JPH089640B2 - ヒト・インターロイキン−2受容体 - Google Patents
ヒト・インターロイキン−2受容体Info
- Publication number
- JPH089640B2 JPH089640B2 JP6105124A JP10512494A JPH089640B2 JP H089640 B2 JPH089640 B2 JP H089640B2 JP 6105124 A JP6105124 A JP 6105124A JP 10512494 A JP10512494 A JP 10512494A JP H089640 B2 JPH089640 B2 JP H089640B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- receptor
- thr
- glu
- dna
- gln
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は遺伝子組み換え技術で得
られたヒト・インターロイキン−2受容体およびその製
造法に関する。
られたヒト・インターロイキン−2受容体およびその製
造法に関する。
【0002】
【従来の技術】インターロイキン−2(以下IL−2と
略称することがある)は、T細胞をインビトロでその機
能を保持したまま増殖させ長期間の継代維持を可能にす
るほかに、胸腺細胞のマイトージェン反応を促進させた
り、ヌードマウス脾細胞のT細胞依存性抗原に対する抗
体産生能を回復させたり、キラー細胞の分化増殖を促進
する作用を有することが知られている(ザ・ジャーナル
・オブ・イムノロジー,第123巻,2928−292
9頁,1979年;イムノロジカル・レビュー,第51
巻,257−278頁、1980年)が、これら全ての
作用には、IL−2と細胞表面に存在するIL−2受容
体との相互作用が不可欠である(ジャーナル・オブ・エ
クスペリメンタル・メディスン,第154巻,1455
−1474頁,1981年;同誌,第158巻,189
5−1911頁,1983年;プロシーディング・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス,第80
巻,6957−6961頁,1983年)。最近、ヒト
T細胞白血病患者血液から樹立したIL−2依存性細胞
株をマウスに免疫して得られた抗Tacモノクローナル
抗体〔ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー,第126
巻,1393頁(1981年)〕がIL−2受容体を認
識していることが示唆されたことから、抗Tac抗体を
用いてのIL−2受容体の生化学的解析が急速に進んだ
〔ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディス
ン,第158巻,1332頁(1983年);ネイチャ
ー,第300巻,267頁(1982年);プロシージ
ングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス,第80巻,6957頁(1983年)〕。抗
Tac抗体とTac抗原との結合部位がIL−2とIL
−2受容体との結合部位と同一であるか否かに関しては
疑問が残されているものの、Tac抗原とIL−2受容
体がその性状において大部分が共通することは明らかと
なった。このようなIL−2とIL−2受容体との相互
作用を利用してこれまでにT細胞やナチュラルキラー細
胞のクローン化に成功している(たとえばネイチャー,
第268巻,154−156頁,1977年;ザ・ジャ
ーナル・オブ・イムノロジー,第130巻,981−9
87頁,1983年)。また、T細胞の白血病化とTa
c抗原の異常発現との間に関係のあることが示唆されて
おり(ブラッド,第62巻,509−510頁,198
3年)、一方、正常細胞においては抗Tac抗体による
IL−2受容体数の減少がみられるのに対し、白血病細
胞では抗Tac抗体によるIL−2受容体数の減少がみ
られない(ダウン・レギュレーションの欠除)ことがわ
かっている(ザ・ジャーナル・オブ・ブラッド,第61
巻,1014−1016頁,1983年)。
略称することがある)は、T細胞をインビトロでその機
能を保持したまま増殖させ長期間の継代維持を可能にす
るほかに、胸腺細胞のマイトージェン反応を促進させた
り、ヌードマウス脾細胞のT細胞依存性抗原に対する抗
体産生能を回復させたり、キラー細胞の分化増殖を促進
する作用を有することが知られている(ザ・ジャーナル
・オブ・イムノロジー,第123巻,2928−292
9頁,1979年;イムノロジカル・レビュー,第51
巻,257−278頁、1980年)が、これら全ての
作用には、IL−2と細胞表面に存在するIL−2受容
体との相互作用が不可欠である(ジャーナル・オブ・エ
クスペリメンタル・メディスン,第154巻,1455
−1474頁,1981年;同誌,第158巻,189
5−1911頁,1983年;プロシーディング・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス,第80
巻,6957−6961頁,1983年)。最近、ヒト
T細胞白血病患者血液から樹立したIL−2依存性細胞
株をマウスに免疫して得られた抗Tacモノクローナル
抗体〔ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー,第126
巻,1393頁(1981年)〕がIL−2受容体を認
識していることが示唆されたことから、抗Tac抗体を
用いてのIL−2受容体の生化学的解析が急速に進んだ
〔ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディス
ン,第158巻,1332頁(1983年);ネイチャ
ー,第300巻,267頁(1982年);プロシージ
ングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス,第80巻,6957頁(1983年)〕。抗
Tac抗体とTac抗原との結合部位がIL−2とIL
−2受容体との結合部位と同一であるか否かに関しては
疑問が残されているものの、Tac抗原とIL−2受容
体がその性状において大部分が共通することは明らかと
なった。このようなIL−2とIL−2受容体との相互
作用を利用してこれまでにT細胞やナチュラルキラー細
胞のクローン化に成功している(たとえばネイチャー,
第268巻,154−156頁,1977年;ザ・ジャ
ーナル・オブ・イムノロジー,第130巻,981−9
87頁,1983年)。また、T細胞の白血病化とTa
c抗原の異常発現との間に関係のあることが示唆されて
おり(ブラッド,第62巻,509−510頁,198
3年)、一方、正常細胞においては抗Tac抗体による
IL−2受容体数の減少がみられるのに対し、白血病細
胞では抗Tac抗体によるIL−2受容体数の減少がみ
られない(ダウン・レギュレーションの欠除)ことがわ
かっている(ザ・ジャーナル・オブ・ブラッド,第61
巻,1014−1016頁,1983年)。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】上記したとおり、細胞
において重要な役割をなすIL−2受容体であるが、I
L−2受容体の蛋白質としての性状やその構造遺伝子に
ついては実体が不明で、またIL−2受容体を遺伝子組
み換え技術によって製造したとの報告はない。
において重要な役割をなすIL−2受容体であるが、I
L−2受容体の蛋白質としての性状やその構造遺伝子に
ついては実体が不明で、またIL−2受容体を遺伝子組
み換え技術によって製造したとの報告はない。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒトIL
−2受容体のポリペプチドおよびそれをコードする遺伝
子について研究を行い、はじめてその遺伝子をクローニ
ングすると共にIL−2受容体のポリペプチドの遺伝子
組み換え技術による製造法を確立し、本発明を完成し
た。すなわち、本発明はインターロイキン−2受容体活
性を有するポリペプチドをコードする新規な組み換えD
NAを用いた遺伝子組み換え技術で得られたインターロ
イキン−2受容体およびこれらの製造法を提供するもの
である。上記IL−2受容体のポリペプチドをコードす
る遺伝子については、例えば図2における1番目から2
52番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコード
する遺伝子が挙げられ、とりわけ図2における1番目か
