JPH09502863A - Mhc分子hla−c−クローン10と複合体を形成する分離されたペプチドとその利用方法 - Google Patents
Mhc分子hla−c−クローン10と複合体を形成する分離されたペプチドとその利用方法Info
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Abstract
(57)【要約】
腫瘍拒絶抗原先駆体の新規なファミリと、これらをコード化する核酸分子とが開示される。これらの腫瘍拒絶抗原先駆体は、BAGE腫瘍拒絶抗原先駆体と称され、これらをコード化する前記核酸分子は、BAGEコード化分子と称される。前記コード化シーケンスと前記腫瘍拒絶抗原先駆体の様々な診断上及び治療上の使用方法が記載される。
Description
【発明の詳細な説明】
MHC分子HLA−C−クローン10と複合体を
形成する分離されたペプチドとその利用方法関連出願
本出願は、1993年6月17日に出願され現在係属中の出願第08/079
,110号の一部継続出願である。発明の分野
本発明は、病状の診断及び治療に於て有用なペプチドに関する。詳しくは、プ
ロセッシングされることによりMHC分子HLA−C−クローン10によって提
示されるペプチドと、その提示されたペプチド自身とに関する。これらのペプチ
ドは、診断及び治療において有用である。背景及び従来技術
ほ乳類の免疫システムが外来の又は異質の物質を認識し、これに対して反応す
るプロセスは複雑である。このシステムの重要な一面は、T細胞応答である。こ
の応答は、T細胞がヒト白血球抗原(HLA)、又は主要組織適合抗原(MHC
s)と呼ばれる細胞表面分子とペプチドとの複合体を認識し、これと相互作用す
ることを必要
とする。前記ペプチドは、前記HLA/MHC分子も提示する細胞によってプロ
セッシングされるより大きな分子から誘導される。この点に関しては、メール(
Male)他の”Advanced Immunology”(J.P.Lip
incot Company,1987)、特にその第6〜10章を参照。前記
T細胞とHLA/ペプチド複合体との相互作用は、HLA分子とペプチドの特定
の組合せに特異的なT細胞を必要とする点で、限定されたものである。たとえ、
特定の複合体が存在しても、特異的なT細胞が存在しなければT細胞応答は起こ
らない。同様に、T細胞が存在しても、特異的な複合体が存在しなければ応答は
起こらない。このメカニズムは、免疫システムの、自己免疫病状に於ける外来の
物質に対する応答や、細胞異常に対する応答に関係している。最近、タンパク質
がHLA結合ペプチドにプロセッシングされるメカニズムに関して多くの研究が
行われている。この点に関して、バリナガ(Barinaga),Scienc
e 257:880(1992);フリーモント(Fremont)他、Sci
ence257:919(1992):マツムラ(Matsumura)他、S
cience 257:927(1992)、ラトロン(Latron)他、S
cience 257:
964(1992)参照。
T細胞が細胞異常を認識するメカニズムは癌にも関連付けられてきた。例えば
、ここに参考文献として添付される1992年5月22日出願、1992年11
月26日公開のPCT出願PCT/US92/04354には、細胞表面上に発
現されるペプチドにプロセッシングされ、特定のCTLによる腫瘍細胞の溶解を
可能にする遺伝子の一つのファミリが開示されている。これらの遺伝子は、「腫
瘍拒絶抗原先駆体」、即ち、”TRAP”分子をコード化するものであると言わ
れており、これらから誘導されるペプチドは、「腫瘍拒絶抗原」、又は、”TR
As”と呼ばれている。この遺伝子ファミリの詳細については、トラヴァーサリ
(Traversari)他、immunogenetics 35:145(
1992):ファン・デア・ブルッゲン(van der Bruggen)他
、Science 254:1643(1991)参照。又、1991年12月
12日出願で現在は米国特許第5,342,774号である米国特許出願第80
7,043号参照。
この開示内容をここに参考文献として添付する米国特許出願第938,334
号には、前記HLA−A1分子によって提示されるノナペプチドが教示されてい
る。こ
の参考文献は、特定のHLA分子に対する特定のペプチドの特異性が既知であれ
ば、特定のペプチドが一つのHLA分子と結合し、他の分子には結合しないと予
期される、と教示している。これは重要である。というのは、保存するHLA表
現型は個体それぞれで異なるからである。その結果、ある特定のペプチドが特異
的HLA分子のパートナとして同定されることが様々な診断上又は治療上の派生
効果を有するとしても、これらはこの特定のHLA表現型を保有する個体にしか
関連性を有していないことになる。細胞異常は一つの特定のHLA表現型に限ら
れている訳ではないので、この分野において更に研究が必要であり、標的治療の
為には対象となる異常細胞の表現型に関するいくらかの知識が必要である。
ここに参考文献として添付する1993年1月22日出願の米国特許出願第0
08,446号には、MAGE−1発現生成物が、第2のTRAにプロセッシン
グされるという事実が開示されている。この第2のTRAは、HLA−Cクロー
ン10−分子によって提示される。この開示には、あるTRAPが複数のTRA
を産生することが可能であることが示されている。
