する。
【００１８】本発明の測定法を実施するにあたり、固相
化若しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は固相化
若しくは標識化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍとしては、抗Ｎ1,Ｎ
12−２Ａｃ−Ｓｐｍモノクロナール抗体を作成する際に
用いた免疫原を作成する際に使用したスペーサーの種
類、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ若しくはＮ1−Ａｃ−Ｓ
ｐｍへの結合位置又は化学結合方法のひとつ以上を変え
て作成したものが望ましい。
化若しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は固相化
若しくは標識化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍとしては、抗Ｎ1,Ｎ
12−２Ａｃ−Ｓｐｍモノクロナール抗体を作成する際に
用いた免疫原を作成する際に使用したスペーサーの種
類、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ若しくはＮ1−Ａｃ−Ｓ
ｐｍへの結合位置又は化学結合方法のひとつ以上を変え
て作成したものが望ましい。
【００１９】なお、本発明において、固相化若しくは標
識化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は固相化若しくは標識
化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍと抗Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍモ
ノクローナル抗体との免疫反応が５０％阻害されるＮ1,
Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの濃度は、測定条件下で両者を反
応させて得られるシグナルを半減させるＮ1,Ｎ12−２Ａ
ｃ−Ｓｐｍの濃度を求めることにより得ることができ、
これは、反応系の検出感度の尺度となり得る。
識化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は固相化若しくは標識
化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍと抗Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍモ
ノクローナル抗体との免疫反応が５０％阻害されるＮ1,
Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの濃度は、測定条件下で両者を反
応させて得られるシグナルを半減させるＮ1,Ｎ12−２Ａ
ｃ−Ｓｐｍの濃度を求めることにより得ることができ、
これは、反応系の検出感度の尺度となり得る。
【００２０】本発明において、検体としては尿、血清、
血漿等各種のものが使用できるが、特に尿が好ましい。
血漿等各種のものが使用できるが、特に尿が好ましい。
【００２１】
【実施例】以下に、実験例及び実施例により本発明をよ
り具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。
り具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。
【００２２】実験例１ 抗体のスクリーニング法 ９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製 Nunc Im
munoplate ＩＩ) の各ウェルに、抗原としてＮ1−アセ
チルスペルミンのヒト血清アルブミン複合体（Ｎ1−Ａ
ｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＨＳＡ）１５μｇ／ｍＬを含む
１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）１００μＬ
を入れ、４０℃で２０分間放置してコーティングした。
次に、コーティング液を捨てて０．１％のツウィーン２
０を含む１０ｍＭリン酸で緩衝化された生食液（ＰＢＳ
Ｔ）で洗浄後、スキムミルク１％を含む５０ｍＭトリス
・塩酸で緩衝化された生食液（ｐＨ７．３）２００μＬ
でブロッキング処理した。ブロッキング液を捨ててＰＢ
ＳＴで洗浄後、各ウェルにハイブリドーマの培養上清６
０μＬと、ＢＳＡ２０ｍｇ／ｍＬを含む１０ｍＭリン酸
で緩衝化された生食液２０μＬを加え、４℃で一晩反応
させた。ウェルを、ＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴで２０
００倍に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）標識−ヤギ抗マウスＩｇＧ溶液（カッペル社）５０
μＬを加え、３７℃、４０分間反応させた。結合した酵
素の活性は、ＰＢＳＴで洗浄した各ウェルに、ｏ−フェ
ニレンジアミン０．５ｍｇ／ｍＬと過酸化水素０．０１
２％を含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．
３）１００μＬを加え、室温下に９分間発色反応させ、
ＥＬＩＳＡプレートリーダー（SLT-Lab Instruments
社）を用い、４９２ｎｍにおける吸光度の増加として測
定した。
munoplate ＩＩ) の各ウェルに、抗原としてＮ1−アセ
チルスペルミンのヒト血清アルブミン複合体（Ｎ1−Ａ
ｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＨＳＡ）１５μｇ／ｍＬを含む
１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）１００μＬ
を入れ、４０℃で２０分間放置してコーティングした。
次に、コーティング液を捨てて０．１％のツウィーン２
０を含む１０ｍＭリン酸で緩衝化された生食液（ＰＢＳ
Ｔ）で洗浄後、スキムミルク１％を含む５０ｍＭトリス
・塩酸で緩衝化された生食液（ｐＨ７．３）２００μＬ
でブロッキング処理した。ブロッキング液を捨ててＰＢ
ＳＴで洗浄後、各ウェルにハイブリドーマの培養上清６
０μＬと、ＢＳＡ２０ｍｇ／ｍＬを含む１０ｍＭリン酸
で緩衝化された生食液２０μＬを加え、４℃で一晩反応
させた。ウェルを、ＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴで２０
００倍に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）標識−ヤギ抗マウスＩｇＧ溶液（カッペル社）５０
μＬを加え、３７℃、４０分間反応させた。結合した酵
素の活性は、ＰＢＳＴで洗浄した各ウェルに、ｏ−フェ
ニレンジアミン０．５ｍｇ／ｍＬと過酸化水素０．０１
２％を含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．
３）１００μＬを加え、室温下に９分間発色反応させ、
ＥＬＩＳＡプレートリーダー（SLT-Lab Instruments
社）を用い、４９２ｎｍにおける吸光度の増加として測
定した。
【００２３】実験例２ ＥＬＩＳＡ結合阻害法 [Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンのヒト血清アルブミ
ン複合体（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ）
の調製]６．５ｍｇのＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン
（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ）を含む１Ｍ酢酸ナトリウ
ム溶液０．５ｍＬに、０．０８３Ｍグルタルアルデヒド
溶液１ｍＬを加えて攪拌し、３０秒間放置した。さら
に、１０．５ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含
む１Ｍ酢酸ナトリウム溶液０．５ｍＬを加えて攪拌し、
室温で３０分間反応させた。さらに、この反応液に水素