ら252番目のコドンで示される塩基配列からなる遺伝
子が好ましい。上記遺伝子はその5'末端にATGまた
は図2における−21番目から−1番目のコドンからな
るシグナルペプチドをコードする塩基配列を有していて
もよい。また該遺伝子の3'末端には翻訳終止コドンと
してのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよ
く、とりわけTAGが好ましい。上記遺伝子はその上流
にプロモーターを有しているのが好ましく、該プロモー
ターは、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプ
ロモーターであればいかなるものでもよい。たとえば動
物細胞(例、サル細胞COS−7,チャイニーズハムス
ター細胞CHOなど)における発現に適したSV40由
来のプロモーター,レトロウィルスのプロモーターなど
が挙げられ、とりわけSV40由来のプロモーターが好
ましい。
−2受容体のポリペプチドおよびそれをコードする遺伝
子について研究を行い、はじめてその遺伝子をクローニ
ングすると共にIL−2受容体のポリペプチドの遺伝子
組み換え技術による製造法を確立し、本発明を完成し
た。すなわち、本発明はインターロイキン−2受容体活
性を有するポリペプチドをコードする新規な組み換えD
NAを用いた遺伝子組み換え技術で得られたインターロ
イキン−2受容体およびこれらの製造法を提供するもの
である。上記IL−2受容体のポリペプチドをコードす
る遺伝子については、例えば図2における1番目から2
52番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコード
する遺伝子が挙げられ、とりわけ図2における1番目か
ら252番目のコドンで示される塩基配列からなる遺伝
子が好ましい。上記遺伝子はその5'末端にATGまた
は図2における−21番目から−1番目のコドンからな
るシグナルペプチドをコードする塩基配列を有していて
もよい。また該遺伝子の3'末端には翻訳終止コドンと
してのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよ
く、とりわけTAGが好ましい。上記遺伝子はその上流
にプロモーターを有しているのが好ましく、該プロモー
ターは、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプ
ロモーターであればいかなるものでもよい。たとえば動
物細胞(例、サル細胞COS−7,チャイニーズハムス
ター細胞CHOなど)における発現に適したSV40由
来のプロモーター,レトロウィルスのプロモーターなど
が挙げられ、とりわけSV40由来のプロモーターが好
ましい。
【0005】本発明のIL−2受容体のポリペプチドを
コードする遺伝子を含有する組み換えDNAは例えば、
(イ)インターロイキン−2受容体を産生する細胞を培養
し、(ロ)培養物からインターロイキン−2受容体のポ
リペプチドをコードする伝令RNAを分離し、(ハ)該
伝令RNAから単鎖の相補DNA(cDNA)を合成
し、(ニ)該相補DNAをプラスミドに組み込み、
(ホ)該プラスミドを完全二重鎖プラスミドに変換し、
(ヘ)得られた組み換えプラスミドで宿主を形質転換
し、(ト)得られた形質転換体を培養後、形質転換体か
ら目的とするDNAを含有するプラスミドを単離し、
(チ)所望により、そのプラスミドから目的とするクロ
ーン化DNAを切り出し、(リ)所望により、該クロー
ン化DNAをビークル中のプロモーターの下流に連結す
ることにより製造することができる。
コードする遺伝子を含有する組み換えDNAは例えば、
(イ)インターロイキン−2受容体を産生する細胞を培養
し、(ロ)培養物からインターロイキン−2受容体のポ
リペプチドをコードする伝令RNAを分離し、(ハ)該
伝令RNAから単鎖の相補DNA(cDNA)を合成
し、(ニ)該相補DNAをプラスミドに組み込み、
(ホ)該プラスミドを完全二重鎖プラスミドに変換し、
(ヘ)得られた組み換えプラスミドで宿主を形質転換
し、(ト)得られた形質転換体を培養後、形質転換体か
ら目的とするDNAを含有するプラスミドを単離し、
(チ)所望により、そのプラスミドから目的とするクロ
ーン化DNAを切り出し、(リ)所望により、該クロー
ン化DNAをビークル中のプロモーターの下流に連結す
ることにより製造することができる。
【0006】IL−2受容体をコードするmRNAとし
ては通常ヒトT細胞、例えばMT−1細胞(ガン,第7
1巻,155−156頁,1980年)よりポリARN
Aを調製し、これを鋳型として、逆転写酵素を用い自体
公知の方法でcDNA鎖を合成し、プラスミドに組込ん
だ後、cDNAを二重鎖DNAへ変換する(モレキュラ
ー・アンド・セルラー・バイオロジー,第2巻,161
−170頁,1982年)。一方、例えば5×109個
のMT−1細胞をNP−40を含む緩衝液中で可溶化
し、抗Tac抗体またはIL−2を担体に結合し、その
カラムを使ってIL−2受容体を精製する。これを自体
公知の方法に従い自動アミノ酸シークエンサーで解析し
(ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー,第256巻,7990−7997頁,1981
年)、N末端のアミノ酸配列を20個程度決定する。こ
の一部のアミノ酸配列に対応する塩基配列をもつオリゴ
ヌクレオタイドを化学合成した後、32Pでラベルしてプ
ローブとなし、自体公知の方法でコロニー・ハイブリダ
イゼーション法(ジーン,第10巻,63−67頁,1
980年)により、アンピシリン耐性のトランスフォー
マントの中から求めるクローンを選出する。上記クロー
ン化されたIL−2受容体のポリペプチドをコードする
遺伝子(DNA)を有するプラスミドはそのまま、また
は所望により制限酵素で切り出すことができる。さらに
上記遺伝子は、化学合成により製造することもできる。
またクローン化された遺伝子は前記した発現に適したビ
ークル中のプロモータの下流に連結することもできる。
なお本発明のDNAは、たとえば大腸菌(294、DH
1、HB101など)を形質転換してその増殖、保存を
なすこともできる。本発明の遺伝子組み換え技術によっ
て得られたIL−2受容体として、例えば図2における
1番目から252番目のアミノ酸配列で示されるポリペ
プチドを含有する蛋白質を挙げることができる。該ポリ
ペプチドはそのN末端にMetを有していてもよい。該
ポリペプチドは糖鎖を有する糖蛋白質であることが好ま
しい。
ては通常ヒトT細胞、例えばMT−1細胞(ガン,第7
1巻,155−156頁,1980年)よりポリARN
Aを調製し、これを鋳型として、逆転写酵素を用い自体
公知の方法でcDNA鎖を合成し、プラスミドに組込ん
だ後、cDNAを二重鎖DNAへ変換する(モレキュラ
ー・アンド・セルラー・バイオロジー,第2巻,161
−170頁,1982年)。一方、例えば5×109個
のMT−1細胞をNP−40を含む緩衝液中で可溶化
し、抗Tac抗体またはIL−2を担体に結合し、その
カラムを使ってIL−2受容体を精製する。これを自体
公知の方法に従い自動アミノ酸シークエンサーで解析し
(ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー,第256巻,7990−7997頁,1981
年)、N末端のアミノ酸配列を20個程度決定する。こ
の一部のアミノ酸配列に対応する塩基配列をもつオリゴ
ヌクレオタイドを化学合成した後、32Pでラベルしてプ
ローブとなし、自体公知の方法でコロニー・ハイブリダ
イゼーション法(ジーン,第10巻,63−67頁,1
980年)により、アンピシリン耐性のトランスフォー
マントの中から求めるクローンを選出する。上記クロー
ン化されたIL−2受容体のポリペプチドをコードする
遺伝子(DNA)を有するプラスミドはそのまま、また
は所望により制限酵素で切り出すことができる。さらに
上記遺伝子は、化学合成により製造することもできる。
またクローン化された遺伝子は前記した発現に適したビ
ークル中のプロモータの下流に連結することもできる。
なお本発明のDNAは、たとえば大腸菌(294、DH
1、HB101など)を形質転換してその増殖、保存を
なすこともできる。本発明の遺伝子組み換え技術によっ
て得られたIL−2受容体として、例えば図2における
1番目から252番目のアミノ酸配列で示されるポリペ
プチドを含有する蛋白質を挙げることができる。該ポリ
ペプチドはそのN末端にMetを有していてもよい。該
ポリペプチドは糖鎖を有する糖蛋白質であることが好ま
