JPH08507927A

JPH08507927A - Ａｐｃ遺伝子の変異決定用抗体およびアッセイ

Info

Publication number: JPH08507927A
Application number: JP6521279A
Authority: JP
Inventors: ヒル，デヴィッド・イー; ジョンソン，カレン・エイ; キンズラー，ケネス・ダブリュー; ヴォーゲルスタイン，バート
Original assignee: Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University
Priority date: 1993-03-19
Filing date: 1994-03-21
Publication date: 1996-08-27
Also published as: WO1994021814A1; EP0689606A1; US5910418A; CA2158429A1

Abstract

(57)【要約】家系性のポリプ状腺腫におけるＡＰＣ遺伝子に生じる多くの変異を検出するために有用な抗体及び該抗体を用いたアッセイを開示する。これらの抗体は所定タンパク質のアミノ末端もしくはカルボキシル末端のエピトープに特異的である。多くのイムノアッセイ方法が記載されているが、これらは全て、家系性のポリプ状腺腫及び散発性結腸カルシノーマにおける多くのＡＰＣ変異は、短縮型ＡＰＣタンパク質をもたらすという観察に基づくものである。一般に、ＡＰＣタンパク質の大きさを測定するかまたは、カルボキシ末端−結合性抗体に対するアミノ末端−結合性抗体の相対結合性を測定する。

Description

【発明の詳細な説明】ＡＰＣ遺伝子の変異決定用抗体およびアッセイ発明の属する技術分野本発明は、医療診断、特に、癌になる遺伝的素質の診断に関する。従来の技術家族性腺腫ポリポーシス（ＦａｍｉｌｉａｌＡｄｅｎｏｍａｔｏｕｓＰｏｌｙｐｏｓｉｓ）（ＦＡＰ）は、数百ないし数千個の良性の結腸腫瘍（腺腫）を発生させる常染色体の慢性疾患である。これらの腫瘍の幾つかは、取り除かなければ、必ず悪性（癌）に進行する。最近、染色体５ｑ２１から腫瘍サプレッサーになる遺伝子の候補として、腺腫ポリポーシスコリ（ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓｐｏｌｙｐｏｓｉｓｃｏｌｉ）（ＡＰＣ）が分離され、これはＦＡＰの進行に関係していた（Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：６６１ −６６５，１９９１）；Ｎｉｓｈｉｓｈｏ，Ｉ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：６６５−６６９，１９９１；Ｇｒｏｄｅｎ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ，５８９−６００，１９９１；Ｊｏｓｌｙｎ，Ｇ．ら、Ｃｅｌｌ，６６：６０１−６１３，１９９１）。さらに、１５０の同族のＡＰＣ遺伝子を分析したところ、ＡＰＣの変異が、ＦＡＰ患者のすべてではないにしろ、そのほとんどの原因であることが分かった（Ｍｉｙｏｓｈｉ，Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：４４５２−４４５６，１９９２）。しかしながら、ＦＡＰ患者の癌は、すべての結腸癌の１％以下と思われる。大多数の結腸癌は、遺伝的根拠が十分には認められず、それ故、散発性として分類されている。最近の研究では、これらの散発性腫瘍の大多数に、ＡＰＣ遺伝子の体細胞変異が認められることが示された（Ｍｉｙｏｓｈｉ，Ｙ．ら、ＨｕｍａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，１：２２９−２３３，１９９２；Ｐｏｗｅｌｌ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，１７：２３５−２３７，１９９２）。さらに、これらの変異は、結腸腫瘍形成の初期に起こると思われ、直径０．５ｃｍ程に小さな腫瘍内に検出された（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｓ．Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，１７：２３５−２３７，１９９２）。散発性腫瘍およびＦＡＰ患者において見つかった変異の性質は驚くべきもので、変異の９４％以上がＡＰＣ遺伝子生成物の端が切り取られた形になると予想された。合わせて考察すると、上述の研究から、ＡＰＣは、結腸新生物形成の主要な態様の進行に際して、初期的且つ重要な役割を果たしていることが示唆される。ＡＰＣ遺伝子は、８，５３８ｂｐのオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ）（ＯＲＦ）を含み、他のタンパク質とはほとんど相同性を持たない２，８４３のアミノ酸からなるポリペプチドをコードすると予想される（Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５３：６６１− ６６５，１９９１；Ｇｒｏｄｅｎ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ６６：５８９−６００，１９９１）。ＡＰＣコード領域のサイズは大きいため、患者の中の変異を同定するには、集中的労力と費用を要する。それ故、この技術分野では、変異体ＡＰＣアレレ（対立遺伝子）を持つ患者を同定するためのより迅速な費用のかからない方法が要望されている。発明の概要本発明の目的は、全長の、および端が切り取られた形のヒトＡＰＣタンパク質を検出できる抗体を提供することである。本発明の他の目的は、全長の、端が切り取られていない形のヒトＡＰＣタンパク質を検出できる抗体を提供することである。本発明の他の目的は、組織内に生成されたＡＰＣタンパク質のサイズを決定することによって、ヒトＡＰＣ遺伝子に変異体が存在するか否かを決定するための方法を提供することである。本発明の他の目的は、ＡＰＣタンパク質の異なる部分に結合する二種類の抗体結合量を比較することによって、体サンプル内のＡＰＣ変異の存在の有無を決定するための免疫組織化学的方法を提供することである。本発明の他の目的は、ＡＰＣ変異の存在の有無を決定するための酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ）を提供することである。本発明の目的は、ＡＰＣタンパク質の異なる部分に結合する二種類の抗体の結合量を比較することによって、体サンプル内のＡＰＣ変異の存在の有無を決定するための酵素結合イムノソルベントアッセイ法を提供することである。本発明の他の目的は、ＡＰＣタンパク質の一つの抗体への反応性が失われたことを見つけ出すことによって、ＡＰＣ変異の存在を決定するための方法を提供することである。本発明の目的は、酵素結合イムノソルベントアッセイを行うにあたって用いられる固体支持体を提供することである。本発明の他の目的は、ＡＰＣタンパク質のアッセイに有用な抗体を生成するハイブリドーマ細胞を提供することである。本発明のこれらのおよびその他の目的は、以下に記載される一つあるいはそれ以上の実施態様によって規定される。本発明の一つの実施態様では、ＡＰＣのアミノ末端の１１０３アミノ酸に含まれるエピトープと特異的に免疫反応する抗体の調製法を提供する。本発明の他の実施態様では、ＡＰＣのカルボキシ末端の３０６アミノ酸に含まれるエピトープと特異的に免疫反応する抗体の調製法を提供する。本発明の他の実施態様では、ヒトＡＰＣ遺伝子の変異の存在の有無を決定するための方法が提供される。その方法は以下の段階からなる：ヒトの体サンプルからタンパク質を抽出し；該抽出夕ンパク質をポリアクリルアミドゲルで分離し；該分離タンパク質をフィルター上にブロットし；該フィルター上にブロットしたタンパク質に下記抗体を結合させるために、ＡＰＣタンパク質と特異的に免疫反応する抗体に、該フィルターを接触させ；該タンパク質に結合する該抗体の位置を決定し；該抗体と結合したタンパク質のサイズを定量し、３００ｋＤａより小さいサイズであれば組織サンプルにＡＰＣ変異が存在することが示唆される。本発明の他の実施態様では、ヒトのＡＰＣ変異の存在決定法が提供される。その方法は次のようである：組織の第一のサンプルまたは体液を、ＡＰＣのアミノ末端、１１０３アミノ酸内に含まれるエピトープと特異的に免疫反応する第一の抗体と接触させ；該第一の組織サンプルまたは体液との第一抗体の結合量を定量し；第二の組織サンプルまたは体液を、ＡＰＣのカルボキシ末端、３０６アミノ酸内に含まれるエピトープと特異的に免疫反応する第二の抗体と接触させ；該第二の組織または体液との第二抗体の結合量を定量し；定量した該第一抗体の結合量と、定量した該第二抗体の結合量とを比較し、こうして、第二抗体より第一抗体とより多く結合する組織または体液が見つかると、そのヒトにＡＰＣ変異が存在することが示唆される。