JP3805378B2 - rDSPAα1の製造の方法 - Google Patents
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Description
本発明は、組換え体Desmondus rotundus唾液のプラスミノーゲンアクチベーターα1(rDSPA α1)の単離及び精製方法、この方法により精製されたrDSPA α1、このように精製されたrDSPA α1を含有する調剤学的組成物、及びこのように製造されたrDSPA α1を用いる治療方法に関する。
発明の背景
血栓症は、血餅の形成によって血管の中で製造される。一方で、肺動脈塞栓症を含む静脈血栓症及び急性心筋梗塞を含む動脈血栓症は区別される。肺動脈塞栓症及び心筋梗塞症は、即座の医学的干渉を必要とする生命を危うくする疾患である。
このような動脈血栓症及び静脈血栓症治療の一般的な形態は酵素による血栓崩壊(Collen et al., Ann. Rev. med., (1988), 39: 405-423)を行うプラスミノーゲンアクチベーターの使用である。これらの物質(血栓溶解物質と呼ばれる)は、プラスミノーゲン(不活性の血液中の線維素溶解系のプロ酵素)を活性のタンパク質分解酵素(プラスミン)に変える。プラスミンは、順番に血餅の実質的成分である線維性の物質フィブリンを溶解する。これは、閉塞した血管の中で再開放すること及び血流量の回復に導く。しかしながら、プラスミンが比較的非特異のプロテアーゼであるので、タンパク質加水分解により、完全な止血(例えばフィブリノゲン)のための血液中の不可欠な成分を分解してしまい、こうして多量に出血する危険を増加させてしまう。
最初の酵素による血栓溶解物質、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼは、循環に注射されるならば、全身的に、プラスミノーゲンをプラスミンに変える及び全身のタンパク質加水分解を引き起こす化合物である。このように、これらの化合物を使用する血栓溶解療法は、出血に関する合併症を伴う。より新しい組織タイプ(一般にt−PAとして言及される)のプラスミノーゲンアクチベーターの使用の上で基づく血栓溶解療法は開発された、しかし、また、それらは数多くのタイプ1つのプラスミノーゲンアクチベーター抑制剤(PAI−1)のようなプラスミノーゲンアクチベーター抑制剤による重大な出血性の合併症、再閉塞の比較的頻繁な発生率、一様に有効な無能及び不活性化への感受性を含む欠点がつきまとう(Loskutoff, seminars in Thrombosis and Hemostasis, Vol. 14, No. 1 (1988))。
最近になって、プラスミノーゲンアクチベーター・タンパク質は、吸血コウモリ(Desmondus rotundus)の唾液及び唾腺から精製された(欧州特許出願公開明細書0383417(Baldus et al.);欧州特許出願公開明細書0352119(Duong et al.))。このようなプラスミノーゲンアクチベーター(DSPAと呼ぶ)はプラスミノーゲンのプラスミンへの転換に触媒作用を起こすが、フィブリン結合性プラスミノーゲンに対してより大きい選択性があるセリンプロテアーゼであるが、血栓溶解療法のために使用され場合、出血の頻度及び程度の軽減に結びつく、さらに、SDPAはPAI−1のような血漿抑制剤によって容易に失活されず、従って、再閉塞のより低い頻度に結びつく。
DSPAの2つの高分子形(α1及びα2と表す)はコウモリの唾液中で見出すことができ、両方とも、プロテアーゼ・ドメインを含むいくつかのドメインからなり、両方とも、フィブリン存在でプラスミノーゲンにしっかりと結合する能力がある。DSPAのいろいろな形態は、哺乳類の細胞培養の中で組換型バイオテクノロジーによって製造され
及び、組換により製造されたDSPA(rDSPA)の小規模精製は、記載されている(Witt et al., Blood (1992), 79: 1213-1217)。しかしながら、商業的規模においてrDSPAの及び調剤学的製剤のために適当な純度の状態での単離及び精製は開示されていない。
この即座の適用は、商業上の規模に関して、組換型DSPA α1(rDSPA α1)の単離及び精製に関する。前記のように発明は、十分に純粋で、商業上市販上及び臨床上に使用できる安定したrDSPA α1である。
発明の概要
本発明は、商業上の規模に関するrDSPA α1の単離及び精製の方法を提供し及び臨床用途のために適当な生成物に関する。
従って、発明の態様はrDSPA α1を精製する方法に関しており、前記の方法は次の工程からなる:
(a) 媒質を、rDSPA α1がカチオン交換樹脂と選択的結合を生じる条件下で、カチオン交換樹脂に適用し;
(b) 場合により、非rDSPA α1タンパク質及び非タンパク質汚染物質を除去するためにカチオン交換樹脂を洗浄し;
(c) 選択的に、結合されたrDSPA α1をカチオン交換樹脂から溶出し;
(d) 工程(c)からのrDSPA α1を含有している溶出液を、疎水性相互作用樹脂にrDSPA α1が選択的結合を生じる負荷条件下で、疎水性相互作用樹脂に適用し;
(e) 場合により、非rDSPA α1タンパク質及び非タンパク質の汚染物質を除去するために疎水性相互作用樹脂を洗浄し;
(f) 選択的に、結合されたrDSPA α1を疎水性相互作用樹脂から溶出し;
(g) 工程(f)からのfDSPA α1を含有する溶出液を、アフィニティークロマトグラフィー樹脂にrDSPA α1が選択的結合を生じる負荷条件下で、アフィニティークロマトグラフィー樹脂に適用し;
(h) 場合により、非DSPA α1タンパク質及び非タンパク質の汚染物質を除去するためにアフィニティークロマトグラフィー樹脂を洗浄し;
(i) 選択的に、実質的に純粋なrDSPA α1を水溶液の形で製造するために、結合されたrDSPA α1をアフィニティークロマトグラフィー樹脂から溶出する。
発明のもう一つの態様は、即座の適用の方法によって単離及び精製されたrDSPA α1タンパク質である。
発明のもう一つの態様は、即座の適用の方法によって単離及び精製されたrDSPA α1及び調剤学的に認容性の付形剤を含有している調剤学的組成物に関する。
発明のもう一つの態様は、動脈又は静脈血栓症のヒトを治療するために、即座の適用方法によって単離及び精製したrDSPA α1を使用する方法である。