しい。
【0007】本発明のIL−2受容体は、例えばIL−
2受容体のポリペプチドをコードする遺伝子を含有する
組み換えDNAを有する動物細胞を培養し、培養物中に
IL−2受容体を生成、蓄積せしめることにより製造す
ることができる。上記した組み換えDNAを有する動物
細胞は、例えば該DNAで、適当な動物細胞、好ましく
はCOS−7、マウスL細胞、ヒトB細胞、ヒトFL細
胞などの哺乳動物の細胞株を遺伝子感染(transf
ection)することにより製造することができる。
本発明のDNAを有する動物細胞は、形質転換体として
製造することもできる。動物細胞の培養は、自体公知の
動物細胞用培地、例えば5〜20%の胎児牛血清を含む
DMEM培地中、30〜40℃で15〜60時間行う。
かくして生成するIL−2受容体のIL−2との結合能
は、IL−2を用いた蛍光抗体法(ザ・ジャーナル・オ
ブ・イムノロジー,第126巻,1393−1397
頁,1981年)あるいはアイソトープで標識したIL
−2との結合能などにより測定することができる。
2受容体のポリペプチドをコードする遺伝子を含有する
組み換えDNAを有する動物細胞を培養し、培養物中に
IL−2受容体を生成、蓄積せしめることにより製造す
ることができる。上記した組み換えDNAを有する動物
細胞は、例えば該DNAで、適当な動物細胞、好ましく
はCOS−7、マウスL細胞、ヒトB細胞、ヒトFL細
胞などの哺乳動物の細胞株を遺伝子感染(transf
ection)することにより製造することができる。
本発明のDNAを有する動物細胞は、形質転換体として
製造することもできる。動物細胞の培養は、自体公知の
動物細胞用培地、例えば5〜20%の胎児牛血清を含む
DMEM培地中、30〜40℃で15〜60時間行う。
かくして生成するIL−2受容体のIL−2との結合能
は、IL−2を用いた蛍光抗体法(ザ・ジャーナル・オ
ブ・イムノロジー,第126巻,1393−1397
頁,1981年)あるいはアイソトープで標識したIL
−2との結合能などにより測定することができる。
【0008】上記培養物からIL−2受容体を分離精製
するには、例えば下記の方法により行うことができる。
すなわち培養細胞を遠心分離法で集めたあと界面活性剤
(たとえばNP−40,トライトンX−100,ツゥイ
ーン−20またはSDS)を含有する緩衝液や低張また
は高張の緩衝液を用いたり、超音波処理や酵素処理など
によってIL−2受容体を含む細胞表面タンパクを可溶
化する。可溶化する前に放射性化合物(たとえばNa
125I,14C−標識アミノ酸,14C−標識炭水化物,3H
−標識アミノ酸,3H−標識炭水化物,35S−標識アミ
ノ酸など)を用いて予めIL−2受容体をアイソトープ
標識しておいてもよい。このようにして得られるIL−
2受容体を含む粗可溶化液をあらかじめ種々のタンパク
を固定化した水不溶性担体で処理して、最終標品に僅か
に混入してくる不純物質をできるだけ除去しておく。こ
の目的で用いられるタンパクとしてはウシ血清アルブミ
ン、ヒト免疫グロブリン、マウス免疫グロブリンなどが
挙げられ、通常はこれらのタンパクを固定化した架橋ア
ガロースなどをつめたカラムに上記粗可溶化液を通過さ
せてその通過液を採取することで不純物質の除去が可能
である。このようにして得られたIL−2受容体を含む
溶液を、次いで非グリコシル化IL−2と水不溶性担体
を共有結合せしめた固定化IL−2〔本発明者らの一部
が発明し同日付で発明の名称「固定化インターロイキン
−2」として特許出願〕を充填したアフィニティーカラ
ムを通してIL−2受容体を吸着させる。カラムを界面
活性剤(たとえばNP−40、トライトンX−100、
ツゥイーン−20またはSDS)および高濃度(0.1
〜1.0M)塩類(NaClなど)を含む緩衝液(たと
えばトリス−塩酸緩衝液)で充分に洗浄したあと、酢酸
緩衝液(pH4.0)を用いて洗浄し、次いでIL−2
レセプターとIL−2との結合を破壊する条件〔たとえ
ばクエン酸緩衝液(pH2.0),3M NaSCNな
ど〕下にIL−2レセプターを溶出させ、必要により溶
媒を留去することによりIL−2受容体を製造すること
ができる。
するには、例えば下記の方法により行うことができる。
すなわち培養細胞を遠心分離法で集めたあと界面活性剤
(たとえばNP−40,トライトンX−100,ツゥイ
ーン−20またはSDS)を含有する緩衝液や低張また
は高張の緩衝液を用いたり、超音波処理や酵素処理など
によってIL−2受容体を含む細胞表面タンパクを可溶
化する。可溶化する前に放射性化合物(たとえばNa
125I,14C−標識アミノ酸,14C−標識炭水化物,3H
−標識アミノ酸,3H−標識炭水化物,35S−標識アミ
ノ酸など)を用いて予めIL−2受容体をアイソトープ
標識しておいてもよい。このようにして得られるIL−
2受容体を含む粗可溶化液をあらかじめ種々のタンパク
を固定化した水不溶性担体で処理して、最終標品に僅か
に混入してくる不純物質をできるだけ除去しておく。こ
の目的で用いられるタンパクとしてはウシ血清アルブミ
ン、ヒト免疫グロブリン、マウス免疫グロブリンなどが
挙げられ、通常はこれらのタンパクを固定化した架橋ア
ガロースなどをつめたカラムに上記粗可溶化液を通過さ
せてその通過液を採取することで不純物質の除去が可能
である。このようにして得られたIL−2受容体を含む
溶液を、次いで非グリコシル化IL−2と水不溶性担体
を共有結合せしめた固定化IL−2〔本発明者らの一部
が発明し同日付で発明の名称「固定化インターロイキン
−2」として特許出願〕を充填したアフィニティーカラ
ムを通してIL−2受容体を吸着させる。カラムを界面
活性剤(たとえばNP−40、トライトンX−100、
ツゥイーン−20またはSDS)および高濃度(0.1
〜1.0M)塩類(NaClなど)を含む緩衝液(たと
えばトリス−塩酸緩衝液)で充分に洗浄したあと、酢酸
緩衝液(pH4.0)を用いて洗浄し、次いでIL−2
レセプターとIL−2との結合を破壊する条件〔たとえ
ばクエン酸緩衝液(pH2.0),3M NaSCNな
ど〕下にIL−2レセプターを溶出させ、必要により溶
媒を留去することによりIL−2受容体を製造すること
ができる。
【0009】
【作用】本発明により得られるIL−2受容体は、公知
の天然型ヒトIL−2受容体やTac抗原と実質的に同
様の活性を有する。ここでヒトIL−2受容体やTac
抗原と実質的に同様の活性とは、例えば以下の生物学的
および免疫学的活性をいう。すなわち、IL−2を結合
することにより正常なT細胞やナチュラルキラー細胞を
その機能を保持させたまま増殖させる活性を有する。し
たがって、本来IL−2受容体を有さない各種動物細胞
(B細胞など)を、本発明で用いられているDNAで遺
伝子感染または形質転換してIL−2受容体を産生せし
めることができるので、T細胞と同様に、これら細胞を
IL−2含有培地中で培養することにより、インビトロ
で長期にわたり増殖、継代したり、株化したり、クロー
ン化することができる。 上記DNAを用いて増殖等が
可能となった上記動物細胞を大量に培養することによ
り、これら細胞が本来産生する各種有用物質を大量に取
得することができる。また前記したとおりT細胞の白血
病化とTac抗原の異常発現との間に関係のあることが
知られているが、本発明のIL−2受容体はTac抗原
とほぼ同様の性質を有するため、例えば該受容体を基質
として用い。また該受容体により製造される抗IL−2
受容体抗体を用いて、細胞に発現するIL−2受容体数
を検出することにより白血病や免疫不全症の診断を行う
ことができる。
の天然型ヒトIL−2受容体やTac抗原と実質的に同
様の活性を有する。ここでヒトIL−2受容体やTac
抗原と実質的に同様の活性とは、例えば以下の生物学的
および免疫学的活性をいう。すなわち、IL−2を結合
することにより正常なT細胞やナチュラルキラー細胞を
その機能を保持させたまま増殖させる活性を有する。し
たがって、本来IL−2受容体を有さない各種動物細胞
(B細胞など)を、本発明で用いられているDNAで遺
伝子感染または形質転換してIL−2受容体を産生せし
めることができるので、T細胞と同様に、これら細胞を
IL−2含有培地中で培養することにより、インビトロ
で長期にわたり増殖、継代したり、株化したり、クロー
ン化することができる。 上記DNAを用いて増殖等が
可能となった上記動物細胞を大量に培養することによ
り、これら細胞が本来産生する各種有用物質を大量に取
得することができる。また前記したとおりT細胞の白血
病化とTac抗原の異常発現との間に関係のあることが
知られているが、本発明のIL−2受容体はTac抗原