化ホウ素ナトリウム５ｍｇを加えて室温下に１０分間反
応させた後、１０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液３００ｍＬ
で、４回液を交換しながら、３時間４５分透析した。 ［Ｎ1−アセチルスペルミジンのヒト血清アルブミン複
合体（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ）の調製］３
ｍｇのＮ1−アセチルスペルミジン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐ
ｄ）を含む１Ｍ酢酸ナトリウム溶液０．５ｍＬに、０．
０２１Ｍグルタルアルデヒド溶液１ｍＬを加えて攪拌
し、３０秒間放置した。さらに、６ｍｇのＨＳＡを含む
１Ｍ酢酸ナトリウム溶液０．５ｍＬを加えて攪拌し、室
温で３０分間反応させた。さらに、この反応液に水素化
ホウ素ナトリウム２．５ｍｇを加えて室温下に１０分間
反応させた後、１０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液３００ｍＬ
で、４回液を交換しながら、３時間透析した。
ン複合体（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ）
の調製]６．５ｍｇのＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン
（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ）を含む１Ｍ酢酸ナトリウ
ム溶液０．５ｍＬに、０．０８３Ｍグルタルアルデヒド
溶液１ｍＬを加えて攪拌し、３０秒間放置した。さら
に、１０．５ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含
む１Ｍ酢酸ナトリウム溶液０．５ｍＬを加えて攪拌し、
室温で３０分間反応させた。さらに、この反応液に水素
化ホウ素ナトリウム５ｍｇを加えて室温下に１０分間反
応させた後、１０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液３００ｍＬ
で、４回液を交換しながら、３時間４５分透析した。 ［Ｎ1−アセチルスペルミジンのヒト血清アルブミン複
合体（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ）の調製］３
ｍｇのＮ1−アセチルスペルミジン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐ
ｄ）を含む１Ｍ酢酸ナトリウム溶液０．５ｍＬに、０．
０２１Ｍグルタルアルデヒド溶液１ｍＬを加えて攪拌
し、３０秒間放置した。さらに、６ｍｇのＨＳＡを含む
１Ｍ酢酸ナトリウム溶液０．５ｍＬを加えて攪拌し、室
温で３０分間反応させた。さらに、この反応液に水素化
ホウ素ナトリウム２．５ｍｇを加えて室温下に１０分間
反応させた後、１０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液３００ｍＬ
で、４回液を交換しながら、３時間透析した。
【００２４】［測定法］９６穴マイクロタイタープレー
ト（ヌンク社製 Nunc Immunoplate ＩＩ）の各ウェル
に、抗原としてＮ1−アセチルスペルミンのヒト血清ア
ルブミン複合体（Ｎ1−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−Ｈ
ＳＡ）、Ｎ1−アセチルスペルミジンのヒト血清アルブ
ミン複合体（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ）、又
は、Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンのヒト血清アルブ
ミン複合体（Ｎ1,Ｎ12−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ）
を１５μｇ／ｍＬ含む１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．５）２００μＬを入れ、４０℃で２０分間放置し
てコーティングした。次に、コーティング液を捨ててＰ
ＢＳＴで洗浄後、スキムミルク１％を含む５０ｍＭトリ
ス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）２００μＬでブロッキン
グ処理した。ブロッキング液を捨ててＰＢＳＴで洗浄
後、各ウェルに、ハイブリドーマ３株のそれぞれの培養
上清をＰＢＳＴで１００倍希釈した液５０μＬと、測定
対象物のスペルミン（Ｓｐｍ）、Ｎ1−アセチルスペル
ミジン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ）、Ｎ1−アセチルスペルミ
ン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ）、Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペ
ルミン（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ）等を、ＰＢＳＴで
各種濃度に希釈した液５０μＬを加え、３７℃で１．５
時間反応させた。ウェルを、ＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳ
Ｔで２０００倍に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ
標識−ヤギ抗マウスＩｇＧ溶液５０μＬを加え、３７
℃、４０分間反応させた。結合した酵素の活性は、ＰＢ
ＳＴで洗浄した各ウェルに、ｏ−フェニレンジアミン
０．５ｍｇ／ｍＬと過酸化水素０．０１２％を含む０．
１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．３）１００μＬを
加え、室温下に５分間発色反応させ、ＥＬＩＳＡプレー
トリーダー（SLT-Lab Instruments 社）を用い、４９２
ｎｍにおける吸光度の増加として測定した。
ト（ヌンク社製 Nunc Immunoplate ＩＩ）の各ウェル
に、抗原としてＮ1−アセチルスペルミンのヒト血清ア
ルブミン複合体（Ｎ1−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−Ｈ
ＳＡ）、Ｎ1−アセチルスペルミジンのヒト血清アルブ
ミン複合体（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ）、又
は、Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンのヒト血清アルブ
ミン複合体（Ｎ1,Ｎ12−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ）
を１５μｇ／ｍＬ含む１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．５）２００μＬを入れ、４０℃で２０分間放置し
てコーティングした。次に、コーティング液を捨ててＰ
ＢＳＴで洗浄後、スキムミルク１％を含む５０ｍＭトリ
ス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）２００μＬでブロッキン
グ処理した。ブロッキング液を捨ててＰＢＳＴで洗浄
後、各ウェルに、ハイブリドーマ３株のそれぞれの培養
上清をＰＢＳＴで１００倍希釈した液５０μＬと、測定
対象物のスペルミン（Ｓｐｍ）、Ｎ1−アセチルスペル
ミジン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ）、Ｎ1−アセチルスペルミ
ン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ）、Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペ
ルミン（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ）等を、ＰＢＳＴで
各種濃度に希釈した液５０μＬを加え、３７℃で１．５