本発明の他の実施態様では、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ）が、ＡＰＣ変異の存在を決定するために提供される。その方法は、ＡＰＣのアミノ末端の１１０３アミノ酸、またはＡＰＣのカルボキシ末端の３０６アミノ酸に含まれる、第一のエピトープと特異的に免疫反応する第一の抗体で、固体支持体をコーティングし；コーティングした固体支持体を、体液または組織の溶解物からなる試験サンプルのアリコートと接触させて、該第一抗体で該アリコートの成分を該固体支持体に結合し；該試験サンプルの固体支持体結合成分を、ＡＰＣの第二のエピトープと特異的に免疫反応する第二の抗体と接触させ、該成分および該第一抗体で該第二抗体を該固体支持体に結合し；該固体支持体に結合する第二の抗体量を定量する：段階からなる。別法として、第一抗体を使用せずに、体液又は組織溶解物からなる試験サンプルを直接固体支持体に結合させてもよい。本発明の他の実施態様では、ヒトのＡＰＣ変異の存在の有無を決定する方法が提供される。この方法は、第一の組織サンプルを、ＡＰＣのカルボキシ末端の３０６アミノ酸（配列番号：２を参照のこと）に含まれるエピトープと特異的に免疫反応する抗体と接触させ；該第一の組織サンプルへの該抗体の結合量を定量する：段階からなり、ここで、抗体と結合しない組織は、ヒトのＡＰＣ変異を示唆している。本発明の他の実施態様では、先端の切り取られた形のＡＰＣを検出する方法が提供される。この方法は、ヒト細胞の試験サンプルを溶解し；該細胞を可溶性画分と粒子画分に分画し；該可溶性画分を、ＡＰＣのアミノ末端の１１０３アミノ酸（配列番号：２を参照されたい）に含まれるエピトープと特異的に免疫反応する抗体と接触させ；該可溶性画分と結合する全ての抗体を検出する：段階からなり、この可溶性画分と結合する抗体が存在すると、該細胞内に先端の切り取られた形のＡＰＣが存在することを示唆している。本発明の他の実施態様では、ＡＰＣのアミノ末端の１１０３アミノ酸に含まれるエピトープ、またはＡＰＣのカルボキシ末端の３０６アミノ酸に含まれるエピトープと特異的に免疫反応する抗体を分泌する、ハイブリドーマ細胞が提供される。本発明のこれらのおよびその他の実施態様は、最近行われている遺伝子技術によるよりも、より安価でより煩雑でないＡＰＣ変異の検出手段を提供する。図面の簡単な説明図１は、ウエスタンブロット分析によるＡＰＣタンパク質の検出について示している。全タンパク質溶解物（１００μｇ）を、ポリクローナル抗ＮＡＰＣ（図ＩＡ）、ポリクローナル抗ＭＡＰＣ（図１Ｂ）またはモノクローナルＦＥ９（図１Ｃ）のいずれかとウエスタンブロットを行うことによってアッセイした。タンパク質溶解物は、ＡＰＣの１３３８にストップコドンを含む結腸癌ＳＷ４８０系（列１）、およびコドン１０６１、１１７５、１２１１、または１３０９のそれぞれに、先端を切り取られた既知のＡＰＣ変異をもつ４種類の異なるＦＡＰリンパ芽球細胞系（列２−５）から作成した。全長のタンパク質を“ＦＬ”、先端を切り取られた変異体のタンパク質を“ＭＴ”で示している。図２は、ウエスタンブロット分析による腫瘍細胞系のＡＰＣタンパク質の検出を示している。全タンパク質溶解物（１００μｇ）は、モノクローナルＦＥ９を用いてウエスタンブロットによってアッセイした。結腸癌１例（Ｃ１）、結腸腺腫３例（Ｃ２からＣ４）、前立腺癌４例（列Ｐ１からＰ４）、膵臓癌４例（列Ａ１からＡ４）を示している。全長のタンパク質は、“ＦＬ”、変異体の先端の切り取られたタンパク質は“ＭＴ”で表した。先端を切り取られたタンパク質は、標準分子量マーカーと比較して、（左から右へ）１００、１３０、１００および１３５ｋＤａのポリペプチドの位置に移動している。図３は、正常および変異体ＡＰＣタンパク質の細胞成分分画について示している。細胞系を分画し、各画分は、ポリクローナル抗ＡＰＣ抗体を用いたウエスタンブロットによって分析した。図３Ａは、ＳＷ４８０細胞から得られた結果を示し、図３Ｂは、ＡＰＣのコドン１３０９で先端を切り取られた変異を含むヘテロ接合性をもつ患者からのリンパ芽球腫細胞系から得られた結果を示す。両パネル共同じ量で、全タンパク質溶解物（列１）、１００，０００Ｘｇの不溶性“細胞膜画分”（列２）、“核画分”（列３）および“細胞質画分”（列４）を負荷した。全長のタンパク質は“ＦＬ”、変異体の先端を切り取られたタンパク質は“ ＭＴ”と示した。図４は、アフィニティー精製したポリクローナル抗ＮＡＰＣ抗体を用いた正常な結腸粘膜の免疫組織化学を写真で捕らえている。ポリクローナル抗ＮＡＰＣ抗体での染色パターン（図４Ａは低倍率、図４Ｂは中程度の倍率）は、正常なウサギ免疫グロブリン（図４Ｄは低倍率、図４Ｅは中程度の倍率）の３倍の高濃度でも認められない。このシグナルはＧＳＴ−ＮＡＰＣ（図４Ｆ、中程度の倍率）と事実上競合したが、３倍高濃度のＧＳＴ−ＭＤＭ２（図４Ｃ、中程度倍率）とは競合しなかった。発明の詳細な説明本発明者らは、数多くのＡＰＣ遺伝子の変異体の存在を、免疫学的方法を用いてヒト組織中に同定できることを見出だした。変異体の９０％より多くが、先端切除ＡＰＣタンパク質を生じると予期されることが、ＦＡＰ患者の白血球のＤＮＡ分析を用いた研究から示された（Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８９：４４５２，１９９２）。原発性、散発性の結腸腫瘍に関するその他の研究では、少なくとも６０％の結腸腫瘍が先端切除のＡＰＣ変異を含んでいることが、示されている（Ｍｉｙｏｓｈｉら、ＨｕｍａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，１：２２９−２３３，１９９２；Ｐｏｗｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ，１７：２３５−２３７，１９９２）。これらの変異は、停止コドンを生成するポイントミューテーション、ならびに変異から直ぐ下流に停止コドンを作り出すようなフレームシフトを生成する欠損および挿入が含まれる。本発明にしたがって、ＡＰＣのアミノ末端の１１０３アミノ酸に含まれるエピトープと特異的に免疫反応する抗体は、先端切除ＡＰＣタンパク質を検出し、ＡＰＣ遺伝子の遺伝性および体細胞性の両変異の大多数を検出するために用いることができる。ＡＰＣタンパク質の一部を他のタンパク質のカルボキシ末端またはその一部と融合することからなる融合タンパク質を作ることができ、実際に作られている。これらの融合タンパク質は、タンパク質コード領域の融合した遺伝子の発現によって得られる。任意の他のタンパク質をＡＰＣとの融合に用いることができる。通常、他のタンパク質は、幾つかの望ましい性質で選択される。例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が用いられるが、その理由は融合タンパク質がアミロースカラムを用いて容易に精製されるためである。また、細菌遺伝子ｔｒｐＥも用いるのに好都合であり、その理由はトリプトファン飢餓によって誘導されうるからである。ＡＰＣタンパク質の部分は、所望するように、他のタンパク質へ融合させるために選択することができる。典型的には、約１００−５００のアミノ酸残基からなるＡＰＣタンパク質の大フラグメントが選択される。本発明の望ましい実施態様では、アミノ末端セグメントおよび所望によりカルボキシ末端セグメントが選択される。例えば、本発明の特別の実施態様では、ＡＰＣアミノ酸１−２２０を含む融合タンパク質が用いられる。他の実施態様では、ＡＰＣアミノ酸２５３７ −２８４３（カルボキシ末端３０６アミノ酸）からなるペプチドが用いられる。本発明の他の実施態様では、ＡＰＣのアミノ酸２２１−１１０３からなるペプチドが用いられる。融合タンパク質は、選択したフラグメント内に含まれるエピトープと特異的に免疫反応する抗体を得るために、動物を免疫するために用いることができる。免疫化動物の抗血清を収集し、随意にアフィニティー精製することができる。動物を免疫するために使用された融合タンパク質、または、望ましくはＡＰＣタンパク質の同部分を持つがアミノ末端タンパク質が異なる融合タンパク質のどちらかをアフィニティー試薬として用いるのが望ましい。ポリクローナル抗体のアフィニティー精製は、この技術分野で熟知されており、日常的な実験方法を用いて行うことができる。融合タンパク質は、本発明の抗体を作り出すために用いることの出来る唯一の免疫原ではない。ＡＰＣタンパク質のアミノ酸配列を含む、合成、組換え、または自然生成のペプチドを単独で、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）のような他のタンパク質と結合して用い、十分な免疫応答を作り出すことができる。免疫応答を強める免疫原を投与するためのその他の手段には、この技術分野で既知のものが用いられるであろう。