とほぼ同様の性質を有するため、例えば該受容体を基質
として用い。また該受容体により製造される抗IL−2
受容体抗体を用いて、細胞に発現するIL−2受容体数
を検出することにより白血病や免疫不全症の診断を行う
ことができる。
【0010】本願明細書および図面において、塩基やア
ミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC−IUB
Commission on Biochemica
lNomenelature による略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下
記する。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場
合は、特に明示しなければL−体を示すものとする。 DNA :デオキシリボ核酸 cDNA:相補的デオキシリボ核酸 A :アデニン T :チミン G :グアニン C :シトシン RNA :リボ核酸 mRNA:伝令リボ核酸 dATP:デオキシアデノシン三リン酸 dTTP:デオキシチミジン三リン酸 dGTP:デオキシグアノシン三リン酸 dCTP:デオキシシチジン三リン酸 ATP :アデノシン三リン酸 EDTA:エチレンジアミン四酢酸 SDS :ドデシル硫酸ナトリウム Gly :グリシン Ala :アラニン Val :バリン Leu :ロイシン Ile :イソロイシン Ser :セリン Thr :スレオニン Cys :システイン Met :メチオニン Glu :グルタミン酸 Asp :アスパラギン酸 Lys :リジン Arg :アルギニン His :ヒスチジン Phe :フェニールアラニン Tyr :チロシン Trp :トリプトファン Pro :プロリン Asn :アスパラギン Gln :グルタミン
ミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC−IUB
Commission on Biochemica
lNomenelature による略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下
記する。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場
合は、特に明示しなければL−体を示すものとする。 DNA :デオキシリボ核酸 cDNA:相補的デオキシリボ核酸 A :アデニン T :チミン G :グアニン C :シトシン RNA :リボ核酸 mRNA:伝令リボ核酸 dATP:デオキシアデノシン三リン酸 dTTP:デオキシチミジン三リン酸 dGTP:デオキシグアノシン三リン酸 dCTP:デオキシシチジン三リン酸 ATP :アデノシン三リン酸 EDTA:エチレンジアミン四酢酸 SDS :ドデシル硫酸ナトリウム Gly :グリシン Ala :アラニン Val :バリン Leu :ロイシン Ile :イソロイシン Ser :セリン Thr :スレオニン Cys :システイン Met :メチオニン Glu :グルタミン酸 Asp :アスパラギン酸 Lys :リジン Arg :アルギニン His :ヒスチジン Phe :フェニールアラニン Tyr :チロシン Trp :トリプトファン Pro :プロリン Asn :アスパラギン Gln :グルタミン
【0011】
【発明の効果】本発明で用いられているIL−2受容体
のポリペプチドをコードする遺伝子を含有する組み換え
DNAは、これを本来IL−2受容体を有さない各種動
物細胞に導入することにより該細胞にIL−2受容体を
産生させることができるため、T細胞などと同様にこれ
ら細胞の増殖、株化等が可能となり、それ故これらの細
胞が産生する各種有用物質を大量に取得することができ
る。また、本発明のIL−2受容体またはこれにより製
造される抗IL−2受容体抗体は、細胞の白血病化にお
いて異常発現するIL−2受容体を検出することがで
き、白血病や免疫不全症の診断薬として用いることがで
きる。
のポリペプチドをコードする遺伝子を含有する組み換え
DNAは、これを本来IL−2受容体を有さない各種動
物細胞に導入することにより該細胞にIL−2受容体を
産生させることができるため、T細胞などと同様にこれ
ら細胞の増殖、株化等が可能となり、それ故これらの細
胞が産生する各種有用物質を大量に取得することができ
る。また、本発明のIL−2受容体またはこれにより製
造される抗IL−2受容体抗体は、細胞の白血病化にお
いて異常発現するIL−2受容体を検出することがで
き、白血病や免疫不全症の診断薬として用いることがで
きる。
【0012】
【実施例】以下の参考例および実施例により本発明をよ
り具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。なお参考例の(vii)に開示した形質転換体
エシェリヒア コリ(Escherichia Col
i)HB101/Tac−2(IFO−14364)
は、昭和59年8月21日から通商産業省工業技術院微
生物工業技術研究所(FRI)に受託番号FERM P
−7796として寄託されている。
り具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。なお参考例の(vii)に開示した形質転換体
エシェリヒア コリ(Escherichia Col
i)HB101/Tac−2(IFO−14364)
は、昭和59年8月21日から通商産業省工業技術院微
生物工業技術研究所(FRI)に受託番号FERM P
−7796として寄託されている。
【0013】参考例 IL−2受容体遺伝子含有DNA
の製造 (i)IL−2受容体のポリペプチドをコードするmRN
Aの製造 ヒトT細胞白血病細胞であるMT−1をRPMI164
0培地(10%の牛胎児血清を含む)中、37℃で培養
した。この培養した細胞1×109個を5Mグアニジン
チオシアネート、5%メルカプトエタノール、50mM
Tris−HCl pH7.6、10mM EDTA
溶液中でテフロンホモゲナイザーによって破壊変性した
後N−ラウロイリルザルコシン酸ナトリウムを4%にな
るように加え、均質化した混合物を5.7M塩化セシウ
ム溶液(5.7M塩化セシウム,0.1M EDTA)
6ml上に重層し、ベックマンSW28のローターを用
いて15℃で24000rpm48時間遠心処理を行
い、RNA沈澱を得た。このRNA沈澱を0.25%N
−ラウロイルザルコシン酸ナトリウム溶液にとかした後
でエタノールで沈澱させ、10mgのRNAを得た。こ
のRNAを高塩溶液〔0.5M NaCl,10mM
Tris−HCl pH7.6,1mM EDTA,0.
3% SDS〕中でオリゴ(dT)セルロースカラムに
吸着させ、ポリ(A)を含むmRNAを低塩溶液(10
mM Tris−HCl pH7.6,1mM EDT
A、0.3% SDS)で溶出させることにより、ポリ
(A)を含むmRNA30μgを分取した。 (ii)単鎖DNAの合成 上記で得たmRNAおよび逆転写酵素を用い自体公知の
方法で単鎖DNAを合成した。すなわち、20μlの反
応液(5μgのmRNA,1.4μgベクター・プライ
マーDNA,5ユニットの逆転写酵素,2mMずつのd
ATP,dCTP,dGTPおよびdTTP,8mM
MgCl2,30mM KCl,0.3mMジチオスレイ
トール,50mM Tris−HCl pH8.3)中
で37℃で20分間インキュベートした後、2μlの
0.25M EDTAと1μlの10%SDSを加えて
反応を止めた後、フェノールで除蛋白し、エタノールで
沈澱させた(モレキュラー・アンド・セルラー・バイオ
ロジー,第2巻,161−170頁,1982年)。 (iii)dC鎖の付加 上記沈澱を15μlの反応液(1mM CoCl2、30
mM Tris−HCl pH6.8,140mMカコジ
レートナトリウム,0.1mMジチオスレイトール,
0.2μgポリ(A),66μM dCTP)に溶か
し、18ユニットのターミナルトランスフェラーゼを加
え、37℃で5分間インキュベートした。次に、1μl
の0.25MEDTAおよび0.5μlの10%SDS
を加えて反応を止め、フェノールで除蛋白し、エタノー
ルで沈澱させた(モレキュラー・アンド・セルラー・バ
イオロジー,第2巻,161−170頁,1982
年)。 (iv)HindIIIによる切断 沈澱を10μlのHindIIIバッファーに溶かし、
2.5ユニットのHindIIIを加え、37℃で1時間
消化した。次にフェノール処理した後エタノールで沈澱
させ、10μlの10mM Tris−HCl pH7.
