JPH01108985A - 組織プラスミノーゲン活性化因子の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は一般的に組織プラスミノーゲン活性化因子（“
ｔ−ＰＡ”）の精製に関するものである。

さらに詳細には、単一の処理操作で精製したｔ−ＰＡを
与える、きわめて簡単な精製方法が見出された。本発明
のｔ−ＰＡ製品は、従来は、単一段階プロセスで且つ高
収率でそのような形態において単離されたことはない、
高度に精製した組成物である。

ｔ−ＰＡ類、すなわち組織プラスミノーゲン活性化因子
は、プロ酵素プラスミノーゲンを酵素的に活性なプラス
ミンに転化することによって、凝血の溶解を包含する、
循環機能に役割を果すものと思われる。プラスミン、繊
維分解性プロテイナーゼ、は、凝血の主成分であるフィ
ブリンを溶解する働きをする。心臓発作患者における凝
血を溶解するためのｔ−ＰＡの治療的な使用は早くから
臨床試験においてすばらしい成功をおさめ、且つ、既に
定評のある凝血溶解酵素、クラウスナー、“リサーチャ
ホズプローブ第二世代ｔ−ＰＡ”、ビオ／テクノロジー
、第４巻７０７〜ｌｌ１頁（１９８６）によって報告さ
れたような、ストレプトキナーゼの効率を、既に遥かに
越えている。凝血のフィブリン成分に対するｔ−ＰＡ類
の特異性は、内出血をもたらすおそれがある、たとえば
フィブリノーゲンのような、血液蛋白質の組織的分解の
回避という、臨床的に重要な利点を有している。

ｔ−ＰＡ類の治療的な使用に対する一般的な欠点の一つ
は、組織又は細胞培地から、あるいは体液から、それら
を単離することの困難性である。

ｔ−ＰＡを分泌することが知られている組織からの細胞
は、培地へのｔ−ＰＡの生産と分泌のために培養するこ
とができる。この“条件付けした”培地を集めて種々の
精製プロセスを施す。種々の組織、たとえば、子宮組織
、内皮細胞など、によって生産される種々の公知のｔ−
ＰＡ類が存在する。

ｔ−ＰＡを精製するための既知の方法は、きわめて複雑
であって、多くの工程を必要とする。その上、従来の方
法による収率は、約２０〜約６０％の範囲にすぎない。

さらにまた、従来の方法によって生じるｔ−ＰＡ製品は
、なお蛋白質汚染物を含有している可能性がある。

米国特許第４，３８１．３４６号（ハラシンら）は、プ
ラスミノゲーン活性化因子を固定化フィブリンに結合さ
せ、溶出したのち、ゲル濾過カラムを通過させて溶離剤
とフィブリン汚染物からプラスミノゲーン活性化因子を
分離することから成る手順により、尿又は腎臓組織培地
からプラスミノゲーン活性化因子を単離するための方法
を開示している。活性化因子はアルギニン、リシン又は
ε−アミノ−カプロン酸を用いるカラムから約６０％の
収率で溶出する。リーケンら“培養物中のヒトの黒色腫
細胞が分泌するプラスミノゲーン活性化因子の精製とキ
ャラクタリゼーション”、ジャーナル　オブ　ビオロジ
カル　ケミストリー、第２５６巻、７０３５〜４１頁（
１９８１）は、亜鉛キレート−アガロース、コンカナバ
リンＡ−アガロース及びセファデックスＧ−１５０カラ
ムによる３段階クロマトグラフィー工程を使用し、且つ
透析及び遠心分離工程をも包含し、且つ４６％の収率を
うる精製方法を記している。同様に、ブーイスら、“尿
ウロキナーゼと区別できない、培養したヒトの内皮細胞
からのウロキナーゼ形プラスミノゲーンの単離とキャラ
クタリゼーション゛′、ジャーナル　オブ　ビオロジカ
ル　ケミストリー、第２５９巻、７１９８〜２０５頁（
１９８４）は、トリトンＸ−１００の存在における漿液
を含まない条件付けした培地からのｐ−アミノベンズア
ミジン−アガロース親和カクロマトグラフイー、その後
の親和精製特異的抗ウロキナーゼＩｇＧ−セファロース
ＣＬ−４Ｂ上の免疫吸着クロマトグラフィーによる、約
４７％の収率での、精製を開示している。