時間反応させた。ウェルを、ＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳ
Ｔで２０００倍に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ
標識−ヤギ抗マウスＩｇＧ溶液５０μＬを加え、３７
℃、４０分間反応させた。結合した酵素の活性は、ＰＢ
ＳＴで洗浄した各ウェルに、ｏ−フェニレンジアミン
０．５ｍｇ／ｍＬと過酸化水素０．０１２％を含む０．
１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．３）１００μＬを
加え、室温下に５分間発色反応させ、ＥＬＩＳＡプレー
トリーダー（SLT-Lab Instruments 社）を用い、４９２
ｎｍにおける吸光度の増加として測定した。
【００２５】実施例１ Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミ
ンに対するモノクローナル抗体の作成［Ｎ1−アセチル
スペルミンのＢＳＡ複合体（抗原）の調製］ ５０ｍｇのＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物（Ａ
ＭＳ）を含むテトラヒドロフラン溶液１ｍＬを、２００
ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬに加えて攪拌し、１Ｎ
水酸化ナトリウム溶液でｐＨを７．０に保ちながら、室
温下に１時間反応させた。この反応液を、５ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ６．８）で膨潤化したセファデックスＧ−
７５のカラム（２ｃｍ×１００ｃｍ）にかけ、５ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で溶出した。誘導体化された
ＢＳＡ画分を集めて凍結乾燥し、ＡＭＳ化されたＢＳＡ
（ＡＭＳ−ＢＳＡ）１８０ｍｇを得た。ＢＳＡへのＳＨ
基の導入数は１７±０．５であった。次に、１０．４ｍ
ｇのＮ1−アセチルスペルミン・３塩酸塩を含む０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）１ｍＬに、１ｍｇのＮ−
(４−マレイミドブチルオキシ)コハク酸イミド（ＧＭＢ
Ｓ）を含むテトラヒドロフラン溶液０．５ｍＬを加え、
ｐＨを７付近に保ちながら、室温で１００分間反応さ
せ、ＧＭＢＳ化Ｎ1−アセチルスペルミン溶液を調製し
た。
ンに対するモノクローナル抗体の作成［Ｎ1−アセチル
スペルミンのＢＳＡ複合体（抗原）の調製］ ５０ｍｇのＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物（Ａ
ＭＳ）を含むテトラヒドロフラン溶液１ｍＬを、２００
ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬに加えて攪拌し、１Ｎ
水酸化ナトリウム溶液でｐＨを７．０に保ちながら、室
温下に１時間反応させた。この反応液を、５ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ６．８）で膨潤化したセファデックスＧ−
７５のカラム（２ｃｍ×１００ｃｍ）にかけ、５ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で溶出した。誘導体化された
ＢＳＡ画分を集めて凍結乾燥し、ＡＭＳ化されたＢＳＡ
（ＡＭＳ−ＢＳＡ）１８０ｍｇを得た。ＢＳＡへのＳＨ
基の導入数は１７±０．５であった。次に、１０．４ｍ
ｇのＮ1−アセチルスペルミン・３塩酸塩を含む０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）１ｍＬに、１ｍｇのＮ−
(４−マレイミドブチルオキシ)コハク酸イミド（ＧＭＢ
Ｓ）を含むテトラヒドロフラン溶液０．５ｍＬを加え、
ｐＨを７付近に保ちながら、室温で１００分間反応さ
せ、ＧＭＢＳ化Ｎ1−アセチルスペルミン溶液を調製し
た。
【００２６】一方、１７．３ｍｇのＡＭＳ−ＢＳＡを含
む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）０．２ｍＬに、
０．５Ｍヒドロキシルアミン溶液（ｐＨ７．０）５０μ
Ｌを加えて室温下に１０分間放置後、さらに、０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．９）２ｍＬを加えた。この溶液
と、先に調製したＧＭＢＳ化Ｎ1−アセチルスペルミン
溶液を混合してボルテックスミキサー攪拌後、１０ｍＭ
トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したセファ
デックスＧ−１００のカラム（２．２ｃｍ×４３ｃｍ）
にかけ、同緩衝液で溶出した。２８０ｎｍにおける蛋白
質吸収画分を集め、Ｎ1−アセチルスペルミンのＢＳＡ
複合体（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＢＳＡ）を得
た。また、同様の方法で、ヒト血清アルブミン（ＨＳ
Ａ）に対応するＮ1−アセチルスペルミンのＨＳＡ複合
体（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＨＳＡ）も調製し
た。
む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）０．２ｍＬに、
０．５Ｍヒドロキシルアミン溶液（ｐＨ７．０）５０μ
Ｌを加えて室温下に１０分間放置後、さらに、０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．９）２ｍＬを加えた。この溶液
と、先に調製したＧＭＢＳ化Ｎ1−アセチルスペルミン
溶液を混合してボルテックスミキサー攪拌後、１０ｍＭ
トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したセファ
デックスＧ−１００のカラム（２．２ｃｍ×４３ｃｍ）
にかけ、同緩衝液で溶出した。２８０ｎｍにおける蛋白
質吸収画分を集め、Ｎ1−アセチルスペルミンのＢＳＡ
複合体（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＢＳＡ）を得
た。また、同様の方法で、ヒト血清アルブミン（ＨＳ
Ａ）に対応するＮ1−アセチルスペルミンのＨＳＡ複合
体（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＨＳＡ）も調製し
た。
【００２７】［免疫]雌性ＢＡＬＢ/cマウスに、コンプ
リート・フロイント・アジュバントで乳化したＮ1−Ａ
ｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＢＳＡ抗原１００μｇを腹腔内
投与した。さらに、１００μｇのＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−
ＧＭＢＳ−ＢＳＡ抗原を１０ｍＭリン酸で緩衝化された
生食液（ＰＢＳ）で希釈したもので、２週間毎に、４回
追加免疫を行った。 ［細胞融合]５回目の最終感作を行ってから４日後に、
マウスの脾細胞を取り出し、これとミエローマ細胞Ｐ３
／ＮＳ−１／１Ａｇ４−１とを、４０％ポリエチレング
リコール１５００（ベーリンガー社）存在下に、Ｓｈｕ
ｌｍａｎらの方法に従って細胞融合した。次いで、融合
細胞は、９６穴培養プレート（コーニング社）を用い
て、ウェル当たり１０5 個の細胞密度で、ＨＡＴ培地中
で培養した。細胞融合後１０〜２０日目に、９６０ウェ
ル中７０８ウェル（７４％）に、細胞の増殖が認められ
た。
リート・フロイント・アジュバントで乳化したＮ1−Ａ
ｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＢＳＡ抗原１００μｇを腹腔内
投与した。さらに、１００μｇのＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−
ＧＭＢＳ−ＢＳＡ抗原を１０ｍＭリン酸で緩衝化された
生食液（ＰＢＳ）で希釈したもので、２週間毎に、４回
追加免疫を行った。 ［細胞融合]５回目の最終感作を行ってから４日後に、