ここに参考文献として添付する1992年12月22日出願の米国特許出願第
994,928号にはチロシナ
ーゼが腫瘍拒絶抗原先駆体として記載されている。この文献には、いくつかの正
常細胞(例えば、メラニン細胞)によって生成される分子が、腫瘍細胞内でプロ
セッシングされてHLA−A2によって提示される腫瘍拒絶抗原を作ることが開
示されている。
ここに参考文献として添付する1993年3月18日出願の米国特許出願第0
8/032,978号には、チロシナーゼから誘導されたのではない第2のTR
Aが、HLA−A2分子によって提示されることが教示されている。このTRA
は、TRAPから誘導されるものではあるが、非MAGE遺伝子によってコード
化される。この開示は、特定のHLA分子が、異なった起源から誘導されたTR
Aを提示する可能性があるということを示している。
本発明の親出願でありここのその全部を参考文献として添付する1993年1
月17日出願の米国特許出願第08/079,110号には、そこにおいてBA
GEファミリと称されているところの遺伝子の新規なファミリが開示された。こ
れらの遺伝子は、腫瘍拒絶抗原先駆体もコード化することが観察された。該出願
に於て、HLA−C−クローン10として知られている前記MHC分子がBAG
E腫瘍拒絶抗原先駆体から誘導された腫瘍
拒絶抗原を提示することが観察されたが、前記腫瘍拒絶抗原は開示されなかった
。本出願は、ここで配列認識番号(SEQ ID NO):10と称するこのペ
プチドと、このペプチドの同定から派生するその他の派生効果とを扱う。
本発明及びその他の様々な側面を、以下の開示において詳述する。図面の簡単な説明
図1は、様々な細胞系に対してCTLクローン82/82を使用したクロム放
出アッセイの結果を示している。
図2は、CTLクローン82/82を、様々な細胞系のパネルに対して使用し
たTNF放出アッセイを結果を示している。
図3は、トランスフェクションされたCOS細胞を使用したTNF放出アッセ
イの結果を示している。
図4は、CTLクローン82/82を使用した様々なトランスフェクション体
のテスト結果とTNF放出測定を示している。
図5は、細胞溶解性T細胞クローンCTL 82/82を配列認識番号(SE
Q ID NO):10のペプチドで刺激した後、細胞の半最大溶解を測定する
ために行
った研究によって得られた結果を示している。好適実施例の詳細説明 例 1
標準方法を使用して、患者MZ2から得たメラノーマ細胞からメラノーマ細胞
系 MZ2−MELを定着した。この細胞系は、例えば、ここにその全体を参考
文献として添付する1992年5月22日出願、1992年11月26日公開の
PCT出願 PCT/US92/04354号に記載されている。細胞系の定着
後、そのサンプルを照射して、これを非増殖性とした。次に、これらの照射済み
サンプルを使用して、これに対して特異的な細胞溶解性T細胞(”CTLs”)
を分離した。
末梢血液単核細胞(”PBMCs”)のサンプルを、患者MZ2から採取し、
前記照射済みメラノーマ細胞に接触させた。この混合物のメラノーマ細胞の溶解
を観察したところ、該サンプル中に、メラノーマ細胞によって提示されたペプチ
ドとHLA分子との複合体に対して特異的なCTLsが存在することが判った。
上述の使用した溶解アッセイは、ここに参考文献としてその開示内容を添付す
るヘリン(Herin)他、Int.J.Cancer 39:390〜396
(1987)に基づくクロム放出アッセイであった。但し、このアッセイについ
てはここに記載しておく。標的メラノーマ細胞を生体外で生育し、次に、これを
10mMのHEPESと30%のFCSとを追加したDMEM中で107細胞/
mlに再懸濁させ、200μCi/mlのNa(51Cr)O4と37℃で45分
間培養した。標識化した細胞を、10mMのHepesを添加したDMEMで3
回洗浄した。次に、これらを10mMのHepesと10%のFCSとを追加し
たDMEM中に再懸濁させ、その後、103個の細胞を含む100μlのアリコ
ットを、96ウェルマイクロプレート中に分布させた。PBLsのサンプルを、
100μlの同じ培地に添加し、同じようにアッセイを行った。プレートを10
0gで4分間遠心分離し、37℃で8%のCO2雰囲気中にて4時間培養した。
プレートを再び遠心分離し、100μlの上清のアリコットを採取し、計数し
た。51Cr放出の百分率は以下の式に基づいて計算された。
ここで、ERは観察された実験51Cr放出量、SRは103標識化細胞を20
0μlの媒体中のみで培養することによって測定された自発的放出量、そしてM
Rは、100μlの0.3%Triton X−100を標的細胞に添加するこ
とによって得られた最大放出量である。
高いCTL活性を示した前記単核血液サンプルを制限希釈によって拡張及びク
ローン化を行い、同じ方法を使用して再スクリーニングした。このようにしてC
TLクローンMZ2−CTL 82/82を分離した。該クローンを、以後「8
2/82」と称する。
同じ方法を使用して、標的K562細胞と、メラノーマ細胞系とをテストした
。図1Aに示されたこれらの結果は、このCTLクローンがメラノーマ細胞系は
認識して溶解するが、K562は認識も溶解もしないことを示している。次に、上
述したものと同じ方法によって、CTLクローン82/82をメラノーマ細胞
系に対してテストした。図1は、MZ2−MEL.43は、CTLクローン82