発明の要約 ｔ−ＰＡの精製に対して以前に開示された方法とは著し
く異なって、本発明の方法は簡単且つ効率的である。こ
の方法は本質的に、条件付けした細胞培地又はその他の
ｔ−ＰＡ源培地を、予備処理したフィブリン粉末又はフ
ィブリン表面と接触させ、フィブリンに結合しているｔ
−ＰＡを溶出することから成っている。フィブリンから
の１−ＰＡの溶出ののちに、過剰のｔ−ＰＡ溶出緩衝剤
は、透析又はその他の通常の方法によって、溶出したｔ
−ＰＡから除去することができる。ここに記した方法を
用いて、少なくとも７０〜７５％またはそれ以上のｔ−
ＰＡ収率を達成することができる。その上、この方法に
よる最後的なｔ−ＰＡ製品は、最低の工程数を用いて生
成した、高度に純粋な組成物である。

本発明の第一の目的は、条件付けした細胞培地、組織又
は体液からのｔ−ＰＡの精製のための能率的且つ効率的
方法を提供することにある。この方法は条件付けした培
地又はその他の源泉から、蛋白質不純物による最低限度
の汚染物をもつにすぎない、高度に精製したｔ−ＰＡ生
成物を生じる、ｔ−ＰＡを直接に単離することができ精
製方法を提供する。

この物質に対して予想される臨床的な需要に対応すべき
大量の精製ｔ−ＰＡの製造に対する、経済的であり且つ
適切な、治療用品縁のｔ−ＰＡ単離のための方法を提供
することは、密接に関連する本発明の目的である。

さらに、商業的に入手することがでさるフィブリンに一
般的に伴なわれる不純物によるｔ−ＰＡの汚染をほとん
ど排除するような具合に、本発明のｔ−ＰＡ精製に対し
て使用すべきフィブリン粉末を予備処理するための方法
を提供することもまｔこ、目的の一つである。

さらに他の目的は、精製した状態のｔ−ＰＡを単離する
ための高価且つ／又は複雑なりロマトグラフイー媒体及
び地理工程の必要を排除する、条件付けした培地又はそ
の他の源泉からのｔ−ＰＡの、安価で容易に入手するこ
とができる吸着剤上への直接的且つ特異的な結合に基づ
く、ｔ−ＰＡ精製方法を提供することにある。その結果
として、きわめて低い単離コストにおいて、大量の精製
ｔ−ＰＡを生産することができる。

発明の説明 本発明に従って、たとえば、条件付けした細胞培地、組
織又は体液のような源泉材料から、以下の段階によって
ｔ−ＰＡ（組織グラスミノーゲン活性化因子）を単離す
る：（１）フィブリンをｔ−ＦＡ溶出緩衝剤と接触させ
ることによって予備処理して、フィブリンから溶出可能
な不純物を除去し、（２）ｔ−ｐＡ溶出緩衝剤から予備
処理したフィブリンを分離し、（３）予備処理したフィ
ブリンを洗浄し、（４）予備処理し洗浄したフィブリン
を組織プラスミノーゲン活性化因子を含有する源泉材料
と接触させ、（５）フィブリン−結合ｔ−ＰＡを源泉材
料から分離し、（６）７（プリン−結合−ｔ−ＰＡを洗
浄し、且つ（７）ｔ−ＰＡ溶出緩衝剤を用いてフィブリ
ンからｔ−ＰＡを溶出する。塩及び過剰の溶出緩衝剤は
透析又はその他の便宜の手段によって除去することがで
きる。この手段は高度に純粋なｔ−ＰＡを与える。

ｔ−ＰＡは、条件付けした細胞培地から、種々の組織（
ｆ二とえば子宮組織）から、又は体液（たとえば血漿又
は尿）から、単離することができる。

″°源泉材料”及び“培地”という用語は、本発明の精
製方法において使用するｔ−ＰＡの液体源泉を言及する
ために、本明細書中で互換的に使用する。培地中にｔ−
ＰＡを分泌する細胞の限定的ではない例を挙げると、ヒ
トの黒色腫細胞系列及び謄帯内皮細胞がある。培地は漿
液を含有していても含有していなくてもよい。ｔ−ＰＡ
は、培養物中の種々のその他の正常及び形質転換した哺
乳動物細胞、たとえば、ウシの大動脈内皮細胞、脱脂質
したブタの心臓組織などからも単離することができる。