マウスの脾細胞を取り出し、これとミエローマ細胞Ｐ３
／ＮＳ−１／１Ａｇ４−１とを、４０％ポリエチレング
リコール１５００（ベーリンガー社）存在下に、Ｓｈｕ
ｌｍａｎらの方法に従って細胞融合した。次いで、融合
細胞は、９６穴培養プレート（コーニング社）を用い
て、ウェル当たり１０5 個の細胞密度で、ＨＡＴ培地中
で培養した。細胞融合後１０〜２０日目に、９６０ウェ
ル中７０８ウェル（７４％）に、細胞の増殖が認められ
た。
【００２８】［細胞の選択]各ウェルの培養上清中の抗
体価を、実験例１の「抗体のスクリーニング法」で検索
し、免疫反応陽性の細胞３個を得た。これらを限界希釈
法でクローン化し、継続的に抗体を産生する細胞、ＡＣ
ＳＰＭ−１、ＡＣＳＰＭ−２、ＡＣＳＰＭ−３の３株を
樹立した。さらに、これら３株の抗原部位への反応性を
確認するため、抗原作成時に副生する可能性のあるＧＭ
ＢＡ−ＨＳＡ（ＡＭＳ−ＨＳＡにスペーサーのＧＭＢＡ
を導入したもの）も調製し、実験例１の抗原Ｎ1−Ａｃ
−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＨＳＡの代わりに、ＧＭＢＡ−Ｈ
ＳＡ、ＡＭＳ−ＨＳＡ（ＨＳＡにＳＨ基を導入したも
の）やキャリア蛋白そのもののＨＳＡをコーティングし
たプレートも調製し、倍々希釈したＡＣＳＰＭ−１株、
ＡＣＳＰＭ−２株、ＡＣＳＰＭ−３株の培養上清との反
応性を確認した。結果を、それぞれ図１〜図３に示し
た。いずれの培養上清も、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢ
Ｓ−ＨＳＡにのみ反応し、ＧＭＢＡ−ＨＳＡ、ＡＭＳ−
ＨＳＡやＨＳＡとは、全く反応しなかった。 ［クローン細胞のサブタイプ］各クローン細胞が産生す
る免疫グロブリンのサブタイプは、マウスモノクローナ
ルSub-isotyping キット（Zymed 社コードＮｏ．９７−
６５５０）を用いて決定した。その結果、０５２０抗体
（ＡＣＳＰＭ−１株）と４９１４抗体（ＡＣＳＰＭ−２
株）はＩｇＧ1、８６２４抗体（ＡＣＳＰＭ−３株）が
ＩｇＧ2bであった。
体価を、実験例１の「抗体のスクリーニング法」で検索
し、免疫反応陽性の細胞３個を得た。これらを限界希釈
法でクローン化し、継続的に抗体を産生する細胞、ＡＣ
ＳＰＭ−１、ＡＣＳＰＭ−２、ＡＣＳＰＭ−３の３株を
樹立した。さらに、これら３株の抗原部位への反応性を
確認するため、抗原作成時に副生する可能性のあるＧＭ
ＢＡ−ＨＳＡ（ＡＭＳ−ＨＳＡにスペーサーのＧＭＢＡ
を導入したもの）も調製し、実験例１の抗原Ｎ1−Ａｃ
−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＨＳＡの代わりに、ＧＭＢＡ−Ｈ
ＳＡ、ＡＭＳ−ＨＳＡ（ＨＳＡにＳＨ基を導入したも
の）やキャリア蛋白そのもののＨＳＡをコーティングし
たプレートも調製し、倍々希釈したＡＣＳＰＭ−１株、
ＡＣＳＰＭ−２株、ＡＣＳＰＭ−３株の培養上清との反
応性を確認した。結果を、それぞれ図１〜図３に示し
た。いずれの培養上清も、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢ
Ｓ−ＨＳＡにのみ反応し、ＧＭＢＡ−ＨＳＡ、ＡＭＳ−
ＨＳＡやＨＳＡとは、全く反応しなかった。 ［クローン細胞のサブタイプ］各クローン細胞が産生す
る免疫グロブリンのサブタイプは、マウスモノクローナ
ルSub-isotyping キット（Zymed 社コードＮｏ．９７−
６５５０）を用いて決定した。その結果、０５２０抗体
（ＡＣＳＰＭ−１株）と４９１４抗体（ＡＣＳＰＭ−２
株）はＩｇＧ1、８６２４抗体（ＡＣＳＰＭ−３株）が
ＩｇＧ2bであった。
【００２９】実施例２ モノクローナル抗体の特異性 作成したモノクローナル抗体の特異性は、抗体の固相化
抗原への結合を、測定対象物質がどの程度阻害するかを
検出する系、「ＥＬＩＳＡ結合阻害法」で評価した。即
ち、実験例２の方法に従い、３つの抗原、Ｎ1−Ａｃ−
Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＨＳＡ、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ
−ＨＳＡ、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ
を、それぞれ固相化したプレートを用いて、各濃度のポ
リアミン類が、抗体と固相化抗原との反応を、どの程度
阻害するかを評価した。免疫原に相当するＮ1−Ａｃ−
Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＨＳＡを固相化した系では、検討し
たポリアミン類の何れによっても全く阻害されず、測定
系としては不適切であった。一方、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ
−ＧＡ−ＨＳＡ、又は、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−Ｇ
Ａ−ＨＳＡを固相化した系では、検討した各成分、Ｓｐ
ｍ、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ、Ｎ1,Ｎ12
−２Ａｃ−Ｓｐｍによって、図４〜９に示した結合阻害
曲線（検量線）が得られた。０５２０、４９１４、８６
２４のいずれの抗体も、Ｎ1−Ａｃ−ＳｐｍとＮ1,Ｎ12
−２Ａｃ−Ｓｐｍに強く、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄと極めて
弱く反応（阻害）し、Ｓｐｍとは全く反応（阻害）しな
かった。図から、これらの抗体を用いてポリアミン類を
測定した場合の測定感度を５０％結合阻害濃度（ＥＣ50
値）として求め、結果を表１に示した。
抗原への結合を、測定対象物質がどの程度阻害するかを
検出する系、「ＥＬＩＳＡ結合阻害法」で評価した。即
ち、実験例２の方法に従い、３つの抗原、Ｎ1−Ａｃ−
Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＨＳＡ、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ
−ＨＳＡ、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ
を、それぞれ固相化したプレートを用いて、各濃度のポ
リアミン類が、抗体と固相化抗原との反応を、どの程度
阻害するかを評価した。免疫原に相当するＮ1−Ａｃ−
Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＨＳＡを固相化した系では、検討し
たポリアミン類の何れによっても全く阻害されず、測定
系としては不適切であった。一方、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ
−ＧＡ−ＨＳＡ、又は、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−Ｇ
Ａ−ＨＳＡを固相化した系では、検討した各成分、Ｓｐ
ｍ、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ、Ｎ1,Ｎ12
−２Ａｃ−Ｓｐｍによって、図４〜９に示した結合阻害
曲線（検量線）が得られた。０５２０、４９１４、８６
２４のいずれの抗体も、Ｎ1−Ａｃ−ＳｐｍとＮ1,Ｎ12
−２Ａｃ−Ｓｐｍに強く、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄと極めて
弱く反応（阻害）し、Ｓｐｍとは全く反応（阻害）しな
かった。図から、これらの抗体を用いてポリアミン類を
測定した場合の測定感度を５０％結合阻害濃度（ＥＣ50
値）として求め、結果を表１に示した。
【００３０】なお、図４はＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−
ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での０５２０
抗体の特異性を、図５は、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−
ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での４９１４
抗体の特異性を、図６は、Ｎ 1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−
ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での８６２４
抗体の特異性を、図７は、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−
ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での０５２０抗体の
特異性を、図８は、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ
固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での４９１４抗体の特異性
を、図９は、Ｎ 1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化
ＥＬＩＳＡ結合阻害法での８６２４抗体の特異性を示し
たものである。
ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での０５２０
抗体の特異性を、図５は、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−
ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での４９１４
抗体の特異性を、図６は、Ｎ 1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−
ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での８６２４
抗体の特異性を、図７は、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−
ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での０５２０抗体の
特異性を、図８は、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ
固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での４９１４抗体の特異性
を、図９は、Ｎ 1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化
ＥＬＩＳＡ結合阻害法での８６２４抗体の特異性を示し
たものである。
【００３１】０５２０、４９１４、８６２４のいずれの
抗体も、Ｎ1−Ａｃ−ＳｐｍとＮ1，Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐ
ｍに特異的であった。平松ら（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１
１７ｐ１０７−１１２（１９９５））やＧ．Ａ．ｖａｎ
ｄｅｎ Ｂｅｒｇら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３２（１
０） ｐ１９３０−１９３７（１９８６））によると、
尿中のＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍ濃度は、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−
Ｓｐｍより著しく低いことから、この測定法で、実質的
に尿中のＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ濃度を反映する測定
値を得ることができる。
抗体も、Ｎ1−Ａｃ−ＳｐｍとＮ1，Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐ
ｍに特異的であった。平松ら（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１
１７ｐ１０７−１１２（１９９５））やＧ．Ａ．ｖａｎ
ｄｅｎ Ｂｅｒｇら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３２（１
０） ｐ１９３０−１９３７（１９８６））によると、
尿中のＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍ濃度は、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−
Ｓｐｍより著しく低いことから、この測定法で、実質的
に尿中のＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ濃度を反映する測定
値を得ることができる。
【００３２】
【表１】
【００３３】実施例３ ９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製 Nunc Im
munoplate）の各ｗｅｌｌに抗原としてＮ1，Ｎ12−２Ａ
ｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡを１６．１μｇ／ｍＬ含む１
０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）１５０μＬを
入れ、４０℃で３０分間放置してコーティングした。次
にＰＢＳＴ３００μＬで洗浄後、スキムミルク１％を含
む５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）３００μ
ｌでブロッキング処理した。ＰＢＳＴで洗浄後、各ｗｅ
ｌｌにＡＣＳＰＭ−１の培養上清をＰＢＳＴで２５倍希
釈した液５０μＬと、測定対象物のＰｕｔ（プトレッシ
ン）、Ａｃ−Ｐｕｔ、Ｏｒｎ（オルニチン）、Ｃａｄ
（カダベリン）、Ｓｐｄ、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ、Ｎ8−Ａ
ｃ−Ｓｐｄ、Ｎ1,Ｎ8−２Ａｃ−Ｓｐｄ、Ｓｐｍ、Ｎ1−
Ａｃ−Ｓｐｍ、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−ＳｐｍをＰＢＳＴで
各種濃度に希釈した液５０μＬを加え、４℃で一晩反応
させた。各ウェルをＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴで２０
００倍に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）−ビオ
チン（ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＱＵＡＬＥＸ社）１００μＬ
を加え、室温で１．５時間反応し、ＰＢＳＴで洗浄後、
ＰＢＳＴで３０００倍希釈したＨＲＰ−ストレプトアビ
ジン（フナコシ社）１００μＬを加え、室温で３０分反
応させた。結合した酵素の活性は、ＰＢＳＴで洗浄した
各ｗｅｌｌに、ｏ−フェニレンジアミン０．５ｍｇ／ｍ
Ｌと過酸化水素０．０１２％を含む０．１Ｍクエン酸・
リン酸緩衝液（ｐＨ５．３）１００μＬを加え、室温下
に６分間反応させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（SLT-
Lab Instruments 社）を用い、４９２ｎｍにおける吸光
度の増加として測定した。結果を図１０に示した。図１
０から明らかなようにこの反応系によれば、Ｎ1，Ｎ12
−２Ａｃ−Ｓｐｍに対する特異性が向上していることが
判る。
munoplate）の各ｗｅｌｌに抗原としてＮ1，Ｎ12−２Ａ
ｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡを１６．１μｇ／ｍＬ含む１
０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）１５０μＬを
入れ、４０℃で３０分間放置してコーティングした。次
にＰＢＳＴ３００μＬで洗浄後、スキムミルク１％を含
む５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）３００μ