/82によって溶解されるが、HLA−A28,HLA−B44,及びHLA−
Cクローン10の発現を欠失した変異体である細胞系MZ2−MEL2.2.5
は、溶解されないことを示しており、これは、前記TRAがこれらのHLA分子
の一つによって提示さ
れるものであることを示唆している。細胞系MZ2−MEL2.2.5を、周知
の技術を使用して、HLA−Cクローン10をコード化するDNAとトランスフ
ェクションさせた時、これらの細胞は、CTLクローン82/82による溶解に
対して感応するようになり、従って、前記CTLクローン82/82によって認
識される抗原がHLA−Cクローン10によって提示されていることを示した。例 2
82/82を標的細胞と接触させた時に、腫瘍壊死因子(TNF)も生成した
か否かを調べるために更に研究を行った。ここで使用した方法は、ここにその開
示内容を参考文献として添付するトラヴァーサリ(Traversari)等、
Immunogenetics35:145〜152(1992)に記載された
ものであった。簡単に説明すると、前記CTL系のサンプルを、培地中にて対象
となる標的細胞のサンプルと結合した。24時間後、前記培養物からの上清を除
去し、次に、TNF感応性のWEHI細胞上でテストした。図2に示されている
ように、14の異なった細胞系のパネルをテストした。
図2は、その結果を、前記上清に対する暴露によって死滅したWEHI細胞の
百分率として示している。これらの結果は、三つのメラノーマ細胞系がこの抗原
を提示することを示している。MZ2 MEL43による強い応答の結果により
、これを以下の実験に使用した。例 3
例2から得た結果は、MA2.MEL.43が目的の標的抗原を提示したこと
を示すものであった。従って、これを、cDNAライブラリを準備するための全
mRNAソースとして使用した。
前記細胞系から全RNAを分離した。前記mRNAは、周知の技術に従って、
オリゴ−dt結合キットを使用して分離した。mRNAが得られた後、これを、
再び標準的方法を使用して、cDNAに転写した。次に、製造業者の指示に従っ
て、このcDNAをEcoRIアダプタに連結し、プラスミドpcD−SRαの
EcoRIサイトにクローン化した。次に、組替えプラスミドを、JM101 E
.coliに電気穿孔した(電気穿孔条件:25μFにて1パルス、2500
V)。
トランスフェクションしたバクテリアを、アンピシリン(50μg/ml)で
選択し、次に、これらをそれぞ
れが400バクテリアから成る87のプールと、200のバクテリアから成る2
97のプールとに分割した。分析に依れば約70%のプラスミドがインサートを
有していたので、各プールは、約280又は約140のcDNAを表すものであ
った。マニアティス(Maniatis)他、in Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual (Cold Spr
ing Harbor.N.Y.,1982)に従って、各プールを飽和状態に
まで増幅し、プラスミドDNAを、アルカリ溶解、酢酸カリウム沈澱によって、
フェノール抽出無しで分離した。例 4
例3に記載したライブラリの準備後、前記cDNAを真核生物細胞にトランス
フェクションした。このトランスフェクションは前述したトランスフェクション
と全く同様に行った。COS−7細胞のサンプルを、10%の胎児ウシ血清を添
加したDelbeco’s変性Eagles培地(”DMEM”)中で、組織培
養平底マイクロウェルに15,000細胞/ウェルの割合で接種した。これらの
細胞を37℃で一晩培養し、培地を取り除き、これを、10%のNu血清、40
0μg/ml
DEAE−デキストラン、100μM クロロキン、100ngの対象プラスミ
ドを含むDMEM培地50μl/ウェルにて置換した。これらのプラスミドは、
上述した種々のプールのプラスミドと、プラスミドpcD−SRα中でHLA−
Cクローン10をコード化するDNAを含む100ngのプラスミドとであった
。37℃にて4時間培養した後、前記培地を除去し、10%のDMSOを含む5
0μlのPBSによって置換した。この培地を2分後に除去し、10%のFCS
を添加した200μlのDMEMによって置換した。
この培地の交換後、COS細胞を37℃で24〜48時間培養した。次に培地
を廃棄し、10%のプールされたヒト血清を含有し、20U/mlのIL−2を
添加した100μlのIscove培地中で、1500細胞のCTLクローン8
2/82を添加した。24時間後に上清を除去し、参考文献として添付したトラ
ヴァサーリ(Traversari)他、Immunogenetics35:
145〜152の記載に従い、TNF含有量をWEHI細胞上のアッセイで測定
した。
テストした384のプールの内、99%が5pg/ml以下の濃度でTNFを
刺激した。二つのプールは、40pg/ml以上産生し、その複製ウェルも同様
の結
果であった。図3はこの結果を示している。これらのプールの一つ、即ち、プー
ル19からのバクテリアを選択し、更に実験した。例 5
前記プール19のバクテリアをクローン化し、800のバクテリアをテストし
た。そこからプラスミドを抽出し、上述したものと同じ方法で、COS細胞の新
たなサンプルにトランスフェクションし、これらの細胞のCTLクローン82/
82の刺激を再びテストした。12の陽性クローンが見つかった。cDNAクロ