ｔ−ＰＡを結合させるために特別に予備処理したフィブ
リン又はフィブリン粉末を使用することが、本発明の方
法の重要な要素の一つである。前処理したフィブリンは
、ｔ−ＰＡ源材料からの高度に純粋な状態にあるｔ　−
ＰＡの単離を容易にする。フィブリン粉末はたとえば、
シグマケミカル社から、商業的に入手することができる
。フィブリン粉末又は固定化フィブリンは本明細書中に
記す手順に従って前処理して、ｔ−、ＰＡの単離のため
に使用することができる。本明細書の全般にわたって、
“フィブリン”又は“フィブリン粉末”とは、沈澱又は
固定化したフィブリンで調製した表面又は粒子状フィブ
リンをも含むものとする。

ｔ−ＰＡの単離のために固定化フィブリンを用いようと
する場合には、記載のような前処理を、固定化の前又は
後のいずれで行ってもよい。フィブリンは、たとえば、
連続的な精製プロセスにおいて使用するために、固体又
は粒子状材料上に固定又は沈澱させることができる。本
発明の方法において使用するために、フィブリンをその
上に固定又は沈澱させることができる材料は、中空繊維
、無定形シリカ、珪藻土などを包含する。

本発明のフィブリン前処理は、除去しないときはｔ−Ｐ
Ａ溶出緩衝剤との接触に際してｔ−ＰＡとの共溶出によ
ってｔ−ＰＡ製品を汚染するおそれがある、溶出可能な
不純物を除去する。本質的に種々の蛋白質から成る、こ
れらの汚染物は、七−ＰＡからのその除去のためには、
複雑な精製手順を必要とするものと思われる。ｔ−ＰＡ
の単離のために使用する前にフィブリンを精製すること
によって、ｔ−ＰＡ自体の精製を単一の主工程のみに低
減することができる。フィブリン前処理は容易に達成す
ることができる。フィブリンをｔ−ＰＡ溶出緩衝剤を用
いて十分に洗浄することによって、さもなければｔ−Ｐ
Ａと共に共溶出するおそれがある、望ましくない蛋白質
などを除去することができる。チオシアン酸カリウム（
“ＫＳＣＮ”）は好適なｔ　−ＰＡ溶出緩衝剤でる。

フィブリンを十分に洗浄するためには任意の便宜な方法
を用いることができる。たとえば、フィブリン粉末をバ
ッチ的にｔ−ＰＡ溶出緩衝剤と混合してもよいし、ある
いはフィブリン又はフィブリン被覆した担体を、ｔ−Ｐ
Ａ溶出緩衝剤との接触のために、カラム又はその他の充
填あるいは懸濁床形態中に入れるという、連続的なプロ
セスを用いることもできる。連続的プロセスにおいては
、フィブリン床を連続的にｔ−ＰＡ溶出緩衝剤と、次い
でｔ−ＰＡ源培地と、最後に再びｔ−ＰＡ溶出緩衝剤と
接触させることによって、フィブリンに結合するに至っ
たｔ−ＰＡを取り出すことができる。

前魁理段階においては、フィブリンの徹底的な洗浄が必
要である。たとえば、バッチ方式においては、フィブリ
ンを１．５Ｍ　ＫＳＣＮ溶液によって、数回、好ましく
は少なくとも５回洗浄すればよい。Ｋ　Ｓ　Ｃ，Ｎをｔ
−ＰＡ溶出緩衝剤として用いる場合には、溶液濃度は少
なくとも１．ＯＭでなｒ′ｆればならず、少なくとも１
．５Ｍから約３．０Ｍに至るまでであることが好ましい
。フィブリンは、ＨＰＬＣ又は直接的な紫外吸収の読み
によって調べるときに、洗浄液中に存在する汚染蛋白質
が実質的に低下又は排除されるまで、洗浄しなければな
らない。

この徹底的な洗浄工程は、商業的に入手するときに伴な
っている低分子量汚染物を除去してフィブリンを精製す
る。従来の方法はいずれも、溶出可能な低分子量不純物
を含有していないフィブリン組成物を与えることはでき
ないものと思われる。