発明の詳細な記述
明細書及び添付の請求の範囲中で使用されるように、反対に指定されない限り、以下の用語は次に示された意味を表す:
「生物媒質」は、細胞が培養された生物媒質に関する。
「調整培地」は、細胞が培養された生物媒質に関する。従って、この媒質は、細胞の成長により調整され、及び細胞増殖の間に媒質中へ排出された生成物を含有する。これらは、両方とも成長の間に製造された老廃物質及び媒質中へ成長の間に細胞によって製造及び分泌されたタンパク質であることができる。
「カチオン交換樹脂」は、結合されたイオンと周囲の液体培地からのイオンを交換することができる天然又は人工的物質(通常は固体)に関する。カチオン交換樹脂は、負の機能上固定されたイオンを有し、かつ正の対イオンを交換する。
市販されているカチオン交換体の中のアンカー基(交換活性成分)は、通常−C6H5O-か、−SO3-か、−PO3-か−AsO3-である。比較的弱いカチオン交換樹脂はカチオンの結合強さが高くないようなもの、例えばカルボキシル又はカルボキシアルキル官能基を有するようなものである。さらに、比較的弱いカチオン交換樹脂は、通常、酸性のpHで充分に分離されない。本発明中で使用された特定の弱いカチオン交換樹脂は、ポリエチレンイミンシランと共有結合したシリカ粒子のマトリックスからなり、その際、このポリエチレンイミンのアミノ基はカルボキシル基で誘導される。そのような樹脂は、Widepore CBX▲R▼クロマトグラフィー樹脂の商標名でJ. T. Bakerから市販されている。
「疎水性相互作用樹脂」は、メチル、エチル、又は他のアルキル基のような荷電してない基を含有する天然又は人工的な物質(通常は固体)に関する。これらの基は、樹脂を通過するタンパク質部分上の基と疎水性の結合を形成し、タンパク質と樹脂基の間の相互作用に基づいてタンパク質を分離する。特別な疎水性相互作用樹脂は、エチレングリコール及びブチル基を用いて誘導したメタクリル酸エステルのタイプのポリマーの共重合によって合成された半硬質の球形のビーズからなる。このような樹脂は、Toyo-Pearl▲R▼ 650M C4の商標名で、Toso-Haasから市販されている。
「アフィニティークロマトグラフィー樹脂」は、タンパク質の精製のために使用される天然又は人工的な物質(通常は固体)に関する。この樹脂は、タンパク質上の基と樹脂上の基との間で生じる親和性に基づきタンパク質を分離する。本発明において、アフィニティークロマトグラフィー樹脂として使用される樹脂は、通常、そのサイズに基づきタンパク質を分離するためのサイズ除外樹脂(size exclusion resin)として使用される。特別なアフィニティークロマトグラフィー樹脂は、20000〜8000000kDaの間の球状タンパク質を分別することができるビーズ形のアリル・デキストラン及びN,N′−メチレンビスアクリルアミドの架橋したコポリマーである。そのような樹脂はSephacryl▲R▼ S-400の商標名で、Pharmaciaから市販されている。
「アルキル」は、単に炭素及び水素からなる、不飽和を含有していない及び1〜18個の炭素原子を有する、有利に1〜6個の炭素原子を有する、直鎖又は分枝鎖の1価のラジカル、例えばメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル(1−メチルエチル)、n−ブチル、t−ブチル(1,1−ジメチルエチル)、s−ブチル(1−メチルプロピル)、n−ペンチル、n−ヘキシルなどに関する。
本明細書において詳説される精製計画によるrDSPA α1生成物の純度に関して適用されるような「実質的に純粋な」とは、最終的な精製生成物中の全タンパク質の80%より多くがrDSPA α1であり、有利に単離された全タンパク質の90%より多くがrDSPA α1であり、特に有利に単離された全タンパク質の98%がrDSPA α1であることを意味する。タンパク質含有量及び純度は、逆相HPLC及びSDS−ページ・ゲル分析に基づく。
「非rDSPA α1及び非タンパク質の汚染物質」は、rDSPA α1が精製されている生物媒質中で見つけ出されたrDSPA α1以外の全ての材料に関する。
「調剤学的に認容性の付形剤」は、非毒性であり、かつその中に懸濁又は含まれた調剤学的成分の生物学的活性に不利に影響を与えない生理学的条件と相容性である必要があるような、認容性の担体、及び調剤学的に認容性の助剤に関する。適当な付形剤は、マンニトール、スクシナート、グリシン又は血清アルブミンのような化合物である。
「治療的有効量」は、それを必要とするヒトに投与する場合、下記されているように、血栓症により特徴付けされる疾病状態に関して有効なり量に十分であるようなrDSPA α1の量に関する。「治療的に有効量」を構成する化合物の量は、化合物、疾病状態及びその程度に依存して変動するが、通常の知識及びこの開示を考慮して、通常の当業者により測定することができる。
この明細書中で使用した「治療する」又は「治療」とは、血栓症により特徴付けられる疾病状態のヒトにおける疾病状態の治療を包括し、かつ次の状態を含む:
(i) ヒトにおいて生じる疾病状態を予防する、特に、まだ診断されてはいないがこの疾病状態になりやすいヒトにおいて生じる疾病状態を予防する;
(ii) 疾病状態を阻止する、すなわちその進行を抑制する;又は
(iii) 疾病状態を緩和する、すなわちこの疾病状態の退行を引き起こす。
「場合により」又は「場合による」とは、次に記載されたような事象が生じるか又は生じないかもしれないことを意味し、かつこの記載は、前記の事象又は状況が生じる事例及び生じない事例を含むことを意味する。
有利な態様の記述
本発明は、商業的規模で及び調剤学的製剤において使用するのに適した形でのrDSPA α1の単離及び精製方法に関する。rDSPA α1は、培養基中へrDSPA α1生成物を分泌することができる哺乳類の細胞株を発酵させることによって産生される。調整培地(すなわち、哺乳類の細胞を含有しているバイオリアクターから得られたその培地)は集菌され、rDSPA α1は他のタンパク質及び汚染物質から、カチオン交換樹脂の使用、引き続きこの樹脂からのrDSPA α1の選択的溶出により始まる一連のクロマトグラフィー工程により分離される。次いで、カチオン交換樹脂から選択的溶出により得られたrDSPA α1画分は疎水性相互作用樹脂に適用され、このマトリックスからの選択的溶出が精製の第2レベルを提供する。次いで、溶出されたrDSPA α1画分はアフィニティークロマトグラフィー樹脂に適用され、選択的溶出は精製の更なる水準を提供する。精製されたrDSPA α1は、次に通常の技術、例えば限外濾過により濃縮され、次いで凍結乾燥される。
