JPH01108985A - 組織プラスミノーゲン活性化因子の精製方法 - Google Patents
組織プラスミノーゲン活性化因子の精製方法Info
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- JPH01108985A JPH01108985A JP22888888A JP22888888A JPH01108985A JP H01108985 A JPH01108985 A JP H01108985A JP 22888888 A JP22888888 A JP 22888888A JP 22888888 A JP22888888 A JP 22888888A JP H01108985 A JPH01108985 A JP H01108985A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は一般的に組織プラスミノーゲン活性化因子(“
t−PA”)の精製に関するものである。
t−PA”)の精製に関するものである。
さらに詳細には、単一の処理操作で精製したt−PAを
与える、きわめて簡単な精製方法が見出された。本発明
のt−PA製品は、従来は、単一段階プロセスで且つ高
収率でそのような形態において単離されたことはない、
高度に精製した組成物である。
与える、きわめて簡単な精製方法が見出された。本発明
のt−PA製品は、従来は、単一段階プロセスで且つ高
収率でそのような形態において単離されたことはない、
高度に精製した組成物である。
t−PA類、すなわち組織プラスミノーゲン活性化因子
は、プロ酵素プラスミノーゲンを酵素的に活性なプラス
ミンに転化することによって、凝血の溶解を包含する、
循環機能に役割を果すものと思われる。プラスミン、繊
維分解性プロテイナーゼ、は、凝血の主成分であるフィ
ブリンを溶解する働きをする。心臓発作患者における凝
血を溶解するためのt−PAの治療的な使用は早くから
臨床試験においてすばらしい成功をおさめ、且つ、既に
定評のある凝血溶解酵素、クラウスナー、“リサーチャ
ホズプローブ第二世代t−PA”、ビオ/テクノロジー
、第4巻707〜ll1頁(1986)によって報告さ
れたような、ストレプトキナーゼの効率を、既に遥かに
越えている。凝血のフィブリン成分に対するt−PA類
の特異性は、内出血をもたらすおそれがある、たとえば
フィブリノーゲンのような、血液蛋白質の組織的分解の
回避という、臨床的に重要な利点を有している。
は、プロ酵素プラスミノーゲンを酵素的に活性なプラス
ミンに転化することによって、凝血の溶解を包含する、
循環機能に役割を果すものと思われる。プラスミン、繊
維分解性プロテイナーゼ、は、凝血の主成分であるフィ
ブリンを溶解する働きをする。心臓発作患者における凝
血を溶解するためのt−PAの治療的な使用は早くから
臨床試験においてすばらしい成功をおさめ、且つ、既に
定評のある凝血溶解酵素、クラウスナー、“リサーチャ
ホズプローブ第二世代t−PA”、ビオ/テクノロジー
、第4巻707〜ll1頁(1986)によって報告さ
れたような、ストレプトキナーゼの効率を、既に遥かに
越えている。凝血のフィブリン成分に対するt−PA類
の特異性は、内出血をもたらすおそれがある、たとえば
フィブリノーゲンのような、血液蛋白質の組織的分解の
回避という、臨床的に重要な利点を有している。
t−PA類の治療的な使用に対する一般的な欠点の一つ
は、組織又は細胞培地から、あるいは体液から、それら
を単離することの困難性である。
は、組織又は細胞培地から、あるいは体液から、それら
を単離することの困難性である。
t−PAを分泌することが知られている組織からの細胞
は、培地へのt−PAの生産と分泌のために培養するこ
とができる。この“条件付けした”培地を集めて種々の
精製プロセスを施す。種々の組織、たとえば、子宮組織
、内皮細胞など、によって生産される種々の公知のt−
PA類が存在する。
は、培地へのt−PAの生産と分泌のために培養するこ
とができる。この“条件付けした”培地を集めて種々の
精製プロセスを施す。種々の組織、たとえば、子宮組織
、内皮細胞など、によって生産される種々の公知のt−
PA類が存在する。
t−PAを精製するための既知の方法は、きわめて複雑
であって、多くの工程を必要とする。その上、従来の方
法による収率は、約20〜約60%の範囲にすぎない。
であって、多くの工程を必要とする。その上、従来の方
法による収率は、約20〜約60%の範囲にすぎない。
さらにまた、従来の方法によって生じるt−PA製品は
、なお蛋白質汚染物を含有している可能性がある。
、なお蛋白質汚染物を含有している可能性がある。
米国特許第4,381.346号(ハラシンら)は、プ
ラスミノゲーン活性化因子を固定化フィブリンに結合さ
せ、溶出したのち、ゲル濾過カラムを通過させて溶離剤
とフィブリン汚染物からプラスミノゲーン活性化因子を
分離することから成る手順により、尿又は腎臓組織培地
からプラスミノゲーン活性化因子を単離するための方法
を開示している。活性化因子はアルギニン、リシン又は
ε−アミノ−カプロン酸を用いるカラムから約60%の
収率で溶出する。リーケンら“培養物中のヒトの黒色腫
細胞が分泌するプラスミノゲーン活性化因子の精製とキ
ャラクタリゼーション”、ジャーナル オブ ビオロジ
カル ケミストリー、第256巻、7035〜41頁(
1981)は、亜鉛キレート−アガロース、コンカナバ
リンA−アガロース及びセファデックスG−150カラ
ムによる3段階クロマトグラフィー工程を使用し、且つ
透析及び遠心分離工程をも包含し、且つ46%の収率を
うる精製方法を記している。同様に、ブーイスら、“尿