3,1mMEDTAに溶かし、3μlのエタノールを加
えた。 (v )dG鎖付リンカーDNAによる環状化 上記DNA 1μlを7ngのオリゴdG付リンカーD
NAと共に10μlの10mM Tris−HCl,p
H7.5、1mM EDTA,0.1M NaCl中で6
5℃、5分、次いで42℃で30分インキュベートした
後0℃に冷やした。これに20mM Tris−HCl
(pH7.5)4mM MgCl2,10mM(NH4)2S
O4,0.1M KCl,0.1mM β−NAD,50
μg/ml BSAになるように加え、0.6μg大腸
菌DNAリガーゼと共に12℃で一晩インキュベートし
た。 (vi)二重鎖DNAの合成 上記反応液に40μM dTTP、40μM dGTP、
40μM dCTP、40μM dATP、0.15mM
β−NADになるように加え(最終液量104μ
l)、0.4μgの大腸菌DNAリガーゼ、0.3μg
大腸菌DNAポリメラーゼI、1ユニットの大腸菌RN
aseHと共に12℃1時間、次いで25℃で1時間イ
ンキュベートした後、大腸菌の形質転換に用いた。 (vii)cDNA含有プラスミドの単離 このようにして4×105個のアンピシリン耐性株が単
離され、これら各々のDNAをニトロセルロースフィル
ターの上に固定した。次いでMT−1細胞より精製され
たIL−2受容体蛋白質のアミノ酸配列をもとにして、
アミノ酸No.4〜8(Asp−Asp−Asp−Pr
o−Pro)(配列番号:2)に対応する塩基配列(3'
CTRCTRCTRGGNGG 5')(配列番号:3、
RはAまたはGを表し、NはA,G,C,Tのいずれか
を表す)をトリエステル法(プロシーディングス・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス U
SA,第75巻,5765−5769頁,1978年)
により化学合成した。このオリゴヌクレオチドに対して
T4ポリヌクレオチドカイネースを用いて50μlの反
応液(オリゴヌクレオチド0.20μg,50mM T
ris・HCl pH8.0,10mM MgCl2,
10mMメルカプトエタノール,50μCir−32PA
TP、3ユニットT4ポリヌクレオチドカイネース)中
で1時間37℃で反応させ、5'末端を32Pで標識し
た。この標識されたオリゴヌクレオチドをプローブとし
てHanahanらの方法(ジーン,第10巻,63−
67頁,1981年)に従って上記のニトロセルロース
フィルター上に固定したDNAに会合させ、オートラジ
オグラフィーによって上記のオリゴヌクレオチドプロー
ブに反応する菌株を2個(E.Coli HB101/
Tac−1およびE.Coli HB101/Tac−
2)単離した。これらの菌株の各々の菌体からプラスミ
ドDNAをアルカリ法(Birnboim H.C.
ら,ヌクレイック・アシッズ・リサーチ,第7巻,15
13−1524頁,1979年)によって単離した。こ
れらのプラスミドをTac−1およびTac−2と名づ
けた。Tac−1とTac−2はTac−2の方がその
5'末端の塩基配列が16塩基長いことを除いて同一で
あった。Tac−2の制限酵素地図を図1に示す。次に
このTac−2プラスミドに挿入されたcDNAの配列
の一次構造(塩基配列)をジデオキシヌクレオチド法と
Maxam−Gilbert法によって決定した。その
一次構造(配列番号:4)は図2に示した。この塩基配
列により規定されるペプチドはその合成開始信号〔N
o.175〜177のATG(コドン−21)〕から始
まって272個のアミノ酸から成る。この中N末端から
21個のアミノ酸(アミノ酸−21〜−1)はシグナル
ペプチドと考えられる。上記の一次構造から、このプラ
スミドはヒトIL−2受容体のポリペプチドをコードす
る塩基配列を全部持っていることが判明した。また上記
塩基配列から推定されるIL−2受容体のアミノ酸配列
(配列番号:5)を図2に示した。 (viii)発現型プラスミドの製造 参考例の(vii)で得たプラスミドTac−2(20μ
g)からヒトIL−2受容体遺伝子部分を制限酵素Ps
tI(部分分解)およびPvuII(完全分解)で切断し
た後、DNA断片を1%アガロースゲル電気泳動で分離
し、2μgのDNAを得た。このDNAの単鎖部分をT
4DNAポリメラーゼ反応でうめた後、フェノール処理
し、エタノール沈澱を行った。このDNAを20μlの
ライゲーション緩衝液(66mM Tris−HCl p
H7.6,6.6mM MgCl2,10mM DTT,
66μM ATP)に溶解し、5'末端をりん酸化した
0.5μgの合成オリゴヌクレオチドリンカー(Hin
dIIIリンカー)5' pCAAGCTTGと5ユニットの
T4DNAリガーゼとを混合し、14℃、17時間反応
させてIL−2受容体のポリペプチドをコードする遺伝
子とオリゴヌクレオチドリンカーを結合させた。リガー
ゼを65℃、10分間の熱処理によって失活させた後、
3倍量の蒸留水を加え、さらに制限酵素HindIIIの
緩衝液(50mMNaCl,10mM Tris−HC
l,pH7.9,6mM MgCl2,100μg/ml
牛血清アルブミン中20ユニットのHindIII)で1
時間処理した。セファロース4Bカラム(0.5cm直
径、20cm長さ)で切断されたリンカー部分とリンカ
ーを結合したIL−2受容体DNAを分離し、エタノー
ル沈澱によりリンカーを結合したIL−2受容体のポリ
ペプチドをコードする遺伝子含有DNAを回収した。一
方、プラスミドpKCRH2(ネイチャー 第307
巻,604−608頁,1984年)を制限酵素Hin
dIIIで切断し、上記リンカーを結合させた二重鎖DN
AをSV40プロモーターの下流にT4DNAリガーゼ
で連結させ発現型プラスミドpKCR・Tac−2・A
を構築した。この場合IL−2受容体ポリペプチドをコ
ードする遺伝子がプロモーターと逆向きに連結したもの
も単離され、これをpKCR・Tac−2・Aiと名付
けた。同様に、プラスミドTac−2より得られたHi
ndIII−PvuIIDNA断片(IL−2受容体のポリ
ペプチドをコードする遺伝子を含む)にHindIIIリ
ンカーを結合し、pKCRH2のHindIIIサイトに
挿入した発現型プラスミドも構築しpKCR・Tac−
2と名付けた。
の製造 (i)IL−2受容体のポリペプチドをコードするmRN
Aの製造 ヒトT細胞白血病細胞であるMT−1をRPMI164
0培地(10%の牛胎児血清を含む)中、37℃で培養
した。この培養した細胞1×109個を5Mグアニジン
チオシアネート、5%メルカプトエタノール、50mM
Tris−HCl pH7.6、10mM EDTA
溶液中でテフロンホモゲナイザーによって破壊変性した
後N−ラウロイリルザルコシン酸ナトリウムを4%にな
るように加え、均質化した混合物を5.7M塩化セシウ
ム溶液(5.7M塩化セシウム,0.1M EDTA)
6ml上に重層し、ベックマンSW28のローターを用
いて15℃で24000rpm48時間遠心処理を行
い、RNA沈澱を得た。このRNA沈澱を0.25%N
−ラウロイルザルコシン酸ナトリウム溶液にとかした後
でエタノールで沈澱させ、10mgのRNAを得た。こ
のRNAを高塩溶液〔0.5M NaCl,10mM
Tris−HCl pH7.6,1mM EDTA,0.
3% SDS〕中でオリゴ(dT)セルロースカラムに
吸着させ、ポリ(A)を含むmRNAを低塩溶液(10
mM Tris−HCl pH7.6,1mM EDT
A、0.3% SDS)で溶出させることにより、ポリ
(A)を含むmRNA30μgを分取した。 (ii)単鎖DNAの合成 上記で得たmRNAおよび逆転写酵素を用い自体公知の
方法で単鎖DNAを合成した。すなわち、20μlの反
応液(5μgのmRNA,1.4μgベクター・プライ
マーDNA,5ユニットの逆転写酵素,2mMずつのd
ATP,dCTP,dGTPおよびdTTP,8mM
MgCl2,30mM KCl,0.3mMジチオスレイ
トール,50mM Tris−HCl pH8.3)中
で37℃で20分間インキュベートした後、2μlの
0.25M EDTAと1μlの10%SDSを加えて
反応を止めた後、フェノールで除蛋白し、エタノールで
沈澱させた(モレキュラー・アンド・セルラー・バイオ
ロジー,第2巻,161−170頁,1982年)。 (iii)dC鎖の付加 上記沈澱を15μlの反応液(1mM CoCl2、30
mM Tris−HCl pH6.8,140mMカコジ
レートナトリウム,0.1mMジチオスレイトール,
0.2μgポリ(A),66μM dCTP)に溶か
し、18ユニットのターミナルトランスフェラーゼを加
え、37℃で5分間インキュベートした。次に、1μl
の0.25MEDTAおよび0.5μlの10%SDS
を加えて反応を止め、フェノールで除蛋白し、エタノー
ルで沈澱させた(モレキュラー・アンド・セルラー・バ
イオロジー,第2巻,161−170頁,1982
年)。 (iv)HindIIIによる切断 沈澱を10μlのHindIIIバッファーに溶かし、
2.5ユニットのHindIIIを加え、37℃で1時間
消化した。次にフェノール処理した後エタノールで沈澱
させ、10μlの10mM Tris−HCl pH7.