特に、本発明は下記のように実践される。
A. 単離及び精製
1. 培養基及び細胞株
この培養基は、DMEMかHam's F12のような哺乳類の細胞増殖のために適当な基本的な培地からなる。特別な培地は、William's E培地(Wiliams, G.M.及びGunn, J.M, Exp. Cell Res., (1974) 89:139)である。接種増殖相のために、基本的な培地は通常、血清源、一般にウシ血清(BS)又は新産児の仔ウシ血清(CS)が補足され、これは約0.1重量%〜10重量%の範囲内の濃度で存在し、通常約1重量%〜5重量%で存在する。他の成長因子又はHEPESのような緩衝液を添加することもできる。灌流増殖相の間、血清濃度は通常同じ濃縮で、一般に約3%〜8%の範囲内で、通常約5%に維持される。
本発明において使用するのに適当な細胞株は、浮遊培養中での非付着性の成長が可能な哺乳類細胞株及び/又はマイクロキャリア・ビーズ上で付着性の成長ができる哺乳類細胞株を含む。これらの必要条件に応ずる特別な細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣(Chinese hampster ovary;CHO)細胞株、BHK細胞又はHEK293細胞株
特に有利なCHO細胞株は、Urlaub, G. and Chasin, L.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77:4216-4220に記載されたDXB11である。これらの細胞は、それぞれDSPA α1及びマウス・ジヒドロ葉酸レダクターゼ(Petri, T., ibid)をコードする配列を含有する発現ベクターpSVP Al1及びpUDHFR1で同時形質移入された。本発明において使用された形質転換されたCHO細胞株は特定のCD16であり、American Type Culture Collection, Rockville, Maryland (ATCC)に寄託されており、ATCC番号CRL 12023が付与されている。
2. 培養及び産生期の拡大
集密的攪拌培養又は他のバイオリアクター培養の一部を用いて接種した後、この細胞培養は産生密度、一般に約1−40×106細胞/mlの範囲内に拡大される。
マイクロキャリア・ビーズ上の所望の細胞密度が達成された後、血清を補充された新たな培地の潅流が開始される。これに対して、細胞は浮遊培養中で育てられてもよい。一般に、この新たな培地中の血清の濃度は約2重量%〜10重量%の範囲内にあり、さらに一般的に約3重量%〜8重量%の範囲内にあり、特に通常約5重量%である。最初に、この潅流量は約0.25〜0.75培養容量/日の範囲内にあり、一般に約0.5の培養容量/日である。細胞増殖が増加するにつれて、潅流量は約1.5〜2.5の培養容量/日の範囲内で、一般に約2〜10日の期間にわたって最終量まで増加される。拡大の間、滅菌した前平衡化されたマイクロキャリア・ビーズは、109個の細胞に対するマイクロキャリアビーズ約0.5〜1.0グラムの範囲内のビーズ対細胞密度比に維持するためにリアクターに添加される。有利に、マイクロキャリア・ビーズは、サンプルライン通して吸引装置を使用する反応器に添加される。
細胞密度が産生水準に到達した後、新たな培地への血清添加量は、一般に約0.1〜2.0の重量%の範囲内の濃度に、一般に1%の濃度に減少される。
産生期中の培養は複数の発酵パラメーターに配慮する必要があり:温度、pH及び溶存酸素水準は、毎日モニターされる。追加の培養基、血清及びアルカリは供給タンクが消耗されるように提供する必要がある。生成物を含有する培地として定義された調整培地の試料は、少なくとも2日毎に通常のように分析され、汚染なしに産生が続いていることが保証される。
バイオリアクターからの調整培地の捕集方法は、約100〜150ミクロンの孔径を有するスクリーンを使用することにより細胞の集菌が最小にされる。浮遊培養は、バイオリアクター中に細胞を残すために渦流フィルタを使用する。集菌は、無菌容器中に捕集され、38日間まで更なる処理の前に貯蔵される。バイオリアクター集菌中に見出されるrDSPA α1は、十分に生物学的に活性でかつ精製する準備ができた処理された形態で、CHO細胞から分泌される。
3. カチオン交換クロマトグラフィー
4〜6の範囲内に、有利に約5にpHを調整した後、調整培地中のrDSPA α1はカチオン交換マトリックス(通常、カラムの形で充填された)に、rDSPA α1とマトリックスとの本質的に完全な結合を提供するために選択された条件下で適用される。他のタンパク質も結合される一方で、この調整培地中の多数の不所望な又は不純物タンパク質及び他の化合物、例えばフェノールレッドはマトリクスと結合できずに、マトリックスを通過して流れるため、初期の結合段階は分離の最初の水準が提供される。rDSPA α1は、さらにマトリックスから選択的に溶出させることにより精製され、その際、この溶出は段階溶出か直線勾配溶出法によって緩衝液のイオン強度を増やすことにより行うことができる。いずれにせよ、rDSPA α1は、下記のように更なる精製のために捕集される。
適当なカチオン交換マトリックスは、rDSPA α1を結合することができるカチオンの官能基を有する誘導された多様な樹脂を含む。合成樹脂、例えばシリカゲル粒子、架橋したアガロース又は架橋したポリメタクリレートポリマー(カルボキシル、カルボキシメチル、スルホニル、ホスホリルなどのようなカチオンの官能基を用いて誘導)からなるようなものが有利である。比較的弱い樹脂、例えばカルボキシル又はカルボキシアルキル官能基、例えばカルボキシメチル又はカルボキシエチルを有するようなものが特に有効である。特に有利な樹脂は、カルボキシル基で誘導されたポリエチレンイミンシランのアミノ基を用いて、ポリエチレンイミンシランに共有結合されたシリカ粒子マトリックスからなる。そのような樹脂は、J.T. Bakerから市販されているBaker Widepore CBX▲R▼(45mmビーズ・サイズ)である。