ウロキナーゼと区別できない、培養したヒトの内皮細胞
からのウロキナーゼ形プラスミノゲーンの単離とキャラ
クタリゼーション゛′、ジャーナル オブ ビオロジカ
ル ケミストリー、第259巻、7198〜205頁(
1984)は、トリトンX−100の存在における漿液
を含まない条件付けした培地からのp−アミノベンズア
ミジン−アガロース親和カクロマトグラフイー、その後
の親和精製特異的抗ウロキナーゼIgG−セファロース
CL−4B上の免疫吸着クロマトグラフィーによる、約
47%の収率での、精製を開示している。
ラスミノゲーン活性化因子を固定化フィブリンに結合さ
せ、溶出したのち、ゲル濾過カラムを通過させて溶離剤
とフィブリン汚染物からプラスミノゲーン活性化因子を
分離することから成る手順により、尿又は腎臓組織培地
からプラスミノゲーン活性化因子を単離するための方法
を開示している。活性化因子はアルギニン、リシン又は
ε−アミノ−カプロン酸を用いるカラムから約60%の
収率で溶出する。リーケンら“培養物中のヒトの黒色腫
細胞が分泌するプラスミノゲーン活性化因子の精製とキ
ャラクタリゼーション”、ジャーナル オブ ビオロジ
カル ケミストリー、第256巻、7035〜41頁(
1981)は、亜鉛キレート−アガロース、コンカナバ
リンA−アガロース及びセファデックスG−150カラ
ムによる3段階クロマトグラフィー工程を使用し、且つ
透析及び遠心分離工程をも包含し、且つ46%の収率を
うる精製方法を記している。同様に、ブーイスら、“尿
ウロキナーゼと区別できない、培養したヒトの内皮細胞
からのウロキナーゼ形プラスミノゲーンの単離とキャラ
クタリゼーション゛′、ジャーナル オブ ビオロジカ
ル ケミストリー、第259巻、7198〜205頁(
1984)は、トリトンX−100の存在における漿液
を含まない条件付けした培地からのp−アミノベンズア
ミジン−アガロース親和カクロマトグラフイー、その後
の親和精製特異的抗ウロキナーゼIgG−セファロース
CL−4B上の免疫吸着クロマトグラフィーによる、約
47%の収率での、精製を開示している。
発明の要約
t−PAの精製に対して以前に開示された方法とは著し
く異なって、本発明の方法は簡単且つ効率的である。こ
の方法は本質的に、条件付けした細胞培地又はその他の
t−PA源培地を、予備処理したフィブリン粉末又はフ
ィブリン表面と接触させ、フィブリンに結合しているt
−PAを溶出することから成っている。フィブリンから
の1−PAの溶出ののちに、過剰のt−PA溶出緩衝剤
は、透析又はその他の通常の方法によって、溶出したt
−PAから除去することができる。ここに記した方法を
用いて、少なくとも70〜75%またはそれ以上のt−
PA収率を達成することができる。その上、この方法に
よる最後的なt−PA製品は、最低の工程数を用いて生
成した、高度に純粋な組成物である。
く異なって、本発明の方法は簡単且つ効率的である。こ
の方法は本質的に、条件付けした細胞培地又はその他の
t−PA源培地を、予備処理したフィブリン粉末又はフ
ィブリン表面と接触させ、フィブリンに結合しているt
−PAを溶出することから成っている。フィブリンから
の1−PAの溶出ののちに、過剰のt−PA溶出緩衝剤
は、透析又はその他の通常の方法によって、溶出したt
−PAから除去することができる。ここに記した方法を
用いて、少なくとも70〜75%またはそれ以上のt−
PA収率を達成することができる。その上、この方法に
よる最後的なt−PA製品は、最低の工程数を用いて生
成した、高度に純粋な組成物である。
本発明の第一の目的は、条件付けした細胞培地、組織又
は体液からのt−PAの精製のための能率的且つ効率的
方法を提供することにある。この方法は条件付けした培
地又はその他の源泉から、蛋白質不純物による最低限度
の汚染物をもつにすぎない、高度に精製したt−PA生
成物を生じる、t−PAを直接に単離することができ精
製方法を提供する。
は体液からのt−PAの精製のための能率的且つ効率的
方法を提供することにある。この方法は条件付けした培
地又はその他の源泉から、蛋白質不純物による最低限度
の汚染物をもつにすぎない、高度に精製したt−PA生
成物を生じる、t−PAを直接に単離することができ精
製方法を提供する。
この物質に対して予想される臨床的な需要に対応すべき
大量の精製t−PAの製造に対する、経済的であり且つ
適切な、治療用品縁のt−PA単離のための方法を提供
することは、密接に関連する本発明の目的である。
大量の精製t−PAの製造に対する、経済的であり且つ
適切な、治療用品縁のt−PA単離のための方法を提供
することは、密接に関連する本発明の目的である。
さらに、商業的に入手することがでさるフィブリンに一
般的に伴なわれる不純物によるt−PAの汚染をほとん
ど排除するような具合に、本発明のt−PA精製に対し
て使用すべきフィブリン粉末を予備処理するための方法
を提供することもまtこ、目的の一つである。
般的に伴なわれる不純物によるt−PAの汚染をほとん
ど排除するような具合に、本発明のt−PA精製に対し
て使用すべきフィブリン粉末を予備処理するための方法
を提供することもまtこ、目的の一つである。
さらに他の目的は、精製した状態のt−PAを単離する
ための高価且つ/又は複雑なりロマトグラフイー媒体及
び地理工程の必要を排除する、条件付けした培地又はそ
の他の源泉からのt−PAの、安価で容易に入手するこ
とができる吸着剤上への直接的且つ特異的な結合に基づ
く、t−PA精製方法を提供することにある。その結果
として、きわめて低い単離コストにおいて、大量の精製
t−PAを生産することができる。
ための高価且つ/又は複雑なりロマトグラフイー媒体及