ｌでブロッキング処理した。ＰＢＳＴで洗浄後、各ｗｅ
ｌｌにＡＣＳＰＭ−１の培養上清をＰＢＳＴで２５倍希
釈した液５０μＬと、測定対象物のＰｕｔ（プトレッシ
ン）、Ａｃ−Ｐｕｔ、Ｏｒｎ（オルニチン）、Ｃａｄ
（カダベリン）、Ｓｐｄ、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ、Ｎ8−Ａ
ｃ−Ｓｐｄ、Ｎ1,Ｎ8−２Ａｃ−Ｓｐｄ、Ｓｐｍ、Ｎ1−
Ａｃ−Ｓｐｍ、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−ＳｐｍをＰＢＳＴで
各種濃度に希釈した液５０μＬを加え、４℃で一晩反応
させた。各ウェルをＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴで２０
００倍に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）−ビオ
チン（ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＱＵＡＬＥＸ社）１００μＬ
を加え、室温で１．５時間反応し、ＰＢＳＴで洗浄後、
ＰＢＳＴで３０００倍希釈したＨＲＰ−ストレプトアビ
ジン（フナコシ社）１００μＬを加え、室温で３０分反
応させた。結合した酵素の活性は、ＰＢＳＴで洗浄した
各ｗｅｌｌに、ｏ−フェニレンジアミン０．５ｍｇ／ｍ
Ｌと過酸化水素０．０１２％を含む０．１Ｍクエン酸・
リン酸緩衝液（ｐＨ５．３）１００μＬを加え、室温下
に６分間反応させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（SLT-
Lab Instruments 社）を用い、４９２ｎｍにおける吸光
度の増加として測定した。結果を図１０に示した。図１
０から明らかなようにこの反応系によれば、Ｎ1，Ｎ12
−２Ａｃ−Ｓｐｍに対する特異性が向上していることが
判る。
【００３４】実施例４ 最適化されたＥＬＩＳＡ結合阻
害法でのモノクローナル抗体の特異性 実験例２の測定法を改良し、再度、抗体の特異性と測定
感度を確認した。９６穴マイクロタイタープレート（ヌ
ンク社製 Nunc Immunoplate II)の各ウェルに、抗原と
してＮ1−アセチルスペルミンのヒト血清アルブミン複
合体（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ）、又は、
Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンのヒト血清アルブミン
複合体（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ）１
５μｇ／ｍＬを含む１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ
８．５）１５０μＬを入れ、４０℃で３０分間放置して
コーティングした。次に、コーティング液を捨ててＰＢ
ＳＴで洗浄後、スキムミルク１％を含む５０ｍＭトリス
・塩酸で緩衝液（ｐＨ７．４）３００μＬ加え、３７℃
で１時間ブロッキング処理した。
害法でのモノクローナル抗体の特異性 実験例２の測定法を改良し、再度、抗体の特異性と測定
感度を確認した。９６穴マイクロタイタープレート（ヌ
ンク社製 Nunc Immunoplate II)の各ウェルに、抗原と
してＮ1−アセチルスペルミンのヒト血清アルブミン複
合体（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ）、又は、
Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンのヒト血清アルブミン
複合体（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ）１
５μｇ／ｍＬを含む１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ
８．５）１５０μＬを入れ、４０℃で３０分間放置して
コーティングした。次に、コーティング液を捨ててＰＢ
ＳＴで洗浄後、スキムミルク１％を含む５０ｍＭトリス
・塩酸で緩衝液（ｐＨ７．４）３００μＬ加え、３７℃
で１時間ブロッキング処理した。
【００３５】ブロッキング液を捨ててＰＢＳＴで洗浄
後、各ウェルに、ハイブリドーマ３株のそれぞれの培養
上清液を表２に示した倍率（２００〜２０,０００倍）
にＰＢＳＴで希釈した液２５μＬと、測定対象物のスペ
ルミン（Ｓｐｍ）、Ｎ1,Ｎ8−ジアセチルスペルミジン
（Ｎ1,Ｎ8−２Ａｃ−Ｓｐｄ）、Ｎ1−アセチルスペルミ
ジン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ）、Ｎ1−アセチルスペルミン
（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ）、Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペル
ミン（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ）をＰＢＳＴで各濃度
に希釈した液７５μＬを加え、室温下に３時間反応させ
た。ウェルをＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴで２０００倍
に希釈したビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体溶液５
０μＬを加え、室温下に１時間反応させた。ウェルを再
びＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴで３０００倍に希釈した
西洋わさびペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン溶
液５０μＬを加え、室温下に３０分間反応させた。
後、各ウェルに、ハイブリドーマ３株のそれぞれの培養
上清液を表２に示した倍率（２００〜２０,０００倍）
にＰＢＳＴで希釈した液２５μＬと、測定対象物のスペ
ルミン（Ｓｐｍ）、Ｎ1,Ｎ8−ジアセチルスペルミジン
（Ｎ1,Ｎ8−２Ａｃ−Ｓｐｄ）、Ｎ1−アセチルスペルミ
ジン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ）、Ｎ1−アセチルスペルミン
（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ）、Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペル
ミン（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ）をＰＢＳＴで各濃度
に希釈した液７５μＬを加え、室温下に３時間反応させ
た。ウェルをＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴで２０００倍
に希釈したビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体溶液５
０μＬを加え、室温下に１時間反応させた。ウェルを再
びＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴで３０００倍に希釈した
西洋わさびペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン溶
液５０μＬを加え、室温下に３０分間反応させた。
【００３６】結合した酵素の活性は、ＰＢＳＴで洗浄し
た各ウェルに、ｏ−フェニレンジアミン０．５ｍｇ／ｍ
Ｌと過酸化水素０．０１２％を含む０．１Ｍクエン酸リ
ン酸緩衝液（ｐＨ５．３）１００μＬを加え、室温下に
５分間発色反応させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（SL
T-Lab Instruments社）を用い、４９２ｎｍにおける吸
光度の増加として測定した。結果を表２にまとめた。測
定系を改良し、抗体の希釈倍率を上げることにより、Ｎ
1,Ｎ12−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡを固相化した系の
測定感度と特異性は、大幅に向上した。即ち、Ｎ1,Ｎ12
−Ａｃ−Ｓｐｍの測定感度は、０５２０抗体が８倍、４
９１４抗体が２２倍、８６２４抗体が７０倍に向上し、
５０％結合阻害濃度で比較した感度は、０．０６〜０．
２μＭになった。また、特異性をＮ1,Ｎ12−Ａｃ−Ｓｐ
ｍによる５０％結合阻害活性とＮ1−Ａｃ−Ｓｐｄによ
る５０％結合阻害活性との比として表現した場合、０５
２０抗体が４８倍、４９１４抗体が１１７倍、８６２４
抗体が４５倍となり、何れも改良前より向上した。
た各ウェルに、ｏ−フェニレンジアミン０．５ｍｇ／ｍ
Ｌと過酸化水素０．０１２％を含む０．１Ｍクエン酸リ
ン酸緩衝液（ｐＨ５．３）１００μＬを加え、室温下に
５分間発色反応させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（SL
T-Lab Instruments社）を用い、４９２ｎｍにおける吸
光度の増加として測定した。結果を表２にまとめた。測
定系を改良し、抗体の希釈倍率を上げることにより、Ｎ
1,Ｎ12−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡを固相化した系の
測定感度と特異性は、大幅に向上した。即ち、Ｎ1,Ｎ12
−Ａｃ−Ｓｐｍの測定感度は、０５２０抗体が８倍、４
９１４抗体が２２倍、８６２４抗体が７０倍に向上し、
５０％結合阻害濃度で比較した感度は、０．０６〜０．
２μＭになった。また、特異性をＮ1,Ｎ12−Ａｃ−Ｓｐ
ｍによる５０％結合阻害活性とＮ1−Ａｃ−Ｓｐｄによ
る５０％結合阻害活性との比として表現した場合、０５
２０抗体が４８倍、４９１４抗体が１１７倍、８６２４
抗体が４５倍となり、何れも改良前より向上した。
【００３７】
【表２】
【００３８】実施例５ ４９１４モノクローナル抗体の
特異性 実施例４で最も測定感度と特異性の高かった４９１４モ
ノクローナル抗体を用い、実施例３の方法でプトレッシ
ン（Ｐｕｔ）、アセチルプトレッシン（Ａｃ−Ｐｕ
ｔ）、Ｌ−オルニチン（Ｏｒｎ）、カダベリン（Ｃａ
ｄ）、スペルミジン（Ｓｐｄ）、Ｎ8−アセチルスペル
ミジン（Ｎ8−Ａｃ−Ｓｐｄ）、Ｎ1−アセチルスペルミ
ジン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ）、Ｎ1,Ｎ8−ジアセチルスペ
ルミジン（Ｎ1,Ｎ8−２Ａｃ−Ｓｐｄ）、スペルミン
（Ｓｐｍ）、Ｎ1−アセチルスペルミン（Ｎ 1−Ａｃ−Ｓ
ｐｍ）やＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン（Ｎ1,Ｎ12−
２Ａｃ−Ｓｐｍ）の希釈系列を測定し、４９１４モノク
ローナル抗体の特異性検討した。図１１のように、この
測定系は、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍに特異的で、Ｎ1
−Ａｃ−ＳｐｍとはＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの２４
％、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄとは０．８５％、Ｎ1,Ｎ8−２Ａ
ｃ−Ｓｐｄとは０．６％、Ｓｐｍとは０．１％、その他
のポリアミン類とはほとんど反応しなかった。
特異性 実施例４で最も測定感度と特異性の高かった４９１４モ
ノクローナル抗体を用い、実施例３の方法でプトレッシ
ン（Ｐｕｔ）、アセチルプトレッシン（Ａｃ−Ｐｕ
ｔ）、Ｌ−オルニチン（Ｏｒｎ）、カダベリン（Ｃａ
ｄ）、スペルミジン（Ｓｐｄ）、Ｎ8−アセチルスペル
ミジン（Ｎ8−Ａｃ−Ｓｐｄ）、Ｎ1−アセチルスペルミ
ジン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ）、Ｎ1,Ｎ8−ジアセチルスペ
ルミジン（Ｎ1,Ｎ8−２Ａｃ−Ｓｐｄ）、スペルミン
（Ｓｐｍ）、Ｎ1−アセチルスペルミン（Ｎ 1−Ａｃ−Ｓ
ｐｍ）やＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン（Ｎ1,Ｎ12−
２Ａｃ−Ｓｐｍ）の希釈系列を測定し、４９１４モノク
ローナル抗体の特異性検討した。図１１のように、この
測定系は、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍに特異的で、Ｎ1
−Ａｃ−ＳｐｍとはＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの２４
％、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄとは０．８５％、Ｎ1,Ｎ8−２Ａ
ｃ−Ｓｐｄとは０．６％、Ｓｐｍとは０．１％、その他
のポリアミン類とはほとんど反応しなかった。
【００３９】実施例６ 健常者の尿中Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ
−Ｓｐｍの測定 実施例５の方法で、健常者の尿検体１６例（男性８例、
女性８例）の希釈系列を測定し、尿中のＮ1,Ｎ12−２Ａ
ｃ−Ｓｐｍ濃度を求めた。測定例の一部を図１２に示し
た。男子及び女子８例ずつの平均値±ＳＤは、それぞれ
０．３４±０．１６、０．３９±０．１４μＭ／ｇ−ク
レアチニンで、全体の平均値は０．３６μＭ／ｇ−クレ
アチニンであった。平松らの報告（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１１７ｐ１０７−１１２（１９９５））によると、
尿中におけるＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ：Ｎ1−Ａｃ−
Ｓｐｍ：Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ：Ｎ1,Ｎ8−２Ａｃ−Ｓｐｄ
の存在比は、３．２％：１．０％：８６．２％：９．６
％であることが報告されている。この測定系の特異性か
らすれば、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ以外のポリアミン
成分の影響は軽微と考えられ、尿中のＮ1,Ｎ12−２Ａｃ
−Ｓｐｍは、ほぼ正確に測定されているものと考えられ
る。
−Ｓｐｍの測定 実施例５の方法で、健常者の尿検体１６例（男性８例、
女性８例）の希釈系列を測定し、尿中のＮ1,Ｎ12−２Ａ
ｃ−Ｓｐｍ濃度を求めた。測定例の一部を図１２に示し
た。男子及び女子８例ずつの平均値±ＳＤは、それぞれ
０．３４±０．１６、０．３９±０．１４μＭ／ｇ−ク
レアチニンで、全体の平均値は０．３６μＭ／ｇ−クレ
アチニンであった。平松らの報告（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１１７ｐ１０７−１１２（１９９５））によると、
尿中におけるＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ：Ｎ1−Ａｃ−
Ｓｐｍ：Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ：Ｎ1,Ｎ8−２Ａｃ−Ｓｐｄ
の存在比は、３．２％：１．０％：８６．２％：９．６
％であることが報告されている。この測定系の特異性か
らすれば、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ以外のポリアミン
成分の影響は軽微と考えられ、尿中のＮ1,Ｎ12−２Ａｃ
−Ｓｐｍは、ほぼ正確に測定されているものと考えられ
る。
【００４０】
【発明の効果】本発明のＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミ
ンと反応するモノクローナル抗体は、尿等の検体中のＮ
1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンを測定することができ、
癌の診断に有用である。
ンと反応するモノクローナル抗体は、尿等の検体中のＮ
1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンを測定することができ、
癌の診断に有用である。
【図１】ＡＣＳＰＭ−１株培養上清液の免疫原への特異
性