それ故、本発明のｔ−ＰＡ精製方法において使用するた
めに必要な、この精製した形態のフィブリンは、新規な
組成物であるとみなされる。

前処理したフィブリン及び条件付けした培地又はその他
のｔ−ＰＡ源材料を、高度のｔ−ＰＡ−フィブリン結合
を確実にするために、ｔ−ＰＡ分子と前処理したフィブ
リンの適切な界面を助長する便宜の手段によって、接触
させる。バッチ方式半連続的又は連続的なプロセス操作
を使用することができ、且つ特定のプロセス形態によっ
て必要とする調整は、この分野の一般的な専門家の知識
内にある。この段階は約４，０°Ｃにおいて１行なうこ
とが好ましいけれども、酵素の変性を生じさせるような
条件でない限りは、室温又はそれ以上に至るまでの温度
も適当である。穏やかな振とう又は撹拌が好ましい。

前処理したフィブリンにｔ−ＰＡを結合させるために十
分な接触を保持し終わったのちに、培地又はその他の源
泉材料からフィブリンを分離する。

バッチ方式においては、分離は、たとえば、遠心分離又
は濾過によって行なうことができる。今や結合したｔ−
ＰＡを包含しているフィブリンを緩衝液で洗浄する。適
当な緩衝液はりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５〜９）（
ＰＢＳ）である。好適な緩衝液は０．０１％のツイーン
８０（商品名）（ＩＣＩ、米国）を伴なうＰＢＳである
。この段階において用いる緩衝液はこの明細書中で説明
し且つ言及した“ｔ−ＰＡ溶出緩衝剤”ではない。

次いでフィブリンからｔ−ＰＡ溶出緩衝剤を用いてｔ−
ＰＡを溶出する。そのためには、１．５Ｍ　ＫＳＣＮを
用いることができ、且つ、それが好適なｔ−ＰＡ溶出緩
衝剤である。溶出は、それ以上のｔ−ＰＡが溶出しなく
なるまで行なう。あまりに少量の溶出緩衝剤ではｔ−Ｐ
Ａの溶出に対して十分ではない。それ故、溶出させるべ
きｔ−ＰＡ５．ＯＰＰ当りに少なくとも約１．０−の溶
出緩衝剤を使用することが好ましい。次いで、七−ＰＡ
溶出緩衝剤及び塩を、分子量１０００の酢酸セルロース
膜ヲ用い６．０．０１％のツイーン８０（商品名）を含
有するＰＢＳに対する透析によって、精製ｔ−ＰＡから
除去する。高度に純粋なｔ−ＰＡを与える透析工程は、
ｔ−ＰＡをヒトの患者注射するために使用することがで
きる前に行なうことが必要である。限外濾過の仕上げ工
程によって、存在している可能性がある可溶化したフィ
ブリンを除去する。

上記の方法によって単離したｔ−ＰＡは高度に純粋であ
る。このｔ−ＰＡは実質的に汚染蛋白質及びその他の汚
染物質を含有していない。従来の精製方法は、多くの他
の蛋白質で汚染された１　−ＰＡを与える。現在、対照
標準用として入手することができるｔ−ＰＡすら汚染蛋
白質を含有している。対照的に、本発明の方法によって
単離したｔ−ＰＡは、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析において、
約９０％の純度の純正ｔ−ＰＡに相当する、単一の主蛋
白質バンドによって特徴的である。

以下の実施例は例証のために与えるものであって、本発
明を制限することを意味してはいない。

本発明の説明の全体にわたり、以下の略号を使用する。

０Ｃ−摂氏度 ｃｍ”　　　−立方センチメートル ２　　−　グラム ＨＰＬＣ−高性能液体クロマトグラフィーＫＳＣＮ−チ
オシアン酸カリウム Ｍ　　　−モル濃度 ｍｉｎ　　−分 ｍ！　　　−ミリリットル ＭＷ　　　−分子量 ＰＢＳ　　−りん酸塩緩衝食塩水 ％　　　−パーセント ＳＤＳ　　−ドデシル硫酸ナトリウム ５ＤＳ−ＰＡＧＥ−ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動 ｔ−ＰＡ−組織プラスミノーゲン活性化因子 μ２　−　ミクロダラム 実施例１ フィブリン前処理−１ｌのフィブリン粉末（シグマケミ
カル社）を４０．０−の１．５Ｍ　ＫＳＣＮ溶液と共に
１時間撹拌して、望ましくない溶出可能な蛋白質を除い
た。この洗浄を全体で５回繰返した。処理したフィブリ
ン粉末を遠心分離によりＫＳＣＮから分離し、ＩＭ　Ｐ
ＢＳ　（ｐＨ７，０）で洗った。