ーンAD5と称するこれらの一つを更にテストした。比較テストにおいて、CO
S細胞を、cDNAクローンAD5とHLA−Cクローン10、HLA−Cクロ
ーン10とMAGE−1、AD5のみ、又はHLA−Cクローン10のみ、にて
トランスフェクションした。コントロール細胞系MZ2−MEL2.2.5及び
MZ2−MEL.43も使用した。CTL上清中のTNF放出を、前述したよう
に、WEHI細胞上でテストした。生存WEHI細胞の光学密度を、MTTを使
用して測定した。図4は、HLA−Cクローン10とcDNA−AD5とでトラ
ンスフェクションしたCOS細胞と、元の細胞系MZ2−MEL.43のみ
がCTLクローン82/82からのTNF放出を刺激したことを示している。例 6
前記cDNA AD5を公知の技術に従って配列決定した。配列検索により、
前記プラスミドインサートは公知の遺伝子又はタンパク質に対して相同性を示さ
ないことが明らかになった。配列認識番号(SEQUENCEID NO):1
は、以後、”BAGE−1”と称する、同定された遺伝子のcDNAヌクレオチ
ド情報を提示する。推定転写解読枠は、前記分子の塩基201〜332に位置し
ている。例 7
例6と同様に、前記cDNAの配列決定後、正常組織の細胞が前記遺伝子を発
現するかどうかを調べる実験を行った。これを調べるために、正常組織から分離
したRNAを、オリゴ−dtをプライマーとして使用して逆転写した。次にその
結果得られたcDNAを下記のプライマーと標準PCR法を使用して増幅した。
プライマー:
5’CAG AAG ATG AAG CAC AGA G-3’ (配列認識番号(SEQ ID NO)
:2)
及び、
5’-GAG CGG TTT TTC TGG CAT TG-3’(配列認識番号(SEQ ID NO)
:3)
増幅生成物の量がけい光画像化によって測定できるように放射性ヌクレオチド
を添加した。
生成物の量は、細胞系MZ2−MEL 3.0から得られ前記遺伝子を発現す
ることが示された生成物の百分率として表された。その結果は以下の通りである
。
MZ−MEL 3.0 100%
肺 <0.5%
胸 ”
胃 ”
皮膚 ”
脳 ”
前立腺 ”
腎臓 ”
精巣 8%
ここでは詳細しない追加実験に於て、細胞系MZ2−MELの前記DNAをE
coRIで消化し、次に、ここに記載のcDNAの最初の300のヌクレオチド
に対応するPCRプローブでハイブリダイゼーションした。標準サザンブロッチ
ングに従って、約5.8,7.5,8.5及び11キロベースの大きさに対応す
る4つのバンドが同定され、これはBage遺伝子のファミリの存在を示唆する
ものである。例 8
腫瘍サンプルと腫瘍細胞系とによる前記遺伝子の発現も調べられた。cDNA
を例4と全く同じようにして得て、次いで、関連配列を増幅するために組(ne
sted)プライマー法を行った。最初に、下記のプライマーを使用して20サ
イクルの増幅を行った。
5’-CGG CTT AGA GGA CCA GGA GAA-3’(配列認識番号(SEQ ID NO
):4)
及び
5’CAG AAG ATG AAG CAC AGA G-3’(配列認識番号(SEQ ID NO:5
)
この後、下記のプライマーを使用して更に20サイクル行った。
5’-GGC TCC AAC CTC CAG CTC AC-3’(配列認識番号(SEQ ID NO)
:6)
及び
5’-TTA GAG GAC CAG GAG AAG G-3’(配列認識番号(SEQ ID NO:
7)
以下にその結果を示す。最初の数字は陽性サンプルの数、二番目の数字はテスト
したサンプルの総数を示す。
メラノーマ 12/20
乳癌 2/5
小細胞肺癌 2/8
非小細胞肺癌 2/5
肉腫 1/4
頭部及び首部腫瘍 1/6
結腸癌 0/4
腎臓癌 0/5
白血病/リンパ腫 0/3例 9
上述の実験は、細胞溶解T細胞クローンCTL82/82が、BAGE遺伝子
によってコード化され、HLA−C−クローン10によって提示される抗原を認
識することを示した。この例に記載の作業は、提示された抗原のアミノ酸配列が
いかにして決定されるかを詳述するものである。
BAGE、即ちAD5をコード化すると同定された前記cDNAクローンを使
用して、多数の不完全なcDNA分子を生成した。前記cDNAクローンを発現
ベクターpcDNAI/Ampに挿入し、NotI及びSphI制限エンドヌク
レアーゼで消化し、その後、製造業者の指示に従って、エクソヌクレアーゼII
Iで処理した。時間の長さを変えるためにエクソヌクレアーゼIIIを使用する
ことによって、AD5の3’末端において連続的に欠失した物が得られた。これ
らの裁頭変異体を、pcDNAI/Ampに再連結させ、E.coli菌株DH
5αF’IQに電気穿孔し、アンピシリン(50μg/ml)によって選択した
。このようにして400のクローンが得られた。
これらの400のクローンからプラスミドDNAを得て、cDNAをコード化
するHLA−C−クローン10
とともにCOS−7細胞にトランスフェクションした。次に、上述したように、
これらのトランスフェクション体を、TNF放出アッセイでテストした。CTL
82/82によるTNF放出を刺激したものは陽性クローンであった。
細胞を陽性トランスフェクション体と陰性トランスフェクション体とに分けた
後、10の陽性体からと10の陰性体からのプラスミドDNAの配列を調べた。