び地理工程の必要を排除する、条件付けした培地又はそ
の他の源泉からのt−PAの、安価で容易に入手するこ
とができる吸着剤上への直接的且つ特異的な結合に基づ
く、t−PA精製方法を提供することにある。その結果
として、きわめて低い単離コストにおいて、大量の精製
t−PAを生産することができる。
発明の説明
本発明に従って、たとえば、条件付けした細胞培地、組
織又は体液のような源泉材料から、以下の段階によって
t−PA(組織グラスミノーゲン活性化因子)を単離す
る:(1)フィブリンをt−FA溶出緩衝剤と接触させ
ることによって予備処理して、フィブリンから溶出可能
な不純物を除去し、(2)t−pA溶出緩衝剤から予備
処理したフィブリンを分離し、(3)予備処理したフィ
ブリンを洗浄し、(4)予備処理し洗浄したフィブリン
を組織プラスミノーゲン活性化因子を含有する源泉材料
と接触させ、(5)フィブリン−結合t−PAを源泉材
料から分離し、(6)7(プリン−結合−t−PAを洗
浄し、且つ(7)t−PA溶出緩衝剤を用いてフィブリ
ンからt−PAを溶出する。塩及び過剰の溶出緩衝剤は
透析又はその他の便宜の手段によって除去することがで
きる。この手段は高度に純粋なt−PAを与える。
織又は体液のような源泉材料から、以下の段階によって
t−PA(組織グラスミノーゲン活性化因子)を単離す
る:(1)フィブリンをt−FA溶出緩衝剤と接触させ
ることによって予備処理して、フィブリンから溶出可能
な不純物を除去し、(2)t−pA溶出緩衝剤から予備
処理したフィブリンを分離し、(3)予備処理したフィ
ブリンを洗浄し、(4)予備処理し洗浄したフィブリン
を組織プラスミノーゲン活性化因子を含有する源泉材料
と接触させ、(5)フィブリン−結合t−PAを源泉材
料から分離し、(6)7(プリン−結合−t−PAを洗
浄し、且つ(7)t−PA溶出緩衝剤を用いてフィブリ
ンからt−PAを溶出する。塩及び過剰の溶出緩衝剤は
透析又はその他の便宜の手段によって除去することがで
きる。この手段は高度に純粋なt−PAを与える。
t−PAは、条件付けした細胞培地から、種々の組織(
f二とえば子宮組織)から、又は体液(たとえば血漿又
は尿)から、単離することができる。
f二とえば子宮組織)から、又は体液(たとえば血漿又
は尿)から、単離することができる。
″°源泉材料”及び“培地”という用語は、本発明の精
製方法において使用するt−PAの液体源泉を言及する
ために、本明細書中で互換的に使用する。培地中にt−
PAを分泌する細胞の限定的ではない例を挙げると、ヒ
トの黒色腫細胞系列及び謄帯内皮細胞がある。培地は漿
液を含有していても含有していなくてもよい。t−PA
は、培養物中の種々のその他の正常及び形質転換した哺
乳動物細胞、たとえば、ウシの大動脈内皮細胞、脱脂質
したブタの心臓組織などからも単離することができる。
製方法において使用するt−PAの液体源泉を言及する
ために、本明細書中で互換的に使用する。培地中にt−
PAを分泌する細胞の限定的ではない例を挙げると、ヒ
トの黒色腫細胞系列及び謄帯内皮細胞がある。培地は漿
液を含有していても含有していなくてもよい。t−PA
は、培養物中の種々のその他の正常及び形質転換した哺
乳動物細胞、たとえば、ウシの大動脈内皮細胞、脱脂質
したブタの心臓組織などからも単離することができる。
t−PAを結合させるために特別に予備処理したフィブ
リン又はフィブリン粉末を使用することが、本発明の方
法の重要な要素の一つである。前処理したフィブリンは
、t−PA源材料からの高度に純粋な状態にあるt −
PAの単離を容易にする。フィブリン粉末はたとえば、
シグマケミカル社から、商業的に入手することができる
。フィブリン粉末又は固定化フィブリンは本明細書中に
記す手順に従って前処理して、t−、PAの単離のため
に使用することができる。本明細書の全般にわたって、
“フィブリン”又は“フィブリン粉末”とは、沈澱又は
固定化したフィブリンで調製した表面又は粒子状フィブ
リンをも含むものとする。
リン又はフィブリン粉末を使用することが、本発明の方
法の重要な要素の一つである。前処理したフィブリンは
、t−PA源材料からの高度に純粋な状態にあるt −
PAの単離を容易にする。フィブリン粉末はたとえば、
シグマケミカル社から、商業的に入手することができる
。フィブリン粉末又は固定化フィブリンは本明細書中に
記す手順に従って前処理して、t−、PAの単離のため
に使用することができる。本明細書の全般にわたって、
“フィブリン”又は“フィブリン粉末”とは、沈澱又は
固定化したフィブリンで調製した表面又は粒子状フィブ
リンをも含むものとする。
t−PAの単離のために固定化フィブリンを用いようと
する場合には、記載のような前処理を、固定化の前又は
後のいずれで行ってもよい。フィブリンは、たとえば、
連続的な精製プロセスにおいて使用するために、固体又
は粒子状材料上に固定又は沈澱させることができる。本
発明の方法において使用するために、フィブリンをその
上に固定又は沈澱させることができる材料は、中空繊維
、無定形シリカ、珪藻土などを包含する。
する場合には、記載のような前処理を、固定化の前又は
後のいずれで行ってもよい。フィブリンは、たとえば、
連続的な精製プロセスにおいて使用するために、固体又
は粒子状材料上に固定又は沈澱させることができる。本
発明の方法において使用するために、フィブリンをその
上に固定又は沈澱させることができる材料は、中空繊維
、無定形シリカ、珪藻土などを包含する。
本発明のフィブリン前処理は、除去しないときはt−P
A溶出緩衝剤との接触に際してt−PAとの共溶出によ
ってt−PA製品を汚染するおそれがある、溶出可能な