ｔ−ＰＡ精製−１５，６μ２のｔ−ＰＡを含有する容量
５０．０ｍｇの条件付けした培地を、上記のように前処
理したｌＩのフィブリン粉末と共に室温で２時間撹拌し
た。次いで消耗した培地から遠心分離によってフィブリ
ン粉末（既に結合ｔ−ＰＡを含有している）を分離して
、５０−容量の食塩溶液で５回洗った。洗ったフィブリ
ン粉末を１゜５ＭのＫＳＣＮ溶液と共に室温で１時間撹
拌して、結合ｔ−ＰＡを溶出した。遠心分離によってＫ
ＳＣＮ溶出液からフィブリン粉末を分離した。溶出液を
限外濾過して塩を除いた。

溶出液濃縮物は、フィブリンアガロース板を用いる標準
溶解ゾーン検定によって、１１．０７μ２の酵素的に活
性なｔ−ＰＡを含有することが認められた。この検定に
おいては、寒天中に沈澱させたフィブリンを含有する板
を酵素的に活性なｔ−ＰＡによって溶解する。ゾーンの
大きさはｔ−ｐＡの量に相当する。この実施例において
認められた酵素活性の水準は、出発培地中の全ｔ−ＰＡ
の７１％の回収を示している。単離したｔ−ＰＡに対し
て５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析を施すと、高純度のもので
あることが認められた。

実施例２ フィブリン前処理−２２のフィブリン（シグマケミカル
社）を５０．Ｏｍｊ！の１．５Ｍ　ＫＳＣＮで５回洗浄
して汚染蛋白質を除去した。５回目のＫＳＣＮ洗浄後に
、洗浄液中にはＨＰＬＣによって汚染蛋白質が検出され
なかった。処理したフィブリン粉末を遠心分離によりＫ
ＳＣＮから分離したのち、ＩＭ　　ＰＢＳ　（ｐＨ７，
０）で洗っに。

ｔ−ＰＡ精製−８８３μ２のｔ−ＰＡを含有する２００
−容量の条件付けした培地を２．Ｏ２の処理フィブリン
と共に室温で２時間撹拌した。フィブリン−ｔ−ＰＡ複
合体を分離して、実施例１と同様にしてｔ−ＰＡ溶出し
た。

処理後の条件付は培地中の残留ｔ−ＰＡ活性をフィブリ
ン凝血溶解検定によって評価して、６２５．０μ２のｔ
−ＰＡ（条件付けした培地中のｔ−ＰＡの約７５％）が
前処理フィブリンに結合していることを示した。

実施例１に記すような、２Ｍ　ＫＳＣＮを用いる溶出後
に、フィブリン凝血溶解検定によって、４５．０−の溶
出液全量中に５４８．０μ２のｔ−ＰＡが溶出している
ことが評価された。５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、約り０％
純度の純正ｔ−ＰＡに相当する、単一主蛋白質バンド（
分子量約６２゜０００）を示した。

この実施例において、上記の前処理したフィブリンの代
りに、洗浄しないか又は部分的に洗浄したフィブリンを
用いて対照試験を行なった。“部分的洗浄”は、前記の
ようなＫＳＣＮを用いる１１２．３又は４回の洗浄と定
義する。すべての対照試験において、条件付けした培地
からのｔ−ＰＡの完全な結合が認められた。しかしなが
ら、非洗浄又は部分的洗浄フィブリン対照試料中の溶出
ｔ−ＰＡは５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって示されるよう
に、少なくとも３つの非特異的に結合した又は内在的な
フィブロイン蛋白質で汚染されていた。