また、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの方法に従って、免疫化動物の脾臓細胞を骨髄腫細胞に融合させ、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を作り出しても良い。ハイブリドーマ細胞は、本来の免疫原、または、ＡＰＣタンパク質の同一あるいはオーバーラップした部分を含むその他の形の免疫原を用い、適切な抗体の生成するか否かによってスクリーニングすることができる。ハイブリドーマ細胞のクローニングおよびサブクローニングは、この技術分野で既知なように、ＡＰＣタンパク質のエピトープと特異的に免疫反応する抗体を安定して生成する細胞系を作り出すために行われる。特異的免疫反応とは、抗体が他のヒトのタンパク質と結合しないことを意味する。特に本発明の実施に有用であると認められたモノクローナル抗体を表ＩおよびＩＩに示す。ＡＰＣを免疫沈降するであろう抗体のすべてが、ウエスタンブロットでＡＰＣと結合するわけではない。この事は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動条件下でエピトープのコンホメーションが破壊されることによると思われる。免疫沈降せず、ウエスタンブロットでもＡＰＣを検出できない他の抗体も、免疫組織化学的に、例えばクリオスタット切片で、ＡＰＣを検出することができる。本発明の一つの方法では、ＡＰＣ変異は、試験サンプルから抽出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動させることによって検出される。本発明による試験用サンプルは、任意の組織であり、新生物形成である疑いのあるものかまたは無いもののどちらかである。また、尿、血液、血清、血漿、***物、唾液等のような、体液が有効である。細胞または脱落した抗原のいずれかが、そのような体液中に検出される。細胞の溶解物もまた有効である。タンパク質はフィルター上にブロットし、次いで、ブロットしたタンパク質を本発明による抗体の一つと接触させる（ウエスタンブロット）。ブロットしたタンパク質に結合する抗体は、適当な染色技術を用いて検出する。タンパク質を結合したタンパク質のサイズを決定する。もし、抗体に結合したタンパク質が約３００ｋＤａより小さいサイズであるならば、このことは、組織サンプル中に、“先端切除変異”、典型的には、ナンセンス、フレームシフト欠損、またはフレームシフト挿入変異、のＡＰＣ変異がある事を示している。その様な先端切除変異を最大数検出するために、タンパク質のアミノ末端部分のエピトープと特異的に免疫反応する抗体を用いることが望ましい。カルボキシ末端エピトープ結合抗体を用いると、組織内に実際に存在する先端切除タンパク質を検出できない結果になる。低分子量の先端切除タンパク質は、標準的なウエスタンブロット技術を用いて適切に検出されると思われるが、高分子量の先端切除タンパク質および全長のＡＰＣタンパク質は、そのサイズが大きいためにＳＤＳ−ＰＡＧＥから十分にブロットされないであろう。そのため、ゲルマトリックスからフィルターへの移動を増強させるような技術を用いることが望ましい。これらの例として、ゲルマトリックスの作成に３％の低融点アガロースを用いることがあげられる。本発明に従って、患者を試験し、患者がＡＰＣの生殖系列の変異を遺伝的に受け継いでいるか否かを決定する、または体細胞変異であることを決定する事ができる。前者の場合、適当かつ便利な組織サンプルは、末梢血液単核細胞または白血球からなる。生殖系列変異が存在する場合には、それは体の任意の組織内で検出される。後者（体細胞変異）の場合、試験する組織サンプルは腫瘍組織または前新生物形成組織でなくてはならない。非腫瘍組織からなる対照タンパク質、望ましくは隣接する非癌組織もまた試験される。その他の本発明のＡＰＣ変異検出方法では、免疫組織化学または免疫蛍光が用いられる。組織サンプルまたは細胞サンプルは、この技術分野で既知の任意の標準的技術によって調製される。末梢血液単核細胞は、既知の方法で、免疫化学的染色のために固定することができる。組織サンプルは凍結させ、マウンティング化合物、例えばＯ．Ｃ．Ｔ．（ＭｉｌｅｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、内に包埋することができる。次いで、この切片は、カットし、ＡＰＣに特異的な抗体と共にインキュベーションし、染色し、観察することができる。一つの方法では、ＡＰＣのアミノ末端部分に含まれるエピトープと免疫反応する抗体を用いて、組織の第一サンプルを染色する。ＡＰＣのカルボキシ末端部分に含まれるエピトープと特異的に免疫反応する第二の抗体を用いて、同じ組織の第二サンプルを染色する。各抗体の結合量を定量する。実際上、アミノ末端抗体がカルボキシ末端抗体よりも多く組織サンプルと結合したならば、先端切除のＡＰＣ変異が示唆される。本発明の一つの実施態様では、例えば免疫蛍光化合物または放射性分子のような検出可能な標識で標識した抗体が用いられる。また、その様な検出可能標識は、アミノ末端またはカルボキシ末端抗ＡＰＣ抗体と免疫反応するさらなる抗体に取り付けることもできる。本発明のその他の実施態様では、抗体は、適当な酵素基質と接触して色の付いた反応生成物を生成する酵素に結合させることによって標識される。本発明の他の実施態様では、検出可能標識は、この技術分野一般的に知られているように、アビジン：ビオチン−リガンド結合ペアを用いて抗体に結合させる。代表的には、抗体をビオチンに結合させ、検出可能標識、例えばアルカリホスファターゼは、アビジンに結合させる。本発明の一つの態様では、アミノ末端抗体およびカルボキシ末端抗体を同じ組織サンプルまたは細胞サンプルと共にインキュベーションする。その場合、抗体は異なる検出可能標識で標識される。酵素結合イムノソルベントアッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ）もまた本発明の範囲内で企図される。そのようなアッセイでは、ＡＰＣのアミノ末端部分に含まれるエピトープと特異的に免疫反応する第一の抗体でコートした、マイクロタイタープレートまたはディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）の様な固体支持体が用いられる。試験サンプルは、そのような成分が試験サンプル中に存在するならば、抗原− 抗体複合体を形成し且つ支持体上にコートした抗体に結合した試験サンプルの成分を安定化するような条件下で、コートした固体支持体と接触させる。この技術分野で既知の方法にしたがって、固体支持体を適当な方法で洗浄し、抗体と特異的に結合しない試験サンプルの成分を取り除く。ＡＰＣの第二のエピトープと特異的に免疫反応する第二の抗体を加える。この様に、第一（アミノ末端）の抗体と結合した試験サンプルの成分は二つの抗体の間に挟み込まれる。試験サンプルの支持体結合成分と特異的に結合しなかった第二の抗体は、形成された抗原−抗体複合体を安定化させる条件下で、洗浄除去する。（第一の抗体と試験サンプルの成分を介して）固体支持体に結合する第二の抗体量は、典型的には、第二の抗体に結合する酵素と接触させて呈色生成物を形成する発色性基質を加えることによって、定量される。他にも、その様なＥＬＩＳＡアッセイをおこなうためのフォーマットが考えられ、そのようなフォーマットは第一の抗体用いることなく固体支持体に直接試験サンプルを結合させることを含む。本発明の他の態様では、試験サンプルの第二のアリコートを用いて、上述のように酵素結合イムノソルベントアッセイを平行して行っても良い。しかしながら、このＥＬＩＳＡ平行実験では、異なる抗体を固体支持体にコートする。このバージョンでは、カルボキシ末端抗体を第一の抗体として用いる。この様にすると、第一および第二のＥＬＩＳＡ平行実験を比べた時、第一のＥＬＩＳＡ実験より第二の実験での結合量が実質上小さい場合には、サンプルに用いた組織のＡＰＣ変異が示唆される。サンプルは、例えば、血液細胞または固体腫瘍の溶解物である。本発明の抗体を用いて行うことの出来るその他のアッセイには、免疫沈降およびタンパク質ドットブロットが含まれる。本発明の実施にあたって用いられる抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルまたはその組み合わせのいずれかであってよい。本発明のその他の態様では、組織サンプルは、例えば免疫組織化学的方法によって、ＡＰＣのカルボキシ末端の３０６アミノ酸のエピトープに特異的に結合する能力について、分析することができる。組織サンプルが抗体と結合しない場合、ＡＰＣの先端切除および／または欠損変異が示唆される。所望するならば、隣接する正常な組織のサンプルを対照として、同じ抗体を用いて分析してもよい。試験サンプルが結合する能力に欠けているのに対照サンプルが抗体に結合する能力を持っていると、ＡＰＣの体細胞変異が示唆される。本発明の他の態様では、免疫学的検出は、ヒトのＡＰＣアレレについての情報を得るために、細胞成分分画と一緒に行われる。全長のＡＰＣタンパク質は粒子画分に見出だされ、これに対して、可溶性または細胞質画分は先端を切り取られた形のみを含んでいることが見出だされた。全長のＡＰＣと先端を切り取られたＡＰＣが同じ細胞内に存在する場合、粒子画分に先端を切り取られた形もまた検出されるが、これは多分ＡＰＣタンパク質のオリゴマー化によるものであろう。この様に、ＡＰＣが粒子画分にのみ検出される場合、そのヒトは二種類の野生型アレレを持つと推測される。ＡＰＣが両方の形で検出される場合、そのヒトは一つの変異体と一つの野生型アレレを持つと推測される。ＡＰＣがサイトゾルのみに認められた場合、そのヒトは二種類のＡＰＣ変異体アレレを持っていると推測される。一つの変異体アレレは、散発性または家族性の結腸癌の素質を示唆している。二種類の変異体アレレは、より悪性の診断を意味している。細胞成分の分画は、本発明に従って、典型的な細胞質細胞成分を典型的な膜関連細胞成分から分離する任意の手段によって行うことができる。分画を行う方法の一つは、細胞を最初に（例えば機械的にまたは浸透法によって）溶解し、次いで、核および未破壊細胞を低速遠心分離、典型的には約５００ｘｇで除去する。上澄液を１時間１００，０００Ｘｇで遠心分離し、粒子または膜関連画分をペレット状にする。残された上澄液は可溶性または細胞質画分であると考えられる。上述のように、全長のＡＰＣが粒子画分に見出だされたのに対して、先端を切り取られたＡＰＣは可溶性画分に見出だされる。全長のＡＰＣが先端を切り取られたＡＰＣと共に細胞内に存在する場合、先端を切り取られたＡＰＣもまた粒子画分に見出だされる。細胞成分の分画を行った後に、タンパク質は、ここで教示された任意の手段で、免疫学的に分析することができる。典型的には、各々の画分のタンパク質は電気泳動で分離し、イムノブロットする。代わりに、画分を、ＡＰＣのアミノ末端部分に結合する抗体および所望によりＡＰＣのカルボキシ末端部分と結合する抗体の両方を用いて、ＥＬＩＳＡフォーマットでアッセイすることができる。本発明による抗体分泌ハイブリドーマは、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＡｖｅｎｕｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ、に寄託した。これらは、それぞれ取得番号ＨＢ１１２９４，ＨＢ１１２９２、ＨＢ１１２９６、ＨＢ１１２８８、ＨＢ１１２９５、ＨＢ１１２９７、ＨＢ１１２９８、およびＨＢ１１２９３のＦＥ９、ＡＣ４、ＣＣ１、ＣＦ１１、ＤＢ１、ＩＡ１、ＩＥ１、およびＨＧ２として知られている抗体を含む。同じエピトープと結合する抗体を作るその他のハイブリドーマは、例えば、抗−イディオタイプの技術を用いて、作ることができる。抗体は、寄託した抗体とその同系列の抗原との結合を完全に阻害する能力を試験することによって、寄託した抗体の同一エピトープへの結合について、試験することができる。ＦＥ９は、ＡＰＣのアミノ酸１６−２９からなるエピトープに結合することが分かった。ＡＣ４は、ＡＰＣのアミノ酸１０９− １７０からなるエピトープと結合する。また、これらの抗体のアイソタイプを変換した変異体を、この技術分野で既知の方法で、作ることもできる。Ｓｐｉｒａら、１９８５、“体細胞変異体によるより良いモノクローナル抗体の生成”。（ ”ＴｈｅＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＢｅｔｔｅｒＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＴｈｒｏｕｇｈＳｏｍａｔｉｃＭｕｔａｔｉｏｎｓ”）、バイオサイエンスおよび医学に於けるハイブリドーマ技術（ＨｙｂｒｉｄｏｍａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｔｈｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ編、７７−７８頁、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと。本発明による固体支持体は、抗体が付着するであろう任意のプラスチック、紙、またはガラスであって良い。最も典型的な固体支持体は、プラスチックミクロタイタープレートからなる。プレコートしたペーパーシートおよびスティック並びに小球もまた、本発明の抗体のキャリアーとして期待される。また、本発明の抗体は、画像化薬（ｉｍａｇｉｎｇａｇｅｎｔ）としても用いることができる。それらをこの技術分野で既知の方法にしたがって標識し、患者に投与して結腸内での腫瘍の存在、または転移を検出することができる。本発明の抗体は、結腸癌の素因を示唆する生殖系列または体細胞変異の存在の有無を決定するために有用である。また、ＡＰＣ変異は、胃、食道、膵臓、および小細胞肺癌の進行中に認められるであろう。生殖系列にＡＰＣ変異が存在することは、ＦＡＰとも関連し、患者が結腸癌になる可能性が高いことを示している。体細胞ＡＰＣ変異は、結腸腫瘍の初期の進行に関係することが認められている。実施例１本実施例は、ＡＰＣ蛋白質の一部分に特異的な抗体を得るための、免疫化およびスクリーニングに有用な細菌融合タンパク質の構築法について説明している。ＡＰＣタンパク質のアミノ末端部分を含む細菌融合タンパク質は、以下のＡＰＣｃＤＮＡの一部分から構築した。ヌクレオチド−１５から７３４を含むＡＰＣ遺伝子フラグメントは、以下のプライマー、５'-ＣＡＡＧＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＡＴＧ−３’、および５'-ＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＧＣＴＴＧＡＧＧＣ−３’ （下線で示した塩基を交換してＥｃｏＲＩサイトを作る）；でＰＣＲ増幅することによって、開始メチオニンの５´側１０ヌクレオチドにＥｃｏＲＩサイトを持つように作り変えられた。ＥｃｏＲＩで消化した後、作り出したＥｃｏＲＩサイトからヌクレオチド６６０の内因性のＥｃｏＲＩサイトまでに及ぶフラグメントを、ｐＡＴＨ３のＥｃｏＲＩサイト（Ｋｏｅｒｎｅｒ，Ｔ．Ｊ．ら、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１９４：４７７−４９０，１９９１）およびｐＧＥＸ −３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローン化してｔｒｐＥ融合体（ｐＡＴＨ−ＮＡＰＣ）およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合体（ｐＧＥＸ−ＮＡＰＣ）を得た。融合タンパク質の第二のオーバーラップしていないセットは、ヌクレオチド６６０の内因性のＥｃｏＲＩサイトから、ｃＤＭＡクローニング中に導入されたヌクレオチド３３０９の外因性ＥｃｏＲＩサイトまでに及ぶＡＰＣＥｃｏＲＩフラグメントから構築した。このフラグメントは、ｐＡＴＨ３、ｐＭＡＬ−Ｃ２（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、およびｐＧＥＸ−２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングして、結果としてｔｒｐＥ融合体（ｐＡＴＨ−ＭＡＰＣ）、マルトース結合性タンパク質（ｍａｌｔｏｓｅｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＢＰ）融合体（ＭＢＰ−ＭＡＰＣ）、またはＧＳＴ融合体（ｐＧＥＸ−ＭＡＰＣ）を得た。融合タンパク質の第三のセットは、ｐＡＴＨ３およびｐＭＡＬ−Ｃ２の発現ベクターにクローニングしたＡＰＣの３０６のカルボキシ末端アミノ酸を含み、それぞれ融合タンパク質ｔｒｐＥ−ＸＣおよびＭＢＰ− ＸＣを得た。全長の融合タンパク質（ｔｒｐＥ−ＸＣ）は７５ｋＤａの分子量を持つ。ｔｒｐＥ融合タンパク質をコードするｐＡＴＨは、温度感受性の大腸菌ＣＡＧ４５６で生産された（Ｂａｋｅｒ，Ｔ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６７７９−６７８３，１９８４）。定常期の大腸菌を１：５に希釈し、１２時間トリプトファン飢餓状態で誘導した。細胞を遠心分離で収集し、１／６０容量のＴＥＮ（５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、５０ｍＭ−ＮａＣｌ）に再懸濁した。リゾチームを２０ｍｇ／ｍｌ加え、培養液を氷上で１５分インキュベーションした。ＮＰ−４０を最終濃度が０．２５％になるように加えた後、サンプルを音波処理し、不溶性の融合タンパク質をペレット状にし（１２，０００Ｘｇで５分間、４℃）、ＴＥＮで洗浄し、−８０℃ で凍結した。ｐＧＥＸがコードするグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を大腸菌ＪＭ１０１細胞中にて製造した。細胞は、３７℃で、５５０nmの吸光度（Ａ₆₀₀）が０．５になるまで増殖させ、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（０．５ｍＭ）を加えることによって誘導した。４時間インキュベーションしたのち、細胞を遠心分離で収集し、１／３０容量のＭＴＰＢＳ（１５０ｍＭ− 塩化ナトリウム、１６ｍＭ−リン酸一ナトリウム、および４ｍＭのリン酸二ナトリウム、ｐＨ７．３）に再懸濁し、音波処理した。不溶性融合タンパク質をペレット状にし、０．０３％ＳＤＳで一回洗浄し、−８０℃で凍結した。大腸菌で発現させた、ｐＭＡＬ−Ｃ２がコードするマルトース結合タンパク質である融合タンパク質ＭＢＰ−ＸＣおよびＭＢＰ−ＭＡＰＣを溶解させた形で生産し、以下の方法で精製した：細胞は３７℃で吸光度（Ａ₆₀₀）が０．５になるまで増殖させた。次いで、融合タンパク質の発現は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドを０．５ｍＭになるように加えて誘導した。４時間インキュベーションの後、細胞を遠心分離で収集し、１／１０容量のＳＴＥ（１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４、および１ｍＭ−ＥＤＴＡ）に再懸濁し、２０Ｋのフレンチプレッシャーセル（ＳＬＭＡｍｉｃｏ，ＳＬＭＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．Ｕｒｂａｎａ，ＩＬ）に１５，０００ＰＳＩで細胞を二度通して破砕した。不溶性物質は、１６，０００Ｘｇで１０分間遠心分離し、残った可溶性物質はアミロースカラムにかけた。可溶性のＭＢＰ−ＸＣおよびＭＢＰ−ＭＡＰＣは、アミロースでカラムから溶出した。ピークのフラクションはＳＤＳ／ＰＡＧＥで同定し、プールした。実施例２本実施例は、ＡＰＣタンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端のセグメントと特異的に免疫反応するポリクローナル抗体の生産について説明している。ｔｒｐＥの細菌融合タンパク質を含む不溶性の細菌ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて精製した。おおよそ３００μｇの融合タンパク質を含むゲルスライスは、完全フロイントアジュバンド（Ｓｉｇｍａ）中でホモジナイズして第一免疫注射に用い、不完全フロイントアジュバンド（Ｓｉｇｍａ）でホモジナイズして追加免疫注射に用いた。２匹のニュージーランドシロウサギに、それぞれのタンパク質調製物を注射した。ウサギは２週間ごとに注射を打たれ、それぞれの追加免疫注射から１０日後に採血した。抗体は、不溶性細菌融合タンパク質であるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに結合させることによって、アフィニティー精製した。２００μｇの融合タンパク質を含む細菌ペレットを融解させ、ＴＥＮで洗浄し、ペレット状にした。１ｍｌの抗血清をペレットに加え、氷上で１時間インキュベーションした。次いで、抗体−不溶性タンパク質複合体をペレット状にし、ＴＢＳで洗浄した。抗体は、５００μｌの０．２Ｍグリシン、ｐＨ２．３中、氷上に５分間置くことによって遊離させた。残された不溶性タンパク質をペレット状にした。抗体溶液は、７０μｌの１ＭトリスｐＨ９．５で中和した。ウシ血清アルブミンおよびアジ化ナトリウムを、最終濃度がそれぞれ５ｍｇ／ｍｌおよび０．０５％になるように加えた。実施例３本実施例では、ＡＰＣのアミノまたはカルボキシ末端セグメントに特異的に免疫反応するモノクローナル抗体の生産について説明する。メスのＣＢ６／Ｆ１マウスは、大腸菌内で発現させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、電気的に溶出精製した２０μｇのｔｒｐＥ−ＮＡＰＣまたはｔｒｐＥ−ＸＣ融合タンパク質を３回連続して腹腔内に注射することによって免疫化した。ハイブリドーマは、融合させた細胞を１ｘ１０⁶／ｍｌの濃度で平板培養することを除いて、ＭｃＫｅｎｚｉe，Ｓ．Ｊ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，４：５４３−５４８，１９８９，に記載の方法にしたがって生成させた。マウスの試験採血試料およびハイブリドーマの抗ＡＰＣ反応性についてのスクリーニングは、上述した方法にしたがって精製した精製ＧＳＴ−ＮＡＰＣ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ら、Ｇｅｎｅ，６７：３１−４０，１９８８）または可溶性ＭＢＰ−ＸＣを用いて、それぞれ５００ｎｇ／ｍｌまたは３μｇ／ｍｌの濃度になるようにプレート上にコートし、抗原捕獲ＥＬＩＳＡを用いて行った。精製ＧＳＴ−ＭＤＭ２は、Ｏｌｉｎｅｒ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３５８：８０−８３，１９９２に記載の方法にしたがって発現させて精製し、精製ＭＢＰ−ＭＡＰＣは負対照の抗原として用いた。抗原／抗体複合体の検出は、西洋サワビのペルオキシダーゼとヤギ抗マウスＩｇＧの重鎖および軽鎖の複合体（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄａｎｄＰｅｒｒｙＬａｂｓ，Ｉｎｃ．）と共にインキュベーションし、次に、ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，４：５４３−５４８，１９８９に記載の方法にしたがってテトラメチルベンジジンで発色させて行った。陽性ハイブリドーマは、すべて限界希釈法によって２度サブクローン化した。ＡＰＣのアミノ末端部分に対するモノクローナル抗体は、最初に、ＧＳＴ−ＮＡＰＣおよびｔｒｐＥ−ＮＡＰＣを用いてウエスタンブロットを行うことによってＡＰＣを特異的に認識するか否かについて試験した結果、抗ＡＰＣ反応性を示したが、このときＧＳＴ−ＭＤＭ２およびｔｒｐＥ−ＭＡＰＣを負の対照として用いた。ＡＰＣのカルボキシ末端部分に対するモノクローナル抗体は、最初に、可溶性融合タンパク質ＭＢＰ −ＸＣを用いてＥＬＩＳＡを行うことによってＡＰＣを特異的に認識するか否かについて試験した結果、抗ＡＰＣ反応性を示したが、このときＭＢＰ−ＭＡＰＣを負の対照として用いた。ＡＰＣのアミノ酸１−２２０に含まれるエピトープと特異的に反応する１０個のハイブリドーマを分離した。ＡＰＣのカルボキシ末端３０６のアミノ酸残基に含まれるエピトープと特異的に反応する６個のハイブリドーマを分離した。これらは、表１および２に示すと共に、それらのアイソタイプについても示した。実施例４本実施例では、ウエスタンブロットおよび免疫沈降を行うことによってＡＰＣアミノ末端に特異的な１０のモノクローナル抗体の特徴について説明している。ウエスタンブロットを行うために、それぞれ１μｇのＧＳＴ−ＮＡＰＣ、ＧＳＴ−ＭＤＭ−２、ｔｒｐＥ−ＮＡＰＣ、およびｔｒｐＥ−ＭＡＰＣを、ＳＤＳ− ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースに移した。ブロットは、１０ｍｌの希釈していないハイブリドーマ上澄液によってプローブした。ウエスタンブロットによって、どの抗体も、全長の４８ｋＤａのＧＳＴ−ＮＡＰＣおよび全長のｔｒｐＥ−ＮＡＰＣを認識することができる。ＧＳＴ−ｈＭＤＭ２またはｔｒｐＥ−ＭＡＰＣは認識されない。しかしながら、それらの抗体はすべて、ＧＳＴ−ＮＡＰＣの列に何本かの低分子バンドを検出した。これらのバンドは全長のＧＳＴ−ＮＡＰＣのタンパク質の分解によるものと思われる。免疫沈降するために、ＳＷ４８０細胞を、³⁵Ｓ−メチオニンで代謝標識した。次いで、溶解物を、ハイブリドーマの上澄液中のそれぞれの抗体１２μｇを用いて沈降させた。５種類の抗体、ＢＤ１２、ＣＣ１、ＣＦ１１、ＥＦ４、およびＦＥ９は、ＳＷ４８０溶解物中の１４７ｋＤａのＡＰＣタンパク質を免疫沈降によって検出することができる。図１Ｃ、列１を参照されたい。特性の一覧を表Ｉに示す。実施例５本実施例では、モノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットで、７種類のリンパ芽球および１つの結腸細胞系内にＡＰＣタンパク質を検出したことを説明している。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、結腸癌細胞系のＳＷ４８０からおよびＦＡＰ患者から得られた７種類のＥＢＶ−不死化リンパ芽球系からのタンパク質溶解物のウエスタンブロット分析に用いられた。ＳＷ４８０細胞系は、ＡＰＣ遺伝子アレレの一方のみを含み、そのアレレはコドン１３３８にナンセンス変異をもち、その結果、予想される１４７ｋＤａのタンパク質サイズを持つ（Ｎｉｓｈｉｓｈｏ，Ｉ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：６６５−６６９，１９９１）。７種類のＦＡＰ細胞系は、すべて正常なアレレならびにＡＰＣ遺伝子の既知の先端切除変異を含む（Ｍｉｙｏｓｈｉ，Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４４５２−４４５６，１９９２）。正常なＡＰＣ遺伝子は、３１２ｋＤａのタンパク質をコードすると予想されるが、これに対して変異体は、２７ｋＤａから１４７ｋＤａの範囲の予想に相対サイズを持つタンパク質である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに次いで行われる標準的ウエスタンブロット技術によるタンパク質溶解物の分析では、全長のＡＰＣタンパク質を検出できなかった。高分子タンパク質の検出を容易にするために、タンパク質溶解物は、変性アガロースゲルシステムで電気泳動させ、タンパク質の移送は、キャピラリー作用で行った。増強的化学発光と組み合わせたこの移送方法は全長のＡＰＣタンパク質の検出を可能にした。より具体的には、電気泳動は、トリス −ホウ酸バッファー（８９ｍＭトリス塩基、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭ−ＥＤＴＡ）中、０．１％ＳＤＳを含む３％の低融解点アガロースゲルを用いて行い、トリス−グリシンバッファー（２５ｍＭトリス塩基、１９１ｍＭグリシン、０，０５％ＳＤＳ）を泳動バッファーとして用いた。細胞タンパク質溶解物は、ＳＤＳ− ＰＡＧＥ負荷用バッファー（６３ｍＭトリス塩酸、ｐＨ６．８、１０％グリセロール、５％２−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、０．０２５％ブロモフェノールブルー）中で、５分間沸騰させて調製した。タンパク質濃度は、文献の方法（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｎ．ら、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６６：４９−５４，１９８７）に従って、アミドブラック染色で定量し、１００μｇの全タンパク質を各列に負荷した。タンパク質は、キャピラリ−アクションで、０．０４％ＳＤＳを含むトリスバッファー溶液（０．１Ｍトリス塩酸、ｐＨ７．５、０．９％塩化ナトリウム）（ＴＢＳ）中でポリビニルジフルオライド膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へ、一晩かけて、移送した。フィルターは、ＴＢＳで簡単にリンスし、１０％の脱脂粉乳、１０％ヤギ血清、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ溶液中で１時間固定した。５％脱脂粉乳、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ溶液中２時間、１−２μｇ／ｍｌの一次免疫抗体と共にインキュベーションした後、フィルターは０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ溶液中で３０分間、溶液を３回交換して洗浄した。西洋サワビペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗ウサギまたはヤギ抗マウス抗体（５％脱脂粉乳、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ溶液中に０．０５μｇ／ｍｌ）をフィルターと共に、４５分間インキュベーションした。次いで、フィルターを６回、各回２０分間、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ中で洗浄した。ペルオキシダーゼ活性は、製造者の処方箋にしたがって、Ａｍｅｒｓｈａｍの増強化学発光検出キットを用いて検出した。ポリクローナル抗ＮＡＰＣ、抗ＭＡＰＣおよびモノクローナルＦＥ９抗体はすべて、ＦＡＰ細胞系でおおよそ３００ｋＤａタンパク質を検出したが、ＳＷ４８０細胞系では認められなかった（図１）。さらに、予想されるサイズに相当する先端切除タンパク質は、ＳＷ４８０および４つのＦＡＰの列で検出された（図１）。一つの場合には、ＦＡＰ患者から新たに採血して、末梢単核細胞を分離した。末梢単核細胞は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７段階勾配（Ｓｉｇｍａ）を製造者の処方箋にしたがって用い、ＥＤＴＡ抗凝血血液から分離した。変異体（１１７ｋＤａ）および全長のＡＰＣタンパク質の両方が検出され、この分析が、血液細胞を用いて直接行うことができることを証明した。３つのＦＡＰリンパ芽球サンプルでは、全長のＡＰＣタンパク質を容易に検出できたにもかかわらず、先端切除のタンパク質は検出されなかった（データは示していない）。これらは、コドン２３２、３０１、６２５でのナンセンス変異の列を含んでいた。これらの細胞系各々からの別々の３種類の細胞溶解物は、変異によって予想されるサイズの範囲のタンパク質を検出できるような様々な異なるゲル電気泳動条件を用いて、抗ＮＡＰＣまたはＦＥ９で分析した。これらの結果から、先端切除ＡＰＣの或る形が、全長ＡＰＣに比較して大変低いレベルで発現していることが示唆されるが、これは変異体の転写物またはタンパク質が不安定であることによると思われる。同様の結果が、モノクローナルＦＥ９、ＣＦ１１およびＥＦ４でも得られた。四番目のモノクローナルＣＣ１は、代謝標識した内因性ＡＰＣを免疫沈降できるにも拘らず、ウエスタンブロットで内因性ＡＰＣを検出しなかった（データには示していない）。実施例６本実施例では、ヒト腫瘍細胞系でＡＰＣタンパク質の変化を検出するためにＡＰＣに特異的な抗体を用いることについて説明している。ヒト腫瘍に於けるＡＰＣタンパク質の状態について決定した。正常組織の混入による問題を避けるために、結腸、***、前立腺、子宮頸部、肺および膵臓の腫瘍から誘導したヒト細胞系のＡＰＣタンパク質について試験した。散発性腺腫（アデノーマ）から誘導した６の細胞系、散発性癌腫（カルシノーマ）から２２、ＦＡＰ腺腫から３、およびＦＡＰ癌から１つを含む、全部で３２の結腸腫瘍細胞系について研究した。ウエスタンブロット分析では、これらの系のうちの２４（７５％）が先端切除ＡＰＣタンパク質を含んでいることが明らかになった（図２）。新規のバンドが抗ＮＡＰＣ，抗ＭＡＰＣ、およびＦＥ９抗体と反応しさえすれば、細胞系は先端切除のＡＰＣタンパク質を含んでいると評価した。興味深いことに、結腸系の８０％（２７／３２）より多くが、全長のＡＰＣタンパク質をまったく含んでいなかった。対照的に、７つの***の、６つの前立腺の、９つの子宮頸部の、９つの膵臓の、および９つの肺の癌腫細胞系はそれぞれ、ウエスタンブロット分析では全長のＡＰＣタンパク質のみを含んでいた（図２）。その結果、ＡＰＣ変異は、これらの腫瘍の進行に一役を果たしていないことが示唆されるが、ミスセンスＡＰＣ変異および／または非常な初期の先端切除変異がこれらの腫瘍タイプに起こる可能性がある。また、これらの結果から、ＡＰＣタンパク質は、多くの異なる組織のタイプ、特に、リンパ球、肺、***、前立腺、膵臓および子宮頸部、に検出されうるレベルで発現することが、示唆される。実施例７本実施例は、ＡＰＣが細胞質に位置することを説明している。ＡＰＣの存在位置を決めるために細胞下レベルで様々な実験を行った。ＳＷ４８０細胞を用いて細胞分画を行った場合、先端切除タンパク質はサイトゾル画分のみに見出だされた（図３Ａ、列４）。方法は、以下の修飾を加えたが、文献の方法（Ｓｐｒｏｔｔら、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６６：４９−５４，１９８７）に従って、行った。細胞は、２００Ｘｇで遠心分離して収菌し、０．５ｍＭ塩化カルシウムを含むＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸塩緩衝液で３回洗浄した。ペレットを溶解バッファー（５ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．８、２ｍＭ−ＭｇＣｌ２、１ｍＭ−ＰＭＳＦ，０．５μｇ／ｍｌロイペプチン（Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍｌトリプシンインヒビター（Ｓｉｇｍａ））に再懸濁した。次いで、サンプルを５００Ｘｇで遠心分離し、核および未溶解細胞をペレット状にした。ペレットは溶解緩衝液で一度洗浄し、“核フラクション” として保存した。上澄液は１００，０００Ｘｇで１時間遠心分離した。得られたペレットを“細胞膜フラクション”とし、上澄液を“サイトゾルフラクション” とした。これら３種類のフラクションは、すべてウエスタンブロット分析する前に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動用緩衝液に直接溶かした。これらのフラクションは、ｐ５３およびＤＣＣがそれぞれ“核”および“細胞膜”フラクションに優勢に見出だされるという所見によって確かめられる。全長のおよび先端切除のＡＰＣタンパク質を含むＦＡＰリンパ芽球腫系を分画した場合、結果は予想に反していた。全長のＡＰＣタンパク質は１００，０００Ｘｇの不溶性の“細胞膜フラクション”に見出だされたが、これに対して、先端切除型は、１００，０００Ｘｇフラクション中およびサイトゾルフラクション中に存在した（図３Ｂ、列２および４）。ＡＰＣの分画は、トリトンＸ−１００処理によって影響を受けなかったが、デオキシコール酸塩、弱イオン性界面活性剤は全長および先端切除のＡＰＣを完全に可溶化した（データには示していない）。この事は、ＡＰＣが細胞膜に存在するタンパク質であるわけではなく、むしろ全長のＡＰＣタンパク質が不溶性の凝集体と複合体を形成していることを示唆している。この様な分画パターンは、別の先端切除ＡＰＣタンパク質を含む第二のＦＡＰリンパ芽球腫でも再確認された。ＡＰＣの細胞内の位置をさらに確かなものにするため、アフィニティー精製したポリクローナル抗体を使用し、凍結させた正常な結腸粘膜切片を用いて、免疫組織化学的研究を行った。凍結させた正常な結腸粘膜サンプルをＯ．Ｃ．Ｔ．（ＭｉｌｅｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に包埋し、１２μｍの切片に切断した。切片は、直ちに、０．３％の過酸化水素を含む無水メタノール中、室温で３０分間固定した。組織は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸塩バッファー（ＰＢＳ）で３回洗浄した。ＡＰＣ抗原は、製造者の処方箋にしたがって、抗原捜査システム（ＡｎｔｉｇｅｎＲｅｔｒｉｅｖａｌＳｙｓｔｅｍ）（ＢｉｏｇｅｎｅｘＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて露出させた。組織は、Ｈ₂Ｏで３回、ＰＢＳで３回、簡単に洗浄し、ヤギ血清を用いて３０分間ブロックし、次いでアフィニティー精製した抗ＮＡＰＣ（１．５μｇ／ｍｌ）または抗ＭＡＰＣ抗体（１．５μｇ／ｍｌ）またはヤギ血清で希釈した正常なウサギの免疫グロブリン（４．５μｇ／ｍｌ）と共に、２時間インキュベーションした。組織は、ＰＢＳで３回、５分間ずつ洗浄した。ビオチニル化したヤギの抗ウサギ抗体（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をヤギの血清で１：２００に希釈し、これに組織を３０分間晒した。組織は、ＰＢＳで３回、それぞれ５分間ずつ洗浄した。製造者の処方箋にしたがって、ＶｅｃｔａｓｔａｉｎＥｌｉｔｅＡＢＣＳｙｓｔｅｍ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、免疫ペルオキシダーゼ染色を行った。ＤＡＰＩ染色は、０．１ｍｇ／ｍｌ−ＤＡＰＩを免疫ペルオキシダーゼ染色した組織に塗布することによって核対比染色として行い、Ｕ．Ｖ．励起下で調べられるようにした。文献の方法（ＳｍｉｔｈＤ．Ｂ．ら、Ｇｅｎｅ６７：３−４０、１９８８）に従って精製した可溶性ＧＳＴ融合タンパク質を用いて、競合試験を行った。ＧＳＴ−ＮＡＰＣおよびＧＳＴ−ＭＤＭ２融合タンパク質は、それぞれ最終濃度３μｇ／ｍｌおよび９μｇ／ｍｌで、一次免疫抗体のインキュベーション中に含んだ。陰窩の上皮細胞の基底面部分で濃縮された細胞質染色は抗ＮＡＰＣで認められる（図４、パネルＡおよびＢ）が、３倍高濃度の正常なウサギのＩｇＧ（図４Ｄおよび４Ｅ）では認められなかった。ＤＡＰＩで対比染色した場合、最も濃いＡＰＣ特異的染色は、核への基底面で認められた。上皮細胞の染色は、陰窩の基底部からリューミナル表面へ著しい増加を示した。同様のパターンがポリクローナル抗ＭＡＰＣ抗体でも認められた。この抗体の結合がＡＰＣに特異的であることを確認するため、可溶性細菌ＧＳＴ−ＮＡＰＣ融合タンパク質または対照となる無関係の融合タンパク質（ＧＳＴ−ＭＤＭ２）を用いて競争試験を行った。シグナルは、ＮＡＰＣ融合タンパク質と十分に競合したが（図４、パネルＦ）、３倍高濃度のＭＤＭ２融合タンパク質による影響は受けなかった（図４、パネルＣ）。抗ＭＡＰＣ抗体で認められたシグナルは、予想されたように、可溶性の細菌ＮＡＰＣ融合タンパク質とは競合しなかった。染色の同様なパターンは、（データとして示していないが）コドン６２５または１３０９のどちらかの先端切除変異をもつ２名の個体から得たＦＡＰ結腸粘膜でも認められた。配列表（2）SEQ ID NO:1:の情報：（i）配列の特性：（A）長さ：9606塩基（B）タイプ：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直線状（ii）分子タイプ：cDNA （iii）ハイポセチカル：NO （iv）アンチセンス：NO （vi）起源：（A）生物：ヒト（viii）ゲノム中の位置：（B）マップの位置：5q21 （ix）特性：（A）NAME/KEY：CDS （B）位置：34..8562 （xi）SEQ ID NO:1：（2）SEQ ID NO:2:の情報：（i）配列の特性：（A）長さ：2843アミノ酸（B）タイプ：核酸（D）トポロジー：直線状（ii）分子タイプ：タンパク質（xi）SEQ ID NO:2：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/577 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者キンズラー，ケネス・ダブリューアメリカ合衆国メリーランド州21234，バルティモア，ハルステッド・ロード 1348 (72)発明者ヴォーゲルスタイン，バートアメリカ合衆国メリーランド州21208，バルティモア，ブレトン・ウェイ 3700

Claims

【特許請求の範囲】１．ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すＡＰＣのアミノ末端1103アミノ酸内に含まれるエピトープと特異的に免疫反応性である複数の抗体から実質的になる、抗体調製物。２．ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すＡＰＣのカルボキシ末端306アミノ酸内に含まれるエピトープと特異的に免疫反応性である複数の抗体から実質的になる、抗体調製物。３．エピトープが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すＡＰＣのアミノ酸２２１〜１１０３内に含まれる、請求項１の抗体調製物。４．エピトープが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すＡＰＣのアミノ末端２２０アミノ酸内に含まれる、請求項１の抗体調製物。５．エピトープが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すＡＰＣのアミノ酸16−29からなる、請求項１の抗体調製物。６．エピトープが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すＡＰＣのアミノ酸109−170 からなる、請求項１の抗体調製物。７．抗体がポリクローナル抗体である、請求項１の抗体調製物。８．抗体がモノクローナル抗体である、請求項１の抗体調製物。９．抗体がポリクローナル抗体である、請求項２の抗体調製物。１０．抗体がモノクローナル抗体である、請求項２の抗体調製物。１１．抗体が、それぞれＡＴＣＣ受託番号HB 11294，HB 11288，HB 11296，及びHB 11292として寄託されているFE9，CF11，CC1，及びAC4からなる群から選択される細胞ラインにより、製造される請求項４の抗体調製物。１２．抗体が、それぞれＡＴＣＣ受託番号HB 11293，HB 11295，HB 11297，及びHB 11298として寄託されているHG2，DB1，IA1，及びIE1からなる群から選択される細胞ラインにより、製造される請求項２の抗体調製物。１３．ヒトの組織サンプルまたは体液からタンパク質を抽出し；ポリアクリルアミドゲル上で上記抽出夕ンパク質を分離し；分離されたタンパク質をフィルター上にブロットし；上記フィルターをＡＰＣタンパク質と特異的に免疫反応する抗体と接触させて、該抗体を該フィルター上にブロットされたタンパク質と結合させ；該タンパク質と結合した抗体の位置を検出し；該抗体と結合したタンパク質の大きさを決定し；かくして、約３００ｋＤａ以下の大きさは、組織サンプルまたは体液中にＡＰＣの変異が存在することを示すこととすることからなる、ヒトＡＰＣ遺伝子内の変異の存在を調べる方法。