不純物を除去する。本質的に種々の蛋白質から成る、こ
れらの汚染物は、七−PAからのその除去のためには、
複雑な精製手順を必要とするものと思われる。t−PA
の単離のために使用する前にフィブリンを精製すること
によって、t−PA自体の精製を単一の主工程のみに低
減することができる。フィブリン前処理は容易に達成す
ることができる。フィブリンをt−PA溶出緩衝剤を用
いて十分に洗浄することによって、さもなければt−P
Aと共に共溶出するおそれがある、望ましくない蛋白質
などを除去することができる。チオシアン酸カリウム(
“KSCN”)は好適なt −PA溶出緩衝剤でる。
A溶出緩衝剤との接触に際してt−PAとの共溶出によ
ってt−PA製品を汚染するおそれがある、溶出可能な
不純物を除去する。本質的に種々の蛋白質から成る、こ
れらの汚染物は、七−PAからのその除去のためには、
複雑な精製手順を必要とするものと思われる。t−PA
の単離のために使用する前にフィブリンを精製すること
によって、t−PA自体の精製を単一の主工程のみに低
減することができる。フィブリン前処理は容易に達成す
ることができる。フィブリンをt−PA溶出緩衝剤を用
いて十分に洗浄することによって、さもなければt−P
Aと共に共溶出するおそれがある、望ましくない蛋白質
などを除去することができる。チオシアン酸カリウム(
“KSCN”)は好適なt −PA溶出緩衝剤でる。
フィブリンを十分に洗浄するためには任意の便宜な方法
を用いることができる。たとえば、フィブリン粉末をバ
ッチ的にt−PA溶出緩衝剤と混合してもよいし、ある
いはフィブリン又はフィブリン被覆した担体を、t−P
A溶出緩衝剤との接触のために、カラム又はその他の充
填あるいは懸濁床形態中に入れるという、連続的なプロ
セスを用いることもできる。連続的プロセスにおいては
、フィブリン床を連続的にt−PA溶出緩衝剤と、次い
でt−PA源培地と、最後に再びt−PA溶出緩衝剤と
接触させることによって、フィブリンに結合するに至っ
たt−PAを取り出すことができる。
を用いることができる。たとえば、フィブリン粉末をバ
ッチ的にt−PA溶出緩衝剤と混合してもよいし、ある
いはフィブリン又はフィブリン被覆した担体を、t−P
A溶出緩衝剤との接触のために、カラム又はその他の充
填あるいは懸濁床形態中に入れるという、連続的なプロ
セスを用いることもできる。連続的プロセスにおいては
、フィブリン床を連続的にt−PA溶出緩衝剤と、次い
でt−PA源培地と、最後に再びt−PA溶出緩衝剤と
接触させることによって、フィブリンに結合するに至っ
たt−PAを取り出すことができる。
前魁理段階においては、フィブリンの徹底的な洗浄が必
要である。たとえば、バッチ方式においては、フィブリ
ンを1.5M KSCN溶液によって、数回、好ましく
は少なくとも5回洗浄すればよい。K S C,Nをt
−PA溶出緩衝剤として用いる場合には、溶液濃度は少
なくとも1.OMでなr′fればならず、少なくとも1
.5Mから約3.0Mに至るまでであることが好ましい
。フィブリンは、HPLC又は直接的な紫外吸収の読み
によって調べるときに、洗浄液中に存在する汚染蛋白質
が実質的に低下又は排除されるまで、洗浄しなければな
らない。
要である。たとえば、バッチ方式においては、フィブリ
ンを1.5M KSCN溶液によって、数回、好ましく
は少なくとも5回洗浄すればよい。K S C,Nをt
−PA溶出緩衝剤として用いる場合には、溶液濃度は少
なくとも1.OMでなr′fればならず、少なくとも1
.5Mから約3.0Mに至るまでであることが好ましい
。フィブリンは、HPLC又は直接的な紫外吸収の読み
によって調べるときに、洗浄液中に存在する汚染蛋白質
が実質的に低下又は排除されるまで、洗浄しなければな
らない。
この徹底的な洗浄工程は、商業的に入手するときに伴な
っている低分子量汚染物を除去してフィブリンを精製す
る。従来の方法はいずれも、溶出可能な低分子量不純物
を含有していないフィブリン組成物を与えることはでき
ないものと思われる。
っている低分子量汚染物を除去してフィブリンを精製す
る。従来の方法はいずれも、溶出可能な低分子量不純物
を含有していないフィブリン組成物を与えることはでき
ないものと思われる。
それ故、本発明のt−PA精製方法において使用するた
めに必要な、この精製した形態のフィブリンは、新規な
組成物であるとみなされる。
めに必要な、この精製した形態のフィブリンは、新規な
組成物であるとみなされる。
前処理したフィブリン及び条件付けした培地又はその他
のt−PA源材料を、高度のt−PA−フィブリン結合
を確実にするために、t−PA分子と前処理したフィブ
リンの適切な界面を助長する便宜の手段によって、接触
させる。バッチ方式半連続的又は連続的なプロセス操作
を使用することができ、且つ特定のプロセス形態によっ
て必要とする調整は、この分野の一般的な専門家の知識
内にある。この段階は約4,0°Cにおいて1行なうこ
とが好ましいけれども、酵素の変性を生じさせるような
条件でない限りは、室温又はそれ以上に至るまでの温度
も適当である。穏やかな振とう又は撹拌が好ましい。
のt−PA源材料を、高度のt−PA−フィブリン結合
を確実にするために、t−PA分子と前処理したフィブ
リンの適切な界面を助長する便宜の手段によって、接触
させる。バッチ方式半連続的又は連続的なプロセス操作
を使用することができ、且つ特定のプロセス形態によっ
て必要とする調整は、この分野の一般的な専門家の知識
内にある。この段階は約4,0°Cにおいて1行なうこ
とが好ましいけれども、酵素の変性を生じさせるような
条件でない限りは、室温又はそれ以上に至るまでの温度
も適当である。穏やかな振とう又は撹拌が好ましい。