陽性クローンであるクローン19C2は、ヌクレオチド1からヌクレオチド67
までにおいて、上述したBAGE遺伝子のための転写解読枠の一部を有していた
。これに対して、陰性トランスフェクション体であるクローン17G12は、前
記遺伝子のヌクレオチド1〜6を有していた。
陽性クローンと陰性クローンのインサートを比較することによって、22のア
ミノ酸からなる一つの領域が、おそらく前記提示されたペプチドの配列を有する
ものとして同定された。即ち、
Met Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu Ser Ala Gln
Leu Leu Gln Ala Arg Leu Met Lys Glu
(配列認識番号(SEQ ID NO):8)
次に、この配列に基づいて合成ペプチドを作り、そのHLA−C−クローン10
でトランスフェクションされたCOS−7細胞をTNF放出の刺激を可能にする
能力についてテストした。第1の陽性ペプチドは16−merであった。
Met Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu Ser Ala Gln
Leu Leu Gln
(配列認識番号(SEQ ID NO):9)
比較的小さいペプチドのテストによって次のペプチドが同定された。
Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu
(配列認識番号(SEQ ID NO):10)
このペプチドは、CTL82/82を効果的に刺激し、80nMのペプチド濃度
において半最大溶解に到達した。これが図5に示されている。
上記の諸例は、腫瘍拒絶抗原先駆体をコード化する核酸分子の分離を示してい
る。この”TRAP”コード化分子は、しかしながら、上述した参考文献に記載
された
過去に開示されたいずれのMAGEコード化配列とも相同ではない。従って、本
発明の一側面は、配列認識番号(SEQ ID NO):1に記載の前記ヌクレ
オチド配列を有する分離された核酸分子である。参考文献に記述された、いかな
るMAGEの配列と比較してもわかるように、この配列はMAGEをコード化す
る配列ではない。又、本発明の一部である核酸配列は、非−MAGE腫瘍拒絶抗
原先駆体もコード化するが、ストリンジェントな条件下においては、記載したヌ
クレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイゼーションをする。ここで「スト
リンジェントな条件」とは、当該技術において周知のパラータをいう。より具体
的には、ここでのストリンジェントな条件とは、3.5xSSC、1xDenh
art’s溶液と、25mM燐酸ナトリウムバッファ(pH 7.0)、0.5
%SDS、及び2mM EDTA中における、65℃で18時間のハイブリダイ
ゼーションをいう。その後、フィルタは、65℃で20分間の2xSSC,0.
1%SDS中での洗浄を4回行い、更に、0.3xSSC,0.1%SDS中に
て最大20分間の洗浄を一回行う。同じ程度のストリンジェントな条件をもたら
すために使用可能なその他の条件、試薬等もあるが、これらの条件は当業者には
周知で
あるのでここでは記載しない。
上記諸例から、又、本発明が前記配列の発現ベクターに於ける使用と、更に、
これら配列の原核(例えば、E.coli)あるいは真核(例えば、CHO又は
COS細胞)の宿主細胞及び細胞系をトランスフェクションするための使用とも
含むことが理解されるであろう。前記発現ベクターは、関連配列、即ち、上述の
配列が、プロモータと操作可能にリンクされていることを必要とする。ヒト白血
球抗原HLA−Cクローン10がこれらの遺伝子から派生した腫瘍拒絶抗原を提
示することが判っているので、前記発現ベクターは、また、HLA−Cクローン
10をコード化する核酸配列も含んでいる。ベクターが両方のコード化配列を含
む場合には、それを使用して正常にはいずれをも発現しない細胞をトランスフェ
クションすることも可能である。上記腫瘍拒絶抗原先駆体コード化配列は、例え
ば、宿主細胞が既にHLA−Cクローン10を発現する場合等において、単独で
使用することも可能である。もちろん、使用可能な具体的な宿主細胞についての
限定はない。所望の場合、前記二つのコード化配列を有するベクターをHLA−
Cクローン10提示細胞に使用することが可能であるので、腫瘍拒絶抗原先駆体
の遺伝子を、HLA−Cクローン10を発現しな
い宿主細胞に使用することが可能である。
本発明は、更に、技術者がそれによって所望の単数又は複数の発現ベクターを
作ることが可能ないわゆる発現キットをも含む。このような発現キットは、前述
したコード化配列のそれぞれの少なくとも分離部分を含むものである。前述した
必要な配列が含まれる限り、所望の場合、他のコンポーネントを追加することも
可能である。
本発明の核酸分子とTRAPsを前述したMAGEファミリから区別するため
に、本発明を、遺伝子とTRAPsとのBAGEファミリと称する。従って、こ
こで”BAGE”を使用する場合は、常に、これは前述した配列によってコード
化される前記腫瘍拒絶抗原先駆体を指す。”BAGEコード化分子”とこれに類
似の用語は、前記核酸分子自身を記載するのに使用される。
更に、例9に記載した配列認識番号(SEQ ID NO):8,9及び10
のペプチドも本発明の一部である。これらのペプチドは、例えば、MHC分子H
LA−Cクローン10を提示する細胞の同定に使用することができる。これを達
成する一つの方法は、検出可能な信号を備えたこれらのペプチドの投与し、その
後、ペプチドが結合した細胞を同定することであり、又、HLA−C−クローン
10提示細胞が結合する固相結合ペプチドを使
用して、それらをアッセイされているサンプルから除去することである。更に、
本発明によって、当業者はTRAPの発現によって特徴付けられる疾患を診断す
ることができる。これらの方法は、前記TRAP遺伝子の発現の測定及び/又は
、HLA−C クローン10によって提示されるTRA等のそこから派生するT
RAs等の発現の測定を含む。前者の場合、このような測定は、ポリメラーゼ連
鎖反応を含むすべての標準的核酸測定方法、又は、標識化ハイブリダイゼーショ
ンプローブによるアッセイ等によって行うことが出来る。後者の場合には、抗体
等の、TRA及びHLAの複合体の結合パートナーによるアッセイが特に好まし
い。測定の別の方法としては、上述したタイプのTNF放出アッセイがある。
TRAP遺伝子の分離によって、TRAP分子自身、特に、配列認識番号(S
EQ ID NO):1によってコード化される前記アミノ酸配列を含むTRA
P分子を分離することも可能になる。これらの分離された分子は、TRAとして
、又は、HLA−C クローン10等のTRAとHLAの複合体として提示され
た場合、アジュバント等の物質と結合させて、TRAP分子の発現によって特徴
付けられる疾患の治療に有用なワクチンを製造することができる。更に、ワクチ
ンは、非増殖性癌細
胞、非増殖性トランスフェクション体等の、その表面にTRA/HLA複合体を
提示する細胞から作ることが出来る。細胞がワクチンとして使用されるすべての
場合、これらは、CTL応答を証明するのに必要な成分の片方又は両方をコード
化する配列でトランスフェクションされた細胞、又は、トランスフェクション無
しで両方の分子を発現する細胞とすることができる。更に、前記TRAP分子、
その関連TRAs、及びTRAとHLAの複合体は、当該技術分野において周知
の技術を使用して、抗原の製造に利用することができる。
ここで「疾患」という時、これは、腫瘍拒絶抗原先駆体が発現されるすべての
病状を指す。このような疾患の一例は、特に、癌メラノーマである。
当該開示に基づく治療方法は、対象体の免疫システムが応答し、HLA−C
クローン10細胞等のTRA提示細胞が溶解されることを前提としている。この
ような方法の一つは、前記複合体に対して特異的なCTLsを、問題の表現型の
異常細胞を有する対象体に投与することである。このようなCTLsを生体外で
開発することは十分に当業者の技術範囲に含まれる。具体的には、血液細胞等の
サンプル細胞を、前記複合体を提示し、特定のCTLの増殖を促進することが可
能な細胞に接触させる。
標的細胞は、上述したタイプのCOS細胞等のトランスフェクション体であって
よい。これらのトランスフェクション体は、その表面に所望の複合体を提示し、
対象のCTLと結合された時に、その増殖を刺激する。
ここに使用したようなCOS細胞は、広く一般に入手可能であり、その他の適
当な宿主細胞も同様である。
養子移入(adoptive transfer)と称される前記治療方法(
グリンバーグ(Greenberg)J.Immunol.136(5):19
17(1986):レッデル(Reddel)他、Science 257:2
38(7−10−92):リンチ(Lynch)他、Eur.J.Immuno
l.21:1403〜1410(1991);カスト(Kast)他、Cell
59:603〜614(11−17−89)について詳述すると、所望の複合
体を提示する細胞を、CTLsと結合させ、この細胞に対して特異的なCTLs
を増殖させる。次に、この増殖したCTLsを、前記特定の複合体を提示してい
る前記異常細胞のいいずれかによって特徴付けられる細胞異常を有する対象体に
投与する。すると、CTLsが異常細胞を溶解し、所望の治療目的を達成する。
上述の治療方法は、対象体の異常細胞の内の少なくと
もいくつかが前記HLA/TRA複合体を提示することを前提としている。これ
は、その技術が特定のHLA分子を提示する細胞を同定する方法と、前記特定の
配列、ここではBAGE配列、を有するDNAを発現する細胞を同定する方法と
に非常に類似しているため、非常に容易に判断することが出来る。一旦、関連複
合体を提示する細胞を上述のスクリーン法によって同定した後は、そのような細
胞を、対象体からの、CTLsを含むサンプルと結合させることが出来る。もし
も細胞提示複合体が前記混合CTLサンプルによって溶解されるならば、BAG
E派生の腫瘍拒絶抗原が提示されていると推定することが出来、その対象体は、上
述の治療アプローチを使用するのに適切な候補となる。
養子移入のみが本発明によって利用可能な治療方法ではない。種々のフプロー
チを使用して、生体内でCTLsを誘発することも可能である。一つのアプロー
チ、即ち、前記複合体を発現する非増殖性細胞の使用については既に記載した。
このアプローチに於て使用される細胞としては、前記複合体を正常時において発
現する細胞、例えば、照射済みメラノーマ細胞や、前記複合体の提示に必要な前
記遺伝子の一つ又は両方によってトランスフェクションされた細胞、等を使用す
ることができる。このア
プローチの一具体例はチェン(Chen)他、Proc.Natl.Acad.