3,1mMEDTAに溶かし、3μlのエタノールを加
えた。 (v )dG鎖付リンカーDNAによる環状化 上記DNA 1μlを7ngのオリゴdG付リンカーD
NAと共に10μlの10mM Tris−HCl,p
H7.5、1mM EDTA,0.1M NaCl中で6
5℃、5分、次いで42℃で30分インキュベートした
後0℃に冷やした。これに20mM Tris−HCl
(pH7.5)4mM MgCl2,10mM(NH4)2S
O4,0.1M KCl,0.1mM β−NAD,50
μg/ml BSAになるように加え、0.6μg大腸
菌DNAリガーゼと共に12℃で一晩インキュベートし
た。 (vi)二重鎖DNAの合成 上記反応液に40μM dTTP、40μM dGTP、
40μM dCTP、40μM dATP、0.15mM
β−NADになるように加え(最終液量104μ
l)、0.4μgの大腸菌DNAリガーゼ、0.3μg
大腸菌DNAポリメラーゼI、1ユニットの大腸菌RN
aseHと共に12℃1時間、次いで25℃で1時間イ
ンキュベートした後、大腸菌の形質転換に用いた。 (vii)cDNA含有プラスミドの単離 このようにして4×105個のアンピシリン耐性株が単
離され、これら各々のDNAをニトロセルロースフィル
ターの上に固定した。次いでMT−1細胞より精製され
たIL−2受容体蛋白質のアミノ酸配列をもとにして、
アミノ酸No.4〜8(Asp−Asp−Asp−Pr
o−Pro)(配列番号:2)に対応する塩基配列(3'
CTRCTRCTRGGNGG 5')(配列番号:3、
RはAまたはGを表し、NはA,G,C,Tのいずれか
を表す)をトリエステル法(プロシーディングス・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス U
SA,第75巻,5765−5769頁,1978年)
により化学合成した。このオリゴヌクレオチドに対して
T4ポリヌクレオチドカイネースを用いて50μlの反
応液(オリゴヌクレオチド0.20μg,50mM T
ris・HCl pH8.0,10mM MgCl2,
10mMメルカプトエタノール,50μCir−32PA
TP、3ユニットT4ポリヌクレオチドカイネース)中
で1時間37℃で反応させ、5'末端を32Pで標識し
た。この標識されたオリゴヌクレオチドをプローブとし
てHanahanらの方法(ジーン,第10巻,63−
67頁,1981年)に従って上記のニトロセルロース
フィルター上に固定したDNAに会合させ、オートラジ
オグラフィーによって上記のオリゴヌクレオチドプロー
ブに反応する菌株を2個(E.Coli HB101/
Tac−1およびE.Coli HB101/Tac−
2)単離した。これらの菌株の各々の菌体からプラスミ
ドDNAをアルカリ法(Birnboim H.C.
ら,ヌクレイック・アシッズ・リサーチ,第7巻,15
13−1524頁,1979年)によって単離した。こ
れらのプラスミドをTac−1およびTac−2と名づ
けた。Tac−1とTac−2はTac−2の方がその
5'末端の塩基配列が16塩基長いことを除いて同一で
あった。Tac−2の制限酵素地図を図1に示す。次に
このTac−2プラスミドに挿入されたcDNAの配列
の一次構造(塩基配列)をジデオキシヌクレオチド法と
Maxam−Gilbert法によって決定した。その
一次構造(配列番号:4)は図2に示した。この塩基配
列により規定されるペプチドはその合成開始信号〔N
o.175〜177のATG(コドン−21)〕から始
まって272個のアミノ酸から成る。この中N末端から
21個のアミノ酸(アミノ酸−21〜−1)はシグナル
ペプチドと考えられる。上記の一次構造から、このプラ
スミドはヒトIL−2受容体のポリペプチドをコードす
る塩基配列を全部持っていることが判明した。また上記
塩基配列から推定されるIL−2受容体のアミノ酸配列
(配列番号:5)を図2に示した。 (viii)発現型プラスミドの製造 参考例の(vii)で得たプラスミドTac−2(20μ
g)からヒトIL−2受容体遺伝子部分を制限酵素Ps
tI(部分分解)およびPvuII(完全分解)で切断し
た後、DNA断片を1%アガロースゲル電気泳動で分離
し、2μgのDNAを得た。このDNAの単鎖部分をT
4DNAポリメラーゼ反応でうめた後、フェノール処理
し、エタノール沈澱を行った。このDNAを20μlの
ライゲーション緩衝液(66mM Tris−HCl p
H7.6,6.6mM MgCl2,10mM DTT,
66μM ATP)に溶解し、5'末端をりん酸化した
0.5μgの合成オリゴヌクレオチドリンカー(Hin
dIIIリンカー)5' pCAAGCTTGと5ユニットの
T4DNAリガーゼとを混合し、14℃、17時間反応
させてIL−2受容体のポリペプチドをコードする遺伝
子とオリゴヌクレオチドリンカーを結合させた。リガー
ゼを65℃、10分間の熱処理によって失活させた後、
3倍量の蒸留水を加え、さらに制限酵素HindIIIの
緩衝液(50mMNaCl,10mM Tris−HC
l,pH7.9,6mM MgCl2,100μg/ml
牛血清アルブミン中20ユニットのHindIII)で1
時間処理した。セファロース4Bカラム(0.5cm直
径、20cm長さ)で切断されたリンカー部分とリンカ
ーを結合したIL−2受容体DNAを分離し、エタノー
ル沈澱によりリンカーを結合したIL−2受容体のポリ
ペプチドをコードする遺伝子含有DNAを回収した。一
方、プラスミドpKCRH2(ネイチャー 第307
巻,604−608頁,1984年)を制限酵素Hin
dIIIで切断し、上記リンカーを結合させた二重鎖DN
AをSV40プロモーターの下流にT4DNAリガーゼ
で連結させ発現型プラスミドpKCR・Tac−2・A
を構築した。この場合IL−2受容体ポリペプチドをコ
ードする遺伝子がプロモーターと逆向きに連結したもの
も単離され、これをpKCR・Tac−2・Aiと名付
けた。同様に、プラスミドTac−2より得られたHi
ndIII−PvuIIDNA断片(IL−2受容体のポリ
ペプチドをコードする遺伝子を含む)にHindIIIリ
ンカーを結合し、pKCRH2のHindIIIサイトに
挿入した発現型プラスミドも構築しpKCR・Tac−
2と名付けた。
【0014】実施例 COS−7細胞におけるIL−2
受容体のポリペプチドをコードする遺伝子の発現 5×105個のCOS−7細胞(セル 第23巻 175
−182頁,1981年)を5%の牛胎児血清を含むダ
ルベッコ・ミニマル・エセンシャル(DMEM)培地を
用いて直径10cmの細胞培養用ディッシュにまき、2
0時間後、培地を交換した。さらに4時間後、40μg
/mlのプラスミドDNAを含む1/10量のトランス
フェクション溶液(プロシーディング・オブ・ナショナ
ルアカデミー・オブ・サイエンス USA 第76巻,
1373−1376頁,1979年)を加え、12時間
インキュベートした後、2.5%グリセロールで1分間
処理した。細胞を洗った後、8%の胎児牛血清を含むD
MEMで37℃、48時間培養した。次に、細胞をマウ
ス抗Tacモノクローナル抗体とFITC(蛍光色素)
標識ヤギ抗マウス抗体で染めた(ジャーナル・オブ・イ
ムノロジー 第126巻,1393−1397頁,19
81年)。対照実験では抗Tac抗体のかわりに抗体の
一種であるネズミ・ミエローマ蛋白X5563を用い
た。IL−2受容体のポリペプチドをコードする遺伝子
の発現はスペクトラムIIIを用いたフロー・サイトメト
リーで測定した。結果を表1に示す。
受容体のポリペプチドをコードする遺伝子の発現 5×105個のCOS−7細胞(セル 第23巻 175
−182頁,1981年)を5%の牛胎児血清を含むダ
ルベッコ・ミニマル・エセンシャル(DMEM)培地を
用いて直径10cmの細胞培養用ディッシュにまき、2
0時間後、培地を交換した。さらに4時間後、40μg
/mlのプラスミドDNAを含む1/10量のトランス
フェクション溶液(プロシーディング・オブ・ナショナ
ルアカデミー・オブ・サイエンス USA 第76巻,
1373−1376頁,1979年)を加え、12時間
インキュベートした後、2.5%グリセロールで1分間
処理した。細胞を洗った後、8%の胎児牛血清を含むD
MEMで37℃、48時間培養した。次に、細胞をマウ
ス抗Tacモノクローナル抗体とFITC(蛍光色素)
標識ヤギ抗マウス抗体で染めた(ジャーナル・オブ・イ
ムノロジー 第126巻,1393−1397頁,19
81年)。対照実験では抗Tac抗体のかわりに抗体の
一種であるネズミ・ミエローマ蛋白X5563を用い
た。IL−2受容体のポリペプチドをコードする遺伝子
の発現はスペクトラムIIIを用いたフロー・サイトメト
リーで測定した。結果を表1に示す。
【0015】
【表1】
【0016】
配列番号:1 配列の長さ:251 配列の型:アミノ酸 トポロジー: 直鎖状 配列の種類:たんぱく質 配列 Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys 5 10 15 Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg 20 25 30 Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly 35 40 45 Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser 50 55 60 Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln 65 70 75 80 Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp 85 90 95 Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn 100 105 110 Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr 115 120 125 Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu 130 135 140 Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln 145 150 155 160 Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu Glu 165 170 175 Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser Cys 180 185 190 Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr Glu Met Ala Ala Thr 195 200 205 Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln Val Ala Val Ala Gly 210 215 220 Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu Ser Gly Leu Thr Trp 225 230 235 240 Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile 245 250。