前処理したフィブリンにt−PAを結合させるために十
分な接触を保持し終わったのちに、培地又はその他の源
泉材料からフィブリンを分離する。
分な接触を保持し終わったのちに、培地又はその他の源
泉材料からフィブリンを分離する。
バッチ方式においては、分離は、たとえば、遠心分離又
は濾過によって行なうことができる。今や結合したt−
PAを包含しているフィブリンを緩衝液で洗浄する。適
当な緩衝液はりん酸ナトリウム緩衝液(pH5〜9)(
PBS)である。好適な緩衝液は0.01%のツイーン
80(商品名)(ICI、米国)を伴なうPBSである
。この段階において用いる緩衝液はこの明細書中で説明
し且つ言及した“t−PA溶出緩衝剤”ではない。
は濾過によって行なうことができる。今や結合したt−
PAを包含しているフィブリンを緩衝液で洗浄する。適
当な緩衝液はりん酸ナトリウム緩衝液(pH5〜9)(
PBS)である。好適な緩衝液は0.01%のツイーン
80(商品名)(ICI、米国)を伴なうPBSである
。この段階において用いる緩衝液はこの明細書中で説明
し且つ言及した“t−PA溶出緩衝剤”ではない。
次いでフィブリンからt−PA溶出緩衝剤を用いてt−
PAを溶出する。そのためには、1.5M KSCNを
用いることができ、且つ、それが好適なt−PA溶出緩
衝剤である。溶出は、それ以上のt−PAが溶出しなく
なるまで行なう。あまりに少量の溶出緩衝剤ではt−P
Aの溶出に対して十分ではない。それ故、溶出させるべ
きt−PA5.OPP当りに少なくとも約1.0−の溶
出緩衝剤を使用することが好ましい。次いで、七−PA
溶出緩衝剤及び塩を、分子量1000の酢酸セルロース
膜ヲ用い6.0.01%のツイーン80(商品名)を含
有するPBSに対する透析によって、精製t−PAから
除去する。高度に純粋なt−PAを与える透析工程は、
t−PAをヒトの患者注射するために使用することがで
きる前に行なうことが必要である。限外濾過の仕上げ工
程によって、存在している可能性がある可溶化したフィ
ブリンを除去する。
PAを溶出する。そのためには、1.5M KSCNを
用いることができ、且つ、それが好適なt−PA溶出緩
衝剤である。溶出は、それ以上のt−PAが溶出しなく
なるまで行なう。あまりに少量の溶出緩衝剤ではt−P
Aの溶出に対して十分ではない。それ故、溶出させるべ
きt−PA5.OPP当りに少なくとも約1.0−の溶
出緩衝剤を使用することが好ましい。次いで、七−PA
溶出緩衝剤及び塩を、分子量1000の酢酸セルロース
膜ヲ用い6.0.01%のツイーン80(商品名)を含
有するPBSに対する透析によって、精製t−PAから
除去する。高度に純粋なt−PAを与える透析工程は、
t−PAをヒトの患者注射するために使用することがで
きる前に行なうことが必要である。限外濾過の仕上げ工
程によって、存在している可能性がある可溶化したフィ
ブリンを除去する。
上記の方法によって単離したt−PAは高度に純粋であ
る。このt−PAは実質的に汚染蛋白質及びその他の汚
染物質を含有していない。従来の精製方法は、多くの他
の蛋白質で汚染された1 −PAを与える。現在、対照
標準用として入手することができるt−PAすら汚染蛋
白質を含有している。対照的に、本発明の方法によって
単離したt−PAは、5DS−PAGE分析において、
約90%の純度の純正t−PAに相当する、単一の主蛋
白質バンドによって特徴的である。
る。このt−PAは実質的に汚染蛋白質及びその他の汚
染物質を含有していない。従来の精製方法は、多くの他
の蛋白質で汚染された1 −PAを与える。現在、対照
標準用として入手することができるt−PAすら汚染蛋
白質を含有している。対照的に、本発明の方法によって
単離したt−PAは、5DS−PAGE分析において、
約90%の純度の純正t−PAに相当する、単一の主蛋
白質バンドによって特徴的である。
以下の実施例は例証のために与えるものであって、本発
明を制限することを意味してはいない。
明を制限することを意味してはいない。
本発明の説明の全体にわたり、以下の略号を使用する。
0C−摂氏度
cm” −立方センチメートル
2 − グラム
HPLC−高性能液体クロマトグラフィーKSCN−チ
オシアン酸カリウム M −モル濃度 min −分 m! −ミリリットル MW −分子量 PBS −りん酸塩緩衝食塩水 % −パーセント SDS −ドデシル硫酸ナトリウム 5DS−PAGE−SDSポリアクリルアミドゲル電気
泳動 t−PA−組織プラスミノーゲン活性化因子 μ2 − ミクロダラム 実施例1 フィブリン前処理−1lのフィブリン粉末(シグマケミ
カル社)を40.0−の1.5M KSCN溶液と共に
1時間撹拌して、望ましくない溶出可能な蛋白質を除い
た。この洗浄を全体で5回繰返した。処理したフィブリ
ン粉末を遠心分離によりKSCNから分離し、IM P
BS (pH7,0)で洗った。
オシアン酸カリウム M −モル濃度 min −分 m! −ミリリットル MW −分子量 PBS −りん酸塩緩衝食塩水 % −パーセント SDS −ドデシル硫酸ナトリウム 5DS−PAGE−SDSポリアクリルアミドゲル電気
泳動 t−PA−組織プラスミノーゲン活性化因子 μ2 − ミクロダラム 実施例1 フィブリン前処理−1lのフィブリン粉末(シグマケミ
カル社)を40.0−の1.5M KSCN溶液と共に
1時間撹拌して、望ましくない溶出可能な蛋白質を除い
た。この洗浄を全体で5回繰返した。処理したフィブリ
ン粉末を遠心分離によりKSCNから分離し、IM P
BS (pH7,0)で洗った。
t−PA精製−15,6μ2のt−PAを含有する容量
50.0mgの条件付けした培地を、上記のように前処
理したlIのフィブリン粉末と共に室温で2時間撹拌し
た。次いで消耗した培地から遠心分離によってフィブリ
ン粉末(既に結合t−PAを含有している)を分離して
、50−容量の食塩溶液で5回洗った。洗ったフィブリ
ン粉末を1゜5MのKSCN溶液と共に室温で1時間撹
拌して、結合t−PAを溶出した。遠心分離によってK
SCN溶出液からフィブリン粉末を分離した。溶出液を
限外濾過して塩を除いた。
50.0mgの条件付けした培地を、上記のように前処
理したlIのフィブリン粉末と共に室温で2時間撹拌し
た。次いで消耗した培地から遠心分離によってフィブリ
ン粉末(既に結合t−PAを含有している)を分離して
、50−容量の食塩溶液で5回洗った。洗ったフィブリ
ン粉末を1゜5MのKSCN溶液と共に室温で1時間撹
拌して、結合t−PAを溶出した。遠心分離によってK
SCN溶出液からフィブリン粉末を分離した。溶出液を
限外濾過して塩を除いた。
溶出液濃縮物は、フィブリンアガロース板を用いる標準
溶解ゾーン検定によって、11.07μ2の酵素的に活
性なt−PAを含有することが認められた。この検定に
おいては、寒天中に沈澱させたフィブリンを含有する板
を酵素的に活性なt−PAによって溶解する。ゾーンの
大きさはt−pAの量に相当する。この実施例において
認められた酵素活性の水準は、出発培地中の全t−PA
の71%の回収を示している。単離したt−PAに対し
て5DS−PAGEゲル分析を施すと、高純度のもので
あることが認められた。
溶解ゾーン検定によって、11.07μ2の酵素的に活
性なt−PAを含有することが認められた。この検定に
おいては、寒天中に沈澱させたフィブリンを含有する板
を酵素的に活性なt−PAによって溶解する。ゾーンの
大きさはt−pAの量に相当する。この実施例において
認められた酵素活性の水準は、出発培地中の全t−PA
の71%の回収を示している。単離したt−PAに対し
て5DS−PAGEゲル分析を施すと、高純度のもので
あることが認められた。
実施例2
フィブリン前処理−22のフィブリン(シグマケミカル
社)を50.Omj!の1.5M KSCNで5回洗浄
して汚染蛋白質を除去した。5回目のKSCN洗浄後に
、洗浄液中にはHPLCによって汚染蛋白質が検出され
なかった。処理したフィブリン粉末を遠心分離によりK
SCNから分離したのち、IM PBS (pH7,
0)で洗っに。
社)を50.Omj!の1.5M KSCNで5回洗浄
して汚染蛋白質を除去した。5回目のKSCN洗浄後に
、洗浄液中にはHPLCによって汚染蛋白質が検出され
なかった。処理したフィブリン粉末を遠心分離によりK
SCNから分離したのち、IM PBS (pH7,
0)で洗っに。
t−PA精製−883μ2のt−PAを含有する200
−容量の条件付けした培地を2.O2の処理フィブリン
と共に室温で2時間撹拌した。フィブリン−t−PA複
合体を分離して、実施例1と同様にしてt−PA溶出し
た。
−容量の条件付けした培地を2.O2の処理フィブリン
と共に室温で2時間撹拌した。フィブリン−t−PA複
合体を分離して、実施例1と同様にしてt−PA溶出し
た。
処理後の条件付は培地中の残留t−PA活性をフィブリ
ン凝血溶解検定によって評価して、625.0μ2のt
−PA(条件付けした培地中のt−PAの約75%)が
前処理フィブリンに結合していることを示した。
ン凝血溶解検定によって評価して、625.0μ2のt
−PA(条件付けした培地中のt−PAの約75%)が
前処理フィブリンに結合していることを示した。
実施例1に記すような、2M KSCNを用いる溶出後
に、フィブリン凝血溶解検定によって、45.0−の溶
出液全量中に548.0μ2のt−PAが溶出している
ことが評価された。5DS−PAGE分析は、約り0%
純度の純正t−PAに相当する、単一主蛋白質バンド(
分子量約62゜000)を示した。
に、フィブリン凝血溶解検定によって、45.0−の溶
出液全量中に548.0μ2のt−PAが溶出している
ことが評価された。5DS−PAGE分析は、約り0%
純度の純正t−PAに相当する、単一主蛋白質バンド(
分子量約62゜000)を示した。
この実施例において、上記の前処理したフィブリンの代
りに、洗浄しないか又は部分的に洗浄したフィブリンを
用いて対照試験を行なった。“部分的洗浄”は、前記の
ようなKSCNを用いる112.3又は4回の洗浄と定
義する。すべての対照試験において、条件付けした培地
からのt−PAの完全な結合が認められた。しかしなが
ら、非洗浄又は部分的洗浄フィブリン対照試料中の溶出
t−PAは5DS−PAGE分析によって示されるよう
に、少なくとも3つの非特異的に結合した又は内在的な
フィブロイン蛋白質で汚染されていた。
りに、洗浄しないか又は部分的に洗浄したフィブリンを
用いて対照試験を行なった。“部分的洗浄”は、前記の
ようなKSCNを用いる112.3又は4回の洗浄と定
義する。すべての対照試験において、条件付けした培地
からのt−PAの完全な結合が認められた。しかしなが
ら、非洗浄又は部分的洗浄フィブリン対照試料中の溶出
t−PAは5DS−PAGE分析によって示されるよう
に、少なくとも3つの非特異的に結合した又は内在的な
フィブロイン蛋白質で汚染されていた。
実施例3
中空繊維上の沈澱フィブリンを使用して、上記のt−P
A精製方法のスケールアップを行なった。
A精製方法のスケールアップを行なった。
大容量(4,Omj)の中空繊維上の受動吸着によって
フィブリノーゲン(352)を固定化した。洗浄後に、
1.omMのCaCQzを含有する炭酸塩緩衝液中の5
.0μ2のトロンビンを、3時間にわたってカートリッ
ジ中に循環させた。
フィブリノーゲン(352)を固定化した。洗浄後に、
1.omMのCaCQzを含有する炭酸塩緩衝液中の5
.0μ2のトロンビンを、3時間にわたってカートリッ
ジ中に循環させた。
500μ2のt−PAを含有する容量400.0−の条
件付けした培地を、沈澱したフィブリンへのt−FAの
最高の結合のために、3.0mj!/minの流速で、
上に調製した中空繊維中に循環させた。
件付けした培地を、沈澱したフィブリンへのt−FAの
最高の結合のために、3.0mj!/minの流速で、
上に調製した中空繊維中に循環させた。
培地中のt−PAの本質的に全部がフィブリンに結合し
た。次いでPBSによる最初の洗浄後に、カートリッジ
中に溶出緩衝剤(1,5M KSCN)を循環させるこ
とによって、t−PAを溶出した。
た。次いでPBSによる最初の洗浄後に、カートリッジ
中に溶出緩衝剤(1,5M KSCN)を循環させるこ
とによって、t−PAを溶出した。
実施例4
商業的に入手することができるt−PAと本発明の方法
によって精製したt−PAの間の純度比較を行なった。
によって精製したt−PAの間の純度比較を行なった。
試験t−PA試料は実施例3におけるようにして精製し
た。市販のt−PAはCF2社から取得した。純度の比
較は5DS−PAGE分析によって行なった。しかしな
がら、市販のt−PAはすべて、安定剤として用いられ
るBSA(ウシの血清アルブミン)又はISA (ヒト
の血清アルブミン)と混合して市販されており、それが
純度の比較を困難とする。本発明によって精製した試験
t−PAは単一の蛋白質バンドを与えた。市販のt−P
Aは複数の蛋白質バンドを与えた。
た。市販のt−PAはCF2社から取得した。純度の比
較は5DS−PAGE分析によって行なった。しかしな
がら、市販のt−PAはすべて、安定剤として用いられ
るBSA(ウシの血清アルブミン)又はISA (ヒト
の血清アルブミン)と混合して市販されており、それが
純度の比較を困難とする。本発明によって精製した試験
t−PAは単一の蛋白質バンドを与えた。市販のt−P
Aは複数の蛋白質バンドを与えた。
実施例5
前記の実施例3におけるようにして調製したフィブリン
カートリッジをt−1)A含有条件付は培地の2追加容
量の精製に対して再循環させた。第2表は、条件付けし
た培地の容量及びその中の七−PAの濃度、並びに精製
サイクルの結果を示す。
カートリッジをt−1)A含有条件付は培地の2追加容
量の精製に対して再循環させた。第2表は、条件付けし
た培地の容量及びその中の七−PAの濃度、並びに精製
サイクルの結果を示す。
これらのデータから本発明のt−PA精製方法は連続プ
ロセス方式に対して適用可能であることを示している。
ロセス方式に対して適用可能であることを示している。
第 2 表
1 400mj2 1000 100 832
832 221m1554100 525 943
298a+j! 74786712 95上記の説
明において本発明の原理、好適具体化及び操作方式を記
した。しかしながら、ここに保護することを意図する本
発明は、これらの特定形態は制限的なものではなく単な
る例証とみなすべきであるから、これらの形態に限定を
うけるものとみなすべきではない。この分野の熟達者は
、本発明の精神から逸脱することなく、種々の修飾及び
変更を行なうことができよう。
832 221m1554100 525 943
298a+j! 74786712 95上記の説
明において本発明の原理、好適具体化及び操作方式を記
した。しかしながら、ここに保護することを意図する本
発明は、これらの特定形態は制限的なものではなく単な
る例証とみなすべきであるから、これらの形態に限定を
うけるものとみなすべきではない。この分野の熟達者は
、本発明の精神から逸脱することなく、種々の修飾及び
変更を行なうことができよう。
本発明の主な特徴及び態様を記すと次のとおりである。
1、(a)フィブリンをt−PA溶出緩衝液と接触させ
て溶出可能な不純物をフィブリンから除去することによ
ってフィブリンを予備処理し、 (b)予備処理したフィブリンをt−PA溶出緩衝液か
ら分離し、 (C)予備処理したフィブリンを洗浄し、(d)洗浄し
た予備処理フィブリンをt−PAを含有する源泉材料と
接触させ、 (e)フィブリン−結合t−PAを該源泉材料から分離
し、 (r)フィブリン−結合t−PAを洗浄し、且つ(g)
フィブリンからt−PA溶出緩衝液を用いてt−PAを
溶出する ことによって、源泉材料からt−PAを単離するための
方法。
て溶出可能な不純物をフィブリンから除去することによ
ってフィブリンを予備処理し、 (b)予備処理したフィブリンをt−PA溶出緩衝液か
ら分離し、 (C)予備処理したフィブリンを洗浄し、(d)洗浄し
た予備処理フィブリンをt−PAを含有する源泉材料と
接触させ、 (e)フィブリン−結合t−PAを該源泉材料から分離
し、 (r)フィブリン−結合t−PAを洗浄し、且つ(g)
フィブリンからt−PA溶出緩衝液を用いてt−PAを
溶出する ことによって、源泉材料からt−PAを単離するための
方法。
2、該源泉材料は条件付けした細胞培地、組織標本及び
体液から選択する上記lに記載の方法。
体液から選択する上記lに記載の方法。
3、該フィブリンはフィブリン粉末又は中空繊維膜又は
不活性微粒子物質から選択した表面上に沈澱させてある
フィブリンである上記lに記載の方法。
不活性微粒子物質から選択した表面上に沈澱させてある
フィブリンである上記lに記載の方法。
4、段階(a)において用いるt−PA溶出緩衝剤はチ
オシアン酸カリウムである上記lに記載の方法。
オシアン酸カリウムである上記lに記載の方法。
5、該チオシアン酸カリウムの濃度は少なくとも約1.