性
【図２】ＡＣＳＰＭ−２株培養上清液の免疫原への特異
性
性
【図３】ＡＣＳＰＭ−３株培養上清液の免疫原への特異
性
性
【図４】Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ固相
化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での０５２０抗体の特異性
化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での０５２０抗体の特異性
【図５】Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ固相
化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での４９１４抗体の特異性
化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での４９１４抗体の特異性
【図６】Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ固相
化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での８６２４抗体の特異性
化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での８６２４抗体の特異性
【図７】Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬ
ＩＳＡ結合阻害法での０５２０抗体の特異性
ＩＳＡ結合阻害法での０５２０抗体の特異性
【図８】Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬ
ＩＳＡ結合阻害法での４９１４抗体の特異性
ＩＳＡ結合阻害法での４９１４抗体の特異性
【図９】Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬ
ＩＳＡ結合阻害法での８６２４抗体の特異性
ＩＳＡ結合阻害法での８６２４抗体の特異性
【図１０】Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ固
相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での０５２０抗体の特異性
相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での０５２０抗体の特異性
【図１１】Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ固
相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での４９１４抗体の特異性
相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での４９１４抗体の特異性
【図１２】Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの検量線及び尿検
体中のＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの濃度
体中のＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの濃度
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (9)
- 【請求項１】固相化若しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−ジアセチ
ルスペルミン又は固相化若しくは標識化Ｎ1−アセチル
スペルミンと抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノク
ローナル抗体の免疫反応を利用した検体中のＮ1,Ｎ12−
ジアセチルスペルミンの測定系を組んだ場合に、Ｎ1,Ｎ
12−ジアセチルスペルミンによる該免疫反応の阻害活性
がＮ1−アセチルスペルミジンによる該免疫反応の阻害
活性の２０倍以上となる測定条件を選択することが可能
になる抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクロナー
ル抗体。 - 【請求項２】固相化若しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−ジアセチ
ルスペルミン又は固相化若しくは標識化Ｎ1−アセチル
スペルミンとの免疫反応が５０％阻害されるＮ1,Ｎ12−
ジアセチルスペルミンの濃度が２０μＭ以下となる測定
条件を選択することが可能になる請求項１記載のモノク
ローナル抗体。 - 【請求項３】検体が尿検体である請求項１又は２記載の
モノクローナル抗体。 - 【請求項４】モノクローナル抗体０５２０，４９１４又
は８６２４。 - 【請求項５】請求項１、２、３又は４記載のモノクロー
ナル抗体を産生する細胞株。 - 【請求項６】固相化若しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−ジアセチ
ルスペルミン又は固相化若しくは標識化Ｎ1−アセチル
スペルミンと抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノク
ローナル抗体の免疫反応を利用して検体中のＮ1,Ｎ12−
ジアセチルスペルミンを測定する際に、その測定条件に
おけるＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンによる該免疫反
応の阻害活性がＮ1−アセチルスペルミジンによる該免
疫反応の阻害活性の２０倍以上となる抗Ｎ1,Ｎ12−ジア
セチルスペルミンモノクローナル抗体を用いることを特
徴とするＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンの測定法。 - 【請求項７】抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノク
ローナル抗体が、測定条件において固相化若しくは標識
化Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン又は固相化若しくは
標識化Ｎ1−アセチルスペルミンとの免疫反応を５０％
阻害するＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンの濃度が２０
μＭ以下となる抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノ
クローナル抗体である請求項６記載の測定法。 - 【請求項８】抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノク
ローナル抗体がモノクローナル抗体０５２０，４９１４
又は８６２４である請求項７記載の測定法。 - 【請求項９】検体が尿検体である請求項６、７又は８記
載の測定法。
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|---|---|---|---|
| JP17436198A JP4663831B2 (ja) | 1997-07-09 | 1998-06-22 | モノクローナル抗体、細胞株及びｎ１，ｎ１２−ジアセチルスペルミンの測定法 |
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|---|---|---|---|
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| JP9-198016 | 1997-07-09 | ||
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-
1998
- 1998-06-22 JP JP17436198A patent/JP4663831B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
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