【0017】配列番号:2 配列の長さ:5 配列の型:アミノ酸 トポロジー: 直鎖状 配列の種類:ペプチド
【0018】配列番号:3 配列の長さ:14 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GGNGGRTCRT CRTC 14。
【0019】配列番号:4 配列の長さ:1309 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:核酸 配列 AACTCCTGAC TCCGATAGAG ACTGGATGGA CCCGCAAGGG TGGCAGCCCA GGCGGACCGA 60 TCTTCCCATC CCACATCCTC CGGCGCGATG CCAAAAAGAG GCTGACGGCA ACTGGGCCTT 120 CTGCAGAGAA AGACCTCCGC TTCACTGCCC CGGCTGGTCC CAAGGGTCAG GAAGATGGAT 180 TCATACCTGC TGATGTGGGG ACTGCTCACG TTCATCATGG TGCCTGGCTG CCAGGCAGAG 240 CTCTGTGACG ATGACCCGCC AGAGATCCCA CACGCCACAT TCAAAGCCAT GGCCTACAAG 300 GAAGGAACCA TGTTGAACTG TGAATGCAAG AGAGGTTTCC GCAGAATAAA AAGCGGGTCA 360 CTCTATATGC TCTGTACAGG AAACTCTAGC CACTCGTCCT GGGACAACCA ATGTCAATGC 420 ACAAGCTCTG CCACTCGGAA CACAACGAAA CAAGTGACAC CTCAACCTGA AGAACAGAAA 480 GAAAGGAAAA CCACAGAAAT GCAAAGTCCA ATGCAGCCAG TGGACCAAGC GAGCCTTCCA 540 GGTCACTGCA GGGAACCTCC ACCATGGGAA AATGAAGCCA CAGAGAGAAT TTATCATTTC 600 GTGGTGGGGC AGATGGTTTA TTATCAGTGC GTCCAGGGAT ACAGGGCTCT ACACAGAGGT 660 CCTGCTGAGA GCGTCTGCAA AATGACCCAC GGGAAGACAA GGTGGACCCA GCCCCAGCTC 720 ATATGCACAG GTGAAATGGA GACCAGTCAG TTTCCAGGTG AAGAGAAGCC TCAGGCAAGC 780 CCCGAAGGCC GTCCTGAGAG TGAGACTTCC TGCCTCGTCA CAACAACAGA TTTTCAAATA 840 CAGACAGAAA TGGCTGCAAC CATGGAGACG TCCATATTTA CAACAGAGTA CCAGGTAGCA 900 GTGGCCGGCT GTGTTTTCCT GCTGATCAGC GTCCTCCTCC TGAGTGGGCT CACCTGGCAG 960 CGGAGACAGA GGAAGAGTAG AAGAACAATC TAGAAAACCA AAAGAACAAG AATTTCTTGG 1020 TAAGAAGCCG GGAACAGACA ACAGAAGTCA TGAAGCCCAA GTGAAATCAA AGGTGCTAAA 1080 TGGTCGCCCA GGAGACATCC GTTGTGCTTG CCTGCGTTTT GGAAGCTCTG AAGTCACATC 1140 ACAGGACACG GGGCAGTGGC AACCTTGTCT CTATGCCAGC TCAGTCCCAT CAGAGAGCGA 1200 GCGCTACCCA CTTCTAAATA GCAATTTCGC CGTTGAAGAG GAAGGGCAAA ACCACTAGAA 1260 CTCTCCATCT TATTTTCATG TATATGTGTT CATTAAAGCA TGAATGGTA 1309。
【0020】配列番号:5 配列の長さ:272 配列の型:アミノ酸 トポロジー: 直鎖状 配列の種類:たんぱく質 配列 Met Asp Ser Tyr Leu Leu Met Trp Gly Leu Leu Thr Phe Ile Met Val 1 5 10 15 Pro Gly Cys Gln Ala Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro 20 25 30 His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn 35 40 45 Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr 50 55 60 Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys 65 70 75 80 Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro 85 90 95 Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro 100 105 110 Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro 115 120 125 Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val 130 135 140 Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His 145 150 155 160 Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg 165 170 175 Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln 180 185 190 Phe Pro Gly Glu Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu 195 200 205 Ser Glu Thr Ser Cys Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr 210 215 220 Glu Met Ala Ala Thr Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln 225 230 235 240 Val Ala Val Ala Gly Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu 245 250 255 Ser Gly Leu Thr Trp Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile 260 265 270。
【図1】 参考例の(vii)で得たプラスミドTac−2
のIL−2受容体活性を有するポリペプチドをコードす
る遺伝子部位の制限酵素地図(斑点部分はシグナルペプ
チドをコードする部分を、黒塗り部分およびそれに挟ま
れた斜線部分はIL−2受容体活性を有するポリペプチ
ドをコードする部分を表わす)である。
のIL−2受容体活性を有するポリペプチドをコードす
る遺伝子部位の制限酵素地図(斑点部分はシグナルペプ
チドをコードする部分を、黒塗り部分およびそれに挟ま
れた斜線部分はIL−2受容体活性を有するポリペプチ
ドをコードする部分を表わす)である。
【図2−1】 上記IL−2受容体活性を有するポリペ
プチドの一次構造(塩基配列)ならびにIL−2受容体
のアミノ酸配列の最初の部分を示す。
プチドの一次構造(塩基配列)ならびにIL−2受容体
のアミノ酸配列の最初の部分を示す。
【図2−2】 上記IL−2受容体活性を有するポリペ
プチドの一次構造(塩基配列)ならびにIL−2受容体
のアミノ酸配列を示し、図2−1に続く部分である。
プチドの一次構造(塩基配列)ならびにIL−2受容体
のアミノ酸配列を示し、図2−1に続く部分である。
【図2−3】 上記IL−2受容体活性を有するポリペ
プチドの一次構造(塩基配列)ならびにIL−2受容体
のアミノ酸配列を示し、図2−2に続く部分である。
プチドの一次構造(塩基配列)ならびにIL−2受容体
のアミノ酸配列を示し、図2−2に続く部分である。
【図2−4】 上記IL−2受容体活性を有するポリペ
プチドの一次構造(塩基配列)ならびにIL−2受容体
のアミノ酸配列を示し、図2−3に続く部分である。
プチドの一次構造(塩基配列)ならびにIL−2受容体
のアミノ酸配列を示し、図2−3に続く部分である。
【図3】 参考例の(viii)に記載した発現型プラスミ
ドpKCR・Tac−2・Aの構造を示す。
ドpKCR・Tac−2・Aの構造を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12N 15/09 (C12N 5/10 C12R 1:91) (C12P 21/02 C12R 1:91) (C12N 5/00 B C12R 1:91)
Claims (2)