実施例３ 中空繊維上の沈澱フィブリンを使用して、上記のｔ−Ｐ
Ａ精製方法のスケールアップを行なった。

大容量（４，Ｏｍｊ）の中空繊維上の受動吸着によって
フィブリノーゲン（３５２）を固定化した。洗浄後に、
１．ｏｍＭのＣａＣＱｚを含有する炭酸塩緩衝液中の５
．０μ２のトロンビンを、３時間にわたってカートリッ
ジ中に循環させた。

５００μ２のｔ−ＰＡを含有する容量４００．０−の条
件付けした培地を、沈澱したフィブリンへのｔ−ＦＡの
最高の結合のために、３．０ｍｊ！／ｍｉｎの流速で、
上に調製した中空繊維中に循環させた。

培地中のｔ−ＰＡの本質的に全部がフィブリンに結合し
た。次いでＰＢＳによる最初の洗浄後に、カートリッジ
中に溶出緩衝剤（１，５Ｍ　ＫＳＣＮ）を循環させるこ
とによって、ｔ−ＰＡを溶出した。

実施例４ 商業的に入手することができるｔ−ＰＡと本発明の方法
によって精製したｔ−ＰＡの間の純度比較を行なった。

試験ｔ−ＰＡ試料は実施例３におけるようにして精製し
た。市販のｔ−ＰＡはＣＦ２社から取得した。純度の比
較は５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって行なった。しかしな
がら、市販のｔ−ＰＡはすべて、安定剤として用いられ
るＢＳＡ（ウシの血清アルブミン）又はＩＳＡ　（ヒト
の血清アルブミン）と混合して市販されており、それが
純度の比較を困難とする。本発明によって精製した試験
ｔ−ＰＡは単一の蛋白質バンドを与えた。市販のｔ−Ｐ
Ａは複数の蛋白質バンドを与えた。

実施例５ 前記の実施例３におけるようにして調製したフィブリン
カートリッジをｔ−１）Ａ含有条件付は培地の２追加容
量の精製に対して再循環させた。第２表は、条件付けし
た培地の容量及びその中の七−ＰＡの濃度、並びに精製
サイクルの結果を示す。

これらのデータから本発明のｔ−ＰＡ精製方法は連続プ
ロセス方式に対して適用可能であることを示している。

第　　２　　表 １　　　４００ｍｊ２　　１０００　１００　　８３２
　　８３２　２２１ｍ１５５４１００　５２５　９４３
　２９８ａ＋ｊ！　　７４７８６７１２　９５上記の説
明において本発明の原理、好適具体化及び操作方式を記
した。しかしながら、ここに保護することを意図する本
発明は、これらの特定形態は制限的なものではなく単な
る例証とみなすべきであるから、これらの形態に限定を
うけるものとみなすべきではない。この分野の熟達者は
、本発明の精神から逸脱することなく、種々の修飾及び
変更を行なうことができよう。

本発明の主な特徴及び態様を記すと次のとおりである。

１、（ａ）フィブリンをｔ−ＰＡ溶出緩衝液と接触させ
て溶出可能な不純物をフィブリンから除去することによ
ってフィブリンを予備処理し、 （ｂ）予備処理したフィブリンをｔ−ＰＡ溶出緩衝液か
ら分離し、 （Ｃ）予備処理したフィブリンを洗浄し、（ｄ）洗浄し
た予備処理フィブリンをｔ−ＰＡを含有する源泉材料と
接触させ、 （ｅ）フィブリン−結合ｔ−ＰＡを該源泉材料から分離
し、 （ｒ）フィブリン−結合ｔ−ＰＡを洗浄し、且つ（ｇ）
フィブリンからｔ−ＰＡ溶出緩衝液を用いてｔ−ＰＡを
溶出する ことによって、源泉材料からｔ−ＰＡを単離するための
方法。

２、該源泉材料は条件付けした細胞培地、組織標本及び
体液から選択する上記ｌに記載の方法。

３、該フィブリンはフィブリン粉末又は中空繊維膜又は
不活性微粒子物質から選択した表面上に沈澱させてある
フィブリンである上記ｌに記載の方法。

４、段階（ａ）において用いるｔ−ＰＡ溶出緩衝剤はチ
オシアン酸カリウムである上記ｌに記載の方法。

５、該チオシアン酸カリウムの濃度は少なくとも約１．
０Ｍである上記５に記載の方法。

６、該濃度は約１．５Ｍ乃至約３．０Ｍである上記５に
記載の方法。

７、該フィブリンをｔ−ＰＡ溶出緩衝剤を用いて十分に
洗浄して洗浄液中の汚染蛋白質の存在を実質的に低下さ
せるか又は排除するすることによって予備処理する上記
ｌに記載の方法。