この結合及び溶出条件は、カチオン性樹脂の結合強さに依存して変動する。Baker Wideopre CBXのような、弱いカチオンの樹脂のために、結合は低いイオン強度で弱酸性条件下で、一般にpH4〜7、有利に約pH5で実施することができる。マトリックスを洗浄した後に、rDSPA α1は、線形溶出又は段階溶出を使用して高いイオン強度を有する流動相にさらすことによって選択的に溶出することができる。Baker Widepore CBX樹脂のために、rDSPA α1は、NaCl約100mM〜500mMの間の塩濃縮液を用いて約7.5のpHで溶出する。次いで、カラムはストリッピングされ、以降の使用のために再生させることができる。
有利に、Baker Widepore CBXマトリックスを用いて、この樹脂は最初に酢酸ナトリウム100mM(pH5)の緩衝液を用いて平衡化される。緩衝液は溶出液のpHが5に安定するまで、1分あたり0.2〜2.0カラム容量の流量でカラムに適用される。rDSPA α1を含有している調整培地は、1.2μmフィルタを用いて濾過し、次いで氷酢酸を使用して、4〜7のpHに、最も有利に5のpHに滴定した。次いで、この培地は、2.0カラム容量/分よりも大きくない流速でギヤポンプを使用してカラムに適用される。フィルタは、カラムマトリックスを閉塞させる粒子を除去するために提供される。
次に、カラムマトリックスは、pHが5に安定するまで、一般に約2〜7のカラム容量により必要とされるアセテート平衡緩衝液を用いて再平衡化される。次にリン酸ナトリウム50mMを含有する洗浄緩衝液(pH7.5)は、溶出液のpHが7.5で安定するまで、0.1〜0.2カラム容量/分でカラムに適用される。次に、rDSPA α1は、リン酸ナトリウム50mM、塩化ナトリウム500mMを含有する溶出緩衝液(pH7.5)を用いてカラムから溶出される。この溶出緩衝液はカラムから溶出するタンパク質をもはや検出されなくなるまで流動される。2.0Mの酢酸ナトリウムを含有するストリッピング緩衝液(pH8)はマトリックスを再生させるためにカラムに適用される。貯蔵緩衝液は酢酸10%及びエタノール45%を含有する。
4. 疎水性相互作用クロマトグラフィー
カチオン交換マトリックスから集められたrDSPA α1画分は、一般に高いイオン強度及び低いpHでrDSPA α1がマトリックスと結合する条件下で、次に疎水性相互作用マトリックス(通常カラムの形状)に適用される。次いで、このrDSPA α1は、線形又は段階的勾を使用して、カラムに適用された流動相の有機溶媒濃縮を増大させることにより選択的に溶出される。このrDSPA α1画分は、更なる精製のために集められる。この工程は、100〜1000ホールドによるDNA汚染物を減少させ、ウイルス汚染物を不活性化する。
適当な疎水性相互作用マトリックスは、疎水基、例えばプロピル、ブチル、オクチル、フェニルなどを共有結合している荷電していない樹脂を含む。この樹脂は架橋した有機ポリマー、例えばスチレン−ジビニルベンゼン、シリカ、アガロース、ポリメタクリレート又は多様な他の適当な粒状の担体であることができる。特に有利な樹脂は、ブチル基で誘導されたメタクリレートタイプのポリマー及びエチレングリコールの共重合によって合成された半硬質の球形のビーズからなる。このような樹脂は、Toso-Haasから市販されているToyo-Pearl▲R▼ 650M(49−90μmビーズ)である。
疎水性相互作用カラムへの結合は、高いイオン強度の条件下で、通常3〜5の酸性のpHで、さらに有利に約4のpHで行われる。実質的に、カチオン交換樹脂から溶出されたrDSPA α1画分に含まれる全タンパク質は、疎水性相互作用カラムに結合される。多様なタンパク質は、疎水性相互作用の異なる強さに基づき、すなわちタンパク質の増大する疎水性の順序で、選択的に溶出することができる。溶出は段階的であるか線形の勾配を有し、通常、エタノール又はイソプロパノールのようなアルコール性溶出液を用いて行われる。特に有利なアルコールは、エチルアルコールである。
有利に、Toyo-Peal C4マトリックスにおいて、平衡は酢酸ナトリウム50mM、塩化ナトリウム500mM(pH4)を有する平衡緩衝液を用いて実施することができる。イオン交換体カラムからのrDSPA α1画分をpH4に滴定した後、これはC4マトリックスに適用され、次いでこのマトリクスは前記した平衡緩衝液を用いて再平衡化される。次いで、このカラムは次のように2つの緩衝液を用いて連続して洗浄される。最初の洗浄(洗浄1)は、HCl 20mM含有する緩衝液を少なくとも2カラム容量で使用する。安定したUV吸光度によって明示されるように、この溶出液がさらにタンパク質を含まなくなるまで洗浄は続けあれる。次いで、このマトリックスは、エタノール19%、HCl 20mMを含有する緩衝液少なくとも10のカラム容量で洗浄され(洗浄2)、この洗浄はエタノール20.5%、HCl 20mMを含有する緩衝液で、さらにタンパク質が溶出しなくなるまで続けられる。rDSPA α1生成物の溶出は、エタノール29%、HCl 20mM(pH2.5)を含有する緩衝液を使用して行われる。生成物を溶出した後、カラムはNaOH100mMを含有する緩衝液少なくとも2カラム容量でストリッピングする。このマトリックスは洗浄1の緩衝液の中で貯蔵される。
5. アフィニティークロマトグラフィー
疎水性相互作用樹脂から捕集されたrDSPA α1画分を、rDSPA α1とアフィニティーマトリックスとの結合が行われる条件下で、次にアフィニティーマトリックス(通常カラムの形)に適用する。一方でrDSPA α1がカラムに結合されて留まり、汚染物質はHCl 20mMの2〜3のカラム容量を用いてカラムを洗浄することにより溶出される。この工程は、調剤学的調製及び溶解性を促進する緩衝液交換を容易にし、さらに潜在的ウイルス性汚染物質の不活性化/除去を補助する。有利に2.5カラム容量の緩衝液を使用する。rDSPA α1は、グリシン200mMを含有する緩衝液(4〜5のpHで遊離塩基)を用いて選択的に溶出される。rDSPA α1画分は濃縮のために捕集される。