Si.USA 88:110〜114(1991年1月)に記載されており、こ
こには、HPVE7ペプチドを発現するトランスフェクションされた細胞の、治
療法に於ける使用が示されている。様々な細胞タイプを使用することができる。
同様に、問題の遺伝子の片方又は両方を担持するベクターを使用することができ
る。ウィルス性又はバクテリア性のベクターが特に好ましい。これらのシステム
において、問題の遺伝子は、例えば、ワクシニアビールスやバクテリアBCG等
によって担持され、これらの物質が実質的に(defacto)宿主細胞に感染
(「インフェクション」)する。その結果得られる細胞は、問題の複合体を提示
し、自己増殖CTLsによって認識され、増殖する。前記腫瘍拒絶抗原又は前記
先駆体自身を、問題のHLA分子を提示するHLA−C クローン10提示細胞
への組み込みを促進するアジュバントと結合させることによっても類似の効果を
達成することができる。前記TRAPはプロセッシングされてHLA分子のペプ
チドパートナーを生成し、他方、TRAは、更なるプロセッシングを必要とせず
に提示される。
本発明のその他の側面は当業者にとって明らかであろ
う。従って、ここでは繰り返す必要はない。
ここに使用した用語及び表現は、説明のための用語であって限定的なものでは
なく、従って、これらの用語及び表現の使用において、図示記載された特徴構成
又はその均等物、又はそれらの一部を除外する意図はなく、本発明の範囲内にお
いて様々な改変態様が可能であると理解される。
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(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI
C07K 7/08 8517−4H C07K 14/47
14/47 9637−4B C12P 21/02 C
C12N 5/10 9281−4B C12N 5/00 B
C12P 21/02 9051−4C A61K 37/02 ADU
//(C12P 21/02
C12R 1:91)
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),AU,CA,FI,JP,K
R,NO,NZ
(72)発明者 ブーン‐ファラー,ティエリー
ベルギー国 ビー‐1200 ブリュッセル
アベニュー・ヒポクラート 74 ユーシー
エル 7459
(72)発明者 クーリ,ピエール
ベルギー国 ビー‐1200 ブリュッセル
アベニュー・ヒポクラート 74 ユーシー
エル 7459
(72)発明者 ルノー,ジャン‐クリストフ
ベルギー国 ビー‐1200 ブリュッセル
アベニュー・ヒポクラート 74 ユーシー
エル 7459
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. 配列認識番号(SEQ ID NO):1に記載のヌクレオチド配列を有 する分離された核酸分子。 2. ストリンジェント条件下において、配列認識番号(SEQ ID NO) :1に記載の核酸配列にハイブリダイゼーションし、かつ、腫瘍拒絶抗原先駆体 をコード化する分離された核酸分子であって、該分離された核酸分子はMAGE 腫瘍拒絶抗原先駆体はコード化しない。 3. 請求項1の核酸分子に対して相補的な、分離されたmRNA分子。 4. 請求項1の核酸分子にてトランスフェクションされた宿主細胞。 5. 請求項2の核酸分子にてトランスフェクションされた宿主細胞。 6. プロモータに操作可能にリンクされた請求項1の分離された核酸分子を有 する発現ベクター。 7. プロモータに操作可能にリンクされた請求項2の分離された核酸分子を有 する発現ベクター。 8. 請求項4の宿主細胞であって、前記宿主細胞はHLA−Cクローン10を 発現するほ乳類細胞である。 9. 請求項5の宿主細胞であって、前記宿主細胞は HLA−Cクローン10を発現するほ乳類細胞である。 10.請求項6の発現ベクターであって、更に、HLA−Cクローン10をコー ド化する核酸分子を含む。 11.請求項7の発現ベクターであって、更に、HLA−Cクローン10をコー ド化する核酸分子を含む。 12.次の要素の分離部分をそれぞれ有する発現キット、 (i)請求項1の分離された核酸分子、及び (ii)HLA−Cクローン10をコード化する核酸分子。 13.次の要素の分離部分をそれぞれ有する発現キット、 (i)請求項2の分離された核酸分子、及び (ii)HLA−Cクローン10をコード化する核酸分子。 14.請求項1の核酸分子によってコード化される分離された腫瘍拒絶抗原先駆 体。 15.プロセッシングされて、HLA−Cクローン10分子によって提示される 腫瘍拒絶抗原となるBAGE腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる 疾患を有する対象体を治療する方法であって、前記BAGEより派生の腫瘍拒絶 抗原とHLA−Cクローン10分子の複合体に対して特異的であって、前記複合 体を提示する細胞を溶解する細胞溶解性T細胞を、 前記疾患を軽減するのに十分な量を、前記対象体に投与する工程を有する方法。 16.核酸分子によってコード化され、かつ、配列認識番号(SEQ ID N O):1のヌクレオチド配列を含む腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付け られる疾患を有する対象体を治療する方法であって、HLA分子と前記腫瘍拒絶 抗原先駆体から派生された腫瘍拒絶抗原との複合体に対して特異的な細胞溶解性 T細胞を、前記疾患を軽減するのに十分な量を、前記対象体に投与する工程を有 する方法。 17.