- 【請求項1】遺伝子組み換え技術で得られた式 GluLeuCysAspAspAspProProGluIleProHisAlaThr PheLysAlaMetAlaTyrLysGluGlyThrMetLeuAsnCys GluCysLysArgGlyPheArgArgIleLysSerGlySerLeu TyrMetLeuCysThrGlyAsnSerSerHisSerSerTrpAsp AsnGlnCysGlnCysThrSerSerAlaThrArgAsnThrThr LysGlnValThrProGlnProGluGluGlnLysGluArgLys ThrThrGluMetGlnSerProMetGlnProValAspGlnAla SerLeuProGlyHisCysArgGluProProProTrpGluAsn GluAlaThrGluArgIleTyrHisPheValValGlyGlnMet ValTyrTyrGlnCysValGlnGlyTyrArgAlaLeuHisArg GlyProAlaGluSerValCysLysMetThrHisGlyLysThr ArgTrpThrGlnProGlnLeuIleCysThrGlyGluMetGlu ThrSerGlnPheProGlyGluGluLysProGlnAlaSerPro GluGlyArgProGluSerGluThrSerCysLeuValThrThr ThrAspPheGlnIleGlnThrGluMetAlaAlaThrMetGlu ThrSerIlePheThrThrGluTyrGlnValAlaValAlaGly CysValPheLeuLeuIleSerValLeuLeuLeuSerGlyLeu ThrTrpGlnArgArgGlnArgLysSerArgArgThrIle(配列番
号:1) で表されるアミノ酸配列を含有するインターロイキン−
2受容体。 - 【請求項2】式 GluLeuCysAspAspAspProProGluIleProHisAlaThr PheLysAlaMetAlaTyrLysGluGlyThrMetLeuAsnCys GluCysLysArgGlyPheArgArgIleLysSerGlySerLeu TyrMetLeuCysThrGlyAsnSerSerHisSerSerTrpAsp AsnGlnCysGlnCysThrSerSerAlaThrArgAsnThrThr LysGlnValThrProGlnProGluGluGlnLysGluArgLys ThrThrGluMetGlnSerProMetGlnProValAspGlnAla SerLeuProGlyHisCysArgGluProProProTrpGluAsn GluAlaThrGluArgIleTyrHisPheValValGlyGlnMet ValTyrTyrGlnCysValGlnGlyTyrArgAlaLeuHisArg GlyProAlaGluSerValCysLysMetThrHisGlyLysThr ArgTrpThrGlnProGlnLeuIleCysThrGlyGluMetGlu ThrSerGlnPheProGlyGluGluLysProGlnAlaSerPro GluGlyArgProGluSerGluThrSerCysLeuValThrThr ThrAspPheGlnIleGlnThrGluMetAlaAlaThrMetGlu ThrSerIlePheThrThrGluTyrGlnValAlaValAlaGly CysValPheLeuLeuIleSerValLeuLeuLeuSerGlyLeu ThrTrpGlnArgArgGlnArgLysSerArgArgThrIle(配列番
号:1) で表されるアミノ酸配列を含有するインターロイキン−
2受容体活性を有するポリペプチドをコードする組み換
えDNAを有する動物細胞を培養し、培養物中にインタ
ーロイキン−2受容体を生成、蓄積せしめることを特徴
とする該受容体の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6105124A JPH089640B2 (ja) | 1994-05-19 | 1994-05-19 | ヒト・インターロイキン−2受容体 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6105124A JPH089640B2 (ja) | 1994-05-19 | 1994-05-19 | ヒト・インターロイキン−2受容体 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59174037A Division JPH0691823B2 (ja) | 1984-08-23 | 1984-08-23 | 新規dnaおよびその製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07165795A JPH07165795A (ja) | 1995-06-27 |
JPH089640B2 true JPH089640B2 (ja) | 1996-01-31 |
Family
ID=14399050
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6105124A Expired - Lifetime JPH089640B2 (ja) | 1994-05-19 | 1994-05-19 | ヒト・インターロイキン−2受容体 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH089640B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014006225A1 (en) * | 2012-07-06 | 2014-01-09 | Innovative Technologies In Biological Systems S.L. | Fluorescent fusion polypeptide, biosensor comprising said polypeptide and uses thereof |
-
1994
- 1994-05-19 JP JP6105124A patent/JPH089640B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH07165795A (ja) | 1995-06-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2865300B2 (ja) | ヒトb細胞刺激因子2レセプター蛋白質 | |
EP0136489B1 (en) | Analogs of human interleukin ii and their preparation | |
JP3652582B2 (ja) | タイプiiインターロイキン−1受容体 | |
US5807991A (en) | Human interleukin-5 receptor | |
EP4122951A1 (en) | Interleukin-2 mutant and use thereof | |
US20050208572A1 (en) | EV127 gene sequences and protein encoded thereby | |
EP0533006A1 (en) | Chimaeric interleukin 5-receptor/immunoglobulin polypeptides | |
JP3255699B2 (ja) | ヒトIL−2レセプターγ鎖分子 | |
US5852176A (en) | Antibodies to receptors for human interleukin-12 | |
JPH0657152B2 (ja) | Csf遺伝子類 | |
JPH064674B2 (ja) | ヒトインタ−ロイキン−1遺伝子のクロ−ニング及び特性化 | |
JPH0678772A (ja) | ヒトインターロイキン−5受容体のα鎖又はその一部、特にshIL5RαをコードするDNA及びそれを含むベクター、このベクターで形質転換された宿主細胞、ならびにその製造及び利用方法 | |
JPH03504439A (ja) | 免疫グロブリンEのための高アフィニティー受容体のγサブユニットをコードするcDNA | |
US20040009950A1 (en) | Secreted human proteins | |
JP3231262B2 (ja) | ヒトTh1特異的タンパク質及びこれをコードする遺伝子、並びにこれに関連する形質転換体、組換えベクター及び抗体 | |
JPH089640B2 (ja) | ヒト・インターロイキン−2受容体 | |
JPH02195888A (ja) | ヒトインターロイキン2活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有する組換えdna体および該組換えdna体により形質転換された原核生物細胞 | |
AU675924B2 (en) | Methods for production of purified soluble type B and type Ahuman platelet-derived growth factor receptor fragments | |
JPH0691823B2 (ja) | 新規dnaおよびその製造法 | |
EP0570462A1 (en) | MODIFIED INTERLEUKIN-1$g(b) | |
JP2839837B2 (ja) | 顆粒球コロニー刺激因子受容体のリガンド結合領域蛋白質をコードしているdna | |
JP3002104B2 (ja) | 顆粒球コロニー刺激因子受容体のリガンド結合領域蛋白質bcをコードしているdna | |
JP3070913B2 (ja) | 膜局在型zap−70を用いた免疫賦活剤 | |
JP2555816B2 (ja) | ヒトインターロイキン−2蛋白質の製造法 | |
JPS61181380A (ja) | 新規dnaおよびその用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19960716 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |