JPH08500729A

JPH08500729A - Ｐ９０抗体またはプローブを用いた前癌細胞または癌細胞の検出方法

Info

Publication number: JPH08500729A
Application number: JP6502631A
Authority: JP
Inventors: レビン，アーノルド，ジェー．; フィンレー，キャシー，エー．; コードン−カード，カルロス
Original assignee: Princeton University
Current assignee: Princeton University
Priority date: 1992-06-26
Filing date: 1993-06-28
Publication date: 1996-01-30
Anticipated expiration: 2018-04-28
Also published as: WO1994000603A1; CA2137822A1; EP0654092A4; CA2137822C; JP3399948B2; EP0654092A1; EP0654092B1; DE69333202T2; DE69333202D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ｐ５３とｄｍ２の発現レベルまたは遺伝子増幅を測定し、ｐ５３とｄｍ２の内の何れか一方またはｐ５３とｄｍ２の両方のレベルの上昇により癌であると診断する癌診断方法を提供する。また本発明は、ｐ５３とｄｍ２の発現レベルまたは遺伝子増幅を測定し、ｐ５３とｄｍ２の内の何れか一方またはｐ５３とｄｍ２の両方のレベルの上昇により予後が悪いと判断する癌の進行を予測する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】Ｐ９０抗体またはプローブを用いた前癌細胞または癌細胞の検出方法本出願は、１９９３年６月２５日出願のＰＣＴ出願第号の一部継続出願であり、このＰＣＴ出願は１９９３年２月１７日出願の米国特許出願第０８／０１８６４９号の一部継続出願である。そして、その米国特許出願は１９９２年６月２６日出願の米国特許出願第０７／９０４７６６号の一部継続出願であり、その米国特許出願第０７／９０４７６６号は１９９１年７月１２日出願の米国特許出願第０７／７０３１８５号の一部継続出願である。さらに、その米国出願第０７／７０３１８５号は１９９０年６月２７日出願の米国特許出願第０７／５４３９６３号の一部継続出願であり、これらの出願は本出願の一部を構成するものとする。発明の背景体細胞における癌原遺伝子における突然変異がヒトの癌の誘発に大きな影響を与えていることが徐々に認識されてきている。そのような癌遺伝子の突然変異の例としては、ｎｅｕ、ｆｅｓ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｍｙｂ、ｆｍｓ、Ｈａ−ｒａｓおよびＫｉ−ｒａｓが挙げられる。癌原遺伝子が癌遺伝子に転換する突然変異は点変異であることが多い。癌原遺伝子およびその発現産物がどの様にして正常な細胞を癌細胞に転換するのかを理解するために更に検討する必要がある。一般に癌遺伝子は優性的に作用すると考えられている。これは、癌原遺伝子から癌遺伝子への変換により、新しい機能、即ち強化転換が生じていることを意味すると考えられている。癌に関連する別の形式の突然変異は、腫瘍抑制遺伝子が改変されその遺伝子産物が腫瘍抑制機能を失った時に生じる。腫瘍抑制遺伝子の例は網膜芽細胞腫感受性遺伝子Ｒｂである。厳密に言うと腫瘍抑制遺伝子は腫瘍の形成に寄与しないが、腫瘍抑制遺伝子は時として劣性癌遺伝子と呼ばれる。両対立遺伝子が突然変異した場合には、腫瘍抑制遺伝子が無いことで腫瘍形成が促進するためその表現型は劣性である。優性および劣性の癌原遺伝子の両方の特性を示す遺伝子産物は５３ｋｄのリンタンパクｐ５３である。ｐ５３遺伝子の突然変異が種々の癌の多くのものに関連していることが徐々に立証されてきている。例えば、Ｉｇｇｏら著のＬａｎｃｅｔ３３５、ページ６７５〜６７９（１９９０年）には、ｐ５３は、肺癌において突然変異を受ける最も一般的な癌原遺伝子であるとの見解が示されている。ｐ５３について知られていることの多くは、野性型と突然変異型のマウスｐ５３をネズミの繊維芽細胞に移入した場合の影響を調べることによって得たものである。この研究は、Ｌｅｖｉｎｅらによる「小形ＤＮＡ腫瘍ウイルスによる転換の一般的メカニズム」における“ｐ５３癌原遺伝子とその産物”、Ｌ．Ｖｉｌｌａｒｒｅａｌ編、ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｏｒｂｉｏｌｏｇｙの第２章（１９８９年）；同書におけるＨｉｎｄｓらによる第７章；およびＬｅｖｉｅによるＢｉｏＥｓｓａｙｓ１２、ページ６０〜６６（１９９０年）において見直しが行われている。ｐ５３遺伝子は、転写調節に関与しているようであり（Ｆｉｅｌｄｓ，ＳとＪａｎｇ，Ｓ．Ｋ．（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９、ページ１０４６〜１０４９；Ｒａｙｃｒｏｆｔ，Ｌ．、Ｗｕ，Ｈ．およびＬｏｚａｎｏ，Ｇ．（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９、ページ１０４９〜１０５１：およびＬｅｖｉｎｅ，Ａ．Ｊ．、Ｍｏｍａｎｄ，Ｊ．およびＦｉｎｌａｙ，Ｃ．Ａ．（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ３５１ページ４５３〜４５６）、また細胞サイクルにおける調節上のチェックポイントとして作用し、Ｇ−１相の細胞を捕収するようである（Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ．、Ｇｅｏｒｇｏｆｆ，Ｉ．およびＬｅｖｉｎｅ，Ａ．Ｊ．（１９９１年）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．５、ページ１５１〜１５９；Ｈｕｐｐ，Ｔ．Ｒ．、Ｍｅｅｋ，Ｄ．Ｗ．、Ｍｉｄｇｌｅｙ，Ｃ．Ａ．およびＬａｎｅ，Ｄ．Ｐ．（１９９２年）Ｃｅｌｌ７１、ページ８７５〜８８６；およびＹｉｎ，Ｙ．、Ｔａｉｎｓｋｙ，Ｍ．Ａ．、Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｆ．Ｚ．、Ｓｔｒｏｎｇ，Ｃ．Ｃ．およびＷａｈｌ，Ｅ．Ｍ．（１９９２年）Ｃｅｌｌ７０、ページ９３７〜９４８）。遺伝子内突然変異、ホモ接合性欠失および構造再配置などのｐ５３遺伝子の遺伝子的変更はヒトの癌においてよく見られる（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．とＫｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．（１９９２年）Ｃｅｌｌ７０、ページ５２３〜５２６；Ｂａｋｅｒ，Ｓ．Ｊ．ら（１９９０年）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５０、ページ７７１７〜７７２２；Ｍｏｒｉ，Ｎ．ら（１９８９）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ４９、ページ５１３０〜５１３５；Ｌｅｅ，Ｊ．Ｈ．ら（１９９０年）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５０、ページ２７２４〜２７２８；Ｖａｒｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．ら（１９９１年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ６、ページ４１３〜４２１；Ｐｒｅｓｔｉ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９１年）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５１ページ５４０５；およびＤａｌｂａｎｇｉ，Ｇ．ら（１９９３年）ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＭｏｌｅｃｕｌａｒＰａｔｈｏｌｏｇｙ２，ページ４〜１３）。これらのｐ５３の変更形態は、機能的ホモテトラマーユニットの活性を減少するかまたは阻止する（ＳｔｅｎｇｅｒＪ．Ｅ．ら（１９９２年）ＭｏｌＣａｒｃｉｎｏｇ５、ページ１０２〜１０６；Ｓｔｕｒｚｂｅｃｈｅｒ，Ｈ．Ｗ．ら（１９９２年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ７，ぺージ１５１３〜１５２３）。突然変異ｐ５３タンパク質は半減期が長く、また退化も遅いため、腫瘍細胞の核中に不活性の複合体と自己凝集性分子が生じる（Ｓｔｕｒｚｂｅｃｈｅｒ，Ｈ．Ｗ．ら（１９８７年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１、ページ２０１〜２１１；Ｈａｌｅｖｙ，Ｏ．ら（１９８９年）ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ９、ページ３３８５〜３３９２）。ヒトにおいては、ｐ５３遺伝子の胚芽系突然変異は、リ・フローメニ（Ｌｉ− Ｆｒａｕｍｅｎｉ）症候群によって影響を受けている家族に見られる。この症候群は、各個人を、軟組織の肉腫を含む種々の腫瘍にかかり易くする稀な常染色体優性の特徴を有する（Ｌｉ，Ｆ．Ｐ．とＦｒａｕｍｅｎｉ，Ｊ．Ｆ．（１９６９年）ＡｎｎＩｎｔｅｒｎＭｅｄ７１、ページ７４７〜７５２；Ｍａｌｋｉｎ，Ｄ．ら（１９９０年）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２５０、ぺージ１２３３〜１２３８）。より最近では、ｐ５３胚芽系突然変異は、明らかに癌の家系ではない癌患者においても検出されており（Ｔｏｇｕｃｈｉｄａ，Ｊら（１９９２年）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６、ページ１３０１〜１３０８）、また、第二の一次新生物を呈する患者の小集団においても検出されている（ＭａｌｋｉｎＤ．ら（１９９２年）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６、ぺージ１３０９〜１３１５）。さらに、軟組織の肉腫においてｐ５３遺伝子の体性突然変異が発生したことが報告されている（Ｓｔｒａｔｔｏｎ，Ｍ．Ｒ．ら（１９９０年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ５、ページ１２９７〜１３０１；Ｍｕｌｌｉｇａ，Ｌ．Ｍ．ら（１９９０年）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８７、ページ５８６３〜５８６７：Ｔｏｇｕｃｈｉｄａ，Ｊ．ら（１９９２年）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５２、ページ６１９４〜６１９９；Ｄｒｏｂｎｊａｋ，Ｍ．ら（１９９３年）提出済：Ｌａｔｒｅｓ，Ｅ．ら（１９９３年）提出済）。癌原遺伝子になる可能性があると認識されている他の遺伝子は、マウス・ダブル・ミニッツ−２（ｍｄｍ２）である（Ｆａｋｈａｒｚａｄｅｈら（１９９１年）、ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ１０（６）、ページ１５６５〜１５６９）。マウスとヒトのｍｄｍ２遺伝子とタンパク質の配列は知られている。（Ｆａｋｈａｒｚａｄｅｈら、ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ１０（６）、ページ１５６５〜１５６９（１９９１年）；Ｏｌｉｎｅｒ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９２年）Ｎａｔｕｒｅ３５８、ページ８０〜８３；およびＣａｈｉｌｌｙ−Ｓｎｙｄｅｒら、ＳｏｍａｔｉｃＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，１３（３）、ページ２３５〜２４４（１９８７年））。配列は、マウス、ラット、ハムスターおよびヒトの遺伝子を含む種の間で、進化的に一定に保たれている（Ｃａｈｉｌｌｙ−Ｓｎｙｄｅｒら、ＳｏｍａｔｉｃＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，１３（３）、ページ２３５〜２４４（１９８７年））。文献においては、ｍｄｍ２遺伝子は、ＭＤＭ２、ＩＭＤＭ２０、ｈｄｍ２（ヒト種）、および１ｍｄｍ２０（マウス種）として呼ばれる。９０ｋＤのリンタンパク質であるｍｄｍ２遺伝子産物は文献ではｐ９０と呼ばれ、これはマウスとヒトの両方の種を示し、また、ヒト種であるＭＤＭ２を示す。ｐ９０タンパク質は、本出願人の関連公報であるＬｅｖｉｎｅらの１９９１年６月２７日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４６０８に記載されている。ｄｍ２は本出願全体を通して使用されているが、これは、ｍｄｍ２遺伝子とタンパク質について文献において用いられている種々の語を含むものとし、全ての種の中での同族種のものも含む。骨肉腫と軟組織の肉腫の両方において１ＭＤＭ２０の増殖とＭＤＭ２（遺伝子産物）過発現があることが立証されている（Ｏｌｉｎｅｒ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９２年）Ｎａｔｕｒｅ３５８、ページ８０〜８３；Ｌａｄａｎｙｉ，Ｍ．ら（１９９３年）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５３、ページ１６〜１８；Ｌｅａｃｈ，Ｆ．Ｓ．ら（１９９３年）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５３、ページ２２３１〜２２３４）。ｈｄｍ２遺伝子またはＩＭＤＭ２０またはＭＤＭ２と呼ばれるｍｄｍ２遺伝子のヒト種は、クローニングされ染色体１２の長腕にマッピングされた（１２ｑ１３−１４）（Ｏｌｉｎｅｒら、１９９２年、”ヒト肉腫におけるｐ５３関連タンパク質をコードする遺伝子の増殖”、Ｎａｔｕｒｅ３５８、ぺージ８０〜８３）。この領域には、骨肉腫と軟組織の肉腫において増殖することが既に発見されている、２種の遺伝子ＳＡＳとＧＬＩを含有している。ＳＡＳ遺伝子は、確認されていない機能を有するタンパク質をコードする。この遺伝子は、悪性繊維性組織球腫（ＭＦＨ）から分離され、ＭＦＨおよび脂肪肉腫において増殖することが示された（Ｔｕｒｃ−Ｃａｒｅｌ，Ｃ．ら（１９８６年）ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅｔＣｙｔｏｇｅｎｅｔ２３、ページ２９１〜２９９；Ｍｅｌｔｚｅｒ，Ｐ．Ｓ．ら（１９９１年）ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈＤｉｆｆ２、ページ４９５〜５０１）。ＧＬＩ遺伝子は、ＤＮＡ結合ジンクフィンガータンパク質をコードする。この遺伝子は最初グリア芽細胞腫から分離されたが、横紋筋肉腫および骨肉腫にて増殖することが報告されている（Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．ら（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６、ページ７０〜７３）。本発明以前においては、突然変異したｐ５３が癌に関連するものと考えられていた。また、ｍｄｍ２の過発現が腫瘍に関係することが本発明より以前から知られていた。しかし、本発明以前には、変更されたｐ５３とｄｍ２遺伝子の関係、細胞中における種々の発現の態様、および診断を行うとともに、癌患者の臨床上の関連性または予後を決定するためにその関係を如何に利用するかという点については開示されていなかった。本発明の目的は、過発現または増殖されたｐ５３およびｄｍ２遺伝子の関係を利用することによって、癌の診断を行うとともに、癌患者の予後を決めることにある。発明の概要本発明は、生物学的試料におけるｐ５３とｄｍ２のレベルを測定し、ｐ５３とｄｍ２の内の何れか一方またはｐ５３とｄｍ２の両方のレベルが上昇した場合に癌の発生を示すようにした癌診断方法を提供するものである。また、本発明の別の目的は、生物学的試料におけるｐ５３とｄｍ２のレベルを測定し、ｐ５３とｄｍ２の内の何れか一方またはｐ５３とｄｍ２の両方のレベルが上昇した場合に予後が悪いとして癌の進行を予想することによって達成される。また、本発明は生物学的試料を３グループに分類する方法を提供する。この方法は、試料中のｐ５３またはｄｍ２のレベルが異常に上昇したか否かを測定すことを含んでおり、第１グループはｐ５３およびｄｍ２のレベルは何れも異常に上昇していない場合を含み、第２グループはｐ５３のレベルは異常に上昇しているがｄｍ２のレベルは異常に上昇していないか、ｄｍ２のレベルは異常に上昇しているがｐ５３のレベルは異常に上昇していない場合を含み、第３グループはｐ５３とｄｍ２の両方のレベルが異常に上昇している場合を含む。さらに、本発明は生物学的試料である癌細胞、または癌性または前癌性になる危険性のある細胞で、少なくとも１つの正常なｐ５３対立遺伝子を含有する細胞を測定する方法を提供する。この方法は、生物学的試料中におけるｄｍ２のレべルが異常に上昇しているか否かを測定することを含み、生物学的試料中におけるｄｍ２のレベルが、正常な生物学的試料と比較して上昇している場合には、癌細胞、または癌性または前癌性になる危険性のある細胞であることが示される。本発明は、分離されたｐ５３／ｄｍ２タンパク質複合体とｄｍ２タンパク質に対する抗体をも提供する。図面の簡単な説明図１：この図は、本発明の抗ｐ９０単クーロン抗体と反応するｐ９０タンパク質のエピトープを示す図である。ハイブリドーマ１Ｆ５、６Ｃ１０、１Ｄ６、４Ｂ２、２Ｅ１２、３Ｆ３、３Ｇ５、３Ｆ８、６Ｈ７、２Ａ９、３Ｇ９、１Ｄ１１、２Ａ１０、１Ｇ２、４Ｂ１１およひ５Ｂ１０によって生成された抗ｐ９０単クーロン抗体が、これらの抗体が反応するエピトープを示す位置のｐ９０アミノ酸エピトープマップの下に、示されている。図２：このグラフは、軟組織肉腫患者２１１人の９０か月間における全体的な生存を示す。図３：このグラフはｐ５３とｍｄｍ２のレベル上昇と、軟組織肉腫患者２１１人（図２参照）のグループにおける生存を示す。グラフ中に示した表現型の類型は下記の通りである。グループＡ：ｄｍ２−／ｐ５３−（ｄｍ２、ｐ５３の何れもレベル上昇がない）。グループＢ：ｄｍ２＋／ｐ５３−およびｄｍ２−／ｐ５３＋。グループＣ：ｄｍ２＋／ｐ５３＋（ｄｍ２、ｐ５３の両方ともレベルが上昇）。図４：抗ｄｍ２抗体と抗ｐ５３抗体を使用した免疫染色パターンを示す。上側の２個のスライドはコントロールグループを示す。左上のスライドは、ｄｍ２−である３Ｔ３−Ｂａｌｂ／ｃ細胞系の染色パターンを示す。右上のスライドは、ｄｍ２＋である３Ｔ３−ＤＭ細胞系の染色パターンを示す。中央の２個のスライドは、同じ患者から採取したヒト腫瘍組織切片の染色パターンを示す。中央左側のスライドはｐ５３のーの染色パターンを示し、中央右側のスライドはｄｍ２＋の染色パターンを示す（以下に述べるグループＢサブセットｐ５３−／ｄｍ２＋サブセットに対応する）。下側の２個のスライドは別患者から採取したヒト腫瘍組織切片の染色パターンを示す。左下のスライドは、ｐ５３＋の染色パターンを示し、右下のスライドはｄｍ２＋の染色パターンを示す（以下に述べるグループＣに対応する）。発明の詳細な説明定義：ｐ５３：本明細書中では、“野性型の”ｐ５３という語は、Ｍａｔｌａｓｈｅｗｓｋｉら、ＥＭＢＯＪ．13、ページ３２５７〜３２６２（１９８４年）；Ｚａｋｕｔ −Ｈｏｕｒｉら、ＥＭＢＯＪ．４、ページ１２５１〜１２５５（１９８５年）；およびＬａｍｂとＣｒａｗｆｏｒｄ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５、ぺージ１３７９〜１３８５（１９８６年）にて報告されているヌクレオチドまたはアミノ酸配列を意味する。この配列はＧｅｎＢａｎｋから入手可能である。野性型のｐ５３には、アミノ酸７２におけるプロリン／アルギニン多型および対応するヌクレオチド多型が含まれる。野性型のｐ５３遺伝子またはタンパク質の突然変異は前癌または癌の状態を呈す。前癌細胞とは、通常１個の正常なｐ５３対立遺伝子と１個の突然変異したｐ５３対立遺伝子を有する細胞である。例えば、突然変異は点変異である。癌細胞においては、通常ｐ５３の対立の両方が突然変異する。例えば、一方の突然変異が点変異で、他方の突然変異が、ｐ５３遺伝子の全てまたは大部分の欠失によるものであるあろう。ｄｍ２：本発明においては、ｄｍ２は、９０ｋＤリンタンパク質（ｐ９０）を含むタンパク質の族、タンパク質ｐ８５（８５ｋＤ）、タンパク質ｐ７６（７６ｋＤ）、タンパク質ｐ７４（７４ｋＤ）およびタンパク質ｐ５８−５７（５８ｋＤと５８ｋＤ）（ｐ５７はラットｐ５８と同等のマウス種である）などの９０ｋＤリンタンパク質の断片または産物、およびこれらの同族種または類似種を表す。ｐ５３タンパク質は、ｄｍ２タンパク質と共免疫沈降する。ｄｍ２タンパク質には、配列化されたマウス・ダブル・ミニッツ−２（ｍｄｍ２）９０ｋＤリンタンパク質が含まれる。また、ｄｍ２という語は、上記のｄｍ２タンパク質をコードする遺伝子を示す。ｍｄｍ２遺伝子とタンパク質の配列はＦａｋｈａｒｚａｄｅｈら、ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ１０（６）、ページ１５６５〜１５６９（１９９１年）；およびＣａｈｉｌｌｙ−Ｓｎｙｄｅｒら、ＳｏｍａｔｉｃＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，１３（３）、ページ２３５〜２４４（１９８７年）に開示されている。ｐ９０ｄｍ２と同種の配列は、ヒト“ｈｄｍ２”などの幾つかの種のゲノム中に存在する。ラット、マウスおよびハムスターだけでなく、ヒトの遺伝子も配列され、それは約９０ｋＤの分子重量を有している（Ｏｌｉｎｅｒ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９２年）Ｎａｔｕｒｅ３５８、ページ８０〜８３）。好ましい実施態様では、ｄｍ２遺伝子とタンパク質はヒト種である。約９０ｋＤのｄｍ２タンパク質は明らかに、ｐ５８タンパク質は高い確率でｐ５３に結合する。Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３から得られる３Ｔ３ＤＭ細胞は、増殖したｍｄｍ２遺伝子の複写に反応して５個のｍｄｍ２を過剰に生成する。ｄｍ２および／またはｐ５３のレベル評価（ｄｍ２＋および／またはｐ５３＋）：本明細書では、細胞内のｄｍ２および／またはｐ５３のレベル上昇は、ｄｍ２またはｐ５３遺伝子の増殖、または細胞などの生物的試料におけるｄｍ２またはｐ５３タンパク質生成物の過発現または蓄積を示す。ｄｍ２またはｐ５３タンパク質のレベルは、生物学的試料、好ましくは細胞におけるｄｍ２またはｐ５３タンパク質の合計測定値であり、遊離タンパク質であるか複合体であるかは関係ない。幾つかの場合においては、ｄｍ２の増殖がないのにも関わらずｄｍ２タンパク質のレベルが上昇したことは、ｄｍ２と突然変異したｐ５３生成物との間にヘテロダイマー／ヘテロテトラマーが形成されたことを示す。突然変異体のｐ５３タンパク質は長い半減期を持ち、退化が遅いため、細胞核中に蓄積する。ｐ５３ミスセンス突然変異は、免疫化学的に検出できるｐ５３突然変異の少なくとも約８５％で大部分を占める。しかし、幾つかの場合には、腫瘍組織内における野性型のｐ５３遺伝子とタンパク質のレベル上昇が検出される。生物学的試料におけるｄｍ２および／またはｐ５３のレベルが、正常な生物学的試料と比べて上昇した場合、癌細胞、または癌性または前癌性になる危険性のある細胞であることを示す。生物学的試料には、組織抽出物、細胞の試料、またはリンパ液、血液または尿などの生物学的流体が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明は生物学的試料を３グループに分類する方法を提供する。この方法は、試料中のｐ５３またはｄｍ２の何れかのレベル、またはｐ５３とｄｍ２の両方のレベルが異常に上昇したか否かを測定すことを含んでいる。第１グループであるグループＡはｐ５３およびｄｍ２の何れも異常なレベル上昇がない場合（ｐ５３ −／ｄｍ２−）を含む。第２グループであるグループＢはｄｍ２のレベルは異常に上昇しているがｐ５３のレベルは異常に上昇していない場合（ｐ５３−／ｄｍ２＋）と、ｐ５３のレベルは異常に上昇しているがｄｍ２のレベルは異常に上昇していない（ｐ５３＋／ｄｍ２−）場合とを含み、第３グループであるグループＣはｐ５３とｄｍ２の両方のレベルが異常に上昇している場合（ｐ５３＋／ｄｍ２＋）を含む。本発明は、ｄｍ２とｐ５３の発現の種々の態様を分類することが、種々の癌に患っている患者の臨床的な経過を診断しまた予測するために臨床的に非常に重要であることを示す。癌の例としては、肉腫、癌腫、白血病、またはリンパ腫である。特に肉腫には軟組織肉腫、骨肉腫などが含まれる。他の態様においては癌には膀胱癌が含まれる。他の態様では、結腸直腸癌、肺癌、卵巣癌、頸部癌、副腎皮質癌、骨癌、胸部癌、脳癌、および慢性骨髄性白血病が対象となるがこれらに限定されるものではない。したがって、本発明は、被検者の前癌組織または腫瘍から生物学的試料を得ることによって被検者の予後を評価し、生物学的試料３つのグループの何れに属するかを決定する方法を提供する。これらの分類の内、第３グループは最も予後が悪いことを示し、第１グループは最も予後が良いことを示す。グループＣ（ｐ５３＋／ｄｍ２＋）：本発明は、ｄｍ２のレベルが上昇しているか否かを測定することにより、癌細胞、または癌性または前癌性になる危険性のある細胞で、少なくとも１個の突然変異ｐ５３対立遺伝子を含む細胞を検出するための方法を提供する。予想外にも、ｄｍ２タンパク質のレベル上昇は、ｐ５３のレベルが上昇したとして、即ち、ｐ５３＋／ｄｍ２＋グループ（図４参照）として検出されるｐ５３の過発現野性型だけでなく、突然変異を含むｐ５３タンパク質のレベル上昇と相互作用し、生存率や腫瘍の進行などの悪い予後を示す臨床病理的変数となる。これらのグループの内、グループＣは最も予後が悪いことを示す。例２と図３は、グループＡ（ｐ５３のレベルもｄｍ２のレベルも上昇していない）とグループＢ（これらのタンパク質の内の一方のみのレベルが上昇）とを比較した時における、非常に生存率が悪いグループで生じた同じ腫瘍部におけるｄｍ２とｐ５３の異常なレベル上昇が免疫学的に検出された状態をしめす。これは予想外のことである。なぜならば、本発明者によって発見されたように、ｄｍ２タンパク質がｐ５３の転写作用を不活性にし、このためｐ５３タンパク質のレベルが上昇した細胞中においてはｄｍ２のレベル上昇がないためである。グループＢ（ｐ５３−／ｄｍ２＋およびｐ５３＋／ｄｍ２−）：グループＢは２つのサブセット、即ちｐ５３のレベルは正常であるがｄｍ２のレベルが上昇した場合（ｐ５３−／ｄｍ２＋）と、ｐ５３のレベルは上昇したがｄｍ２のレベルは正常である場合（ｐ５３＋／ｄｍ２−）を含む。３グループの内、グループＢは、グループＡよりは悪いがグループＣよりは良い予後を示す。グループＢのサブセットｐ５３＋／ｄｍ２− ：突然変異や過発現による野性型ｐ５３遺伝子およびタンパク質などのｐ５３タンパク質のレベルが上昇したことが検出された場合、即ち、ｐ５３＋／ｄｍ２− グループが検出された場合、前癌のまたは癌の状態を示す。ｐ５３の突然変異体は野性型ｐ５３の機能を不活性化し、ｐ５３遺伝子の突然変異体およびタンパク質を含有する細胞は腫瘍形成の可能性が高い。また野性型のｐ５３タンパク質のレベル上昇は、予後を悪化させる一因となる。細胞中におけるＤＮＡの損傷またはウイルス性癌原遺伝子生成物の結合は、野性型ｐ５３タンパク質を安定にし、その濃度が増加する。グループＢのサブセットｐ５３−／ｄｍ２＋：本発明は、予想外にもｄｍ２のレベルが上昇した場合にも、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（３Ｔ３ＤＭ細胞）または前癌または癌細胞などの細胞に対してｐ５３のレベルが上昇した場合と同様な特性を与えること明らかにした。何れの場合においても、動物においては、細胞中のｄｍ２またはｐ５３のレベルが上昇し、腫瘍発生の可能性が高くなる。ｐ５３−／ｄｍ２＋に関しては、細胞中における野性型ｐ５３対立遺伝子のレベルが正常であっても、ｄｍ２のレベルが上昇している場合には細胞の腫瘍化の可能性が高まる。本発明は、細胞が少なくとも２個の正常なｐ５３対立遺伝子、即ち野性型ｐ５３または正常レベルのｐ５３を含む場合において、癌細胞、または癌性または前癌性になる危険性のある細胞を検出するための方法を提供するもので、この方法は、生物学的試料中におけるｄｍ２のレベルが異常に上昇したか否かを検出することを含み、このレベル上昇は、正常な生物学的試料中におけるｄｍ２のレベルと比較した場合のレベル上昇を意味する（図４参照）。グループＡ（ｐ５３−／ｄｍ２−）：グループＡは、ｐ５３とｄｍ２の両方ともが正常のレベルである場合を含む。このグループにおける前癌細胞と癌細胞は、ｐ５２および／またはｄｍ２のレベル上昇以外の原因によるものである可能性が高い。３グループの内、グループＡの予後が最もよい。ＤＭ２またはＰ５３の上昇レベルの検出：増幅：ｄｍ２あるいはｐ５３遺伝子の増幅は、核酸プローブ法などの公知の方法を用いて検出できるであろう。ＤＮＡの高次の複写数は例えばサザンブロット法によって検出でき、増大したＲＮＡ量はノーザンブロット法によって検出できるであろう（Ｇｅｏｒｇｅ，Ｄ．Ｌ．およびＰｏｗｅｒｓ，Ｖ．Ｅ．、Ｃｅ１１２４：１１７−１２３（１９８１）：Ｇｅｏｒｇｅ，Ｄ．Ｌ．ら、ＥＭＢＯＪ．，４：１１９９−１２０３（１９８５）；Ｓｉｎｇｈ，Ｌ．およびＪｏｎｅｓ，Ｋ．Ｗ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１２：５６２７−５６３８（１９８４）参照）。過発現：生物学的試料中のｄｍ２およびｐ５３タンパクレベルは、抗ｄｍ２および抗ｐ５３抗体を用いた免疫組織化学染色法等の公知の方法で検出される。免疫組織化学に基づく陽性核染色により、ｐ５３、ｄｍ２、あるいはｐ５３／ｄｍ２複合体レベルの上昇が示される。過発現されたｐ５３タンパクはｐ５３遺伝子の突然変異に関連付けられる。本発明の一実施態様においては、ｄｍ２とｐ５３の各種腫瘍における核の過発現は、腫瘍細胞核染色における染色割合（％）から、次の３グループのいずれかに分類される：（ａ）陰性（＜２０％）、（ｂ）異生（２０ −７０％）、（ｃ）相同（＞７０％）。本発明の他の実施態様においては、ｄｍ２レベルの上昇の検出にあたって、前癌状態あるいは癌状態が正常な生物学的試料（細胞など）のレベルの２−１００倍であることが示される。好ましい実施態様においては、上昇したレベルとは正常な生物学的試料（細胞など）のレベルの５−５０倍である。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体は公知の方法によって調製されるであろう。本発明の抗体には、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５−１２８１（１９８９年）の方法に従って調製されたリコンビナント・ポリクローナルあるいはモノクローナルのＦａｂフラグメントが含まれる。さらに以下の文献を参照されたい：Ｂｕｒｄｏｎら編、「生化学と分子生物学における実験室技法」第１３巻、ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、アムステルダム（１９８５年）中に掲載された、Ｃａｍｐｂｅｌｌ「モノクローナル抗体技術、謡歯類およびヒトハイブリドーマの産生と特徴」。癌遺伝子間における一つのアミノ酸の相違に対して特異性を発現するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を調製する方法は、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋらによる米国特許第４７９８７８７号に記載されている。簡単に言えばポリクローナル抗体は、突然変異体ｐ５３と野性型ｐ５３とを区別する抗体産生能のあるｐ５３タンパクやそのフラグメントをウサギ、マウス、ラット、ヤギなどの哺乳類宿主に注入して得る。注入されたぺプチドやぺプチドの断片は、野性型または突然変異型の配列を含有しているであろう。噛乳類からの血清は抽出・スクリーニング工程にかけ、そのぺプチドやぺプチド断片に特異的なポリクローナル抗体を得る。同様の方法をｄｍ２タンパクにも適用できるであろう。モノクローナル抗体を産生するには、哺乳類宿主に上記のぺプチドまたはぺプチド断片を接種し、これを増殖させる。最終増殖から２、３日経過後、脾臓を被接種哺乳類から摘出する。牌臓から得た細胞浮遊液を、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによるＮａｔｕｒｅ２５６、４９５−４９７ページ（１９７５年）に記載の一般的な方法によって腫瘍細胞と融合させる。ペプチド断片として役に立つものであるためにはぺプチド断片は、検出されるＰ５３またはｄｍ２分子のエピトープを定めるのに充分なアミノ酸残基を含有しなければならない。もし断片が抗原性であるには短すぎる場合には、分子担体に結合してもよい。適切な担体分子としては、キーホールリンペットヘモシアニン、子牛血清アルブミンが挙げられる。結合は本分野で公知の方法によって行うことができる。そのような方法の一つとして、断片のシステイン残基と担体分子のシステイン残基とを結合する方法がある。ぺプチド断片は本分野で公知の方法によって合成することができる。好適な方法の幾つかがＳｔｕａｒｔとＹｏｕｎｇによる「固相ぺプチド合成」（第２版、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、１９８４年）に記載されている。ｐ５３とｄｍ２の共免疫沈降法に適する抗体としては、ＰＡｂ４２１とＡｂ２が挙げられる。ＰＡｂ４２１は、ヒト、マウス、ラットなどを含む種々の宿主から得られたｐ５３のカルボキシ末端を認識し、Ｈａｒｌｏｗらによって”ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ”３９、８６１−８６９（１９８１年）に記載されている。Ａｂ２はヒトｐ５３のアミノ末端に特異的であり、ニューヨーク州、マンハセットのオンコジェンサイエンス社から入手できる。ｐ５３を発現しないＲＥＦ細胞が同じ抗体で同様に処理されたときには、ｄｍ２タンパクは免疫沈降しない。免疫沈降物は遠心分離で回収できる。遠心分離やカラムからの溶出に続き、ｄｍ２がｐ５３／ｄｍ２複合体からＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって分離される。９０ＫＤの単一バンドは切断され、配列される。本発明は単離されたｄｍ２／ｐ５３複合体をも提供するものであるが、これは種々の形質転換細胞からのｄｍ２とｐ５３を共免疫沈降することによって得られる。ｄｍ２を精製する他の方法は、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄらによる、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４、６９７０−６９７４（１９８７年）に記載された方法である。本発明はｄｍ２（ｐ９０）遺伝子産物に対してモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマを提供する。これらのハイプリドーマのあるものはＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている：３Ｇ５ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８２）、４Ｂ１１（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８３）、２Ａ１０（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８４）、２Ａ９（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８５）、および４Ｂ２（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８６）。ハイブリドーマ３Ｇ５、４Ｂ１１、２Ａ１０、２Ａ９，および４Ｂ２は、特許手続上のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の要請に従ってこの要請を満たすべく、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８２，ＨＢ１１１８３、ＨＢ１１１８４、ＨＢ１１１８５およびＨＢ１１１８６としてそれぞれメリーランド州２０８５２、ロックヴィル、パークローン・ドライブ１２３０１にあるＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託された。細胞中のＤｍ２のレベルを測定し調整するためのアッセイ：細胞中のｄｍ２および／またはｐ５３のレベルは、増幅されたまたは過発現されたｄｍ２および／またはｐ５３遺伝子またはタンパクを認識できる、本分野で公知のアッセイ法で決定される。標識抗体を用いてタンパクを検出するために種々のアッセイが利用できる。一段階アッセイにおいては、標的分子は、もしそれが存在する場合には標識抗体で固定化されインキュベートされる。標識抗体は固定化された標的分子と結合する。未結合の分子を洗浄除去した後、アッセイでサンプルの標識の存在を調べる。二段階アッセイにおいては、固定化された標的分子は未標識の抗体とともにインキュベー卜される。標的分子と未標識抗体の複合体は、もしそれが存在する場合には、その後当該未標識抗体に特異的な第二の標識抗体に結合する。サンプルを洗浄し、上記のように標識の存在を調べるアッセイを行う。標識抗ｄｍ２抗体はイメージング法によってｄｍ２を検出するのに用いることができる。イメージングの一方法としては、イメージ化されるべき腫瘍細胞を検出可能なマーカーによって標識された抗ｄｍ２抗体と接触させる方法がある。この方法は標識抗体がｄｍ２に結合する条件下で行われる。ｄｍ２に結合した抗体が検出されることで、ｄｍ２がイメージ化され検出される。抗体を標識するのに用いられるマーカーはその用途によって選ぶ。当業者はマーカーを容易に選択、決定できる。標識された抗体は腫瘍の存在を検出するためのイムノアッセイや組織学的応用分野において用いることができる。標識抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってよいがモノクローナル抗体が好ましく、ＡＴＣＣに寄託された上記の抗体が挙げられる。本発明の好ましい実施態様においては、標識は放射性原子、酵素あるいは発色団である。放射性原子の例としてはＰ³²、Ｉ¹²⁵、Ｈ³、およびＣＨ¹⁴が挙げられる。酵素の例としてはホースラディッシュペロキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。発色団の例としてはフルオレセンやローダミンが挙げられる。抗体とこれらの標識との結合は公知の方法によるものであってよい。例えば酵素および発色団はジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミドなどのカップリング剤によって抗体と結合される。あるいは、結合はリガンド−レセプターのぺアを介したものであることもできる。適切なリガンドーレセプターのぺアの例としてはビオチン−アビジン、または−ストレプトアビジン、および抗体−抗原が挙げられる。ｄｍ２タンパクに対する抗体を用いて細胞や組織中のｄｍ２タンパクの上昇したレベルを検出することができる。一実施態様においては、ｄｍ２のエピトープに向けられた抗体は、免疫組織病理学的技法により原位置（ｉｎｓｉｔｕ）で用いることができる。これらの方法は、ポリープ、非定型胸部組織、あるいは転移や再発の恐れがより高い腫瘍細胞中などにおいて、組織が癌性となる恐れの高い場合の診断に利用できる。ハイブリドーマ１Ｆ５、６Ｃ１０、１Ｄ６、４Ｂ２、２Ｅ１２、３Ｆ３、３Ｇ５、３Ｆ８、６Ｈ７、２Ａ９、３Ｇ９、１Ｄ１１、２Ａ１０、１Ｇ２、４Ｂ１１、および５Ｂ１０はｄｍ２タンパクのエピトープ（図１参照）に対するモノクローナル抗体を産生する。これらハイブリドーマのいくつかはＡＴＣＣ（上記参照）に寄託されている。モノクローナル抗体は、ネズミおよびヒトの両者のタンパクのエピトープ、さらに宿主の種の間に同型なｄｍ２配列が保存されているかぎり他の種のものとも反応する。本発明の他の実施態様においては、癌細胞はｄｍ２を放出することがあり、これが患者の血液やリンパ液中のｄｍ２量を増大させる。そこでイムノアッセイなどのアッセイによって細胞や体液中の正常ｄｍ２値や正常値を超えたｄｍ２レべルを検出できる。野性型ｐ５３に対するｄｍ２の結合を阻止する治療剤のスクリーニング：野性型ｐ５３に対するｄｍ２の結合を阻止するための治療剤のスクリーニングを各種アッセイによって行うことができる。本発明は、野性型ｐ５３に対するｄｍ２の有害な結合を防ぐのに充分な親和性を有するｄｍ２と複合体を形成する治療剤を選択するための方法を開示する。方法は種々のアッセイを包含し、一例として、ｄｍ２を支持体に固定化して野性型のｐ５３と標識された治療剤の双方に同時あるいは順番に接触させ、この治療剤がｄｍ２の野性型ｐ５３への結合を充分に防ぐように野性型のｐ５３と効果的に競合するかどうかを決定するものが挙げられる。他の態様では野性型のｐ５３を標識化し、治療剤には標識しない。さらに他の態様においては、ｐ５３を支持体に固定化し標識したｄｍ２と治療剤の双方（または標識しないｄｍ２と標識した治療剤）と接触させたうえ、ｐ５３に結合したｄｍ２の量が治療剤を添加しない場合と比べて減少しているかどうかを調べる。ｄｍ２は本発明の抗ｄｍ２抗体で標識化することができる。一態様においては、本発明方法は以下のステップを包含する：ａ）固体支持体に所定量のｄｍ２をｄｍ２が支持体の表面に付着するような条件下で接触（たとえは抗ｄｍ２抗体を用いてｄｍ２を固体支持体に接触）させ、ｂ）支持体に未結合のｄｍ２を除去し、ｃ）ｄｍ２が結合している固体支持体を、その結合しているｄｍ２に野性型ｐ５３が結合してこれと複合体を形成するような条件下で野性型のｐ５３に結合させ、ｄ）未結合のｐ５３を除去し、ｅ）このようにして形成されたｄｍ２／ｐ５３複合体に、サンプル中に存在する標識された潜在的治療剤が野性型ｐ５３と競合しながら結合ｄｍ２へと結合するような条件下で、検出可能なマーカーで標識された所定量のサンプルを接触させ、ｆ）固体支持体に未結合である標識化潜在的治療剤の濃度を定量的に決定し、ｇ）ｄｍ２と特異的に結合しｄｍ２が野性型ｐ５３に結合するのを阻止する潜在的治療剤のサンプル中の濃度を決定する。固体支持体は、当業者が容易に選択、決定できる。好ましい一方法においては、固体支持体は不活性ポリマーからなるビーズであり、また別法においては固体支持体はマイクロウェルである。上記の方法において用いられるマーカーについては当業者はこれを任意に選択できる。検出可能なマーカーは好ましくは酵素、常磁性イオン、ビオチン、蛍光体、発色団、重金属、あるいはラジオアイソトープである。より好ましいマーカーとしては酵素が挙けられ、中でも最も好ましくはホースラディッシュペロキシダーゼまたはアルカリフォスファターゼである。本発明方法の更なる態様によれば、潜在的治療剤は酵素で標識されているとともに、ステップｆ）では固体支持体に結合しなかった標識化潜在的治療剤を除去し、これを、酵素が基質と反応して検出可能な生成物を形成するような条件の下で、酵素に対する特異的基質と接触させる。本発明はさらに、マウス、ラット、ハムスター、ヒトを含む噛乳類における癌を治療する方法を提供するものであり、この方法においては野性型ｐ５３へのｄｍ２の有害な結合が阻止される。この方法の一態様によれば、野性型ｐ５３へのｄｍ２の結合の阻止は、ｄｍ２を充分量の抗ｄｍ２抗体と接触させることによってなされる。また別の態様では、野性型ｐ５３へのｄｍ２の結合の阻止は、ｄｍ２を過剰量の抗イディオタイプｐ５３抗体と接触させることによってなされる。他の態様では、ｐ５３の転写プロモーターを阻止しないｄｍ２抗イディオタイプ抗体を投与してもよい。腫瘍を治療するための他の方法においては、遺伝子治療によって増幅されたｄｍ２遺伝子を正常な数のｄｍ２遺伝子で置き換え、上昇したｐ５３値レベルを正常化する。さらに別の腫瘍治療方法においては、アンチセンス遺伝子治療によって増幅されたｄｍ２遺伝子をアンチセンスｄｍ２遺伝子で置き換える。相対的結合親和性を決定するための方法は本技術分野で公知の方法であってよい。たとえば、ｐ５３タンパクがｈｓｃ７０に結合しているかどうかを決定する方法は、Ｆｉｎｌｅｙら、Ｍｏｌ．ａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｌ．８、５３１− ５３９（１９８８）およびＨｉｎｄｓら、Ｍｏｌ．ａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｌ．７、２８６３−２８６９（１９８７）に記載されている。これらの論文に記載の方法では、抗ｐ５３および抗ｈｓｃ７０抗体を用いた共免疫沈降法が行われている。実施例実施例１ｃＤＮＡクローンの単離：ＨｅＬａ細胞から調製されたλｇｔｌｌｃＤＮＡライブラリーを、低緊縮下でマウスｍｄｍ２ｃＤＮＡをプローブとして用いてスクリーニングした。ｃＤＮＡインサートを陽性ファージから単離し、さらに特徴付けるためにブルースクリプトベクター中にサブクローニングした。全コード領域を含有する完全長ｃＤＮＡを二つの重複したクローンから再構築し、Ｓａｎｇｅｒの方法によって完全に配列決定した（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７年、”ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｗｉｔｈｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ１４：５４６３−５４６７）。ｈｄｍ２に対するモノクローナル抗体の生成：ライブラリーのスクリーニングによって得られたｃＤＮＡクローンは、ｈｄｍ２コード領域のＮ−末端コード領域を含有し、最初のメチオニン開始コドンでトランケートされていた。このｃＤＮＡを完全長のｈｄｍ２ｃＤＮＡとリコンビナントしてリーダー配列と最初のメチオニンのないコード領域を得た。このコード配列をｐＱＥ１１ベクター（Ｑｕｉａｇｅｎ）に挿入し６個のヒスチジン残基がｈｄｍ２のＮ−末端に融合した完全オープンリーディングフレームを得た。発現プラスミドをＥ．Ｃｏｌｉに導人し、ヒスチジン−ｈｄｍ２融合タンパクをＮｉ−²⁺−ＮＴＡ−アガロース（Ｑｕｉａｇｅｎ）カラムクロマトグラフィーで精製した。精製物中の主なタンパク種の易動度はｉｎｖｉｔｒｏでの翻訳されたｈｄｍ２と同等であった。Ｂａｌｂ／Ｃマウスをｈｄｍ２タンパクを産生するそのＥ．ｃｏｌｉで免疫した。ハイブリドーマは通常の手順により準備した。そしてエンザイム−リンクトイムノソルベントアッセイとインビトロで変換されたｈｄｍ２タンパクの免疫沈降法によりスクリーニングした。３回のクローニングにより安定したクローンを確率した。ヒトｄｍ２ｃＤＮＡの単離：ＨｅＬａ細胞から構築したλｇｔｌｌライブラリーを、低緊縮下でマウスｍｄｍ２ｃＤＮＡを用いてスクリーニングした。計１４個の陽性クローンが単離され、さらに分析するためにｃＤＮＡインサートをブルースクリプトベクター中にサブクローニングした。予備的な制限地図化と部分的な配列決定によって、それらはヒトｄｍ２ｃＤＮＡのクローンの一部であることが判明した（Ｆａｋｈａｒｚａｄｅｈ，Ｓ．Ｓ．ら、１９９１年、「マウス腫瘍細胞株中で増幅された遺伝子の亢進発現を伴う腫瘍形成潜在能」ＥＭＢＯＪ．１０：１５６５−１５６９）。完全長コード領域を二つの重複したｃＤＮＡクローンから構築し、配列決定した。ｈｄｍ２と呼ばれる、このｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列は、文献に記載のｈｄｍ２配列と類似のものであり（Ｏｌｉｎｅｒ，Ｊ．Ｄ．ら、１９９２年、「ヒトサルコーマにおけるｐ５３−関連タンパクをコードする遺伝子の増幅」、Ｎａｔｕｒｅ３５８：８０−８３）、コード領域においては完全に同一で非コード領域においては多少相違がある。これらの二つのｃＤＮＡクローンが二つの大きく異なる細胞源（ＨｅＬａ細胞と結腸カルチノーマ）から得られたにもかかわらず同等なコード配列を有しているという事実は、それらが野性型のｈｄｍ２コード配列を体現したものであるかあるいは異なる癌細胞中に系統的突然変異が或ることを示唆している。実施例２臨床的にも病理学的にもよく特徴が把握されている成人軟組織サルコーマ２１１例のコホートを分析した。７３名の患者からなる部分集団において腫瘍と正常検体が入手できた。分子レベルおよび生物学的観点からの考察をこの７３名の患者からなる群にもとづいておこなった。しかしながら、臨床病理との相関付けを行うにあたっては、免疫組織化学的手法を利用するとともに、メモリアル・スローアン−ケタリング・癌センターにおいて患者が得ることができ、頻繁にデータ更新がなされている臨床および病理学的情報データベースから得た２１１人の軟組織サルコーマ患者に関する情報を利用した。組織この実施例で用いられた軟組織サルコーマ（ＳＴＳ）に罹患した２１１人の成人患者のコホー卜中、腫瘍病巣の分析結果はリポサルコーマ７１例、平滑筋肉腫５３例、悪性繊維性組織球腫２２例、繊維肉腫１５例、末梢神経鞘腫瘍（ＰＮＳＴ）１５例、滑膜肉腫１３例、横紋筋肉腫４例、および未分化型肉腫１８例であった。分析したＳＴＳの多くは原発性腫瘍であり（１２９例）、残る病巣は再発性（３９例）あるいは転移性（４１例）であった。２例の分娩時胎位については不明である。分析した２１１例のＳＴＳにおいては、１６９例が進行したサルコーマに分類され、３９例の腫瘍が進行度の低い病変に分類された。３例の進行度については不明である。これらの患者からなるコンホー卜の追跡調査期間の中央値と平均値はそれぞれ２９カ月および３４カ月であった。完全な追跡調査データは２１１名の患者中２０９名から得ることができた。腫瘍試料は凍結保存液（ＯＣＴ化合物、マイルズ・ラボラトリーズ、エルクハート、インディアナ州）に包埋し、イソペンタン中で急速冷凍し−７０℃で保存した。各ブロックからヘマトキシリン−エオジンで染色された代表的部分をとり、顕微鏡下で観察して腫瘍の存在を確認するとともにこれらの病変部に存在する腫瘍細胞の割合（％）と腫瘍壊死の範囲を評価した。付近の腫瘍および正常組織試料を採集し、分子的遺伝子アッセイを２１１例中７３例に基づいて行った（下記参照）。これらの組織サンプルは外科的に摘出されたあと直ちに凍結し−７０ ℃で保存後、ＤＮＡを取り出した。モノクローナル抗体と免疫組織化学ｐ９０遺伝子でコードされた遺伝子産物に対するマウスモノクローナル抗体の一団を用いて本研究を行った。抗体４Ｂ２はアミノ末端領域に位置するエピトープを検出する。抗体２Ａ９と２Ａ１０はｐ９０の中央部の二つの異なるエピトープを同定する。抗体４Ｂ１１はｐ９０のカルボキシ末端領域に位置する配列を認識する。ｐ５３タンパク上の異なるエピトープを検出する三つのマウスモノクローナル抗体を本研究で使用した。抗ｐ５３抗体ＰＡｂ１８０１（Ａｂ−２、”ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ”、マンハセット、ニュウヨーク）は、野性型および突然変異型双方のヒトｐ５３タンパクのアミノ酸（ａａと略記）３２−７９の間に位置するエピトープを認識する（Ｂａｎｋｓ，Ｌ．ら、１９８６年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ１５９、５２９−５３４）。抗体ＰＡｂ２４０（Ａｂ−３、”ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ”）は、突然変異体ｐ５３産物のあるものの特徴となっている、ａａ１５６−３３５の間に位置するコンフォーメーションエピトープを認識する（Ｇａｎｎｏｎ，Ｊ．Ｖ．ら、１９９０年、ＥＭＢＯ．Ｊ．９、１５９５−１６０２）。抗体ＰＡｂ１６２０（ＡＢ−５、ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ）は野性型のｐ５３と特異的に反応する（Ｂａ１１，Ｒ．Ｋ．ら、１９８４年、ＥＭＢＯ．Ｊ．３、１４８５−１４９２）。抗ｐ９０及び抗ｐ５３抗体と同じサブクラスのマウスモノクローナル抗体である、ＭＩｇＳ−ＫｐＩを同様の稀釈率で陰性のコントロールとして使用した。冷メタノール−アセトン（１：１稀釈）で固定した５μｍの厚さの凍結組織片を用いてアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ法を行った。簡単に言えば、組織片を１５分間１０％の正常ウマ血清（ＯｒｇａｎｏｎＴｅｃｋｎｉｋａＣｏｒｐ．、ウエストチェスター、ぺンシルバニア州）でインキュベートし、次いで適切に稀釈した一次抗体（２Ａ９、４Ｂ２および４Ｂ１１を稀釈率１：１００で、２Ａ１０を稀釈率１：１０００で使用）（Ａｂ−２は２００ｎｇ／ｍｌ、Ａｂ −３は２５０ｎｇ／ｍｌ、Ａｂ−５は３μｇ／ｍｌ）で２時間インキュベートした。充分に洗浄したあと、組織片を２００倍稀釈したビオチン化ホースラディッシュ抗マウスＩｇＧ抗体（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア州）で３０分間、アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１：２５稀釈）で３０分間インキュベートした。ジアミノベンジディン（０．０６％ＤＡＢ）を最終色素原として、またヘモトキシリンを核の対比染色のために使用した。免疫組織化学的評価を少なくとも二人の別々の研究者によって行い、核染色を示した腫瘍細胞の概算パーセントを算出した。ｐ９０とｐ５３双方の核免疫反応性を次の三つのカテゴリーに分類した：陰性（＜２０％の腫瘍細胞が核染色を示す）、異生（２０−７９％の腫瘍細胞が核の反応性を示す）、および相同（＞／＝８０％の腫瘍細胞が強い核染色を示す）。サザンブロッティング法とＲＥＬＰ分析１．６ｋｂのヒトｄｍ２ｃＤＮＡ断片プロープであるｐＨＤＭ（ＥｃｏＲＩ）を用いて遺伝子増幅をサザンブロッティング法で評価した。ｂ−アクチンプロープである（ＥｃｏＲＩ）をコントロールとして用いた。二つのプローブを染色体１７の短腕の対立遺伝子欠失の解析のために用いた：ＰＹＮＺ２２（１７ｐ１３．３、Ｄ１７Ｓ５、ＴａｑＩ）およびｐｈｐ５３Ｂ（１７ｐ１３．１、ｐ５３、Ｂｇ１ＩＩ）。サザンブロッティング法による解析は文献記載に従った（Ｐｒｅｓｔｒｉ，Ｊ．Ｃ．ら、（１９９１）、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５１、５４０５；Ｄａ１ｂａｇｎｉ，Ｇら、（１９９３）、ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＭｏｌｅｃｕｌａｒＰａｔｈｏｌｏｇｙ２、４− １３）。簡単に言えば、ＤＮＡをＯｎｃｏｒ社によって開発された方法によって対にした正常及び腫瘍試料から非有機的に抽出し（Ｏｎｃｏｒ、ガイザーズバーグ、メリーランド州）、適切な制限酵素で分解し、０．７％アガロースゲル中で電気泳動を行い、ナイロン膜上にブロッティングした。膜は４２℃で１時間、ＨｙｂｒｉｓｏｌＩ（Ｏｎｃｏｒ社）で予備ハイブリダイズし、［Ｐ３２］ｄＣＴＰに高い特異活性ように標識したプローブで一夜ハイブリダイズした。膜を洗浄し、−７０℃で増感スクリーンを使用して放射線写真撮影した。ＵｌｔｒａｓｃａｎＸＬＬａｓｅｒＤｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）とＢｅｔａｓｃｏｐｅ６３０ＢｌｏｔＡｎａｌｙｚｅｒ（べターゲン社、ウオルサム、マサチューセッツ州）で濃度を測定し結果を確認した。少なくとも５コピー遺伝子／細胞であったときにｄｍ２増幅があったと考えた。異型性の喪失（ＬＯＨ）については、腫瘍試料中の対立遺伝子のシグナル強度が４０％を超えて低下したときに異型性が喪失したものと定義した（Ｐｒｅｓｔｒｉ，Ｊ．Ｃ．ら、（１９９１）、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５１、５４０５；Ｏｌｕｍｉ，Ａ．Ｆ．ら、（１９９０）、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５０、７０８１−７０８３）。一本鎖配座多形性（ＳＳＣＰ）分析およびＤＮＡ塩基配列決定これらについてはＯｒｉｔａら（Ｏｒｉｔａ，Ｍ．ら（１９８９年）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ５、８７４−８７９）によって報告された方法を僅かにかえて行った。増幅は上述の試料から抽出した１００ｎｇのゲノムＤＮＡを用いて行った。使用したプライマーはヒトｐ５３遺伝子のイントロン配列のフランキングエキソン５から９から得たものであり、この配列についてはすでに論文が発行されている（Ｍｏｌｌ，Ｕ．Ｍ．ら、（１９９２年）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８９、７２６２−７２６６）。ＤＮＡはＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）を用いてＰＣＲ（９４℃で３０秒、エキソン８と９に対して５８℃で３０秒、エキソン５、６、７に対しては６３ ℃で３０秒、そして最後にすべての試料に対して７２℃で６０秒）の３０サイクル後に増幅された。増幅された試料は変性され、１０％グリセロールを含有する非変性アクリルアミドゲル上に置き、室温で１２ −１６時間１０−１２ワットで処理した。ゲルは８０℃、真空下で乾燥し、ー７０℃で４−１６時間Ｘ線フィルムに曝した。配列決定アッセイにおけるゲノムＤＮＡの増幅はＳＳＣＰ分析において用いたものとは独立したものであり、３５サイクル（９４℃で６０秒、上記の条件で５８℃と６３℃で６０秒、さらに７２℃で９０秒）かけて増幅した。ＤＮＡ断片を２％の低融点アガロースゲルから単離し、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ら、（１９７７年）、ＰｒｏｃＮａｔ１ＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ７４、５４６３−５４６７）で精製・配列決定した。両方の鎖は、分析した各ＤＮＡについて配列決定するとともに、野性型のｐ５３を含有するコントロール試料から得たゲノムＤＮＡも突然変異を確認するために平行して配列決定した。ＤＭ２の増幅とＤＭ２タンパクの過剰生産ｄｍ２遺伝子の増幅を７３例の成人軟組織サルコーマ（ＳＴＳ）中の１１例で調べたところ、５倍から３５倍に増幅していた。ｄｍ２の増幅は、病気の進行度が低い場合（４例）より病気の進行度が高い場合（７例）においてより高頻度で検出された。転移性のＳＴＳ（１１例中３例、２７％）において原発性のＳＴＳ（４８例中４例、８％）におけるより増幅はより普通に観察された。抗ｄｍ２抗体の免疫染色のパターンはまず３Ｔ３−Ｂａｌｂｃと３Ｔ３−ＤＭ細胞を用いて評価した。ＤＭ細胞においては強い核染色が見られ、増幅ｄｍ２遺伝子を有しｄｍ２タンパクを過発現していることが報告されたが、一方Ｂａｌｂ −ｃ細胞は反応せず（図４）ｄｍ２タンパクレベルが低かった。１１例の増幅したケース中６例が、抗ｄｍ２抗体で核免疫反応性を示す腫瘍細胞が２０％を超えることを示した。しかしながら、残る５例では反応は見られなかった。６２例中、明らかに増幅されていないｄｍ２遺伝子を有する１７例において、組織片を用いてｄｍ２抗体で検出されたようにｄｍ２タンパクのレベルの上昇を示した（ｄｍ２陽性表現形）。ｐ５３欠失、点変異、およびｐ５３核免疫反応性体細胞および腫瘍ＤＮＡの７３個のぺアを、染色体１７の短腕に対する二つの異なったプローブを用いて調べた。調査した情報通知例５１例中２７例（５３％）で染色体１７の短腕の欠失が見いだされた。染色体１７ｐの異形性の喪失（ＬＯＨ）が進行度の高いサルコーマと進行度の低いサルコーマの両者で観察された。染色体１７ｐのＬＯＨは原発腫瘍（３３例中１３例、４１％）より転移腫瘍（８例中６例、７５％）においてより高頻度で見いだされた。ｐ５３が細胞内での過発現に関連していると思われることから、ｐ５３の具体的な遺伝子内突然変異をより特徴付けるために、７３例のＳＴＳをＳＳＣＰで（エキソン５から９）分析し、このアッセイで陽性であったものをＤＮＡ配列決定した。突然変異の存在が１４例で確認された。これら１４例のＳＴＳのうち１１例が抗体ＰＡｂ１８０１に対しｐ５３核免疫反応性を示した。点変異を１１例のサルコーマ中７例において、配列決定によって点変異が特徴付けられ、５例がＡＴからＧＣの変異を、２例がＧＣからＡＴへの変異を示した。４例において移動度の変化がＳＳＣＰによって検出されたが、突然変異を同定するための配列決定は行われなかった。突然変異の１４例中３例はＰＡｂ１８０１に対して陰性の免疫染色結果を示した。突然変異の内の１例は停止コドンを産生し、コドン１６５中において同定された。他の１例はコドン２７８でＣ欠失があり、３４４の位置で停止コドンを産生した。他の突然変異はスプライス供与位置に影響するエキソン５において起こった。一つを除いて、染色体１７ｐの状態に関する全ての情報提供突然変異体に随伴する短腕欠失が認められた。加えて、１３例が研究中のエキソンに対する点変異の証拠なしに陽性の核染色を示した。結局、分析した２１１例のＳＴＳ中５６例が陽性核免疫染色パターンをＰＡｂ１８０１に対して示した（表１）。ｐ５３陽性の表現形と腫瘍の進行度の間には大きな開きがあった。さらに、ＳＴＳに罹患している患者は、２０％を超える腫瘍細胞でｐ５３核免疫染色を示し、生存率が顕著に低かった。ＤＭ２とＰ５３の遺伝子型と表現型の変化：臨床病理学との関連７３例からなるサブグループ中のただ１例が増幅ｄｍ２とｐ５３遺伝子の突然変異体を示したが、これは転移繊維肉腫であった。しかしながら、コホー卜の全２１１例中２２例がｄｍ２とｐ５３の両方のタンパクに対して連続した組織片で陽性の核免疫反応性を示した（表１）。これらの分子の染色パターンは、それらが共発現した場合には、一般に異生であった。表現形の組み合わせ（グループＡ：ｄｍ２−／ｐ５３−；グループＢ：ｄｍ２−／ｐ５３−およびｄｍ２−／ｐ５３＋；グループＣ：ｄｍ２＋／ｐ５３＋）を臨床病理学的パラメーターと比較したところ、陽性表現形と予後不良の間に相関関係が認められた。データにより、グループＡが最も予後が良く、グループＣが最も予後不良であることが示された（図３参照）。実施例３ｐ９０の免疫沈降あるいはｐ９０とｐ５３の共免疫沈降のための抗体を調製するのにｐ９０を用いることができる。ｐ９０は沈降物から単離し、精製される。高ｐ９０抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよい。ｐ９０に対するポリクローナル抗体を調製する方法として以下のものがあげられる。ウサギにおけるｐ９０抗体の産生手続：ｐ９０タンパク断片は０．７ｍｇ／ｍｌの濃度で使用する。次のように免疫を行う：０日目：２００μｌのＰＢＳと２００μｌのＲＩＢＩ（アジュバンド）中２５ μｇ、７日目：２００μｌのＰＢＳと２００μｌのＲＩＢＩ（アジュバンド）中５０ μｇ、１４日目：２００μｌのＰＢＳと２００μｌのＲＩＢＩ（アジュバンド）中５０ μｇ、２１日目：休止２８日目：２００μｌのＰＢＳと２００μｌのＲＩＢＩ中５０μｇ３９日目：採血 − アッセイ５２日目：２００μｌのＰＢＳと２００μｌのＲＩＢＩに５０μｇを加え動物に投与、５９日目：採血 − 最終注入後７日後におけるアッセイ６２日目：放血死ＥＬＩＳＡ法を適用し、４℃でウェルを一夜コーティング（２００ｎｇ／ウェル）してアッセイを行った。３７℃で１時間２％ＢＳＡでブロックする。１％ＢＳＡ中に血清を加え稀釈し、３７℃で２時間インキュベートする。１％ＢＳＡで調製した第二抗体稀釈液（ＴＡＧＯヤギ抗ウサギペロキシダーゼ−ｃａｔ＃６４３０）では３７℃で１時間インキュベートする。血清抗体価は最初のアッセイで１：２５０００（カットオフ吸光度：４５０ｎｍで０．４００）、最終アッセイで＞５００００。Ｋｉｒｋｅｇａｒｒｄ＆ＰｅｒｒｙＴＭＢぺロキシダーゼ基質溶液で展開し、４５０ｎｍでの吸光度を読み取る。実施例４ＡＴＣＣ（前述）に寄託されたハイブリドーマ、１Ｆ５、６Ｃ１０、１Ｄ６、４Ｂ２、２Ｅ１２、３Ｆ３、３Ｇ５、３Ｆ８、６Ｈ７、２Ａ９、３Ｇ９、１Ｄ１１、２Ａ１０、１Ｇ２、４Ｂ１１および５Ｂ１０はｐ９０タンパクのエピトープに対するモノクローナル抗体を産生する（図１参照）。以下に記載のプロトコールは、これらのモノクローナル抗体と他の抗ｐ９０抗体を一時抗体として用いて、ＤＭ２遺伝子コード産物であるｐ９０タンパクを組織中、好ましくはヒト組織中で免疫組織化学的方法によって検出するものである。アビジン−ビオチン免疫パーオキシダーゼ法は、感度が高いため適切な手法である。ヒトの正常および腫瘍組織切片をクリオスタットで切り出し、マイクロスライドに載置する。これらの切片を阻止血清で、次いで過酸化水素およびアビジン−ビオチンプロック剤でインキュベートする。第一抗体、即ち抗ｐ９０抗体を適切な濃度で使用する。この適切な濃度は、各抗体について滴定を行うことによって経験的に決定される。次に、切片をビオチン化第二ウマ抗マウス抗体、次いでアビジン−ビオチンパーオキシダーゼ複合体でインキュベートする。ジアミノベンジディンを用いて最終反応を行う。切片をへマトキシリンで対比染色し、載物台に載せて最終分析する。上記の免疫組織化学方法においては、典型的にはｐ９０タンパクのみが正常レベルからはずれた上昇値で組織において検出されるが、この理由は上記の例で試験した組織について、モノクローナル抗体は細胞中のｐ９０の上昇のみを検出できるからである。免疫組織化学的アビジン−ビオチン−パーオキシダーゼ法パラフィン埋め込み切片１）ポリ−Ｌ−リジンで被覆したスライド上に５μｍの組織切片を置く。２）切片を６０Ｃのオーブンに３０分入れてパラフィンを溶かす。３）スライドを室温まで冷却し、脱パラフィンおよび再水化のための処理を行う。キシレン−３回（各回５分）１００％エタノール−３回（各回３分）９５％エタノール−３回（各回３分）４）蒸留水中で洗浄し、ＰＢＳに移す。５）１％のＨ₂Ｏ₂を用いて１５分間冷却し、内因性のパーオキシダーゼ活性を除去する。６）ＰＢＳ中で洗浄（３回）。７）内因性のパーオキシダーゼ活性を除去するために、肝臓、膵臓、脳等のビオチンを含有する細胞中に、アビジン−ビオチン阻止キット（Ｖｅｃｔｏｒ）を適用する。溶液は順番に用い（アビジンの後でビオチン）、スライドは各溶液を用いて１５分インキュベー卜すること。８）ＰＢＳ中で洗浄する。９）酵素分解−酵素の選択は、各抗体に対して最適になるように経験的に行う。共通の酵素：ぺプシン（ブタの胃の粘膜，Ｓｉｇｍａ）：ＨＣＬ溶液（２５０ｍｌの蒸留水に２００μｌのＨＣｌを加えたもの）に０．２５グラムのぺプシンを加え、３０分インキュベートする。トリプシン（ウシの膵臓タイプＩ，Ｓｉｇｍａ）：２５０ｍｌのＴＲＩＳに０．０６２５グラムのトリプシンを加え、５分間インキュベートする。蒸留水中で洗浄し、トリプシン阻止剤（Ｓｉｇｍａ）（２５０ｍｌのＰＢＳと０．０２５グラムのトリプシン阻止剤との混合液）を用いて１５分間インキュベートする。プロナーゼ（カルビオケム・ベーリング）：２５０ｍｌのＴＲＩＳに０．００５５グラムのプロナーゼを加え、４分間インキュベートする。フィシン（懸濁液、Ｓｉｇｍａ）：そのまま使用可能。滴下し、４５分インキュベートする。サポニン（洗剤、Ｓｉｇｍａ）：２５０ｍｌの蒸留水の混合液に０．１２５グラムのサポニンを加え、３０分間インキュベートする。１０）スライドを蒸留水中で洗浄し、ＰＢＳに移す。１１）阻止血清−１０％の通常血清（特定の種−第２抗体と同じ）を加え、２０〜３０分間インキュベート。１２）阻止血清を真空で吸い上げ除去し、適切な希釈した第１抗体を加え、加湿チャンバー内で４℃で一晩インキュベートする。第１抗体は、１Ｆ５、６Ｃ１０、１Ｄ６、４Ｂ２、２Ｅ１２、３Ｆ３、３Ｇ５、３Ｆ８、６Ｈ７、２Ａ９、３Ｇ９、１Ｄ１１、２Ａ１０、１Ｇ２、４Ｂ１１、および５Ｂ１０のハイブリドーマによって生産される抗ｐ９０モノクローナル抗体から選択する。第１抗体は最適な濃度となるように経験的に適宜希釈する。１３）ＰＢＳを用いて丁寧に洗浄する。ＰＢＳを３回交換（各回５分）１４）適切に希釈されたビオチン化第２抗体を加え、３０分間インキュベートする。１５）ＰＢＳを用いて洗浄（各５分で３回）。１６）１：２５（Ａ：Ｂは等割合）希釈のアビジン−ビオチン複合体（Ｖｅｃｔｏｒ）を３０分間インキュベートする。１７）ＰＢＳを用いて洗浄（各５分で３回）１８）色原体基質溶液：パーオシキダーゼージアミノベンザディン（０．０６％ＤＡＢ）（５ｍｇ／ＤＡＢ／１００ｍｌのＰＢＳに１００ｕｌの０．３％Ｈ₂Ｏ₂ ）。望ましい色強さになるまでインキュベートする（約５分）。１９）へマトキシリンを用いて対比染色を行なう。免疫組織化学的アビジン−ビオチン−パーオキシダーゼ法冷凍組織切片１）５μｍの冷凍組織切片を室温中に３０分間置いて切片を解凍し、乾燥する。２）適切な固定液を１０分間加える（各抗体に最適な固定液を選択）。３）１％のＨ₂Ｏ₂を用いて１５分間冷却し、内因性のパーオキシダーゼ活性を除去する。４）ＰＢＳ中で洗浄（３回）。５）内因性のパーオキシダーゼ活性を除去するために、内在性ビオチンに富む細胞中に、アビジン−ビオチン阻止キットを加える。アビジン１５分インキュベートし、ＰＢＳを用いて洗浄し、そしてビオチンを用いて１５分インキュベートする。６）ＰＢＳ中で洗浄する（３回）。７）阻止血清−１０％の通常血清（特定の種−第２抗体と同じ）を加え、加湿チャンバー内で１０〜３０分間インキュベートする。８）阻止血清を真空で吸い上げ除去し、適切な希釈した第１抗体を加えて１〜２時間インキュベートする。第１抗体は、１Ｆ５、６Ｃ１０、１Ｄ６、４Ｂ２、２Ｅ１２、３Ｆ３、３Ｇ５、３Ｆ８、６Ｈ７、２Ａ９、３Ｇ９、１Ｄ１１、２Ａ１０、１Ｇ２、４Ｂ１１，，および５Ｂ１０のハイブリドーマによって生産される抗ｐ９０モノクローナル抗体から選択する。第１抗体は最適な濃度となるように経験的に適宜希釈するが、典型的には、ハイブリドーマの上澄みとリン酸緩衝血清（ＰＢＳ）との容量比で１〜１０００である。９）ＰＢＳを用いて丁寧に洗浄。１０）適切に希釈されたビオチン化第２抗体を加え、３０分間インキュベートする。１１）ＰＢＳを用いて洗浄（３回）１２）１：２５希釈（Ａ：Ｂは等割合）のアビジン−ビオチン複合体（Ｖｅｃｔｏｒ）を３０分間インキュベートする。１３）ＰＢＳとＰＢＳ／Ｔｒｉｔｏｎを用いて洗浄（３回）。１４）色原体基質溶液：パーオシキダーゼ−ジアミノベンザディン（０．０６％ＤＡＢ）で約５分間。１５）へマトキシリンを用いて対比染色を行う。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/574 Ａ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／０６０６３ (32)優先日 1993年６月25日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＫＲ，ＵＳ (72)発明者レビン，アーノルド，ジェー. アメリカ合衆国 08540 ニュージャージー州，プリンストン，フリッツランドルフロード 138 (72)発明者フィンレー，キャシー，エー. アメリカ合衆国 19067 ペンシルバニア州，ヤードリー，ベイベリーレーン 660 (72)発明者コードン−カード，カルロスアメリカ合衆国 10021 ニューヨーク州, ニューヨーク，イースト 63 ストリート 504，エーピーティ 24アール

Claims

【特許請求の範囲】１．生物学的試料におけるｐ５３とｄｍ２のレベルを測定し、ｐ５３とｄｍ２の内の何れか一方またはｐ５３とｄｍ２の両方のレベルの上昇により癌であると診断する癌診断方法。２．生物学的試料におけるｐ５３とｄｍ２のレベルを測定し、ｐ５３とｄｍ２の内の何れか一方またはｐ５３とｄｍ２の両方のレベルの上昇により予後が悪いと判断する癌の進行を予測する方法。３．生物学的試料を３グループに分類する方法であって、試料中のｐ５３またはｄｍ２のレベルが異常に上昇したか否かを測定すことを含んでおり、第１グループはｐ５３およびｄｍ２のレベルは何れも異常に上昇していない場合を含み、第２グループはｐ５３のレベルは異常に上昇しているがｄｍ２のレベルは異常に上昇していないか、ｄｍ２のレベルは異常に上昇しているがｐ５３のレベルは異常に上昇していない場合を含み、第３グループはｐ５３とｄｍ２の両方のレベルが異常に上昇している場合を含む方法。４．対象物から生物学的試料を得てこの試料が属するグループを請求項３に記載の方法を用いて決定し、グループが第３グループである場合に予後が最もを悪くなるとする対象物の予後の評価方法。５．対象物から生物学的試料を得てこの試料が属するグループを請求項３に記載の方法を用いて決定し、グループが第１グループである場合に予後が最も良いとする対象物の予後の評価方法。６．プローブを用いてｄｍ２遺伝子の増殖または発現のレベルを測定する請求項３に記載の方法。７．プローブが抗体である請求項６に記載の方法。８．抗体がモノクローナル抗体である請求項７に記載の方法。９．抗体が請求項１４〜１８から成る群から選択されるものである請求項８に記載の方法。１０．トキシンに結合された請求項２７、２８、２９、３０または３１のモノクローナル抗体。１１．請求項１０の抗体を腫瘍に接触させることにより抗体を腫瘍に結合させる腫瘍を持つ患者の治療方法。１２．検出可能なマーカによって標識が付けられた請求項２７、２８、２９、３０または３１のモノクローナル抗体。１３．請求項１２の抗ｄｍ２抗体が映像化すべき腫瘍と結合するような条件下でその抗体を腫瘍に接触させ、結合した抗体を検出することによって腫瘍を映像化する腫瘍の映像化方法。１４．癌細胞、または癌性または前癌性になる危険性のある細胞であって、少なくとも１個の正常なｐ５３対立遺伝子を含む細胞が生物学的試料の中にあるかどうかを検出する方法であって、生物学的試料中におけるｄｍ２のレベルがｄｍ２発現のレベルに比較して異常に上昇したか否かを検出することを含み、生物学的試料中におけるｄｍ２のレベルが異常に上昇したことによって癌細胞、または癌性または前癌性になる危険性のある細胞であると判断する方法。１５．レベルの上昇を生物学的試料の免疫組織化学的な染色パターンによって決定する請求項１４に記載の方法。１６．ｄｍ２遺伝子の増殖または発現のレベルをプローブを用いて決定する請求項１４に記載の方法。１７．プローブが核酸プローブである請求項１６に記載の方法。１８．プローブが抗体である請求項１６に記載の方法。１９．抗体がモノクローナル抗体である請求項１８に記載の方法。２０．ｐ５３／ｄｍ２複合体２１．モノクローナル抗体か、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８２として寄託されたハイブリドーマ３Ｇ５によって生産されるものである請求項１９に記載の方法。２２．モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８３として寄託されたハイブリドーマ４Ｂ１１によって生産されるものである請求項１９に記載の方法。２３．モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８４として寄託されたハイブリドーマ２Ａ１０によって生産されるものである請求項１９に記載の方法。２４．モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８５として寄託されたハイブリドーマ２Ａ９によって生産されるものである請求項１９に記載の方法。２５．モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８６として寄託されたハイブリドーマ４Ｂ２によって生産されるものである請求項１９に記載の方法。２６．モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８２として寄託されたハイブリドーマ３Ｇ５、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８３として寄託されたハイプリドーマ４Ｂ１ＬＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８４として寄託されたハイブリドーマ２Ａ１０、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８５として寄託されたハイブリドーマ２Ａ９、およびＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８６として寄託されたハイブリドーマ４Ｂ２を含む群から選択されたハイブリドーマによって生産されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープと同じエピトープを認識するものである請求項１９に記載の方法。２７．モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８２として寄託されたハイブリドーマ３Ｇ５、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８３として寄託されたハイブリドーマ４Ｂ１１、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８４として寄託されたハイブリドーマ２Ａ１０、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８５として寄託されたハイブリドーマ２Ａ９、およびＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８６として寄託されたハイブリドーマ４Ｂ２を含む群から選択されたハイブリドーマによって生産されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープと同じエピトープと競合するものである請求項１９に記載の方法。２８．競合モノクローナル抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８２として寄託されたハイプリドーマ３Ｇ５、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８３として寄託されたハイブリドーマ４Ｂ１１、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８４として寄託されたハイプリドーマ２Ａ１０、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８５として寄託されたハイプリドーマ２Ａ９、およびＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８６として寄託されたハイブリドーマ４Ｂ２を含む群から選択されたハイブリドーマによって生産されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープと同じエピトープの５０〜１００％の範囲で阻止するものである請求項２７に記載の方法。２９．ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８２として寄託されたハイブリドーマ３Ｇ５によって生産されるモノクローナル抗体。３０．ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８３として寄託されたハイブリドーマ４Ｂ１１によって生産されるモノクローナル抗体。３１．ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８４として寄託されたハイブリドーマ２Ａ１０によって生産されるモノクローナル抗体。３２．ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８５として寄託されたハイブリドーマ２Ａ９によって生産されるモノクローナル抗体。３３．ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８６として寄託されたハイブリドーマ４Ｂ２によって生産されるモノクローナル抗体。３４．ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８２として寄託されたハイブリドーマ３Ｇ５、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８３として寄託されたハイブリドーマ４ＢＩＬＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８４として寄託されたハイブリドーマ２Ａ１０、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８５として寄託されたハイブリドーマ２Ａ９、およびＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８６として寄託されたハイブリドーマ４Ｂ２を含む群から選択されたハイブリドーマによって生産されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープと同じエピトープを認識するモノクローナル抗体。３５．ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８２として寄託されたハイブリドーマ３Ｇ５、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８３として寄託されたハイブリドーマ４Ｂ１１、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８４として寄託されたハイブリドーマ２Ａ１０、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８５として寄託されたハイブリドーマ２Ａ９、およびＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８６として寄託されたハイブリドーマ４Ｂ２を含む群から選択されたハイブリドーマによって生産されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープと同じエピトープと競合するモノクローナル抗体。３６．ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８２として寄託されたハイプリドーマ３Ｇ５、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８３として寄託されたハイブリドーマ４Ｂ１１、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８４として寄託されたハイブリドーマ２Ａ１０、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８５として寄託されたハイブリドーマ２Ａ９、およびＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８６として寄託されたハイブリドーマ４Ｂ２を含む群から選択されたハイブリドーマによって生産されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープと同じエピトープを５０〜１００％の範囲で阻止する請求項３５に記載のモノクローナル抗体。３７．ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８２として寄託されたハイブリドーマ３Ｇ５、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８３として寄託されたハイプリドーマ４ＢＩＬ、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢｌ１１８４として寄託されたハイブリドーマ２Ａ１０、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８５として寄託されたハイブリドーマ２Ａ９、およびＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８６として寄託されたハイブリドーマ４Ｂ２を含む群から選択されるハイブリドーマ。３８．請求項２９〜３３のモノクローナル抗体の群から選択されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープ。３９．請求項３１のモノクローナル抗体によって認識されるエピトープ。４０．（ａ）ｐ５３タンパク質を認識する抗ｐ５３抗体を含む容器と、（ｂ）ｄｍ２タンパク質を認識する抗ｄｍ２抗体を含む容器とを含有する診断キット。４１．抗体に標識が付けられている請求項４０の診断キット。４２．（ａ）抗ｐ５３抗体を認識する標識化抗体と、（ｂ）抗ｄｍ２抗体を認識する標識化抗体とをさらに含有する請求項４０の診断キット。