本発明において、親和性樹脂として使用された樹脂はサイズ排除樹脂(size exclusion resin)として通常使用されるものである。適当な親和性マトリックスは、25〜75μmの間の直径を有するビーズの形のアリルデキストラン及びN,N’−メチレンビスアクリルアミドの架橋したポリマーからなる樹脂を包含する。特に有利な樹脂は、Pharmaciaから市販されている及び20000−8000000kDaの間の球状タンパク質を分別することができるSeqhacryl 400▲R▼である。
親和性樹脂へのrDSPA α1の結合は、低いイオン強度及び低いpHの条件下で実施される。実質的に、疎水性相互作用樹脂から捕集された全てのrDSPA α1はカラムに結合される。このrDSPA α1は、pH及び/又はイオン強度を上げることによって選択的に溶出することができる。通常、溶出は、グリシン(遊離塩基)200mMを含有する溶出液を用いて段階的又は線形勾配で実施される。
有利に、Sephacry S-400マトリックスにおいて、平衡はエタノール19%、HCl 20mMを有している緩衝液を用いて溶出液のpHが不変になるまで実施することができる。このマトリックスは、疎水性相互作用カラムからのrDSPA α1画分で負荷され、次いで、HCl 20mMを含有する緩衝液を用いて、溶出液からのUV信号が安定するまで洗浄される。結合されたrDSPA α1の溶出は、グリシン200mMを含有する緩衝液を用いて行われる。生成物を溶出した後に、カラムはNaOH 100mMを含有する緩衝液少なくとも2カラム容量を用いてストリッピングする。マトリックスを洗浄緩衝液(HCl 20mM)の少くとも2カラム容量を用いて洗浄した後、このマトリックスを緩衝液中で貯蔵することができる。
6. 濃縮
次いで、本発明の精製されたタンパク質は、一般に濾過又はその種の他の方法によって濃縮され、最終的に凍結乾燥されるか、又は通常の調剤学的製剤に組み込むことができる。実用的な濃縮及び凍結乾燥方法は、科学文献中で十分に記載されている。
B. 製剤
1. 調剤学的組成物
本発明は、明らかな治療上の値を有する試薬を提供する。rDSPA α1は前記の方法により精製され、これは動脈の及び静脈の血栓症の治療において実用的でなければならない。
前記のように精製された組換体DSPA α1は、患者に投与することができる、この試薬は治療のために他の成分、例えば通常の調剤学的に認容性の担持剤又は希釈液と組み合わせることができるか、生理学的に無害の安定剤及び付形剤と組み合わせることができる。これらの組合物は滅菌濾過され、投与形剤に変えられ、例えば凍結乾燥により投与バイアル、又は安定化された水性調製剤の形で貯蔵される。
有効な療法に必要な多量の試薬は、投与の手段、患者の生理学的な状態及び投与された他の医薬を含めた多くの異なる要因に依存する。このように、治療投与は、安全及び効力を最適化するために滴定されなければならない。一般に、試験管内で使用された用量はこの試薬のインサイトゥ投与のために有効な量における有用なガイダンスを提供することができる。治療のための有効量の動物実験は、さらにヒトへの投与の予測を提供する。多様な考察が記載されている、例えばGilman et al. (eds) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press;及びRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn。
投与の方法はこの中に及び次に、例えば経口、静脈内、腹腔内、筋肉内投与、経皮的拡散などについて議論されている。調剤学的に認容性の担持剤は、水、食塩水、緩衝液及び例えばMerck Index, Merck & Co., Rahway, New Jerseyに記載された他の化合物を含める。他のプラスミノーゲンアクチベーターの必要な容量に基づいて、80〜110mgの間の全用量が必要であると予想させる(Physicians' Desk Reference, 49th ed. (1995), Medical Economics Data Production Company, pp 1083-1085)。
治療用製剤は、通常のいかなる投与製剤の形でも投与することができる。活性成分を単独で投与することもできるが、調剤学的調製剤として存在するのが有利である。製剤は前記したような少なくとも1種の活性成分を、1種以上の認容性の担持剤と組み合わせてなる。各担持剤は、他の成分と相溶性でかつ患者に有害でないという意味で、調剤学的及び生理学的に両方とも認容性でなければならない。製剤は、経口又は腸管外(皮下、筋肉内、静脈内及び経皮を含める)の投与のために適当な製剤を含む。この製剤は、通常単位用量の形で存在することができ、薬学の分野において当業者に周知の方法で製造することができる(例えばGilman et. al., ibid, and Remington ibid.参照)。
概要において、本発明の概要に記載多様な本発明の有利な態様は次のようなものである:
生物媒質からrDSPA α1を単離及び精製する方法において、この方法は次の工程からなる:
(a) pH5で培地を、アミノ基はカルボキシル基により誘導化され、rDSPA α1とカチオン交換樹脂との選択的結合を生じる、ポリエチレンイミンシランに共有結合されるシリカ粒子のマトリックスからなるカチオン交換樹脂に適用し、
(b) 非rDSPA α1タンパク質及び非タンパク質の汚染物質を除去するために、カチオン交換樹脂をpH 5でNaOAc 100mM及びpH7.5でNaPO4 50mMで洗浄し;
(c) 結合されたrDSPA α1をカチオン交換樹脂からリン酸ナトリウム50mM及び塩化ナトリウム500mMを含有する緩衝液を用いてpH7.5で溶出し;
(d) 工程(c)からのrDSPA α1を含有する溶出液を、pH4で、rDSPA α1と疎水性相互作用樹脂との選択的結合を生じる、エチレングリコール及びブチル基で誘導されたメタクリレートタイプのポリマーの共重合により合成された半硬質の球形のビーズからなる疎水性相互作用樹脂に適用し、
(e) 非rDSPA α1タンパク質及び非タンパク質の汚染物質を除去するために、疎水性相互作用樹脂をHCl 20mMで、及び次いでEtOH 19%を含有するHCl 20mMで洗浄し、
(f) 結合したrDSPA α1を疎水性相互作用樹脂から、エタノール29%及び塩酸20mMを含有する緩衝液でpH2.5で溶出し;