１４．抗体が、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すアミノ末端1103アミノ酸内に存在するエピトープに結合する、請求項１３の方法。１５．ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すＡＰＣのアミノ酸16-29が、該エピトープを含む、請求項１３の方法。１６．抗体が、それぞれＡＴＣＣ受託番号HB 11294，HB 11288，HB 11296，及びHB 11292として寄託されているFE9，CF11，CC1，及びAC4からなる群から選択される細胞ラインにより、製造される請求項１３の方法。１７．抗体がポリクローナル抗体である、請求項１３の方法。１８．抗体がモノクローナル抗体である、請求項１３の方法。１９．組織サンプルが腫瘍である、請求項１３の方法。２０．体液が末梢血の単核細胞を含む、請求項１３の方法。２１．第一の組織サンプルまたは体液を、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すＡＰＣのアミノ末端1103アミノ酸内に含まれるエピトープと特異的な免疫反応性をもつ第一の抗体と接触させ；第一のサンプルに対する第一の抗体の結合量を調べ；第二の組織サンプルまたは体液を、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すＡＰＣのカルボキシ末端306アミノ酸内に含まれるエピトープと特異的に免疫反応性をもつ第二の抗体と接触させ；第二のサンプルに対する第二の抗体の結合量を調べ；第一の抗体の結合量と第二の抗体の結合量を比較し；かくして、第二の抗体より第一の抗体の結合量が実質的に多いサンプルが見つかったときは、ヒトにおけるＡＰＣの変異を示唆することとする、ヒトにおけるＡＰＣ変異の存在を調べる方法。２２．第一及び第二の組織サンプルが腫瘍組織である、請求項２１の方法。２３．第一及び第二の体液サンプルが末梢血単核細胞を含む、請求項２１の方法。２４．第一及び第二の組織サンプルが腫瘍組織の溶解物である、請求項２１の方法。２５．第一及び第二のサンプルが同一サンプルであり、そして第一及び第二の抗体が異なる検出可能なタグで標識されている、請求項２１の方法。２６．第一抗体、第二抗体、第一抗体に結合する抗体、及び第二抗体に結合する抗体からなる群から選択される抗体に連結した酵素により生じる呈色反応生成物により、抗体の結合を調べる請求項２１の方法。２７．第一抗体、第二抗体、第一抗体に結合する抗体、及び第二抗体に結合する抗体からなる群から選択される抗体に連結した蛍光化合物により、抗体の結合を調べる請求項２１の方法。２８．第一抗体が、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すＡＰＣのアミノ酸109-170 内に含まれるエピトープと免疫反応性である、請求項２１の方法。２９．第一抗体が、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すＡＰＣのアミノ酸16-29内に含まれるエピトープと免疫反応性である、請求項２１の方法。３０．第一抗体が、それぞれＡＴＣＣ受託番号HB 11294，HB 11288，HB 11296 ，及びHB 11292として寄託されているFE9，CF11，CC1，及びAC4からなる群から選択されるハイブリドーマにより製造される請求項２１の方法。３１．第二抗体が、それぞれＡＴＣＣ受託番号HB 11293，HB 11295，HB 11297 ，及びHB 11298として寄託されているHG2，DB1，IA1，及びIE1からなる群から選択されるハイブリドーマにより製造される請求項２１の方法。３２．酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）である請求項２１の方法。３３．免疫組織化学的アッセイ法である請求項２１の方法。３４．第一の組織サンプルまたは体液を、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すＡＰＣのカルボキシ末端306アミノ酸内に含まれるエピトープと特異的な免疫反応性をもつ抗体と接触させ；第一の組織サンプルに対する該抗体の結合量を調べ；かくして、該抗体を結合しない組織はヒトにおけＡＰＣの変異を示唆することとする、ヒトにおけるＡＰＣ変異の存在を調べる方法。３５．さらに、第一組織に隣接する正常組織からなる第二の組織サンプルを抗体と接触させ；該抗体の第二組織サンプルに対する結合量を調べ；かくして、第一組織が該抗体と結合しない場合に該抗体が第二組織サンプルと結合することは、第一組織中での体細胞ＡＰＣ変異を示唆することとする、請求項３４の方法。３６．ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すＡＰＣのアミノ末端1103アミノ酸内に含まれるエピトープと特異的に免疫反応性である第一の抗体でコートした固体支持体からなる、ＥＬＩＳＡを実施するために用いる固体支持体。３７．エピトープがＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すＡＰＣのアミノ末端２２０アミノ酸内に含まれる、請求項３６の固体支持体。３８．抗体がそれぞれＡＴＣＣ受託番号HB 11294，HB 11288，HB 11296，及び HB 11292として寄託されているFE9，CF11，CC1，及びAC4からなる群から選択される細胞ラインにより製造される、請求項３６の固体支持体。３９．ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すＡＰＣのカルボキシ末端306アミノ酸内に含まれるエピトープと特異的に免疫反応性である第一の抗体でコートした固体支持体からなる、ＥＬＩＳＡを実施するために用いる固体支持体。４０．抗体がそれぞれＡＴＣＣ受託番号HB 11293，HB 11295，HB 11297，及び HB 11298として寄託されているHG2，DB1，IA1，及びIE1からなる群から選択される細胞ラインにより製造される、請求項３９の固体支持体。４１．ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すＡＰＣのアミノ末端1103アミノ酸内に含まれるエピトープと特異的に免疫反応性である抗体を分泌するハイブリドーマ細胞。４２．ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すＡＰＣのカルボキシ末端306アミノ酸内に含まれるエピトープと特異的に免疫反応性である抗体を分泌するハイブリドーマ細胞。４３．エピトープが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すＡＰＣのアミノ末端２２０アミノ酸内に含まれる、請求項４５のハイブリドーマ細胞。４４．エピトープが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すＡＰＣのアミノ酸16−29 からなる、請求項４５のハイブリドーマ細胞。４５．エピトープが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すＡＰＣのアミノ酸109−1 70からなる、請求項４５のハイブリドーマ細胞。４６．それぞれＡＴＣＣ受託番号HB 11294，HB 11288，HB 11296，及びHB 112 92として寄託されているFE9，CF11，CC1，及びAC4からなる群から選択される細胞ラインにより製造される抗体と同じエピトープに結合する抗体を分泌する、請求項４５のハイブリドーマ細胞。４７．それぞれＡＴＣＣ受託番号HB 11293，HB 11295，HB 11297，及びHB 112 98として寄託されているHG2，DB1，IA1，及びIE1からなる群から選択される細胞ラインにより製造される抗体と同じエピトープに結合する抗体を分泌する、請求項４６のハイブリドーマ細胞。４８．ヒトから得られた試験細胞サンプルを溶解し；該細胞を可溶性及び不溶性フラクションに分離し；上記可溶性フラクションを、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示すＡＰＣのアミノ末端1103アミノ酸内に含まれるエピトープと特異的に免疫反応性である抗体と接触させ；該可溶性フラクションと結合する抗体を検出し；かくして可溶性フラクションに結合する抗体の存在を試験細胞中に切断型のＡＰＣが存在することの指標とする、切断型ＡＰＣの検出方法。４９．さらに、不溶性フラクションを該抗体と接触させ；該不溶性フラクションと結合する抗体を検出し；かくして不溶性フラクションに結合する抗体の不存在を、該試験細胞中に完全長のＡＰＣが存在しないことの指標とする、請求項４８の方法。