８、該予備処理したフィブリンを段階（Ｃ）においてり
ん酸塩緩衝した食塩水によって洗浄する上記ｌに記載の
方法。

９、段階（ｆ）の該フィブリン結合ｔ−ＰＡをりん酸塩
緩衝した食塩水によって洗浄する上記ｌに記載の方法。

ＩＯ０段階（ｇ）は溶出すべきｔ−ＰＡの０．５ミクロ
ダラム当りに対して少なくとも約１．０−のｔ−ＰＡ溶
出緩衝剤を使用する上記ｌに記載の方法。

１１、段階（ｇ）においてフィブリンから溶出したｔ−
ＰＡ透析旭理を施す上記ｌに記載の方法。

１２、上記ｌに記載の方法によって単離した組織プラス
ミノーゲン活性化因子。

１３、汚染蛋白質を含有していない高度に精製したｔ−
ＰＡ。

１４、ｔ−ＰＡ溶出緩衝剤によって溶出することができ
る不純物を実質的に含有していないことを特徴とする、
高度に精製したフィブリン。

１５、フィブリンをｔ−ＰＡ溶出緩衝剤を用いて十分に
洗浄することによって調製した、上記１４に記載の高度
に精製したフィブリン。

１６、チオシアン酸カリウムを用いて十分に洗浄するこ
とによって調製した上記１５に記載の高度に精製したフ
ィブリン。

１７、りん酸塩緩衝食塩水を用いて洗浄する上記１５に
記載の高度に精製したフィブリン。

特許出願人　ダブリュー・アール・ブレイス・アンド・
カンパニー一コネチカット

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）フィブリンをｔ−ＰＡ溶出緩衝剤と接触させ
   て溶出可能な不純物をフィブリンから除去することによ
   ってフィブリンを予備処理し、 （ｂ）予備処理したフィブリンをｔ−ＰＡ溶出緩衝剤か
   ら分離し、 （ｃ）予備処理したフィブリンを洗浄し、 （ｄ）洗浄した予備処理フィブリンをｔ−ＰＡを含有す
   る源泉材料と接触させ、 （ｅ）フィブリン−結合ｔ−ＰＡを該源泉材料から分離
   し、 （ｆ）フィブリン−結合ｔ−ＰＡを洗浄し、且つ（ｇ）
   フィブリンからｔ−ＰＡ溶出緩衝剤を用いてｔ−ＰＡを
   溶出する ことによって、源泉材料からｔ−ＰＡを単離するための
   方法。 ２、該フィブリンはフィブリン粉末、又は中空繊維膜又
   は不活性微粒子物質から選択した表面上に沈澱させてあ
   るフィブリンである、特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ３、段階（ａ）において用いるｔ−ＰＡ溶出緩衝剤はチ
   オシアン酸カリウムである特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ４、該フィブリンをｔ−ＰＡ溶出緩衝剤を用いて十分に
   洗浄して洗浄液中の汚染蛋白質の存在を実質的に低下さ
   せるか又は排除するすることによって予備処理する、特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、段階（ｇ）においてフィブリンから溶出したｔ−Ｐ
   Ａに透析処理を施すことを包含する特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ６、汚染蛋白質を含有していない高度に精製したｔ−Ｐ
   Ａ。 ７、ｔ−ＰＡ溶出緩衝剤によって溶出することができる
   不純物を実質的に含有していないことを特徴とする、高
   度に精製したフィブリン。 ８、フィブリンをｔ−ＰＡ溶出緩衝剤を用いて十分に洗
   浄することによって調製した、特許請求の範囲第７項記
   載の高度に精製したフィブリン。 ９、チオシアン酸カリウムを用いて十分に洗浄すること
   によって調製した特許請求の範囲第８項記載の高度に精
   製したフィブリン。 １０、りん酸塩緩衝食塩水を用いて洗浄する、特許請求
   の範囲第８項記載の高度に精製したフィブリン。