0Mである上記5に記載の方法。
0Mである上記5に記載の方法。
6、該濃度は約1.5M乃至約3.0Mである上記5に
記載の方法。
記載の方法。
7、該フィブリンをt−PA溶出緩衝剤を用いて十分に
洗浄して洗浄液中の汚染蛋白質の存在を実質的に低下さ
せるか又は排除するすることによって予備処理する上記
lに記載の方法。
洗浄して洗浄液中の汚染蛋白質の存在を実質的に低下さ
せるか又は排除するすることによって予備処理する上記
lに記載の方法。
8、該予備処理したフィブリンを段階(C)においてり
ん酸塩緩衝した食塩水によって洗浄する上記lに記載の
方法。
ん酸塩緩衝した食塩水によって洗浄する上記lに記載の
方法。
9、段階(f)の該フィブリン結合t−PAをりん酸塩
緩衝した食塩水によって洗浄する上記lに記載の方法。
緩衝した食塩水によって洗浄する上記lに記載の方法。
IO0段階(g)は溶出すべきt−PAの0.5ミクロ
ダラム当りに対して少なくとも約1.0−のt−PA溶
出緩衝剤を使用する上記lに記載の方法。
ダラム当りに対して少なくとも約1.0−のt−PA溶
出緩衝剤を使用する上記lに記載の方法。
11、段階(g)においてフィブリンから溶出したt−
PA透析旭理を施す上記lに記載の方法。
PA透析旭理を施す上記lに記載の方法。
12、上記lに記載の方法によって単離した組織プラス
ミノーゲン活性化因子。
ミノーゲン活性化因子。
13、汚染蛋白質を含有していない高度に精製したt−
PA。
PA。
14、t−PA溶出緩衝剤によって溶出することができ
る不純物を実質的に含有していないことを特徴とする、
高度に精製したフィブリン。
る不純物を実質的に含有していないことを特徴とする、
高度に精製したフィブリン。
15、フィブリンをt−PA溶出緩衝剤を用いて十分に
洗浄することによって調製した、上記14に記載の高度
に精製したフィブリン。
洗浄することによって調製した、上記14に記載の高度
に精製したフィブリン。
16、チオシアン酸カリウムを用いて十分に洗浄するこ
とによって調製した上記15に記載の高度に精製したフ
ィブリン。
とによって調製した上記15に記載の高度に精製したフ
ィブリン。
17、りん酸塩緩衝食塩水を用いて洗浄する上記15に
記載の高度に精製したフィブリン。
記載の高度に精製したフィブリン。
特許出願人 ダブリュー・アール・ブレイス・アンド・
カンパニー一コネチカット
カンパニー一コネチカット
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、(a)フィブリンをt−PA溶出緩衝剤と接触させ
て溶出可能な不純物をフィブリンから除去することによ
ってフィブリンを予備処理し、 (b)予備処理したフィブリンをt−PA溶出緩衝剤か
ら分離し、 (c)予備処理したフィブリンを洗浄し、 (d)洗浄した予備処理フィブリンをt−PAを含有す
る源泉材料と接触させ、 (e)フィブリン−結合t−PAを該源泉材料から分離
し、 (f)フィブリン−結合t−PAを洗浄し、且つ(g)
フィブリンからt−PA溶出緩衝剤を用いてt−PAを
溶出する ことによって、源泉材料からt−PAを単離するための
方法。 2、該フィブリンはフィブリン粉末、又は中空繊維膜又
は不活性微粒子物質から選択した表面上に沈澱させてあ
るフィブリンである、特許請求の範囲第1項記載の方法
。 3、段階(a)において用いるt−PA溶出緩衝剤はチ
オシアン酸カリウムである特許請求の範囲第1項記載の
方法。 4、該フィブリンをt−PA溶出緩衝剤を用いて十分に
洗浄して洗浄液中の汚染蛋白質の存在を実質的に低下さ
せるか又は排除するすることによって予備処理する、特
許請求の範囲第1項記載の方法。 5、段階(g)においてフィブリンから溶出したt−P
Aに透析処理を施すことを包含する特許請求の範囲第1
項記載の方法。 6、汚染蛋白質を含有していない高度に精製したt−P
A。 7、t−PA溶出緩衝剤によって溶出することができる
不純物を実質的に含有していないことを特徴とする、高
度に精製したフィブリン。 8、フィブリンをt−PA溶出緩衝剤を用いて十分に洗
浄することによって調製した、特許請求の範囲第7項記
載の高度に精製したフィブリン。 9、チオシアン酸カリウムを用いて十分に洗浄すること
によって調製した特許請求の範囲第8項記載の高度に精
製したフィブリン。 10、りん酸塩緩衝食塩水を用いて洗浄する、特許請求
の範囲第8項記載の高度に精製したフィブリン。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US9703587A | 1987-09-16 | 1987-09-16 | |
US097035 | 1987-09-16 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01108985A true JPH01108985A (ja) | 1989-04-26 |
Family
ID=22260492
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP22888888A Pending JPH01108985A (ja) | 1987-09-16 | 1988-09-14 | 組織プラスミノーゲン活性化因子の精製方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0307774A3 (ja) |
JP (1) | JPH01108985A (ja) |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1981001417A1 (en) * | 1979-11-13 | 1981-05-28 | S Husain | Isolation of plasminogen activators useful as therapeutic and diagnostic agents |
ES2003262A6 (es) * | 1987-04-20 | 1988-10-16 | Arche S R L Lab | Procedimiento extractivo del activador tisular del plasminogeno a partir del ovario de cerda prenada |
-
1988
- 1988-09-07 EP EP88114583A patent/EP0307774A3/en not_active Withdrawn
- 1988-09-14 JP JP22888888A patent/JPH01108985A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0307774A2 (en) | 1989-03-22 |
EP0307774A3 (en) | 1990-02-28 |
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