プロセッシングされて、HLA−Cクローン10分子によって提示される 腫瘍拒絶抗原となるBAGE腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる 疾患を有する対象体を治療する方法であって、前記BAGEより派生の腫瘍拒絶 抗原とHLA−Cクローン10分子の複合体に対する免疫応答を誘発する薬剤を 、前記複合体を提示する細胞に対する前記応答を誘発するのに十分な量を、前記 対象体に投与する工程を有する方法。 18.核酸分子によってコード化され、かつ、配列認識番号(SEQ ID N O):1のヌクレオチド配列を含む腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付け ら れる疾患を有する対象体を治療する方法であって、HLA分子と腫瘍拒絶抗原先 駆体の複合体に対する免疫応答を誘発する薬剤を、前記複合体を提示する細胞に 対する前記免疫応答を誘発するのに十分な量を、前記対象体に投与する工程を有 する方法。 19.プロセッシングされて、HLA−Cクローン10分子と複合体を形成する BAGEより派生の腫瘍拒絶抗原となるBAGE腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によ って特徴付けられる疾患を診断する方法であって、対象体からのサンプルを、前 記複合体に対して特異的な薬剤と接触させる工程と、前記複合体と前記薬剤との 相互作用を、前記疾患であるとの確定として測定する工程を有する方法。 20.配列認識番号(SEQ ID NO):1に記載の配列を有する核酸分子 によってコード化される腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる疾患 を診断する方法であって、対象体からのサンプルを、前記配列又はその発現生成 物に対して特異的な抗原と接触させる工程と、前記配列又は前記発現生成物との 間の相互作用を、前記疾患であるとの確定として測定する工程を有する方法。 21.配列認識番号(SEQ ID NO):8,配列 認識番号(SEQ ID NO):9及び配列認識番号(SEQ ID NO) :10からなるグループから選択される分離されたペプチド。 22.細胞溶解性T細胞応答を誘発する方法であって、HLA−C−クローン1 0提示細胞を、細胞溶解性T細胞の存在下において、HLA−C−クローン10 と配列認識番号(SEQ ID NO):10の複合体に対して特異的な細胞溶 解性T細胞の増殖を誘発するのに十分な量の請求項21の分離されたペプチドと 接触させる工程を有する方法。 23.プロセッシングされて、HLA−Cクローン10によって提示される配列 認識番号(SEQ ID NO):10のアミノ酸配列から成る腫瘍拒絶抗原と なるBAGE腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる疾患を有する対 象体を治療する方法であって、前記BAGEより派生の腫瘍拒絶抗原とHLA− Cクローン10分子の複合体に対して特異的で、かつ前記複合体を提示する細胞 を溶解する細胞溶解性T細胞を、前記疾患を軽減するのに十分な量を、前記対象 体に投与する工程を有する方法。 24.核酸分子によってコード化され、かつ、配列認識番号(SEQ ID N O):1のヌクレオチド配 列を含む腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる疾患を有する対象体 を治療する方法であって、HLA分子と配列認識番号(SEQ ID NO): 10のアミノ酸配列からなる腫瘍拒絶抗原の複合体に対して特異的な細胞溶解性 T細胞を、前記疾患を軽減するのに十分な量を、前記対象体に投与する工程を有 する方法。 25.プロセッシングされて、HLA−Cクローン10によって提示される配列 認識番号(SEQ ID NO):10のアミノ酸配列から成る腫瘍拒絶抗原と なるBAGE腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる疾患を有する対 象体を治療する方法であって、前記BAGEより派生の腫瘍拒絶抗原とHLA− Cクローン10分子の複合体に対する免疫応答を誘発する薬剤を、前記複合体を 提示する細胞に対して前記応答を誘発するに十分な量を、前記対象体に投与する 工程を有する方法。 26.核酸分子によってコード化され、かつ、配列認識番号(SEQ ID N O):1のヌクレオチド配列を有する腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付 けられる疾患を有する対象体を治療する方法であって、HLA−C−クローンと 配列認識番号(SEQ ID NO): 1.0のアミノ酸配列からなるペプチドの複合体に対する免疫応答を誘発 する薬剤を、前記複合体を提示する細胞に対する前記免疫応答を誘発するのに十 分な量を、前記対象体に投与する工程を有する方法。 27.プロセッシングされることによって、HLA−Cクローン10分子と複合 体を形成する配列認識番号(SEQ ID NO):10のアミノ酸配列から成 るBAGEより派生の腫瘍拒絶抗原となるBAGE腫瘍拒絶抗原先駆体の発現に よって特徴付けられる疾患を有する対象体を診断する方法であって、対象体から のサンプルを、前記複合体に対して特異的な薬剤と接触させる工程と、前記複合 体と前記薬剤との間の相互作用を、前記疾患であることの確定として測定する工 程を有する方法。 28.配列認識番号(SEQ ID NO):1に記載の配列を有する核酸分子 によってコード化される腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる疾患 を診断する方法であって、対象体からのサンプルを、前記先駆体から派生しかつ 配列認識番号(SEQ ID NO):10のアミノ酸からなる腫瘍拒絶抗原に 対して特異的な薬剤と接触させる工程と、前記薬剤と前記配列又は前記発現生成 物との間の相互作用を、前記疾 患であることの確定として測定する工程を有する方法。
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