(g) rDSPA α1を含有する工程(f)からの溶出液を、pH2.5で、rDSPA α1とアフィニティークロマトグラフィー樹脂との選択的結合が生じる20000の及び8000000kDaの間の球状タンパク質を分別するアリル・デキストラン及びN,N’−メチレンビスアクリルアミドの架橋したポリマーからなるアフィニティークロマトグラフィー樹脂に適用し、
(h) 非rDSPA α1タンパク質及び非タンパク質の汚染物質を除去するために、アフィニティークロマトグラフィー樹脂を、HCl 20mMで洗浄し;
(i) 水溶液の形で実質的に純粋なrDSPA α1を製造するために、結合したrDSPA α1をアフィニティークロマトグラフィー樹脂から、グリシン200mMを含有する緩衝液を用いて4〜5のpHで溶出する。
次の特定の製造及び実施例は、本発明の実施を補助するガイドとして提供され、本発明の範囲を限定するものではない。
例1
rDSPA α1の細胞培養の製造
DSPAワーキング細胞バンク(DSPA Working Cell Bank)からのバイアルを解凍し、成長培地(WEC5.0の培地、変更ウィリアムズE)中で仔ウシ血清5%を有するローラーボトル中へ接種した。2週期間にわたり、この細胞は4つのローラーボトル中へ拡大され、ローラーボトルからトリプシン処理され、4つの1Lのスピナーフラスコ中へ、それぞれ1Lの成長培地あたり4×108個の細胞で接種された。4日後に4つのスピナーからの培養は、10Lのバイオリアクターに接種するために使用した。さらに1Lの成長培地を接種の比にバイオリアクター培地に添加した。次の日に、このバイオリアクターを成長培地で10Lまで満たした。マイクロキャリアビーズあり及びなしの培養はこのプロトコルに従った。培地pHは7.0〜7.4に制御し、酸素添加は常にスパーギングシステム(sparging system)によって常に維持された。温度は34〜39℃に維持された。
バイオリアクター中の接種の日の細胞密度は1mLあたり8.1×105個細胞であり、2日後にこの細胞密度は2倍になり、その時点で、潅流量は0.5培養用量/日(cv/day)に設定した。この潅流量は細胞密度に関連して増加され、バイオリアクターの接種後の9日目にこの密度は6.2×106細胞/mLに達し、潅流は2cv/dayに増大させた。
次いで、このバイオリアクターは産生培地(WEC5.0培地中1%仔ウシ血清)に交換され、2日後に産生集菌の捕集を開始し、10週間続けた。産生期の間の平均の細胞密度は約75%生存率で1mLあたり15×106細胞であった。平均rDSPA α1産生はrDSPA40ミリグラム/リットルであり、平均日生産速度はrDSPA α1 6ピコグラム/細胞/日であった。
発酵容量の拡大は、1つのリアクターの内容物の半分を新たな容器へ移すことにより達成された。両方のバイオリアクターは産生培地(2cv/dayで潅流)に置かれ、産生集菌の捕集は直ちに開始された。
例2
rDSPA α1の精製
1. カチオン交換クロマトグラフィー(カラムA)。バイオリアクター集菌を周囲温度(15〜25℃)で貯蔵した。次いで、0.45ミクロンのフィルタを通して濾過し、その後カチオン交換カラムの上へ供給した。集菌の精製は、J.T. Bakerにより製造のCBX樹脂(カラムA)を使用するカラムクロマトグラフィー工程を開始した。この工程はタンパク質の本質的な精製を容易にした。
カラムA緩衝液は次のものからなる:緩衝液A1:平衡緩衝液(50mM NaoAc、pH5.0)、緩衝液A2:洗浄緩衝液(50mM NaPO4、pH7.5)、緩衝液A3:溶出緩衝液(50mM NaPO4、500mM NaCl、pH7.5)、緩衝液A4:ストリップ緩衝液(2M NaAc、pH8.0)、及び緩衝液A5:貯蔵緩衝液(45%EtOH、10%HoAc)。
次のカラムの操作パラメータは、樹脂6kgを充填されたカラムに対して適当であり、15リットルのカラム容量を有していた。多くても4.5グラムのrDSPA α1は運転あたりカラムに負荷することができた。このカラムは多くても2リットル/分の流量及び多くても20psiのカラム圧力で負荷された。このカラム及びモニター仕様は各運転の前に確認された。この負荷材料及びクロマトグラフィー緩衝液は使用の前にヘリウムでスパージする(sparging)ことに脱ガスされた。
バイオリアクター集菌は1.2mmのフィルタを用いて濾過され、次いで、氷酢酸を用いてpH5.00(±0.10)に滴定された。負荷の前に、カラムは溶出液がpH5.00(±0.2)になるまで、多くても30リットルの緩衝液A1で平衡化された。カラムが平衡化された後、集菌はカラム上に供給された。カラムは少なくとも80リットルの緩衝液A1で再平衡化された。溶出液がpH5.00(±0.20)でありかつ安定なUVベースラインが達成された場合、カラムは適切に再平衡化された。このカラムは少なくとも145リットルの緩衝液A2を用いて洗浄された。このカラムは、溶出液がpH7.50(±0.20)であり、かつ安定なUVベースラインが達成された場合、適切に洗浄された。
生成物は、緩衝液A3の少なくとも30リットルを用いて溶出され、別の容器中で捕集された。安定したUVベースラインが到達される場合に溶出は完全であるとみなされる。生成物を溶出した後、カラムは少なくとも30リットルの緩衝液A4を用いて、安定したUVベースラインが達成されるまでストリッピングされた。次いで、このカラムは再利用(使用の50サイクルを上回らない)のために清浄化された。カラムA生成物(又は溶出液)は2〜8℃で貯蔵された。平均回収率は93%であり、溶出液の平均(タンパク質)純度は81%であった。
2. 疎水性相互作用クロマトグラフィー(カラムB)。CBX樹脂の上でクロマトグラフィーに続いて、rDSPA α1生成物はC4疎水性相互作用樹脂(Toso-Haas)(カラムB)を使用してクロマトグラフィー処理した。この工程は、非タンパク質の汚染物質の本質的な除去を容易にし、さらに可能なウイルス汚染物質の不活性化/除去を促進した。カラムB緩衝液は次のものからなる:緩衝液B1:平衡緩衝液(50mM NaoAc、500mM NaCl、pH4.0)、緩衝液B2:洗浄及び貯蔵緩衝液(20mM HCl)、緩衝液B3:洗浄緩衝液(20mM HCl、19%EtOH)、緩衝液B4:洗浄緩衝液(20mM HCl、20.5%EtOH)、緩衝液B5:溶出緩衝液(20mM HCl、29.5% EtOH)、及び緩衝液B6:ストリップ緩衝液(0.1N NaOH)。次のカラム操作パラメーターは、15リットルのカラム容量に適している。多くて9グラムのrDSPA α1が運転あたりカラムに負荷される。このカラムは多くて2リットル/分の流量で及び多くて15psiのカラム圧力で負荷した。カラム及びモニター仕様は各運転の前に確認した。
負荷する前に、溶出液がpH4.00(±0.20)になるまでカラムは平衡化される。カラムA溶出液は氷酢酸を用いてpH4.00(±0.10)で滴定され、脱ガスされ、負荷される。このカラムは、溶出液がpH4.00(±0.20)であり、かつ安定したUVベースラインが到達されるまで、少なくとも30リットルの緩衝液B1を用いて再平衡化した。このカラムは緩衝液で3回洗浄した。最初の洗浄は少なくとも45リットルのB2を用いて行った。このカラムは溶出液がpH1.90(±0.20)であり、かつ安定したUVベースラインが到達されるまで適当に洗浄した。このカラムは2回目に少なくとも145リットルの緩衝液B3を用いて、安定したUVベースラインが到達されるまで洗浄した。このカラムは3回目に少なくとも30リットルの緩衝液を用いて洗浄され、安定なUVベースラインが達成される場合に完了した。
このrDSPA α1は、少なくとも30リットルの緩衝液B5を用いてカラムから溶出され、別の容器中に捕集した。溶出は安定したUVベースラインが到達されるまで続いた。次いでカラムは再利用(使用の50サイクルを上回らない)のために清浄化した。カラムB生成物(又は溶出液)は、2〜8℃で多くても15日間更なる処理の前に貯蔵した。平均の回収率は91%であり、溶出液の平均(タンパク質)純度は97%であった。
3. アフィニティークロマトグラフィー(カラムC)。カラムB生成物は、次にSephacryl S-400 (Pharmacia)(カラムC)を用いてクロマトグラフィー処理した。この工程は、製剤にするために緩衝液交換を容易にし、さらにウイルスの汚染物質の不活性化/除去を促進する。カラムC緩衝液は次のものからなる:緩衝液C1:平衡緩衝液(20mM HCl、19%EtOH)、緩衝液C2:洗浄緩衝液(20mM HCl)、緩衝液C3:溶出及び貯蔵緩衝液(滅菌の濾過されたグリシン200mM)、及び緩衝液C4:ストリップ緩衝液(0.1N NaOH)。次のカラム操作パラメーターは、10リットルのカラム容量に適している。多くても20グラムのrDSPA α1が運転あたりカラム上に負荷することができる。このカラムは多くても0.5リットル/分の流量及び多くて15psiカラム圧力で負荷された。1以上のカラムB運転からの溶出液を集め、次いで緩衝液C2 1部及び緩衝液5溶出液 2部で希釈した。最終的なエタノール濃度は約19%であった。
負荷する前に、溶出液がpH1.80(±0.20)になるまで、カラムは少なくとも15リットルの緩衝液C1を用いて平衡化されれた。負荷した後に、カラムを少なくとも30リットルの緩衝液C2で洗浄した。UV信号が安定する場合、カラムは適切に洗浄された。この生成物を少なくとも20リットルの緩衝液C3を用いてカラムから溶出し、別の容器に捕集した。安定したUVベースラインが到達されるまで、溶出は続けされた。
生成物を溶出した後に、カラムは、少なくとも12リットルの緩衝液C4を用いてストリッピングされ、再利用が20サイクルを上回らないまで貯蔵した。カラムC生成物(又は溶出液)は、緩衝液C3を用いて、ミリリットルあたり<1mgの濃度に希釈され、次の処理のために2〜8℃で貯蔵される。rDSPA α1の平均回収率は97%であり、溶出液の平均(タンパク質)純度は98%であった。
濃縮及び製剤工程は、前記の精製工程の完了に引き続き行われ、多くても70日間貯蔵されたS−400親和性カラム溶出液に関して行われた。カラムC溶出液が集められ、低分子量の物質(30000のダルトン、カットオフ)を除去する渦巻型限外濾過膜を用いて濃縮した。この生成物は、発熱性物質不含のコンテナに8mg/mlより高い濃縮で捕集された。
最終的な製剤緩衝液(グリシン200mM、4%マンニトール(w/v))を、7.5mg/mLまでのバルク調製生成物(bulk formulated product)の濃度にするために添加した。次いで、バルク調製生成物を滅菌濾過し、バイアル中へ入れ、凍結乾燥した。
Claims (18)
- 組換え体Desmodus rotundus唾液プラスミノーゲンアクチベーター(rDSPA α1)を生物媒質から精製する方法において、次の工程:
(a) 培地をカチオン交換樹脂に4〜7のpHで適用すること;
(b) 非rDSPA α1タンパク質及び非タンパク質の汚染物質を除去するために、このカチオン交換樹脂を洗浄すること;
(c) 結合されたrDSPA α1をこのカチオン交換樹脂から選択的に溶出すること;
(d) 工程(c)からのrDSPA α1含有溶出液を疎水性相互作用樹脂に3〜5のpHで適用すること;
(e) 非rDSPA α1タンパク質及び非タンパク質の汚染物質を除去するために、この疎水性相互作用樹脂を洗浄すること;
(f) 結合されたrDSPA α1を疎水性相互作用樹脂から選択的に溶出すること;
(g) 工程(f)からのrDSPA α1含有溶出液を、1〜4のpHで、かつ低いイオン強度で、25〜75μmの直径を有するビーズの形のアリルデキストラン及びN,N′−メチレンビスアクリルアミドの架橋したコポリマーからなるアフィニティークロマトグラフィー樹脂に適用すること、その際、前記ビーズが20000〜8000000kDaの球状タンパク質を分別することができる;
(h) 非rDSPA α1タンパク質及び非タンパク質の汚染物質を除去するために、このアフィニティークロマトグラフィー樹脂を洗浄すること;
(i) 結合されたrDSPA α1をアフィニティークロマトグラフィー樹脂から水溶液の形で、純粋なrDSPA α1を製造するために選択的に溶出すること;
を含む、rDSPA α1の精製方法。 - 生物媒質が調整培地である、請求項1記載の方法。
- 工程(a)中のカチオン交換樹脂が、カルボキシル基又はカルボキシアルキル基で誘導化されたシリカゲル粒子、架橋したアガロース又は架橋したポリメタクリレートポリマーからなる、請求項1記載の方法。
- カチオン交換樹脂がポリエチレンイミンシランに共有結合したシリカ粒子のマトリックスからなり、その際、ポリエチレンイミンシランのアミノ基はカルボキシル基により誘導化されている、請求項3記載の方法。
- 工程(c)中のrDSPA α1の溶出を、NaPhos 50mM及び100mM〜500mMの間のNaClを含有する緩衝液又は同等のイオン強度の緩衝液を用いて実施する、請求項4記載の方法。
- 工程(d)中の疎水性相互作用樹脂が、1〜10個の炭素の長さのアルキル鎖で又はアリール−アルキル基で誘導化された荷電してない樹脂である、請求項1記載の方法。
- 荷電してない樹脂がシリカゲル粒子、架橋したアガロース又は架橋したポリメタクリレートポリマーからなる、請求項6記載の方法。
- 荷電してない樹脂が、ブチル基で誘導化された、エチレングリコール及びメタクリレートタイプのポリマーの共重合により合成された半硬質の球形のビーズからなる、請求項6記載の方法。
- 工程(d)中の負荷条件が、NaPhos 50mM、リン酸を用いてpH4に調節されたNaCl 500mM又は同等のイオン強度の緩衝液中の工程(c)からの溶出液を適用することを含む請求項8記載の方法。
- 工程(f)中の溶出を、HCl 20mMを含有しかつ25%を超えるエタノール濃度を有する緩衝液を用いて実施する、請求項8記載の方法。
- エタノール濃度が28.5%〜30%の間にある、請求項10記載の方法。
- エタノール濃度が29%である、請求項10記載の方法。
- 工程(i)の中の溶出を、グリシン200mMを含有する緩衝液を用いて3〜6のpHで、又は同等のイオン強度の緩衝液を用いて実施する請求項1記載の方法。
- さらにrDSPA α1の水溶液を濃縮することを含む、請求項1記載の方法。
- さらに濃縮されたrDSPA α1溶液を凍結乾燥することを含む、請求項14記載の方法。
- さらにrDSPA α1の水溶液を濃縮し、濃縮されたrDSPA α1溶液を凍結乾燥することを含む、請求項1記載の方法。
- 次の工程:
(a) カルボキシル基又はカルボキシアルキル基により誘導化されたシリカゲル粒子、架橋したアガロース又は架橋したポリメタクリレートポリマーからなるカチオン交換樹脂に4〜7のpHで培地を適用して、カチオン交換樹脂にrDSPA α1を選択的に結合させること;
(b) 非rDSPA α1タンパク質及び非タンパク質の汚染物質を除去するためにカチオン交換樹脂を洗浄すること;
(c) 結合されたrDSPA α1を、リン酸ナトリウム50mM及び100mM〜500mMのNaClを含有する緩衝液又は同等のイオン強度の緩衝液を使用して、カチオン交換樹脂から選択的に溶出すること;
(d) 工程(c)からのrDSPA α1含有溶出液を、3〜5のpHで、シリカゲル粒子、架橋したアガロース又は架橋したポリメタクリレートポリマーからなる疎水性相互作用樹脂に適用して、疎水性相互作用樹脂にrDSPA α1を選択的に結合させること;
(e) 非rDSPA α1タンパク質及び非タンパク質の汚染物質を除去するために、疎水性相互作用樹脂を洗浄すること;
(f) 結合されたrDSPA α1を、HCl 20mMを含有し、かつ25%を超えるエタノール濃度を有する緩衝液を使用して、疎水性相互作用樹脂から選択的に溶出すること;
(g) 工程(f)からのrDSPA α1含有溶出液を、1〜4のpHで、25〜75μmの直径を有するビーズの形の、アリルデキストラン及びN,N′−メチレンビスアクリルアミドの架橋したポリマーからなるアフィニティークロマトグラフィー樹脂に適用して、アフィニティークロマトグラフィー樹脂にrDSPA α1を選択的に結合させること;
(h) 非rDSPA α1タンパク質及び非タンパク質の汚染物質を除去するために、アフィニティークロマトグラフィー樹脂を洗浄すること;
(i) 結合されたrDSPA α1を、3〜6のpHでグリシン200mMを含有する緩衝液を用いて又は同等のイオン強度の緩衝液を用いて選択的に溶出して、水溶液の形で純粋なrDSPA α1を製造すること;
を含む請求項1記載の方法。 - rDSPA α1を生物媒質から単離及び精製する方法において、次の工程:
(a) 培地を、アミノ基がカルボキシル基により誘導化されたポリエチレンイミンシランと共有結合したシリカ粒子のマトリックスからなるカチオン交換樹脂に、pH5で適用して、カチオン交換樹脂にrDSPA α1を選択的に結合させること;
(b) 非rDSPA α1タンパク質及び非タンパク質の汚染物質を除去するために、pH5でNaOAc 100mMを用いて、及びpH7.5でNaPO4 50mMを用いてカチオン交換樹脂を洗浄すること;
(c) 結合されたrDSPA α1をカチオン交換樹脂からリン酸ナトリウム50mM及び塩化ナトリウム500mMを含有する緩衝液を用いて、pH7.5で溶出すること;
(d) 工程(c)からのrDSPA α1含有溶出液を、pH4で、ブチル基で誘導されたエチレングリコール及びメタクリレートタイプのポリマーの共重合により合成された半硬質の球形のビーズからなる疎水性相互作用樹脂に適用して、疎水性相互作用樹脂にrDSPA α1を選択的に結合させること;
(e) 非rDSPA α1タンパク質及び非タンパク質の汚染物質を除去するために、HCl 20mMを用いて及び次いで19%のEtOH含有するHCl 20mMを用いて疎水性相互作用樹脂を洗浄すること;
(f) 結合されたrDSPA α1を、疎水性相互作用樹脂から29%のエタノール及び塩酸20mMを含有する緩衝液を用いてpH2.5で溶出すること;
(g) 工程(f)からのrDSPA α1含有溶出液を、pH2.5で、20000〜8000000kDaの球状タンパク質を分別するアリルデキストラン及びN,N′−メチレンビスアクリルアミドの架橋したポリマーからなるアフィニティークロマトグラフィー樹脂に適用して、アフィニティークロマトグラフィー樹脂にrDSPA α1を選択的に結合させること;
(h) 非rDSPA α1タンパク質及び非タンパク質の汚染物質を除去するために、HCl 20mMを用いてアフィニティークロマトグラフィー樹脂を洗浄すること;
(i) 結合されたrDSPA α1を、アフィニティークロマトグラフィー樹脂から、グリシン200mMを含有している緩衝液を用いて、4〜5のpHで溶出し、水溶液の形で純粋なrDSPA α1を製造すること;
を含む、rDSPAの単離及び精製方法。
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